治療包括炎症狀況的疾病的寡核苷酸組合物和方法

2023-06-11 12:42:51

專利名稱：治療包括炎症狀況的疾病的寡核苷酸組合物和方法
技術領域：
本發明涉及用於基於反義寡核苷酸治療的方法、試劑和組合物。具體地，本發明涉及基於反義寡核苷酸治療在治療與患者中cAMP降低相關疾病中的應用，這些疾病包括，例如，PDE相關的疾病如炎症狀況。本發明還涉及基因治療方法和鑑定環狀AMP磷酸二酯酶參與的新的基於反義的策略的方法。
背景技術：
肺泡和氣道上皮被認為是動態屏障，在調節對氧化應激的炎性和代謝應答、膿毒症、內毒素血症和其它肺部關鍵疾病中起重要作用。呼吸上皮尤其是在上皮-血液界面的炎性/感染性狀況的主要靶，並且其自身能通過募集炎性細胞並產生炎性介質而放大炎症信號。
慢性阻塞性肺病(COPD)是炎性氣道和肺泡疾病的一個實例，其中炎症持續上調被認為起重要作用。COPD的炎症特徵是嗜中性粒細胞、CD8陽性淋巴細胞和巨噬細胞在氣道中的浸潤增加。嗜中性粒細胞和巨噬細胞在COPD的氣道炎症病變中起重要作用，因為它們能釋放多種介質，包括彈性蛋白酶、金屬蛋白酶、和氧自由基，它們能促進組織炎症和損傷。已經提出COPD患者氣道中的炎症細胞積累是因為促炎細胞因子釋放增加和吸引炎症細胞到氣道中並活化和維持其存在的趨化因子的釋放增加。這些存在的細胞還釋放酶(如金屬蛋白酶)和氧自由基，它們對組織有負作用並使疾病持續。已經顯示，在COPD患者的肺中大量促炎症細胞因子和趨化因子增加。其中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和白細胞介素8(IL-8)有重要作用，它們在COPD患者的氣道中增加。
炎症似乎起重要作用的呼吸系統疾病的其它實例包括哮喘、嗜酸性粒細胞性咳嗽、支氣管炎、急性和慢性肺異體移植排斥、結節病、肺纖維化、鼻炎和鼻竇炎。哮喘的特徵為氣道炎症、可逆性阻塞和氣道高反應性。在這種疾病中，參與的炎症細胞主要是嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞和肥大細胞，儘管嗜中性粒細胞和巨噬細胞也很重要。已經表明，大量細胞因子和趨化因子在氣道中增加並通過促進炎症、阻塞和高反應性在該病的病理生理中起重要作用。
嗜酸性粒細胞性咳嗽特徵是慢性咳嗽和在患者氣道中存在炎症細胞，其中多為嗜酸性粒細胞，而缺少氣道阻塞或高反應性。該疾病中，幾種細胞因子和趨化因子也增加，儘管它們多是針對嗜酸性粒細胞。嗜酸性粒細胞被募集到氣道中並被活化，並可能釋放酶和氧自由基，它們在維持炎症和咳嗽中起作用。
急性支氣管炎是在下氣道感染或刺激性事件期間發生的急性疾病，這些事件例如由於汙染、塵、氣體或化學物而引起。慢性支氣管炎特徵是在兩年中至少3個月的多數天裡存在咳嗽和產生痰。在急性或慢性支氣管炎期間，還可以在氣道中發現炎症細胞多數是嗜中性粒細胞，以及廣泛的趨化因子和細胞因子。這些介質被認為在疾病期間出現的炎症、症狀和粘液產生中起作用。
肺移植在具有晚期肺病的患者中進行。當身體的炎症細胞，淋巴細胞不識別供體器官為「自己」時發生急性和更重要的慢性異體移植排斥。炎症細胞被趨化因子和細胞因子募集並釋放大量導致組織破壞的酶，在慢性排斥時疾病被稱為閉塞性細支氣管炎。
結節病是組織內發生慢性非乾酪性肉芽腫的未知原因疾病。肺是最經常受影響的器官。支氣管肺泡灌洗顯示主要是淋巴細胞、巨噬細胞增加，有時嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞也增加。這些細胞也被細胞因子和趨化因子募集並活化，並被認為參與疾病發生。
肺纖維化是以進行性和慢性纖維化(形成疤痕)為特徵的肺組織疾病，這種纖維化將導致慢性呼吸功能不全。肺纖維化存在不同的類型和原因，但其特徵都具有炎症細胞流入和持續、成纖維細胞活化和增殖將膠原沉積在肺組織中。這些事件似乎與肺組織內釋放細胞因子和趨化因子有關。
急性鼻炎是在鼻或上氣道感染或刺激性事件期間發生的急性疾病，這些事件例如由於汙染、塵、氣體或化學物而引起。慢性鼻炎特徵是持續存在慢性流鼻涕、鼻充血、噴嚏和瘙癢。在急性或慢性鼻炎期間，還可以在上氣道中發現炎症細胞以及廣泛的趨化因子和細胞因子。這些介質被認為在疾病期間出現的炎症、症狀和粘液產生中起作用。
急性鼻竇炎是急性、通常是感染性鼻竇疾病，其特徵是鼻充血、流鼻涕、膿痰、頭痛或鼻竇痛，有或無發燒。慢性鼻竇炎特徵是急性鼻竇炎症狀持續超過6個月。在急性或慢性鼻竇炎期間，還可以在上氣道和鼻竇中發現炎症細胞以及廣泛的趨化因子和細胞因子。這些介質被認為在疾病期間出現的炎症、症狀和粘液產生中起作用。
如上所述，這些炎性呼吸系統疾病都具有這些特徵存在募集和活化不同炎症細胞的介質，這些細胞釋放引起症狀的酶或氧自由基，持續炎症，和當慢性疾病時破壞或損壞正常組織。
合理的治療方法是下調細胞因子和趨化因子生成和炎症細胞應答。這已經通過局部或全身性施用皮質類固醇在所有上述疾病中獲得不同程度的成功。皮質類固醇是免疫抑制性的，不僅對炎症細胞有作用而且對身體的其它細胞也有作用，當長期施用時導致毒性。
儘管COPD、哮喘和其它炎性呼吸系統疾病藥物的可用性，這些疾病的流行和發病率保持穩定或增加。顯而易見，對於炎性呼吸系統疾病治療有未被滿足的醫療需求，並且急迫需要創新性治療劑。基於反義寡核苷酸的治療提供新的替代性方法，它選擇性降低特定基因的表達而沒有傳統治療策略的不期望的毒性作用。反義治療正被研究用於治療幾種疾病。之前如WO9966037所述已經表明，針對炎性介質受體的反義寡核苷酸能被給予到肺並下調其靶。
對於炎性呼吸系統疾病或任意其它系統性炎性疾病，使大量細胞釋放促炎症細胞因子和趨化因子下調並對抗炎性介質或酶釋放有更低作用的治療方法可能具有超過當前治療的優點。
環狀核苷酸cAMP和cGMP是參與信號轉導途徑和機制的遍在性第二信使。哺乳動物細胞已經進化出複雜和高度保守性的酶系統，通過多種和複雜的前饋和反饋機制，這些酶調節環狀核苷酸的生成和滅活。cAMP和cGMP都是從各自的三磷酸形式(ATP和GTP)分別由腺苷醯(腺苷酸)或鳥苷醯(鳥苷酸)環化酶的催化活性形成，這些酶描述於Essayan D.M.Cyclic nucleotide phosphodiesterase(PDE)inhibitors and immunomodulation.Biochem.Pharmacol.，1999，57，965-973。cAMP/cGMP滅活是通過由環狀核苷酸依賴性磷酸二酯酶(PDE)催化水解切割3』-磷酸二酯鍵、導致形成相應的無活性5』-單磷酸而實現的，如下所述Essayan，1999 and Perry M.J.and Higgs G.A.Chemotherapeutic potential of phosphodiesterase inhibitors.1998，CurrOpon Chem Biol.4472-81。
已經表明，炎症應答及其進展對於環狀核苷酸穩態水平的調節極其敏感，這些作用的靶細胞超過免疫細胞的範圍還包括另外的細胞如氣道平滑肌細胞、上皮細胞和內皮細胞和神經元細胞，如Perry andHiggs，1998；Essayan，1999所述。在此方面，細胞內環狀核苷酸調節在炎症調節中起主要作用的概念顯現出來，並在最近演變為靶向和提高炎症/自身免疫應答。因此提示體外和體內環狀核苷酸PDE抑制劑具有作為抗抑鬱劑、抗增殖劑、免疫調節劑、宮縮抑制劑(tocolytics)、變力性劑/變時性劑(inotropes/chronotropes)、和細胞保護劑的潛在治療用途。
細胞內cAMP似乎不僅在平滑肌鬆弛、活化和增殖中，而且在調節炎症細胞釋放介質中具有基礎作用。降低的cAMP水平能導致氣道上皮細胞中炎症介質如TNF-α、GM-CSF和IL-8生成增加。
細胞因子在細胞穩態以及炎症/自身免疫/感染性疾病中的調節作用的分子機制研究已經開始提供設計藥理介入的治療策略的新方法。一種這樣的方法是PDE酶阻斷的化學治療潛能，這顯示對於廣泛疾病狀態的有前景治療劑的現象多樣性和複雜性。PDE抑制的一種機理性理解集中於環狀核苷酸(cAMP/cGMP)的免疫調節特性，從而為由此能清楚證明抗炎性、治療性應用作準備。
炎症應答及其進程對於環核苷酸穩態水平的調節極其敏感，這些作用的靶細胞超過免疫細胞的範圍還包括結構細胞如上皮細胞、平滑肌細胞和內皮細胞和神經元細胞(Perry and Higgs，1998；Essayan，1999)。細胞內環狀核苷酸調節在炎症調節中起主要作用。環狀核苷酸PDE是大的、生長中的多基因家族，包括至少11個PDE同工酶家族。PDE的區別在於其組織和細胞分布、以及其分子和理化性質包括核苷酸和蛋白質序列、底物特異性、抑制劑敏感性和輔因子要求。在不同家族內，通過mRNA剪接和使用不同啟動子從同相同基因產生組織特異性同工型。
cAMP特異性PDE4酶家族是最集中研究的PDE之一。該家族內的酶大多在促炎症和免疫細胞中發現，它們在調節cAMP代謝中起關鍵作用。PDE4酶表達於巨噬細胞、嗜中性粒細胞、細胞毒性CD8+T細胞、支氣管上皮細胞、和氣道平滑肌細胞。而且，PDE4抑制劑在呼吸系統疾病動物模型中調節炎症，提示在用小分子抑制劑的基於治療劑的介入策略中PDE4可以代表合適的靶。抗PDE4藥物抑制細胞內cAMP水解，從而提供支氣管擴張並抑制炎症反應。選擇性PDE4抑制劑如cilomilast和roflumilast在嗜中性粒細胞炎症的動物模型中有活性(Bundschuch DS et al.J.Pharmacol.Exp.Ther.2001，297280-290)。
儘管正在對PDE4抑制劑用於治療氣道炎症的應用進行大量臨床研究，幾種抑制劑已經被排除，這是由於毒性、限制劑量的副作用，其中噁心和嘔吐是最常見的生理表現。因此，提高PDE4抑制劑的治療比是主要挑戰，這仍是重要的研究領域。
考慮到酶在靶組織中的分布，在氣道平滑肌和炎症細胞中具有高活性的PDE3和PDE4，這些酶的選擇性抑制劑可以加到慢性氣流阻塞的治療中。一般來說，小分子抑制劑已經集中於一種或幾種PDE而沒有評價抑制PDE所有同工酶的潛在不利作用。例如，已經建議，由於PDE4拮抗劑的毒性多數將通過抑制PDE4同種型D而出現。此外，如本文所述，抑制某些PDE4同工酶不降低所有促炎症介質，然而，當使用正確組合的反義寡核苷酸時，同種型特異性寡核苷酸的組合可導致寬得多的作用。
PDE3家族含有兩種不同基因，PDE3A和PDE3B，它們是cGMP抑制的並顯示對cAMP的高親合性。每種PDE3基因編碼至少兩種剪接異構體。PDE3A已經在平滑肌、血小板、和心肌組織中鑑定。PDE3B在脂肪細胞和肝細胞中最豐富。然而，選擇性PDE3抑制劑或組合PDE4抑制劑的臨床試驗的初步數據有些令人失望，並且對其期望已經改變很多，這是由於這些藥物的療效有限並且由於副作用而使其臨床應用受限。
PDE7首先在人膠質母細胞瘤中分離。PDE7A編碼cAMP特異性PDE，它對cGMP和PDE3和PDE4抑制劑不敏感，其胺基酸序列與其它cAMP PDE明顯不同。人類有兩種基因(PDE7A和PDE7B)已經被表徵。PDE7A基因編碼三種同工酶(PDE7A1、PDE7A2和PDE7A3)，它們通過mRNA可變剪接來自同一基因。在人中，PDE7A2mRNA在骨骼肌、心和腎中表達豐富，而睪丸、肺和免疫系統(胸腺、脾、淋巴結、血液白細胞)是PDE7A1的豐富來源。此外，活化的、而非幼稚的人T淋巴細胞表達PDE7A3剪接變體。相比較而言，PDE7B在人中作為單個同工酶存在，它與PDE7A有約70％序列相似性，但動力學特性不同。PDE7B主要在腦和多種其它組織，包括肝、心、甲狀腺和骨骼肌中表達。已經顯示，用抗CD3和抗CD28抗體刺激人幼稚T細胞促進IL-2生成和克隆擴增。這些作用被歸因於PDE7A，這種酶的下調阻止淋巴細胞增殖(Li L et al.，Science，1999，283，848-851)。
PDE4家族含有4種不同基因(PDE4A-D)。由於這些基因的可變剪接，已報導多種剪接變體並被分成兩大類，長形式和短形式。PDE4A、B和D基因產物在大多數免疫和炎症細胞中發現。它們或以組成型或在活化後存在，見下述Burnouf C.and Pruniaux M.P.Current Pharmaceutical Design 2002；81255-1296。抑制所有或某些同種型的PDE4與幾種炎症介質的下調相關；然而某些促炎症細胞因子(如IL-6)的增加已經被描述(Giembycz M.A.Expert Opin InvestDrugs 2001，101361-1379)。
因此希望抑制所有三種PDE酶，然而這種方法可能受困於使用每種這些酶的抑制劑時已經描述的毒性。局部應用反義寡核苷酸可能克服酶抑制的全身毒性，但這些PDE的太多同工酶使得這種方法不現實。抑制一種或幾種PDE酶的同種型可能不如全部抑制PDE有效，因為其它同種型的存在具有促炎症作用。
因此，對於炎性呼吸系統疾病的治療，希望尋求下調促炎症介質和炎症細胞而更少影響抗炎症介質或抑制酶的方法。因此，本發明提出針對選定的PDE酶同種型的反義寡核苷酸的組合作為治療炎性呼吸系統疾病或cAMP增加起作用的任何疾病的治療應用。
發明簡述本發明提供有效下調所針對的PDE同種型基因的反義寡核苷酸化合物，以及不僅有效下調所針對的PDE同種型基因而且下調其它相關基因的選定的反義寡核苷酸，所述其它相關基因包括其它PDE同種型基因和炎症基因。本發明還提供包含至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合的組合物，所述至少兩種反義寡核苷酸化合物均針對不同的PDE靶基因、均可有效下調或抑制PDE靶基因，組合中每種寡核苷酸化合物的濃度使之表現對其靶基因的小於20％的抑制，而寡核苷酸化合物的組合表現超過20％抑制並且至少加倍抑制至少一種靶基因。本發明還提供含有製藥接受載體和上述至少兩種反義寡核苷酸的組合的藥物組合物。
本發明的組合顯示通過已被稱為多基因敲除的方法行使抑制性作用。多基因敲除包括這些情況，其中1)反義寡核苷酸不僅下調所針對的基因，而且下調其它相關基因；和2)至少2種反義寡核苷酸的組合，各自的濃度使得反義寡核苷酸自身實際上不能有效下調所針對的基因，而其組合導致顯著下調兩種反義寡核苷酸所針對的基因以及任選的其它相關基因。
本發明使用以上策略提供治療和/或預防患者中與cAMP降低相關的疾病的方法、組合物和試劑盒，所述疾病包括PDE相關的疾病和炎症疾病包括呼吸系統疾病和更具體的COPD和哮喘。
本發明提供包含至少2種反義寡核苷酸化合物的組合物，每種反義寡核苷酸化合物能下調不同的基因，每種反義寡核苷酸化合物的濃度使得反義寡核苷酸自身實際上不能有效下調所針對的基因，而所述至少2種反義寡核苷酸的組合導致顯著下調所述反義寡核苷酸各自所針對的基因以及任選的其它相關基因。本發明還提供所述組合物在治療和/或預防炎性呼吸系統疾病中的應用。
本發明提供包含至少兩種反義寡核苷酸的組合物，所述兩種寡核苷酸能下調不同的PDE同工酶基因，每種反義寡核苷酸化合物的濃度使得反義寡核苷酸自身實際上不能有效下調所針對的基因，而所述至少2種反義寡核苷酸的組合導致顯著下調所述兩種反義寡核苷酸所針對的基因以及任選的其它相關基因。本發明還提供所述組合物在治療和/或預防炎性呼吸系統疾病中的應用。
本發明還提供降低細胞環狀AMP磷酸二酯酶表達及相應活性並從而維持細胞內cAMP和細胞因子/趨化因子生成的適當平衡的方法、試劑和組合物。
本發明還提供體外、體內和離體鑑定/篩選能干擾PDE表達並能提高細胞內cAMP水平的新的反義寡核苷酸化合物的組合、藥物和疫苗的方法和工具。
本發明還提供基於基因的治療和轉染方法，其中一種或多種反義寡核苷酸化合物被用於細胞轉染或遞送給人和動物以幹擾PDE同種型基因表達。
本發明還提供有效抗PDE3同種型如PDE3A和PDE3，PDE4同種型如PDE4A、PDE4B和PDE4D和PDE7同種型如PDE7A的反義寡核苷酸。
本發明還提供有效用於本發明的組合物和方法的反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸具有選自下組的序列Seq.ID No.3；Seq.ID No.4；Seq.ID No.7；Seq.ID No.15；Seq.ID No.17；Seq.ID No.19；Seq.IDNo.20；Seq.ID No.25；Seq.ID No.27；Seq.ID No.35；Seq.ID No.36；Seq.ID No.37；Seq.ID No.41；Seq.ID No.42；Seq.ID No.43；Seq.IDNo.45；Seq.ID No.51；Seq.ID No.55；Seq.ID No.58；Seq.ID No.64；Seq.ID No.72；Seq.ID No.73；Seq.ID No.74；Seq.ID No.81；Seq.IDNo.86；Seq.ID No.131；Seq.ID No.132；Seq.ID No.139；Seq.ID No.140；Seq.ID No.145；Seq.ID No.150；Seq.ID No.152；Seq.ID No.153；Seq.ID No.154；Seq.ID No.155；Seq.ID No.156(表1a-f)。
參考附圖通過閱讀幾個優選實施方案的以下非限制性描述，本發明的其它目的和優點將是顯而易見的。


參考以下描述和附圖將可以更好理解本發明，其中圖1是6塊凝膠的半定量PCR，表示結構細胞(A549、支氣管平滑肌細胞(BSMC)、NCI-H292)、免疫細胞(外周血單個核細胞，PBMC)和組織(肺、腦)中的不同磷酸二酯酶(PDE)的表達譜。3A＝PDE3A；3B＝PDE3B；7A＝PDE7A；7B＝PDE7B；4A＝PDE4A；4B＝PDE4B；4C＝PDE4C；4D＝PDE4D；P＝PBGD(膽色素原脫氨酶)；G＝GAPDH(3-磷酸甘油醛脫氫酶)；(-)＝無逆轉錄的RNA擴增；MW＝100bp DNA序列梯；圖2是7塊凝膠的半定量PCR，表示PDE7A同種型在結構細胞(A549、NHBE、BSMC)和非結構細胞(Eol-1、Hut-78、Jurkat和U937)中的表達譜，這些細胞相關於肺炎症反應中潛在重要的細胞。7A1＝PDE7A1；7A2＝PDE7A2；7A3＝PDE7A3；G(-)＝GAPDH，(-)＝無逆轉錄的RNA擴增；MW＝100bp DNA序列梯；
圖3是8塊凝膠的半定量PCR，表示1700種反義系列中的一些在降低Eol-1和U937細胞中PDE7A mRNA表達的效果。C＝無反義物；Top-1701、Top-1702、Top-1703、Top-1706、Top-1707和Top-1726＝針對PDE7A的反義物；100bp＝DNA序列梯；(0)、(10)和(20)＝以μM(微摩爾)表示的反義物濃度；圖4是6塊凝膠的半定量PCR，表示1700種反義系列中的一些在降低Jurkat和Hut-78細胞中PDE7A mRNA表達的效果。C＝無反義物；Top-1702、Top-1703、Top-1706、Top-1707和Top-1726＝針對PDE7A的反義物；100bp＝DNA序列梯；(0)、(10)和(20)＝以μM(微摩爾)表示的反義物濃度；圖5是6塊凝膠的半定量PCR，表示1700種反義系列中的一些在降低BSMC和A549細胞中PDE7A mRNA表達的效果。C1和C2＝無反義物；Top-1702、Top-1703和Top-1706＝針對PDE7A的反義物；MW＝100bp DNA序列梯；(0)和(20)＝以μM(微摩爾)表示的反義物濃度；圖6是6塊凝膠的半定量PCR，表示1300種反義系列中的一些在降低A549和U937細胞中PDE3A mRNA表達的效果。C＝無反義物；Top-1301、Top-1302、Top-1303、Top-1307、Top-1308、Top-1309和Top-1311＝針對PDE3A的反義物；100bp＝DNA序列梯；(0)、(10)和(20)＝以μM(微摩爾)表示的反義物濃度；圖7是6塊凝膠的半定量PCR，表示1300種反義系列在降低BSMC細胞中PDE3A mRNA表達的效果。C1和C2＝無反義物；Top-1301、Top-1302、Top-1303、Top-1307、Top-1308、Top-1309和Top-1311＝針對PDE3A的反義物；100bp＝DNA序列梯；(0)和(20)＝以μM(微摩爾)表示的反義物濃度；圖8中的半定量PCR表示所述1300和1700種反義系列的反義寡核苷酸在降低BSMC細胞中MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-12、TIMP-1、COX-1、IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、TNF-α的相對效果。C＝無反義物；Top-1301、Top-1303、Top-1308和Top-1311＝針對PDE3A的反義物；Top-1702、Top-1703和Top-1706＝針對PDE7A的反義物；MW＝100bp DNA序列梯；圖9中半定量PCR的凝膠表示由所述1700和1300種系列的組合在降低U937細胞中多基因敲除PDE3A和PDE7A mRNA表達的效果和概念。C＝無反義物；1＝Top-1301；2＝Top-1303；3＝Top-1307；4＝Top-1311；5＝Top-1702；6＝Top-1703；7＝Top-1706；8＝Top-1702和1301；9＝Top-1703和Top-1301；10＝Top-1706和Top-1301；11＝Top-1702和Top-1303；12＝Top-1703和Top-1303；13＝1706和1303；14＝Top-1702和Top-1307；15＝Top-1703和Top-1307；16＝Top-1706和Top-1307；17＝Top-1703和Top-1311；18＝Top-1706和Top-1311；MW＝100bp DNA序列梯。組合9和13可有效進行多基因敲除；圖10中半定量PCR表示所述1300和1700種反義系列的多基因敲除在調節U937細胞中PDE4B、IL-10、IL-15、MMP-1、MMP-2、MMP-8、TIMP-1表達水平的效果和概念。C＝無反義物；Top-1301、Top-1303、Top-1307和Top-1311＝針對PDE3A的反義物；Top-1703和Top-1706＝針對PDE7A的反義物；MW＝100bp DNA序列梯。1＝Top-1301；2＝Top-1303；3＝Top-1703；4＝Top-1706；5＝Top-1301和Top-1703；6＝Top-1303和Top-1706；7＝Top-1311和Top-1703；8＝Top-1307和1703；圖11表示人PDE反義(AS)功能測試的結果及其在TNF-α蛋白水平上的多基因敲除的相對效果。測試評價了針對不同同種型PDE的反義寡核苷酸對PHA刺激的人PBMC生成TNF-α的影響。PBMC用一種AS轉染，PDE3B ASTop-1360(Seq.ID No.58)＝3B；PDE4B ASTop-1437(Seq.ID No.86)＝4B；PDE4D AS Top-1498(seq.ID No.140)＝4D；PDE4A AS Top-1413(Seq.ID No.74)＝4A。PBMC還用兩種AS的組合轉染，3B/4B＝Top-1360(Seq.ID No.58)+Top-1437(Seq.ID No.86)；3B/4D＝Top-1360(Seq.ID No.58)+Top-1498(seq.ID No.140)；4A/4D＝Top-1413(Seq.ID No.74)+Top-1498(seq.ID No.140)；4B/4D＝Top-1437(Seq.ID No.86)+Top-1498(seq.ID No.140)。錯配AS(3Bmi、4Ami、4Bmi和4Dmi)也包括在該研究中。PHA攻擊但未轉染的PBMC被當作對照。
圖12表示靶向PDE4B和PDE7A的組合反義處理的多靶抑制和協同效應。小鼠(每組8隻)經鼻滴注50mg Top-2437(靶向PDE4B)、50mg Top-2713(靶向PDE7A)或兩種反義物(每種50mg)的組合。對照小鼠接受相同量的對照反義寡核苷酸。滴注後16小時，實時PCR分析(A)PDE4B、(B)PDE7A和(C)PDE4A表達，用HPRT(參考基因)校正。數據代表每隻小鼠PDE4B表達、PDE7A表達和PDE4A表達的抑制％。條代表平均抑制％；圖13表示靶向PDE4B mRNA的寡核苷酸對LPS誘導的肺炎症和PDE mRNA表達的特異性抑制作用。A)抑制PDE4B對PDE的其它mRNA表達的影響。暴露於LPS後6小時，用實時PCR評價TOP2430處理小鼠中不同PDE mRNA的表達水平。通過比較所得表達水平與接受對照反義寡核苷酸的小鼠中測量的表達水平，確定抑制％。所示值代表平均值+/-SD(n＝8-9)。B)用TOP2430預處理的暴露於LPS的小鼠的肺中細胞流入的抑制。暴露於LPS後6小時進行BAL細胞的差異細胞計數。所示值代表平均值+/-SD(n＝8-9)。C)TNF-α釋放在BAL中的作用。用ELISA測量TOP2430處理的小鼠中TNF-α釋放，並通過比較TOP2430後所得TNF-α值與用對照反義寡核苷酸處理小鼠中所得值確定抑制％。
圖14表示靶向小鼠PDE4B mRNA的反義寡核苷酸的特異性抑制對香菸誘導的肺炎症的影響。A)香菸暴露後24小時和48小時的支氣管肺泡灌洗細胞計數。值是平均值+/-SD。PMN＝嗜中性粒細胞；AM＝巨噬細胞。B)暴露於香菸的小鼠的肺組織中TNF-αmRNA表達。通過從暴露於香菸後48小時的全肺分離的RNA製備的cDNA進行實時PCR來評價TNF-αmRNA表達水平(3隻小鼠)。對照小鼠偽吸菸(5隻小鼠)。值是相對於HPRT的TNF-α表達的平均值+/-SD。C)用TOP2430(4隻小鼠)或對照反義(5隻小鼠)預處理並暴露於香菸3小時後的小鼠中的TNF-α和PDE4B mRNA表達。通過從暴露於香菸後48小時的全肺分離的RNA製備的cDNA進行實時PCR來評價TNF-α和PDE4B mRNA表達水平。值是相對於HPRT的TNF-α或PDE4B表達的平均值+/-SD。
附表說明表1a鑑定根據本發明的人PDE7A寡核苷酸反義物；表1b鑑定根據本發明的人PDE3A寡核苷酸反義物；表1c鑑定根據本發明的人PDE3B寡核苷酸反義物；表1d鑑定根據本發明的人PDE4A寡核苷酸反義物；
表1e鑑定根據本發明的人PDE4B寡核苷酸反義物；表1f鑑定根據本發明的人PDE4D寡核苷酸反義物；表2a和2b表示用於標準PCR的人寡核苷酸引物；表2c表示用於實時PCR的人寡核苷酸引物；表2d表示用於實時PCR的小鼠寡核苷酸引物；表3a和3b表示在細胞系、原代細胞和組織中的人PDE表達模式；表4a表示在A549細胞系和人PBMC中初步篩選人PDE寡核苷酸反義物的總結；表4b表示具有多基因敲除作用的人PDE單種反義物；和表5表示體內初步篩選小鼠PDE寡核苷酸反義物。
具體實施例方式
本發明涉及用於治療與細胞cAMP降低相關的疾病和/或與至少一種PDE水平升高相關的疾病的基於反義寡核苷酸的化合物、治療組合物和方法。本發明目的是增加細胞中的cAMP水平，同時降低促炎症介質的水平以及由炎症細胞釋放的酶的水平。
為獲得這些作用，在其中一個方面，本發明利用本文中被稱為「多基因敲除(knock down)」的技術。多基因敲除是指通過根據本發明的不僅下調其所抗的同工酶基因而且下調相關基因的單種反義寡核苷酸化合物，或通過分別下調不同同工酶基因的至少兩種反義寡核苷酸化合物，而抑制或下調多個基因。
與細胞cAMP水平降低相關的疾病包括至少一種cAMP特異性PDE的水平增加的疾病(即PDE相關疾病)。
術語「下調」在本文中用於表示至少部分抑制基因的表達。根據本發明，反義寡核苷酸化合物下調或抑制其所針對的基因，即反義寡核苷酸化合物表現出足以引起抑制的序列互補性的基因。
術語「相關基因」表示也可在與細胞cAMP降低和/或至少一種PDE水平增加的相關疾病的病理生理中起作用、但不與所述寡核苷酸反義化合物全部或部分互補的其它基因。這些基因包括但不限於編碼PDE酶或同種型、介質例如細胞因子和趨化因子的基因和編碼酶的基因。介質的實例包括IL-6、IL-7、IL-8、IL-15和TNFα。合適的酶的實例包括但不限於基質金屬蛋白酶(MMP)、如MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-12。
根據本發明，本文中反義寡核苷酸化合物定義為天然存在或修飾的寡核苷酸，優選抗核酸酶，它們表現出與編碼特定靶蛋白的DNA或mRNA互補性，使得它們能干擾所述mRNA的轉錄或翻譯和/或誘導RNA酶或RNA酶樣活性並因此具有降低所述靶蛋白表達的功能。當寡核苷酸化合物與靶DNA或mRNA雜交從而幹擾/防止其轉錄/翻譯時，所述靶蛋白的表達被降低。因此，此處的寡核苷酸化合物必須與所針對的核酸足夠互補以便與之雜交。因此，儘管在最優選的實施方案中，寡核苷酸化合物與所針對的核酸100％互補，但正如本領域技術人員所知，100％互補對於在寡核苷酸化合物與所針對核酸之間發生雜交是不必要的。
本發明還涉及對反義寡核苷酸的修飾，該修飾不顯著不利影響其降低或抑制靶蛋白的表達的活性，但修飾還可能增強這種活性。術語「核酸」和「核酸分子」可以互換使用，表示含核苷酸即核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或兩者都含的分子。該術語包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的單體和多聚物，其中在多聚物中核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸經5』-3』連接而互相連接在一起。然而連接可以包括核酸合成領域已知的任何連接，包括例如含5』-2』連接的核酸。用於核酸分子的核苷酸可以是天然存在的、或者可以是能與天然存在鹼基對形成鹼基配對關係的合成產生的類似物。能形成鹼基配對關係的非天然存在鹼基的實例包括但不限於氮雜和脫氮嘧啶類似物、氮雜和脫氮嘌呤類似物、和其它雜環鹼基類似物，其中嘌呤和嘧啶環的碳原子和氮原子的一個或多個已經被雜原子如氧、硫、硒、磷等取代。
本發明的反義寡核苷酸化合物還可以通過插入或去除1或多個鹼基進行修飾而不對其活性有顯著不利的影響。特別地，一般能在表現出與所針對的基因100％互補性的寡核苷酸的末端添加或去除鹼基而不顯著喪失抑制活性。可以進行這樣的修飾以增加活性或提供寡核苷酸增強的穩定性。此外，也可以替換本發明反義寡核苷酸化合物中的1或多個鹼基而不對其活性有不利影響，例如，用一種嘌呤替換另一種嘌呤(腺嘌呤、鳥嘌呤)和用嘧啶替換嘧啶(胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。
根據本發明的反義寡核苷酸化合物還包括siRNA(小幹擾RNA)和由於RNAi(RNA幹擾)方法含有它們的RISC(RNA誘導的沉默複合物)。RNA幹擾(RNAi)方法最近已經描述，被認為是抑制靶基因表達的新工具。多年前已知，RNAi基於低等真核生物中的古老的抗病毒防禦機制。它被雙鏈RNA誘導，雙鏈RNA被加工成21-23nt的小幹擾RNA(siRNA)，在RISC複合物幫助下與單鏈形式靶mRNA雜交以後將引起同源的內源mRNA降解。RNAi的工作方式仍未完全闡明，但在廣泛的真核生物如線蟲、蠅、植物、真菌和哺乳動物中，它已經被用作產生功能喪失表型的首選方法。
根據本發明的反義寡核苷酸化合物還包括核酶和單鏈或雙鏈的、RNA或DNA的短核苷酸序列，其中可以摻入上述化學修飾，並能體外和/或體內抑制基因轉錄和/或翻譯。
在一個方面，不結合具體作用模式，本發明的組合物和方法似乎通過已被稱為「多基因敲除」的機制起作用。多基因敲除在本發明中表示1)不僅下調所針對的基因而且下調其它相關基因的反義寡核苷酸化合物；和2)至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合，其中每種能下調基因，每一種的濃度使得所述反義寡核苷酸化合物單獨使用時實際上對下調其針對的基因無效，所述組合導致反義寡核苷酸所針對的兩種基因都顯著下調並還可以下調其它相關基因。
在一個方面，本發明提供用於治療和/或預防與細胞cAMP降低和/或至少一種PDE水平增加相關疾病的藥物組合物，所述組合物包含藥物接受的載體和至少兩種反義寡核苷酸化合物，每種寡核苷酸化合物針對編碼PDE的靶基因的至少一部分的不同，每種寡核苷酸化合物能下調所抗靶基因，每種寡核苷酸化合物的存在濃度使得它表現出對靶PDE基因的小於20％的抑制，而所述組合表現出大於20％的抑制並且對至少一種靶基因和任選對其它相關基因的抑制至少加倍。
本領域技術人員可以知道，很低濃度的根據本發明的寡核苷酸化合物的組合，例如表現出對靶PDE基因的小於1％抑制的濃度，不能組合表現出至少20％的抑制。能被用於形成根據本發明的組合的每種寡核苷酸化合物的最低濃度將變化，並且這種濃度可以是實現0.5％抑制的濃度或者實現1％-5％抑制的濃度。
本發明提供用於治療和/或預防與細胞cAMP降低和/或至少一種PDE水平增加相關疾病的藥物組合物，所述組合物包含藥物接受的載體和至少兩種反義寡核苷酸化合物，其中每種寡核苷酸化合物能下調不同靶基因，所述寡核苷酸的至少一種的濃度使得其自身實際上無效，例如表現出對靶基因的小於20％抑制，而所述寡核苷酸的組合表現出大於20％的抑制並且對至少一種靶基因和任選對其它相關基因的抑制至少加倍。
本發明還提供至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合用於治療和/或預防與細胞cAMP降低相關的疾病如呼吸道炎症疾病的用途，其中每種寡核苷酸化合物針對編碼不同PDE同種型的基因，每種寡核苷酸化合物能下調所針對的基因，所述寡核苷酸化合物的濃度使得每種寡核苷酸單獨使用實際上不能有效下調所針對基因，而至少兩種寡核苷酸化合物的組合能有效下調寡核苷酸化合物所針對基因的至少一個和任選下調其它相關基因。
本發明還提供治療和/或預防與細胞cAMP降低相關的疾病如呼吸道炎症疾病的方法，所述方法包含向對象施用至少兩種反義寡核苷酸化合物，每種能下調不同的靶PDE基因，所述寡核苷酸化合物的施用濃度使得每種寡核苷酸化合物單獨使用時實際上不能有效下調其靶基因，例如表現出小於20％抑制靶基因的濃度，而所述寡核苷酸化合物的組合能有效下調寡核苷酸化合物所針對基因的至少一個和任選下調其它相關基因。
本發明還提供上述藥物組合物用於製造藥物的用途，所述藥物用於治療和/或預防與細胞cAMP降低或cAMP特異性PDE水平增加相關的疾病(PDE相關疾病)，如炎性疾病。本發明方法和組合物所針對的炎性疾病一般定義為存在炎症細胞和/或介質的疾病。炎性疾病的實例包括但不限於多發性硬化，接觸皮炎、變應性和非變應性眼病，類風溼性關節炎、膿毒性休克、骨質疏鬆症和認知障礙。本發明方法和組合物所針對的炎性呼吸系統疾病一般定義為存在炎症細胞和介質的呼吸道和肺的疾病。炎性呼吸系統疾病的實例包括但不限於COPD、哮喘、嗜酸性粒細胞性咳嗽、支氣管炎、急性和慢性肺異體移植排斥、結節病、肺纖維化、鼻炎和鼻竇炎。
本發明還提供上述藥物組合物用於製造藥物的用途，所述藥物用於治療和/或預防生理病理中涉及環AMP降低的疾病。
本發明還提供修飾反義寡核苷酸的方法，使得它可以達到靶核苷酸和/或可以更有效抗靶基因而用於治療和/或預防炎性呼吸系統疾病。
本發明還提供製劑，其中包括上述組合物，所述製劑是全身性和/或局部製劑。
本發明還提供將藥物組合物遞送至靶多核苷酸的體內方法，包括向對象施用上述組合物和允許組合物達到靶基因的表面活性劑的組合。
優選地，可用本發明反義寡核苷酸化合物治療的對象或患者包括但不限於無脊椎動物、脊椎動物、鳥、哺乳動物如豬、山羊、綿羊、牛、狗、貓、和尤其是人。根據本發明的寡核苷酸化合物設計成適用於待治療的具體動物。特別地，反義寡核苷酸化合物的序列將隨待治療對象根據物種基因組間差異而變化。
本發明還提供有效抗PDE家族的酶例如能抑制其表達的反義寡核苷酸，所述PDE家族的酶包括但不限於PDE3、PDE4和PDE7。本領域技術人員將知道，每種PDE亞型還可以包括同種型。例如PDE3亞型包括PDE3A和PDE3B同種型；PDE4亞型包括同種型PDE4A、PDE4B、PDE4C和PDE4D；PDE7亞型包括同種型PDE7A1、PDE7A2、PDE7A3和PDE7B。
本文中術語「反義寡核苷酸化合物實際上無效的濃度」涉及每種寡核苷酸化合物的使用，當單獨使用時在這種濃度下實際上未觀察到寡核苷酸所針對基因的下調(在表現出靶基因小於20％抑制的濃度)。這是與根據本發明的至少兩種寡核苷酸化合物的組合的作用進行對比，對於組合，每種以它們單獨存在不能有效下調它們所針對的基因的濃度存在時(在表現出低於20％抑制的濃度)，這種組合表現出大於20％抑制，並且對寡核苷酸化合物所針對的基因的至少一種的抑制效果至少加倍。
單種寡核苷酸有效性的比較舉例說明於但不限於圖13和14和表4b和5。例如在圖13A中，針對小鼠PDE4B的TOP 2430體內抑制PDE4A、4B、4D和7A，但對PDE3B沒有影響。
至少兩種寡核苷酸化合物的組合的有效性的比較舉例說明於但不限於圖9、10、11和12。例如與單獨使用時每種寡核苷酸對PDE3A或PDE7A表達的影響進行比較，圖9中Top-1703(Seq ID No.4)和Top-1301(Seq ID No.35)或Top-1706(Seq ID No.7)和Top-1303(SeqID No.37)的組合對同時降低PDE3A和PDE7A表達方面表現出有更大影響。與單獨使用時每種寡核苷酸對TNFα表達的影響進行比較，圖11中Top-1360(Seq ID No.58)和Top-1437(Seq ID No.86)或Top-1360(Seq ID No.58)和Top-1498(Seq ID No.140)或Top-1413(Seq IDNo.74)和Top-1498(Seq ID No.140)或Top-1437(Seq ID No.86)和Top-1498(Seq ID No.140)的組合對降低人PBMC中TNFα表達和釋放表現出有更大影響。與低濃度下單獨使用時每種寡核苷酸對PDE4B或PDE7A表達的影響進行比較，圖12中，小鼠體內經鼻滴注Top-2437(PDE4B)和Top2713(PDE7A)的組合表現出對同時降低小鼠PDE4B和PDE7A表達有更大影響。
反義寡核苷酸化合物的很多組合可根據本發明使用，所述組合導致上述的多基因敲除。反義寡核苷酸組合的實例包括但不限於針對PDE3的至少一種寡核苷酸化合物與針對PDE7的至少一種寡核苷酸化合物。組合的替代性實例可以包括針對PDE4的至少一種寡核苷酸和針對PDE7的至少一種寡核苷酸。組合的替代性實例可以包括針對PDE3的至少一種寡核苷酸、針對PDE4的至少一種寡核苷酸和針對PDE7的至少一種寡核苷酸。這樣的反義寡核苷酸化合物可以選自但不限於表1a-f提供的寡核苷酸。
本文中術語「寡核苷酸」表示含約1到約100個核苷酸的核酸分子，更優選1到80個核苷酸，甚至更優選約4到約35個核苷酸。術語「寡核苷酸」還包括修飾的寡核苷酸和上述寡核苷酸化合物。
本文所用術語「修飾的寡核苷酸」和「修飾的核酸分子」表示核酸，包括寡核苷酸，其中在所有或任意的核酸鹼基、糖部分、核苷間磷酸鍵的天然分子結構的分子水平上具有一或多個化學修飾，以及還具有附加取代基的分子，所述附加取代基如二胺、膽甾基或其它親脂性基團，或在這些位點的修飾的組合。核苷間膦酸酯鍵可以是磷酸二酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、矽氧烷、碳酸酯、羧甲酯、acetamidate、氨基甲酸酯、硫醚、橋聯phosphoranidate、橋聯亞甲基膦酸酯、硫代磷酸酯(phosphorothioate)、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、橋聯硫代磷酸酯和/或碸核苷間鍵，或3』-3』、2』-5』或5』-5』鍵，和這些相似鍵的組合(產生混合主鏈修飾的寡核苷酸)。修飾可以在內部(單個或重複)或在寡核苷酸分子的末端，並且可以包括加到核苷間磷酸酯鍵的分子上，如膽甾基、在氨基之間具有不同數目碳殘基的二胺化合物和末端核糖、脫氧核糖和磷酸酯修飾，所述修飾切割或交聯到相對鏈或締合的酶或其它蛋白。親電基團如核糖二醛可以與這種蛋白的賴氨醯殘基的ε-氨基共價連接。親核基團如連接到寡聚物上的n-乙基馬來醯亞胺可以共價結合到mRNA的5』端或另一個親電位點。術語修飾的寡核苷酸還包括在糖部分上含有修飾如2』-取代的核糖核苷酸的寡核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體，其中任何一個通過5』-3』鍵而連接在一起。修飾的寡核苷酸還可以包括PNA或嗎啉代修飾的主鏈，其中序列的靶特異性被維持。
任選地，此處描述的寡核苷酸可以與多種生理載體分子一起配製。此處描述的寡核苷酸還可以與增強其進入靶細胞能力的分子複合。這種分子的實例包括但不限於碳水化合物、多胺、胺基酸、肽、脂、和細胞生長的關鍵分子。例如寡核苷酸可以與脂組合，所得寡核苷酸/脂乳液或脂質體懸液可以有效增加寡核苷酸的體內半衰期。
作為替代，針對PDE靶的寡核苷酸還可以被質子化/酸化，起磷酸二酯酶抑制劑和抗菌劑的雙重作用。因此，本發明的另一個實施方案是使用調節PDE的治療性寡核苷酸，該寡核苷酸還可以被質子化/酸化以增加細胞吸收，在脂質體中改善包裹，使得它還可以用作抗生素。另外，寡核苷酸可以與多種公知化合物和結構複合，例如進一步增強寡核苷酸的體內穩定性，或者增強其藥理性質(如增加體內半衰期、降低毒性等)。
本文所用術語「核酸主鏈」表示連接分子中核苷酸的化學部分。這可以包括由任意和所有方式的化學連接核苷酸形成的結構。本文所用修飾的主鏈包括核苷酸間化學鍵的修飾，以及可用於增強穩定性和親合性的其它修飾，如糖結構的修飾。例如可以使用脫氧核糖的[α]-異頭物，其中鹼基相對於天然[β]-異頭物是反向的。在一個優選實施方案中，糖基的2』-OH可以改變成2』-O-烷基或2』-O-烷基-n(O-烷基)，它們提供對降解的抗性而不影響親合性。
術語「酸化」和「質子化/酸化」在本文可以互換使用，表示質子(或正氫離子)加到核酸上質子接受位點的過程。質子接受位點包括核酸鹼基結構上的氨基和磷酸二酯鍵的磷酸酯。當pH降低時，這些接受位點被質子化的數目增加，導致更高質子化/酸化的核酸。
術語「質子化/酸化的核酸」表示一種核酸，當它以約16 A260/ml的濃度溶解於水中時具有低於生理pH的pH，即低於約pH7。修飾的核酸、核酸酶抗性核酸、和反義核酸都可以被這個定義包括。通常，通過將質子加到核酸的活性位點上而使核酸被質子化/酸化，儘管降低核酸pH的其它修飾也可以使用並且也被該術語包括。
本文所用術語「封端的」表示在分子水平具有化學修飾的核酸，這種修飾防止選定核苷酸例如通過核酸酶作用而降解。這種化學修飾的定位使得它保護核酸的整體部分，例如反義寡核苷酸的編碼區。封端可以是3』封端或5』封端。例如，3』封端可以在分子的最3』的位置，或者如果它是核酸整體序列的3』則可以在3』端的內部。
術語「基本抗核酸酶的」表示與天然存在或未修飾核酸比較，抗核酸酶降解的核酸。本發明的修飾核酸至少有超過對應未修飾核酸1.25倍的核酸酶降解抗性，更優選超過對應未修飾核酸至少2倍的抗性，甚至更優選超過至少5倍的抗性，最優選超過至少10倍的抗性。這種基本抗核酸酶的核酸包括但不限於具有修飾主鏈的核酸，所述修飾主鏈如硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、乙基磷酸三酯、2』-O-甲基硫代磷酸酯、2』-O-甲基-p-乙氧基核糖核苷酸、2』-O-烷基、2』-O-烷基-n(O-烷基)、3』-O-烷基、3』-O-烷基-n(O-烷基)、2』-氟、2』-脫氧-赤蘚戊呋喃糖基、2』-O-甲基核糖核苷、氨基甲酸甲酯、碳酸甲酯、反向鹼基(如反向T)、或這些主鏈的嵌合形式。
本文所用術語「基本抗酸的」表示與未修飾核酸比較，抗酸降解的核酸。典型地通過比較抗性核酸的降解百分率與對應未修飾核酸(即具有「正常」主鏈、鹼基和磷酸二酯鍵的相對應核酸)的降解百分率來測量核酸的相對抗酸性。抗酸性核酸優選至少有超過對應未修飾核酸1.5倍的酸降解抗性，超過至少2倍的抗性，甚至更優選超過至少5倍的抗性，最優選超過至少10倍的抗性。
本文所用術語「PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B寡核苷酸」各自表示分別靶向影響PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B表達或活性的序列的寡核苷酸。這些包括但不限於PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B DNA編碼序列，PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7BDNA啟動子序列，PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B DNA增強子序列、編碼PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4C、PDE4D、PDE7A、PDE7B的mRNA等。
如上討論，本發明的一個實施方案提供靶向影響PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4D、PDE7A表達或活性的序列的反義寡核苷酸。在一個實施方案中，反義寡核苷酸可以有表1a-f所示序列之一。在另一個實施方案中，正如本領域技術人員所理解，反義寡核苷酸可以包含這些序列的片段或變體，它們可以改變寡核苷酸組成和/或長度，但維持或增加寡核苷酸下調基因表達的活性。在另一個實施方案中，本發明提供具有表1a-f所示序列的至少兩種反義寡核苷酸的組合。
本文所用術語「處理」、「治療」等一般表示獲得期望藥理和/或生理作用。這種作用可以是預防性的，即完全或部分預防疾病或其症狀，和/或可以是治療性的，即部分或完全治癒疾病和/或減輕疾病引起的不利作用。本文所用「處理」涵蓋對已經定義的對象中疾病的任何處理，所述對象尤其是人，並包括(a)預防對象發生疾病，所述對象容易發生該疾病但仍未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即停止其發展；或(c)緩解疾病，即引起疾病消退。
術語「藥學可接受的」在本文中用於載體、表面活性劑和組合物時表示可接受用於治療患者對象的物質，所述物質無毒或對於本文所述任何途徑給藥不是不可接受的。
本發明一般針對通過施用根據本發明的治療有效量的反義寡核苷酸化合物而治療對象，所述化合物包括siRNA、核酶、單或雙鏈的短核苷酸序列，包括可以與靶核酸互補的RNA和/或DNA，或者可以任選地經上述修飾，具有所述RNA寡核苷酸的至少一部分的RNA寡核苷酸，所述RNA寡核苷酸能與RNA雜交形成寡核苷酸-RNA雙鏈體，或嵌合寡核苷酸，它們將下調或抑制內源性基因的體內表達。
「治療有效量」意思是指無毒性但足以提供期望治療效果的反義寡核苷酸化合物的量。在此情況下，反義寡核苷酸的這種劑量有效緩解、改善、或預防待治療狀況或疾病的症狀，如與細胞cAMP降低相關的疾病，PDE相關疾病、炎性疾病如炎症性呼吸系統疾病。
本文提供的藥物組合物包含上述反義寡核苷酸和一種或多種藥學可接受的表面活性劑。增強本發明反義寡核苷酸吸收的合適的表面活性劑或表面活性劑成分之前已經在美國申請公開2003/0087845中描述，該申請公開的關於表面活性劑的內容併入本文。該申請提出合適的表面活性劑「...包括合成和天然、以及全長和截短形式的表面活性蛋白A、表面活性蛋白B、表面活性蛋白C、表面活性蛋白D、表面活性蛋白E、二飽和磷脂醯膽鹼(除了二棕櫚醯以外)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、磷脂醯膽鹼、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、磷脂酸、泛醌、溶血磷脂醯乙醇胺、溶血磷脂醯膽鹼、棕櫚醯溶血磷脂醯膽鹼、脫氫表雄酮、多萜醇、sulfatidic acid、甘油-3-磷酸、磷酸二羥基丙酮、甘油、甘油-3-磷酸膽鹼、二羥基丙酮、棕櫚酸、胞嘧啶二磷酸(CDP)二醯基甘油、CDP膽鹼、膽鹼、磷酸膽鹼，以及天然和人工片狀體，它們是以下表面活性劑成分的天然載體介質ω-3脂肪酸、天然載體、多烯酸(polyenic acid)、多烯酸(polyenoicacid)、卵磷脂、棕櫚酸、環氧乙烷或環氧丙烷的非離子性嵌段共聚物、單體和多聚體形式的聚丙烯、單體和多聚體形式的聚環氧乙烷、具有右旋糖苷和/或烷醯基側鏈的聚(乙烯胺)、Brij35、Triton X-100和合成表面活性劑ALEC、Exosurf、Survan和Atovaquone等。這些表面活性劑可以單獨或作為製劑中多組分表面活性劑的一部分使用，或共價鍵合到反義寡核苷酸(oligo)的5』和/或3』端。
本發明組合物的反義組分包括至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合，可以在脂顆粒或賦形劑如脂質體或微晶中包含於藥物製劑中。美國專利6,025,339中描述，脂顆粒可以是任何合適的結構，如單層或多層，只要所述反義寡核苷酸包含於其中。帶正電的脂質如N-[1-(2，3-二油醯氧)丙基]-N，N，N-三甲基-氨基甲磺酸酯，或「DOTAP」，對於這樣的顆粒和賦形劑是特別優選的。這種脂顆粒的製劑是公知的。如見Janoff等人的U.S.Pat.No.4,880,635；Kurono等人的4,906,477；Wallach的4,911,928；Wallach的4,917,951；Allen等人的4,920,016；Wheatley等人的4,921,757；等。
本發明的組合物可以用運輸反義寡核苷酸化合物到期望部位如肺的任何方式施用。本文公開的反義化合物可以用任何合適的方式施用到患者的肺，但優選氣溶膠吸入方式施用，其中包含可呼吸顆粒，所述可呼吸顆粒包含反義化合物。
本發明的組合物可以作為包括可呼吸大小的顆粒的製劑施用於呼吸系統，例如顆粒大小小到足以經吸入通過鼻、口和咽喉並穿過支氣管和肺泡。一般來說，可呼吸顆粒大小範圍在約0.5到10微米之間。氣溶膠中不可呼吸大小的顆粒傾向於沉積在咽喉並被吞咽，因此氣溶膠中不可呼吸顆粒的量優選最少化。對於經鼻施用，優選10-500微米範圍的顆粒大小以確保保留在鼻腔中。
可以通過將反義化合物與合適的載體如無菌無熱源水或磷酸鹽緩衝液製備用於產生氣溶膠的活性化合物(反義寡核苷酸化合物)的液體藥物組合物。
含反義化合物的固體顆粒組合物任選地可以含有用於輔助形成氣溶膠的分散劑以及其它治療性化合物。合適的分散劑是乳糖，它可以與反義化合物以任意合適的比例混合，如1∶1的重量比。
反義組合物可以施用抗支氣管收縮、抗變態反應和/或抗炎有效的量，施用量依賴於待治療疾病的程度、患者對象的狀況、具體製劑、給藥途徑、向對象給藥的時間安排等。一般來說，寡核苷酸的細胞內濃度期望是0.05-50μM，或更具體的0.2-5μM。對於向哺乳動物患者如人施用，典型使用約0.001、0.01、0.1、或1mg/kg直至約50、或100mg/kg或更多的劑量。然而其它劑量也包括在內。根據活性化合物在任何具體製劑中的溶解性，每日劑量可以分成一個或幾個單位劑量施用。
含反義化合物的液體顆粒的氣溶膠可以通過任意合適的手段產生，如用噴霧器。噴霧器是經壓縮氣體通常是空氣或氧氣加速、通過狹窄的文丘裡噴嘴或者經超聲激發的方式，將活性成分的溶液或懸液轉化成治療性氣溶膠霧的商品裝置。用於噴霧器的合適製劑包含在液體載體中的活性反義寡核苷酸成分，其量最高可達製劑的40％w/w優選少於20％w/w。載體典型是水或稀的水性醇溶液，優選通過加入例如氯化鈉而與體液等滲。任選的添加劑包括，如果製劑不是無菌製備時的防腐劑，例如羥基苯甲酸甲酯，抗氧化劑、抗細菌劑、調味劑、揮發性油、緩衝劑和乳化劑和其它製劑表面活性劑。
包含活性寡核苷酸化合物和製藥接受表面活性劑的固體顆粒的氣溶膠還可以用任何固體顆粒藥物氣溶膠發生器產生。用於向對象施用固體顆粒藥物的氣溶膠發生器產生可呼吸的顆粒(解釋如上)，並以適於人給藥的速率產生一定體積的氣溶膠，其中含預定計量的藥物劑量。活性寡核苷酸成分典型地佔製劑的0.1-100w/w。第二種類型的示例性氣溶膠發生器包括計量劑量吸入器。計量劑量吸入器是加壓氣溶膠分散器，典型地在液化推進劑中含有活性成分的懸液或溶液製劑。使用時這些裝置通過適用於遞送計量體積的閥門釋放製劑，典型地10-150μl，以產生含活性成分的細顆粒噴霧。合適的推進劑包括某些氯氟碳化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷或氫氟烷及其混合物。製劑還可以含有一種或多種助溶劑如乙醇，乳化劑和其它製劑表面活性劑如油酸或失水山梨醇三油酸酯，抗氧化劑和合適的調味劑。無論是從固體還是液體顆粒形成，可以約1-150升/分鐘的速率經氣溶膠發生器產生氣溶膠。
本發明的製劑可以是口服、頰內、肺內、直腸、子宮內、腫瘤內、顱內、經鼻、肌內、皮下、血管內、鞘內、可吸入、透皮、皮內、腔內、可植入、離子電滲、經眼、陰道、關節內、經耳、靜脈內、肌內、腺體內、器官內、淋巴內、可植入、緩釋、和腸溶包衣製劑。用於製劑的載體可以是例如固體和/或液體載體。
對於適於與本發明的寡核苷酸化合物一起組合以提供適於施用於治療呼吸系統疾病的組合物/製劑的其它載體，可以參考「Remington’sPharmaceutical Sciences」，17thEd.Mack Publishing Company，Easton，Pa.，1985。
在本發明的另一方面，提供製品，它包括包裝材料，包裝材料內含有藥學可接受的反義寡核苷酸組合物，可有效治療與細胞cAMP降低或PDE水平增加相關的狀況，包括炎症疾病。在一個實施方案中，組合物包含可有效抑制PDE基因的反義寡核苷酸化合物，所述寡核苷酸化合物與該基因至少50％互補。在另一方面，組合物包含至少兩種反義寡核苷酸化合物，每種反義寡核苷酸化合物能下調不同的PDE基因，每種反義寡核苷酸化合物的存在濃度使得反義寡核苷酸化合物單獨使用時實際上不能有效下調所針對基因，而反義寡核苷酸化合物的組合可以有效下調反義寡核苷酸所針對基因的至少一種。
在一個實施方案中，製品的包裝材料包含標籤，它指示組合物能用於治療炎症疾病並還可以包括適應症，該疾病是多發性硬化、接觸性皮炎、變應性和非變應性眼病、類風溼性關節炎、膿毒性休克、骨質疏鬆症和認知障礙中的一種。
在另一個實施方案中，製品的包裝材料包含標籤，它指示組合物能用於治療炎性呼吸系統疾病，並還可以包括適應症，該疾病是COPD、哮喘、嗜酸性粒細胞性咳嗽、支氣管炎、急性和慢性肺異體移植排斥、結節病、肺纖維化、鼻炎或鼻竇炎中的一種。
對於本發明的目的，包裝材料可以是包裝根據本發明的含核苷酸的組合物的任何合適的材料，包括瓶或其它容器(塑料或玻璃)、紙盒、管、或其它保護性包裝材料。將會知道，包裝可以根據寡核苷酸組合物的性質變化，例如液體製劑可以有不同於氣溶膠製劑的包裝。
本發明用以下非限制性實施例進一步詳細說明。
RPMI1640(Wisent，cat#10040CV)；FBS(胎牛血清，Wisent，cat#80150)；青黴素，鏈黴素(GIBCO，cat#15140-122)；HEPES(Wisent，cat#26060Ci)和L-穀氨醯胺(Gibco，cat#25030-081)；DMEM/F12(Wisent，cat#10090CV)；丙酮酸鈉(Wisent，cat#25000-Ci)；無菌PBS(GIBCO，cat#25030-081)；胰蛋白酶0.25％和EDTA 0.01％(Wisent，cat#25-052-Ci)；Hanks平衡鹽溶液(HBSS)cellgro，cat#20021-cv；PHA(植物凝集素，Sigma，lot#073K8925)hEGF(人重組表皮生長因子，cat-4230；BPEclonetics cat#4009；氫化可的松clonetics cat#4031；腎上腺素clonetics cat#4221；轉鐵蛋白clonetics cat#4205；胰島素clonetics cat#4021；視黃酸cloneticscat#4085；三碘甲狀腺原氨酸clonetics cat#4211；慶大黴素/兩性黴素Bclonetics cat#4081；人表皮生長因子(hEGF)clonetics cat#4230；胰島素，cat#cc-4021；hFGF(人成纖維細胞生長因子)cat#cc-4068；SmBm Bullet試劑盒(Cat#CC 3182，Clonetics).BEBM Bullet試劑盒(Cat#CC 4175，Clonetics)；TrizolInvitrogen，cat#15596-018 DNA酶IFermentas，cat#EN0521；RT-PCR試劑盒的上標第一鏈合成系統(Invitrogen，cat#11904-018)；dNTPsInvitrogen，cat#10297-018；寡(dT)12-18；Invitrogen，cat#11904-018；Qiagen RNAeasy Mini試劑盒(Qiagen，Cat#74106)；β-巰基乙醇(Sigma，Cat#M-6250)；99％乙醇(Commercial alcohols Inc.，Brampton，Ontario，Canada)；QiaVac 24Manifold(Qiagen，Cat#19403)；一次性真空連接器(Qiagen，Cat19407)；DNA酶I試劑盒(Fermentas，Cat.#EN0521)；RiboGreen定量試劑(Invitrogen-Molecular probes，Cat#R-11490)；Taq PCR核心試劑盒(Qiagen，Cat#201223)，Light-Cycler Instrument1.5版(Roche，Cat#3531414)；20ml反應用LC毛細管(Roche，cat#1909339)；LC FastStart DNA Master SYBR Green 1PLUS(100ml)(Roche，Cat#03752186001)；K3EDTA管(Greiner Bio-one，cat#455036B110306)；Ficoll(Amersham Biosciences；cat#17-1440-03)；人TNF-αELISA試劑盒(BioSource Cat#CHC-1754，lot#041703)；小鼠TNF-αELISA試劑盒(BioSource，cat#cmc3013)；ELISA讀板儀(濾光器450nm，參考濾光器650nm，Biorad，680型)；Escort II轉染試劑，(Sigma，cat#L6037)，脂多糖(SIGMA-Aldrich；cat.#L-4391，lot#083K4048，E.Coli011B4)；甲苯噻嗪(Anased)，(Novopharm；cat.#02239093；lot no.KA09802D)；克他命(Vetalar)(Bioniche；cat.#01989529；lot.#K033A)；Hema-3染料組(Fisher scientific Co.Cat#122-911，lot#999901)；Poltron PT 1200(Brinkmann Instruments)；Alamar Blue，(Biosource，cat#DAL1100)，人肺總RNA，(BDBioscience，cat#64092-1，lot#4030253)；人平滑肌總RNA，(BDBioscience，cat#cr2628，lot#3110321)；人腦總RNA，(BD Bioscience，cat#64098-1，lot#4010842)。
細胞人支氣管平滑肌細胞(BSMC)(cat#CC 2576)；正常人支氣管上皮細胞(NHBE)(cat#CC 2540)購自Clonetics。EOL-1(人急性骨髓「嗜酸性粒細胞性」白血病細胞系，ATCC)。U937(人組織細胞細胞系；ATCC)，HL-60(人急性早幼粒細胞白血病細胞系；ATCC)；A549(人肺癌細胞系；ATCC)；Jurkat(人急性T細胞白血病；ATCC)和Hut-78(人皮膚T淋巴細胞淋巴瘤細胞系；ATCC)。NCI-H292(人黏膜表皮樣肺癌細胞系，ATCC)；PBMC，(人外周血單核細胞)。
細胞培養EOL-1、U937、HL-60、Jurkat和NCI-H292培養於RPMI 1640中，其中含2mM L-穀氨醯胺、1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、10mMHepes、1mM丙酮酸鈉、10％FBS、青黴素100U/mL、鏈黴素100mcg/mL，Hut78培養於Iscove’s改進的培養基中，其中含有4mM L-穀氨醯胺、1.5g/L碳酸氫鈉、10％FBS、青黴素100U/mL、鏈黴素100mcg/mL。
A549培養於Ham′s F12K中，其中含有2mM L-穀氨醯胺、1.5g/L碳酸氫鈉、10％FBS、青黴素100、鏈黴素100μg/mL。
支氣管平滑肌細胞培養於含SmBm培養基的25cm2瓶中，所述培養基含有0.5μg/mL hEGF、25mg/ml慶大黴素、25μg/mL兩性黴素B、2.5mg/mL胰島素、hEGF 10ng/mL和FBS 5％。細胞培養10天以獲得足夠每次試驗的細胞。
正常人支氣管上皮細胞(NHBE)培養於含BEBM培養基的25cm2瓶中，所述培養基含有基礎培養基(500mL)和以下生長補充劑BPE2mL、氫化可的松0.5mL、hEGF0.5mL、腎上腺素0.5mL、轉鐵蛋白0.5mL、胰島素0.5mL、視黃酸0.5mL、三碘甲狀腺原氨酸0.5mL、GA-10000.5mL。細胞培養10天以獲得足夠每次試驗的細胞。
細胞活力用Alamar Blue測試按製造商建議系統性測試細胞活力。
人外周血單核細胞(PBMC)經Ficoll-Hypaque密度梯度離心來自正常供體的EDTA K3血而離PBMC。PBMC以2×106細胞/mL/孔鋪板到含RPMI 1640培養基的12孔板中，所述培養中還添加10％熱滅活FBS、青黴素100U/mL、鏈黴素100μg/mL。
反義處理U937、EOL-1、Jurkat、Hut-78細胞系離心(5分鐘，1500RPM，室溫)收穫細胞，用1x HBSS洗滌並以1×106細胞/mL重懸於無血清RPMI培養基中。1×106細胞與精確濃度(0-20μM之間)的反義物在無菌微管中培養5分鐘。然後將每個反應轉移到12孔板中並在37℃培養5小時。RPMI/FBS 20％加到終濃度10％FBS，細胞在37℃過夜培養。離心(5分鐘，1500RPM，室溫)收穫細胞並用1x Hans平衡鹽溶液(HBSS)洗滌。
A549細胞系(直接轉染)細胞經胰蛋白酶處理，重懸於DMEM-F12(106細胞/孔)中並在無血清條件下37℃培養過夜。第二天貼壁細胞與不同濃度(0、5、10、15或20μM)的反義物直接在孔中一起37℃培養5小時。DMEM-F12/FBS 20％加到終濃度10％FBS，細胞在37℃過夜培養。離心(5分鐘，1500RPM，室溫)收穫細胞並用1x HBSS洗滌。
Escort II試劑介導的A549細胞系轉染A549以3×105細胞/mL種植於12孔板中37℃、5％CO2下過夜。第二天，用1x HBSS洗滌細胞兩次並用500μL無血清和抗生素的DMEM-F12覆蓋。轉染複合物由1μg反義和2.5μL Escort II試劑組成。根據製造商推薦製備DNA-Escort II複合物並加入細胞中。
BSMC和NHBE原代細胞細胞經胰蛋白酶(胰蛋白酶0.025％，EDTA 0.01％)在37℃處理3-5分鐘，用培養基終止反應，細胞計數，以5×105細胞/mL重懸於12孔板中並在37℃培養(過夜)。第二天，洗滌細胞，改變培養基並用無血清培養基替換。反義物以不同濃度(0-20μM之間)直接加入孔中。混合物在37℃培養5小時。加入血清至終濃度5％，繼續培養48小時。用HBSS洗滌細胞3次，收穫，並提取RNA。
PBMC與濃度範圍0-5μM的反義物在RPMI 1640細胞培養基中按2×106細胞/mL/孔一起培養16-20小時，培養基中還補充了5％熱滅活FBS、青黴素100U/mL、鏈黴素100μg/mL和10μg/mL PHA。回收細胞以後在製備RNA之前洗滌。
RNA提取根據RNAeasy mini試劑盒方法用Qiagen的QiaVac 24多支管(manifold)從細胞沉澱中提取RNA並根據Fermentas程序用DNA酶I處理。根據製造商方案(Invitrogen-Molecular probes)用RiboGreen試劑定量RNA。
逆轉錄(RT)用RT-PCR試劑盒的上標第一鏈合成系統，在總反應體積20μL中，進行第一鏈cDNA製備。1μg RNA首先在65℃變性5分鐘，與0.5mM各種dNTP、0.5μg寡(dT)12-18一起在冰上冷卻至少1分鐘。混合物在42℃培養2分鐘，加入第二份預混物，其中含有1X第一鏈緩衝液、10mM DTT、40單位RNA酶OUT和40單位SuperScriptIIRT。反應體系在42℃孵育10分鐘，在50℃孵育1小時並在70℃加熱15分鐘滅活。
聚合酶鏈式反應(PCR)用優化量的cDNA(根據靶基因10-200ng)在1x PCR緩衝液(10xTris-HCl，KCl，(NH4)中在總反應體積50μL中進行PCR反應，反應體系中含有0.2mM各種dNTP、8.5pmol各種PCR引物和2.5單位Taq DNA聚合酶。混合物在94℃下加熱5分鐘，隨後是30至35個循環(根據靶)，各循環由在94℃孵育1分鐘、60℃孵育45秒和72℃孵育45秒組成。在72℃補充延伸10分鐘。用1.5％瓊脂糖凝膠電泳在溴化乙錠存在下分析PCR產物。用於各基因的PCR引物序列和PCR擴增產物的預期大小描述於表2a-b。用Total Lab軟體(用Rolling Ball；Ultra Lum Inc.，Model UC4800扣除背景)定量PCR產物。
實時PCR在存在0.5mM各種PCR引物和4μL LC FastStart DNA MasterSYBR Green1 PLUS下用3μL cDNA反應物在總體積20μL中製備PCR反應混合物。
步驟1(變性)95℃，10分鐘(斜率20℃/秒)步驟2(40個循環)95℃，(斜率20℃/秒)；57℃，5秒(斜率20℃/秒)(除了PDE4D，Tm＝59℃)；72℃，10秒(斜率20℃/秒)步驟3(解鏈曲線)95℃，(斜率20℃/秒)；70℃，30秒(斜率20℃/秒)；95℃，0秒(斜率20℃/秒)。
步驟4(冷卻)40℃，30秒(斜率20℃/秒)用於各個基因的PCR引物序列描述於表2c-d。用RelQuant程序(Roche)定量PCR產物。
人TNF-αELISA在沒有PHA刺激16-18小時下如前述用反義物(0.05μM每種)轉染PBMC。之後用PHA(10μg/mL)刺激細胞6小時。收集上清，2000rpm離心5分鐘，保存於-80℃直至用於如製造商所述進行ELISA。
動物所有動物操作經Mispro Biotech Service Inc.Animal CareCommittee(動物保護委員會)批准，並遵守Canadian Council of AnimalCare動物試驗指南。C57BL/6和AKR/J小鼠(20-25g)(Charles RiverCanada，Lasalle QC，Canada)飼養於Mispro Biotech Service Inc.動物設施(Montreal QC，Canada)。
經ip注射氯胺酮/甲苯噻嗪輕度麻醉體內反義靶驗證和多基因交叉敲除的C57BL/6。對於接受反義寡核苷酸的組，收穫肺之前16-20小時經鼻滴注反義寡核苷酸溶液(50mg/小鼠/反義物)預處理小鼠。對照小鼠接受無菌PBS中的相同量的對照反義寡核苷酸。
脂多糖(LPS)-誘導的肺炎症模型經ip注射氯胺酮/甲苯噻嗪輕度麻醉C57BL/6小鼠，並經鼻滴注10mg大腸桿菌血清型0111B4的LPS(Sigma-Aldrich，Oakville ON，Canada)以誘導急性肺炎症。對照小鼠接受相似體積的無菌PBS。對於接受反義寡核苷酸的組，在LPS暴露之前12小時經鼻滴注反義寡核苷酸溶液(200mg/小鼠)預處理小鼠。對照小鼠接受無菌PBS中的相同量對照反義寡核苷酸。滴注LPS後6小時進行支氣管肺泡灌洗並收穫肺。
香菸誘導的肺炎症模型用吸菸儀器(SC IREQ Scientific Respiratory Equipment Inc.，Montreal Canada)將AKR/J小鼠暴露於8支1R3F研究香菸(Universityof Kentucky)的全部煙中。對照小鼠假吸菸。對於接受反義寡核苷酸的組，將小鼠輕度麻醉並在暴露於香菸之前3小時和之後24小時經鼻滴注反義寡核苷酸溶液(200mg/小鼠)預處理小鼠。對照小鼠接受無菌PBS中的相同量對照反義寡核苷酸。暴露於香菸之後48小時進行支氣管肺泡灌洗並收穫肺。
支氣管肺泡灌洗(BAL)和差異細胞計數ip注射氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉小鼠。行氣管切開術並用0.5ml冰冷PBS洗肺四次。計總細胞數，然後在細胞離心塗片(cytospin slide)上離心。用Wright-Giemsa染色細胞離心塗片之後評價差異細胞計數。在浸油顯微鏡下至少計數200個細胞。BAL液保存於-80℃供隨後測量TNF-α。
小鼠TNF-αELISA
BAL液中的TNF-α水平用小鼠TNF-αELISA試劑盒根據製造商推薦進行測量。
逆轉錄(RT)和實時PCR用polytron PT 1200(Brinkman Instruments)勻漿小鼠肺，用Qiagen RNAeasy mini試劑盒(Qiagen，Mississauga ON，Canada)提取總RNA，隨後經DNA酶I消化。用Ribogreen螢光測定法(InvitrogenCorporation，Burlington ON，Canada)定量總RNA。用Super ScriptTMII RT試劑盒(Invitrogen Corporation，Burlington ON，Canada)，採用第1鏈cDNA合成法，從1μg RNA製備cDNA。用LC FastStart DNAMaster SYBR Green 1 PLUS(Roche Diagnostics，Laval QC，Canada)，用50ng cDNA準備實時PCR反應並在LightCycler(RocheDiaghostics，Laval QC，Canada)中運行。用TibMolbiol(Adephia，NJ)設計引物組並經GSP純化(見表2d)。PBGD或HPRT用作參考基因。每次實時PCR運行包括校準cDNA(由小鼠肺組織的合併RNA製備)，並用校準的Cp值校正基因/PBGD或基因/HPRT比例。此外，對於PBGD和對於HPRT，用校準cDNA製作每個基因的標準曲線並創建係數文件，其中包括校正靶基因和參考基因之間的擴增效率差異。
實施例實施例1本實施例涉及PDE同種型的細胞和組織分布。炎性呼吸系統疾病特徵在於炎症細胞(巨噬細胞、淋巴細胞、嗜中性粒細胞和嗜酸性粒細胞)和組織細胞(大多是上皮細胞和平滑肌細胞)之間的相互作用。評價PDE3(PDE3A和B)、PDE7(PDE7A和B)和PDE4(PDE4A、B、C和D)同種型在不同細胞和組織中的mRNA表達。用於每種PDE同種型的引物的總結可見表2a。選用的細胞是A549(來自肺腺癌的上皮細胞)、和NCI-H292(粘液上皮肺癌)。在BSMC(人支管平滑肌細胞)和PBMC(外周血單核細胞)中評估原代人細胞中的表達。也用正常人肺表徵PDE的表達。最後，包括正常人腦作為對照，因為多數PDE在該組織中表達。圖1中可見，除了PDE7A和PDE4B在上述條件下在評價的每種細胞和組織中都表達以外，不同細胞和組織表達不同同種型的PDE。PDE4C mRNA被發現在這些試驗所用細胞和組織中的豐度較低。PDE4A被發現在肺和腦中，而PDE4D被確認在肺和氣道細胞中(A549和NCI-H292)。因為PDE7A存在於所有測試細胞中，最近已經建議它對淋巴細胞介導的疾病很重要，我們也評價了PDE7A的亞同種型。如圖2所示，PDE7A1似乎是在所有測試細胞中最多表達的同種型。
重複幾次PCR，PDE酶同種型在每種細胞系、原代細胞或組織中的表達的存在或缺乏表示於表3a和b。應該注意PDE3A沒有在PBMC和除了A549以外的幾個細胞系中發現。而且相應於PDE7B和PDE4C的信使在此處所用細胞和組織中很少檢測到。
實施例2本實施例涉及有效抗PDE7A的反義寡核苷酸。設計了幾種抗PDE7A mRNA的反義寡核苷酸並評價了它們在表達PDE7A的細胞中的效果。表1a包括所用序列的列表。用濃度逐步增加的寡核苷酸進行所有試驗，並通過比較處理細胞與未處理細胞中的PDE7A mRNA密度與GAPDH密度的比率評價效果。
圖3中發現在Eol-1細胞中Top-1702(Seq.ID No.3)、Top-1706(Seq.ID No.7)、Top-1703(Seq.ID No.4)、Top-1701(Seq.No.2)、和Top-1707(Seq.ID No.8)可以有效抑制PDE7A mRNA表達。此外，Top-1702(Seq.ID No.3)、Top-1703(Seq.ID No.4)、Top-1706(Seq.ID No.7)、和Top-1707(Seq.ID No.8)抑制U937細胞中的PDE7A。圖4中，幾種PDE7A反義寡核苷酸(Top-1702(Seq.ID No.3)，Top-1703(Seq.ID No.4)，和Top-1706(Seq.ID No.7))在10-20μM濃度，在Jurkat細胞中顯示對PDE7A mRNA的超過60％抑制。寡核苷酸Top-1707(Seq.ID No.8)和Top-1726(Seq.ID No.23)在所研究條件下實際上無效。在Hut-78細胞中寡核苷酸Top-1703(Seq.ID No.4)在10μM保持其效果，而Top-1706(Seq.ID No.7)效力較低，Top-1702(Seq.ID No.3)無效。在BSMC和A549細胞中，Top-1702(Seq.IDNo.3)，Top-1703(Seq.ID No.4)和Top-1706(僅BSMC顯示，Seq.ID No.7)都能如圖5所示有效下調PDE7A的mRNA表達。而且，也在人PBMC中評價這些PDE7A反義物。結果顯示在這些反義物中，Top-1706(Seq.ID No.7)有效抑制其特異性信使的40％，表4a。此處報告的結果是靶和反義寡核苷酸一級序列特異性的，並且不是由於間接或非特異性作用。
總體結果提示本發明的針對PDE7A的反義策略可以成功提供對靶mRNA的顯著抑制。在設計的寡核苷酸中，Top-1703(Seq.ID No.4)，Top-1706(Seq.ID No.7)和Top-1702(Seq.ID No.3)似乎可最有效地在研究的所有細胞系和原代細胞中抑制PDE7A的mRNA表達。這些結果提示這些反義寡核苷酸能用於本發明的基於治療劑的策略。
實施例3本實施例涉及有效抗PDE3A和PDE3B的反義寡核苷酸。設計一組反義寡核苷酸並測試它們在幾種細胞類型中降低mRNA水平的能力。表1b-c包括所用序列的列表。
發現幾種反義寡核苷酸能有效降低A549細胞和/或U937細胞中的PDE3A mRNA水平，包括Top-1301(Seq.ID No.35)，Top-1302(Seq.ID No.36)，Top-1303(Seq.ID No.37)，Top-1307(Seq.ID No.41)，Top-1308(Seq.ID No.42)，TOP 1309(Seq.ID No.43)，Top-1311(Seq.ID No.45)和Top-1312(Seq.ID No.46，儘管如圖6、表4a(上)和4b(下)所示有效性較低)。如圖7所示，在原代支氣管平滑肌細胞中，相同的反義寡核苷酸也可有效降低PDE3A mRNA表達。
用PDE3B對PBMC進行的試驗顯示，幾種反義物可有效的特異性阻斷PDE3B mRNA，如表4a所示，在這些反義物中Top-1357(Seq.ID No.55)表現出75％抑制，Top-1351(Seq.ID No.49)表現出4％抑制。總的來說，這些結果提示本發明的針對PDE3A和/或PDE3B抑制的反義策略是有效的。幾種其它的反義寡核苷酸，Top-1304(Seq.ID No.38)，Top-1305(Seq.ID No.39)，Top-1313(Seq.ID No.47)，Top-1351(Seq.ID No.49)，不提供顯著的mRNA抑制，這提示此處報告的反義阻斷效率是靶和反義寡核苷酸一級序列特異性的，而不是由於間接反義作用。
實施例4本實施例涉及抗PDE4有效的反義寡核苷酸。設計了幾種抗PDE4mRNA的反義寡核苷酸並在表達PDE4的細胞中評價它們的效果。表1d-f包括所用序列的列表。所有試驗用增加濃度的寡核苷酸進行並且經實時PCR比較處理細胞與未處理細胞中PDE4A、-B、-D、mRNA密度比HPRT(次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶，作為內部對照)密度的比例進行評價(表2c和d)。
發現幾種反義寡核苷酸可有效降低PBMC中的PDE4mRNA水平，包括Top-1411(PDE4A，Seq.ID No.72)，Top-1437(PDE4B，Seq.ID No.86)和Top-1498(PDE4D，Seq.ID No.140)，分別是43、53和56％，表4a。
總的來說，這些結果提示本發明的針對PDE4抑制的反義策略是有效的。幾種其它反義寡核苷酸，Top-1406(PDE4A，Seq.ID No.67)、Top-1430(PDE4B，Seq.ID No.79)、Top-1495(PDE4D，Seq.ID No.137)，不提供顯著的mRNA抑制，這提示此處報告的反義阻斷效率是靶和反義寡核苷酸一級序列特異性的，而不是由於間接反義作用。
實施例5本實施例涉及PDE的單一同種型對不同PDE的mRNA生成的抑制作用。本試驗在A549細胞和PBMC中進行。如表4b所示，發現幾種反義物不僅抑制其特異性靶而且能下調對應其它PDE的mRNA。PDE3A反義Top-1308(Seq.ID No.42)在A549細胞系中不僅提供對其特異性mRNA的抑制(60％)，而且下調PDE3B(53％)、PDE4A(63％)、PDE4D(26％)和PDE7A(44％)的表達。在PBMC中進行相同試驗，結果表明PDE3B反義Top-1357(Seq.ID No.55)能特異性抑制其靶(62％)，並且還能分別對應PDE4A、-4B、-4D和7A的信使下調76、43、65和38％，表4b。這種多基因敲除過程也在PBMC中用抗PDE4A的Top-1413(Seq.ID No.74)、抗PDE4B的Top-1437(Seq.ID No.86)、抗PDE4D的Top-1490(Seq.ID No.132)、抗PDE7A的Top-1706(Seq.ID No.7)發現，表4b。因為以下原因所觀察到的抑制是特異性的在本研究中使用的所有Top反義寡核苷酸與研究的其它PDE寡核苷酸序列不具有任何同源性。此外，此處所用的有效的反義物不影響研究的所有PDE，例如抗PDE3B、-4A和7A作用強的Top-1308(Seq.ID No.42)以較低程度的有效性抗-4D，而對PDE4B無效。而且，本研究所用幾種其它反義物既沒有發現抗其特異性靶的活性也沒有發現抗其它PDE的活性，((Top-1312，Seq.ID No.46)，Top-1404，Seq.ID No.65))，表4b。這些結果表明反義寡核苷酸對PDE同種型mRNA的抑制影響其它PDE的生成，並且解釋了本文所述的單一的寡核苷酸誘導的多基因敲除過程。
實施例6本實施例涉及單一同種型的PDE對細胞因子和酶mRNA生成的抑制作用。細胞因子和趨化因子是在細胞活化和募集中重要的介質。在這些介質中間，已經顯示在炎性呼吸系統疾病的病理生理中增加和/或起作用的是白細胞介素(IL)-6、IL-7、IL-8、IL-15和TNF-α。幾種酶直接或間接參與組織破壞和/或修復。這些酶中包括基質金屬蛋白酶，MMP(MMP-1、-2、-3、-12)，即一種組織特異性MMP1(TIMP-1)抑制劑和環加氧酶cox-1。已經在一些炎性呼吸系統疾病中證明了MMP與其抑制劑或TIMP的比例增加。在人原代平滑肌支氣管細胞中評價了PDE3A或PDE7A mRNA的抑制對介質和酶mRNA生成的作用。
如圖8所示，有效降低PDE3A(Top-1301(Seq.ID No.35)，Top-1303(Seq.ID No.37)，Top-1308(Seq.ID No.42)，Top-1311(Seq.ID No.45))或PDE7A(Top-1702(Seq.ID No.3)，Top-1703(Seq.ID No.4)，Top-1706(Seq.ID No.7))mRNA生成的反義寡核苷酸也降低IL-6、IL-7、IL-15、TNF-α的mRNA和較低程度降低IL-8的mRNA。所述反義寡核苷酸也對MMP12的mRNA有抑制作用，但在此濃度對MMP-1、MMP-2、MMP-3、TIMP-1和cox-1mRNA沒有作用。
單一PDE特異性的反義對其它PDE的作用見表4b。幾種特異性PDE反義物((Top-1308(Seq.ID No.42)；Top-1357ID No.55)；Top-1413(Seq.ID No.74)；Top-1437(Seq.ID No.86)；Top-1490(Seq.ID No.132)；Top-1706(Seq.ID No.7))不僅可有效下調其特異性靶，而且對其它磷酸二酯酶有抑制作用。
而且，因為本研究中使用的所有Top反義寡核苷酸與所研究細胞因子或酶的核苷酸序列沒有任何相似性，所觀察到的抑制是特異性的。此外，Top反義物降低mRNA生成的水平是序列和細胞因子特異性的。這些結果表明，反義寡核苷酸對PDE同種型mRNA的抑制影響介質和酶生成。
實施例7本實施例涉及同種型特異性反義寡核苷酸的組合對PDE3A和PDDE7A基因表達的作用。在表達這兩種PDE同種型的U937細胞中評價組合寡核苷酸對PDE3A和PDE7A mRNA表達的作用。對此，在研究條件下在這種細胞系中分別以實際無效的濃度使用每種寡核苷酸(10μM，如圖9所示)。PDE3A和PDE7A反義寡核苷酸的某些組合比單獨的任一種反義寡核苷酸在有效降低PDE3A和PDE7A mRNA表達上要顯著得多。Top-1703(Seq.ID No.4)和(Seq.ID No.35)或Top-1706(Seq.ID No.7)和Top-1303(Seq.ID No.37)的組合表現出對PDE3A和PDE7A mRNA的強烈協同抑制。此外，此處報告的作用是靶和反義一級序列特異性的，因為幾種其它TOP-1700和TOP-1300寡核苷酸組合不具有顯著的mRNA抑制作用。
用於本發明組合的有效的PDE寡核苷酸反義化合物在此描述為能抑制靶PDE基因表達的那些，其中當與另一種寡核苷酸化合物(都以低於20％抑制其靶基因的濃度提供)組合時，引起至少一種靶基因被抑制超過20％並且是單獨一種寡核苷酸化合物表現的抑制量的至少兩倍。所述組合可以表現對兩種PDE核酸靶的抑制，以及對編碼其它PDE和炎症介質的核酸的抑制。
這些結果顯示了組合兩種不同靶基因如PDE7A和PDE3A的核苷酸序列來源的兩種反義寡核苷酸的特異性、多基因敲除作用。儘管所述寡核苷酸的使用濃度當單獨使用時對其靶基因沒有作用，所述組合誘導對其靶基因的顯著抑制。
實施例8本實施例涉及PDE3A和PDE7A反義寡核苷酸的組合對介質和酶mRNA表達的作用。多基因敲除對細胞因子、趨化因子和酶基因mRNA表達的作用見圖10。結果從U937單核細胞系獲得。需要注意在研究濃度下每種反義寡核苷酸單獨使用時對IL-10和MMP-8mRNA表達具有小的抑制作用。當單獨使用時所述反義寡核苷酸對PDE4B、MMP-1、MMP-2和TIMP-1 mRNA表達沒有抑制作用。2種反義寡核苷酸的組合(Top-1311(Seq.ID No.45)+Top-1703(Seq.ID No.4)或Top-1307(Seq.ID No.41)+Top-1703(Seq.ID No.4))具有與單獨使用每種反義寡核苷酸相同的作用(對IL-10和MMP-8mRNA輕度抑制，對PDE4B、MMP-1、MMP-2、和TIMP-1mRNA表達沒有作用)。然而，2種反義寡核苷酸的組合(Top-1301(Seq.ID No.35)+Top-1703(Seq.ID No.4)或Top-1303(Seq.ID No.37)+Top-1706(Seq.ID No.7))具有協同抑制作用，表現為不僅IL-10和MMP-8 mRNA表達的顯著降低而且還顯著降低PDE4B、MMP-1和MMP-2 mRNA表達，而不影響TIMP-1 mRNA表達。使用反義寡核苷酸的後2種組合所發現的多基因敲除是選擇性的，因為抑制幾種MMP的酶活性的基因TIMP-1不受影響，而且是特異性的，因為管家基因GAPDH不受所述組合影響。這些結果與實施例5中的結果相一致，表明多基因敲除具有更寬抗炎作用的潛力。
實施例9本實施例使用功能性測試(即抑制TNF-α生成)來舉例說明組合2種選定的抗PDE同種型寡核苷酸在人PBMC中的多基因敲除作用。
細胞因子在所有疾病包括哮喘和COPD的慢性炎症調控中起關鍵作用。TNF-α是在幾種炎症疾病中表達的最重要的促炎症細胞因子之一。在COPD患者的誘導的痰中TNF-α水平顯著增加(Keatings et Am.J.Respir.Crit.Care Med.1996；153；530-534.)。而且有證據表明體重降低的COPD患者顯示從循環細胞中釋放的TNF-α增加並且TNF-α可以誘導骨骼肌細胞凋亡，導致一些具有嚴重COPD的患者中可見的特徵性肌消瘦和惡病質(De Godoy et Am.J.Respir.Crit.Care Med.1996，153，633-637.)。
PDE4抑制劑通過增加細胞內環狀AMP引起炎症細胞釋放的細胞因子和趨化因子降低(Torphy，Am.J.Respir.Crit.Care Med.1998，157，351-370)。與皮質類固醇比較，PDE4抑制劑對中性粒細胞具有強抑制作用(Au et al.，Br.J.Pharmacol.1998，123，1260-1266.)，表明它們可用於COPD的抗炎治療。初步證據表明PDE4抑制劑Cilomilast改善COPD患者的肺功能和症狀，這可能是由於細胞因子抑制(Compton et al.，Lancet.2001，358，265-270)。此處表明幾種選定的反義寡核苷酸組合不僅抑制其特異性PDE靶而且引起多基因敲除，包括促炎症細胞因子TNF-α生成的降低。圖11表明當反義寡核苷酸(Top-1360(PDE3B，Seq.ID No.58)；Top-1413(PDE4A，Seq.ID No.74)；Top-1437(PDE4B，Seq.ID No.86)；Top-1498(PDE4D，Seq.ID No.140))單獨使用時在測試濃度下對從PHA活化的PBMC釋放的TNF-α具有小的、最低作用。然而當評價組合時，它們對PBMC釋放TNF-α提供超過加和的作用。觀察到的對TNF-α釋放的作用是特異性的，因為單獨或與其它反義組合使用錯配反義物時，對受刺激的PBMC釋放TNF-α沒有作用。
因為TNF-α被認為是炎症和慢性呼吸系統疾病中的共同特徵，本發明提供治療幾種炎症疾病的寬治療應用。
實施例10本實施例表明通過體內施用抗PDE同種型的反義寡核苷酸，有可能降低PDE4A、PDE4B和PDE7A的mRNA的表達。在該試驗中，經鼻滴注(50mg)施用每種反義寡核苷酸(表5)並在16小時後收集肺。通過實時PCR分析由全肺製備的cDNA，評價靶mRNA的表達。表5列舉了對每種小鼠靶mRNA特異性的幾種反義寡核苷酸，所測量的抑制活性大於25％。各試驗中包括的對照反義寡核苷酸不顯示不同mRNA靶的抑制活性，這提示所觀察到的反義活性是靶和反義寡核苷酸序列特異性的。因此，通過簡單的經鼻滴注活性反義寡核苷酸可以實現抑制小鼠肺中幾種PDE mRNA的表達。
實施例11本實施例證明可使用2種反義寡核苷酸的組合體內誘導多基因敲除。圖12A表明在測量TOP 2437時間點，抗PDE4B的小鼠反義寡核苷酸在低濃度(50mg/小鼠)下單獨使用時對PDE4B mRNA表達沒有顯著抑制作用。然而組合Top 2437(抗PD4B的反義寡核苷酸)和Top2713(抗PDE7A的反義寡核苷酸)導致小鼠肺中PDE4B被抑制超過40％。圖12B表明儘管TOP2437和TOP2713當低濃度單獨使用時對PDE7A mRNA表達有很小抑制作用，兩種反義寡核苷酸的組合抑制83％的PDE7A mRNA表達。結果表明與單獨使用的反義處理比較，靶向兩種不同PDE同工酶的兩種反義物的組合導致每種靶基因更高水平的抑制，例如超過加和水平的抑制。
圖12C表明抗PDE4B和PDE7A的反義寡核苷酸的組合也將降低小鼠肺中PDE4A mRNA表達。結果表明即使每種反義寡核苷酸自己沒有作用，經組合處理後可以實現PDE4A mRNA表達的高水平協同抑制。
這些結果證明，不僅通過組合抗這些同種型的兩種反義寡核苷酸能獲得靶PDE同種型的超過加和的抑制，而且通過用不抗給定同種型的兩種反義的組合處理也可以實現另外抑制其它PDE同種型。
實施例12本實施例表明抗特異性PDE同種型的反義寡核苷酸能部分抑制LPS誘導小鼠中的急性肺炎症。在該實施例中PDE4B是靶，因為之前已經表明它在LPS誘導的炎症中是重要的(Ma et al.，Mol.Pharmacol.，1999，55，50-57.；Wang et al.，Molec.Pharmacol.，1999，56，170-174.)。此外，我們以前的結果證實LPS處理小鼠，導致PDE4B表達上調(數據未示出)。
為證明靶mRNA表達能在LPS暴露小鼠中被抑制，在暴露於LPS之前12小時經鼻滴注200mg TOP2430(對PDE4B特異的)或對照反義寡核苷酸而預處理小鼠。圖13A表明，TOP2430預處理後PDE4B表達被降低86％。圖13A也表明施用抗PDE4B的反義寡核苷酸也部分抑制肺PDE4A、4D和7A mRNA表達。作為比較，抑制PDE4B後PDE3B表達被刺激117％。這個實施例以另一種方式證明體內多基因敲除的概念。
圖13B表明抑制PDE4B對LPS誘導的急性肺炎症的作用。結果表明與對照小鼠相比，在暴露於LPS的小鼠肺中TOP2430對PDE4B的抑制顯著減少細胞內流(減少40％，p＜0.013)。在處理小鼠中，總細胞減少與肺灌洗液中存在的嗜中性粒細胞(減少40％，p＜0.016)和巨噬細胞(減少50％，p＜0.002)顯著降低有關。而且TOP2430預處理引起肺灌洗液中LPS誘導的TNF-α濃度顯著降低(26％)(圖13C)。
結果表明通過向小鼠局部遞送反義寡核苷酸可實現特異性抑制靶PDE mRNA。而且抑制暴露於LPS的小鼠中PDE4B表達對炎症應答具有顯著作用，使得細胞內流降低、中性粒細胞和巨噬細胞向肺遷移和TNF-α釋放減少。這種作用的機制可能與多基因敲除相關，同時抗PDE4B的反義寡核苷酸還導致幾種其它PDE下調。
實施例13該實施例涉及靶向特異性PDE4B mRNA的反義寡核苷酸對香菸暴露誘導的急性肺炎症的抑制效果(圖14)。
圖14顯示使AKR/J小鼠呼吸香菸煙的作用。持續暴露至少48小時，再24小時之後吸菸致使支氣管肺泡灌洗液細胞(嗜中性粒細胞和巨噬細胞)顯著增加(圖14A)。結合炎症細胞的內流，暴露於香菸誘導肺組織中TNF-α增加表達(增加3-5倍，圖14B)。已經表明巨噬細胞、嗜中性粒細胞和TNF-α在吸菸誘導的肺炎症和進展到隨後的肺氣腫中有重要作用(Churg et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.，2002，166，849-854；Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，2002，27，368-374)。
圖14C表明PDE4B抑制對吸菸誘導的TNF-αmRNA表達增加的作用。結果表明與用對照反義寡核苷酸預處理的小鼠比較，用TOP2430抑制PDE4B 20％使肺組織中TNF-α表達降低21％。
總的來說，這些結果表明可以在暴露於香菸的小鼠中實現特異性抑制PDE4B mRNA表達，並且對全肺組織中TNF-αmRNA表達具有相似的作用。
權利要求
1.反義寡核苷酸化合物，所述化合物針對編碼PDE的核酸序列的至少一部分，其中所述化合物有效抑制所述PDE表達。
2.權利要求1定義的化合物，選自Seq.ID No.3；Seq.ID No.4；Seq.ID No.7；Seq.ID No.15；Seq.No.17；Seq.ID No.19；Seq.ID No.20；Seq.ID No.25；Seq.ID No.27；Seq.ID No.35；Seq.ID No.36；Seq.No.37；Seq.ID No.41；Seq.ID No.42；Seq.ID No.43；Seq.ID No.45；Seq.ID No.51；Seq.ID No.55；Seq.ID No.58；Seq.ID No.64；Seq.ID No.72；Seq.ID No.73；Seq.ID No.74；Seq.ID No.81；Seq.IDNo.86；Seq.ID No.131；Seq.ID No.132；Seq.ID No.139；Seq.ID No.140；Seq.ID No.145；Seq.ID No.150；Seq.ID No.152；Seq.ID No.153；Seq.ID No.154；Seq.ID No.155；和Seq.ID No.156。
3.治療具有與cAMP降低相關疾病的對象的組合物，其中包含權利要求1定義的寡核苷酸化合物並組合有藥學可接受的載體。
4.權利要求3定義的組合物，用於治療PDE相關疾病。
5.權利要求4定義的組合物，用於治療炎症疾病。
6.權利要求5定義的組合物，用於治療炎症性呼吸系統疾病。
7.權利要求3定義的組合物，還表現對編碼不同炎性蛋白的至少一種基因的抑制，所述炎症蛋白選自PDE同種型、細胞因子、趨化因子、炎症介質、白細胞介素、TNF-α、和基質金屬蛋白酶。
8.治療具有與cAMP降低相關疾病的對象的方法，包括向所述對象施用治療有效量的權利要求3定義的組合物。
9.權利要求8定義的方法，其中所述疾病是PDE相關疾病。
10.治療與cAMP水平降低相關疾病的藥物組合物，所述組合物包含藥學可接受的載體和均能抑制靶PDE表達的至少兩種反義寡核苷酸化合物，每種寡核苷酸針對編碼不同靶PDE的核酸序列的至少一部分，每種寡核苷酸化合物存在的濃度表現出對其靶PDE的小於20％的抑制，而所述組合表現出超過20％的抑制並且對至少一種靶PDE的抑制至少加倍。
11.權利要求10定義的組合物，其中所述組合表現出對超過一種靶PDE的抑制。
12.權利要求10定義的組合物，其中所述組合表現出對其它炎症基因的抑制，所述其它炎症基因選自其它PDE同種型、細胞因子、趨化因子、炎症介質、白細胞介素、TNF-α、和基質金屬蛋白酶。
13.根據權利要求10的組合物，其中所述寡核苷酸化合物針對編碼PDE的核酸，所述PDE選自PDE3A、PDE3B、PDE4A、PDE4B、PDE4D、PDE7A和PDE7B。
14.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE3A的核酸的寡核苷酸化合物。
15.權利要求14定義的藥物組合物，其中所述PDE7A寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.3；Seq.ID No.4；Seq.ID No.7；Seq.ID No.15；Seq.ID No.17；Seq.ID No.19；Seq.ID No.20；Seq.ID No.25；Seq.IDNo.27；而且所述PDE3A寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.35；Seq.IDNo.36；Seq.ID No.37；Seq.ID No.41；Seq.ID No.42；Seq.ID No.43；Seq.ID No.45。
16.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.3；Seq.ID No.4；Seq.ID No.7；Seq.ID No.15；Seq.ID No.17；Seq.ID No.19；Seq.ID No.20；Seq.ID No.25；Seq.ID No.27；而且所述針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.51；Seq.ID No.55；Seq.ID No.58。
17.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4A的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.3；Seq.ID No.4；Seq.ID No.7；Seq.ID No.15；Seq.ID No.17；Seq.ID No.19；Seq.ID No.20；Seq.ID No.25；Seq.ID No.27；而且所述針對編碼PDE4A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.64；Seq.ID No.72；Seq.ID No.73；Seq.ID No.74；Seq.ID No.145；Seq.ID No.150；Seq.ID No.152。
18.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.3；Seq.ID No.4；Seq.ID No.7；Seq.ID No.15；Seq.ID No.17；Seq.ID No.19；Seq.ID No.20；Seq.ID No.25；Seq.ID No.27；而且所述針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.81；Seq.ID No.86；Seq.ID No.153；Seq.ID No.154；Seq.ID No.155；和Seq.ID No.156。
19.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE7A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.3；Seq.ID No.4；Seq.ID No.7；Seq.ID No.15；Seq.ID No.17；Seq.ID No.19；Seq.ID No.20；Seq.ID No.25；Seq.ID No.27；而且所述針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.131；Seq.ID No.132；Seq.ID No.139；Seq.ID No.140。
20.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE3A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE3A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.35；Seq.ID No.36；Seq.ID No.37；Seq.ID No.41；Seq.ID No.42；Seq.ID No.43；Seq.ID No.45；而且所述針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.51；Seq.ID No.55；Seq.ID No.58。
21.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE3A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE3A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.35；Seq.ID No.36；Seq.ID No.37；Seq.ID No.41；Seq.ID No.42；Seq.ID No.43；Seq.ID No.45；而且所述針對編碼PDE4A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.64；Seq.ID No.72；Seq.ID No.73；Seq.ID No.74；Seq.ID No.145；Seq.ID No.150；Seq.ID No.152。
22.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE3A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE3A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.35；Seq.ID No.36；Seq.ID No.37；Seq.ID No.41；Seq.ID No.42；Seq.ID No.43；Seq.ID No.45；而且所述針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.81；Seq.ID No.86；Seq.ID No.153；Seq.ID No.154；Seq.ID No.155；和Seq.ID No.156。
23.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE3A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE3A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.35；Seq.ID No.36；Seq.ID No.37；Seq.ID No.41；Seq.ID No.42；Seq.ID No.43；Seq.ID No.45；而且所述針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.131；Seq.ID No.132；Seq.ID No.139；Seq.ID No.140。
24.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4A的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.51；Seq.ID No.55；Seq.ID No.58；而且所述針對編碼PDE4A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.64；Seq.ID No.72；Seq.ID No.73；Seq.ID No.74；Seq.ID No.145；Seq.ID No.150；Seq.ID No.152。
25.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.51；Seq.ID No.55；Seq.ID No.58；而且所述針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.81；Seq.ID No.86；Seq.ID No.153；Seq.ID No.154；Seq.ID No.155；和Seq.ID No.156。
26.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE3B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.51；Seq.ID No.55；Seq.ID No.58；而且所述針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.131；Seq.ID No.132；Seq.ID No.139；Seq.ID No.140。
27.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE4A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE4A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.64；Seq.ID No.72；Seq.ID No.73；Seq.ID No.74；Seq.ID No.145；Seq.ID No.150；Seq.ID No.152；而且所述針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.81；Seq.ID No.86；Seq.ID No.153；Seq.ID No.154；Seq.ID No.155；和Seq.ID No.156。
28.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE4A的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE4A的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.64；Seq.ID No.72；Seq.ID No.73；Seq.ID No.74；Seq.ID No.145；Seq.ID No.150；Seq.ID No.152；而且所述針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.131；Seq.ID No.132；Seq.ID No.139；Seq.ID No.140。
29.根據權利要求10的藥物組合物，包含針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物和針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物，其中所述針對編碼PDE4B的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.81；Seq.ID No.86；Seq.ID No.153；Seq.ID No.154；Seq.ID No.155；和Seq.ID No.156；而且所述針對編碼PDE4D的核酸的寡核苷酸化合物選自Seq.ID No.131；Seq.ID No.132；Seq.ID No.139；Seq.ID No.140。
30.根據權利要求10的藥物組合物，其中所述寡核苷酸均具有選自以下的序列Seq.ID No.3；Seq.ID No.4；Seq.ID No.7；Seq.ID No.15；Seq.No.17；Seq.ID No.19；Seq.ID No.20；Seq.ID No.25；Seq.ID No.27；Seq.ID No.35；Seq.ID No.36；Seq.ID No.37；Seq.ID No.41；Seq.ID No.42；Seq.ID No.43；Seq ID No.45；Seq.ID No.51；Seq.ID No.55；Seq.ID No.58；Seq.ID No.64；Seq.ID No.72；Seq.ID No.73；Seq.ID No.74；Seq.ID No.81；Seq.ID No.86；Seq.ID No.131；Seq.ID No.132；Seq.ID No.139；Seq.ID No.140；Seq.ID No.145；Seq.ID No.150；Seq.ID No.152；Seq.ID No.153；Seq.ID No.154；Seq.ID No.155；和Seq.ID No.156。
31.治療與cAMP降低相關疾病的方法，所述方法包括向對象施用至少兩種反義寡核苷酸化合物，每種寡核苷酸針對編碼不同靶PDE的核酸序列的至少一部分，其中每種寡核苷酸化合物均能抑制靶PDE表達，每種寡核苷酸化合物存在的濃度表現出對其靶PDE的小於20％的抑制，而所述組合表現出超過20％的抑制並且對至少一種靶PDE的抑制至少加倍。
32.權利要求31定義的方法，其中所述疾病是PDE相關疾病。
33.根據權利要求10的藥物組合物的用途，用於製造治療和/或預防炎症性呼吸系統疾病的藥物。
34.製劑，包含權利要求10的組合物，選自全身性製劑和局部性製劑。
35.權利要求34的製劑，選自口服、頰內、肺內、直腸、子宮內、腫瘤內、顱內、經鼻、肌內、皮下、血管內、鞘內、可吸入、透皮、皮內、腔內、可植入、離子電滲、經眼、陰道、關節內、經耳、靜脈內、肌內、腺體內、器官內、淋巴內、可植入、緩釋、和腸溶包衣製劑。
36.權利要求35的製劑，它是口服製劑，其中所述載體選自固體和液體載體。
37.向靶多核苷酸遞送藥物組合物的體內方法，包括向對象施用權利要求10的組合物，所述組合物包含一定量的載體和寡核苷酸化合物，所述量允許組合物達到所述靶PDE核酸。
38.權利要求10的組合物，其中所述寡核苷酸化合物選自反義寡核苷酸、修飾的反義寡核苷酸、siRNA和核酶。
39.權利要求34定義的製劑，用於局部性施用。
40.製品，包含包裝材料，所述包裝材料內含有可有效治療對象中與cAMP降低相關疾病的反義寡核苷酸組合物，所述組合物包含藥學可接受的載體和有效抑制PDE基因的反義寡核苷酸化合物，所述寡核苷酸化合物與所述基因至少50％互補，所述包裝材料包含標籤，標籤指示所述組合物用於治療所述疾病。
41.製品，包含包裝材料，所述包裝材料內含有可有效治療對象中與cAMP降低相關疾病的反義寡核苷酸組合物，所述組合物包含藥學可接受的載體和至少兩種反義寡核苷酸化合物的組合，每種反義寡核苷酸化合物均能下調不同的PDE靶基因，每種反義寡核苷酸化合物存在的濃度使得所述反義寡核苷酸化合物表現出對其靶PDE的小於20％的抑制，而反義寡核苷酸化合物的所述組合能有效的加倍抑制至少一種靶基因，所述製品的包裝材料包含標籤，標籤指示所述組合物能用於治療所述疾病。
42.權利要求40定義的製品，其中所述標籤指示所述組合物用於治療PDE相關疾病。
43.權利要求41定義的製品，其中所述標籤指示所述組合物用於治療PDE相關疾病。
44.權利要求1定義的組合物，其中所述化合物的至少一部分與RNA雜交形成寡核苷酸-RNA雙鏈體。
45.權利要求1的化合物，它是寡核苷酸、反義寡核苷酸、DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸、具有能與RNA雜交形成寡核苷酸-RNA雙鏈體的所述RNA寡核苷酸的至少一部分的RNA寡核苷酸、或嵌合寡核苷酸。
全文摘要
本發明涉及針對編碼磷酸二酯酶(PDE)的基因的治療性反義寡核苷酸以及它們的組合應用。這些反義寡核苷酸可以用作分析工具和/或治療患者中與細胞cAMP降低相關疾病的治療劑，這些疾病例如呼吸道的炎症性疾病，包括例如，哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、急性呼吸窘迫症候群、支氣管炎、慢性支氣管炎、矽肺病、肺纖維化、肺異體移植排斥、過敏性鼻炎和慢性鼻竇炎以及環狀AMP增加或PDE水平降低有益的其它狀況。
文檔編號C07H21/02GK1918175SQ200480035367
公開日2007年2月21日 申請日期2004年9月29日 優先權日2003年9月29日
發明者P·倫齊, K·澤姆朱米, H·德安朱 申請人:託皮根藥品公司