用於細胞重編程的組合物及其用途的製作方法

2023-10-18 01:11:54

專利名稱：：用於細胞重編程的組合物及其用途的製作方法用於細胞重編程的組合物及其用途相關申請的交互引用本申請要求2006年7月19日提交的美國臨時專利申請第60/832,070號的權益，其全部內容通過引用完整併入本申請。對聯邦政府資助的研究下的發明權益的聲明本工作受到美國國立衛生研究院(NationalInstitutesofHealth)的下列資助金的資助第DK064054號和第DK071831號資助金。(美國)政府享有本發明的某些權益。
背景技術：
：因為目前用於治療1型糖尿病(T1D)的方法不可有效預防長期併發症，研究者正尋求可選的治療方法，包括使用胰島素生成細胞(IPC)來恢復血糖正常。儘管可以通過植入功能性(3細胞來治療T1D,但是胰島的植入因犧牲供體胰島和需要終生的免疫抑制治療來減少移植排斥危險而受到阻礙。為了治療1型糖尿病，研究者正積極尋求用於實現幹細胞向生成胰島素的胰腺P細胞子代(IPC)的定向分化的可靠策略。使用重組DNA技術的基因調控是將幹細胞定向分化為所需譜系、特別是關於肝臟至內分泌胰腺轉分化的非常有前景的方法。該方法已經用於在體外和體內實驗中從肝細胞和肝臟幹細胞產生IPC。儘管這些研究提供了使用肝臟作為潛在的自體供體細胞用於1型糖尿病治療中的細胞治療的重要前景，但是已經證明人類臨床治療中使用基因操作受到爭議。因此，迫切需要不依賴於基因治療的用於產生胰島素生成細胞的組合物和方法。
發明內容如下文所述，本發明的特徵是用於治療或預防以感興趣的細胞(例如胰腺細胞)的數量或生物活性缺乏為特徵的疾病、紊亂或損傷(例如jf唐尿病)的治療方法。一方面，本發明提供了一種用於細胞(例如成體細胞或胚胎幹細胞)重編程的方法，所述方法涉及使成體細胞接觸融合或包含蛋白轉導結構域的轉錄因子多肽或其片段，並且改變成體細胞中至少一種多肽(例如胰腺轉錄因子多肽)的表達水平，由此使得該細胞重編程。另一方面，本發明提供了一種用於產生胰島素生成細胞的方法，所述方法涉及使細胞(例如成體細胞或胚胎幹細胞)接觸與蛋白轉導結構域融合的胰腺轉錄因子或其片段，並且增加該細胞中胰島素的表達，由此產生胰島素生成細胞。又一方面，本發明提供了一種用於誘導胰島素生成細胞再生的方法，所述方法包括使胰腺細胞接觸包含Pdx-l多肽、VPA16激活結構域以及蛋白轉導結構域的融合蛋白或其生物活性片段，由此誘導胰腺細胞再生。又一方面，本發明提供了一種用於產生胰島素生成細胞的方法，所述方法包括使肝臟衍生細胞接觸包含Pdx-l多肽、VP16激活結構域以及蛋白轉導結構域的融合蛋白或其生物活性片段，由此產生胰島素生成細胞。在一個實施方案中，使肝臟衍生細胞體外或體內接觸。在另一個實施方案中，經門靜脈或經其分枝提供所述融合蛋白，使得所述融合蛋白定向肝臟的特定葉。在又一個實施方案中，通過肝臟衍生細胞的轉分化來產生胰島素生成細胞。又一方面，本發明提供了一種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法涉及^f吏所述受治療者的成體細胞接觸與蛋白轉導結構域融合的胰腺轉錄因子或其片段，並且增加所述成體細胞中胰島素表達，由此產生胰島素生成細胞。又一方面，本發明提供了一種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治療者的成體胰腺細胞接觸包含Pdx-l多肽、VP16激活結構域以及蛋白轉導結構域的融合蛋白或其生物活性片段，並且誘導所述成體胰腺細胞再生，由此改善所述受治療者的高血糖。又一方面，本發明提供了一種改善有需要的受治療者(例如患有1型或2型糖尿病的人或動物患者)的高血糖的方法，所述方法包括使肝臟衍生細胞接觸包含Pdx-l多肽、VP16激活結構域以及蛋白轉導結構域的融合蛋白或其生物活性片段，並產生胰島素生成細胞，由此改善所述受治療者的高血糖。在一個實施方案中，所述肝臟衍生細胞是肝細胞或肝臟衍生的千細胞。在又一個實施方案中，在接觸所述融合蛋白之前細胞不能表達可檢測水平的胰島素。在又一個實施方案中，所述方法減低所述受治療者的血糖水平。在又一個實施方案中，所述方法使得所述受治療者的血糖水平正常。在又一個實施方案中，所述方法還包括進行有效量的包含Ngn3多肽、蛋白轉導結構域的融合蛋白或其生物活性片段的給藥。另一方面，本發明提供了一種含有或基本組成為與早期或晚期胰腺轉錄因子(例如，Pdx-l、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll以及Pax6)具有至少85%、90%、95%或甚至100%的胺基酸同一性的多肽以及蛋白轉導結構域(例如，HIV-1TATPTD結構域、聚精氨酸序列、VP22結構域或觸角足(antennapedia)蛋白轉導結構域)的融合多肽、其類似物或片段，其中所述融合蛋白在細胞中的表達相對於相應對照細胞改變至少一種多肽的表達。在一個實施方案中，所述融合多肽還包括單純皰滲病毒VP16(//erp^Wmp/exvirusVP16);敫活結構i或或其片l爻或類似物，用於純化的序列標籤(例如六組氨酸標籤)，或特別結合抗體的抗原結構域(例如V5結構域)。在又一個實施方案中，所述融合多肽包含或基本組成為人類Pdx-l多肽或其片段，單純皰滲病毒VP16激活結構域，以及蛋白轉導結構域，或其生物活性片段。又一方面，所述融合多肽含有胰腺轉錄因子啟動子和可檢測結構域。在多個實施方案中，所述啟動子選自Pdx-l、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll以及Pax6中的任一種或多種，在其他實施方案中，所述可^r測結構域選自綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、葡萄糖醛酸糖苦酶(GUS)、螢光素酶、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)以及P-半乳糖苷酶中的任一種或多種。在其他實施方案中，所述多肽還包含促進多肽純化的胺基酸序列標籤，例如六組氨酸標籤或GST。在其他方面，本發明提供了包含編碼任何前述方面的多肽的核酸序列的表達載體。在一個實施方案中，所述載體含有操作性連接所述核酸序列的啟動子。在一個實施方案中，所述啟動子被定位用於細菌或哺乳動物細胞中的表達。又一個方面，本發明提供了一種包含任何前述方面的表達載體的宿主細胞。在一個實施方案中，所述細胞是原核或真核細胞。在其他實施方案中，所述細胞選自細菌細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞以及酵母細胞中的任何一種或多種。又一方面，宿主細胞(例如，哺乳動物細胞、人類細胞)含有任何前述方面的融合多肽。在又一些其他實施方案中，所述細胞選自下述細胞中的任一種或多種脂肪細胞、骨髓衍生細胞、表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、肝細胞、肌細胞、神經元、胰腺細胞和它們的祖細胞或幹細胞。在其他實施方案中，所述宿主細胞還包含第二融合多肽，例如含有Ngn3和蛋白轉導結構域的融合多肽，或其生物活性片段。又一方面，本發明提供了一種包含任何前述方面的宿主細胞的組織。又一方面，本發明提供了一種包含任何前述方面的宿主細胞的器官。又一方面，本發明提供了一種包含任何前述方面的宿主細胞的基質。又一方面，本發明提供了一種用於產生任何前述方面的重組多肽的方法，其包括提供一種使用任何前述方面的被定位在細胞中表達的分離的核酸分子轉化的細胞；在用於表達所述核酸分子的條件下培養所述細胞；以及分離所述多肽。又一方面，本發明提供了一種藥物組合物，其包含於藥學上可接受的賦形劑中的有效量的任何前述方面的多肽或前述方面的宿主細胞。在其他實施方案中，所述組合物還含有有效量的包含Ngn3胺基酸序列和蛋白質轉導結構域或其生物活性片段的融合多肽。又一方面，本發明提供了一種包裝的藥物，所述藥物包含任何前述方面的多肽或任何前述方面的宿主細胞；和4吏用所述多肽或細胞改善受治療者的高血糖(例如，與1型或2型糖尿病有關的高血糖)的說明書。又一方面，本方面提供了一種用於治療高血糖(例如，與1型或2型糖尿病有關的高血糖)的藥盒，所述藥盒包含有效量的任何前述方面的融合多肽或任何前述方面的宿主細胞，及其使用說明書。又一方面，本方面提供了一種腺病毒相關病毒(AAV)載體，其包含Pdx-l、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6以及MafA中任何一種或多種的胰腺轉錄因子，其中所述多肽可操作地連接用於被定位在哺乳動物細胞中表達的啟動子。又一方面，本發明提供了一種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治療者的一種細胞接觸前述方面的AAV載體並且誘導所述細胞表達胰島素，由此改善所述受治療者的高血糖。又一方面，本發明提供了一種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治療者的肝臟衍生細胞接觸前述方面的AAV載體並且誘導所述細胞表達胰島素，由此改善所述受治療者的高血糖。又一方面，本發明提供了一種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治療者的一種細胞接觸前述方面的AAV載體並且誘導所述細胞表達胰島素，由此改善所述受治療者的高血糖。又一方面，本發明提供了一種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法涉及使所述受治療者的肝臟書f生細胞4妄觸前述方面的AAV載體並且誘導所述細胞表達胰島素，由此改善所述受治療者的高血糖。又一方面，本發明提供了一種宿主細胞(例如，成體細胞、胚胎幹細胞、肝細胞或胰腺細胞)，所述宿主細胞包含前述方面的AAV載體或多肽(例如融合多肽)。在一個實施方案中，所述細胞是下述細胞中的一種或多種脂肪細胞、骨髓衍生細胞、表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、肝細胞、肌細胞、神經元、胰腺細胞或它們的祖細胞或幹細胞。又一方面，本發明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含於藥學上可接受的賦形劑中的有效量的腺病毒載體。又一方面，本發明提供了一種治療受治療者的糖尿病的方法，所述方法包括使所述受治療者接觸有效量的Pdxl多肽，以誘導Pdxl、INGAP、Reg3d、Reg3g以及胰腺炎相關蛋白Pap中的任何一種或多種基因在所述受治療者組織中的表達，由此治療糖尿病。在一個實施方案中，表達增加是下述情況中的一種或多種Pdxl增加約3-4倍，INGAP表達增加約14-15倍，Reg3d表達增加約7-8倍，Reg3g增加約6-7倍，以及胰腺炎相關蛋白Pap增加30-35倍。在又一個實施方案中，所述方法增加Pdxl、胰島素I、胰高血糖素、彈性蛋白酶、IAPP、胰島素II、促生長素抑制素、NeuroD、Isl-l以及胰腺外分泌基因p48和澱粉酶中任何一種或多種的表達。在又一個實施方案中，至少兩種、三種、四種或五種基因的表達增加。在又一個實施方案中，所有這些基因的表達都增加。又一方面，本發明提供了一種誘導有需要的受治療者中胰島卩細胞再生的方法，所述方法包括將有效量的Pdxl蛋白給藥至所述受治療者並且誘導胰島(3細胞再生。在一個實施方案中，進行至少約l-5mg/kg體重的PDX1的給藥。在另一個實施方案中，經靜脈系統或腹腔系統進行PDX1的給藥。在另一個實施方案中，所述方法增加胰島素水平至少約l-20倍。在另一個實施方案中，PDX1的給藥增加Pdxl、INGAP、Reg3d、Reg3g、胰腺炎相關蛋白Pap、胰島素I、胰高血糖素、彈性蛋白酶、IAPP、胰島素II、促生長素抑制素、NeuroD、Isl-l以及胰腺外分泌基因p48和澱粉酶中任何一種或多種的表達。在又一些其他方面，本發明提供了宿主細胞(例如，成體細胞、胚胎幹細胞、肝細胞或胰腺細胞)和藥物組合物，所述宿主細胞包含AAV載體，所述藥物組合物包含於藥學上可接受的賦形劑中的有效量的所述載體或細胞。在任何前述方面的多個實施方案中，所述細胞是下述任意一種或多種的成體細胞(例如肝細胞或肝臟衍生細胞)脂肪細胞、骨髓衍生細胞、表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、肝細胞、肌細胞、神經元、胰腺細胞以及它們的祖細胞或幹細胞。在又一些其他實施方案中，使所述細胞體外或體內接觸。在任何前述方面的又一些其他實施方案中，16改變是在相應的對照細胞中不可檢測地表達的多肽水平的增加(例如5%、10%、25%、50%、75%、85%、95%或更多)。在又一些其他實施方案中，重編程細胞表達胰島素。在任何前述方面的多個實施方案中，轉錄因子是Pdx-l、Pdx-l/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6以及MafA中的任何一種或多種。在又一些其他實施方案中，所述細胞是體外或體內接觸的胚胎細胞或成體胰腺細胞。在任何前述方面的又一些其他實施方案中，所述接觸增加了胰島素生成細胞的數量。在其他實施方案中，所述"l妄觸通過複製或新生增加了再生。在其他實施方案中，所述方法還包括使所述細胞接觸一種融合蛋白，所述融合蛋白包含Ngn3和蛋白轉導結構域或其生物活性片段。在又一些其他實施方案中，所述方法還包括獲得所述多肽的步驟。在任何前述方面的又一些其他實施方案中，所述給藥方法提供了一種或多種胰腺轉錄因子的順序給藥，包括下述的任何一種或多種給藥進行有效量於細胞中的Pdxl蛋白的給藥至少約0-4天(例如，0天、1天、2天、3天或4天)；進行接下來的Ngn3的給藥，使得有效量的Ngn3存在至少約2-6天(例如，2天、3天、4天、5天或6天)；進行接下來的Pax4的給藥，使得有效量的Pax4存在至少約4-8天(例如，4天、5天、6天、7天、8天)；持續進行Pdxl的給藥，使得有效量的Pdxl維持於細胞中，其中在Pax4存在於細胞中的同時進行Pdxl的給藥。在任何前述方面的又一些其他實施方案中，所述融合蛋白含有或基本組成為作為早期因子或晚期因子(例如，Pdx-l、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6、MafA)的胰腺轉錄因子(例如人類或小鼠)。在又一些其他實施方案中，任何前述方面的所述融合蛋白與參考序列具有至少85%、90%或95%的同一性，其中序列比較是多肽或肽片段的總長度。具體地，本發明提供了用於1型和2型糖尿病的蛋白治療。從具體實施方式和權利要求來看，本發明的其他特徵和優點將顯而易見。定義"胰腺和十二指腸同源框-l(Pdx-1)多肽"是指與GenBank登錄號NP_032840、AAI11593提供的序列或NM008814編碼的序列具有至少85%同源性並且具有DNA結合或轉錄調控活性的蛋白或其片段。"胰腺和十二指腸同源框-l(Pdx-1)"核酸序列是指編碼PDX-1的核酸序列。典型的pdx-l核酸序列包括BC111592和NM_008814。"NeuroDl多肽"是指神經原分化蛋白1或其片段，其與GenBank登錄號NP—002491或NP—035024提供的序列具有至少85%同源性並且具有DNA結合或轉錄調控活性。"NeuroDl核酸分子"是指編碼NeuroDl多肽的多核苷酸或其片段。典型的NeuroDl核酸分子包括NM_002500和NM—010894。"神經元素3(Neurogenin3)多肽"是指與GenBank登錄號AAK15022或AAI04328提供的序列具有至少85%同源性並且具有DNA結合或轉錄調控活性的蛋白或其片段。"神經元素3核酸分子"是指編碼神經元素3多肽或其片段的多核苷酸或其片段。典型的神經元素3核酸分子包括AF234829和BC104327。"Pax4多肽"是指與GenBank登錄號AAI07151或NP一035168提供的序列具有至少85%同源性並且具有DNA結合或轉錄調控活性的蛋白或其片段。"Pax4核酸分子"是指編碼Pax4多肽的多核苦酸或其片段。典型的Pax4多肽包括NMJ)11038和BC107150。"成體細胞"是指非衍生自胚胎或生殖細胞的體細胞。"誘導再生"是指誘導細胞、組織或器官的發生。再生的方法包括但不限於新生、複製、細胞增殖、轉分化，或涉及產生類似感興趣的細胞的其他細胞的任何其他方法。"蛋白轉導結構域"是指促進蛋白進入細胞或細胞器的胺基酸序列。典型的蛋白轉導結構域包括但不限於最小的十一胺基酸多肽(unidecapeptide)蛋白轉導結構域(對應於包含YGRKKRRQRRR的HIV-1TAT的殘基47-57)、包含足夠引導進入細胞的多個精氨酸(例如，3、4、5、6、7、8或9個精氨酸)的聚精氨酸序列、VP22結構域(Zender等，CancerGeneTher.2002Jun;9(6):489-96),以及觸角足蛋白轉導結構域(Noguchi等,Diabetes(《糖尿病》)2003;52(7):1732-1737)。另外，參見NatBiotechnol.(《自然生物技術》)2001年12月；19(12):1173-6。"重編程"是指改變細胞使得在重編程細胞中產生在重編程之前在該細胞中(或在相應的對照細胞中)不產生的至少一種蛋白產物。通常，重編程細胞具有改變的轉錄或翻譯模式，使得重編程細胞表達在重編程之前在該細胞中(或在相應的對照細胞中)不表達的一系列蛋白。"肝臟衍生細胞"是指衍生自肝臟的任何細胞。這樣的細胞包括肝細胞、肝臟幹細胞、肝細胞的原代或永生培養物，或獲得自肝臟的任何其他糹田胞。"胰腺轉錄因子"是指在胰腺組織中表達的任何轉錄因子。典型的胰腺轉錄因子包括但不限於Pdx-l、Pdx-l/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2(小鼠NM—010919、NP—035049，人類C075092、AAH75092)、Nkx6.1(小鼠NP—659204、AF357883,人類P78426、NM_006168)、Isll(小鼠NM—021459、NP_067434,人類NM—002202、NP—002193)、Pax6(小鼠BC036957、AAH36957，人類NP_000271、BC011953),以及MafA[(v-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A)(人類NP—963883、NM_201589，小鼠NP一919331、NM—194350)]。"轉分化"是指細胞中這樣一種變化，即使得轉分化的細胞表達通常在該細胞中不表達的至少一種感興趣的蛋白的變化。例如，轉分化為胰島素生成細胞表型的肝細胞表達胰島素或胰高血糖素。"VP16激活結構域"是指當其與感興趣的序列拼接時增加轉錄的衍生自單純皰滲病毒的胺基酸序列。典型的VP16激活結構域描述於例如Sadowski,I"Ma,J"Triezenberg，S.和Ptashne，M.(1988)。GAL4-VP16isanunusuallypotenttranscriptionalactivator.(GAL4-VP16是一種顯著有效的轉錄激活因子。)Nature(《自然》)335,563-564;和Triezenberg,S.J.,Kingsbury,R.C.和McKnight，S.L.(1988).FunctionaldissectionofVP16(VP16的功能性吾'J才斤),thetrans-activatorofherpessimplexvirusimmediateearlygeneexpression.(單純皰滲病毒即早基因表達的反轉激活因子)，GenesDev.(《基因與發育》)2,718-729。圖18G顯示了一種典型的VP16激活結構域。"改變"是指基因或多肽的表達水平變化(增加或減少)，如通過如上所述的那些本領域已知的標準方法所檢測的。如本文所使用的，改變包括表達水平變化10%,優選表達水平變化25%，更優選變化40%,以及最優選變化50%或更大。"類似物"是指具有參考多肽或核酸分子的功能的結構相關的多肽或核酸分子。"化合物"是指任何小分子化合物、抗體、核酸分子或多肽，或其片段。在該7>開內容中，"包含"、"包括"、"含有"、"具有"等具有美國專利法中賦予它們的含義，且可指"嚢括"、"涵蓋"等，"基本由......組成"、"基本組成為"等具有美國專利法中賦予它們的含義，該術語為開放式的，允許多於所引用的事項的存在，只要所引用的事項的基本或新穎特徵不因多於所引用的事項的存在而改變，但排除現有技術的實施方案。"可檢測的標記物"是指當與感興趣的分子連接時，使得後者可經分光鏡、光化學、生物化學、免疫化學或化學方法檢測的組合物。例如，有用的標記物包括放射性同位素、磁珠、金屬珠、膠粒、螢光染料、高電子密度試劑、酶(例如，通常用於ELISA的酶)、生物素、洋地黃毒苷或半抗原。"標記的核酸或多肽"是這樣的核酸或多肽即通過連接鍵或化學鍵與標記物共價連接，或通過離子鍵、範德華力、靜電吸引、疏水相互作用或氫鍵與標記物連接，使得核酸或探針的存在可通過檢測與所述核酸或探針連接的標記物的存在而4全測的核酸或多肽。"有效量"是指相對於未治療的患者改善疾病的症狀所需要的製劑的量。用於實施本發明來治療性治療疾病的活性化合物的有效量根據給藥的方式、受治療者的年齡、體重以及一般健康狀況而不同。最終，主治醫師或獸醫將決定合適的量和給藥方案。這樣的量被稱為"有效"量。"片段"是指多肽或核酸分子的一部分。該部分包含參考核酸分子或多肽的整個長度的優選至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。片段可含有IO、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個核苷酸或胺基酸。"融合蛋白"是指合併至少兩個非天然連續的胺基酸序列的蛋白質。"同一性"是指感興趣的序列和參考序列之間的胺基酸或核酸序列的同一性。序列同一性通常使用序列分析軟體(例如，威斯康辛大學生物技術中心基因計算機組的序列分析軟體包(威斯康辛大學麥迪遜分校大學路1710號，53705),BLAST、BESTFIT、GAP或PILEUP/PRETTYBOX程序)測量。這些軟體通過將同源性程度分配至不同的置換、刪除和/或其他修飾而將同一或相似的序列進行配對。保守置換通常包括下列組內的置換甘氨酸，丙氨酸；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天門冬氨酸，穀氨酸，天門冬醯胺，穀氨醯胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；以及苯丙氨酸，酪氨酸。在確定同一性程度的一個典型的方法中，使用BLAST程序，e^和e—腦之間的概率分值表示密切相關的序列。"雜交"是指於不同的嚴謹性條件下在互補多核苷酸序列(例如，表l和2中所列的基因)或其部分之間配對形成雙鏈分子。(見，例如Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987)MethodsEnzymol.152:399;Kimmel,A.R.(1987)MethodsEnzymol.152:507)。例如，嚴謹的鹽濃度通常為小於約750mM的NaCl和75mM的枸櫞酸鈉，優選小於約500mM的NaCl和50mM的枸櫞酸鈉，以及最優選小於約250mM的NaCl和25mM的枸櫞酸鈉。低嚴謹性雜交可在不存在有機溶劑(例如曱醯胺)的情況下獲得，而高嚴謹性雜交可在至少約35%曱醯胺的存在下，最優選至少約50%甲醯胺的存在下獲得。嚴謹的溫度條件通常包括至少約30。C的溫度，更優選至少約37。C,以及最優選至少約42。C。不同的其他參數，諸如雜交時間、洗滌劑例如十二烷基硫酸鈉(SDS)的濃度、以及載體DNA的包含或排除為本領域技術人員公知。不同的嚴謹性程度通過合併所需的這些不同條件而實現。在一個優選的實施方案中，在30。C於750mMNaCl、75mM枸櫞酸鈉以及1%SDS中進行雜交。在一個更優選的實施方案中，在37。C於500mMNaCl、2150mM枸求彖酸鈉、1%SDS、35%甲醯胺以及100pg/ml變性的鮭4青DNA(ssDNA)中進行雜交。在一個最優選的實施方案中，在42。C於250mMNaCl、25mM枸櫞酸鈉、1%SDS、50%甲醯胺以及200嗎/mlssDNA中進行雜交。關於這些條件的有用的變更為本領域技術人員顯而易見。對於大多數應用來說，雜交之後的洗滌步驟還將在嚴謹性上不同。洗滌的嚴謹性條件可由鹽濃度和溫度來定義。如上所述，洗滌的嚴謹性可通過降低鹽濃度或增加溫度而增加。例如，洗滌步驟的嚴謹鹽濃度優選為小於約30mM的NaCl和3mM的枸櫞酸鈉，最優選小於約15mM的NaCl和1.5mM的枸櫞酸鈉。洗滌步驟的嚴謹溫度條件通常包括至少約25。C的溫度，更優選至少約42。C,最優選至少約68。C。在一個優選的實施方案中，在25。C於30mMNaCl、3mM枸櫞酸鈉以及0.1%SDS中進4亍洗滌步驟。在一個更優選的實施方案中，在42。C於15mMNaCl、1.5mM枸櫞酸鈉以及0.1。/。SDS中進行洗滌步驟。在一個最優選的實施方案中，在68。C於15mMNaCl、1.5mM枸櫞酸鈉以及0.1%SDS中進行洗滌步驟。關於這些條件的其他變更為本領域技術人員顯而易見。雜交技術為本領域4支術人員/^知，且描述於例如Benton和Davis(Science196:180，1977);Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA(《美國科學院院刊》)72:3961，1975);Ausubel等(CurrentProtocolsinMolecularBiology(《現代分子生物學實驗技術》)，WileyInterscience,紐約，2001);Berger和Kimmel(GuidetoMolecularCloningTechniques(《分子克隆4支術指南》),1987，學術出版社，紐約)；以及Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆實-驗室手冊》)，冷泉港實-驗室出版社，紐約。"增加或減少，，是指積極或消極的改變。這樣的改變為參考值的5%、10%、25%、50%、75%、85%、90%或甚至100%。"分離的核酸分子"是指脫離基因的核酸(例如DNA)，其在本發明的核酸分子所來源的生物的天然存在的基因組中側鄰該基因。其術語包括例如摻入載體的重組DNA;摻入自動複製質粒或病毒的重組DNA;或摻入原核或真核生物的基因組DNA的重組DNA;或作為獨立於其他序列的分離的分子存在的重組DNA(例如，通過PCR或限制性內切酶消化產生的cDNA或基因組片段或cDNA片段)。另外，該術語包括自DNA分子轉錄的RNA分子，以及作為編碼另外的多肽序列的雜交基因的一部分的重組DNA。"分離的多肽"是指與天然伴隨的組分分離的本發明的多肽。通常，當所述多肽至少60%重量脫離蛋白質和天然伴隨的天然存在的有機分子時被分離。在一個實施方案中，製備物為至少75%、85%、90%、95%或至少99%重量的本發明多肽。本發明的分離的多肽可通過下述方式獲得例如，從天然來源提取，通過編碼這樣的多肽的重組核酸表達，或通過化學合成蛋白質。可通過任何合適的方法來測量純度，例如，柱層析、聚丙烯醯胺凝膠電泳或HPLC分析。"標誌物"是指具有與疾病或紊亂相關的表達水平或活性改變的任何蛋白質或多核苷酸。"基質"是指提供一種或多種細胞的存活、增殖或生長的介質。在一個實施方案中，基質是包含可生物降解的介質的細胞支架。"天然存在"是指在生物體細胞中內源性表達。"獲得多肽"中的"獲得"是指合成、購買或其它方式獲取多肽。"可操作地連接"是指第一多核苷酸被定位鄰近第二多核香酸，當合適的分子(例如轉錄激活蛋白)結合所述第二多核香酸時所述第二多核苷酸指導所述第一多核苷酸的轉錄。"多肽"是指任何胺基酸鏈，不管長度或翻譯後修飾。"被定位用於表達"是指本發明的多核苷酸(例如DNA分子)被定位鄰近DNA序列，指導該序列的轉錄和翻譯(即，促進例如本發明的重組多肽或RNA分子的產生)。"啟動子"是指足夠指導轉錄的多核苷酸。典型的啟動子包括位於翻譯起始位點上遊(例如，立即上遊)的具有100、250、300、400、500、750、900、1000、1250以及1500個核苷酸長度的核酸序列。"受治療者"是指哺乳動物，包括但不限於人類或非人類哺乳動物，諸如牛、馬、犬、羊或貓。如本文所使用的，術語"治療"是指減輕或改善紊亂和/或與其相關的症狀。應理解，儘管未排除，但治療紊亂或異常狀況不需要所述紊亂、異常狀況或與其相關的症狀完全消除。"改善"是指減輕、抑制、減小、減弱、遏制或穩定疾病的發展或進展。如本文所使用的，術語"預防"、"預防性治療"等是指減小不患有病症或異常狀況但處於患有紊亂或異常狀況的危險中或易於發展紊亂或異常狀況的受治療者發展紊亂或異常狀況的概率。"參考"是指標準或對照條件。圖1A和1B是示意圖。圖1A顯示了胰島轉錄因子在發育中的胰腺內分泌分化中的作用的簡化模型。各TF的推薦位置基於其表達時間點和顯著的功能性作用的時間點或二者皆有。圖1B顯示了蛋白轉導結構域(PTD)融合蛋白的結構。圖2A、2B和2C顯示了通過考馬斯藍染色(圖2A)的PTD-Ngn3-V5融合蛋白，使用抗V5抗體(1:5000)的蛋白質印跡(Westernblot)(圖2B),和通過考馬斯藍染色的有或無PTD結構域的PTD-Ngn3-V5融合蛋白。細菌裂解物存在於第1和第2泳道中，Ni-NTA純化的PTD-Ngn3-V5融合蛋白存在於第3泳道中，通過箭號指示它們的位置。圖3A至3D顯示了PTD-Ngn3融合蛋白的分析。圖3A是顯示分析融合蛋白的細胞轉導時程的蛋白質印跡。圖3B包括顯示已轉導融合蛋白的培養物中的細胞的兩張顯樣i照片。左側為使用相差顯示的細胞，右側為使用螢光顯示的細胞。螢光圖像顯示PTD-Ngn3融合蛋白的細胞間局限化。圖3C顯示了PTD-Ngn3在培養基中的穩定性。圖3D是蛋白質印跡，顯示了Ngn3融合蛋白保留其生物功能並能夠誘導NeuroD和Pax4耙基因表達。圖4A和4B是顯示可溶和不可溶的PTD-Ngn3融合蛋白純化的考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠。圖5A和5B是分別顯示Pdxl和PTD-PDX1融合蛋白純化的考馬斯藍染色的SDS-PAGE凝膠和曲線圖。圖5B顯示可溶的PTD-Pdxl融合蛋白的腹腔內注射恢復糖尿病小鼠的血糖量正常。圖6是曲線圖，顯示血糖攻擊試驗對於接受PTD-Pdxl融合蛋白腹腔內注射的糖尿病小鼠的影響、對於接受PTD-GFP融合蛋白的對照糖尿病小鼠的影響或對於正常小鼠的影響。PTD-Pdxl融合蛋白腹腔內注射恢復了糖尿病小鼠響應血糖攻擊(二乘線)的能力。圖7A和7B顯示了PTD-Pdx-l蛋白腹腔內注射對於90%胰切除術小鼠的血糖水平的作用。圖7A是曲線圖，顯示了接受PTD-Pdxl注射的小鼠表現在接受注射的幾天內血糖水平降低。當所述融合蛋白的注射停止時，該作用最終消失。圖7B包括兩張顯微照片，顯示了經腹腔內注射給藥至糖尿病小鼠的PTD-PdxlVP16促進胰腺p細胞再生。從接受PTD-GFP(圖7B-a)或PTD-Pdxl-VP16(圖7B-b)的小鼠所取的胰腺切片使用抗pHH3(磷光體-組蛋白H3蛋白，紅色)抗體和抗胰島素(綠色)抗體進行雙免疫染色。通過Dapi染色以藍色突顯細胞核。圖7B-a和7B-b顯示許多陽性染色的有絲分裂細胞存在於接受PTD-Pdxl-VP16或Pdxl注射的小鼠的胰腺胰島內(箭號)和胰島外。相比之下，在接受PTD-GFP注射的小鼠的胰島內(圖7B-a,箭號)未觀察到有絲分裂(染色)細胞，且在胰島外稀有細胞。圖8是曲線圖，顯示了PTD-PdxlVP16融合蛋白的腹腔內注射改善鏈唑黴素(Stz)誘導的糖尿病小鼠的高血糖。圖9是曲線圖，顯示了PTD-PdxlVP16融合蛋白和PTD-Ngn3融合蛋白的腹腔內注射逆轉鏈唑黴素(Streptozotocin)誘導的糖尿病小鼠的高血糖。圖10A和10B是顯微照片，顯示了PTD-Pdxl-VP16蛋白的腹腔內注射促進胰腺p細胞的穩健再生。圖10A顯示了在完整胰腺切片中胰島素免疫染色突顯的胰島素陽性的胰島p細胞。圖10B顯示了在不同尺寸(小到大)的胰島中胰島素免疫染色的高倍鏡視圖。某些僅顯示單個的胰島素+細胞。圖11A-11D是顯微照片。圖11A顯示了胰腺的胰島(3細胞中的胰島素染色。圖11B顯示了胰島素陽性細胞存在於接受PTD-Pdxl-VP16融合蛋白腹腔內注射的小鼠肝臟中。圖11C是顯示第二抗體對照的切片，顯示染色為特異性。圖11D顯示了無胰島素染色存在於接受PTD-GFP對照融合蛋白腹腔內注射的,J、鼠的肝臟切片。圖12顯示了接受PTD-Pdxl-VP16和PTD-Ngn3腹腔內注射的小鼠在注射後第27天的肝臟切片中胰島素生成細胞(IPC)的四張顯^f鼓照片。不同的生成胰島素的肝細胞存在於肝臟切片中(共1-2%)。圖13A和13B顯示了AAV胰腺轉錄因子對鏈唑黴素誘導的糖尿病小鼠血糖水平的作用。圖13A顯示了在接受AAV-GFP注射(&108病毒顆粒)的小鼠肝臟切片中的GFP蛋白表達。約20%的肝細胞表達GFP蛋白，但分布不均勻。圖13B是曲線圖，顯示了接受AAV-Ngn3門靜脈注射的小鼠的血糖水平(三角形線)、接受AAV-Pdx-l-VP16門靜脈注射的小鼠的血糖水平(菱形線)或接受AAV-Pdx-l-VP16和Ngn3門靜脈注射的小鼠的血糖水平(正方形線)。在接受AAV-Pdx-l-VP16和Ngn3注射的小鼠中觀察到協同作用。圖14顯示了一隻接受AAV-Pdxl-VP16門靜脈注射(左小圖)的小鼠和一隻接受AAV-Ngn3門靜脈注射(右小圖)的小鼠(各lx108的病毒顆粒)的肝臟切片中的胰島素陽性細胞。大多數IPC分布於肝包膜下。圖15顯示了一隻接受AAV-PV/AAV-Ngn3門靜脈注射(各lx108的病毒顆粒)的小鼠的肝臟切片中存在胰島素陽性細胞。左上，胰島陽性對照、。圖16包括四張顯孩i吸片，顯示了一隻接受AAV-PV/AAV-Ngn3門靜脈注射的小鼠的肝臟切片中的胰高血糖素免疫染色。圖17A和17B為示意圖，顯示了胰腺轉錄因子的順序表達。圖18A-181為胰腺轉錄因子的胺基酸和核酸序列。圖19A和19B顯示了腹腔內注射後rPdx1的體內動力學和組織分布。圖19A是顯示血液Pdxl水平的動力學的蛋白質印跡。以rPdxl蛋白(100嗎/只小鼠)腹腔內注射正常的Balb/c小鼠。在指定時間採集血液樣品，將20|il血清/泳道裝載於SPDS-PAGE凝膠內。使用抗抗體通過蛋白質印跡檢測rPdxl蛋白。圖19B顯示了12幅小圖，顯示Pdxl的體內組織分布的免疫組織化學分析。在rPdxl(100嗎/只小鼠)腹腔內注射之後1小時或24小時收穫肝臟、胰腺以及腎臟組織，並且於10%福馬林中固定。使用抗Pdxl抗體(1:2000)對石蠟切片進行免疫染色。在治療後l小時(上兩行)和24小時(下三行)通過光學顯微鏡檢查觀察Pdxl蛋白在肝臟(1、4以及7)、胰腺(2、5以及8)以及腎臟(3、6以及9)器官中的典型分布模式。底行(10-12)是正常小鼠的肝臟、胰腺以及腎臟組織切片的Pdxl免疫染色。圖lB-2的箭號表示具有強細胞核Pdxl免疫染色的胰腺中的小胰島。圖19C是示意圖，顯示了用於產生本文所述的結果的實驗性時間線。該時間線概括在這裡。首先測試評價正常小鼠中血糖基線、葡萄糖攻擊胰島素釋放(15分鐘)、腹腔內葡萄糖耐量試驗(IPGTT)以及肝臟和胰腺組織胰島素。然後通過低劑量的鏈唑黴素5x腹腔內注射誘導小鼠成糖尿病。定期監測空腹血糖水平，並將兩次連續讀數大於250mg/dL的血糖水平定義為糖尿病(高血糖)。測量某些糖尿病小鼠的葡萄糖攻擊的胰島素釋放，以評價這些糖尿病小鼠中的殘留胰腺(3細胞處理葡萄糖衝擊的能力。使用純化的Pdxl或PTD-GFP融合蛋白(100嗎/只小鼠/次注射)每天一次腹腔內注射糖尿病小鼠連續10天，並以指定頻率監測血糖水平。在蛋白注射的首劑後第14天左右、在IPGTT檢測之後以及在IPGTT的15分鐘採集血液樣品後，處死兩組中的某些小鼠。採集重要器官的組織，並分成三個份一份速凍用於RT-PCR以檢測基因表達，一份在10%福馬林中固定用於免疫組織學研究，一份沒入酸性乙醇中用於提取組織胰島素。在所述融合蛋白的首次注射後約第30-35天內對於接近血糖量正常的小鼠實施次全胰切除術，並監測血糖水平。在蛋白治療後40天和50天之間處死所有實驗小鼠，並如上所述採集組織。變化樣品採集獨立地實施相似的動物實-驗六次。圖20A-20D顯示了Pdxl蛋白對血糖水平的體內作用。圖20A是曲線圖，顯示了在5x低劑量(50嗎/gbw)鏈唑黴素腹腔內注射後被誘導成糖尿病(兩個讀數的空腹血糖水平250-300mg/dL)的Balb/c小鼠的血糖水平。將糖尿病小鼠隨機分配至實驗性rPdxl或GFP對照組中，並分別接受100嗎Pdxl或GFP蛋白每天一次腹腔內注射，連續10天(紅色橫條)。使用血糖測計儀通過尾靜脈抽血定期監測血糖水平。在首次注射後第14-15天和第40天處死某些小鼠。在首次注射後第14天和第40天左右在正常小鼠、GFP治療的小鼠或rPdxl治療的小鼠中進行IPGTT。在治療後第30天左右在所選擇的對照小鼠和rPdxl治療的小鼠中進行次全胰切除術。圖20B提供了兩幅曲線圖，顯示了腹腔內葡萄糖耐量試驗(IPGTT)。在IPGTT之前至少8小時使小鼠空腹。腹腔內注射推注劑量的葡萄糖(lmg/gbw)，並在O分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘以及120分鐘時檢測正常小鼠(底部黑色線)、rPdxl治療的小鼠(中間的灰色線)或GFP治療的小鼠(頂部的灰色線)的血糖水平。圖20C是顯示血糖水平的曲線圖，圖20D顯示了IPGTT之後在治療後15分鐘、第14天和第40天的胰島素水平。如上所述監測小鼠血糖水平。在15分鐘時採集正常小鼠和治療的通過推注劑量(lmg/gbw)的葡萄糖腹腔內注射攻擊的小鼠的血液樣品。通過小鼠超敏感胰島素ELISA試劑盒分析胰島素水平。每組含有至少5隻小鼠。圖21A-21D顯示了Pdxl蛋白促進胰腺胰島細胞再生。圖21A提供了顯示了胰島素免疫組織化學的四幅小圖。使用抗胰島素抗體(L1000)對於來自以GFP(左)或rPdxl(右)治療的小鼠的石蠟包埋胰腺組織的切片進行免疫染色。在10x(上面的小圖)或40x(下面的小圖)放大率獲取典型圖像。圖21B顯示了胰腺組織的胰島素/胰高血糖素雙免疫染色。使用兔抗胰高血糖素抗體/PE(紅色)和豚鼠抗胰島素抗體/FITC(綠色)對於GFP治療的小鼠和rPdxl治療的小鼠的胰腺組織的石蠟切片進行免疫染色，並在螢光顯微鏡術下觀察。以40x放大率獲取所有圖像。圖21C提供了兩幅顯示實時定量RT-PCR分析的曲線圖。通過實時RT-PCR檢測在rPdxl或GFP治療(100昭/天，持續10天)後第14天和第40天時從糖尿病小鼠的胰腺組織提取的總RNA,和五種耙基因包括胰島素、Pdxl、INGAPrP、Reg3y和PAP的表達。使表達水平相對於|3-肌動蛋白基因的表達校正正常。結果代表每組中至少3隻個體小鼠。將相對的基因表達的倍數差異計算為rPdxl治療的胰腺中靶基因表達的平均Ct植(與標準的肌動蛋白cDNA相比)和GFP治療的胰腺樣品中這些靶基因的平均CT值(與標準的肌動蛋白cDNA相比)的比值。縮寫INGAPrP^胰島新生相關蛋白有關的蛋白；Reg3『再生的胰島衍生的3Y;PAP4夷腺炎相關蛋白。圖21D是顯示瓊脂糖凝膠中的實時PCR條帶的瓊脂糖凝膠。在瓊脂糖凝膠中運行實時產物，以確認治療後第14天和第40天的樣品的尺寸和特異性(凝膠中的單個條帶)。圖22A-22C顯示了Pdxl蛋白促進肝細胞轉分化為胰島素生成細胞。圖22A包括顯示胰島素免疫組織化學染色的九幅小圖。使用抗胰島素抗體(l:250)在4。C下過夜溫育肝臟的石蠟切片。使用40x物鏡獲取圖像。在治療後第14天觀察rPdxl治療的小鼠的肝臟切片中的胰島素陽性細胞。縮寫B.D.,旦管，H.T.V屍肝臟終末靜脈，B，黑色箭號表示單個具有雙核的表達胰島素的肝細胞的核染色質凝聚特徵。圖22B顯示了肝臟中胰腺基因的表達。通過瓊脂糖凝膠電泳分析從正常小鼠、GFP治療的小鼠或rPdxl治療的小鼠提取的RNA的逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增。從小鼠胰腺分離的RNA用作陽性對照。對於Ngn3RT-PCR分析，由於成體胰腺不表達該基因，Ngn3cDNA質粒(*)用作陽性對照。縮寫NoRT-未逆轉錄，D114或D40-首次蛋白注射後第14天或第40天。圖22C和22D為顯示其他器官中胰腺基因的表達。通過RT-PCR檢測從rPdx1治療的糖尿病小鼠治療後第14天的其他器官組織提取的總RNA和四種關鍵的胰腺基因(Pdxl、胰島素、胰高血糖素以及澱粉酶)的表達。所有RT-PCR結果代表了在各特定組中至少三隻個體小鼠，這些結果獨立地重複三次。圖23A和23B為顯示胰腺和肝臟組織胰島素測量的曲線圖。圖23A顯示了胰腺組織的胰島素測量。使用正常小鼠(n=4)或GFP(n=4)或rPdxl(n=5)經連續10天腹腔內注射治療的糖尿病小鼠的各組用於該研究。在注射後第14天或第40天處死小鼠，並對完整的肝臟或胰腺進行稱重，並採集用於揭J又組織胰島素，以防止減小抽樣變異。在酸性乙醇中提取組織胰島素，並使用小鼠超敏感胰島素ELISA試劑盒通過ELISA檢測組織胰島素。將胰腺中的組織胰島素含量表示為每mg溼重胰腺組織的胰島素的量(ng)。**=&<0.05)和***=(pO.OOl)。圖23B顯示了肝臟組織胰島素測量。如上所述使用相同的方法提取肝臟組織胰島素。將肝臟中的組織胰島素含量表示為每mg溼重的肝臟組織的胰島素的量(ng)。在第14天，rPdxl治療的小鼠(n=6)在第14天的肝臟胰島素含量顯著高於正常小鼠(n=4)或GFP治療的小鼠(n=5)的肝臟胰島素含量。**=(pNgn3、Pax4NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll或Pax6或其片段。優選地，胰島-1、Pdxl、neuroD、Nkx6.1或MafA多肽(例如PTD融合多肽)的持續表達維持在有效水平超過1周、2周、3周或超過1個月、3個月、6個月或12個月。如果需要，胰腺轉錄因子的持續表達與Ngn3和/或Pax4多肽(例如PTD融合多肽)的瞬時存在結合。轉導病毒(例如，逆轉錄病毒、腺病毒以及腺病毒相關病毒)載體尤其因為它們的高效感染和穩定的整合和表達而可用於體細胞基因治療(參見，例如，Cayouette等，《人類基因治療》8:423-430,1997;Kido等，《現代眼科研究》15:833-844,1996;Bloomer等，《病毒學雜誌》71:6641-6649,1997;Naldini等,《科學》272:263-267，1996;以及Miyoshi等，《美國科學院院刊》94:10319,1997)。例如，可將編碼胰腺轉錄因子蛋白、其變異體或其片段的多核苷酸克隆至逆轉錄病毒載體中，且可由其內源性啟動子、由逆轉錄病毒長末端重複或由感興趣的靶細胞類型的特異性啟動子而驅動表達。其他可使用的病毒載體包括例如痘苗病毒、牛乳頭狀瘤病毒或皰滲病毒，諸如EB病毒(還可參見例如以下參考文獻的載體Miller,《人類基因治療》15-14,1990;Friedman,《科學》244:1275-1281,1989;Eglitis等，《生物技術》6:608-614,1988;Tolstoshev等，《生物技術新見》1:55-61,1990;Sharp,《柳葉刀》337:1277-1278,1991;Cornetta等，《核酸研究和分子生物學》36:311-322,1987;Anderson,《科學》226:401-409，1984;Moen，BloodCells17:407-416,1991;Miller等，《生物技術》7:980-990,1989;LeGalLaSalle等,《科學》259:988-990,1993;以及Johnson,《胸科》107:77S-83S,1995)。逆轉錄病毒特別地得以很好地開發，且已經用於臨床環境中(Rosenberg等，《新英格蘭醫學雜誌》323:370:1990;Anderson等，美國專利第5,399,346號)。在一個實施方案中，腺病毒相關病毒載體(例如，血清型2)用於將多核苷酸給藥至肝臟或肝葉。非病毒方法也可用於將治療劑導入需要調控高血糖的患者的細胞。例如，可通過在脂質轉染的存在下進行核酸給藥(Feigner等，《美國科學院院刊》84:7413,1987;Ono等，NeuroscienceLetters(《神經科學通訊》)17:259,1990;Brigham等，Am.J.Med.Sci.(《美國醫學科學雜誌.》298:278,1989;Staubinger等，MethodsinEnzymology(《酶學方法》)101:512,1983)，通過在非唾液血清類粘蛋白-聚賴氨酸共軛的存在下進行核酸給藥(Wu等，JournalofBiologicalChemistry(《生物化學雜誌》)263:14621,1988;Wu等，《生物化學雜誌》264:16985，1989)或在外科手術條件下通過顯微注射(Wolff等，《科學》247:1465,1990)進行核酸給藥而將核酸分子導入細胞。在一個實施方案中，核酸聯合脂質體和魚精蛋白進行給藥。基因轉移還可通過使用涉及體外轉染的非病毒方式而實現。這樣的方法包括使用磷酸釣、DEAE葡聚糖、電穿孔以及原生質體融合。脂質體還可潛在地有益於將DNA遞送至細胞中。將正常基因植入至患者的受影響的組織中還可通過將正常核酸轉移至可離體培養的細胞類型(例如，自體或異源原代細胞或其子代)之後將細胞(或其子代)注射至靶組織或通過導管遞送。用於多核苷酸治療方法的cDNA表達可由任何合適的啟動子(例如，人巨細胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)或金屬硫蛋白啟動子)指導，並由任何合適的哺乳動物調控元件調控。例如，如果需要，已知優先指導特定細胞類型(例如，肝細胞、肝幹細胞或其他肝臟衍生細胞)基因表達的增強子可用於指導核酸的表達。所使用的增強子可包括但不限於被表徵為組織特異性或細胞特異性的增強子的那些。可選地，如果基因組克隆用作治療構建體，調控可通過同源調控序列介導，或者，如果需要，通過來自異源來源的調控序列介導，包括上述的任何啟動子或調控元件。本發明包括的另一種治療方法涉及將重組治療劑諸如重組胰腺轉錄因子蛋白或其融合蛋白、變異體或片段直接給藥至潛在的或實際的患病組織的部位，或給藥至其中所述多肽將具有治療作用的器官，或者全身給藥(例如，通過任何傳統的重組蛋白給藥技術)。所給藥的蛋白的劑量取決於多種因素，包括個體患者的尺寸和健康狀況。對於任何特定的受治療者，具體的給藥方案應根據個體需要和進行組合物給藥或監督組合物給藥的人員的專業判斷而隨時間調整。多肽和多核苷酸治療劑本發明提供了一種用於鑑定能夠作為用於治療以為細胞數量或生物活性缺乏為特徵的疾病或紊亂的治療劑的組合物(包括胰腺轉錄因子、蛋白轉導結構域/融合多肽、其片段，編碼這些蛋白、肽、小分子抑制劑以及模擬物的核酸分子)的簡單方法。因此，使用本文所述的方法進行鑑定通過將細胞重編程為另一種細胞類型或促進再生的多肽，諸如轉錄因子或被發現具有醫學價值的其他製劑。這樣的多肽可用作治療劑或用作用於現有多肽的結構修飾的信息，例如通過推理性藥物設計。這些方法可用於篩選對以感興趣的細胞類型缺乏為特徵的多種異常狀況有效的製劑。對於治療用途，使用本文7>開的方法鑑定的融合多肽可例如配製於藥學上可接受的緩沖液諸如生理鹽水中進行全身給藥。優選的給藥途徑包括，例如，提供藥物在患者中的連續、維持水平的皮下、靜脈內、腹腔內、肌肉內或皮內注射。使用於生理學上可接受的載體中的治療有效量的多肽或核酸分子治療劑而實施人類患者或其他動物的治療。合適的載體和它們的配製描述於，例如，E.W.Martin的Remington'sPharmaceuticalSciences(《雷明頓氏藥物科學》)。要給藥的治療劑的量根據給藥方式、患者的年齡、體重以及細胞缺乏的臨床症狀而不同。通常，(給藥)量在用於治療其他疾病的其他治療性多肽或蛋白治療劑的範圍內。在一個實施方案中，以下述劑量進行本發明的融合多肽的給藥即控制通過本領域技術人員已知的診斷方法或使用測量胰腺轉錄因子多肽的表達或生物活性(諸如靶基因的表達)的任何分析方法確定的高血糖的臨床或生理性症狀的劑量。在一個實施方案中，以至少約l-5mg/Kg體重或至少約5jig/g體重、0.1mg/20g體重或lmg/20g的有效量進行本發明的組合物的給藥。在其他實施方案中，進行至少約0.5mg/kg、lmg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg、10mg/kg、12mg/kg、15mg/kg或20mg/kg的本發明的多肽治療劑的給藥。藥物組合物的配製用於治療以細胞數量缺乏為特徵的疾病、紊亂或損傷的本發明組合物的給藥可通過下述方式進行即導致與其他組分組合有效改善、減輕或穩定所述疾病的所述治療劑的濃度的任何合適的方式。例如，減少或正常化受治療者血糖水平的量。治療性多肽、多核苷酸或包含這些製劑的細胞可以以任何合適的量包含在任何合適的載體物質中，並可以以佔組合物總重量的1-95%(按重量)的量提供。可以以適於胃腸外(例如，皮下、靜脈內、肌肉內或腹腔內)給藥途徑的劑型提供所述組合物。可以根據傳統藥學習慣配製所述藥物組合物(參見，例如，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(《雷明頓藥物科學與實踐》)(第20版)，A.R.Gennaro，LippincottWilliams以及Wilkins編輯，2000;和EncyclopediaofPharmaceuticalTechnology(《製藥工藝學百一+全書》,J.Swarbrick和J.C.Boylan編輯，1988-1999，MarcelDekker，NewYork)。理想地，所述多肽可被修飾或配製成增強多肽半衰期、增加吸收或提供持續釋放。可以將根據本發明的藥物組合物配製成當給藥時基本立即或在給藥後的任何預定時間或時間段釋放活性化合物。已知後面的組合物類型通常作為控釋製劑，其包括(i)經延長的時間段產生體內的基本恆定藥物濃度的製劑；(ii)在預定的延遲時間之後，經延長的時間段產生體內的基本恆定藥物濃度的製劑；(iii)在預定的時間段通過維持體內的相對、持續、有效水平而持續起作用的製劑，其具有與活性物質(鋸齒形動力學模式)的血漿水平波動有關的伴隨的最低程度不想要的副作用；(iv)通過例如鄰近腹腔或於腹腔腔內或在其中需要所述組合物分布的其他部位空間放置控釋組合物來使作用局部化的製劑；(v)允許方便給藥使得例如每1-2天一次或每1-2周一次給藥劑量；以及(vi)通過使用載體或化學衍生物將治療劑給藥至患有疾病、紊亂或損傷的受治療者的功能受幹擾的特定細胞類型(例如，肝細胞或胰腺細胞)而耙向疾病、紊亂或損傷的製劑。對於某些應用來說，控釋製劑消除了為維持血漿水平在治療水平而在當天頻繁給藥的需要。物的代謝速率的控釋。在一個實施例中，通過合適地選4^多種配製參數和成分包括例如多種類型的控釋組合物和包衣而獲得控釋。因此，將治療劑與合適的賦形劑一起配製成當給藥時以控制方式釋放治療劑的藥物組合物。其實例包括單個單元或多個單元的片劑或膠嚢組合物、油劑溶液、懸浮液、乳劑、微嚢、微球、分子絡合物、納米顆粒、貼劑以及脂質體。如果需要，將本發明的治療組合物與增強感興趣的細胞再生或增強感興趣的細胞重編程的其他製劑一起提供。在一個實施方案中，所述製劑是生長因子，諸如可溶的生長因子。例如，將治療性多肽、多核苷酸或含有這些製劑的細胞與可溶的生長因子諸如PDGF、EGF、VEGF、bFGF、HGF、NGF、KGF—起提供，或與|3細胞促進因子諸如尼克醯胺、exentin4、GLP-1、p細胞調節素(betacellulin)、胰島新生相關蛋白(INGAP)或Ghrelin—起提供。給藥方法所述藥物組合物可通過以含有傳統的非毒性藥學上可接受的載體和佐劑的劑型、製劑或經合適的給藥裝置或植入劑通過注射、輸注或植入(皮下、靜脈內、肌肉內、腹腔內等)。在一個實施方案中，經滲透泵提供本發明的治療性組合物。這樣的組合物的配製和製備為藥物配製領域的技術人員公知。其配製可見於《雷明頓藥物^+學與實踐》，見上文。胃腸外應用的組合物可以以單位劑型(例如，單劑量安瓿)或以含有幾個劑量和其中可添加合適防腐劑的小瓶(見下文)中提供。所述組合物可以是溶液、懸浮液、乳劑、輸注裝置或用於植入的遞送裝置的形式，或其可作為在使用前使用水或其他合適的載體重新溶解的乾粉提供。除了活性多肽治療劑外，所述組合物還可包括合適的胃腸外可接受的載體和/或賦形劑。所述活性多肽治療劑可摻入至用於控釋的滲透泵、微球、微嚢、納米顆粒、脂質體等中。另外，所述組合物可包括懸浮劑、增溶劑、穩定劑、pH調節劑、張度調節劑和/或分散劑。如上所述，根據本發明的藥物組合物可以是適於無菌注射的形式。為了製備這樣的組合物，將合適的活性融合多肽治療劑溶解或懸浮於胃腸外可接受的液體載體中。可以應用的可接受的載體和溶劑有水、可通過添加合適量的鹽酸、氫氧化鈉或合適的緩衝液調節至合適pH的水、1,3-丁二醇、林格氏溶液以及等滲氯化鈉和葡萄糖溶液。含水製劑還可以含有一種或多種防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯曱酸正丙酯)。在化合物中的一種僅少量或輕微溶解於水的情況中，可添加促溶劑或增溶劑，或者溶劑可包括10-60%w/w的丙二醇等。在一個實施方案中，局部經導管提供本發明的治療性組合物(例如，多肽、多核苷酸或含有這些製劑的細胞)。例如，為了使肝臟衍生細胞重編程為胰島素生成細胞，經門靜脈將本發明的組合物提供至肝臟。更優選地，通過將所述組合物提供(例如，經導管)至門靜脈的三個分枝的僅一個分枝，而將組合物尤其靶向肝臟的單個葉，使得肝臟的僅一個葉包含胰島素生成細胞。在其他實施方案中，經滲透泵提供本發明的組合物。理想地，滲透泵經l-3天、3-5天、5-7天或2、3、4或5周提供所述組合物的控釋。聯合治療如果需要，本發明的組合物可聯合本發明的任何其他多肽或多核苷酸(包括輔助監測蛋白治療功效的可才全測地標記的融合蛋白)或本領域已知的任何傳統治療劑給藥。在一個實施方案中，本發明的融合多肽，諸如與蛋白轉導結構域融合的胰腺轉錄因子，用於減輕糖尿病受治療者的高血糖。該治療作用甚至在該治療方法不完全消除患者對胰島素的依賴的情況下也是合乎需要的。因此，本發明的融合多肽可以與胰島素一起給藥以改善高血糖或其症狀或併發症。理想地，本發明的治療性融合多肽減輕患者對胰島素的依賴至少約5%、10%或15%，更理想地至少約20%、25%,或甚至30%,或甚至更理想地50%、75%、85%,或更多。在其他實施方案中，所述多肽治療劑與本發明的多核苷酸(例如，編碼胰腺轉錄因子或融合多肽的多核苷酸)聯合。在其他實施方案中，本發明的組合物聯合飲食、體重減輕或口服胰島素治療劑、可注射的胰島素治療劑、鼻腔胰島素治療劑或其他的胰島素治療劑，以減少和/或正常化血糖水平。本發明的聯合可以配製在一起且同時給藥或可以相互間在24小時內、2天、3天或5天內或1周、2周、3周或5周內給藥。藥盒或藥物系統本發明的組合物可以組裝成用於改善高血糖的藥盒或藥物系統。根據本發明該方面的藥盒或藥物系統包含攜帶工具，例如箱、硬紙盒、試管等，其中具有一種或多種封閉限制形式的容器，諸如小瓶、試管、安瓿、瓶子等。本發明的藥盒或藥物系統還可以包含用於使用本發明製劑的相關i兌明書。除非特別指明，本發明的實踐應用了在本領域技術人員範圍內的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的傳統技術。這些技術在下列參考文獻中得以完整解釋諸如"分子克隆實驗手冊"，第二版(Sambrook,1989);"寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)，，(Gait,1984);"AnimalCellCulture(動物細胞培養)"(Freshney,1987);"《酶學方法》""HandbookofExperimentalImmunology(《實驗免疫學手冊》)，，(Weir,1996);"GeneTransferVectorsforMammalianCells(用於哺乳動物細胞的基因轉移載體)"(Miller和Calos，1987);《現^分子生物學實驗技術》(Ausubel，1987);"PCR:ThePolymeraseChainReaction(PCR:聚合酶鏈式反應)，，(Mullis，1994);"CurrentProtocolsinImmunology(現代免疫學實驗技術)"(Coligan,1991)。這些技術適用於製備本發明的多核苷酸和多肽，這樣，可以被考慮用於實施和實踐本發明。用於具體實施方案的特別有用的技術在下文的部分中討論。實施例本文所述的研究提供了蛋白轉導結構域融合蛋白(包括蛋白轉導結構域(PTD)胰腺轉錄因子(PTF)融合蛋白)的治療性和/或預防性用途。在一個實施方案中，PTD-PTF融合蛋白用於指導肝細胞的重編程或轉分化為胰腺內分泌前體細胞或其他胰島素生成細胞。本發明的PTD-PTF用於逆轉糖尿病受治療者的高血糖。簡而言之，本發明提供了具有或無11個胺基酸的TAT蛋白轉導結構域(PTD)的編碼PTF融合基因(Pdxl、Pdxl-VP16、Ngn3和Pax4)的構建體。這些構建體已用於產生和純化在體內具有生物活性的PTD-Ngn3、Ngn3以及Pax4融合蛋白。本發明提供了用於監測轉分化過程的組合物和方法，包括用於分析以細胞水平和分子水平存在的轉分化事件的顏色編碼的PTF報告基因。將肝細胞重編程為肝臟衍生的胰腺前體細胞(接下來在細胞移植之後成熟為功能性胰腺細胞(3細胞樣胰島素生成細胞)並且恢復糖尿病小鼠的血糖量正常的可行性受到糖尿病小鼠中胰腺轉錄因子轉基因表達的病毒介導的表達的支持。有利地，本發明的Ngn3和Pax4融合蛋白僅在本文所述的細胞中瞬時存在。該瞬時存在足以生成肝臟衍生的調節葡萄糖的完全功能性胰島素生成細胞。本文所述的研究提示本發明提供了相對於提供Ngn3和Pax4持續表達的方法的某些優點。具體地，慢病毒介導的Ngn3持續表達導致肝細胞脫離細胞循環並經歷細胞凋亡，而在表達Pdxl-VP16的IPC中的LV介導的Pax4持續表達導致被植入的小鼠的嚴重高血糖和死亡。實施例1:含有蛋白轉導結構域的Ngn3融合蛋白(PTD-Ngn3)圖1B中提供了顯示典型的含有蛋白轉導結構域(PTD)的融合蛋白的結構的示意圖。儘管以一種特定結構顯示不同結構域的取向，但這僅作為一個例子而4是供。其他組合和結構在本發明的範圍內。具體地，PTD結構域可定位在多肽的羧基末端或氨基末端或任何其他位置。使用pCRT7/CT畫TOPO表達質粒(Invitrogen)產生PTD-Ngn3-V5-His標籤或Ngn3-V5-His標籤融合蛋白。因為抗His標籤抗體也識別許多富有組氨酸的蛋白，pCRT7/CT-TOPO質粒也編碼V5表位，提供了4吏用高質量、可商購獲得的抗V5抗體選擇性檢測重組蛋白的優點。簡而言之，使用含有PTD(YGRKKRRQRRR)序列的引物，將編碼小鼠Ngn3的整個閱讀框的cDNA用於產生PCR產物。(所有PCR產物通過在佛羅裡達大學DNA中心實驗室(UniversityofFloridaDNACoreFacility)測序而得以確認)。將PTD-Ngn3和Ngn3PCR產物克隆至表達質粒pCRT7/CT-TOPO質粒(Invitrogen)中，使得產生V5和his標記的融合蛋白。將所產生的載體命名為pCR-PTD-Ngn3-V5-His或pCR-Ngn3-V5-His(PTD陰性對照)。最終的cDNA以下列順序編碼肽序列PTD(Ilaa)-Ngn3(214aa)-V5表位(14aa)-His標籤(6aa)。所產生的融合多肽保留Ngn3的生物功能。儘管描述了含有特定蛋白轉導結構域(PTD)的融合蛋白，本領域技術人員理解本發明不限於此。各結構域的位置因增強例如蛋白在宿主細胞中的生物活性、轉導、可溶性或表達而不同。例如，PTD結構域可存在於多肽的羧基端或氨基端，或可位於分子內的任何位置。實施例2:PTD-Ngn3-V5-His融合蛋白的製備和純化為了製備所需的融合蛋白，在含有氨爺西林(100|ig/ml)的LB培養基中於37。C培養使用pCR-PTD-Ngn3-V5-His或pCR-Ngn3-V5-His質粒轉化的大腸桿菌BL21(DE3)細胞至OD6(K)0.5(對數中期)。通過持續4小時添加0.5mM異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導融合蛋白的表達。收穫誘導的細胞並通過於裂解緩衝液(Invitrogen)中聲處理裂解。根據製造商的說明，使用Ni-NTA凝膠柱(Invitrogen)純化可溶的PTD-Ngn3或Ngn3融合蛋白，然後使用PD10柱(Amersham)脫鹽。通過考馬斯藍染色觀察純化的蛋白(圖2A和2C)，並使用抗V5抗體(圖2B)通過蛋白質印跡分析確認。將蛋白等分在含有10%甘油的PBS中，儲存於-8(TC直至使用。純化的PTD-Ngn3和Ngn3融合蛋白(圖2C)顯示了分子量的輕微差異(圖2C)實施例3:含有PTD結構域的Ngn3融合蛋白的功能性特徵為了評價PTD融合蛋白穿透細胞的能力，實施了PTD-Ngn3轉導的時程。使用含有純化的PTD-Ngn3融合蛋白(0.2pM)的培養基溫育WB細胞(一種大鼠肝臟上皮幹細胞樣克隆細胞系(Tsao等，Exp.CellRes.,15438-52，1984)不同的時間段，使用PBS洗滌三次，並收穫於2xSDS樣品緩衝液中。使用抗V5抗體通過蛋白質印跡檢測PTD-Ngn3-V5融合蛋白(圖3A)。該分析的結果表明由PTD結構域介導的蛋白轉導在2小時時達到頂峰。為了觀察該過程，根據製造商的說明(Pierce)使用FITC標記純化的PTD-Ngn3融合蛋白。以0.2(iM的終濃度將PTD-Ngn3-V5^FITC添加至WB細胞，持續2小時。缺乏PTD的Ngn3融合蛋白未能進入細胞。圖3B顯示〉70。/o的細胞在細胞質和細胞核中均含有FITC標記的融合蛋白。為了確定PTD-Ngn3融合蛋白在細胞培養基中的穩定性，將所述融合蛋白(0.2(iM)添加至WB細胞，並在指定時間去除等分的培養基。使用抗V5抗體通過蛋白質印跡檢測融合蛋白(圖3C)。儘管蛋白水平減少，但在24小時時，PTD-Ngn3蛋白仍舊存在於培養基中。圖4A和4B顯示了純化的可溶的和不可溶的PTD-Ngn3融合蛋白的質量。為了確定PTD-Ngn3是否可激活為下遊革巴基因的NeuroD和Pax4，使用LV-Ngn3(MOI=20)或PTD-Ngn3(0.2pM，每6個小時添加新鮮的PTD-Ngn3)處理人類Huh7細胞持續4天。提取RNA,並進行RT-PCR。圖3D顯示了LV-Ngn3和PTD-Ngn3蛋白處理之間NeuroD和Pax4(下遊靶基因)的Ngn3激活的等同的效力。這些結果表明具有生物活性的PTD-Ngn3融合蛋白產生且該蛋白可通過抗V5抗體4全測到。實施例4:PTD-Pdxl曙VP16(PTD-PV)或PTD-Pdxl-VP16/PTD隱Ngn3腹腔內注射恢復糖尿病小鼠的血糖水平Pdxl作為胰腺的"主要"調控基因而起作用。每天一次使用his標籤純化的可溶的PTD-Pdxl融合蛋白或PTD-GFP融合蛋白(100g/只小鼠)注射鏈唑黴素誘導的糖尿病小鼠，持續10天，每隔一天通過尾靜脈抽血監測血糖水平。圖5A和5B顯示了這些實驗的結果。圖5A顯示了用於注射的純化的蛋白，圖5B顯示了可溶的Pdxl蛋白的多次腹腔內注射將高血糖逆轉至接近正常血糖。在接受PTD-GFP注射的對照小鼠中未觀察到對血糖水平的作用。對正常小鼠、PTD-GFP融合蛋白注射的小鼠和PTD-Pdxl融合蛋白注射的小鼠進行腹腔內葡萄糖耐量試驗(IPGTT)(圖6)。使用PTD-Pdxl融合蛋白注射的小鼠顯示相對於正常小鼠(菱形)的幾乎正常的IPGTT曲線(正方形)。相比之下，接受PTD-GFP的小鼠不能降低額外劑量的葡萄糖。這些結果表明可溶的Pdxl融合蛋白的腹腔內注射降低了糖尿病小鼠的血糖水平，且這些結果具有統計顯著性。不希望受理論限制，PTDPdxl融合蛋白進入胰腺細胞並促進胰腺(3細胞再生是可能的，可選地，在PTDPdx1融合蛋白被轉移至腸繫膜脈管系統(毛血細管、小靜脈以及淋巴道)中之後經門靜脈運輸系統進入肝細胞之後可促進肝細胞轉分化為胰島素生成細胞。為了確定胰腺p細胞再生是否在恢復血糖量正常中起作用，在接受可溶的PTDPdxl融合蛋白注射的小鼠中進行了胰切除術。該手術去除了〉90%的胰腺。在手術後監測血糖水平。給小鼠提供胰島素每天一次注射(PID)且以100嗎劑量每天一次提供可溶的Pdxl融合蛋白，持續5天。監測血糖水平。圖7A顯示了在該小鼠中觀察到的高血糖的快速反跳。通過重複的腹腔內PTDPdxl融合蛋白注射實現血糖量正常。鑑於通過胰切除術去除90%的胰腺導致持續的高血糖，這些結果是令人驚訝的。圖7B表明Pdxl或PTD-Pdxl-VP16腹腔內注射促進胰腺胰島細胞再生。組蛋白H3(—種與染色質結構有關的蛋白)，在有絲分裂中的染色質凝聚過程中尤其被磷酸化(在絲氨酸IO)。磷酸基-組蛋白H3(pHH3)的抗體用作檢測細胞中有絲分裂活性的可靠方法。在另一個實驗中，使用純化的可溶的PTD-PV或PTD-PV/PTD-Ngn3融合蛋白每天腹腔內注射患有鏈唑黴素誘導的糖尿病的兩隻小鼠(50颶/只小鼠)，持續5天。Pdxl-VP16是Pdxl的激活形式(Pdxl-VP16)。每兩天監測小鼠血糖水平一次。在注射後第27天處死小鼠。圖8和9顯示了小鼠血糖水平的變化。如圖8所示，在糖尿病小鼠的注射後小於3周，可溶的PTD-Pdxl-VP16腹腔內注射將血糖水平從約400mg/dl降低至約200mg/dl。另外，PTD-PV/PTD-Ngn3聯合顯示了在2周內將血糖水平從約385mg/dl降低至200mg/dl的協同作用(圖9)。兩隻小鼠的體重穩定。實施例5:胰腺P細胞再生為了檢查所觀察的血糖水平降低的機制，處死小鼠，將胰腺、肝臟、脾臟、腎臟、心臟以及肺臟固定於10%曱酪中，用於組織學檢查。圖10A和10B顯示了對PTD-Pdx1-VP16注射的'J、鼠胰腺的胰島素免疫染色的結果。這些結果表明在這些注射的小鼠胰腺中具有強有力的胰腺p細胞的再生。相似的結果見於PTD-PV/PTD-Ngn3注射的小鼠胰腺。圖10A顯示了包括完整胰腺胰島(3細胞的胰腺的典型切片。圖10B顯示了新再生的胰島在尺寸上不同，具有許多小胰島。大多數新再生的胰島接近或鄰近胰管，表明P細胞新生的存在。某些單個分散的胰島素陽性(3細胞鄰近外分泌腺，提示外分泌細胞轉分化為內分泌p細胞。胰腺p細胞再生的一個機制是殘留的(3細胞複製。實施例6:促進肝細胞轉分化為胰腺內分泌細胞包括胰島素生成細胞對肝臟進行切片，並使用抗胰島素抗體進行免疫染色。圖11A-11D顯示了在接受PTD-Pdxl-VP16可溶蛋白注射的小鼠的肝臟切片(圖11B)中可觀察到的分散的胰島素陽性細胞。在接受PTD-GFP融合蛋白的小鼠的肝臟切片(D)中未檢測到胰島素陽性細胞。還在接受注射的PTD-Pdxl-VP16/PTD-Ngn3融合蛋白的小鼠的肝臟切片(圖12)中通過抗胰島素抗體檢測到分散的胰島素陽性細胞。這些結果表明d、鼠血糖水平的降低歸因於由PTD-PTF(Pdxl-VP16或Pdxl-VP16/Ngn3)介導的月夷腺(3細胞再生和肝細胞至內分泌胰腺轉分化。這些結果表明修飾的胰腺"主要"調控基因、可溶的PTD-Pdxl-VP16蛋白或可溶的PTD-Pdxl-VP16和PTD-Ngn3蛋白的組合多次腹腔內注射至鏈唑黴素誘導的糖尿病小鼠具有降低血糖水平和改善小鼠的糖尿病的協同作用。該小鼠血糖水平的降低是由於外源性胰腺p細胞再生和肝細胞轉分化產生的胰島素生成細胞的數量增加而導致。這些結果表明經蛋白轉導結構域(PTD)進行的胰腺轉錄因子的遞送可在體內成功用於誘導胰腺(3細胞並使肝細胞重編程為胰島素生成細胞。該方法成功用於治療小鼠糖尿病，表明使用PTD技術遞送的胰腺轉錄因子(Pdxl-VP16和Ngn3)的組合可用於改善人類1型和2型糖尿病。該治療可通過將重組的人類PTD-Pdxl-VP16和PTD-Ngn3蛋白注射至腹腔或門靜脈以促進治療糖尿病和預防與持續高血糖相關的代謝併發症的內源性胰腺細胞再生和/或肝細胞轉分化而應用。實施例7:AAV-PTF(Pdxl-VP16、Ngn3，或二者均有)的門靜脈注射降低糖尿病小鼠中的血糖水平本發明證明了通過誘導關鍵的胰腺轉錄因子(即Pdxl、Pdxl-VP16、Ngn3以及Pax4)的基因在體外將肝幹細胞重編程為功能性生成胰島素的(3細胞子代的可行性。另夕卜，本發明的結果提示用於重編程的有效的轉錄因子組合(Pdxl-VP16與Pax4組合和/或Pdxl-VP16與Ngn3組合)。在具體的實施方案中，本發明提供了可用於持續表達感興趣的胰腺轉錄因子的表達胰腺轉錄因子的病毒載體。這樣的病毒載體可聯合僅瞬時存在於細胞中的含有胰腺轉錄因子的融合多肽使用。使用lx108病毒顆粒的AAV-Pdxl-VP16、AAV-Ngn3或AAV-Pdxl-VP16/AAV-Ngn3經門靜脈注射三組糖尿病小鼠，一組接受AAV-GFP的小鼠作為AAV病毒的對照。每兩天監測血糖水平一次，對於接近正常血糖水平的小鼠進行葡萄糖耐量試驗。處死各組的l只小鼠，並檢查肝臟和胰腺中(3細胞再生和肝臟中胰腺內分泌細胞的存在。圖13A顯示AAV血清型2的肝細胞轉導效率總體約20%。圖13B顯示了AAV-Pdxl-VP16和AAV-Ngn3組合有效降低糖尿病小鼠的血糖水平並恢復小鼠響應高葡萄糖攻擊的能力。單獨AAV-Ngn3顯示無顯著的血糖降低作用。AAV-Pdxl-VP16顯示降低血糖水平的中等作用。實施例8:肝臟衍生的胰島素陽性細胞使用抗胰島素抗體和抗胰高血糖素抗體通過免疫染色對接受AAV-PV、AAV-Ngn3或AAV-PV/AAV-Ngn3病毒的小鼠的肝臟石蠟切片進行檢測。圖14(左小圖)顯示了AAV-PV門靜脈注射將某些肝細胞轉化為強胰島素陽性細胞。該結果與在這些動物中鑑定的血糖水平降低相一致(圖13B)。經門靜脈注射接受AAV-PV/AAV-Ngn3的動物的肝臟切片顯示許多胰島素陽性細胞。大多數這些細胞分布在中央靜脈周圍(圖15)。大多數胰島素陽性細胞位於肝包膜下的邊緣。與該表現相一致，經門靜脈注射接受AAV-PV/AAV-Ngn3的小鼠的血糖水平被正常化。儘管胰島素陽性細胞的分布在區域間不同，據估計胰島素陽性細胞的總百分數達到肝細胞總數量的2-3%。在單獨接受AAV-Ngn3注射的小鼠中未觀察到血糖水平的顯著降低。在來自這些小鼠的肝臟切片中僅鑑定到分散的胰島素陽性肝細胞(圖14,右小圖)。實施例9:肝臟衍生的胰高血糖素陽性細胞為了確定肝細胞是否可被胰腺轉錄因子(PTF)轉化為胰腺內分泌細胞，使用抗胰高血糖素抗體對接受AAV-PV、AAV-Ngn3或AAV-PV/AAV-Ngn3病毒的小鼠的肝臟石蠟切片進行免疫染色。這些研究鑑定了肝臟中的胰高血糖素陽性的肝細胞。大多數胰高血糖素陽性的肝細胞緊靠中央靜脈。圖16顯示了接受AAV-PV/AAV-Ngn3門靜脈注射的d、鼠肝臟切片的胰高血糖素免疫染色的結果。經門靜脈將編碼Pdxl-VP16和Ngn3的重組腺病毒相關病毒(AAV)的組合給藥至患有鏈唑黴素誘導的糖尿病的小鼠。接受該組合的小鼠顯示血糖水平的協同性降低，表明Pdxl-VP16和Ngn3的表達改善了這些小鼠的糖尿病。該作用大部分由肝細胞轉分化為胰島素生成細胞介導，較小程度由內源性胰腺|3細胞再生介導。單獨AAV-Pdxl-VP16門靜脈注射顯示降低血糖水平。該作用與顯示肝臟切片中胰島素陽性細胞和胰高血糖素陽性細胞的存在的組織學結果相一致。為了確定這些作用是否部分由胰腺再生導致，分析了這些小鼠的胰腺的胰島素免疫染色。在經門靜脈注射接受AAV-PTF的小鼠中鑑定到比經腹腔內注射接受載體的小鼠中觀察到較低水平的胰腺(3細胞再生。單獨AAV-Ngn3門靜脈注射顯示對血糖水平無顯著作用。在這些小鼠的肝臟切片中僅鑑定到分散的胰島素陽性細胞和胰高血糖素陽性細胞。鑑於關鍵的胰腺基因諸如Pdxl-VP16和Ngn3可經門靜脈一皮遞送而成功將肝臟中的肝細胞轉分化為胰島素生成細胞，可能與蛋白轉導結構域融合的胰腺轉錄因子可經門靜脈被遞送至肝臟，並且這些融合蛋白可用於體內轉分化肝細胞和促進|3細胞再生。這些方法可用於治療患有1型和2型糖尿病的患者和預防與持續高血糖相關的併發症。實施例10:胰腺轉錄因子融合蛋白治療的順序給藥使用圖17中所示的在P細胞分化過程中順序表達的三種胰腺轉錄因子體內再生和重編程而提供蛋白治療，圖17提供了特定PTF表達的順序和持續時間的概況(Soria,《分化》2001;68(4-5):205-219;Hui等,《內分泌學雜誌》2002;146(2):129-141)。圖18A-18I提供了典型胰腺轉錄因子的序列。Pdxl以雙相性方式在發育中的胰腺中表達。它首先在胚齡E9.5至E10之間達到頂峰(在所有胰腺前體細胞中表達)，且表達持續約2-3天。然後，接下來在5-6天的時間間隔Pdxl低水平表達。在該間隔期間，Ngn3表達在Ell開始，在E15達到頂峰，並持續2-4天。Ngn3表達決定細胞向胰腺內分泌細胞轉化的命運。Pax4因Ngn3消失而出現，並持續約1-3天。Pax4僅在發育中的(3細胞中表達。在Pax4激活之後，Pdxl再次出現，在分化的p細胞中持久性表達，並維持(3細胞功能。圖17B描述了模擬圖17A中所述的PTF表達序列的天然過程的PTD-PTF融合蛋白給藥。用於胰腺轉錄因子融合多肽的遞送方法反映了發育過程中這些因子的體內表達。具體地，監測小鼠中PTD-GFP融合蛋白的組織動力學和組織分布。通過三種途徑(門靜脈、靜脈內以及腹腔內)將100嗎(約5嗎/g體重)PTD-GFP融合蛋白對小鼠給藥，在治療後1小時、2小時、5小時、10小時以及24小時收穫組織。通過蛋白質印跡估計PTD-GFP或PTD-PTF的平均半衰期，並通過光密度法進行定量(Cai等，EurJPharmSci(《歐洲藥學科學雜誌》)2005;Kaneto等，NatMed(《自然醫學》)2004;IO(IO):I128-1132)。基於PTD-GFP數據監測PTD-PTF蛋白在不同組織中的分布。如Xiong等，StemCellsDev(《幹細胞進展》)2005;14(4):367-377所述通過免疫組織化學染色並通過先前研究中所述使用抗V5抗體通過蛋白質印跡分析來分析不同組織中的PTD-PTF蛋白。基於這些研究的結果，將對鏈唑黴素誘導的糖尿病小鼠的融合蛋白腹腔內遞送或門靜脈注射遞送方法優化成反映發育過程中這些因子的內源性表達模式。接下來，如上所述，監測對肝臟重編程或胰腺再生的作用。實施例11:報告基因構建體的產生在慢病毒載體中產生含有與編碼螢光顏色的蛋白偶聯的啟動子基因(包括大鼠胰島素-1啟動子eGFP、NeuroD-eGFP、Nkx2.2-RFP以及Pax4-RFP)的質粒。這些編碼螢光顏色的報告基因用於監測轉分化的階段。含有全長的人類Pax4或小鼠Nkx2.2啟動子DNA序列的質粒用於構建融合報告基因。使用合適的引物通過PCR將小鼠Pax4啟動子(-2153-+1)和Nkx2.2(-1840bp至+21)克隆至pCR2.1-TOPO克隆載體中的限制酶Xhol/Sa11(Pax4)和BamHI/Xho1(Nkx2.2)之間。使用相同的限制酶切割所產生的質粒和pDsRed-Express-Nl質粒。純化Pax4(或Nkx2.2)啟動子的插入序列，並連接至pDsRed-Express-Nl質粒的MCS位點。在篩選含有Pax4或Nkx2.2插入序列的陽性克隆之後，通過限制性消化和序列分析確認這些克隆的整合，擴增報告基因質粒pDsRed-Pax4-RFP和pDsRed-Nkx2.2-RFP並將它們用於體外轉染以檢測它們的功能。使用來自人類肝臟的基因組DNA作為模板，使用合適的引物、PfUDNA聚合酶(Washiobio,中國)通過PCR產生包含950bp(-940至+10)的人類NeuroD/(32啟動子的報告基因構建體(Miyachi等，BrainResMolBrainRes(《腦研究分子腦研究》)1999;69(2》223-231)。將擴增的PCR產物經受電泳、凝膠純化，並使用TA克隆試劑盒(Invitrogen)將其克隆至pCR2.1-TOPO載體(Invitrogen)中。使用EcoRl和BamHl通過限制性消化從質粒切除啟動子片段，並將其插入eGFP表達載體(pEGFP-1，Clontech)。通過限制性消化和序列分析確認該克隆的整合。實施例12:小鼠rPdxl的產生和表4正最近發現Pdxl轉錄因子的觸角足樣結構域具有內建的PTD，允許該蛋白結合和穿透細胞膜(Noguchi等,《糖尿病》52，1732-1737(2003))並發揮轉錄功能。首先，構建含有小鼠PDX1或PTD-GFPcDNA的表達質粒，各質粒還含有編碼C末端六組氨酸標籤的另外的核苷酸序列(用於使用氮川三乙酸鎳柱快速純化)。為了獲得用於體外和體內動物研究的足夠量的近乎均勻的蛋白質，首先將細菌表達條件優化為每升生長培養基產生10mgrPdxl或PTD-GFP,並將純化方案改進成確保高產率和純度。圖19A描述了rPdxl和PTD-GFP的結構組成(頂部小圖)，顯示了表明rPdxl和PTD-GFP融合蛋白的純度的考馬斯藍染色的SDS凝膠(左小圖)。基於凝膠光密度法，這些重組蛋白始終具有至少90-95%的純度。還使用抗Pdxl抗體或抗GFP抗體通過蛋白質印跡(右小圖)確認rPdxl和GFP蛋白。為了確認rPdxl蛋白具有穿透細胞的能力，使用rPdxl蛋白(0.2的終濃度)溫育WB細胞持續不同的時間，之後使用PBS洗滌細胞三次。然後將細胞裂解物收集於裂解緩衝液中，通過SDS-PAGE分離它們的蛋白，並使用抗Pdxl抗體和抗肌動蛋白抗體(對照)進行印跡。對細胞印跡中的rPdxl的相對量進行定量並使用肌動蛋白通過光密度法進行標準化。如圖19B所示，rPdxl蛋白進入在5分鐘之內停止。在Pdxl4參入進行時，糹田胞rPdxl蛋白水平在1-2小時時達到其峰值，並在6小時時開始降落。為了確定內化的rPdxl蛋白是否具有生物活性，分析了rPdxl蛋白的轉錄功能。首先，使用含有pNeuroD-GFP報告基因(Pdxl轉錄因子的直接下遊靶基因)的慢病毒轉導WB細胞。然後，在存在或不存在rPdxl蛋白(1^M)的情況下溫育細胞72小時。收穫這些細胞用於流式細胞術，通過檢測表達pNeuroD-GFP的WB細胞的百分數評價rPdxl介導的NeuroD基因活性。為了比較外部給藥的rPdxl和細胞製造的Pdxl的效率，使用慢病毒Pdxl載體轉導含有NeuroD-GFP啟動子構建體的WB細胞72小時，並記錄Pdxl水平。表達pNeuroD-GFP的WB細胞用作天然的細胞Pdxl蛋白的陽性對照。重要地，使用WB細胞的LV轉導效率接近幾乎100%,如所報導的通過LV-CMV-GFP載體表達所判斷的(Tang等，LabInvest(《實驗室包埋》)86,829-841(2006))。圖19C(左小圖)顯示了於細胞離心塗片器載玻片上採集的表達NeuroD-GFP的細胞的典型螢光顯微照片。流式細胞術揭示了LV-Pdxl處理的細胞(21。/。)和rPdxl蛋白處理的細胞(19%)在處理72小時後的可比的轉錄效率。當這兩種處理與僅含有pNeuroD-GFP載體的對照細胞相比時，顯示統計學上的顯著差異(圖19C,右小圖)。這些結果明顯證明了rPdxl蛋白能夠快速進入細胞並有效激活其下遊的NeuroD基因靶。這些發現證實rPdxl蛋白通過LV-Pdxl轉基因表達方式具有與細胞內產生的天然Pdxl蛋白相同或可比的轉錄活性。實施例13:體內動力學和組織分布儘管觸角足樣PTD允許rPdxl蛋白進入細胞，但關於rPdxl的體內組織分布知道得較少。因此，為了探索rPdxl蛋白用於糖尿病的安全和臨床可行性治療，監測了rPdxl蛋白的組織分布和藥代動力學。以每隻小鼠0.1mg或1mgrPdxl融合蛋白腹腔內注射Balb/c小鼠。在15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、6小時以及24小時時收集血液樣品，並使用抗Pdxl抗體通過免疫印跡4企測血清中的rPdxl蛋白。如圖20A所示，rPdxl蛋白在血液中的出現在早至注射後1小時時開始明顯，在2小時時達到峰值，然後在6小時時顯著降落。在24小時的血液樣品中未檢測到rPdxl蛋白。對於體內組織分布研究，在腹腔內注射後i小時或24小時收穫肝臟、胰腺以及腎臟，並在10%福馬林中固定。使用抗Pdxl抗體對石蠟切片進^f亍免疫染色。圖19B顯示了選自在注射後1小時(頂部兩^f亍)或24小時(底行)接受O.lmgrPdxl蛋白的動物的典型肝臟、胰腺以及腎臟組織圖像。發現Pdxl蛋白在肝細胞的細胞核中濃集，Pdxl陽性細胞在最接近中央靜脈處為最大濃度。該分布模式與預測的用於含有PTD的蛋白的快速內化的途徑(在Pdxl情況下，Pdxl經末端靜脈或毛細血管進入門靜脈系統)相一致。確實，預期在最接近中央靜脈的那些細胞具有最高的Pdxl摻入。在胰腺的周圍外分泌細胞中(可能因直接攝取)和沿胰腺末端毛細血管也檢測到Pdxl蛋白。在腎臟樣品中，Pdxl蛋白以與蛋白過濾和消除的解剖途徑相一致的方式出現蛋白一開始見於腎小球細胞、cap細胞、近端小管細胞和遠端小管細胞，最終在集合管細胞中積累。在注射後24小時，在肝臟、胰腺以及腎臟切片中僅觀察到弱的Pdxl蛋白免疫染色(底行)。另外，在注射後1小時於脾臟、心臟、肺臟以及腦的組織中可能因為血液中的高水平Pdxl而檢測到無特徵性模式的低水平Pdxl蛋白，並且在注射後24小時變為不可檢測的水平。基於這些發現結果和文獻中的數據(Matsui等，Curr.ProteinPept.Sci.(《蛋白質和肽科學現狀》)4,151-157(2003);Schwarze等，《科學》285，1569-1572(1999)),選擇0.1mgPdxl作為起始劑量，以24小時間隔作為我們的治療時間安排，以確定rPdxl對糖尿病小鼠的體內作用實施例14:rPdxl蛋白對糖尿病小鼠的血糖水平的體內作用流程1(圖19C)描述了用於評價給藥的rPdxl蛋白在Stz誘導的糖尿病(空腹血糖在約300mg/dL)小鼠中的體內治療作用的實驗策略(Cao等，《糖尿病》53,3168-3178(2004);Tang等，《實驗室包埋〉〉86,83-93(2006))。使用純化的rPdxl或PTD-GFP蛋白腹腔內注射(0.1mg或約5jig/g體重)這些動物，連續10天。含有PTD的綠色螢光蛋白(自身是具有工程PTD的非治療性蛋白)用作陰性對照。在不同的時間點監測空腹血糖水平。如圖21A所示(底部黑色線)，接受rPdxl注射的小鼠在首次注射後2周內達到接近血糖量正常，然而，在接受PTD-GFP蛋白的小鼠中未觀察到高血糖的改善(圖21B中的灰色線)。在蛋白注射首日之後的第14天處死小鼠，收集不同器官組織用於組織胰島素測量、基因表達分析和/或免疫組織化學研究。在注射後第14天和第40天，腹腔內葡萄糖耐量試驗(IPGTT)(圖20B)顯示接受注射的小鼠在兩個時刻表現與可見於正常小鼠(黑色線)的接近正常的IPGTT曲線(灰色中部線)。相比之下，接受PTD-GFP的那些小鼠未給出降低推注劑量的葡萄糖的任何能力的提示(頂部灰色線)。為了評價rPdxl治療的糖尿病小鼠中在它們的血糖水平於rPdxl注射後第14天左右接近正常化之後葡萄糖刺激的胰島素釋放的能力，使用腹腔內注射推注劑量的葡萄糖(lmg/g)注射攻擊正常小鼠和治療的小鼠，在注射後15分鐘採集血清用於胰島素測量。圖20C和20D顯示在正常小鼠、實驗小鼠和對照小鼠中血糖水平(圖20C)和血清胰島素水平(圖20D)的結果。寡核苷酸引物序列示於表l(下文)中。表l:實時PCR引物名稱、序列、大小、GenBank號以及PCR條件基因正向引物反向引物PCR大小GenBank登錄號Tm('C)循環數肌動蛋白ACCACACCTTCTACAATGAGCGGTACGACCAGAGGCATACA185NM—0073935638胰島素GCCCTTAGTGACCAGCTATGGACCACAAAGATGCTGTTT167應—008386.25638PdxlATGAAATCCACCAAAGCTCACAGTTCAACATCACTGCCAGCTI卯NM—008814.25638INGAPGCTCTTATCTCAGGTTCAAGGAGATACGAGGTGTCCTCCAGG178NM一013893.15638Reg3gCATGACCCGACACTGGGCTATGGCAGACATAGGGTAACTCTAAG190NM—011260.15638PAPAATACACTTGGATTGGGCTCCCCTCACATGTCATATCTCTCC195NM—011036.15638如圖21C和21D所示，在注射後第14天和第40天獲得的樣品的血糖水平證實了使用rPdxl或PTD-GFP蛋白治療的小鼠的血清胰島素水平。Pdxl治療的小鼠在IPGTT中15分鐘時的葡萄糖刺激的胰島素釋放在第14天和第40天分別大於GFP對照組6.9倍和11.3倍，提示rPdxl治療的小鼠處理推注劑量的葡萄糖攻擊的能力顯著改善。儘管Pdxl治療的小鼠的血糖水平在第40天接近血糖量正常，在葡萄糖刺激15分鐘後釋放的胰島素(2.6|ig/L)仍舊比正常的非糖尿病小鼠(5.7嗎/L)低得多，(表明新形成的胰島素生成細胞的成熟度)或小於胰腺組織或非胰腺組織中用於葡萄糖內穩定的(3細胞群的最佳水平。實施例15:Pdxl治療促進內源性B細胞再生為了確定胰腺中再生的胰島P細胞是否在rPdxl介導的血糖量正常的小鼠中起作用，使一組Pdxl介導的血糖量正常的小鼠(n=4)在注射後30天左右經受次全(〉90%)胰切除術，處理去除的胰腺組織用於形態學分析，和/或組織胰島素測量。如圖20A所示，血糖水平在次全胰切除術之後急劇升高，表明胰腺中胰島素生成細胞在rPdxl注射後第30天保持和維持血糖量正常中起主要作用。這些結果暗示rPdxl蛋白體內的遞送促進了內源性(3細胞再生。注意到GFP治療小鼠中的血糖升的舉交高，表明最低的自發性|3細胞再生的存在。對石蠟包埋的胰腺組織切片的組織學和胰島素表達的檢測證實強有力的胰島p細胞再生明顯，較大和豐富的胰島可見於Pdxl治療的小鼠胰腺，而在GFP治療的小鼠中觀察到稀少的小胰島(圖21A和21B)。所使用的寡核苷酸引物序列示於表2中(下文)。表2:引物名稱、序列、大小、GenBank號以及PCR條件tableseeoriginaldocumentpage65促生長素抑素CTCTGCATCGTCCTGGCTTTGGGCTCCAGGGCATCATTCTCT173NM—0092155640IAPPTGAACCACTTGAGAGCTACACTCACCAGAGCATTTACACATA282NM一O104915540Glut-2CGGTGGGACTTGTGCTGCTGGGAAGACGCCAGGAATTCCAT412NM—0311975640P48CCCAGAAGGTTATCATCTGCCCGTACAATATGCACAAAGACG245NM_0188095740彈性蛋白酶AATGACGGCACCGAGCAGTATGTCCATCTCCACCAGCGCACAC344NMJB36125740澱粉酶TGGGTGGTGAGGCAATTAAAGTGGTCCAATCCAGTCATTCTG371NM—0096695640葡萄糖激酶ATCCTGGCAGAGTTCCAGCTCTTGTGTTTCATCTGATGCT373NM—0102925640Pdx1ACCGCGTCCAGCTCCCTTTCCCGAGGTCACCGCACAATCT357NM—0088145740NeuroDlCATCAATGGCAACTTCTCTTTTGAAACTGACGTGCCTCTAAT257NM_0108945640Isl1AGACCACGATGTGGTGGAGAGGAAACCACACTCGGATGACTC296NM—0214595640NKx2.2GACAGCAGCGACAACCCCTACACGTGAGACGGATGAGGCTGG306NM—0109195640NKx6.1AGAGTTCGGGTCCAGAGGTAGTGATGCAGAGTCCGCCGT382NM—1449555640Pax4CCAGCCACAGGAATCGGACTATCCCTGGAGAATTTTTTGGTACT252NM—0110385740Pax6GTGAATCAGCTTGGTGGTGTCGAAGGGCACTCCCGTTTATAC308NM_013627564066tableseeoriginaldocumentpage67另外，在這些胰腺中還觀察到具有胰腺外分泌細胞表現的單個分散的胰島素陽性細胞。這些發現表明當rPdxl蛋白以多重劑量給藥時，經尚未定義的分子和細胞機制促進內源性生成胰島素的(3細胞的再生。為了進一步觀察再生的胰島的模式，使用抗胰島素抗體和抗胰高血糖素抗體進行雙免疫螢光研究。基於(3細胞/|3細胞比例和分布模式將小鼠中的胰腺胰島任意分成三期(圖21B)具有重要意義1期，胰腺P細胞/(3細胞比例為約0.2,具有豐富的雜亂的胰高血糖素陽性(3細胞和較少的(3細胞分散其中；2期，(3細胞/p細胞比例約為1,具有大致相等數量的胰高血糖素陽性細胞|3細胞和胰島素陽性細胞(3細胞；3期，胰腺|3細胞/|3細胞比例為5,顯示相反的比例，生成胰島素的(3細胞佔優勢。1期至3期的胰島的結構變得較有序，同時生成胰島素的p細胞的數量增加。由於在GFP治療的小鼠中也觀察到上述三種容易辨別的模式，這些模式顯現為代表胰島細胞再生進展的常見表現。為了確定rPdxl介導的胰島(3細胞再生的分子事件，分析了已知與胰腺和(3細胞再生以及正常的(3細胞生理功能相關的幾種基因的狀態。實時PCR用於確定胰腺中它們的表達水平。在使用rPdxl治療第14天和第40天之後，處死小鼠，從胰腺提取總RNA,以評價再生過程中的基因表達(Gagliardino,《內分泌學雜誌》177，249-259(2003)，Pittenger,《胰腺》34，103-111(2007),Jonsson等，《自然》，371,606-609(1994)，Wu等,Mol.CellBiol.(《分子細胞生物學》17,6002-6013(1997)，Staffers等，Nat.Genet.(《自然:遺傳學》)15,106-110(1997)，Holland等，《糖尿病》54，2586-2595(2005))。如圖21C所示，rPdxl治療糖尿病小鼠在第14天導致胰島素(21.3倍)、內源性Pdx1(3.8倍)、INGAP(14.5倍)、Reg3d(8.1倍)、Reg3g(6.8倍)以及胰腺炎相關蛋白Pap的水平(34.3倍)相對於它們相應的對照(GFP治療的胰腺)值顯著上調。在治療後第40天觀察到相似模式的上述基因上調持續。有趣地，儘管當Pap的表達與GFP治療的小鼠比較時持續上調，但當治療後第40天與第14天時的比較時，顯著減少。不論負責這些作用的機制(即，(3細胞分化和複製，導管細胞新生或外分泌細胞轉分化)如何，rPdx1蛋白具有經上調胰腺再生基因誘導新的細胞形成並由此改善高血糖異常狀況的能力。實施例16:Pdxl治療促進肝細胞轉分化為胰島素生成細胞幾個體內研究顯示病毒介導的肝細胞內Pdxl的轉基因表達導致肝細胞轉分化為IPC並逆轉糖尿病小鼠中的高血糖(Ferber,S.等，《自然醫學》6,568-572(2000),Ber,I.等，《生物化學雜誌》278，31950-31957(2003))。然而，使用rPdxl蛋白直接體內治療糖尿病小鼠是否可對肝細胞轉分化具有相似作用並不清楚。為了確定rPdxl給藥在注射後第14天對肝臟的作用，從使用Pdxl或GFP治療的小鼠獲得肝臟組織，並使用抗胰島素抗體免疫組織化學4全測這些樣品IPC的存在。可溶的Pdxl蛋白的多次腹腔內注射將高血糖逆轉為接近正常血糖量。圖22A顯示了來自使用PTD-GFP(左列)或Pdxl(右兩列)治療的小鼠的典型肝臟顯微照片。大多數分散的胰島素染色的陽性肝細胞沿中央靜脈邊緣分布(顯微照片中標註的C.V.),這是一種與肝臟中rPdxl組織分布相一致的模式(見圖22B)。存在具有小雙細胞核和凝聚染色質的分散的單個胰島素陽性肝細胞(黑色箭號)，暗示較成熟的細胞模式。這些細胞學特徵與具有較大細胞核和較開放的染色質模式(箭號)的那些鄰近的胰島素陰性的活性肝細胞明顯不同。在對照的GFP治療的小鼠肝臟中未觀察到胰島素生成細胞。接著，通過比較蛋白注射後第14天和第40天的結果研究Pdxl或GFP治療的肝臟中胰腺基因的表達模式(圖22B)。Pdxl治療的肝臟在第14天專有地表達多種胰腺基因，包括內源性Pdxl、胰島素I、胰高血糖素、彈性蛋白酶和IAPP,並且與GFP治療的肝臟的基因表達相比上調其他胰腺內分泌基因(胰島素II、促生長素抑制素、NeuroD以及Isll)和胰腺外分泌基因(p48和澱粉酶)的表達。未檢測到Ngn3基因的表達。有趣地，在第40天，未觀察到胰島素I、胰高血糖素、彈性蛋白酶以及IAPP基因的表達，而其他上述胰腺基因表達持續存在(儘管以降低的水平)。這些數據表明rPdxl介導的肝細胞產生的胰島素在早期可具有降低高血糖並促進胰腺p細胞再生的重要作用。實施例17:rPdxl蛋白對其他重要器官的作用上述發現結果證明了，當rPdxl體內遞送時，通過促進內源性胰島細胞再生和肝細胞轉分化為IPC而具有對糖尿病小鼠的真實治療作用。鑑於rPdxl蛋白無差別地穿透細胞的固有能力，還檢測了rPdxl對不同器官的胰腺基因(包括Pdxl、胰島素I、胰高血糖素以及澱粉酶)表達的作用的特異性。在收穫接受rPdxl治療後第14天的小鼠的心臟、腦、腎臟、肺臟、腸以及脾臟的組織之後，提取總RNA用於通過RT-PCR進行基因表達研究。該方法背後的理論是如果腹腔內rPdxl治療導致胰腺關鍵基因的無差別激活，這些發現結果會造成對上述肝臟中胰腺基因觀察結果顯著性的懷疑(圖22B)。如圖22C所示，在心臟、腦、腎臟、肺臟、腸以及脾臟中發現很小的或沒有rPdxl治療對胰腺基因激活的徵象。這些結果表明Pdxl治療方案在通過促進肝細胞轉分化和P細胞再生而恢復血糖量正常方面有效，無不想要的全身毒性的任何可檢測證據。實施例18:胰腺和肝臟之間在組織胰島素水平的互補關係為了確定rPdxl治療後胰腺和肝臟組織衍生的胰島素改善血糖水平的相對作用，將Pdxl注射後第14天或第40天左右處死的Stz處理的小鼠的胰腺和肝臟提取在酸性乙醇中，並使用用於檢測小鼠胰島素的超敏感ELISA試劑盒^r測所產生的胰島素含量。圖23A顯示Pdxl治療的糖尿病小鼠在注射後第14天和第40天的胰腺胰島素含量分別為正常胰腺水平的約44%和68%，與GFP治療的對照小鼠(12.0ng/mg和9.5ng/mg)相比，在治療後第14天是GFP治療的對照小鼠的6.7倍水平，治療後第40天是GFP治療的對照小鼠的15.8倍水平。這些發現結果提示體內rPdxl治療促進胰腺中胰島(3細胞再生。當將該胰腺胰島素生成增加與治療後第14天和第40天的GFP治療的小鼠相比時，具有統計學顯著性。這些結果還與我們對於次全胰切除術之後的反跳性高血糖的發現相一致(圖21A)。對於與胰腺胰島素含量測量相似治療的糖尿病小鼠，檢測了注射後第14天和第40天肝臟組織的胰島素含量。如圖23B所示，確實，Pdxl治療的小鼠中在治療後第14天的肝臟組織胰島素含量相對於GFP治療的小鼠顯著增加(約16倍)，且比正常肝臟增加接近9倍。有趣地，在Pdxl治療後第40天肝臟胰島素含量顯著降低，但它仍舊是GFP治療的小鼠的7.3倍，且為正常肝臟的約2倍。當將該肝臟胰島素產生的增加與正常小鼠或GFP治療的小鼠的胰島素水平相比時具有統計學顯著性。rPdxl蛋白的產生、純化以及表徵示於圖24A-24C中。Pdxl組織分布示於圖25A和25B。實施例19:Pdxl治療不誘導健康小鼠中胰腺基因的表達使用大劑量rPdxl蛋白以兩種方式注射正常小鼠。第一種，使用單次大劑量(10mg)純化的rPdxl蛋白注射小鼠，第二種，使用lmg/天注射小鼠連續10天。觀察小鼠的體重、健康狀況，以及其他指標，包括血糖水平，肝臟酶和心肌酶，以監測潛在毒性。當將上述參數與未使用Pdxl蛋白注射的正常小鼠比較時，不具有顯著變化。在注射後第14天處死所有小鼠，並檢測肝臟中關鍵的胰腺基因表達。因為在第14天，使用rPdxl注射的小鼠的肝臟強烈表達胰腺基因，包括胰島素、胰高血糖素、澱粉酶以及內源性Pdxl。為了確定這些關鍵的胰腺基因是否在接受大劑量rPdxl注射的血糖量正常的小鼠中表達，收穫來自兩組小鼠的肝臟的總RNA,並如圖26所示通過RT-PCR檢測基因表達。在接受PTD-GFP注射的對照小鼠中未觀察到對血糖水平的作用。肝臟中無所觀察的胰腺基因的可檢測表達。這提示rPdxl蛋白體內給藥對正常小鼠無相關的毒性。該結果提示rPdxl蛋白治療僅在糖尿病動物中起作用且對正常小鼠無作用。使用下述材料和方法進行上述實驗。70PTD融合蛋白的腹腔內(i.p.)和門靜脈(p.v.)遞送通過以50嗎/g體重每天一次腹腔內注射鏈唑黴素(Stz)持續5天將小鼠誘導成高血糖(>350mg/ML)。然後對正常小鼠或糖尿病小鼠進行麻醉並使用於500(ilPBS中的指定量(50-200(xg/只小鼠)的PTD-GFP或PTD-PTF融合蛋白腹腔內注射。參見(Kay等，《人類基因治療》1992;3(6):641-647)。經尾靜脈抽血監測血糖水平。接著採集不同組織包括胰腺和肝臟用於免疫組織化學分析生成胰島素的細胞和生成胰高血糖素的細胞的存在。對於PTD-PTF融合蛋白的門靜脈遞送，使用異氟烷麻醉5-6周齡的小鼠，並根據國立實驗動物管理與使用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)方案進4亍手術才喿作。將動物剃毛，在上腹部區域中製造l-2cm的切口，以暴露門靜脈。將特殊的導管放置入門靜脈的一個主要分枝中，將出口與植入在小鼠腹部皮膚下的Alzet滲透泵連接(Theeuwes等，AnnBiomedEng(《生物醫學年評》)1976;4(4):343-353)。將PTD融合蛋白經導管以恆定速率持續不同時間遞送至門靜脈。對於糖尿病小鼠，監測血糖水平，如先前Cao等，《糖尿病》，2004;53(12):3168-3178和Tang等,《實驗室包埋》2006;86:83-93中所述在標準化血糖之後進行IPGTT。在某些時間點，處死小鼠，收集肝臟、脾臟、腎臟、十二指腸和胰腺的組織，以及植入的重編程的肝細胞。這些組織用於形態學分析、免疫染色(石蠟切片)，和基因表達，以及用於通過ESISA測定組織胰腺激素含量(冷凍組織)，諸如胰島素、胰高血糖素和澱粉酶。小型滲透泵植入和PTD-PTF遞送PTD-PTF融合蛋白的長期給藥通過在異氟烷麻醉下皮下植入Alzet小型滲透泵而實現(Alza,2001型號-1周，或2002型號-2周)(Theeuwes等，《生物醫學年評》1976;4(4):343-353;Heinrichs等，《美國科學院院刊》1996;93(26):15475-15480),輸注泵的出口與導管連接允許PTD-PTF融合蛋白連續輸入門靜脈或腹腔。Alzet滲透泵提供了以可預測水平不間斷暴露於試驗試劑，允許下述事項短半衰期蛋白的持續給藥(實驗動物長期給藥的方便方法)；使不想要的實驗變量最小化，並確保可再現的恆定的結果；消除對於夜間或周末給藥的需要；減少對實驗動物的處理和應激；小至足夠用於小鼠或非常年幼的大鼠；以及使得製劑靶向遞送至幾乎任何組織。皮下植入泵，以lul/小時速率持續1周或以0.5ul/小時的速率持續2周輸注PTD-PTF融合蛋白(溶解於PBS中或單獨以PBS作為對照載體)。為了實現10ug/g體重/天的PTD-PTF的劑量，將5-10mg/ml的母液用於具有20g體重的小鼠，並相應調整。在植入之前通過在37。C水浴中過夜溫育來激活滲透泵，以經時間標準化PTD-PTF融合的起始和速率。蛋白質印跡在1600小時時植入PTD-PTF泵，並且在移除泵之後24小時檢測血糖水平。採集小鼠組織，並使用PBS勻漿化緩衝液(l%Triton-X、1mM苯甲磺醯氟以及蛋白酶抑制劑雞尾酒)提取蛋白。於4。C在20,000rpm離心組織裂解物30分鐘。在使用Bio-Rad蛋白試劑實施的標準蛋白分析中測定上清液的蛋白濃度。將上清液與等量的2xSDS樣品緩沖液混合，並加熱至95。C持續5分鐘。然後在15,000rpm離心加熱的混合物5分鐘，以去除不溶解的物質。使用SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳分析上清液。將蛋白轉移至硝酸纖維素膜，並使用抗V5抗體(1:5000)或使用抗GFP抗體進行印跡，然後使用電化學發光(AmershamECL發光系統(AmershamPharmaciaBiotech,Buckinghamshire,英國))觀察。使用光密度掃描儀器通過光密度法對融合蛋白水平進行定量。RT-PCR、組織學、免疫組織化學以及焚光顯樣史術這些方法在我們的實驗室中得到良好建立，其詳細情況可見於下列出版物(它們的內容通過引用併入本申請)Cao等，《糖尿病》2004;53(12):3168-3178;Tang等，《實驗室包埋》2006;86:83-93。對於觀察組織切片中的GFP蛋白，將小鼠組織固定於福馬林中過夜，並轉移至50%蔗糖中12小時。將組織切為冷凍切片，並使用含有DAPI的封固劑覆蓋載玻片。在螢光顯樣i鏡下對含有GFP的細胞進行觀察並照相。質粒和質粒構建如下，通過將VP16的激活結構域(80個胺基酸)與小鼠的Pdxl的COOH末端融合而構建Pdxl-VP16。使用T7引物和包括Clal位點(5'-TCGCAGTGGATCGATGCTGGAG-3')的3'引物從IPFl-pcDNA3分離全長的Pdxl。使用HindIII和Clal切割產物並將其亞克隆至pCS2+的VP16-N中(《糖尿病》，2004;53:3033-3345)。然後，將Pdxl-VP16亞克隆至pcDNA3的HindIII和Xbal位點中。PTD序列被添加於該序列。腺病毒相關病毒血清型2(AAV2)載體我們實驗室構建了含有小鼠Pdxl、Pdxl-VP16、Ngn3編碼序列的所有AAV2-PTF質粒。已經證實了這些病毒的質量和滴度。簡而言之，使用合適的正向和反向引物通過pfU乂人GFP和PTF(小鼠Pdxl、mPdxl-VP16以及mNgn3)的編碼序列相應的pCRT-cDNA質粒擴增它們(開始於XbaI位點並結束於HpaI位點)。在加A反應之後，使用pCR2.1-TOPO載體連接這些PCR產物。通過XbaI和HpaI消化含有正確插入序列和AAV骨架質粒(pUFl1)的陽性克隆。通過凝膠純化回收6.2kb的pUFll載體和DNA插入序列(mPdxl、mPdxl-VP16以及mNGN3),然後根據標準操作程序連接。通過限制性酶消化和序列分析儀確認來自所選的陽性克隆的編碼序列和正確方向。AAV-PTF載體質粒具有雞(3-肌動蛋白啟動子和CMV增強子。通過293細胞的三重質粒轉染產生AAV2載體。使用CsCl梯度超速離心純化AAV2-PTF病毒，並通過實時PCR以每ml基因組拷貝數測定病毒顆粒(VP)的滴度。通過銀染的SDS-PAGE評價載體的純度。將濃縮的載體分成等份，儲存在-80。C用於體內研究。rPdxl蛋白的構建和製備通過PCR擴增全長的小鼠PdxlcDNA，並亞克隆至pET28b(Novagen)的NdeI和XhoI位點中。於37。C培養含有表達質粒的BL21(DE3)細胞至O.D,為0.8的光密度。將異丙基(3-D-l-硫代半乳糖苷(IPTG)添加至0.5mmol/L的終濃度，然後於18。C溫育18小時。於含有5mM咪哇和蛋白酶抑制劑的緩衝液A(RocheDiagnostics)中通過脈衝聲處理裂解細菌。將離心後獲得的細菌裂解物的上清液應用於氮川三乙酸鎳(Ni-NTA)瓊脂糖柱(Invitrogen),並使用幾種體積量的洗滌緩衝液(含有25mM咪唑的緩衝液A)洗滌。通過含有250mM咪唑的洗脫緩沖液洗脫蛋白。在PBS透析之後通過SDS-PAGE/考馬斯藍染色表徵所洗脫的蛋白部分的純度。PTD-GFP蛋白的構建和製備通過PCR方法構建在GFP的N末端具有HIV-1TAT的11個胺基酸(YGRKKRRQRRR)的質粒。將PCR片段直接克隆至pT7/CT-TOPO表達質粒(Invitrogen)中。4艮大程度上如所述用於rPdxl蛋白的方法進行蛋白製備和純化。pNeuroD-GFP和小鼠Pdxl慢病毒載體的製備如先前所述構建含有小鼠Pdxl的cDNA編碼序列的慢病毒載體(LV)(Tang等，《實驗室包埋》86,83-93(2006))。通過PCR複製人類NeuroD/(32啟動子(Miyachi等，《腦研究分子腦研究》69,223-231(1999))的950bp報告基因構建體(-940至+10),並與GFP連接。通過將pNeuroD-GFP基因插入pTYF載體盒而構建LV。製備慢病毒，並如先前所述測定滴度(Tang等，《實驗室包埋》86,83-93(2006))。細胞進入和免疫印跡使用純化的rPdxl(0.2nm)處理70%匯合的WB細胞(大鼠肝臟上皮幹細胞)15分鐘、30分鐘、l小時、2小時、6小時、12小時以及24小時。使用PBS洗滌細胞三次，並將其收穫於含有蛋白酶抑制劑混合物74的細胞裂解緩沖液(150mMNaCl,50mMTris-HCl,pH7.5，500pMEDTA，1.0%TritonX-100以及1%去氧膽酸鈉)(RocheDiagnostics)中。如先前所述13使用兔抗Pdxl血清(1:1000,使用純化的小鼠rPdxl產生)或抗His抗體(1:2000，Invitrogen)通過蛋白質印跡檢測細胞裂解物中的rPdxl(50jig/泳道)，用於細月包進入研究。細胞轉導和流式細胞術分析首先，在如先前所述1的操作程序之後以20的感染複數通過LV-pNeuroD-GFP轉導70%匯合的WB細胞。然後，在存在或不存在0.5|imrPdxl蛋白的情況下，溫育轉導的WB細胞。使用LV-Pdxl(用作細胞產生的Pdxl蛋白的陽性對照)轉導含有pNeuroD-GFP的WB細胞。在處理後72小時收穫細胞，於10/o甲醛中固定10分鐘，然後使用PBS加P/。BSA洗滌3次，並重懸浮用於流式細胞分析。使用處理的細胞製備細胞離心塗片器載玻片，並使用含有DAPI的封固劑覆蓋。動物研究如先前所述,使用鏈唑黴素(Stz)(Sigma)以50mg/kg體重(bw)劑量注射Balb/c小鼠，連續5天，誘導糖尿病。具有連續兩個讀數為約300mg/dL的空腹血糖水平的動物接受蛋白治療。使用純化的rPdxl或GFP蛋白(0.1mg/天/只小鼠)腹腔內注射糖尿病小鼠連續10天。在小鼠被剝奪食物8小時之後使用血糖測計儀定期測量空腹血糖水平。動物研究的順序實驗事件總結於流程1(圖25C)中。腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)在進行IPGTT之前使小鼠空腹8小時。使用葡萄糖(lmg/gbw)腹腔內注射正常小鼠、rPdxl治療的小鼠或GFP治療的小鼠，並於注射後5分鐘、15分鐘、30分鐘、60分鐘以及120分鐘測量血糖水平。在全身麻醉條件下進行次全胰切除術(約90%)。在不同時間點處死小鼠，採集器官組織和血液用於後面的組織學、基因表達、胰腺/肝臟組織含量以及血清胰島素水平的研究。Pdxl蛋白體內動力學和組織分布使用O.lmg或lmg的rPdxl腹腔內注射小鼠。在15分鐘、30分鐘、l小時、2小時、6小時以及24小時時抽取血液樣品。收穫來自正常小鼠和rPdxl治療的小鼠的器官組織切片，固定於10%福馬林，並包埋於石蠟中，用於使用抗Pdxl抗體(1:1000)的Pdxl免疫染色。從血液樣品分離血清，將30pl/泳道裝載於SDS-PAGE凝膠以分離血清蛋白，然後如上所述使用抗Pdxl抗體進4亍蛋白質印跡。RT-PCR使用Trizol試劑從小鼠胰腺和肝臟組織製備總RNA，並使用superscriptIII逆淨爭錄酶(Invitrogen,CA)<吏用隨才幾六聚體引物合成cDNA。如先前所述(Cao等，《糖尿病》53,3168-3178(2004))通過RT-PCR測定肝臟基因表達。將正向和反向PCR引物設計成位於不同外顯子中，它們的序列列於補充的數據(表1)中。在所有RT-PCR分析中不包括RT、陽性以及空白對照。結果代表至少三個獨立的實-驗。實時定量RT-PCR分析使用SYBR綠作為用於各循環過程中的PCR產物量的分析物，在熱循環儀檢測系統(MJresearchInc.DNAengineopticon2)中，使來自GFP治療的對照小鼠和rPdxl治療的小鼠的胰腺組織的cDNA以兩份或三份經受三個獨立的PCR反應。根據實時PCR條件設計引物，其序列列於表l中。對於實時PCR，需要95°C的起始變性溫度15分鐘，以激活酶，56°C的退火溫度用於所有引物對。PCR擴增進行38個循環。免疫組織化學和免疫螢光將來自不同器官的組織固定於10%福馬林中24小時，並在製備石蠟塊之前轉移至PBS。使用抗豬胰島素第一抗體(1:1000,Dako)、抗Pdxl第一抗體(1:5000,CV.Wright饋贈)、抗胰高血糖素第一抗體(1:200，Dako)溫育切片，然後使用抗小鼠或兔IgG的-束根過氧化物酶HRP(Dako)共軛的第二抗體(1:5000)溫育。如先前所述3使用DAB底物試劑盒(Dako)觀察具體的免疫染色。對於雙免疫螢光，使用豚鼠抗豬胰島素第一抗體(1:200，Dako)和山羊抗胰高血糖素第一抗體(1:50，SantaCruz)於4。C過夜溫育石蠟包埋切片(5pm)，然後使用FITC共軛的驢抗豚鼠IgG(1:1000,RDI)和alexafluor594螢光染料共輒的驢抗山羊第二抗體溫育(1:500，Invitrogen,Molecularprobes)。通過ELISA進行的組織和血清胰島素測量收穫胰腺和肝臟的完整器官，稱重，並根據較小改變的公開的操作程序4使用相應量(1mlbuffer/0.1g肝臟或0.05g胰腺)立即將其放置於冰上的酸性乙醇溶液中(於70%乙醇中的180mMHC1)。才艮據製造商的說明使用超敏感的小鼠胰島素ELISA試劑盒(ALPCO)測量組織胰島素水平。立即通過BIO-RAD3550-UV酶標儀測量光學吸光度。將最終結果轉化為胰島素/mg胰腺組織或ng胰島素/g肝臟組織。對於血清胰島素測量，首先將正常小鼠和治療的小鼠禁食6小時，並在葡萄糖(lmg/gbw)刺激之後15分鐘採集血液樣品。如在組織胰島素ELISA中所述測定血清胰島素水平。統計學分析通過使用獨立的樣品t檢驗分析我們的實驗結果的統計學顯著性，需要小於0.05的P值用於將數據考慮為具有統計學顯著性。其他實施方案對於前面的描述，顯而易見的是可以對本文所述的發明進行改變和變更以使其適應不同的用途和條件。這些實施方案也在下文的權利要求的範圍之內。本文中變量的任何定義中一系列元素的引用包括作為任何單個元素77或所列元素的組合(或亞組合)的變量的定義。本發明實施方案的引用包括作為任何單個實施方案的實施方案或與任何其他實施方案或其部分組合的實施方案。在該說明書中提到的所有專利和出版物以如同各獨立的專利和出版物特別和獨立地通過引用併入本申請的相同的程度併入本申請。具體地，Cao等，《糖尿病》2004;53(12):3168-3178;Tang等，《實驗室包埋》2006;86:83-93;以及國際專利公布號WO2005/083059的全部內容通過引用整體併入本申請。權利要求1.一種用於細胞重編程的方法，所述方法包括(a)使所述細胞接觸與包含蛋白轉導結構域融合的轉錄因子多肽或其片段的融合蛋白；並且(b)改變所述細胞中至少一種多肽的表達水平，由此使所述細胞重編程。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞選自脂肪細胞、骨髓衍生細胞、表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、肝細胞、肌細胞、神經元、胰腺細胞和它們的祖細胞或幹細胞。3.根據權利要求1所述的方法，其中使所述細胞體外或體內接觸。4.根據權利要求1所述的方法，其中所述改變是在相應對照細胞中不可^r測地表達的多肽的水平增加。5.根據權利要求1所述的方法，其中所述重編程的細胞表達胰島素。6.—種用於產生胰島素生成細胞的方法，所述方法包括(a)使細胞接觸包含蛋白轉導結構域的胰腺轉錄因子或其片段，並且(b)增加所述細胞中胰島素的表達，由此產生胰島素生成細胞。7.才艮據權利要求6所述的方法，其中所述細胞選自脂肪細胞、骨髓衍生細胞、表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、肝細胞、肌細胞、神經元、胰腺細胞和它們的祖細胞或幹細胞。8.根據權利要求7所述的方法，其中所述細胞是肝細胞或肝臟衍生細胞。9.根據權利要求6所述的方法，其中所述步驟(a)的細胞在接觸所述融合蛋白之前不能表達可檢測水平的胰島素。-10.根據權利要求6所述的方法，其中所述轉錄因子選自Pdx-l、Pdx-l/VP16、Ngn3、Pax4、N畫D1、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6以及MafA。11.一種用於產生胰島素生成細胞的方法，所述方法包括使胰腺細胞接觸包含Pdx-l多肽、VPA16激活結構域以及蛋白轉導結構域的蛋白或其生物活性片段，由此誘導胰腺細胞再生。12.根據權利要求11所述的方法，其中所述胰腺細胞體外或體內接觸。13.根據權利要求11所述的方法，其中所述接觸增加胰島素生成細胞的數量。14.根據權利要求11所述的方法，其中所述再生通過複製或新生而發生。15.根據權利要求11所述的方法，其中所述方法還包括使所述細胞接觸包含Ngn3和蛋白轉導結構域的蛋白或其生物活性片段。16.—種用於產生胰島素生成細胞的方法，所述方法包括使肝臟衍生細胞接觸包含Pdx-l多肽、VPA16激活結構域以及蛋白轉導結構域的蛋白或其生物活性片段，由此誘導胰腺細胞再生。17.根據權利要求1-16任一項所述的方法，其中使所述肝臟衍生細胞體外或體內接觸重組融合蛋白。18.根據權利要求17所述的方法，其中所述體內接觸通過經門靜脈將所述融合蛋白遞送至受治療者而發生。19.根據權利要求16所述的方法，其中通過所述肝臟衍生細胞的轉分化而產生所述胰島素生成細胞。20.—種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法包括(a)使所述受治療者的細胞接觸與蛋白轉導結構域融合的胰腺轉錄因子或其片段；並且(b)增加所述細胞中胰島素的表達，由此產生胰島素生成細胞。21.根據權利要求20或22所述的方法，其中所述體細胞選自脂肪細胞、骨髓衍生細胞、表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、肝細胞、肌細胞、神經元、胰腺細胞和它們的祖細胞或幹細胞。22.根據權利要求6所述的方法，其中所述轉錄因子選自Pdx-l、Pdx國l/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6以及MafA。23.—種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法包括(a)使所述受治療者的成體胰腺細胞接觸包含Pdx-l多肽、VP16激活結構域以及蛋白轉導結構域的融合蛋白或其生物活性片^a;並且(b)誘導所述成體胰腺細胞再生，由此改善所述受治療者的高血糖。24.—種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法包括(a)使肝臟衍生細胞接觸包含Pdx-l多肽、VP16激活結構域以及蛋白轉導結構域的融合蛋白或其生物活性片段；並且(b)產生胰島素生成細胞，由此改善所述受治療者的高血糖。25.根據權利要求23所述的方法，其中所述成體細胞是肝細胞或肝臟衍生細胞。26.根據權利要求20-23任一項所述的方法，其中所述受治療者患有l型或2型糖尿病。27.根據權利要求20-23任一項所述的方法，其中所述步驟(a)的細胞在接觸所述融合蛋白之前不能表達可檢測水平的胰島素。28.根據權利要求20-23任一項所述的方法，其中所述方法降低所述受治療者的血糖水平。29.根據權利要求20-23任一項所述的方法，其中所述方法正常化所述受治療者的血糖水平。30.根據權利要求20-23任一項所述的方法，其中所述方法還包括進行有效量的包含Ngn3多肽、蛋白轉導結構域或其生物活性片段的融合蛋白的給藥。31.根據權利要求1-30任一項所述的方法，其中所述方法還包括獲得所述多肽的步驟。32.根據權利要求1-30任一項所述的方法，其中所述方法還包括以使得給藥反映發育過程中內源型轉錄因子的時間點的方式而進行Pdx-1、Pdx-l/VP16、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6以及MafA中的任何一種或多種的給藥。33.根據權利要求32所述的方法，其中所述給藥方法提供細胞內的有效量Pdxl蛋白持續至少約0-4天。34.根據權利要求33所述的方法，所述方法還包括進行接下來Ngn3的給藥，使得有效量Ngn3存在至少約2-6天。35.根據權利要求34所述的方法，所述方法還包括進行接下來Pax4的給藥，使得有效量Pax4存在至少約4-8天。36.根據權利要求35所述的方法，所述方法還包括進行Pdxl的給藥，使得有效量Pdxl持續於所述細胞中，其中在Pax4存在於細胞中的同時發生Pdxl的給藥。37.根據權利要求1-35任一項所述的方法，其中所述受治療者是動物或人類患者。38.—種融合多肽，所融合多肽包含(a)與胰腺轉錄因子具有至少85%胺基酸同一性的多肽；和(b)蛋白轉導結構域，其類似物或其片段，其中所述融合多肽在細胞中的表達相對於相應對照細胞改變至少一種多肽的表達。39.根據權利要求38所述的融合多肽，其中所述胰腺轉錄因子是早期因子或晚期因子。40.根據權利要求39所述的融合多肽，其中所述胰腺轉錄因子選自Pdx-l、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6以及MafA。41.根據權利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含人類胰腺轉錄因子。42.根據權利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽還包含皰滲病毒VP16激活結構域或其片段或其類似物。43.根據權利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽還包含用於純化的序列標籤。44.根據權利要求38所述的融合多肽，其中所述序列標籤是六組氨酸標籤。45.根據權利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽還包含特異性結合抗體的抗原結構域。46.根據權利要求45所述的融合多肽，其中所述抗原結構域是V5結構域。47.根據權利要求38所述的融合多肽，其中所述融合多肽包含或基本組成為(a)人類Pdx-l多肽或其片段；(b)單純皰滲病毒VP16激活結構域；以及(c)蛋白轉導結構域，或其生物活性片段。48.—種融合多肽，所述融合多肽包含胰腺轉錄因子啟動子和可檢測的結構域。49.根據權利要求38所述的融合多肽，其中所述啟動子選自Pdx-l、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6以及MafA。50.根據權利要求49所述的融合多肽，其中所述可檢測的結構域選自綠色螢光蛋白、紅色螢光蛋白、葡萄糖醛酸糖苷酶(GUS)、螢光素酶、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)以及(3-半乳糖苷酶。51.根據權利要求38-50任一項所述的融合多肽，其中所述多肽還包含促進所述多肽純化的胺基酸序列標籤。52.根據權利要求48所述的融合多肽，其中所述序列標籤是六組氨酸標籤或GST。53.根據權利要求38-52任一項所述的融合多肽，其中序列比較是所述多肽或肽片段的總長度。54.根據權利要求38-52任一項所述的融合多肽，其中所述多肽包含延長所述多肽半衰期、增加所述多肽吸收或提供所述多肽的持續釋放的改變。54.—種表達載體，所述表達載體包含編碼權利要求37-51任一項所述的多肽的核酸序列。55.根據權利要求54所述的表達載體，所述表達載體包含可操作地連接所述核酸序列的啟動子。56.根據權利要求54所述的表達載體，其中所述啟動子被定位用於在細菌或哺乳動物細胞中表達。57.—種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求40至41任一項所述的表達載體。58.根據權利要求57所述的宿主細胞，其中所述細胞是原核細胞或真核細胞。59.根據權利要求57所述的宿主細胞，其中所述細胞選自細菌細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞以及酵母細胞。60.—種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求38-52任一項所述的融合多肽。61.根據權利要求60所述的宿主細胞，其中所述細胞是來自人類或動物受治療者的哺乳動物細胞。62.根據權利要求61所述的宿主細胞，其中所述細胞選自脂肪細胞、骨髓衍生細胞、表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、肝細胞、肌細胞、神經元、胰腺細胞和它們的祖細胞或幹細胞。63.根據權利要求60所述的宿主細胞，其中所述宿主細胞還包含含有Ngn3和蛋白轉導結構域的融合多肽或其生物活性片段。64.—種組織，所述組織包含權利要求60-63任一項所述的宿主細胞。65.—種器官，所述器官包含權利要求60-63任一項所述的宿主細胞。66.—種基質，所述基質包含權利要求60-63任一項所述的宿主細胞。67.—種用於產生權利要求32-40任一項所述的重組多肽的方法，所述方法包括(a)提供一種使用38-52任一項所述的被定位在細胞中表達的分離的核酸分子轉化的細胞；(b)在用於表達所述核酸分子的條件下培養所述細胞；(c)以及分離所述多肽。68.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含於藥學上可接受的賦形劑中的有效量的38-52任一項所述的多肽或權利要求60-63任一項所述的宿主細胞。69.根據權利要求68所述的藥物組合物，所述藥物組合物還包含有效量的含有Ngn3胺基酸序列和蛋白轉導結構域的融合多肽或其生物活性片段。69.—種包裝的藥劑，所述藥劑包含(a)權利要求38-52任一項所述的多肽或權利要求60-63任一項所述的宿主細月包；(b)使用所述多肽或細胞以改善受治療者的高血糖的說明書。70.根據權利要求70所述的藥劑，其中所述多肽被配製成增強所述多肽的半衰期、增加所述多肽的吸收或提供所述多肽的持續釋放。71.—種用於治療高血糖的藥盒，所述藥盒包含有效量的權利要求38-52任一項所述的融合多肽或權利要求60-63任一項所述的宿主細胞及其使用說明書。72.根據權利要求71所述的藥盒，其中所述高血糖與1型或2型糖尿病有關。73.—種病毒載體，所述載體包含38-52任一項所述的多肽。74.—種腺病毒相關病毒(AAV)載體，所述載體包含選自Pdx-l、Ngn3、Pax4、NeuroDl、Nkx2.2、Nkx6.1、Isll、Pax6以及MafA的胰腺轉錄因子，其中所述多肽可操作地連接被定位用於在哺乳動物細胞中表達的啟動子。75.—種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法包括(a)使所述受治療者的細胞接觸權利要求74所述的AAV載體；並且(b)誘導所述細胞表達胰島素，由此改善所述受治療者的高血糖。76.—種改善有需要的受治療者的高血糖的方法，所述方法包括(a)使所述受治療者的肝臟衍生細胞接觸權利要求74所述的AAV載體；並且(b)並且誘導所述細胞表達胰島素，由此改善所述受治療者的高血糖。77.—種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求73所述的AAV載體。78.根據權利要求77所述的宿主細胞，其中所述細胞是成體細胞、胚胎幹細胞、肝細胞或胰腺細胞。79.根據權利要求77所述的宿主細胞，其中所述細胞選自脂肪細胞、骨髓衍生細胞、表皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞、造血細胞、肝細胞、肌細胞、神經元、胰腺細胞和它們的祖細胞或幹細胞。80.—種藥物組合物，所述藥物組合物包含於藥學上可接受的賦形劑中的有效量的權利要求74所述的腺病毒載體。81.—種治療受治療者糖尿病的方法，所述方法包括使所述受治療者接觸有效量的Pdxl多肽，以誘導選自Pdxl、INGAP、Reg3d、Reg3g以及胰腺炎相關蛋白Pap的基因在所述受治療者組織中的表達，由此治療糖尿病。82.根據權利要求81所述的方法，其中所述表達增加選自下述情況Pdxl增加約3-4倍，INGAP表達增加約14-15倍，Reg3d表達增加約7-8倍，Reg3g增加約6-7倍，以及胰腺炎相關蛋白Pap增加30-35倍。83.根據權利要求81所述的方法，所述方法增加選自下述的基因的表達Pdxl、胰島素I、胰高血糖素、彈性蛋白酶、IAPP、胰島素II、促生長素抑制素、NeuroD、Isl-l以及胰腺外分泌基因p48和澱粉酶。84.根據權利要求81所述的方法，其中至少兩種、三種、四種或五種基因的表達增加。85.根據權利要求81所述的方法，其中所有所述基因的表達增加。86.—種誘導有需要的受治療者中胰島(3細胞再生的方法，所述方法包括將有效量的Pdxl蛋白給藥至所述受治療者並且誘導胰島(3細胞再生。87.根據權利要求86所述的方法，其中PDX1的給藥量為至少約1-5mg/kg體重。88.根據權利要求86所述的方法，其中經靜脈注射或腹腔注射進行PDX1的給藥。89.根據權利要求86所述的方法，其中所述方法增加胰島素水平至少約1-20倍。90.根據權利要求86所述的方法，其中PDX1的給藥增加選自下述的基因的表達Pdxl、INGAP、Reg3d、Reg3g、胰腺炎相關蛋白Pap、胰島素I、胰高血糖素、彈性蛋白酶、IAPP、胰島素II、促生長素抑制素、NeuroD、Isl-l以及胰腺外分泌基因p48和澱粉酶。全文摘要本發明提供了用於治療以感興趣的細胞的數量或生物活性缺乏為特徵的疾病、紊亂或損傷的治療組合物和方法。所述方法提供了用於生成重編程的細胞或用於增加感興趣的細胞、組織或器官的再生的組合物。這樣的方法可用於治療具有特定細胞類型缺乏或該細胞類型產生的多肽缺乏的受治療者。具體地，本發明提供了用於改善或預防與1和2型糖尿病相關的高血糖及有關併發症的預防和治療方法以及組合物。文檔編號A61K39/00GK101553245SQ200780034605公開日2009年10月7日申請日期2007年7月19日優先權日2006年7月19日發明者楊李軍申請人:佛羅裡達大學研究基金會有限公司