博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素和類毒素的純化方法

2023-06-11 22:46:21 2

專利名稱：：博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素和類毒素的純化方法
技術領域：
：本發明涉及預防豬傳染病的藥物。更具體地說，本發明涉及一種博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素的改良的類毒素，一種含有該類毒素和巴斯德氏菌所產皮膚壞死毒素的類毒素的類毒素混合物以及該類毒素的製備方法。
背景技術：
：萎縮性鼻炎(以下簡稱AR)是一種豬慢性呼吸道疾病，具有極強的傳染性，其原發症狀有鼻甲萎縮，鼻發育不全，鼻出血，鼻部彎斜，並引起其他呼吸道疾病等等。已知該病由產毒的支氣管敗血性博代氏桿菌(以下簡稱「Bb」)和產毒的出血敗血性巴斯德氏菌(以下簡稱「Pm」)引起，這兩種菌可使上呼吸道黏膜感染。Bb作為一種粘附因子，具有血紅細胞凝集作用和積聚作用，因而容易附著於鼻黏膜，而Pm不具這樣的粘附因子，因此不能由其自身定殖。所以，為了建立Pm感染，在鼻黏膜部位引起損害的一種易感因子是必須的，而這樣一種有代表性的易感因子就是Bb。已知與引起鼻黏膜損害有關的病原學因子是一種氣管細胞毒素和一種皮膚壞死毒素。在一個實驗性感染試驗中，先用Bb使豬感染，幾天後接著用Pm進行鼻內感染，結果引發如在一個牧場裡所觀察到的那樣嚴重的AR。博代氏桿菌屬包括百日咳博代氏桿菌、付百日咳博代氏桿菌、支氣管敗血性博代氏桿菌以及avium博代氏桿菌等。這些桿菌產生各種具有生物學活性的物質。Bb皮膚壞死毒素(以下簡稱「BbT」)就是這樣的物質之一，可以由任一種博代氏桿菌產生。已經發現，具有諸如出血壞死活性，引起鼻甲萎縮的活性，引起鼻發育不全的活性，致死活性，平滑肌血管收縮活性，引起局部血循環阻斷活性，引起脾萎縮活性，抑制抗體產生的活性等生物活性的BbT在博代氏桿菌病中起重要作用，而且還發現，BbT在小豬肺炎病灶形成過程中也起著重要作用(RoopII，R.M.eta1.，Infect.Immun.，55，p.217-222(1987))。另一方面，一部分出血壞死性巴斯德氏菌，或一部分非典型巴斯德氏菌可產生Pm皮膚壞死毒素(以下簡稱「PmT」)。業已證實，具有諸如出血壞死活性，致鼻甲萎縮的活性，致發育不全的活性，致死活性，致局部血循環阻斷的活性和致脾萎縮的活性等生物活性的PmT，在由產毒性Pm引起的疾病方面起重要作用。而且還發現，PmT與由產毒性Pm所致豬肺炎病灶的形成密切相關(Iwatsu，S.andSawada，T.；Jpn.J.vet.Sci.，50，p.1200-1206(1988))。雖然BbT和PmT二者都不被分泌入培養基中，而是在菌細胞中積蓄起來，但它們在長期的培養後，由於溶菌作用，可以從菌細胞內釋放出來，進入培養基上清液中。在體內過程中，由於溶菌作用從菌細胞中釋放出來的皮膚壞死毒素可影響生命體。在上面提及的情況下，皮膚壞死毒素在生命體中的保護作用尚不清楚，為了闡明這種保護作用的機理，需要開發一種大規模製備皮膚壞死毒素的方法和開發一種皮膚壞死毒素的類毒素，用於預防該病。但是，皮膚壞死毒素由於其自身的下述性質一直難於純化對熱的不穩定性，在純化操作進行過程中容易引起自身凝集，與菌細胞衍生的諸如脂質、酸性蛋白和疏水物質等這樣一類物質形成複合物。而且，鑑於BbT和PmT儘管具有相似的生物活性但沒有免疫學交叉反應性，從獸醫和豬飼養業觀點出發，人們一直熱切希望開發一種安全、有效的BbT-PmT類毒素混合物。迄今為止，用於從含細菌皮膚壞死毒素的溶液中，特別是從博代氏桿菌菌細胞提取物中部分純化皮膚壞死毒素的已知方法包括採用離子交換色譜的純化方法(Kume，K.etal.，Infect.Immun.，52(4)，p.370-377(1986))。但是，這種方法的缺點是重複性差。我們也了解到一種利用透析、蔗糖梯度超速離心和凝膠過濾色譜部分純化皮膚壞死毒素的方法(Endoh，M.etal.，Microbiol.Immunol.，30，(7)，p.659-673(1986))。但這一方法同樣顯示重複性差的缺點，況且，儘管採用了多步純化步驟，仍不能提供足夠純度的純化。另一個例子是採用以核酸去除劑、陰離子交換色譜和羥基磷灰石吸附色譜處理的純化方法(Horiguchi，Y.etal.，Microbiol.Pathogen.，6，P.361-368(1989))。但是，這一純化方法同樣有其不足，在於它需要一種昂貴的試劑，即核酸去除劑，而且涉及多步純化步驟。還有一種採用核酸去除試劑、透析和陽離子交換色譜的純化方法(Horiguchi，Y.etal.，FEMSMicrobiol.Letters，66，p.39-44(1990))。雖然這種純化方法具有高重複性，並能提供較高純度的皮膚壞死毒素，但像在上一個方法中指出的那樣，它也需要一種昂貴的試劑。還有一個實例是採用鹽析和染料配體親和色譜的純化方法(ZhangY.L.andSekuraR.D.，Infect.Immun.，59(10)，p.3754-3759(1991))。雖然這種純化方法顯示出高重複性，但其不足是提供的純化純度不充分。迄今報告的滅活AR疫苗有三個類型，即滅活的Bb單價疫苗，滅活的Pm單價疫苗以及滅活的Bb/Pm雙價疫苗，每一種疫苗都已加以研究，或已經投入實際應用。滅活的Bb疫苗包括含有由經甲醛、戊二醛等滅活的無致病力的一種細菌，並添加鋁凝膠或油佐劑的疫苗(Goodnow，R.A.Vet.Med.SmallAnim.Clin.，72，P.1210-1212(1977)；Nakase，Y.etal.，Proc.Int.PigVet.Soc.Congr.，8，(1976)；Giles，C.J.andSmith，I.M.，Vet.Bull.(London)，53，p.327-338(1983))。還發現，存在於Bb外膜上並具有腺苷酸環化酶活性的一種68KDa蛋白，顯示預防萎縮性鼻炎的作用(MontarazJ.A.etal.，Infect.Immun.，47，p.744-755(1985))。還了解到一種組成疫苗，含一種Bb產生的纖維狀血凝素作為主要成份(Hansen，G.R.etal.；InAtrophicrhinitisinpigs(Ed.Peterson，K.B.andNielsen，N.C.)CommunicationoftheEuropeanCommunities，Luxembourg，p.89-97(1983)，andOhgitani，T.etal.，Vaccine，9，p.653-658(1991))另據報導，為了提供一種抗毒素而添加皮膚壞死毒素的一種疫苗並不是有效的(Soderlind，O.andBergstrom，G.Int.pigVet.Sci.Congr.，p.175(1984)；Marel，C.M.vonderetal.，Int.pigVet.Sci.Congr.，p.170(1984))。另一方面，一種滅活的Pm單純疫苗含有Pm類毒素(Pederson，K.B.andBarfod，K.Nord.Vet.Med.，31，p.293-302(1982)；Foged，N.F.etal.，Vet.Rec.，125，p.7-11(1989))，這種疫苗業已得到研究，或已投入實際應用。Bb/Pm聯合滅活疫苗包括(1)、無致病力的Bb與無致病力的能產生PmT的PmD型細菌的混合物(該混合物還添加不能產生PmT的細菌)，或Bb與PmT類毒素的混合物(Barford，K.andPederson，K.B.，Nord.Vet.Med.，36，p.337-345(1984)；Baalsrud，K.J.，ActaVet.Scand.，28，p.305-311(1987))；deJong，M.F.etal.，Vet.Quart.9，p.49-59(1987))；Kobisch，M.andPennings，A.Vet.Rec.，124，p.57-61(1989))，這種混合疫苗只是為了預防AR的目的；(2)、無致病力的Bb與無致病力的可產生PmT的PmD型細菌以及無致病力的PmA型細菌的混合物(Ostle，A.G.etal.，Vet.Med.p.722-775(1986))，這種混合疫苗的目的是預防AR和肺炎；(3)、無致病力的Bb與無致病力的PmA型細菌、無致病力的insidiosa丹毒絲菌以及PmT類毒素的混合物(Jayappa，H.etal.Int.PigVet.Soc.Congr.，p.44(1988))。這種混合疫苗的目的是預防其他疾病以及AR和肺炎。這三種疫苗都已投入實際應用。鑑於BbT在Bb感染引起的鼻甲萎縮和肺炎病灶形成方面起著重要作用，ZoopII，R.M.等人指出需要一種BbT類毒素(Infect.Immun.，55，p.217-222(1987))。然而，他們從未提到將BbT和PmT類毒素聯合使用。Chanter，N等人已經提出，由於BbT和PmT協同作用誘導的豬鼻黏膜損害可創造有利於Bb和Pm繁殖的環境，所以PmT類毒素與Bb的這種重要毒素的結合應用更為有效(Res.Vet.Sci.，47，p.48-53(1989))。但是，含具有BbT活性組分的疫苗的應用至今尚未成功地增強BbT中和抗體的產生(Soderlind，O.andBergstrom，G.，Proc.Int.PigVet.Sci.Congr.，p.175(1984)；Marel，C.M.vonder.etal.，Proc.Int.PigVet.Sci.Congr，p.170(1984))。另一方面，Nakai等人透露，在接受高純度BbT類毒素的豬和小鼠中，中和抗體的產生得到增強(The111thJapanVeterinarySociety，lectureabstract，p.183(1991))。但是，他們也從未提到該BbT類毒素與PmT類毒素的聯合應用。本發明的公開內容為了找到一種有效純化皮膚壞死毒素(dermonecrotictoxin)的方法，本發明的發明人作了認真的研究，作為研究結果，已經發現(1)、用下面的純化方法能容易獲得回收率較高、內毒素含量較低的部分純化的皮膚壞死毒素即採用一種以直接硫酸化法作硫酸化處理的色譜凝膠，或一種與硫酸化後的分子共價結合的色譜凝膠，例如，纖維素硫酸酯凝膠，肝素固定化的吸附凝膠或硫酸化的烷基固定化吸附凝膠，對含皮膚壞死毒素的溶液，例如博代氏桿菌(Bordetella)提取物作色譜分離；(2)、對上述用經直接硫酸化法作硫酸化處理的色譜凝膠或與硫酸化後的分子共價結合的色譜凝膠獲得的部分純化的皮膚壞死毒素，進一步作透析、陽離子交換色譜和凝膠過濾色譜分離，能容易地獲得回收率較高的高純度的皮膚壞死毒素；(3)與未經純化的博代氏菌細胞提取物中的皮膚壞死毒素相比，採用經直接硫酸化法作硫酸化處理的色譜凝膠或與硫酸化分子共價結合的色譜凝膠作色譜分離所得的部分純化的皮膚壞死毒素的免疫反應性大大改善。而且，本發明人業已證實，用化學處理法所獲得的皮膚壞死毒素級分的減毒產物能有效地和安全地用於預防豬的萎縮性鼻炎，該皮膚壞死毒素組分的製備方法是將該博代氏桿菌菌細胞提取物與藉助直接硫酸化法硫酸化的色譜凝膠或共價結合了硫酸化分子的色譜凝膠相接觸，以便使該皮膚壞死毒素吸附到凝膠上，並與雜質分開，接著將這種皮膚壞死毒素從凝膠上洗脫下來。這樣，本發明得以完成。為了建立豬的Pm感染，Bb的預先感染作為引起豬鼻黏膜部位損傷的一種因素是必須的。凡是用BbT抗毒素免疫的豬，由Bb和Pm感染引起的鼻黏膜上的Pm克隆和鼻甲萎縮都得到減輕。然而，由於可以看到不同個體之間效果的明顯波動，據透露，單用BbT類毒素對AR滅活疫苗來說，是不夠的。基於上面提到的研究結果，為了開發一種類毒素混合物，本發明人進行了認真的研究，結果，已經找到一種類毒素混合製劑能有效、安全地用於預防豬的萎縮性鼻炎，該類毒素混合製劑的製備方法是將從用纖維素硫酸酯凝膠等分離方法自博代氏桿菌菌細胞提取物中，純化至比活性達37,000MND/mg蛋白或更高活性的毒素中分離得到的類毒素，與從由產毒的Pm所產生的PmT分離得到的類毒素相混合。這樣就形成一種類毒素混合製劑，即本發明的第二實施方案。本文所用的最小壞死劑量(MND)是指這樣一個劑量單位1MND規定為在1μg/ml的脂多糖(例如，從血清型O111B4大腸桿菌衍生的一種脂多糖)存在下，給豚鼠皮內注射後一天，產生一個不小於5mm直徑壞死斑所需要的最小劑量的皮膚壞死毒素。附圖的簡要描述圖1顯示本發明皮膚壞死毒素純化方法的一個步驟中的色譜圖。圖2顯示本發明皮膚壞死毒素純化方法的一個步驟中的色譜圖。圖3顯示本發明皮膚壞死毒素純化方法的一個步驟中的色譜圖。圖4顯示本發明皮膚壞死毒素的純化方法所得皮膚壞死毒素組分的分析結果。圖5顯示根據本發明所獲得的類毒素在小鼠模型上的藥效試驗結果。圖6顯示根據本發明所獲得的類毒素在懷孕母豬模型上的藥效試驗結果。圖7顯示對BbT中和抗體保護作用方面的研究結果。實施本發明的最佳方法本發明提供一種部分純化皮膚壞死毒素的方法，該方法包括以下步驟將含皮膚壞死毒素的溶液與用直接硫酸化法硫酸化了的色譜凝膠，或共價結合了硫酸化分子的色譜凝膠相接觸，以使該皮膚壞死毒素吸附到凝膠上，然後將其從凝膠上洗脫下來。本發明還提供一種從採用該部分純化皮膚壞死毒素的方法純化所得BbT衍生的BbT類毒素，以及一種用以下方法製備的類毒素混合製劑將該BbT類毒素與從產毒性Pm所產生的PmT衍生的一種類毒素相混合。該類毒素混合製劑對預防豬的萎縮性鼻炎是安全、有效的。本發明中用作起始材料的含皮膚壞死毒素的溶液包括從Bb、百日咳博代氏桿菌和付百日咳博代氏桿菌得到的菌細胞提取物。本發明的起始材料還包括從採用基因工程技術表達BbT的細胞所得的提取物。本發明中所用的優選提取物是從Bb得到的菌細胞提取物。以通常的方式，用下列方法培養Bb用博-讓二氏培養基(Bordet-Gengou)和麥康基氏培養基(Macconkey)等瓊脂培養基培養，或用像蛋白腖培養基(Horiguchi，Yetal.，Microb.Pathogen.，6，p.361-368(1989))、Cohen-Willer培養基和Stenner-Scholte培養基等這樣一類液體培養基作靜止培養、搖床培養和充氣旋轉器培養。用Conradi棒等器具把瓊脂培養基上的細菌培養物混懸於纖維素硫酸酯凝膠的起始緩衝液中。在用離心法回收菌細胞後，液體培養基中的細菌培養物，被混懸於纖維素硫酸酯凝膠的起始緩衝液中。可用下列方法純化所獲得的菌細胞懸液Kume，K等的方法(Infect.Immun.52(4)，p.370-377(1986))；Endoh，M等的方法(Microbiol.Immul.，30(7)，P.659-673(1986))；Horiguchi，Y等的方法(Microbial.Pathogen.，6，p.361-368(1988)或FEMSMicrobiol.Letters，66，p.39-44(1990))；ZhangY.L和SekuraR.D.的方法(Infect.Immun.，59(10)，p.3754-3759(1991))；或用直接硫酸化法進行硫酸化後的色譜凝膠如纖維素硫酸酯凝膠或共價結合了硫酸化分子的凝膠，作吸附色譜分離。但是，根據本發明，最優選的實施方案是將這種菌細胞懸浮液用直接硫酸化法硫酸化後的凝膠或與硫酸化分子共價結合的凝膠作吸附色譜分離純化。菌細胞懸液經超聲處理、酶處理、擠壓和反覆凍融等處理，以製備菌細胞勻漿，再用離心法或膜過濾法除去細胞碎片。可直接地，或進一步經使用核酸去除劑、脫鹽和超速離心等作的純化的預處理後，將如此所得的細菌提取物用於本發明的方法。根據本發明的方法，預處理並不總是必要的，而是菌細胞提取物可直接地用具有硫酸化分子作配體的吸附凝膠或經直接硫酸化法硫酸化了的吸附凝膠作吸附色譜分離，從而使該純化操作過程十分簡單和方便。現就本發明所述的、以經直接硫酸化法硫酸化了的色譜凝膠或共價結合了硫酸化分子的色譜凝膠舉例說明如下本發明所用的「經直接硫酸化法硫酸化的色譜凝膠」是指其凝膠本身在如吡啶這樣的有機溶劑存在下，經由例如酯鍵，與氯磺酸和硫酸酐這樣的硫酸化劑直接反應而被硫酸化的一種色譜凝膠(例如纖維素)，典型地包括硫酸酯被導入由晶纖維素或晶形區纖維素和非晶形區纖維素組成的球形纖維素中的纖維素硫酸酯凝膠。所得的纖維素硫酸酯保留了起始物的形狀，在水性溶劑中不溶，而且具有優良的物理穩定性，因此而適於用作色譜凝膠。這些作為起始材料的纖維素，例如以Avicel(由AsahiKaseiKogyoK.K.生產)和CellulofineGC-15，GH-25，GC-100，GC-200(Chisso公司生產)等商品名，易於在市場上買到。這種作為起始材料的纖維素可用上面提及的方法作硫酸化處理，某些已經硫酸化了的纖維素，例如「SulfatedCellulofine」(Chisso公司生產)，是可從市場上買得到的。本發明採用的「與硫酸化分子共價結合的色譜凝膠」是指與肝素(一種高度硫酸化的葡糖胺多糖)或磺丙基(一種硫酸化的烷基)或具磺基(sulfonegroup)的藍色染料通過CNBr法等共價結合的，含有諸如交聯纖維素、交聯葡聚糖或交聯瓊脂糖凝膠一類天然高分子量聚合物，或諸如親水性乙烯基聚合物或苯乙烯二乙烯基苯共聚物一類的合成高分子量聚合物的色譜凝膠，其中包括許多可從市場上買得到的產品。與肝素共價結合的色譜凝膠包括「肝素瓊脂糖凝膠CL-6B(「HeparinSepharoseCL-6B」)(Pharmacia公司)，「AffigelHeparinGel」(Bio-Rad公司)，「HeparinCellulofine」(SeikagakuKogyoK.K.公司)等等。與藍色染料共價結合的色譜凝膠包括「AffigelBlueGel」(Bio-Rad公司)，「AF-blueToyopearl」(TosoK.K.公司)，「BlueCellulofine」(SeikagakuKogyoK.K.公司)等等。與磺丙基共價結合的色譜凝膠包括「SP-Sephadex」(Pharmacia公司)，「SP-Toyopearl650M」(TosoK.K.公司)等等。按如下的方法，採用含硫酸基(sulfategroup)作配基的吸附凝膠或經直接硫酸化法硫酸化的吸附凝膠，從含皮膚壞死毒素的溶液中，尤其是從博代氏桿菌菌細胞提取物中，進行皮膚壞死毒素的純化和收集。雖然本發明以纖維素硫酸酯凝膠的應用作為優選實施方案加以說明，但在相似的條件下，也可使用其他的凝膠。預先用中性範圍pH(pH7-9)並具有適當比電導率(雖然因凝膠種類的不同，其數值在某種程度上可有所波動，但通常為20mS/cm或更低，一般為3-20mS/cm，較普通用的是5-20mS/cm)的緩衝液平衡纖維素硫酸酯凝膠，即為了有利於凝膠色譜的洗滌和洗脫，緩衝液的比電導率需要加以標化，例如，添加了濃度範圍為0-0.2M氯化鈉的0.02M磷酸鹽緩衝液。接著做吸附操作，使皮膚壞死毒素吸附到纖維素硫酸酯凝膠上。以批式純化或柱式純化這種工業上常用的方式進行一系列純化操作，如把皮膚壞死毒素吸附到纖維素硫酸酯凝膠上，洗滌凝膠，洗脫皮膚壞死毒素等等。採用批式純化時，把纖維素硫酸酯放入博代氏桿菌菌細胞提取物中，在溫度為0-30℃和pH範圍約7.0-9.0的條件下，緩慢攪拌混合物10-60min，以便使皮膚壞死毒素吸附到纖維素硫酸酯上。在這種情況下，在吸附操作進行前，需要把纖維素硫酸酯作適當的濃縮或稀釋，以便使博代氏桿菌菌細胞提取物的比電導率落在上面提到的範圍內，通常為3-20mS/cm或更低些。吸附操作完成後，把提取物和凝膠的混合物裝入過濾器，並作負壓抽濾，以將凝膠與濾液分開。將具有上述固定範圍比電導率(通常為約3-20mS/cm，或更低)和pH約5-10的適宜緩衝液，例如添加0.1M氯化鈉的0.02M磷酸鹽緩衝液，倒入該分離的凝膠中，用負壓抽濾洗滌凝膠。然後將pH約5-10，比電導率高於上述固定範圍而一般低於130mS/cm(例如，優選範圍約為22-46mS/cm)的適宜緩衝液，例如添加濃度為0.2-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩衝液，倒入該凝膠中，以洗脫吸附的皮膚壞死毒素。採用柱式純化時，起始材料、洗滌用緩衝液和洗脫用緩衝液的條件可以與批式純化的條件相似。本發明推薦把緩衝液的流速調整到約10ml/cm2/hr-500ml/cm2/hr。本發明的這種純化法使含皮膚壞死毒素溶液中的皮膚壞死毒素能夠特異地吸附，其提供的皮膚壞死毒素純度提高几十倍到110倍，且皮膚壞死毒素的回收率高(40-100％)。內毒素可引起發熱或休克一類的副反應，在菌細胞勻漿提取物中，其與皮膚壞死毒素共存，含量很高，但它不能被吸附到纖維素硫酸酯凝膠上，因此內毒素的含量可降低到1/30-1/800。獲得的純化皮膚壞死毒素的比活性高達4×105至3×106MND/mg蛋白，在SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳上形成一條主帶。正如上面所提到的，根據本發明的純化方法，可以以高產率和高純度，從含皮膚壞死毒素的起始溶液中提取所需要的皮膚壞死毒素。純化操作十分簡單，純化所用的色譜吸附劑可以自己製備，也可以低成本從市場買到，從反覆使用後沒有變質的經濟觀點來看，該吸附劑也是極其令人滿意的。因此，對皮膚壞死毒素的工業化生產來說，本發明的純化方法是一種十分令人滿意的方法。此外，本發明的純化方法也可以與傳統的陽離子交換色譜和凝膠過濾色譜等純化方法結合應用以進一步提高純度，籍此提供比傳統純化方法所獲得的更為出色的結果。用本發明的方法純化的皮膚壞死毒素經化學試劑處理後可轉變成類毒素，後者失去毒素活性而保留免疫原性。用普通的方法，例如用甲醛(Nakai，T.etal.，Infect.Immun.，46，p.429-434(1984))或戊醛(Endoh，M.etal.，Microbiol.Immunol.，30，p.659-673(1986))等試劑能將皮膚壞死毒素轉變成類毒素。為了在把該類毒素給予生命體後誘導體液免疫，佐劑與類毒素一同施用。所用佐劑的例子有鋁凝膠、油佐劑和皂角苷等。該類毒素顯示出比未純化的皮膚壞死毒素組分更高的免疫原性，還十分安全，這些特點被下面闡述的諸實施例中的資料所證實。由本發明的純化方法獲得的部分純化的皮膚壞死毒素具有高純度，並除去了大部分內毒素，因此可用於製備動物用疫苗。此外，在本發明的純化方法與傳統的純化方法聯合應用而使該部分純化的皮膚壞死毒素的純度進一步得到提高的情況下，該部分純化的皮膚壞死毒素也可用於製備各種試劑或藥劑，甚至可用於製備人用百日咳博代氏桿菌疫苗。大多數自然感染的Bb病例不產生BbT中和抗體，但具有細菌凝集作用的抗體以高比率增加，後者已被用於該病的血清學診斷。根據本發明人的觀測，在有AR出現的15個縣的48個農場的327頭豬中，只有一個農場(佔2.1％)的2頭豬(佔0.6％)中查出BbT中和抗體陽性。傳統的Bb滅活疫苗可使細菌凝集作用的抗體增加，從而幹擾診斷。但是，本發明的純化法與常規純化法聯合應用，進一步提高BbT的純度後，可製備一種能產生中和抗體但不會增加具細菌凝集作用的抗體的類毒素。能夠使疫苗誘導的抗體和感染誘導的抗體之間具有血清學差別的疫苗或類毒素謂之「標識疫苗」。例如，在無特殊病原體(SPF)的農場裡，如果出現任何原因引起的Bb感染而使用本發明的類毒素以防止AR，則可藉助測定具有細菌凝集作用的抗體，查出被感染的豬。本發明的另一個方面是提供一種含有根據本發明的純化方法製備的BbT類毒素以及由巴斯德氏菌所產皮膚壞死毒素的類毒素之類毒素混合製劑。就本發明所用的PmT來說，作為起始材料的Pm菌細胞提取物包括從產毒性Pm或非典型巴斯德氏菌來源的菌細胞提取物(Kamp，E.M.I.E.etal.，Vet.Rec.，126，p.434-437(1990))。另外的選擇是，本發明的起始材料也包括PmT由基因工程技術表達的菌細胞之提取物。本發明所用的優選提取物是來源於產毒性Pm的菌細胞提取物，產毒性Pm採用普通的方法加以培養，例如在心臟浸液培養基、酪蛋白胰酶大豆肉湯、Luria-Bertani培養基、肉浸液培養基等一類液體培養基中作靜止培養、搖動培養或充氣旋轉器培養(deJong，M.F.andAkkermans，J.P.W.M.，Vet.Quart.，8，p.294-314)，或用右旋糖-澱粉培養基、血瓊脂培養基和YPC培養基等一類瓊脂培養基培養(Namioka，S.andMurata，M.，CornellVet.，51，p.498-507(1961))。用Conradi棒等器具，把瓊脂培養基上的細菌培養物混懸於Tris緩衝液等中。用離心法回收菌細胞後，將液體培養基中的細菌培養物，混懸於供下面純化步驟用的適宜緩衝液中。菌細胞混懸液經超聲處理、酶處理、擠壓和反覆凍融等方式處理，以便製成菌細胞勻漿。用離心法或膜過濾法除去細胞碎片。用離子交換色譜和以能識別PmT的抗體製備的親和色譜等分離方法純化菌細胞提取物。另外的選擇是，產毒性Pm的培養物在液體培養基中培養24至65小時後所獲得的上清液也可作為起始材料用於純化，或者直接用於減毒處理。如此製備的皮膚壞死毒素組分用甲醛、戊醛等作解毒處理。解毒處理完成後，採用透析等方法，以磷酸鹽緩衝的生理鹽水取代緩衝液，並往裡面加入佐劑。可以加入的佐劑範例包括鋁凝膠、油佐劑和皂角苷等。將濃度2倍於添加了佐劑的單價疫苗的一種抗原溶液，與另一種濃度2倍於添加了佐劑的單價疫苗的抗原溶液相混合，即可製成類毒素混合製劑。根據本發明獲得的類毒素混合製劑不但十分安全，而且還能誘導中和BbT和PmT的抗體，因此能保護豬免患因這二種毒素引起的鼻甲萎縮或發育不全。在下小豬前至少一周，當以2-6周的間隔給妊娠母豬肌肉注射根據本發明得到的BbT類毒素和類毒素混合製劑兩次時，即可通過初乳提供的母體抗體防止其後代受感染。對於後來的分娩，只要在臨產前接種一針本發明的類毒素，即可足以建立免疫。就嚴重AR感染的農場的情況而言，以2至6周的間隔給出生不少於7天的仔豬肌內注射本發明的類毒素二次，也能夠有效地建立直接的保護作用。通過下面的製備方法和實例可對本發明進行更詳細地說明，但是不應理解為本發明僅限於此。實施例製備方法1在不高於0℃的溫度下，把氯磺酸(117克)逐滴加到吡啶(600ml)中，攪拌混勻。在氯磺酸逐滴加入後，將混合物加熱至65至70℃，往裡面加入CellulofineGC-15(80g，Chisso公司生產)，在65-70℃條件下攪拌該混合物3小時，使其反應。反應完成後，將混合物冷卻，加入10％氫氧化鈉水溶液，以逐漸中和該混合物。將凝膠過濾分離出來，並用0.01M磷酸鹽緩衝的生理鹽水充分洗滌凝膠，以產生纖維素硫酸酯凝膠。製備方法2在不高於0℃的溫度下，把氯磺酸(117克)滴加到吡啶(600ml)中，將混合物攪拌混勻。在氯磺酸逐滴加入後，將混合物加熱至65-70℃，往裡面加入色譜用Avicel(80克，微晶纖維素，AsahiKaseiKogyoK.K.公司生產)，攪拌期間混合物溫度保持在65-70℃4小時。反應完成後，將混合物冷卻，加入10％氫氧化鈉水溶液，以中和該混合物。過濾分離出凝膠，並用0.01M磷酸鹽緩衝的生理鹽水充分洗滌凝膠，以產生結晶纖維素硫酸酯凝膠。製備方法3在0-5℃溫度下，將氯磺酸(82克)逐滴加到吡啶(500ml)中，將混合物攪拌混勻。在氯磺酸逐滴加入後，將混合物加熱至65-70℃。往裡加入80克CellulofineGC-25(Chisso公司生產)，將混合物在65-70℃條件下攪拌4小時，使發生反應。反應完全後，將混合物冷卻，並緩慢加入10％氫氧化鈉水溶液，以中和混合物。過濾分離出凝膠，並用0.01M磷酸鹽緩衝的生理鹽水(pH7.2)充分洗滌凝膠，以產生纖維素硫酸酯凝膠。實施例1(從色譜柱梯度洗脫)將按製備方法1製備的CellulofineGC-15硫酸酯凝膠填裝色譜柱(50mm(內徑)×200mm)中，並用0.02M磷酸鹽緩衝液(pH8.0；比電導率約3mS/cm)平衡該柱。將Bb菌株S611的細胞提取液(200ml)加到柱中，然後用上述的緩衝液洗滌柱，以洗掉碎片。接著用添加0-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩衝液(pH8.0，比電導率約3-46mS/cm)作梯度洗脫，得到含總蛋白量9.1mg的皮膚壞死毒素的組分。皮膚壞死毒素的回收率為39.6％，純度(純化的皮膚壞死毒素組分的比活性/菌細胞勻漿提取物的比活性)高達32.1。實施例2(從色譜柱逐段洗脫)將按製備方法1所製備的CellulofineGC-15硫酸酯凝膠填裝色譜柱(252mm(內徑)×210mm)中，並用0.02M磷酸鹽緩衝液(pH8.0；比電導率約3mS/cm)平衡該柱。將Bb菌株S611的細胞提取物(總蛋白量為29-35克)加到柱上，然後用添加0-0.15M氯化鈉的0.02M磷酸鹽緩衝液(pH7.8-8.0，比電導率約3-17mS/cm)洗滌柱，以洗掉細菌碎片。接著用添加0.3-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩衝液(pH7.5-7.7；比電導率約30-46mS/cm)洗脫，得到含總蛋白量為0.2-1.1克的皮膚壞死毒素的組分。如表1所示，皮膚壞死毒素的回收率為76-100％，純度(純化的皮膚壞死毒素組分的比活性/菌細胞勻漿提取物的比活性)高達22-114，而內毒素含量降低到0.1-3％。表1(a)用BCA微量蛋白試驗(Pierce)測定(b)用Endospacy(SeikagakuKogyoK.K.)測定實施例3(從肝素瓊脂糖凝膠柱梯度洗脫)將肝素瓊脂糖CL-6B凝膠(Pharmacia公司生產)填裝色譜柱(25mm(內徑)×140mm)，並用0.02M磷酸鹽緩衝液(pH8.0；比電導率約3mS/cm)平衡該柱。Bb菌株S611的細胞提取液(總蛋白量為420mg)加到柱上，然後用上述緩衝液洗柱，以洗去菌細胞碎片。接著用添加0-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩衝液(pH8.0；比電導率約3-46mS/cm)作梯度洗脫，獲得含24mg總蛋白的皮膚壞死毒素的組分。皮膚壞死毒素的回收率為40.8％，純度(純化皮膚壞死毒素的比活性/菌細胞勻漿提取物的比活性)高達7。分析結果見表2。實施例4(從SP-Toyopearl650M柱上作梯度洗脫)將SP-Toyopearl650M柱(Toso.K.K.公司生產)填充色譜柱(50mm(內徑)×140mm)，並用0.02M磷酸鹽緩衝液(pH8.0；比電導率約3mS/cm)平衡該柱。Bb菌株S611的細胞提取液(總蛋白量631mg)加到柱上，然後用上述緩衝液洗滌柱，以洗除菌細胞碎片。接著用添加0-0.5M氯化鈉的磷酸鹽緩衝液(pH8.0；比電導率約3-46mS/cm)作梯度洗脫，獲得含2mg總蛋白的皮膚壞死毒素組分。皮膚壞死毒素的回收率為11.5％，純度(純化的皮膚壞死毒素組分的比活性/菌細胞勻漿提取物的比活性)高達35.5。分析結果見表2。實施例5(高純度純化方法)將按實施例1製備的纖維素硫酸酯凝膠純化組分，對33mM檸檬酸鹽/66mM磷酸氫二鈉/1M尿素(pH5.0)作透析。將透析液(9.1mg總蛋白)加到用相同緩衝液平衡過的SP-Toyopearl650M(TosoK.K.公司生產；10mm(內徑)×80mm)柱上，接著用相同緩衝液洗滌以洗掉碎片。然後用添加0-0.5M氯化鈉的上述緩衝液作梯度洗脫，得到含皮膚壞死毒素(3.1mg總蛋白)的組分(SP組分)。該SP組分在用50mM磷酸鹽緩衝液(pH7.1)/0.3M硫酸鈉/1M尿素平衡過的TSK-gelG3000SW柱(21mm(內徑)×600mm)上，用高效液相色譜(HPLC)作進一步純化，得到含皮膚壞死毒素(1.3mg總蛋白)的組分(HPLC組分。圖1至圖3分別顯示這些色譜分離結果。菌細胞勻漿提取物和皮膚壞死毒素各組分的分析結果列於表3和圖4，純化的毒素性質列於表4。表3(a)根據BCA蛋白測定(Pierce公司生產)表4.分子量146kDa最小皮膚壞死劑量0.23ng最小脾萎縮劑量0.07ng小鼠LD503.8ng實施例6(降低毒性)將甲醛加入到按實施例1至5製備的各皮膚壞死毒素組分中，在37-40℃下使其反應3-14天，以使毒性降低。將10％甲醛的3％當量加到皮膚壞死毒素組分中，第2天的加入當量仍為3％，第3天加入2％當量。降低毒性的反應結束後，將皮膚壞死毒素組分對磷酸鹽緩衝的生理鹽水作透析處理。實施例7(加入佐劑)把氫氧化鋁凝膠和防腐劑(乙汞硫代水楊酸鈉或甲醛)加到按實施例6製備的解毒皮膚壞死毒素中。實施例8(小鼠效價試驗)給5周齡ddy小鼠腹腔注射0.5ml按實施例7獲得的類毒素，隔2周注射一次，共二次。在最後一次免疫後二周，給動物腹腔注射約50(25-100)個LD50的皮膚壞死毒素進行攻擊，觀察7天內的存活率。結果如圖5顯示。類毒素劑量與小鼠存活率之間呈正相關。實施例9(對繁殖豬的安全性試驗)如實施例6一樣，將按實施例2製備的組分作去毒處理。按實施例7製備添加氫氧化鋁凝膠的類毒素(2-50μg/2ml/一次劑量)，並給10周齡的SPF豬作肌內注射，隔3周注射一次，共注射2次。在受試豬中，均未觀察到由於注射引起的臨床症狀和體溫異常。實施例10(對妊娠母豬的有效性試驗)如實施例5獲得的HPLC組分按實施例6作降低毒性處理。按實施例7製備添加氫氧化鋁凝膠的類毒素(25μg/ml)後，給妊娠母豬作肌內注射，於下小豬前3周和6周各肌注一次，每次注射體積為2ml。給對照母豬注射安慰劑疫苗。餵以充足母體初乳的新生仔豬於出生後3天，鼻內給予2×108Bb菌株S611活細胞作攻擊，其中一半仔豬於2和3周齡時，各肌注一針2600MND皮膚壞死毒素作進一步攻擊。表5顯示所獲得的皮膚壞死毒素中和抗體滴度。產小豬的母豬血和初乳中BbT中和抗體滴度分別為32和256，而仔豬的母體抗體滴度為128。其母體抗體保持陽性達6周以上。注射安慰劑的對照母豬及其仔豬均為血清學陰性。攻擊試驗結果列於表6。12頭對照豬中有9頭查出鼻甲萎縮(評級為+-+++)，而免疫組中均未查出鼻甲萎縮。兩組動物之間回收的鼻內細菌無差別。至於體重增長，如圖6所示，當除用Bb活菌攻擊外還用皮膚壞死毒素作攻擊後，二組之間有差別。2周齡時用皮膚壞死毒素作首次攻擊後，對照組的體重增長率減少到免疫組的三分之一，3周齡時用皮膚壞死毒素作第二次攻擊後，對照組的豬全部死亡。表5(a)分娩時表6攻擊物鼻甲細菌組別豬編號BbBbT萎縮回收(a)備註Y126+--/-b)++++Y127+--/-+Y128+--/-++++免疫Y129+--/-++++Y130++-/-+Y131++-/-++++Y132++-/-++++Y133++-/-+Y134++-/-++++Y151+-+/++++Y152+--/+++++Y153+--/+++++Y154+-++/+++++Y155+-+/++對照Y156+--/-++++Y157+++++/++NTc)第2天死亡d)Y158+++++/+++NT第2天死亡Y159+++++/++NT第6天死亡Y160+++++/++NT第5天死亡Y161++++/++NT第1天死亡Y162+++/+NT第3天死亡(a).鼻內拭子塗抹的培養皿上出現的菌落數；-0，+～50，++～100，+++～200，++++＞200(b).分成5級(-，+，++，+++，++++)作評定；左鼻甲骨/右鼻甲骨的得分。(c).未作試驗(d).第二次BbT攻擊後算起的天數實施例11(對繁殖豬的效價試驗)將按實施例2獲得的組分按實施例6作減毒處理。按實施例7製備添加氫氧化鋁凝膠的類毒素(25μg/2ml/每次劑量)後，給10周齡的SPF豬作肌肉注射，以3周間隔注射二次。最後一次免疫後4周，經鼻內給予2×108活Bb菌攻擊豬，檢測皮膚壞死毒素中和抗體的滴度直至攻擊後3周為止。如表7所示，對照豬即使在攻擊後仍保持BbT中和抗體血清學陰性。另一方面，免疫組中的所有豬均轉變成BbT中和抗體血清學陽性。注射2或6μg/2ml/每次劑量類毒素免疫的豬在攻擊後中和抗體滴度呈現迅速的升高，而注射20或50μg/2ml/每次劑量類毒素免疫的豬在攻擊後中和抗體滴度無明顯升高。據報導，皮膚壞死毒素具有抑制抗體產生的作用(Sekiya，K.Microbiol.Immunol.，27，p.905-915(1983))。攻擊後對照豬中和抗體不見升高的原因，看來像是由於攻擊細菌引起的BbT的免疫抑制作用。因此，鑑於免疫組豬中和抗體的急劇升高是由於不受BbT抑制抗體產生作用的影響，提示2μgBbT類毒素這一劑量對繁殖的豬是有效的。表7BbT鼻內類毒)豬編)首次免疫後各周的首次免疫後各周的細菌素劑號b).BbT中和抗體滴度Bb凝集抗體滴度回收量a)034571003710結果0Y135＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜10＜10＜1040++Y136＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜10＜10＜1080++++2Y137＜1＜11688128＜10＜10＜10640+++Y138＜1＜1163216512＜10＜10＜101280+++Y139＜1＜1816161024＜10＜10＜1080++++6Y140＜1＜1163216512＜10＜10＜10640+++Y141＜1＜1166416128＜10＜10＜10320-Y142＜1＜164643264＜10＜10＜10160++++20Y143＜1＜132646432＜10＜10＜10640++++Y144＜1＜14881＜10＜10＜1040+Y145＜1＜1163288＜10＜10＜10320++50Y146＜1＜164646464＜10＜10＜101280+++Y147＜1＜11281286432＜10＜10＜10320+Y148＜1＜1642566464＜10＜10＜10640++a).μg/2ml/單次劑量b).於0周和3周給10周齡SPF豬肌肉注射BbT類毒素兩次，7周時鼻內給予活Bb菌作攻擊。製備方法4(破碎的菌細胞提取物BbT類毒素1)將Bb菌S611株置發酵罐蛋白腖培養基中在37℃通氣培養24小時。用離心法濃縮菌細胞，然後用機械破碎法將菌細胞破碎。用離心法或微孔濾膜(孔徑0.45μm)過濾法除去細菌碎片後，在獲得的溶液(即BbT粗組分)中加入終濃度為0.8％的甲醛，在37-40℃條件下減毒處理7天。所得類毒素對磷酸鹽緩衝的生理鹽水進行透析。以1mg(以鋁含量計)/ml的用量將氫氧化鋁凝膠加到經過透析的產物中，形成BbT類毒素1。製備方法5(BbT類毒素2)按製備方法4獲得的BbT粗組分在纖維素硫酸酯凝膠柱上作色譜分離純化。將該BbT粗組分加到用20mM磷酸鹽緩衝液(pH8.0)經過平衡的纖維素硫酸酯凝膠柱上，然後用相同緩衝液洗滌凝膠。用添加了1.5MNaCl和1M尿素的20mM磷酸鹽緩衝液(pH8.0)將BbT從纖維素硫酸酯凝膠柱(7.8cm(內徑)×45cm)上洗脫下來。按製備方法4將洗脫的組分(CS1組分)作解毒處理，經透析後加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素2。製備方法6(BbT類毒素3)用TSKgelHW65(2.64cm(內徑)×69cm)和HW75(2.64cm(內徑)×64cm)柱相結合的色譜分離法將按製備方法5獲得的CS1組分作進一步純化。使CS1組分通過已用添加0.3M硫酸鈉和1M尿素的0.05M磷酸鹽緩衝液(pH7.2)平衡過的該色譜柱，並用相同緩衝液作分級分離。然後合併含皮膚壞死毒素的諸級分(組分)。按製備方法4將合併的級分作解毒處理，經透析後加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素3。製備方法7(BbT類毒素4)按製備方法4獲得的粗提BbT組分在纖維素硫酸酯凝膠柱上作色譜分離純化。將該粗提BbT加到已用添加0.1MNaCl的20mM磷酸鹽緩衝液(pH8.0)平衡過的纖維素硫酸酯凝膠上，並用相同緩衝液洗滌凝膠。用添加0.5MNaCl的20mM磷酸鹽緩衝液(pH8.0)將BbT從纖維素硫酸酯凝膠上洗脫下來。按製備方法4將洗脫的組分(CS2組分)作解毒處理，經透析後加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素4。製備方法8(BbT類毒素5)按製備方法7獲得的CS2組分用Affi-gelblue柱(BioRad公司生產；100-200目；5.0cm(內徑)×17cm)作進一步純化。將CS2組分對50mMTris緩衝液(pH7.5)透析後，加到已用相同緩衝液平衡過的Affigelblue柱上，將柱用已添加1M磷酸氫二鈉的50mMTris緩衝液(pH7.5)加以洗滌。在用50mMTris緩衝液(pH7.5)將該柱作進一步洗滌後，用已添加2M氯化鎂和1M尿素的50mMTris緩衝液(pH7.5)將BbT洗脫下來。按製備方法4將此純化組分作解毒處理，經透析後加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素5。製備方法9(BbT抗毒素)將如實施例1和實施例5獲得的高純度BbT組分按製備方法4作解毒處理，經透析後加入氫氧化鋁凝膠，形成BbT類毒素6。給27周齡的SPF豬接種該類毒素，在3個月中共接種8次，每次接種1ml，使產生BbT抗毒素(中和抗體滴度為4,096；凝集作用抗體的滴度＜20)。製備方法10(PmT類毒素)將產毒性PmD型菌S70株置含心臟浸液肉湯的發酵罐中37℃通氣培養24小時。用離心法濃縮菌細胞後用機械破碎法加以破碎。用離心法或微孔濾膜(孔徑0.45μm)過濾法除去碎片後所得的溶液(縮寫為「粗製PmT」)通過陰離子交換色譜加以純化。將粗製PmT加到已用添加0-0.3MNaCl或Tris緩衝液的中性磷酸鹽緩衝液平衡過的陰離子交換器上，然後用相同緩衝液洗滌陰離子交換器。用添加0.4-0.5MNaCl的相同緩衝液將PmT從該交換器上洗脫下來。在該部分純化的PmT組分中加入0.4％的甲醛，在37℃進行14天或更長時間的減毒。獲得的類毒素對磷酸鹽緩衝的生理鹽水作透析。把氫氧化鋁凝膠以1mgAl/ml的用量加到透析液中，形成PmT類毒素。實施例12(用各種純化法所獲得的BbT類毒素對豚鼠的免疫原性)將按製備方法4-8獲得的活性為3,000MND/ml(解毒前的活性)的幾種BbT類毒素給豚鼠(Hartely；雌性；5周齡)在大腿部作肌注，每種類毒素的注射體積為0.5ml。在注射後28天給動物放血，測定BbT中和抗體的滴度。用磷酸鹽緩衝的生理鹽水將滅活血清作雙倍系列稀釋，進行中和抗體測定。將等量BbT(滴度4MND/0.1ml)加到稀釋血清中，在冰冷條件下反應過夜。之後，取0.1ml混合物注入豚鼠皮下，注射後1天進行檢測，中和抗體滴度以抑制皮膚壞死反應的血清最大稀釋度(即血清的稀釋倍數)表示。如表8所示，注射具比活性為1.4×104MND/mg蛋白的BbT類毒素1和2的豚鼠保持中和抗體的血清學陰性。在注射具比活性3.7×104MND/mg蛋白的BbT類毒素3的情況下，3隻豚鼠中有2隻為血清學陽性，注射比活性大於7.8×104MND/mg蛋白的BbT類毒素的所有動物都轉為血清學陽性。在純化期間BbT易於成為不溶性，並容易與像脂、酸性蛋白等一類細菌衍生的物質形成複合物(Wordlaw，A.C.andParton，R.Pharmacol.Ther.，19，p.1-53(1983))。由此看來，減少這些細菌衍生物能夠使解毒更充分，或可減少BbT分子上免疫原的抗原決定基的掩蔽，以增強抗原提呈的效果，從而提高BbT類毒素的免疫原性。表8BbT類毒素比活性(MND/mg蛋白)皮膚壞死毒素中和抗體滴度114000＜2＜2＜2214000＜2＜2＜2337000＜224476000323212859600083232無致病力疫苗-＜2＜2＜2(由A生產)無致病力疫苗-＜2＜2＜2(由B生產)每種類毒素濃度調整到3000MND/ml，並以1mgAl/ml的用量加入氫氧化鋁凝膠。實施例13(BbT中和抗體的保護作用方面)給2日齡SPF豬腹腔注射按製備方法10所獲得的BbT抗毒素，注射體積分別為0.2，1.0，2.0或20ml，使豬被動免疫。3日齡時鼻內給予108CFU的Bb菌S611株作攻擊。7日齡時肌注粗製BbT(1,940MND/每頭豬)作進一步攻擊。如圖7所示，在BbT中和抗體滴度大於1時，可觀察到對抗BbT致死活性的保護作用，而當其中和抗體滴度大於4時，還可能免遭皮膚壞死。實施例14(PmT中和抗體的保護作用方面)按製備方法10所得粗製PmT類毒素與等量的福氏不完全佐劑混合，加以乳化。8頭SPF妊娠母豬分成二組，免疫組6頭，對照組二頭。免疫組的豬在妊娠期間，肌肉注射類毒素(840MND/ml)2-5次，注射體積3ml/次/每頭豬。分娩後仔豬餵以足量初乳，2日齡或9日齡時，肌注20-160MND粗製PmT作攻擊。攻擊後連續14天觀察小豬，並檢查鼻甲損傷。如表9所示，觀察到在PmT中和抗體滴度大於2時，可保護小豬免患PmT所致鼻甲萎縮，即使中和抗體滴度小於2時也有可能保護小豬免遭死亡。表9試驗類別PmT中和抗體滴度a)死亡數/總數b)平均鼻甲萎縮得分c)免疫組1280/20640/20320/30160/5040/1020/90對照組＜20/102.4＜23/142.3a)攻擊時用胚胎期牛肺細胞測得的母體抗體滴度。b)給2日齡或9日齡小豬在大腿部位肌注20-160MNDPmT作攻擊。c)鼻甲萎縮的平均得分值；0正常，1輕度，2中度，3重度，4極重度。實施例15(在用BbT抗毒素被動免疫的仔豬上所作的Bb和Pm攻擊試驗)給2日齡SPF仔豬腹腔注射20ml按製備方法10所獲BbT抗毒素，作被動免疫。在3和7日齡時分別給豬鼻內施用108CFU的Bb菌S611株和108CFU的Pm菌D型S70株，6周齡時進行屍體解剖。如表10所示，用BbT抗毒素免疫後，可從鼻黏膜回收大量Bb菌，而與對照相比，Pm菌的回收量則相當低。對照組的鼻甲損傷評定為重度(+-+)到極重度(++++)，而免疫組中，一頭豬為正常(-)，其餘豬為重度到極重度，表明個體與個體之間的差異很大。表10不同日齡時BbT不同日齡時PmT鼻內細菌組別仔豬中和抗體滴度中和抗體滴度鼻甲回收量豬號.性別3715304437153044萎縮BbPmDa)Y89♀256NT643216＜2NT＜2＜2＜2++++++++++免疫組Y100♀256128643264＜2＜2＜2＜2＜2-++++-Y125256128643232＜2＜2＜2＜2＜2+++++++-Y80＜1NT＜1＜1＜1＜2NT＜2＜2＜2++++++++++++對照組Y83♀＜1NT＜1＜1＜1＜2NT＜2＜2＜2+++++++++++Y99♀＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2++++++++++++a)給2日齡仔豬腹腔注射豬抗BbT抗血清*小豬3日齡時鼻內給予BbS611菌(188CFU/頭)，7日齡時鼻內給予PmDS70菌(108CFU/頭)，使其遭受攻擊。皮膚壞死毒素在菌細胞內產生，藉助細菌溶解從菌細胞分泌出來。因此，BbT抗毒素不能阻斷Bb在鼻黏膜上的繁殖。為了Pm的繁殖，Bb應預先在鼻黏膜部位已引起損害。作為由Bb所產生的可引起鼻黏膜損害的因子，BbT(Elias，B.etal.，Jpn.J.Vet.Sci.，52，p.677-688(1990))和氣管細胞毒素(Cookson，B.T.andGoldman，W.E.，J.Cell.Biochem.，11B(Suppl.)p.124；Dugal，F.etal.，Can.J.Vet.Res.，56，p.260-264(1992))是最重要的。由於氣管細胞毒素具有終止氣管纖毛運動的作用，破壞纖毛上皮細胞的作用以及加速粘液分泌的作用，所有這些作用對於Pm的繁殖都是至關重要的，因此，用BbT抗血清免疫只能部分地阻斷Pm的繁殖。鑑於這些事實，應建立至少是抗BbT和氣管細胞毒素的免疫，以阻斷Pm在鼻黏膜上的繁殖。但是，氣管細胞毒素類毒素離實際應用相差甚遠，面臨許多問題有待解決，例如，純化方法的建立、免疫原性以及產率等。因此，為了防止萎縮性鼻炎的原發症狀而避免經濟損失，AR滅活疫苗應至少包含皮膚壞死毒素的類毒素混合製劑。實施例16(類毒素混合製劑的實施例)將氫氧化鋁凝膠加到按實施例2和6所得的解毒BbT中，其混合物加以攪拌。BbT類毒素貯存溶液的製備方法是把BbT濃度調整到8,700-220,000MND/ml(相當於解毒前2-50μg/mlBbT蛋白)，把鋁的濃度調整到0.5-2.5mg/ml，並加入防腐劑。PmT貯存溶液的製備方法是在按製備方法10所得的濃度為3,400MND/ml或更高(解毒前的毒素量)的解毒PmT中，加入氫氧化鋁凝膠以及防腐劑。所用的防腐劑有0.01％乙基汞硫代水楊酸鈉或0.1-0.4％甲醛。BbT貯存溶液與PmT類毒素貯存溶液等量混合，形成類毒素混合製劑。給9周齡SPF豬頸部肌注接種該類毒素混合製劑2ml，接種二次，間隔3周。間隔一段時間後，製備血清，測定BbT中和抗體和PmT中和抗體的滴度。用胎牛肺細胞做中和試驗，測定PmT中和抗體的滴度(Rutter，J.M.andLuther，P.D.，Vet.Rec.，114，p.393-396(1984))。表11顯示豬的中和抗體滴度，而表12則是小鼠的滴度試驗結果。未觀察到給豬和小鼠接種後，BbT和PmT類毒素單用和類毒素混合製劑之間的免疫原性的明顯差別。該類毒素混合製劑顯現足以起保護作用的中和抗體反應，而且是十分安全的。表11首次免疫後不同天數首次免疫後不同天數試驗組別a)豬的BbT中和抗體滴度PmT中和抗體滴度編號0102135506401021355064BbT單用Y117＜1＜1＜132328＜2＜2＜2＜2＜2＜2Y118＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2＜2Y119＜1＜1＜164168＜2＜2＜2＜2＜2＜2類毒素Y120＜1＜1＜1643216＜2＜2＜2256128128混合製劑Y121＜1＜1＜11684＜2＜2＜2643216Y122＜1＜1＜122＜1＜2＜2＜2643232PmT單用Y123＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2643216Y124＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜212812864Y125＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜212812864對照Y114＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2＜2Y115＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2＜2Y116＜1＜1＜1＜1＜1＜1＜2＜2＜2＜2＜2＜2a)於0天和21天，將每種類毒素在頸部作肌注。表12表中所列中和抗體滴度係指攻擊時所測得的滴度。權利要求1.細菌所產生的皮膚壞死毒素的純化方法，其特徵在於使含皮膚壞死毒素的溶液與一種通過直接硫酸化反應硫酸化的色譜凝膠或一種與硫酸化分子共價結合的色譜凝膠接觸，從而使皮膚壞死毒素被吸附到凝膠上，然後從凝膠上把吸附的皮膚壞死毒素洗脫下來。2.根據權利要求1的皮膚壞死毒素的純化方法，其中吸附凝膠選自纖維素硫酸酯凝膠，後者是導入硫酸酯的纖維素，或選自含有與肝素、磺丙基或其分子內含磺基(sulfonegroup)的蘭色染料單獨結合或聯合結合的天然高分子量聚合物或合成高分子量聚合物的色譜凝膠。3.根據權利要求1的皮膚壞死毒素的純化方法，其包含以下步驟(1)、用pH為7-9，固定的比電導率範圍為3-20mS/cm或更低的緩衝液將凝膠作預處理，使藉助直接硫酸化反應而被硫酸化的色譜凝膠或與硫酸化分子共價結合的色譜凝膠達到平衡，(2)、使含皮膚壞死毒素的溶液與具有硫酸基作為配基的吸附凝膠，或藉助直接硫酸化作用而被硫酸化的吸附凝膠，在pH7-9，溫度0-30℃以及固定的比電導率範圍為3-20mS/cm或更低的條件下相接觸，(3)、在從凝膠洗脫皮膚壞死毒素前，先用pH為5-10，固定的比電導率範圍為3-20mS/cm或更低的緩衝液洗滌吸附凝膠，以及(4)、用pH為5-10，比電導率大於3-20mS/cm的固定範圍直至達130mS/cm的緩衝液從凝膠上洗脫皮膚壞死毒素。4.根據權利要求3的皮膚壞死毒素純化方法，包括下列步驟(1)、用pH為7-9，比電導率為20mS/cm或更低的緩衝液將凝膠作預處理，使纖維素硫酸酯凝膠達到平衡，(2)、在pH為7-9，溫度為0-30℃以及比電導率為20mS/cm或更低的條件下，使含皮膚壞死毒素的溶液與纖維素硫酸酯凝膠接觸，(3)、用pH為5-10以及比電導率為20mS/cm或更低的緩衝液在自凝膠洗脫皮膚壞死毒素前，先洗滌吸附凝膠，(4)、用pH為5-10以及比電導率範圍為22-130mS/cm的緩衝液將皮膚壞死毒素從凝膠上洗脫下來。5.根據權利要求3的皮膚壞死毒素純化方法，包括下列步驟(1)、用pH為7-9以及比電導率範圍為3-5mS/cm的緩衝液將凝膠預先處理，使結合肝素的色譜凝膠平衡，(2)、用pH為7-9，溫度為0-30℃以及比電導率範圍為3-5mS/cm的條件下，使含皮膚壞死毒素的溶液與結合肝素的色譜凝膠相接觸，(3)、在自凝膠洗脫皮膚壞死毒素前，先用pH為5-10以及比電導率範圍為3-5mS/cm或更低的緩衝液洗滌吸附凝膠，(4)、用pH為5-10以及比電導率範圍為3-130mS/cm的緩衝液將皮膚壞死毒素從凝膠上洗脫下來。6.根據權利要求1或3的皮膚壞死毒素純化方法，其中含皮膚壞死毒素的溶液是博代氏桿菌菌細胞提取物。7.根據權利要求1或3的皮膚壞死毒素的純化方法，其中含皮膚壞死毒素的溶液是採用基因工程技術使博代氏桿菌的皮膚壞死毒素在其內得到表達的微生物或細胞的培養物或提取物。8.一種皮膚壞死毒素類毒素，其製備方法包括用化學方法處理部分純化的皮膚壞死毒素或高度純化的皮膚壞死毒素，以使該皮膚壞死毒素類毒素失去皮膚壞死毒素的活性而保留其免疫原性；該部分純化的皮膚壞死毒素的製備方法是使含由博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素的溶液，與一種藉助直接硫酸化反應得以硫酸化的色譜凝膠，或一種與硫酸化分子共價結合的色譜凝膠相接觸，從而使皮膚壞死毒素被吸附到凝膠上，接著再從該凝膠上把皮膚壞死毒素洗脫下來；而該高度純化的皮膚壞死毒素是通過將該部分純化的皮膚壞死毒素作進一步純化而製備的。9.根據權利要求8的皮膚壞死毒素類毒素，其中所述部分純化的皮膚壞死毒素是由包含以下步驟的純化方法所製備(1)、用pH為7-9以及固定的比電導率範圍為3-20mS/cm或更低的緩衝液預先處理凝膠的方法，使靠直接硫酸化反應而得以硫酸化的色譜凝膠，或與硫酸化分子共價結合的色譜凝膠達到平衡，(2)、使含皮膚壞死毒素的溶液與靠直接硫酸化反應而得以硫酸化的色譜凝膠，或與硫酸化分子共價結合的色譜凝膠，在pH為7-9，溫度為0-30℃以及固定的比電導率範圍為3-20mS/cm或更低的條件下相接觸，(3)、在從凝膠上洗脫皮膚壞死毒素之前，先用pH為5-10以及固定的比電導率範圍為3-20mS/cm或更低的緩衝液洗滌吸附凝膠，以及(4)、用pH為5-10和比電導率大於3-20mS/cm的固定範圍直到130mS/cm的緩衝液把皮膚壞死毒素從凝膠上洗脫下來。10.根據權利要求要求8的皮膚壞死毒素類毒素，其比活性為3.75×105最小壞死劑量(下文中簡稱為MND)/mg蛋白或更高。11.一種聯合疫苗，含有由博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素的類毒素和由巴斯德氏菌所產皮膚壞死毒素的類毒素。12.根據權利要求11的聯合疫苗，含有權利要求8的由博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素的類毒素和由巴斯德氏菌所產皮膚壞死毒素的類毒素。13.根據權利要求11的聯合疫苗，含有權利要求9的由博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素的類毒素以及巴斯德氏菌所產皮膚壞死毒素的類毒素。14.根據權利要求11的聯合疫苗，其中所述由博代氏桿菌所產的皮膚壞死毒素的類毒素具有的比活性為37,000MND/mg蛋白或更高。全文摘要本發明目的在於提供一種製備皮膚壞死毒素的方法，由博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素的經過改良的類毒素以及含有該改良的由博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素的類毒素和由巴斯德氏菌所產皮膚壞死毒素的類毒素的類毒素混合製劑。本發明提供一種部分純化皮膚壞死毒素的方法，包括使含皮膚壞死毒素的溶液與一種藉助直接硫酸化反應而被硫酸化的色譜凝膠，或一種與硫酸化分子共價結合的色譜凝膠相接觸，從而使皮膚壞死毒素吸附到凝膠上，然後從凝膠上把吸附的皮膚壞死毒素洗脫下來。本發明還提供從博代氏桿菌所產皮膚壞死毒素獲得的類毒素，該皮膚壞死毒素用上述的部分純化皮膚壞死毒素的方法製備，還提供將該毒素與產毒性巴斯德氏菌所產生的皮膚壞死毒素的類毒素相混合而製得的類毒素混合製劑，該類毒素混合製劑用於預防豬的萎縮性鼻炎是安全、有效的。文檔編號A61K39/00GK1154655SQ95194457公開日1997年7月16日申請日期1995年6月7日優先權日1994年6月10日發明者河合透,牛島稔大,高瀨公三,藤川英雄申請人:財團法人化學及血清療法研究所