一種牛幹擾素-α多肽基因的製作方法

2023-06-09 10:55:01

專利名稱：一種牛幹擾素-α多肽基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種牛幹擾素-Ol基因。
背景技術：
幹擾素(interferon.IFN)最早是由英國科學家Isaacs和Lindemann於1957年 發現。1980年國際幹擾素命名委員會正式將其定名為interferon,簡寫為IFN。 牛基因工程幹擾素-(x的研究始於上世紀80年代中期，1985年Velan等最先以 人幹擾素-a基因為探針從牛的cDNA文庫中克隆了牛幹擾素-(x基因，目前為 止已克隆並測序了 8個牛幹擾素-cx基因亞型。重組牛幹擾素-a的體外表達具 有抗水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、呼吸道合胞體病毒、 副流感以及非洲豬瘟等多種病毒的作用，因此需要將牛幹擾素-(X轉入原核表達 體系進行表達(大腸桿菌是最為常用和最普遍的原核表達體系)。但由於牛幹 擾素-a基因屬於真核基因，所以在原核表達體系(如大腸桿菌)內存在低表達 和構建表達載體後轉錄的mRNA翻譯活性低的問題，所以限制了牛幹擾素-a 在實際畜牧生產中的應用和推廣。

發明內容
本發明的目的是為了解決目前牛幹擾素-ot基因在原核表達體系(如大腸杆 菌)內存在低表達和構建表達載體後轉錄的mRNA翻譯活性低的問題，而提 供的一種牛幹擾素-(x多肽基因。
本發明牛幹擾素-a多肽基因序列如SEQIDNO: 1所示。本發明木糖還原 酶基因序全長516bp， 7bp處有起始密碼子ATG， 508bp處有終止密碼子TAA， 有504bp完整的開放閱讀框。
本發明牛幹擾素-a多肽基因所編碼的胺基酸序列與天然的牛幹擾素-(x多 肽相同，但本發明牛幹擾素-a多肽基因序列中43bp 48bp處的鹼基為 "CGTCGC"(此處天然牛幹擾素-a多肽基因鹼基為"AGGAGG")， 73bp 78bp 處的鹼基為"CGTCGC"(此處天然牛幹擾素-a多肽基因鹼基為"AGAAGG")， 106bp 108bp處的鹼基為"CGC"(此處天然牛幹擾素-oc多肽基因鹼基為"AGA")， 262bp 264bp處的鹼基為"CTG"(此處天然牛幹擾素-a多肽基 因鹼基為"CTA")， 370bp 372bp處的鹼基為"CGC"(此處天然牛幹擾素-a 多肽基因鹼基為"AGG")， 385bp 387bp處的鹼基為"CGT"(此處天然牛 幹擾素-a多肽基因鹼基為"AGA")， 412bp 414bp處的鹼基為"CGC"(此 處天然牛幹擾素-a多肽基因鹼基為"AGA")， 442bp 444bp處的鹼基為"CGC"
(此處天然牛幹擾素-a多肽基因鹼基為"AGA")， 457bp 459bp處的鹼基為
"CGC"(此處天然牛幹擾素-a多肽基因鹼基為"AGA")， 496bp 501bp處 的鹼基為"CGTCGC"(此處天然牛幹擾素-(x多肽基因鹼基為"AGGAGA")。 本發明利用原核表達系統(大腸桿菌)優勢表達基因(偏愛密碼子)對牛 幹擾素-a多肽基因進行基因改造；由於密碼子的改變本發明的牛幹擾素-a多 肽基因的密碼子及密碼子對均為優勢密碼子和密碼子對，所以本發明的牛幹擾 素-(x多肽基因在大腸桿菌中的蛋白表達量明顯提高，密碼子分析結果如圖2、 11、 12、 13和14所示，明顯強於天然牛幹擾素-a多肽基因(如圖1、 7、 8、 9 和10所示)，因此本發明牛幹擾素-(x多肽基因可以在原核表達系統(大腸桿菌) 中高效表達牛幹擾素-a成熟多肽。
本發明的牛幹擾素-a多肽基因的5'端自由能圖如圖3所示，天然牛幹擾 素-(x多肽基因的5'端自由能圖如圖4所示，本發明的牛幹擾素-a多肽基因的3' 端自由能圖如圖5所示，天然牛千擾素-a多肽基因的3'端自由能圖如圖6所 示；經RNAstructure (Version 4.3)軟體分析本發明牛幹擾素-a多肽基因5，端
自由能高於天然牛幹擾素-a多肽基因，而且在本發明牛幹擾素-oi多肽基因翻 譯起始區周圍的序列不形成明顯的二級結構，使翻譯起始調控元件易被核糖體 識別和結合，所以本發明的牛幹擾素-a多肽基因轉錄後mRNA的二級結構明 顯優於天然牛幹擾素-a多肽基因，提高牛幹擾素-a的mRNA翻譯活性。
本發明所比對用天然牛幹擾素-a多肽基因與天然牛幹擾素-oiA型基因同 源，相似性大於99%。


圖1是天然牛幹擾素-a多肽基因在大腸桿菌中密碼子分析結果圖，圖2 是本發明牛幹擾素-a多肽基因在大腸桿菌中密碼子分析結果圖，圖3是本發明 牛幹擾素-a多肽基因的5'端自由能圖，圖4是天然牛幹擾素-a多肽基因的5，端自由能圖，圖5是本發明牛幹擾素-ot多肽基因的3'端自由能圖，圖6是天 然牛幹擾素-a多肽基因的3，端自由能圖，圖7是圖1中A部放大圖，圖8是 圖1中B部放大圖，圖9是圖1中C部放大圖，圖IO是圖1中D部放大圖， 圖11是圖2中E部放大圖，圖11是圖2中F部放大圖，圖11是圖2中G部 放大圖，圖11是圖2中H部放大圖。
具體實施例方式
具體實施方式
一本實施方式牛幹擾素-a多肽基因序列如下所示
AAAGCTTTCGTCGC AAAG ATTAAGTCGAC 。
本實施方式牛幹擾素-(x多肽基因序列由上海生工生物工程技術服務有限 公司合成。
本實施方式中藉助DNAstar軟體推導基因的胺基酸序列，並根據胺基酸序 列藉助http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html在線密碼子分析工具推導大腸 桿菌優勢表達的基因序列。
本實施方式用RNAstmcture (Version 4.3)軟體設計基因5'末端及3，末端 自由能值，提高牛幹擾素-a多肽基因的mRNA的5，端自由能值，使得核糖體 結合位點區域二級結構簡單；並降低3，端自由能，使得3，端結構穩定性提高， 延長mRNA在體內的半衰期。
將本實施方式牛幹擾素-a多肽基因轉入原核無毒基因編碼物種特異性抗 性表達載體(pWL載體)，然後在大腸桿菌DH5ci中進行非融合表達，通過SDS-PAGE鑑定產物表達量。檢測結果顯示本實施方式牛幹擾素-a多肽基因在 大腸桿菌中進行了高效表達，蛋白表達量佔菌體總蛋白的30%以上(而天然的 牛幹擾素-a多肽基因連接到pWL載體中在大腸桿菌中則基本不表達)，說明 了本實施方式牛幹擾素-a多肽基因可以在大腸桿菌表達體系內高效表達。序列表
東北農業大學
—種牛幹擾素-a多肽基因
2
1 516 DNA 人工序列
CDS <222〉 (7)…(508)

牛幹擾素-ot多肽基因 〈400〉 1
gaattc atg tgc cat ctg ccg cat acc cat age ctg gcg aac cgt cgc gtg 51 Met Cys His Leu Pro His Thr His Ser Leu Ala Asn Arg Arg Val 15 10 15
ctg atg ctg ctg cag cag ctg cgt cgc gtg age ccg age age tgc ctg 99 Leu Met Leu Leu Gin Gin Leu Arg Arg Val Ser Pro Ser Ser Cys Leu
20 25 30
cag gat cgc aac gat ttt gaa ttt ctg cag gaa gcg ctg ggc ggt age 147 Gin Asp Arg Asn Asp Phe Glu Phe Leu Gin Glu Ala Leu Gly Gly Ser
35 40 45
cag ctg cag aaa gcg cag gcg att age gtg ctg cat gaa gtg acc cag 195 Gin Leu Gin Lys Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Val Thr Gin 50 55 60cat acc His Thr
65 3肪a_gc lys Ser 80
g3t Ctg
Asp Leu
ctg ctg Leu Leu
ctg acg Leu Thr
gtg gtg Val Val 145 cag gaa Gin Glu 160
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C3g
Gin
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cag gcg Gin Ala
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gaa gtg Glu Val
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3CC
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atg Met 150 aaa Lys
a_cc Thr
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ctg Leu
a&a Lys 135 cgc Arg
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gcg Ala
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gcg Ala
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cat His
Phe
age Ser
ctg
Leu
90
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Gly
cgc Arg
age Ser
ccg
Pro
75
gat
Asp
ctg Leu
aaa Lys
ccg Pro
gcg acc tgg gat 243 Ala Thr Trp Asp
age Ser
age Ser 155 gtcgac 516
cag cag Gin Gin
cgc ggc Arg Gly
tat Tyr
tgc Cys 140 昭c Ser
ttt Phe 125 gcg Ala
acc Thr
ctg Leu
gcg Ala 110
cat His
acc 291
Thr
95
ccg 339 Pro
cgt 387 Arg
tgg gaa 435 Trp Glu
aac ctg 483 Asn Leu
2 167 PRT <213〉人工序列
〈400〉 2
Met Cys His丄eu Pro His Thr His Ser Leu Ala Asn Arg Arg Val Leu 15 10 15
Met Leu Leu Gin Gin Leu Arg Arg Val Ser Pro Ser Ser Cys Leu Gin 20 25 30Asp Arg Asn Asp Phe Glu Phe Leu Gin Glu Ala Leu'Gly Gly Ser Gin
35 40 45
Leu Gin Lys Ala Gin Ala lie Ser Val Leu His Glu Val Thr Gin His
50 55 60
Thr Phe Gin Leu Phe Ser Thr Glu Gly Ser Pro Alei Thr Trp Asp Lys 65 70 75 80
Ser Leu Leu Asp Lys Leu Arg Ala Ala Leu Asp Gin Gin Leu Thr Asp
85 90 95
Leu Gin Ala Cys Leu Thr Gin Glu Glu Gly Leu Arg Gly Ala Pro Leu
100 105 110
Leu Lys Glu Asp Ser Ser Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe His Arg Leu
115 120 125
Thr Leu Tyr Leu Gin Glu Lys Arg His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val
130 135 140
Val Arg Ala Glu Val Met Arg Ala Phe Ser Ser Ser Thr Asn Leu Gin 145 150 155 160
Glu Ser Phe Arg Arg Lys Asp 16權利要求
1、一種牛幹擾素-α多肽基因，其特徵在於牛幹擾素-α多肽基因序列如下所示GAATTCATGTGCCATCTGCCGCATACCCATAGCCTGGCGAACCGTCGCGTGCTGATGCTGCTGCAGCAGCTGCGTCGCGTGAGCCCGAGCAGCTGCCTGCAGGATCGCAACGATTTTGAATTTCTGCAGGAAGCGCTGGGCGGTAGCCAGCTGCAGAAAGCGCAGGCGATTAGCGTGCTGCATGAAGTGACCCAGCATACCTTTCAGCTGTTTAGCACCGAAGGCAGCCCGGCGACCTGGGATAAAAGCCTGCTGGATAAACTGCGCGCGGCGCTGGATCAGCAGCTGACCGATCTGCAGGCGTGCCTGACCCAGGAAGAAGGCCTGCGCGGCGCGCCGCTGCTGAAAGAAGATAGCAGCCTGGCGGTGCGCAAATATTTTCATCGTCTGACGCTGTATCTGCAGGAAAAACGCCATAGCCCGTGCGCGTGGGAAGTGGTGCGCGCGGAAGTGATGCGCGCGTTTAGCAGCAGCACCAACCTGCAGGAAAGCTTTCGTCGCAAAGATTAAGTCGAC。
全文摘要
一種牛幹擾素-α多肽基因，它涉及一種牛幹擾素-α基因。它解決了目前牛幹擾素-α基因在原核表達體系內存在低表達和構建表達載體後轉錄的mRNA翻譯活性低的問題。本發明牛幹擾素-α多肽基因序列如SEQ ID NO1所示。本發明木糖還原酶基因序全長516bp，7bp處有起始密碼子ATG，508bp處有終止密碼子TAA，有504bp完整的開放閱讀框。本發明牛幹擾素-α多肽基因可以在原核表達系統中高效表達牛幹擾素-α成熟多肽。本發明的牛幹擾素-α多肽基因轉錄後mRNA的二級結構明顯優於天然牛幹擾素-α多肽基因，提高牛幹擾素-α的mRNA翻譯活性。
文檔編號C12N15/21GK101591659SQ200810064638
公開日2009年12月2日 申請日期2008年5月30日 優先權日2008年5月30日
發明者孫仰峰, 勐 李, 李文輝, 王君偉 申請人:東北農業大學