結腸癌病理演變前期microrna-29a水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的製作方法

2023-06-11 13:26:36 4

專利名稱：結腸癌病理演變前期microrna-29a水平原位雜交檢測試劑盒及檢測方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與結腸癌病理演變RNA表達改變 (病理演變過程)的相關檢測技術。
背景技術：
根據國內外權威機構提供的資料，我國每年癌症的新增人數260萬，死亡人數近 210萬，患者700多萬，全球每年新增癌症患者800萬，死亡人數接近800萬，患者約有8400 多萬人，到2020年以上人數將翻一番，這是一組可怕的數字。癌症診治成本越來越高，按癌症患者的年治療費用20萬(貧窮地區可能偏高，發達地區可能遠遠高出20萬)，700多萬患者，每年的花費是1. 4萬億人民幣，扣除成本35%約4千億，每年約有1萬億人民幣白白消耗了。而且，癌症患者大部分會在治療後不久死亡。因此，現有的臨床癌症診治模式一定要改變，本發明的創新點是提前做到預防性篩查，然後及時介入預防性調控和預防性治療，做到基因水平癌症的治未病。2005年美國衛生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家單位做了一個年度報告，對 1972年發起的抗癌大戰進行回顧，報告認為人類在抗癌大戰中是失敗，結論是癌症死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰失敗的幾個因素是1.腫瘤細胞異質性(多態性);2.腫瘤細胞耐藥性；3.抗癌藥物設計思路不完善(動物模型設計不科學)等。同時，該報告中亦提出應重新審視現有診治癌症的措施。本發明人在長期研究中發現，導致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期診斷。依照現有的臨床醫學影像(B超、CT、核磁共振成像等)及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖類激素、細胞膜因子、細胞核因子、細胞流式技術)指標來診斷癌症，都是腫瘤形成後診斷，前者要有組織學變化或已有佔位性病變，後者大部分是腫瘤形成後所分泌、釋放、或腫瘤的標記物。傳統臨床觀念認為佔位性癌塊在2公分下是屬於早期癌症的診斷，這一概念值得認真討論，2公分以下癌塊屬早期這一界定科學性是不夠嚴謹的，從細胞學角度來分析，1公分的腫塊約有一億個腫瘤細胞，2公分的腫塊其三維空間的細胞疊加數遠不止 2億個腫瘤細胞，從癌變前期到單克隆癌細胞產生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當長，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很難證實的是在這個病理演變過程中，腫塊是癌症唯一的發生地和單獨的病灶，可能癌細胞早已遷移到其它組織或器官生長。臨床研究早已證實，一旦形成腫塊的同時，其它癌細胞通過不同途徑遷移到其它部位克隆生長，一旦切除原發灶後，其它器官復發灶或多發癌塊灶先後形成。因此，在臨床上以 2公分以下的癌腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴謹(有些病例，在發現原發病灶時，同時發現轉移病灶，不在我們表述的內容中)，其實這時已經是晚期診斷和晚期治療，這是導致癌症死亡率不降的真正原因。隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，癌症基因組學等研究的深入展開，為了尋求更早期的診斷癌症、治療癌症、以及預防癌症，已取得長足進步。至今，我們已有可能在基因的一級轉錄功能產物(mRNA水平或microRNA)上做更精確的早期篩查和診斷，在癌變前期或癌細胞形成(單克隆)前，就可以做到早期預測和篩查。微小核糖核酸(microRNA/miRNA)是一段長度約為22核苷酸的寡核糖核酸分子， 它們可以藉由調控mRNA來抑制轉譯作用或是造成mRNA的解低基因的表現。近來有許多研究發現，miRNA與癌症具有高度的相關性。因此推論miRNA可能是癌化過程的一個導因。到目前為止，在人體上有超過700個miRNA被發現，而大約有100左右的miRNA被確認與人類癌症具有相關性，這其中包含有食道癌、乳癌、血癌、肺癌、腦癌、肝癌、直腸結腸癌、膠質細胞瘤、垂體瘤等多種腫瘤在食道癌細胞中，miR-17-92家族等microRNA在多種腫瘤中表達上調。miR-21在成膠質細胞瘤、乳腺癌、胰腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中上調表達。雖然腫瘤組織microRNA表達譜與腫瘤發病及預後相關，但是檢測技術複雜、創傷大，難以真正應用於臨床診斷。相比較而言，外周血血清較易獲得和檢測，臨床應用便捷，利於推廣。血清中是否存在血清microRNA的表達譜與對應腫瘤組織microRNA表達譜關聯？ 2008年至今已報導多項血清microRNA與腫瘤關係的研究工作，為血清microRNA作為分子標記應用於腫瘤的早期診斷和預後提供了工作基礎。microRNA在血清中可長期穩定存在，耐RNA酶降解，煮沸、反覆凍融、酸鹼環境、長期保存等各種處理方法均不會造成血清microRNA的損失。血清microRNA的來源尚無定論，現在普遍認為其來源於組織細胞的主動分泌過程。成熟的microRNA在細胞內被脂質或脂蛋白包被成外切酶體(Exosome)，分泌至胞外並進入血液；進入血液的外切酶體可經內吞作用進入受體細胞並去包被，釋放出microRNA發揮生物學功能。外切酶體介導的細胞間microRNA的交換，是細胞通訊的一種新的途徑，對維持內環境的穩態有重要作用。血清 microRNA作為腫瘤診斷和預後的標誌物，主要有以下優點檢測的損傷小、穩定性好、靈敏度高，可應用於早期腫瘤的檢測。但是，由於血清中microRNA的表達量較低，尋找一種靈敏度高、操作簡便且成本低廉的檢測方法是目前血清microRNA應用於腫瘤臨床檢測亟待解決的問題。microRNA是一類高度保守的非編碼小RNA，主要通過結合靶基因mRNA的5pUTR、 編碼區或3pUTR而在轉錄後水平上對基因的表達行負調控功能，microRNA參與基因表達調控的方式主要是抑制翻譯過程的進行，少數情況下也可引起mRNA降解，生物信息學分析表明，每個microRNA可能調節數百個靶基因，提示microRNA可能參與調節細胞生命活動中眾多的信號轉導途徑，在細胞增殖、分化、凋亡、免疫反應及血管生成等一系列過程中發揮作用。miRNA有望成為診斷結腸癌的新的生物標誌物.正常細胞和癌細胞都能釋放miRNA 到外周血。循環中的miRNA被高度穩定的複合體(最常見的是胞外體和微小囊泡)包裹， 以阻止miRNA被RNA酶降解。miR-17_3p和miR-9^i在結腸癌患者血漿中明顯升高，而在切除腫瘤組織後，這兩種miRNA都顯著下降，miR-9h還能與結腸癌和其他疾病，如胃癌和炎症性腸病進行鑑別，進一步分析表明，miR-92a能夠產生88. 5%的ROC面積，在相對RNU6B 核內小RNA表達的臨界值為240時，其敏感性和特異性分別為89%和70%. miR-92a的診斷價值進一步被確定，Huang等指出，miR-9^i和miR-29a能從正常人群中區分結腸癌和高危的腺瘤，從而證實miR-^a對早期診斷結腸癌有用。除了外周血，因為結腸細胞不斷脫落到腸腔中，大便中也有結腸癌特異性的miRNA，可作為另一有價值的診斷途徑。本發明選擇多組臨床標本(癌症病人、高危人群、正常對照)採用核酸原位雜交技術和免疫組化方法對micr0RNA-29a與結腸癌的早期預警進行檢測分析。本發明人在研究中發現micr0RNA-29a在結腸癌患者、癌症高危人群、正常對照人有明顯的表達量變化，將micr0RNA-29a作為早期篩查結腸癌變前期有非常重要的臨床診斷意義。MICR0RNA-29A在結腸癌變前期過程中高表達。他作於癌變前期篩查、及結腸癌治療後的復發、轉移預警也有非常重要的臨床意義。發明人在長期的研究中，得出了一種新理念，癌症和其它臨床的重大疾病的臨床診治模式一定要改變，不能只停留現在治已病(發病後診治)，要做到預防性診治，做到治已病，只有這樣才能降低重大疾病的發病率和死亡率，降低社會成本和醫療成本。因此，發明人在開發和生產重大疾病的RNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了創新。特別是篩選臨床標本(正常人群、癌症高危人群、腫瘤患者)，突破了正常組織與腫瘤組織比較的一貫性研發思路，來尋找和開發癌前變的RNA水平，與癌症早期基因病理生理學演變密切相關，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上腫瘤形成後診治模式變成腫瘤的預防性診治，爭取了腫瘤診治的時間和空間，達到預防癌症。目前，MICR0RNA-29A表達譜檢測方法用Northern雜交、表達晶片、實時螢光定量 PCR和Solexa測序等分析技術，而這些方法多用於科研方面，不適應臨床應用，而檢測RNA 比基因分析更科學(DNA分析大部分在易感性的表象上，RNA是功能性體現)，比蛋白分析更可靠(RNA與蛋白轉錄有時候不同步)。根據現有的文獻資料採用原位雜交技術和組化免疫方法檢測Micr0RNA-29a水平表達量的檢測技術及試劑盒未見報導。本發明人在針對創新性發明的要求，設計了(結腸癌患者、高危人群、正常對照)不同數據例組，用原位雜交技術進行檢測，結果表明以上結腸癌症病人MICR0RNA-29A高表達，高危人群有不同程度表達15-25%，正常對照都是低表達。表明MICR0RNA-29A結腸癌變前期篩查的重要標誌物。原位雜交技術(in situ hybridization)是將分子生物學與細胞化學技術結合起來，以標記的核酸分子為探針，在組織細胞原位檢測特異性核酸分子的技術。其原理是使含有特異序列、經過標記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細胞中的互補核酸單鏈即靶核酸發生雜交，再以放射自顯影或免疫細胞化學方法對標記探針進行探測，從而在細胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子(雖不明確該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便於示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利於以後的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。常用的同位素標記物有咕、353、1251和3牛。同位素標記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優點，但是由於放射性同位素對人和環境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素標記物中目前最常用的有生物素、地高辛和螢光素三種。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。根據所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、衝洗和顯示。本發明採用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針(RNA)和檢測的靶RNA是採用鹼基互補(雜交互補)的原理，同時經過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結果沒有影響。鑑於目前臨床上癌症的診斷(影像醫學和生化指標物都是腫瘤形成後的診斷)是晚期診斷，治療也是晚期治療，導致死亡率不降的醫治模式。本發明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從治已病變成預防性治未病，達到預防性診治，將目前影像醫學手段和眾多生化標記物無法檢測到癌前變RNA水平量化改變技術，做了創新性的技術突破，提供癌前變RNA水平篩查技術。使臨床上有了一項新的癌前變RNA水平真正早期篩查的技術，為臨床癌症的診治爭取時間和空間。

發明內容
本發明的目的首先是提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包含原位雜交檢測探針和標記物。其次，本發明還要提供上述試劑盒用於與結腸癌變前期篩查及治療後轉移早期預警相關的原位雜交檢測方法。為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下本發明首先提供一種原位雜交檢測試劑盒，其包括雜交探針和標記物，其中，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. 1所示序列的互補序列，序列號NR_(^9503. 1，核苷酸序列長度是64bp，位於染色體7q32. 3〃上。本發明試劑盒的一個優選方案是，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、螢光素、酶及納米材料。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括雜交液。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括增強劑。本發明試劑盒的一個優選方案是還包括顯色劑。本發明的癌變前期MICR0RNA-29A篩查試劑盒應用價值在於，對各種癌變前期篩查，及癌變後或治療後復發、轉移、擴散發生預警，進一步配合臨床治療。本發明還提供一種MICR0RNA-29A原位雜交的檢測方法，包括以下步驟
(1)在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交複合體的條件下，將底物中待測 RNA與雜交探針接觸，形成雜交複合體；和
(2)檢測所述雜交複合體。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的可形成穩定雜交複合體的條件為 核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16 - 24小時。本發明所述的檢測方法，其中優選地是，所述的底物選用人的血液白細胞標本或其它器官組織細胞標本。更優選地是，所述的血液標本或其它器官組織細胞標本來自結腸癌患者、結腸癌高危人群、健康正常人群。本發明的檢測試劑盒是採用核酸雜交技術和組化免疫方法相結合，以 MICR0RNA-29A為檢測對象，合成探針是MICR0RNA-29A序列的互補序列，檢測的底物是人體血液標本白細胞或組織細胞的RNA的表達量。原位雜交技術的顯示方法能提供 MICR0RNA-29A的半定量或定量表達程度判定。根據雜交後免疫組化顯色判定以上RNA的表達量，正常人MICR0RNA-29A低表達，即少量顯色，MICR0RNA-29A在結腸癌病人和正常對照有顯著差異，該基因的表達量比正常人表達量都高。本發明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試劑盒的核酸雜交原理是分子生物學業內人士均熟知，具體操作步驟是標本處理、預雜交、雜交、免疫組化染色、鏡下進行定量分析、結果報告，其中雜交的具體步驟包括
1).將待測標本放入反應槽中；
2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；
3).儀器自動棄去液體，自動後固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預雜交(42°C);
5).儀器自動棄去液體，自動清洗；
6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C);
7).儀器自動棄去液體，自動清洗；
8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(室溫)；
9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；
10).取出封片鏡檢。本發明的一個優選實施例的方案是以MICR0RNA-29A合成的核酸探針用地高辛標記(地高辛標記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標記優點，還克服了生物素標記的探針在原位雜交過程中受組織內源性生物素幹憂等缺點)，將該雜交探針與人體血液白細胞的待測RNA核酸進行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察RNA 的存在和定位，根據染色的細胞數，判斷目的RNA的表達量。本發明方法是目前常用的核酸原位雜交技術，該方法通過檢測底物細胞中的 MICR0RNA-29A表達量，用來確定結腸癌病理演變前期的RNA變化量，預警各種癌變是否發生及結腸癌患者治療後是否復發、轉移的預測。因為MICR0RNA-29A在正常人中低表達，如果MICR0RNA-29A表達量增高，說明有患癌的風險，說明癌變已發生，或癌症病人術後已經復發、轉移，從而獲得癌症的診斷信息。一個試劑盒可以多人份使用或一人份使用。本發明具有如下有益效果
本發明的臨床意義是更早期跟蹤檢測各種癌變發生和病理演變過程中MICR0RNA-29A 表達量的變化，預警結腸癌發生、發展趨勢。 本發明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測與癌症標誌物，以及影像醫學檢查有顯著不同。本發明可以在RNA水平檢測MICR0RNA-29A異常表達，在影像醫學檢查未發現佔位性癌病灶復發之前，癌症生化指標未產生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上基因表達異常的信息採集，給臨床癌病患者一個真正的早期預警以及治療後轉移復發及早預測。這樣才有可能實施癌症的早期篩查、早期預防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治結腸癌惡疾。此外，本發明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強的特點，同時，本發明的檢測方法操作方便、簡單，能在區級以上醫院普遍使用和推廣。


圖1是本發明MICR0RNA-29A原位雜交技術流程圖。圖2是本發明實施例中結腸癌病人MICR0RNA-29A表達圖片。圖3是高危人群圖片。圖4是本發明實施例中正常人MICR0RNA-29A表達圖片。
具體實施方式
下面結合實施例，更具體地說明本發明的內容。應該理解，下面的實施例用於說明而非限定本發明內容，任何形式上的改變或變通將落入本發明的保護範圍。實施例1
按照常規方法製備本實施例的原位雜交試劑盒，該試劑盒包括以MICR0RNA-29A設計的雜交探針、標記物、說明書，其中本實施例的探針標記物選用地高辛。試劑盒雜交液組成
權利要求
1.一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物，其特徵在於，所述的雜交探針為序列表SEQ ID NO. 1所示序列的互補序列。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述的標記物選自放射性物質、化學發光或顯色物質、生物素、金屬鱟、螢光素、酶及納米材料。
3.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒還包括雜交液。
4.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒還包括增效劑。
5.如權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，該試劑盒還包括顯色劑。
6.一種micr0RNA-29A基因原位雜交檢測方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟(1)在權利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩定雜交複合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交複合體；和(2)檢測所述雜交複合體。
7.如權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於，所述的可形成穩定雜交複合體的條件為核酸雜交的溫度為42°C ；核酸雜交的時間為16 - 24小時。
8.如權利要求6所述的檢測方法，其特徵在於，所述的底物選用人的血液白細胞標本。
9.如權利要求8所述的檢測方法，其特徵在於，所述的血液白細胞標本選自癌症、高危人群、正常人標本。
10.micr0RNA-29A基因在製備檢測結腸癌病變原位雜交試劑盒中的應用，其特徵在於， 所述試劑盒含有權利要求1所述的雜交探針。
全文摘要
本發明公開一種原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針和標記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測與結腸癌早期病理演變有密切相關microRNA-29a的方法，包括以下步驟(1)在雜交探針與靶序列可形成穩定雜交複合體的條件下，將底物中待測RNA與雜交探針接觸，形成雜交複合體；和(2)檢測所述雜交複合體。本發明的試劑盒和檢測方法可在RNA水平上檢測microRNA-29a表達量，比影像醫學和現有的臨床生化檢測指標更早期，能實現真正的癌變前期RNA水平篩查，同時，本發明的檢測方法簡單方便，成本低,便於縣區級醫院推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK102443644SQ201110429079
公開日2012年5月9日 申請日期2011年12月20日 優先權日2011年12月20日
發明者張雲福, 張玉麗, 裘建英, 裘霖 申請人:蘇州福英基因科技有限公司