治療認知功能障礙的靶位的製作方法
2023-06-03 19:30:51
專利名稱：治療認知功能障礙的靶位的製作方法
本申請是以下申請的分案申請申請日2003年11月24日；申請號200380109146.X(PCT/US2003/038191)；發明名稱同上。
1.對相關申請的交叉引用
本申請要求享有於2002年11月22日提交的美國申請序列號60/413,152的權益，其全文併入作為參考。
2.政府支持
本發明在政府支持下完成，獲得國家衰老研究所的基金第PO1AG09973號。政府擁有本發明的某些權利。
3.
背景技術：
由於對認知功能障礙的認識日漸增加，開發出靈敏的方法以檢測功能障礙並治療功能障礙的需求也日漸增加。存在許多病情，如痴呆(如，雷維小體痴呆、血管痴呆、阿耳茨海默氏症以及與HIV相關的痴呆)、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏症、精神分裂症、抑鬱症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、輕度認知功能障礙(MCI)以及與年齡有關的認知衰退(ARCD)，靈敏地檢測出認知功能障礙能使有這些病情的患者受益。
認知功能障礙(如，雷維小體痴呆、血管痴呆、阿耳茨海默氏症與HIV相關的痴呆、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、MCI和ARCD)涉及的大量病況的主要危險因素是衰老。患有這些病況的個體具有在整個病程中嚴重程度增加的認知症狀。在未患有這些病症的情況下，衰老本身對於認知的影響對於定義疾病和正常衰老的界線是至關重要的。同時，衰老對於認知的影響可以與神經退行性疾病、確定性易獲病性的病程、疾病的進展速率或其他特性相互影響。
開發認知功能障礙的檢測方法和療法的重要手段包括使用實驗室動物。以動物模型描述的認知功能障礙可能擴展到人的認知功能障礙上。在與年齡相關的認知功能障礙的上下文範圍中，以遠系繁殖的年老的Long-Evans鼠(Charles River Laboratories；Gallagher M，等，Behav.Neurosci.107618-626；1993)的廣泛行為特徵可鑑定自然發生的認知功能障礙的形式。該認知老化模型使用了在其一生中保持無病原狀態的動物。在所有衰老的鼠上進行的生理機能和屍體解剖的測試被用於排除患有會干擾衰老疾病或病症研究的病況的動物。該模型的重要特點是其反映出了老年人認知衰退的變化現象。另外，該模型中的老年鼠的認知衰退的個體差異可用行為評估的方式來觀察，該評估對中顳葉中相聯結構的功能靈敏，該系統對人的表述性記憶至關重要。
該模型的另一個重要特點是其指導理解了造成與年齡相關的認知功能障礙的基因多樣性。該對與年齡相關的認知功能障礙的遺傳影響不可能是單基因的，即由單個基因中的缺失或突變造成的。單基因病很少見而且一般影響年輕人。因為它們的嚴重性，單基因病經常造成不能達到平均期望壽命。在人中，大量常見且嚴重的病情影響成年人群，隨著實足年齡的增加而增加了頻率和嚴重程度，而且這不能夠歸因於單個基因(比如可參見，Hegele RA.Trends Endocrinol Metab.2003 8371-377；Shih DQ，等Curr Diab Rep.2002 2125-134；Barlassina C，等J Am Soc Nephrol.2002 Suppl 3S155-S164)。不斷增加的證據表明成熟期發病或與衰老相關的病情的遺傳組成反應出了比由單基因病造成的絕對缺陷或極大功能增進更微妙的多基因表達的改變。確定這些與年齡相關的病情的分子基礎的挑戰就是要鑑定基因的多樣性並確認特定基因組中表達的相對小的改變是否真與遠系繁殖的諸如人群的群體中的病情相關或導致這些病情。所以，利用哺乳動物遠系繁殖老化模型可幫助分析海馬中的多基因表達水平間的關係和在遠系繁殖的年輕或老年個體中的學習能力。
用Morris水迷宮(MWM)進行的行為評估中，在迷宮周圍的空間提示結構的指導下，鼠學習並記下了逃跑平臺的位置。在探測試驗中，利用測定動物搜索逃跑平臺位置的空間偏好來測試進行認知的基礎。在研究群體中的老年鼠能毫無困難地遊到可見的平臺上，但當隱藏平臺時需要利用空間信息了，就可檢測年齡決定的功能障礙了。正如許多公開報導的那樣，遠系繁殖的Long-Evans品種中的老年鼠的個體表現變化極大，那些鼠中的一部分表現得和年輕成體一樣，但大約40-50％的落後於年輕個體表現的範圍(Gallagher等Behav.Neurosci.107618-626，1993)。年老鼠中的這種可變性反映出可靠的個體差異。所以，在年老群體中，一些動物認知功能有障礙了並被稱為年老功能障礙的(AI)。其他動物認知功能沒有障礙，或年老功能無障礙的(AU)。
最初表徵的幾周後利用MWM在新空間環境中進行的再次評估中，AI動物一如既往的有障礙，而AU動物能再次熟練表現(Colombo等Proc.Natl.Acad.Sci.9414195-14199，1997)。在對AI和AU鼠認知能力的MWM評估中的差異甚至在間隔3個月以上時仍是可靠的(Gallagher和Burwell，Neurobiol.Aging 10691-708，1989)。另外，MWM中的AI和AU特徵能區分在其他行為任務中同樣年齡個體的表現，所述行為任務需要同樣的認知功能，如Barnes圓形迷宮(Gallagher和Burwell Neurobiol.Aging 10691-708，1989)和放射狀臂形迷宮(RAM)。這種齧齒動物年老群體中自然產生的功能障礙顯示認知老化是不可避免的或嚴格與實足年齡相聯繫，而且重要的是，它提供了機會用以比較造成衰退或持久記憶的大腦變化的軌跡。利用該模型的其他背景研究顯示認知功能障礙的發生並不依賴於包括神經元缺失或相關迴路的廣泛退化的神經退行(Rapp和Gallagher Proc.Natl.Acad.Sci.939926-9930，1996)。所以，該模型可能是比要測定神經元缺失影響的準備工作更靈敏的認知老化測試方法。
除了可靠性之外，該模型所用的認知評估已經證明能對相關大腦系統的老化影響靈敏。在AU和AI鼠的神經迴路中顯示有顯著的生物學差異產生了，該迴路對MWM中評估的認知功能至關重要。例如，相對於AU並年輕的鼠，AI鼠中的海馬神經元對某些化學遞質具有減弱的應答，如乙醯膽鹼和穀氨酸(Nicolle等J.Neurosci.199604-9610，1999)。在穀氨酸受體亞型的解剖分布研究中，利用該模型可揭示出減少了紅藻氨酸鹽(kainate)結合在海馬的CA3區域，該區域僅限於年老無障礙的鼠中並與年輕和年老障礙的鼠有區別(Nicolle等Neuroscience 74741-756，1996)。存在有越來越多對認知功能障礙生物和遺傳基礎理解的需求。
4.發明簡述 在一個方面，本發明描述了一種鑑別與諸如哺乳動物的個體所預期行為相關的基因的方法，其包括提供一個具有預期行為的測試個體的群體，提供一個缺少預期行為的對照個體的群體，各自分離並合併來自測試和對照群體的神經組織如海馬的表達的RNA，在每個對照和測試RNA合併庫中測定大量基因的表達水平並從大量基因中選出一個基因，所述基因的表達水平在哺乳動物的測試群體和對照群體間有差異。選擇的基因是與預期行為相關的候選基因。可通過任何合適的方式來檢測大量基因的表達水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋白質水平，包括Western印跡、蛋白質槽印跡或蛋白質陣列。大量基因可包括涉及穀氨酸轉運的基因，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，不同於穀氨酸轉運蛋白EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的基因或涉及神經元間突觸間隙和/或突觸外空間中穀氨酸分解代謝的基因，如天冬氨酸氨基轉移酶。優選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達水平。可選地，選出的基因顯示出減少的表達水平。
在另一方面，本發明描述了一種鑑別與個體預期認知功能相關的基因的方法，其包括提供一個具有預期認知功能的哺乳動物測試群體，提供一個缺少預期認知功能的哺乳動物對照群體，各自分離並合併來自測試和對照群體的神經組織如海馬的表達的RNA，在每個對照和測試RNA合併庫中測定大量基因的表達水平並從大量基因中選出一個基因，所述基因的表達水平在哺乳動物的測試群體和對照群體間有差異。選擇的基因是與預期認知功能相關的候選基因。可通過任何合適的方式來檢測大量基因的表達水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋白質水平，包括Western印跡、蛋白質槽印跡或蛋白質陣列。大量基因可包括涉及穀氨酸轉運的基因，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，不同於穀氨酸轉運蛋白EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的基因或涉及神經元間突觸間隙和/或突觸外空間中穀氨酸分解代謝的基因，如天冬氨酸氨基轉移酶。優選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達水平。可選地，選出的基因顯示出減少的表達水平。
本發明的另一個方面涉及一種篩選用於促進認知功能的化合物的方法，其包括向諸如哺乳動物的個體給藥測試化合物，在給藥所述測試化合物後測定所述個體的諸如海馬的神經組織中的基因的表達水平，將所述基因的所述表達水平與個體神經組織參考表達水平進行比較，其中該個體沒有給藥所述測試化合物，並測定所述基因的表達水平是否與相應參考表達水平有差異，其中所述差異顯示測試化合物為促進認知功能的候選治療劑。測試化合物可以是小分子，如但不限於式I，II或III所示的那些分子。其他方法可以包括將所述基因的表達水平與個體神經組織參考表達水平進行比較，其中向該個體給藥了頭孢曲松。可通過任何合適的方式來檢測基因的表達水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋白質水平，包括Western印跡、蛋白質槽印跡或蛋白質陣列。基因可以是涉及穀氨酸轉運的，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，或可以是涉及神經元間突觸間隙和/或突觸外空間中穀氨酸分解代謝的，如天冬氨酸氨基轉移酶。優選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達水平。可選地，選出的基因顯示出減少的表達水平。
本發明的另一個方面涉及一種篩選用於促進認知功能的化合物的方法，其包括向諸如哺乳動物的個體給藥測試化合物，在給藥所述測試化合物後測定所述個體的諸如海馬的神經組織中的穀氨酸轉運蛋白基因的表達水平，將所述基因的所述表達水平與個體神經組織參考表達水平進行比較，其中該個體沒有給藥所述測試化合物，並測定所述基因的表達水平是否與相應參考表達水平有差異，其中所述差異顯示測試化合物為促進認知功能的候選治療劑。測試化合物可以是小分子，如但不限於式I，II或III所示的那些分子。可通過任何合適的方式來檢測基因的表達水平，如微陣列分析、原位雜交組化、定量PCR、SAGE分析、Northern印跡分析或點印跡分析，或通過合適的方法來測量蛋白質水平，包括Western印跡、蛋白質槽印跡或蛋白質陣列。優選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達水平。可選地，選出的基因顯示出減少的表達水平。
一種篩選用於促進諸如哺乳動物的個體的認知功能的化合物的方法，包括如下步驟將測試化合物與表達圖4所列基因的細胞接觸，如，穀氨酸轉運蛋白基因EAAT1、2、3、4或5，天冬氨酸氨基轉移酶或垂體腺苷酸環化酶活化因子多肽(PACAP)，並測定所述基因的表達水平是否由於所述細胞接觸所述測試化合物而改變，如果存在所述改變則顯示所述化合物有能力促進諸如哺乳動物的個體所需的認知功能。化合物可以是小分子，如式I，II或III所示的那些分子。細胞可以來源於神經組織，如培養的神經元、培養的神經膠質或初級神經元培養基；或可以是永生化的細胞、神經元細胞系、神經膠質細胞系或星形細胞細胞系。優選地，從大量基因中選出的基因顯示出增加的表達水平。可選地，選出的基因顯示出減少的表達水平。
本發明上述每一個方面中所用的測試化合物可以是小分子，如任何第三代頭孢菌素(頭孢磺吡苄、頭孢氨噻、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、拉氧頭孢和頭孢他啶)、丙戊酸或MS-153。另外，測試化合物可以活化基因表達，包括選自EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的穀氨酸轉運蛋白，或天冬氨酸氨基轉移酶基因。可選地，測試化合物可以是基因表達的抑制劑。
在另一方面，本發明描述了一種文庫，其包括大量編碼基因的cDNA序列，所述基因由於在哺乳動物中保持認知功能而在哺乳動物神經組織中差異表達。優選地，文庫包括編碼基因的cDNA序列，所述基因由於用頭孢曲松、丙戊酸或MS-153對哺乳動物處理而在神經組織中差異表達。文庫可以包括源於穀氨酸轉運蛋白基因的cDNA序列，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5，或源於天冬氨酸氨基轉移酶的序列。文庫包含的cDNA至少有20％、50％或80％的序列源於穀氨酸轉運蛋白基因。
本發明的另一方面是一種包括微陣列晶片，其包括其上各個編址位置上附有cDNA序列的固相支持物，cDNA序列與上述cDNA文庫的成分相對應，如那些在神經組織中由於個體認知功能的保持或由於用頭孢曲松或丙戊酸處理個體而造成差異表達的cDNA序列。微陣列晶片的成分包括選自EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5的穀氨酸轉運蛋白或天冬氨酸氨基轉移酶序列。
本發明也描述了一種藥物組合物，包括有效治療量的刺激化合物，所述化合物刺激圖4所列基因的神經組織中的表達，所述基因是例如穀氨酸轉運蛋白基因EAAT1、2、3、4或5、天冬氨酸氨基轉移酶或垂體腺苷酸環化酶活化因子多肽(PACAP)。藥物組合物還可以包含小分子。
在另一個方面，本發明描述了一種藥物組合物，包括有效治療量的式I、II或III化合物。可選的，藥物組合物可包含除了頭孢曲松或丙戊酸的有效治療量的化合物，其由通過將化合物給藥給諸如哺乳動物的個體或細胞來篩選用於促進認知功能的化合物的方法來鑑定，並在暴露或不暴露於化合物的條件下，測定在那些個體或細胞間的差異化的基因表達。這些化合物是促進認知功能的候選化合物。
本發明的另一方面描述了一種在諸如人的哺乳動物中保持認知功能或在諸如人的哺乳動物中治療認知功能障礙的方法，該方法通過刺激涉及在神經組織中穀氨酸運輸或穀氨酸分解代謝的神經組織的基因表達來進行。另外，在諸如人的哺乳動物中保持認知功能需要包括給藥一種藥物組合物，其能刺激圖4所列基因的神經組織表達，所述基因是例如穀氨酸轉運蛋白基因EAAT1、2、3、4或5，天冬氨酸氨基轉移酶或垂體腺苷酸環化酶活化因子多肽(PACAP)。
本發明也描述了一種在諸如人的哺乳動物中保持認知功能的方法，需要包括給藥一種藥物組合物，其為下式任意一種小分子I、II或III。對於在諸如人的哺乳動物中保持認知功能的方法，需要包括給藥式I的化合物，則哺乳動物不出現作為抗生素治療適應症的傳染病的症狀。
本發明也描述了在諸如人的哺乳動物中促進認知功能，需要包括向所述哺乳動物給藥一定量的藥物組合物，其刺激圖4所列基因的神經組織的表達從而足以促進以下認知功能空間記憶的獲得，長期空間記憶或空間記憶恢復。本發明也描述了在年老的諸如人的哺乳動物中保持認知功能或治療認知功能障礙，並治療諸如人的哺乳動物中的有障礙的認知功能，該方法需要通過向哺乳動物給藥有效治療量的頭孢曲松或其類似物或衍生物，丙戊酸或其類似物或衍生物或MS-153或其類似物或衍生物來進行。在哺乳動物表現出有障礙的認知功能的情況下，有障礙的認知功能可以與以下病情相關輕度認知功能障礙、與年齡相關的認知衰退、記憶力衰退、衰老或痴呆。另外，在哺乳動物表現出有障礙的認知功能的情況下，有障礙的認知功能可能與阿耳茨海默症有關。
基於以下詳細說明和權利要求書，本發明的其他特點和優點將是顯而易見的。
5.簡要
圖1是描述了在MWM評估中年輕和年老的大鼠的行為特徵的圖。
圖2是描述了10隻年老的大鼠在初始MWM表徵與它們在RAM中的記憶力表現之間的可靠性的圖。
圖3是概述了哺乳動物穀氨酸轉運蛋白及其人類同源體在各種腦組織中發現的不同細胞類型中的分布的圖表。
圖4是概述了在年輕(Y)、年老有障礙的(AI)和年老無障礙(AU)的動物中利用微陣列反映出的EAAT2/GLT1、EAAT1/GLAST和EAAT3/EEAC1 mRNA的表達情況的圖表。
圖5是概述了在年輕(Y)、年老有障礙的(AI)和年老無障礙(AU)的動物中利用原位組化反映出的EAAT2/GLT1、EAAT1/GLAST和EAAT3/EEAC1 mRNA的豐度的圖表。
圖6是描述了在用頭孢曲松治療(每天注射200mg/kg im，持續一周)的AI大鼠中減少的記憶錯誤的圖表。
6.發明詳細說明 為了方便起見，在說明書、實施例和所附的權利要求書中所使用的某些術語集中在此。除非另有定義，此處所用的技術和科學術語具有如同本發明所屬領域普通技術人員所通常理解的相同意義。
6.1定義 此處所用的冠詞「一」和「這」指一個或多於一個(即，至少一個)的冠詞的語法用語。例如，一要素指一個要素或多於一個的要素。
此處所用的″年老″指哺乳動物處在或接近其平均生命跨度的終點。例如，年老大鼠約為24-30個月大的年齡。年老的人為70歲或以上。
術語″脂肪族″為公認的表述，其指直鏈、支鏈、環狀烷烴、烯烴或炔烴。在一些具體實施方式
中，本發明的脂肪族基團為直鏈或支鏈並具有1至約20個碳原子。
術語″烷基″為公認的表述，其包括飽和的脂肪族基團，包括直鏈烷基基團，支鏈的烷基基團、環烷基(脂環族)基團、烷基取代的環烷基基團和環烷基取代的烷基基團。在一些具體實施方式
中，直鏈或支鏈烷基在其主鏈中具有約30個或更少的碳原子(如，C1-C30直鏈、C3-C30支鏈)，並可選地，約20個或更少。同樣，環烷基在其環狀結構中具有約3至10個碳原子，並可選地在環狀結構中有約5、6或7個碳。術語″烷基″也被定義可包括滷代的烷基。
術語″胺″和″氨基″為公認的表述，其指未取代和取代的胺，如以下通式所代表的部分
其中R50、R51和R52各自獨立地代表氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R61或R50和R51和N原子結合在一起形成在環結構中具有4至8個原子的雜環；R61代表芳基、環烷基、環鏈烯基、雜環或多環；而且m等於零或為1-8整數。在一些具體實施方式
中，R50或R51中僅有一個是羰基，如，R50、R5和氮一起並不形成亞胺。在其它具體實施方式
中，R50和R51(並任選R52)各自獨立地代表氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R61。所以，術語″烷基胺″包括胺基，如上所定義，其上附有取代的或未取代的烷基，即R50和R51中至少一個是烷基。
術語″醯氨基″為公認的表述，其指如以下通式所代表的部分
其中R50如上定義，而且R54代表氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R61，其中m和R61如上定義。
術語″氨基甲醯基″為公認的表示作氨基-取代的羰基，其包括如以下通式所代表的部分
其中R50和R51如上定義。本發明中某些氨基的具體實施方式
包括可能不穩定的亞胺。
術語″烷硫基″指烷基基團，如上定義，其具有附於其上的硫基。在一些具體實施方式
中，″烷硫基″部分代表-S-烷基、-S-鏈烯基、-S-炔基和-S-(CH2)m-R61中的一個，其中m和R61如上定義。有代表性的烷硫基基團包括甲硫基、乙基基等等。
術語″芳烷基″為公認的表述，其指用芳基基團(如，芳香族或芳香雜環基團)取代的烷基。
術語″鏈烯基″和″炔基″為公認的表述，其指不飽和的脂肪族基團，在長度以及可能的取代方面與如上所述的烷基類似，但各自至少包含一個雙鍵或三鍵。
除非碳的數目另外指出，″低級烷基″指烷基，如上定義，只具有1至10個碳，可選地在其主鏈結構中有1至約6個碳原子。同樣，″低級鏈烯基″和″低級炔基″具有相似的鏈長。
術語″烷氧基的″或″烷氧基″為公認的表述，其指烷基，如上定義，其上附有氧基。有代表性的烷氧基基團包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等等。″醚″為兩個碳氫化合物通過氧共價連結形成的。因此，使烷基成為醚的烷基取代基是或類似於烷氧基，如可以用-O-烷基、-O-鏈烯基、-O-炔基、-O-(CH2)m-R61中之一來表示，其中m和R61如上所述。
此處所用的″類似物″指功能上與另一個化學物質相似的化合物，但其並不共有完全一樣的化學結構。例如。頭孢曲松類似物與頭孢曲松足夠相似，儘管與頭孢曲松的結構有微小差異，但其能在治療應用中替代頭孢曲松。
此處所用的術語″陣列″和″矩陣″指在設備上可編址的位置或「地址」的排列。位置可以排列成兩維陣列、三維陣列，或其他矩陣形式。位置的數量能從幾個直至至少數十萬。最重要的是，每個位置代表完全獨立的反應位點。「核酸陣列」指包含核酸探針的陣列，如寡核苷酸或基因的較大部分。在陣列上的核酸可以是單鏈的1。探針為寡核苷酸的陣列被稱為″寡核苷酸陣列″或″寡核苷酸晶片」。″微陣列″，在此也被稱為「生物晶片」、「生物學晶片」或「基因陣列」，是一種具有密度至少約100/cm2離散區域的陣列，密度優選地至少約1000/cm2。微陣列中的區域具有典型的尺寸，如直徑範圍在約10-250μm之間，並在陣列中與其他區域以約相同距離分隔。
此處所用的″天冬氨酸氨基轉移酶″指催化草醯乙酸和穀氨酸轉變成天冬氨酸和2-酮戊二酸的酶(E.C.2.6.1.1)，以及編碼具有天冬氨酸氨基轉移酶活性的胺基酸的核酸和同源物(如可參見，GenBank登錄號BC000498或XM_062678)。天冬氨酸氨基轉移酶涉及突觸間隙和突觸外空間中的穀氨酸催化。前述的同源物相信存在於其他哺乳動物中，包括靈長類、犬科、貓科和齧齒動物。
此處所用的″β-抑制蛋白2″指細胞內支架/適應連接蛋白質，其幫助從活化的G蛋白質-偶聯受體處轉送額外的信號。另外，這些蛋白質涉及穿膜受體內吞的內吞作用中。β-抑制蛋白2也指編碼抑制蛋白蛋白質的核酸。前述的同源物相信存在於其他哺乳動物中，包括靈長類、犬科、貓科和齧齒動物。
術語″碳環″為公認的表述，其指芳香族或非芳香族的環，其中環上的每個原子都是碳。
術語″羰基″為公認的表述，其包括如以下通式所代表的那些部分
其中X50為鍵或代表氧或硫，而R55和R56代表氫、烷基、鏈烯基、-(CH2)m-R61或藥學上可接受的鹽，R56代表氫、烷基、鏈烯基或-(CH2)m-R61，其中m和R61如上定義。當X50為氧而R55或R5不為氫，則該分子式代表「酯」。當X50為氧而R5如上定義，則該部 1CDNA陣列可以是雙鏈的。分在此被稱為羧基，並且尤其當R55為氫時，則該分子式代表″羧酸″。當X50為氧而R56為氫，則該分子式代表″甲酸″。一般而言，當以上分子式的氧原子替換為硫，則該分子式代表″硫代羰基″基團。當X50為硫而R55或R56不為氫，則該分子式代表″硫代酯″。當X50為硫而R55為氫，則該分子式代表″硫代羧酸″。當X50為硫而R56為氫，則該分子式代表″硫代甲酸″。在另一方面，當X50為鍵而R55不為氫，則以上分子式代表″酮″基。當X50為鍵而R55為氫，則以上分子式代表″醛″基。
術語″手性″為公認的表述，其指具有鏡像體不能重疊的性質的分子，而術語″非手性″指鏡像體能重疊的分子。″原手性分子″指在特定過程中有轉化成手性分子潛力的分子。
術語″順式″為公認的表述，其指在一個雙鍵邊上的2個原子或基團的排列方式，使得這些原子或基團原子或基團處在雙鍵的同一側。順式構型通常標示為(Z)構型。
此處所用的″認知功能″指較高層次的智力、大腦過程，其涉及學習和記憶，包括但不僅限於，注意力、掌握、短期記憶、長期記憶和記憶恢復、以及表達對周遭和自身的興趣。在動物模型系統中，可用現有大量方式測定認知功能，包括利用以下設施Morris水迷宮、Barnes圓形迷宮、升高的輻射臂狀迷宮、T形迷宮或任何其他個體要運用空間信息的迷宮。現有已知的其他測試可用於評估認知功能，如恐懼狀態、積極躲避、明亮的開放區域、黑暗活躍度計量、升高的正型迷宮、雙室探險測試或強迫遊泳測試。人類中，可以不受限制的測量認知功能。測量通過阿耳茨海默症評估級別-認知亞級別(ADAS-cog)；臨床全球印象的變化級別(CIBIC-正級別)；阿耳茨海默症協作研究運動的每日生活級別(ADCS-ADL)；迷你精神狀態檢測(MMSE)；神經精神病學目錄(NPI)；臨床痴呆等級級別(CDR)；劍橋神經心理自動測試組(CANTAB)或Sandoz臨床評估-老年病(SCAG)來進行。另外，可以利用成像技術來測量認知功能，如正電子發射斷層撮影法(PET)、功能性磁共振成像(fMRI)、單光子發射計算斷層撮影法(SPECT)或任何其他可測定大腦功能的成像技術。
″促進″認知功能指影響有障礙的認知功能從而使之更類似於與年齡相符的正常、無障礙個體的功能，其包括影響認知功能已減少的狀態，如，相對於正常個體減少約10％、30％、50％、75％、90％或95％。可將認知功能促進到任何可檢測的程度，但優選足以促進到使有障礙的個體能進行每日正常生活行為。
″保持″認知功能指影響正常或有障礙的認知功能從而使之不衰退或不降至個體首次表現或診斷觀察值以下。
″有障礙的認知功能″指與年齡相符的正常個體所觀察到狀況相比，不如其強健的認知功能，其包括認知功能已減少的狀態，如，相對於年齡相符的正常個體測量到的認知功能，減少約10％、30％、50％、75％、90％或95％。有障礙的認知功能可能與許多疾病或病症相關，包括痴呆(如，雷維小體痴呆、血管痴呆、阿耳茨海默氏症以及與HIV相關的痴呆)、亨廷頓氏舞蹈病、帕金森氏症、精神分裂症、肌萎縮性脊髓側索硬化症、輕度認知功能障礙(MCI)以及與年齡有關的認知衰退(ARCD)。可選地，有障礙的認知功能可以在個體中顯現，但不作為可診斷的疾病或病症出現。例如，有障礙的認知功能可以由個體中的細微代謝、毒性、神經毒、因治療而引起的、熱量或化學變化而造成的。這些細微改變包括但不僅限於，局部缺血、供氧不足、腦血管意外、外傷、外科手術、壓力、質量效應、出血、輻射、血管痙攣、神經變性疾病或病症。
此處所用的″對照群體″指缺少與認知功能相關的預期行為的哺乳動物，其通常包括不年輕的哺乳動物。
術語″共價鍵″為公認的表述，其指在2個原子間的鍵，其中電子靜電吸附於這2個原子的核上，而且在核間增加的電子密度的淨效應等於核間排斥力。當鍵與金屬離子連在一起時，術語共價鍵包括等同的鍵。
術語″組合文庫″或″文庫″為公認的表述，其指大量被術語稱為「成分」的化合物，在文庫中它們從一種或多種起始原料通過運用相同或不同的反應物或反應條件合成或製備而來的。有大量其他術語(以及其他技術)與組合文庫相關。術語″鑑定標籤″為公認的表述，其指記錄一系列用於合成化學文庫的反應步驟的手段。術語″固定″為公認的表述，並且當用於種類物時，其指一種狀態及種類物的行為，其中種類物附著於有吸附力的表面上，該吸附力大於所用環境對表面所用的吸附力。術語″固相支持物″為公認的表述，其指不能溶解的基質材料，並可以(任選)具有堅硬的或半堅硬的表面。術語″接頭″為公認的表述，其指連接支持物的分子的分子或基團，包括固相支持物或聚合支持物，以及組合文庫的成分。術語″聚合支持物″為公認的表述，其指可溶或不溶的聚合物，其中化學部分可通過反應與聚合支持物的功能性基團共價鍵合。術語″聚合支持物的功能性基團″為公認的表述，其指聚合支持物的化學部分，聚合支持物能與化學部分反應形成聚合物支持的氨基酯。
此處所用的″衍生物″指化合物如，頭孢菌素或丙戊酸的化學修飾。化合物的化學修飾可包括諸如，以烷基、醯基或氨基替代氫。也可能是其他許多修飾。化合物的衍生物保持原化合物至少一個功能性質。
此處所用的″預期行為″指如正常、無障礙個體中所觀察到的認知功能的行為表現。例如，動物中的預期行為反映了動物的認知功能，可用以下設施測量，如Morris水迷宮、Barnes圓形迷宮、升高的輻射臂狀迷宮、T形迷宮；或通過許多測試之任一，如恐懼狀態、積極躲避、明亮的開放區域、黑暗活躍度計量、升高的正型迷宮、雙室探險測試或強迫遊泳測試。在人類中，預期行為反映了個體的認知功能，可用個體進行每日正常生活行為的能力來測量或可以實施大量認知功能測試來測量，包括但不僅限於，ADAS-cog、CIBIC-正級數、ADCS-ADL、MMSE、NPI、CDR、CANTAB或SCAG。
術語″雜原子″為公認的表述，其指除了碳或氫之外的元素的原子。示例的雜原子包括硼、氮、氧、磷、硫和硒。
術語″芳基″為公認的表述，其指5-、6-和7-元單環芳香族基團，其可以包括零至4個雜原子，例如，苯、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、噠嗪和嘧啶等等。那些在環結構中具有雜原子的芳基基團也可被稱為″雜芳基」。芳環可以用如上所述的那些取代基在一個或多個環上的位置上進行取代，例如，滷素、疊氮化物、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環烷基、羥基、烷氧基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、氨基甲醯基、磷酸酯、亞磷酸酯、羰基、羧基、甲矽烷基、醚、烷硫基、磺醯基、磺醯氨基、酮、醛、酯、雜環基、芳香族或雜芳化合物的部分、-CF3、-CN等等。術語″芳基″也包括具有2個或多個環的多核環系統，其中鄰接的環共同擁有2個或多個碳原子(環為「稠環」)，其中至少有一個環是芳香族的，如，其他環可以是環烷基、環鏈烯基、環炔基、芳基和/或雜環基。
術語鄰、間和對為公認的表述，其分別指1，2-、1，3-和1，4-二取代的苯。例如，稱為1，2-二甲苯和鄰二甲苯的就是同義詞。
術語″雜環基″或″雜環基團″為公認的表述，其指3-至約10-元環結構，可選地3-至約7-元環結構，其環結構包括1至4個雜原子。雜環也可以是多環。雜環基基團包括諸如，噻吩、噻蒽、呋喃、吡喃、異苯並呋喃、色烯、氧雜蒽、苯氧雜蒽、吡咯、咪唑、吡唑、異噻唑、異噁唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、噠嗪、吲嗪、異吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、異喹嗪、喹啉、酞嗪、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、蝶啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、吩嗪、吩砒嗪、吩噻嗪、呋咱、吩噁嗪、吡咯烷、氧雜環戊烷、硫雜環戊烷、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉、內酯、諸如氮雜環丁烷內醯胺和吡咯烷內醯胺的內醯胺、磺內醯胺、磺酸內酯等等。雜環可以用如上所述的那些取代基在一個或多個位置上進行取代，例如，滷素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、氨基甲醯基、磷酸酯、亞磷酸酯、羰基、羧基、甲矽烷基、醚、烷硫基、磺醯基、酮、醛、酯、雜環基、芳香族或雜芳化合物的部分、-CF3、-CN等等。
此處所用的″差異表達″指組織中感興趣的基因的有差別的表達水平，包括定量和定性的測定，所述組織有差別地處理或暴露於不同的環境因子中或改變生理環境。
此處所用的″基因″或″基因序列″指基因的部分或完整的編碼序列、其互補物及其5′或3′未翻譯區域。基因的″編碼序列″指出現在基因mRNA轉錄中的那套核苷酸。″基因表達″指製備或轉錄基於基因DNA序列的RNA的過程。基因表達的「活化劑」指刺激基因的DNA序列轉錄為RNA轉錄體的化合物。″內源″基因為在物種中天然存在的基因，不需要人工整合，如隨機插入或轉染進生物體或細胞的基因組中。
此處所用的″穀氨酸轉運蛋白″指穿膜蛋白質，其能從細胞外空間中，包括突觸間隙和突觸外空間，去除L-穀氨酸，即哺乳動物中樞神經系統(CNS)中的初級興奮神經遞質。可以在神經元和神經膠質細胞的膜中發現穀氨酸轉運蛋白。在人類中已經鑑定了幾種穀氨酸轉運蛋白，其包括諸如，溶質載體蛋白家族1成員1(SLC1A1或EAAC1或EAAT3；例如GenBank登錄號NM_004170)、溶質載體蛋白家族1成員2(SLC1A2或EAAT2或GLT1；例如登錄號NM-_0041710)、溶質載體蛋白家族1成員3(SLC1A3或EAAT1、GLAST或GLAST1；例如登錄號NM_004172)、溶質載體蛋白家族1成員6(SLC1A6或EAAT4；例如GenBank登錄號NM_005071)和溶質載體蛋白家族1成員7(SLC1A7或EAAT5；例如GenBank登錄號NM_006671)。另外，在Rattus norvegicus和Mus musculus中已經鑑定了穀氨酸轉運蛋白(Slc1a1/Eaac1/REAAC1、Slc1a2/GluT/GLT-1/GluT-R、Slc1a3/Eaat1/GLAST/GluT-1和Slc1a6/Eaat4)。上述同源物據信存在於其他哺乳動物中，包括靈長類、犬科、貓科和齧齒動物。通過給藥能增加穀氨酸轉運蛋白的穀氨酸轉運活性的試劑，能增加穀氨酸轉運蛋白的活性。已報導的能增加穀氨酸轉運蛋白活性的試劑的例子包括諸如，((R)-(-)-5-甲基-1-煙醯基-2-吡唑啉(MS-153；Shimada等，EurJ Pharmacol.386263-70，1999)；利多卡因(Do等，AnesthAnalg.951263-8，2002)和激酶抑制劑(如，Conradt，J Neurochem.681244-51，1997)。
此處所用的基因″表達水平″指基因表達的水平，可通過任何用於檢測基因表達存在、極限量、定量、定性的測試方法來測定，如，通過測定mRNA水平(如，通過″Northern印跡″或″微陣列分析″)或蛋白質(如，通過檢測全長或截短多肽基因產物的量(如，用抗體的免疫學方法))。
術語″內消旋化合物″為公認的表述，其指具有至少兩個手性中心但由於平面或點對稱而無手性的化合物。
此處所用的″促代謝穀氨酸受體″(mGluR)指G蛋白質-偶聯的受體，其對神經遞質穀氨酸做出反應。基於它們的基本序列相似性、信號轉換聯繫和藥理學圖譜，有3組mGluR。組I由mGluRl(mGluRla、mGluRlb、mGluRlc、mGluRld；如，GenBank登錄號NM_000838所示的人mGluRla剪切變體)和mGluR5(mGluR5a、mGluR5b；如，GenBank登錄號NM_000842所示的人mGluR5a剪切變體)組成，其確定與磷脂酶C偶聯。組II由mGluR2(如，GenBank登錄號NM_000839)和mGluR3(如，GenBank登錄號NM_000840)組成，其不與腺苷酸環化酶相聯。組II由mGluR4(mGluR4a、mGluR4b；如，GenBank登錄號NM_000841)，mGluR6(如GenBank登錄號NM_000843)，mGluR7(mGluR7a、mGluR7b；如，GenBank登錄號NM_000844所示的人mGluR7a剪切變體)和mGluR8(如，GenBank登錄號NM_000845)組成，其不與腺苷酸環化酶相聯。對於各個mGluR組，有大量可從商業渠道獲得激動劑和拮抗劑。例如，組I的激動劑包括但不限於L-使君子氨酸((L)-(+)-α-氨基-3，5-二氧代-1，2，4-噁二唑烷-2-丙酸)、(S)-3，5-二羥基苯基甘氨酸((S)-3，5-DHPG)、反式氮雜環丁烷-2，4-二甲酸(tADA)、(1S，3R)-1-氨基環戊烷-1，3-二甲酸((1S，3R)-ACPD)和(RS)-2-氯-5-羥基苯基甘氨酸(CHPG)；而拮抗劑包括但不限於(S)-4-羧基-3-羥基苯基甘氨酸((S)-4C3HPG)、7-(羥基亞氨基)環丙烯並[b]苯並吡喃-1a-甲酸乙酯(CPCCOEt)、(RS)-1氨基茚滿-1，5-二甲酸(AIDA；UPF523)、2-甲基-6-(苯基乙炔基)吡啶(MPE鹽酸鹽)、2-甲基-6-(2-苯基乙烯基)吡啶(SIB-1893)、6-甲基-2-(苯基偶氮)-3-吡啶酚(SIB-1757)和(S)-(+)-α-氨基-4-羧基-2-甲基苯乙酸(LY367385)。組II的激動劑包括(2S，2′R，3′R)-2-(2′，3′-二羧基環丙基)甘氨酸(DCGIV)、(2S，1′S，2′S)-2-(羧基環丙基)甘氨酸(L-CCG-I；(2S，3S，4S)-CCG)、(S)-3羧基-4-羥基苯基甘氨酸((S)-3C4HPG)和(2R，4R)-4-氨基吡咯烷-2，4-二甲酸((2R，4R)-APDC)；而拮抗劑包括(2S)-α-乙基穀氨酸(EGLU)和(2S)-2-氨基-2-[(1S，2S)-2-羧基環丙-1-基]-3-(黃嘌呤-9-基)丙酸(LY341495)。組III的激動劑包括(1S，3R，4S)-1-氨基環戊烷-1，2，4-三甲酸(ACPT-I)、L(+)-2-氨基-4-膦醯基丁酸(L-AP4)、(R，S)-4-膦醯基苯基甘氨酸((R，S)-PPG)和O-磷酸-L-絲氨酸(L-SOP)；而拮抗劑包括(RS)-α-環丙基-4-膦醯基苯基甘氨酸(CPPG)、(S)-2-氨基-2-甲基-4-膦醯基丁酸(MAP4)和(RS)-α-甲基絲氨酸-O-磷酸酯(MSOP)。近來的證據表明與神經膠質相關的促代謝穀氨酸受體能改變穀氨酸轉運蛋白的表達(Aronica等，Eur.J.Neurosci.2003；172106-18，2003)。
此處所用的″中年″指已經過了性成熟期的哺乳動物，即，不年輕但也不接近物種的平均壽命跨度，即，不年老。例如，中年鼠約12-18個月大。中年的人在20至70歲之間。
此處所用的″神經組織″指神經系統的組織，即包含神經元和神經膠質的組織。特別指明，神經組織可以指特定在大腦中發現的結構，包括「海馬組織」。海馬組織指在顳皮層發現的海馬狀結構，包括內鼻層、前下託、腦下腳、原腦下腳、齒狀回、以及已知為CA1、CA2、CA3和CA4的區域。海馬涉及的過程如短期記憶、長期記憶的形成、記憶恢復、表述性記憶和空間導航。
此處所用的″神經保護″指組合物和治療方法，其具有減少、阻止或改善有障礙的認知功能的作用，並保護、恢復或回復遭受有障礙的認知功能的組織。
術語″硝基″為公認的表述，其指-NO2；術語″滷素″為公認的表述，其指-F、-Cl、-Br或-I；術語″巰基″為公認的表述，其指-SH；術語″羥基″指-OH；而術語″磺醯基″為公認的表述，其指-SO2-。″滷化物″指具有相應的滷素陰離子，而「類滷化物」按照Cotton和Wilkinson的《高級無機化學》第560頁中的定義。
術語″磷醯基″為公認的表述，其一般可以由以下通式表示
其中Q50表示S或O，而R59表示氫，低級烷基或芳基。當用於取代時，如烷基，則磷醯烷基的磷醯基團一般可以由以下通式表示
其中Q50和R59各自獨立地如上所定義，而Q51代表O、S或N。當Q50為S時，磷醯基部分為″硫代磷酸酯″。
術語″磷醯胺酸酯″為公認的表述，其可以由以下通式表示
其中Q51、R50、R51和R59如上定義。
術語″膦胺酸酯″為公認的表述，其可以由以下通式表示
其中Q51、R50、R51和R59如上定義，而R60代表低級烷基或芳基。
可以向鏈烯基和炔基進行類似的取代從而產生諸如，氨基鏈烯基、氨基炔基、氨基甲醯基鏈烯基、氨基甲醯基炔基、亞氨基鏈烯基、亞氨基炔基、鏈烯硫基、炔硫基、羰基-取代的鏈烯基或炔基。每個表述的定義，如，烷基、m、n等等，在任何結構中出現多於一次時，其意指在同一結構中各處進行獨立的定義。
術語″硒代烷基″為公認的表述，其指其上附帶有取代的硒基基團的烷基。示例的″硒醚″可以在烷基進行取代，選自-Se-烷基、-Se-鏈烯基、-Se-炔基和-Se-(CH2)m-R61，m和R61如上定義。
術語三氟甲烷磺醯基、甲苯磺醯基、甲磺醯基和九氟丁烷磺醯基為公認的表述，其分別指三氟甲烷磺醯基、對甲苯磺醯基、甲磺醯基和九氟丁烷磺醯基基團。術語三氟甲烷磺酸酯、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁烷磺酸酯為公認的表述，其分別指三氟甲烷磺酸酯、對甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和九氟丁烷磺酸酯的功能基團及包含所述基團的分子。
縮寫Me、Et、Ph、Tf、Nf、Ts和Ms分別代表甲基、乙基、苯基、三氟甲烷磺醯磺醯基、九氟丁烷磺醯基、對甲苯磺醯基和甲磺醯基。本領域普通技術人員所用的有機化學縮寫的更全面的列表參見Journal of Organic Chemistry每一卷的第一期；該列表一般出現在稱為標準縮寫列表的表格中。
此處所用的″垂體腺苷酸環化酶活化因子多肽″(PACAP)指神經多肽，其為cAMP-依賴性信號途徑的有效的活化因子。PACAP起多功能肽的作用並涉及多種過程，如調節激素分泌、能量代謝、神經元存活，而且它是神經膠質穀氨酸轉運蛋白EAAT1和EAAT2的調節因子(Figiel和Engele，J.Neurosci.153596-3605，2000)。PACAP屬於選凝素/胰高血糖素/血管活性腸肽(VIP)超家族，並存在源於相同前體的兩種醯胺化形式，即PACAP38(38-胺基酸殘基)和PACAP27(27-胺基酸殘基)。PACAP的主要結構在被囊動物、魚類、兩棲類和哺乳動物的整個進化中高度保守，而且在果蠅中也測定出了PACAP-樣神經肽。除了PACAP-38和PACAP-27，PACAP受體的第三類激動劑為Maxadilian。Maxadilan是有效的血管擴張肽，其從吸血沙地蠅的唾液腺提取物中分離而得。近來已證實，儘管maxadilan同PACAP沒有明顯的胺基酸序列同源性，但在哺乳動物中，maxadilan與PACAP受體1型結合(Moro和LernerMaxadilan，J.Biol.Chem.272(2)966-70，1997)。PACAP及其受體主要都分布在神經和內分泌系統中，顯示出高效的多效性功能。所以，激發PACAP受體的PACAP肽、Maxadilan或肽衍生物和類似物、肽-樣化合物和小分子激動劑能用於增加穀氨酸轉運蛋白的活性。
術語″多環″或″多環基團″為公認的表述，其指2個或多個環(如，環烷基、環鏈烯基、環炔基、芳基和/或雜環基)，其中2個鄰接的環共同擁有2個或多個碳，如，環是″稠環″。通過非鄰接的原子連接的環術語稱作「橋」環。多環的每個環可用如上所述的那些取代基來取代，例如，滷素、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環烷基、羥基、氨基、硝基、巰基、亞氨基、氨基甲醯基、磷酸酯、亞磷酸酯、羰基、羧基、甲矽烷基、醚、烷硫基、磺醯基、酮、醛、酯、雜環基、芳香族或雜芳化合物部分、-CF3、-CN等等。
此處所用的″大量″指2或更多。
術語″前藥″為公認的表述，其意為包含在生理條件下能轉化為本發明抗菌劑的化合物。製備前藥的普通方法是選擇在生理條件下能水解成預期化合物的部分。在其它具體實施方式
中，通過宿主動物的酶活性來轉化前藥。
術語″保護基團″為公認的表述，其指臨時保護潛在反應功能基團不發生不要的化學轉化的取代基。這些保護基團的實例分別包括羧酸酯、醇的甲矽烷基醚及醛和酮的乙縮醛和縮酮。化學保護基團領域可參見Greene和Wuts的Protective Groups in Organic Synthesis(第2版，Wiley紐約，1991)的綜述。
術語″羥基-保護基團″為公認的表述，其指那些要保護在合成過程中羥基基團不發生不要的反應的基團，其包括諸如，現有技術中已知的苄基或其他合適的酯或醚基團。
術語″羧基-保護基團″為公認的表述，其指那些要保護在合成過程中羧酸基團不發生不要的反應的基團，如胺基酸或肽的C末端或酸性或羥基吖庚因環的取代基。羧基保護基團的實例包括諸如，苄基酯、環已基酯、4-硝基苄基酯、叔丁基酯、4-吡啶甲基酯等等。
術語″氨基-保護基團″為公認的表述，其指保護氨基基團不參與與一些其他功能基團發生的反應的基團，但其能在需要時從胺上去除。這些基團如上述Greene和Wuts著作的第7章和Barton的ProtectiveGroups in Organic Chemistry的第2章(McOmie編輯，Plenum Press，紐約，1973)中所述的。合適基團的例子包括醯基保護基團，例如，甲醯基、丹醯基、乙醯基、苯甲醯基、三氟乙醯基、琥珀醯基、甲氧基琥珀醯基、苄基和取代的苄基，如3，4-二甲氧基苄基、鄰硝基苄基和三苯基甲基；那些分子式-COOR的基團，其中R包括諸如以下基團的基團，甲基、乙基、丙基、異丙基、2，2，2-三氯乙基、1-甲基-1-苯基乙基、異丁基、叔丁基、叔戊基、乙烯基、烯丙基、苯基、苄基、對硝基苄基、鄰硝基苄基和2，4-二氯苄基；醯基和取代的醯基，如甲醯基、乙醯基、氯乙醯基、二氯乙醯基、三氯乙醯基、三氟乙醯基、苯甲醯基和對甲氧基苯甲醯基；其他基團如，甲磺醯基、對甲苯磺醯基、對溴苯磺醯基、對硝基苯基乙基和對甲苯磺醯基-氨基羰基。優選的氨基-保護基團為苄基(-CH2C6H5)、醯基[C(O)R1]或SiR13，其中R1為C1-C4烷基、滷甲基或2-滷-取代的-(C2-C4烷氧基)，芳香族尿烷保護基團，例如，羰基苄氧基(Cbz)和脂肪族尿烷保護基團，如叔丁氧基羰基(Boc)或9-芴基甲氧基羰基(FMOC)。
每種表述的定義，如低級烷基、m、n、p等等，當其在結構中出現超過一次時，其意在同一結構中不同位置各自獨立定義。
術語″吸電子基″為公認的表述，其指有從相鄰原子吸引價電子傾向的取代基，即取代基相對於相鄰原子是電負性的。吸電子能力水平的量化由Hammett西格馬(σ)常數得出。該公知的常數在許多文獻中有敘述，例如，March，Advanced Organic Chemistry 251-59(McGrawHill Book Company紐約，1977)。Hammett常數值一般以負值表示供電子基團(σ(P)＝-0.66表示NH2)而以正值表示吸電子基團(σ(P)＝0.78表示硝基)，σ(P)顯示了相對替換性。示例的吸電子基包括硝基、醯基、甲醯基、磺醯基、三氟甲基、氰基、氯化物等等。示例的供電子基包括氨基、甲氧基等等。
此處所用的″RNA″指各種核糖核酸，如信使RNA、成熟RNA、多聚腺苷酸化的RNA，未多聚腺苷酸化的RNA和包含內含子和/或5′或3′未翻譯區的RNA。此處所用的「表達的RNA」指通過聚合酶從基因組或線粒體DNA上轉錄的RNA。
術語″區域異構體″為公認的表述，其指具有相同分子式但在原子的連通性上有差異的化合物因此，″區域選擇過程″為相對其它異構體偏好產生特定區域異構體的過程，如，反應產生統計學顯著增加的某種區域異構體的產量。
術語″差向異構體″為公認的表述，其指具有完全相同化學構造並包含超過一種立構中心的分子，但其在這些立構中心中僅有一個的構型中有差異。
此處所用的″小分子″指一種成分，其具有小於約5kD的分子量，最優選小於約4kD。小分子可以是核酸、肽、多肽、模擬肽、碳水化合物、脂或其它有機(含碳)或無機分子。許多製藥公司和供應商有許多化學和/或生物混合物的文庫，通常是真菌、細菌或藻類的提取物，它們能用本發明的任何試驗來篩選從而鑑定能調節生物活性的化合物，如預期行為或認知功能。
術語″立體異構體″為公認的表述，其指具有完全相同化學構造化合物，但在原子或基團的空間排列上有差異。特別地，″對映異構體″指化合物的2個立體異構體，它們的鏡像影像是不能互相重疊的。另一方面，″非對映異構體″指具有2個或多個非對稱中心的立體異構體，而且其分子不互為鏡像影像。
另外，″立體選擇過程″為相對產生其它可能的立體異構體，更偏好產生反應產物中特定立體異構體的過程。″對映選擇過程″為偏向產生反應產物中2個可能的對映異構體中的一個過程。
術語″結構-活性關係″或″(SAR)″為公認的表述，其指改變藥物或其它化合物分子結構的方法，該方法改變了其與受體，酶，核酸或其他靶位等的相互作用。
此處所用的″個體″指哺乳動物，如人、非人靈長類、綿羊、牛、豬、馬、貓、鼠或犬。優選地，個體為人。本發明所述的「需要」治療的個體或哺乳動物具有有障礙的認知功能，該認知功能能由在此所述的方法和組合物來改善。可以理解「取代」或」用...取代″包括隱含的限定，即這種取代符合取代原子和取代基所允許的價，而且取代形成穩定的化合物，如不會自發通過諸如重排、環化、消除或其他反應而產生變化。
術語″取代的″預期也包括有機化合物所允許的所有取代基。在一個廣義的方面，允許的取代基包括有機化合物的無環的和環的、分支的或不分支的、碳環的和雜環的、芳香族和非芳香族取代基。示例的取代基包括諸如如上所示的那些。合適有機化合物的允許的取代基可以是一個或多個並可以是相同或不同的。為了本發明的目的，雜原子，如氮，可以帶來有氫取代基和/或任何此處所述的有機化合物允許的取代基，其符合雜原子的價。本發明不以任何方式被有機化合物所允許的取代基限制。
術語″磺酸酯″為公認的表述，其指可由如下通式所表示的部分
其中R57為電子對、氫、烷基、環烷基或芳基。
術語″硫酸酯″為公認的表述，其包括由如下通式所表示的部分
其中R57如上定義。
術語″磺醯氨基″為公認的表述，其包括由如下通式所表示的部分
其中R50和R56如上定義。
術語″氨磺醯基″為公認的表述，其指可由如下通式所表示的部分
其中R50和R51如上定義。
術語″磺醯基″為公認的表述，其指可由如下通式所表示的部分
其中R58為如下之一氫、烷基、鏈烯基、炔基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基。
術語″亞碸基″為公認的表述，其指可由如下通式所表示的部分
其中R58如上定義。
術語″合成″為公認的表述，其指通過體外化學或酶學合成方法生產。
此處所用的″測試群體″指具有預期行為或認知功能的個體。測試群體的成員可包括年輕、中年和老年個體。
此處所用的″治療劑″指化學化合物或組合物，當向需要的個體適量給藥時，其能誘導預期的治療或預防效果。″治療劑″可以是任何化學部分或有生物、生理或藥理活性的生物物質，其能局部或系統性地作用於需要的個體。化學治療劑的實例也被稱為「藥物」，已在公知文獻中描述了，如Merck索引，Physicians Desk Reference，和Pharmacological Basis of Therapeutics，而且它們包括但不限於藥劑；維生素；礦物質補充劑；用於處理、診斷、治療或緩解疾病或病症的物質；影響機體結構或功能的物質或前藥，其在生理環境中被替代後能具有生物活性或更多活性。抗生素試劑和FabI/FabK抑制劑是治療劑的實例。生物治療劑的實例包括含有基因並能將基因遞送到個體的載體。
治療劑誘導動物的局部或系統效應，尤其是由藥物活性物質造成的哺乳動物的，更特別的是人的。所以，治療劑可在動物或人中用於診斷、治療、緩解、治療或預防噁性病況或增強預期的身體或精神發育和/或狀態。
為了有效果，治療劑以產生預期局部或系統效應的量或濃度以合理的利益/風險率進行遞送，從而應用於任何治療中。這種治療劑的有效量會根據治療的個體和病情、個體的體重和年齡、病情的嚴重程度、給藥方式等而變化，其能由本領域普通技術人員方便的確定。例如，本發明的某些組合物可以足以產生效果的量以合理的利益/風險率來進行給藥，從而應用於這種治療中。有障礙的認知功能的上下文中，能用標準行為或現有已知評估認知功能的其他測試來評估呈現的治療效果的程度。
術語″反式″為公認的表述，其指在一個雙鍵邊上的2個原子或基團的排列方式，使得這些原子或基團原子或基團處在雙鍵的不同側。反式構型通常標示為(E)構型。
此處所用的″治療″個體有障礙的認知功能或″治療″具有有障礙的認知功能的個體指通過合適的方法向個體提供治療劑，如，給藥藥物，從而使至少一個有障礙的認知功能的症狀穩定或減輕。治療有障礙的認知功能能防止功能障礙，延緩功能障礙的進程或改善功能障礙(減輕疾病嚴重程度)或治療功能障礙。
此處所用的″載體″指組合物，其用於將DNA或RNA導入進組織。所屬領域技術人員公知的方法可用於構建包含核酸的表達載體，該核酸編碼與合適的轉錄/翻譯控制信號相連的感興趣的蛋白質。如參見，Sambrook & Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版)，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(2001)和Ausebel等Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates& Wiley Interscience，N.Y(1989)所述的技術。
將載體或質粒轉化入細胞的合適方法包括脂/DNA複合物，如美國專利第5,578,475；5,627,175；5,705,308；5,744,335；5,976,567；6,020,202；6,051,429號所述的那些方法。合適的試劑包括lipofectamine，一種3∶1(w/w)的聚-陽離子脂三氟乙酸2，3-二油醯氧基-N-[2(精胺羧基-氨基甲醯基)乙基]-N，N-二甲基-1-丙銨(DOSPA)(Chemical Abstracts登記名稱N-[2-(2，5-雙[(3-氨基丙基)氨基]-1-氧基戊基)氨基]乙基)-N，N-二甲基-2，3-雙(9-十八碳烯氧基)-1-丙銨-三氟乙酸鹽)的脂質體配方，和膜過濾水中的中性脂二油烯基磷酯醯乙醇胺(DOPE)。實例有Lipofectamine 2000TM(可從Invitrogen(以前的Gibco/Life Technologies)#11668019處獲得)配方。其他試劑包括FuGENETM轉染試劑(非脂質體形式中的脂和80％乙醇中的其他化合物的混合物，可從Roche Diagnostics Corp.#1814443處獲得)和LipoTAXITM轉染試劑(獲得自Invitrogen Corp.的脂配方，其能產生預期的生物活性蛋白質。#204110)。可通過電穿孔來轉染細胞，如Roach和McNeish(Methods in Mol.Biol.1851(2002))所述的那樣。用來產生穩定遺傳變化的細胞的合適病毒載體系統可以是基於腺病毒、慢病毒、反轉錄病毒、腺相關病毒(AAV)和其他病毒的，並可以用可從商業渠道獲得的病毒成分來製備。載體可通過現有技術導入到神經細胞和組織中，包括注射(如注射到大腦特定區域)、通過使用動靜脈吻合流術導入血管空間或腦脊髓液中以及其他機械方法。
″年輕″指約性成熟年齡的青春期和正常成年哺乳動物，而且其時海馬剛完全成熟。對於鼠來說，″年輕″鼠為6-9個月大。對人來說，″年輕″人為10-20歲。
6.2引言認知功能的行為和遺傳評估的聯合研究 用Morris水迷宮和輻射臂狀迷宮進行的認知功能的行為評估已經用於鑑定與年齡相關的認知功能的改變。基於其認知功能，將這些行為評估用作為表徵動物的方法，這樣就可以將認知功能的行為評估與遺傳和生理測定結合起來，從而檢測大腦衰老效應的差異。
為了獲得大腦中與年齡和行為相關的變化的基因模板，應用基因表達陣列提供了同時分析成千上萬表達的基因的可能性。這些方法也提出了一些挑戰。首先，我們的鼠模型，類似於衰老人群，其包含遺傳上遠系繁殖的群體，其能增加個體可變性，從而成為基因表達譜中的幹擾因子。第二，用傳統定量方法來評估海馬中的特定mRNA的表達水平，我們發現與年齡和行為有關的基因表達變化通常相對較小，小於已經報導的現有Genechip
或微陣列方法中解析度極限的基因表達水平的2倍差異。例如，Landfield及其同事的工作就由於不能檢測小於2倍的基因表達改變而受到限制(WO03/025122 A2)。
在此我們描述了克服這些挑戰的策略，證實了可靠的基因表達的小變化，我們用傳統方法顯示了該區分老年和年輕鼠的基因表達。分析更廣泛的基因顯示該方法可重複地顯示了很多基因，這些基因在與年老鼠行為相關的海馬中顯示出表達改變。
鑑定與認知功能障礙相關的基因第一次使人們確定候選化合物是否能調節與正常認知功能相關的基因表達。能調解這些更接近於諸如人的具有預期認知功能的哺乳動物中表達水平的基因表達的化合物在用作為治療劑時，能預見其可恢復或增強認知功能。用該方法，我們報導發現了與保持年老哺乳動物中認知功能相關的基因。不僅限於推測，我們相信這種保持代表了活性生物過程，其能用合適的治療劑處理來引發或誘導。當然，我們在此報導一種這樣的試劑為頭孢曲松，一種第三代頭孢菌素。另一種這樣的試劑為丙戊酸和MS-153。用下述篩選方法可鑑定並優化其他這樣的治療劑。產生本發明的實驗方法和本發明本身以及本發明的實踐技術會在以下章節中敘述。
6.2.1分離RNA 當從個體的組織樣品或細胞中分離RNA時，重要的是從個體中分離出組織或細胞後，防止基因表達的任何進一步變化。已知表達水平的改變在震動後迅速發生，如熱休克或用脂多糖(LPS)或其他試劑活化。另外，組織和細胞中的RNA快速降解。因此，在優選的具體實施方式
中，從個體中獲得的組織或細胞儘可能的速凍住。
RNA能通過大量方法從組織樣品中分離，如在實施例中所述的或用CsCl離心後的硫氰酸胍裂解(Chirgwin等，1979，Biochemistry 185294-5299)。在苯酚/硫氰酸胍混合物(得自Invitrogen)中使組織均一化並在異丙醇沉澱後用氯仿提取從而從冰凍組織中分離RNA。然後重懸浮RNA小顆粒並進一步過RNeasy柱(Qiagen)來純化。所有RNA可以在缺少RNA酶抑制劑的情況下儲存於-80℃，並用瓊脂糖凝膠電泳來評估其完整性。能用所述從單個細胞中製備cDNA文庫的方法來從單個細胞中獲得RNA，如Dulac，C.(1998)Curr.Top.Dev.Biol.36，245和Jena等(1996)J.Immunol.Methods 190199所述的那樣。必須小心避免RNA降解，如加入RNA酶抑制劑。
然後可以富集特定物種的RNA樣品。在一個具體實施方式
中，從RNA樣品中分離聚(A)+RNA。一般而言，這種純化法有在mRNA上加上聚-A的好處。尤其，如上所指出，聚-T寡核苷酸可固定在固相支持物上從而用作mRNA的親合配體。達到該目的的試劑盒可從商業渠道獲得，如，MessageMaker試劑盒(Invitrogen #10298016)。
在一個具體實施方式
中，富集感興趣序列的RNA群，如那些涉及認知功能的基因。能通過諸如引物特異性cDNA合成或基於cDNA合成的線性擴增以及體外模板直接轉錄來進行富集(如參見，Wang等(1989)PNAS 86，9717；以上的Dulac等，和以上的Jena等)。
富集的或不在特定物種或序列中的RNA群能進一步被擴增。該擴增在使用來自單個或一些細胞的RNA時尤其重要。許多擴增方法適用於本發明的方法中，包括諸如PCR；連接酶鏈式反應(LCR)(如參見，Wu和Wallace，Genomics 4,560(1989)，Landegren等，Science 241，1077(1988))；自持序列複製(SSR)(如參見，Guatelli等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990))；基於序列的核酸擴增(NASBA)和轉錄擴增(如參見，Kwoh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989))。對於PCR技術，如參見PCR TechnologyPrinciples andApplications for DNA Amplification(H.A.Erlich著，Freeman Press，N.Y.，N.Y.，1992)；PCR ProtocolsA Guide to Methods andapplications(編輯.Innis，等，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Mattila等，Nucleic Acids Res.19，4967(1991)；Eckert等，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(McPherson等著，IRL Press，Oxford)和美國專利第4,683,202號。擴增方法如下所述，有Ohyama等(2000)BioTechniques 29530；Luo等(1999)Nat.Med.5，117；Hegde等(2000)BioTechniques 29548；Kacharmina等(1999)Meth.Enzymol.3033；Livesey等(2000)Curr.Biol.10301；Spirin等(1999)Invest.Ophtalmol.Vis.Sci.403108和Sakai等(2000)Anal.Biochem.28732。也可在細胞上原位進行RNA擴增和cDNA合成(如參見，Eberwine等(1992)PNAS 893010)。″定量PCR″指利用PCR規程使人能確定樣品中反應產物的量或反應產物的數量。
所屬領域技術人員會理解如何使用擴增方法，如果要獲得定量結果，必須注意使用保持或控制相對的核酸擴增率以獲得定量的擴增。「定量」擴增的方法對所屬領域技術人員來說是公知的。例如，定量PCR包括用相同引物同時共擴增已知量的對照序列。這提供了內部可用於校正PCR反應的標準。然後，高密度陣列可包括特異性探針做內在擴增的核酸的定量標準。
一個優選的內在標準為合成的AW106 cRNA。根據所屬領域技術人員已知的標準技術，AW106 cRNA與分離自樣品的RNA結合。然後用反轉錄酶，反轉錄RNA產生DNA拷貝。然後(如，通過PCR)用標記的引物擴增cDNA序列。典型地通過電泳來分離擴增產物，並確定(與擴增產物成比例的)放射性的量。然後通過比較已知AW106RNA標準產生的信號來計算樣品中RNA的量。具體的定量PCR規程如PCR Protocols，A Guide to Methods and Applications，lords等，Academic Press，Inc.N.Y.，(1990)所述。
在優選的具體實施方式
中，用反轉錄酶和由寡(dT)和編碼噬菌體T7啟動子的序列組成的引物反轉錄出樣品mRNA，用以提供單鏈DNA模板。用DNA聚合酶聚合出第二條DNA鏈。合成雙鏈cDNA後，加入T7 RNA聚合酶並從cDNA模板上轉錄出RNA。接下來從每個單鏈cDNA模板上進行的轉錄輪次使得擴增了RNA。體外聚合的方法對所屬領域技術人員來說是公知的(如參見以上的Sambrook &Russell而且該特定方法在Van Gelder，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，871663-1667(1990)中有詳述，他們證明了根據該方法進行的體外擴增保持了各種RNA轉錄體的相對率)。另外，Eberwine等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，893010-3014提供了一種規程，其在體外轉錄中使用2輪擴增以獲得大於初始材料106倍的增加，從而允許甚至在生物樣品有限的情況下來檢測表達。
所屬領域技術人員會理解上述直接轉錄方法提供了反義(aRNA)庫。當反義RNA用作靶核酸時，選擇陣列中提供的寡核苷酸探針來互補反義核酸的亞序列。相反，當靶核酸為正義核酸庫時，挑選寡核苷酸探針來互補正義核酸的亞序列。最終，當核酸庫是雙鏈時，探針可以是任意意義的靶核酸，包括正義和反義鏈。
6.2.2分析RNA 在一些具體實施方式
中，相對於成百或成千的基因，足以確定一種或少量基因的表達。儘管微陣列能用於這些具體實施方式
中，但是也可用各種其它的檢測基因表達的方法。本節描述了一些檢測並定量mRNA或其編碼的多肽的示例方法。方法的第一步包括從細胞中分離出mRNA，該步驟可以以如上所述的方式進行。可以以如上所述的方式來標記一種或多種核酸。
在一個具體實施方式
中，樣品中獲得的mRNA反轉錄出第一條cDNA鏈並進行PCR，如RT-PCR。內務基因或其他表達不發生變化的基因能用作內在的對照和進行試驗的對照。PCR反應後，電泳分離擴增的產物並檢測。通過使用定量PCR，擴增產物的水平可與樣品中存在的RNA水平相關聯。擴增的樣品也可以在瓊脂糖或聚丙烯醯胺凝膠上分離，轉到濾膜上，而該濾膜雜交有感興趣的基因的特異探針。進行平行PCR擴增，如多重PCR，能同時分析大量的樣品。
使用的定量PCR技術是以TaqManTM探針的使用為基礎的。在存在寡核苷酸探針的情況下，通過PE Applied Biosystems 7700序列檢測系統上擴增靶序列來進行特定序列的檢測，其中探針的5』和3』端各自標記有報告和淬滅螢光染(FQ探針)，其能在2個PCR引物間退火。當探針結合在引物間時，僅能檢測到特定產物。PCR擴增進行中，Taq聚合酶的5′-核酸酶活性開始從探針上切下報告染料。當報告染料與淬滅染料物理分離時，用帶有CCD的照相機測定信號從而檢測出產生的信號。也可以使用諸如敘利亞綠的插入性染料。每個產生的信號等於一個裂解的探針，其與一個靶鏈的擴增相對應。根據提供的說明書，可利用PE Applied Biosystem TaqMan PCR核心試劑盒來進行PCR反應。進一步，該技術如美國專利第6,326,462號所述。可選地，能從Applied Biosystems和Qiagen處獲得探針，與Invitrogen的鉑定量PCR試劑盒和Rotorgene 3000一起使用。
在另一個具體實施方式
中，通過點印跡分析和相關方法來確定mRNA的水平(如參見，G.A.Beltz等的Methods in Enzymology，Vol.100，Part B，R.Wu，L.Grossmam，K.Moldave，編著AcademicPress，紐約，第19章，第266-308頁，1985)。在一個具體實施方式
中，在濾膜上印跡(即，非共價鍵)特定量的從細胞中提取的RNA，而該濾膜雜交有感興趣的基因的特異探針。由於印跡能包含多點RNA，因此能同時分析大量RNA樣品。利用方法來檢測雜交，該方法依賴探針標記的類型。在另一個點印跡方法中，一個或多個上或下調認知功能障礙的基因的一個或多個探針吸附於膜上，並用獲得自和源自個體細胞或組織的RNA的標記核酸來溫育該膜。這種點印跡本質上就是包含少於微陣列探針數的陣列。
″點印跡″雜交有著廣泛的應用並開發出許多版本(如參見，M.L.M.Anderson和B.D.Young的Nucleic Acid Hybridization-APractical Approach，B.D.Hames和S.J.Higgins，編.，IRL Press，Washington D.C.，第4章，第73-111頁，1985)。
另一種形式，即所謂的「三明治」雜交，包括將寡核苷酸探針共價結合到固相支持物上，並利用它們捕獲並檢測多個核酸靶位(如參見，M.Ranki等，基因，21，第77-85頁，1983；A.M.Palva，T.M.Ranki，和H.E.Soderlund的英國專利申請GB 2156074A，1985年10月2日；T.M.Ranki和H.E.Soderlund的美國專利第4,563,419號，1986年1月7日；A.D.B.Malcolm和J.A.Langdale的PCT WO86/03782，1986年7月3日；Y.Stabinsky，的美國專利第4,751,177號，1988年1月14日；T.H.Adams等的PCT WO 90/01564，1990年2月22日；R.B.Wallace等6 Nucleic Acid Res.11，p.3543，1979；和B.J.Connor等，80 Proc.Natl.Acad.Sci.USA pp.278-282，1983)。這些形式的多個版本被稱為「反點印跡」。
也能用Northern印跡來確定mRNA水平。電泳分離特定量的RNA並轉移到濾膜上，該濾膜然後雜交有相應於感興趣基因地探針。該方法，儘管在要分析大量樣品和基因時更麻煩些，但它仍有非常準確的優點。
優選的高通量基因表達分析的方法是系列(″SAGE″)技術，其首次由Velculescu等(1995)Science 270，484-487提出。SAGE的優點是其具有能在特定細胞類型中檢測所有基因的潛力，提供出有關這些基因相關表達的定量信息，允許迅速比較2個細胞中基因的基因表達，並產生能用於鑑定檢測的基因的序列信息。所以至今，SAGE方法已證明其能可靠地在各種細胞類型中檢測調節和非調節基因的表達(Velculescu等(1997)Cell 88，243-251；Zhang等(1997)Science276，1268-1272和Velculescu等(1999)Nat.Genet.23，387-388)。
產生並探測核酸的技術例如在上述的Sambrook & Russell(上文)中有進一步描述。
可選地，可通過原位雜交組化來確定一種或多種上或下調認知功能障礙的基因的表達水平。在一個具體實施方式
中，按照現有已知的技術，從個體中獲得組織樣品，製備切片並進行原位雜交，從而檢測感興趣的基因的表達水平。
以上方法可用於評估內源基因表達的增加，所述基因可通過向哺乳動物導入新的轉錄單位或基因活化構建體來活化，轉錄單位或基因活化構建體包括內源調節序列、內源外顯子和剪接位點，可操作地與內源基因的第二個外顯子相連，其中細胞包含內源外顯子和在內源基因中存在的外顯子(如參見，美國專利第5,641,670；5,773,746；5,733,761；5,968,502；6,702,989和6,565,844號)。
在其他方法中，通過測量基因編碼的蛋白質水平來檢測基因的表達水平。如通過免疫沉澱、ELISA或免疫組化來進行該方法，利用的試劑如抗體，其特異檢測基因編碼的蛋白質。其它技術包括Western印跡分析。免疫試驗常用於定量細胞樣品中的蛋白質水平，並且許多其他免疫試驗技術出現在現有技術中。本發明不局限於特定試驗過程，並因而要包括同源的和異源的過程。本發明能進行的示例的免疫試驗包括螢光極化免疫試驗(FPIA)、螢光免疫試驗(FIA)、酶免疫試驗(EIA)、懸液抑制免疫試驗(NIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和放射免疫試驗(RIA)。指示部分或標記基團能吸附於特定抗體上並選擇從而使之達到各種方法所使用的需求，其中通常通過可用的試驗設備和兼容的免疫試驗過程來規範這些方法。用於進行各種上述免疫試驗的常規技術對本領域普通技術人員是已知的。
對於細胞分泌的多肽，可在生物流體中測定這些多肽的表達水平。
在一些具體實施方式
中，可通過以下章節所詳述的微陣列分析來檢測和/或測定mRNA水平。
6.3引言微陣列 一般而言，用陣列來確定表達譜包括以下步驟(a)從個體獲得mRNA樣品並製備其標記的核酸(″靶核酸」或」靶″)；(b)在足以使靶核酸與陣列上相應探針結合的條件下，將靶核酸與陣列接觸，如通過雜交或特異結合；(c)可選地從陣列上去除未結合的靶；(d)檢測結合的靶，和(e)分析結果。此處所用的″核酸探針探針」或」探針″為吸附在陣列上的核酸，而″靶核酸″為與陣列雜交的核酸。以下將更詳細地描述這些步驟的每一步。
6.3.1標記用於微陣列分析的核酸 一般而言，要標記靶分子從而允許檢測靶分子與微陣列的雜交。「標記」指探針直接或通過與一個或多個信號產生系統的成分的結合形式來包含一種信號產生系統的成分，因而其是可檢測的。直接可檢測標記的實例包括整合於、通常是共價結合於探針部分的同位素和螢光部分，或可檢測標記的能結合於探針分子功能部分的光活化或化學活化的衍生物，探針部分如核苷酸單體，如，引物的dNMP。
在富集和/或擴增RNA期間或之後標記核酸。例如，用公知的寡dT引物或隨機引物反轉錄法從mRNA來製備標記的cDNA(如參見，Klug和Berger，1987，Methods Enzymol.152316-325)。在存在有結合了可檢測標記的dNTP的情況下進行反轉錄，最優選為螢光標記的dNTP。可選地，在存在標記的dNTP的情況下，分離的mRNA可轉化成由體外雙鏈cDNA轉錄而合成的標記的反義RNA(Lockhart等，Nature Biotech.141675，1996)。在可選的具體實施方式
中，在缺少可檢測標記的情況下合成cDNA或RNA探針，然後進行標記，如通過結合生物素標記的dNTP或rNTP，或一些相似的方法(如光交聯生物素的補骨脂素衍生物與RNA)，接著加入標記的抗生蛋白鏈菌素(如藻紅蛋白結合的抗生蛋白鏈菌素)或等價物。
在一個具體實施方式
中，在42℃溫浴60分鐘包含RNA和0.5mMdGTP，dATP和dCTP加上0.1mM dTTP和螢光脫氧核糖核苷酸(如，0.1mM若丹明110 UTP(Perken Elmer Cetus)或0.1mM Cy3 dUTP(Amersham))的混合物和反轉錄酶(如SuperScriptTM II，LTI Inc.)來合成標記的cDNA。
感興趣的螢光部分或標記包括香豆素及其衍生物，如7-氨基-4-甲基香豆素，氨基香豆素，bodipy染料，如Bodipy FL、瀑布蘭，螢光素及其衍生物，如螢光素異硫氰酸酯、俄勒岡綠，若丹明染料，如德克薩斯紅、四甲基若丹明、曙紅和藻紅，花青染料，如Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7、FluorX，大環螯合的鑭系離子，如，量子染料TM，螢光能量轉化染料，如噻唑橘紅-溴乙非啶異質二聚體、TOTAB、丹醯基，等。個別螢光化合物具有連接設備或本發明實驗中所需檢測元素的功能，或能修飾取得這些功能，這樣的化合物包括，如，丹醯基氯；螢光素，如3，6-二羥基-9-苯基二苯吡喃醇；若丹明異硫氰酸酯；N-苯基1-氨基-8-磺酸萘；N-苯基2-氨基-6-磺酸萘；4-乙醯氨基-4-異硫氰基-芪-2，2′-二磺酸；芘-3-磺酸；2-甲苯氨基萘-6-磺酸酯；N-苯基-N-甲基-2-氨基萘-6-磺酸酯；溴化乙錠；stebrine；亞金氨基-0，2-(9′-蒽)棕櫚酸酯；丹醯基磷脂醯乙醇胺；N，N′-二十八烷基噁羰花青N，N′-二己基噁羰花青；部花青，4-(3′-芘基)硬脂酸酯；d-3-氨基脫氧馬萘雌酮；1 2-(9′-蒽基)硬脂酸酯；2-甲基蒽；9-乙烯基蒽；2，2′(亞乙烯基對亞苯基)雙苯噁唑；對雙(2-甲基-5-苯基-噁唑基))苯；6-二甲基氨基-1，2-苯並吩嗪；視黃醇；雙(3′-氨基吡啶)1，10-癸烷基二碘化物；hellibrienin磺酸萘腙；氯代四環素；N-(7-二甲基氨基-4-甲基-2-氧代-3-色烯基)馬來醯亞胺；N-(對-(2苯並咪唑基)-苯基)馬來醯亞胺；N-(4-氟萘基)馬來醯亞胺；雙(高香草醛酸)；刃天青；4-氯-7-硝基-2，1，3-苯甲醯噁二唑；部花青540；試滷靈；孟加拉玫瑰紅和2，4-二苯基-3(2H)-呋喃酮(如參見，Kricka，1992，Nonisotopic DNA Probe Techniques，Academic Press San Diego，Calif.)。許多螢光標記可通過商業渠道從SIGMA-AIdrich，Amersham Biosciences，Molecular Probes，Pfizer(以前的Pharmacia)，BD Biosciences(以前的CLONTECH)，ChemGenesCorp.，Glen Research Corp.，Invitrogen，Fluka Chemica-BiochemikaAnalytika(Fluka Chemie AG，Buchs，瑞士)，和Applied Biosystems(Foster City，Calif.)以及其他技術人員知道的商業渠道獲得。
化學發光標記包括蟲螢光素和2，3-二氫酞吖嗪二酮，如發光氨。
感興趣的同位素部分或標記包括32P、33P、35P、125I、2H、14C等等(參見Zhao等，Gene 156207，1995；Pietu等，Genome Res.6492，1996)。
標記也可以是信號產生系統成分，其與一種或多種相同系統其他的成分一起提供可監測的標記。這些標記的示例有特異結合配對成分，如配體，如生物素、螢光素、異羥基洋地黃毒甙元、抗原、多價陽離子、鰲合基團等等，其中該成分特異結合於信號產生系統的其它成分，其中其他成分直接或間接提供可檢測的信號，如結合了螢光部分或能將底物轉化成發色產物的酶部分的抗體，如鹼性磷酸酶結合抗體等等。
其他感興趣的標籤包括那些僅在相連探針特異結合靶分子時提供信號的標籤，其中這些標籤包括「分子燈塔」，如Tyagi & Kramer，Nature Biotechnology 14303，1996和EP 0 070 685 B1所述。其他感興趣的標籤包括那些如美國專利第5,563,037號；WO 97/17471和WO 97/17076所述的標籤。
在一些情況下，在雜交後標記雜交的靶核酸。例如，當標記dNTP的生物素用於諸如擴增或轉錄時，抗生蛋白鏈菌素結合報告基團可用於標記雜交的複合物。
在其它具體實施方式
中，不標記靶核酸。在這種情況下，可用胞質共振來測定雜交，如Thiel等，Anal.Chem.694948，1997所述。
在一個具體實施方式
中，多(如2、3、4、5或更多)套靶核酸被標記並用於雜交反應(「多重」分析)中。例如，一套核酸可與一種細胞或組織樣品的RNA相對應，而另一套核酸可與另一種細胞或組織樣品的RNA相對應。多套核酸可用不同標記來標記，如，具有獨特發色譜的不同螢光標籤，因而可以區分它們。然後混合這些套核酸並將它們同時與微陣列雜交。
雙色螢光標記的應用和確定基因表達改變的檢測方案如Shena等，Science 270467-470，1995所述。利用標記有2種不同螢光基團的cDNA的優點為可直接並有內在對照地比較mRNA水平，該水平與製得的2種細胞狀態中的每個陣列化的基因相對應，而且由於實驗條件(如雜交條件)細微差異造成的變化不會影響接下來的分析。
在雜交大量靶核酸時使用的可分辨標記的例子是公知的，其包括2種或更多種不同發射波長的螢光染料，像Cy3和Cy5，螢光蛋白質和染料的組合，像phicoerythrin和Cy5，2種或更多種具有不同發射能量的同位素，像32P和33P，具有不同散射譜的金或銀顆粒，在不同處理條件產生信號的標記，像溫度、pH、用其他試劑處理等，或在處理後的不同時間點產生信號。基於不同底物特異性的酶(鹼性磷酸酶/過氧化物酶)，使用一種或多種酶產生信號可以有更多種可分辨的標記。
另外，為了減少實驗錯誤，優選在雙色差異雜交實驗中顛倒使用螢光標記以減少偏向個別基因或陣列位置點的偏差。換句話說，優選首先用一種來自兩種測量細胞的mRNA標記(如用第一種螢光色標記來自第一種細胞的核酸並用第二種螢光色標記來自第二種細胞的核酸)來測定基因表達，然後用相反的標記(如，用第二種螢光色標記來自第一種細胞的核酸並用第一種螢光色標記來自第二種細胞的核酸)來測量來自兩種細胞的基因表達。在暴露水平和震蕩對照參數水平以上的多次測量提供了另外的實驗錯誤的對照。
在雜交到陣列之前可評估標記核酸的質量。例如，標記核酸樣品能與探針雜交，該探針衍生自基因的5′、中間和3′部分，該基因已知或懷疑存在於核酸樣品中。這可以指示標記核酸是否是全長的核酸或它們是否降解了。在一個具體實施方式
中，Affymetrix(Santa Clara，CA)的GeneChip
Test3陣列可用於該目的。該陣列包含表示特定基因子集的探針，這些基因來自幾種包括哺乳動物的生物體。所以，標記核酸樣品的質量能通過將一小部分樣品與陣列雜交來確定，如Affymetrix(Santa Clara，CA)的GeneChip
Test3陣列。
6.3.2微陣列分析 用於本發明的優選的陣列，如微陣列，包括基因的一種或多種探針，所述基因為涉及認知功能的候選基因。示例的陣列包括一種或多種用來研究認知功能的感興趣的基因，如那些GeneChip
鼠表達集合230或GeneChip
鼠神經U34陣列上的基因，其包含超過1,200條與神經生物學研究相關的序列(包括激酶、細胞表面的基因)。另外，通過同時跟蹤分布於整個基因組的將近1,500個被稱為單核苷酸多態性(SNP)的基因變體，人們可以使用GeneChip
HuSNPTM陣列來研究整個人的基因組。SNP是很好的基因組搜索標記，因為它們簡單、豐富、廣泛並帶來大多數的人群基因的變化。利用高通量技術，如基因GeneChip
陣列，SNP比諸如微衛星序列的傳統標記更容易跟蹤。
陣列可以包括與至少10，優選至少20，至少50，至少100或至少1000個基因。陣列可以包括與約10％、20％、50％、70％、90％或95％列於圖3的基因或其他微陣列上可用的基因相對應的探針。陣列可以包括與約10％、20％、50％、70％、90％或95％列於圖3的基因相對應的探針，或與其他在細胞中高至少2倍、優選至少3倍、更優選至少4倍、5倍、7倍並最優選至少約10倍表達的基因相對應的探針。一個所用的示例優選陣列為實施例中所用和所述的陣列。
可有一種或多於一種探針與微陣列上的每一個基因相對應。例如，微陣列可以包括2至20個探針與一個基因相對應，並優選約5至10個。探針可與基因的全長RNA序列或其互補序列相對應，所述基因特徵為疾病候選基因，或它們可與其一部分相對應，所述部分足夠長足以允許特定雜交。這些探針可包括約50個核苷酸至約100、200、500或1000個核苷酸或超過1000個核苷酸。如此處進一步所述的，微陣列可進一步包含寡核苷酸探針，其由約10至50個核苷酸組成，優選約15至30個核苷酸並更優選20-25個核苷酸。探針優選為單鏈。探針與其靶有足夠的互補性，從而提供序列特異性雜交所預期的水平(見下文)。
典型地，本發明所用的陣列具有每cm2大於100個不同探針的位點密度。優選地，陣列具有每cm2大於500個的位點密度，更優選大於約1000/cm2，最優選大於約10,000/cm2。優選地，陣列在單個片基上有大於100個不同的探針，更優選大於約1000個不同的探針，更優選大於約10,000個不同的探針並最優選在單個片基上有大於100,000個不同的探針。
如下所述，通過現有已知的方法來製備微陣列，或由公司來定製它們，如Affymetrix(Santa Clara，CA)。
一般而言，可用兩種類型的微陣列。這兩種類型被稱為「合成」和「遞送」。在合成類型中，通過用核苷酸原位合成核酸逐步製備微陣列。在每一輪合成中，加入核苷酸生成鏈，直至獲得所期望的長度。在微陣列的遞送類型中，用各種遞送技術將製成的核酸放在已知位置上。大量文獻描述了不同的微陣列技術，如，Shena等，Tibtech 16301，1998；Duggan等，Nat.Genet.2110，1999；Bowtell等，Nat.Genet.2125，1999。
Affymetrix(Santa Clara，CA)開發了一種新的合成技術，其將照相平版印刷技術與DNA合成化學結合在一起從而能生產高密度的寡核苷酸微陣列。這些晶片在約1.6cm2面積中包括多至400,000組寡核苷酸。寡核苷酸以其3′端的錨定來最大化單鏈核酸雜交的有效性。這些被稱為「GeneChip
」的晶片一般包括特定基因的幾個寡核苷酸，如，在15-20之間，如16個寡核苷酸。由於Affymetrix(Santa Clara，CA)出售定製的微陣列，所以包含能上或下調認知功能障礙的基因的微陣列能從Affymetrix(Santa Clara，CA)處訂購。
也能通過機械微點樣來製備微陣列，如Synteni(Fremont，CA)商業化的那些。根據這些方法，少量核酸可印在固相表面上。Synteni製備的微點樣陣列在約3.6cm2面積中包含多至10,000組cDNA。
第三組微陣列技術為″按需點滴″遞送方法，最先進的噴墨技術，其利用壓電和其他推進形式來把核酸從小管中傳送到固相表面上。有幾個中心開發了噴墨技術，包括Incyte Pharmaceuticals(Palo Alto，CA)和Protogene(Palo Alto，CA)。該技術形成10,000個點/cm2的密度。也可參見Hughes等，Nat.Biotechn.19342，2001。
陣列優選包括對照和參照核酸。對照核酸為能用於顯示雜交有效的核酸。例如，所有的Affymetrix(Santa Clara，CA)表達陣列包含幾種原核基因的探針集，如，E.coli生物素合成中的bioB、bioC和bioD以及P1噬菌體的cre。在這些基因或其部分的混合物存在的情況下進行與這些陣列的雜交，如Affymetrix(Santa Clara，CA)提供的有該效果的混合物(部分號900299)，其能驗證雜交的有效性。包括靶核酸的對照核酸也能是用體外轉錄從cDNA克隆合成的mRNA。其它可包括在陣列中的對照基因為聚A對照，如dap、lys、phe、thr和trp(其包括在Affymetrix的GeneChip
上)。
參照核酸能將一個實驗與另一個實驗的結果標準化，並在定量的水平上比較多個實驗。示例的參照核酸包括已知表達水平的內務基因，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、己糖激酶和肌動蛋白。
也可為靶基因的探針、表達水平對照或標準化對照提供錯配對照。除了存在一種或多種錯配對照之外，錯配對照可為寡核苷酸探針或其他與其相應測試或對照探針一樣的核酸。
陣列也可包含能與基因的大於一個的等位基因雜交的探針。例如陣列能包含一個識別特定基因等位基因1的探針和另一個識別等位基因2的探針。
微陣列能如下製備。在一個具體實施方式
中，寡核苷酸陣列在固相支持物上合成。示例的固相支持物包括玻璃、塑料、聚合物、金屬、非金屬、陶瓷、有機物等。利用晶片遮蓋技術和光保護化學，可能產生有序的核酸探針陣列。這些陣列，其被稱作諸如「DNA晶片」或非常大量的固定聚合物陣列(″VLSIPSTM″陣列)，它們能在約1cm2至幾cm2面積的片基上包括數百萬確定的探針區域，在其上整合了少量至數百萬探針的集合(如參見，美國專利第5,631,734號)。
構建固相核酸陣列以檢測靶核酸已有文獻描述了。參見Fodor等，Science，251767-777，1991；Sheldon等，Clinical Chemistry 39(4)718-719，1993；Kozal等，Nature Medicine 2(7)753-759，1996和Hubbell美國專利第5,571,639號；Pinkel等PCT/US95/16155(WO96/17958)；美國專利第5,677,195；5,624,711；5,599,695；5,451,683；5,424,186；5,412,087；5,384,261；5,252,743和5,143,854號；PCT專利公開號92/10092和93/09668；和PCT WO 97/10365。簡言之，組合策略允許利用最少的合成步驟來合成包含大量探針的陣列。例如，僅用32步化學合成步驟就可能合成並吸附所有可能的DNA 8聚寡核苷酸(48或65,536種可能的組合)。一般而言，VLSIPSTM過程僅利用4n步合成步驟就提供了一種在陣列上產生4n個不同寡核苷酸探針的方法(如參見，美國專利第5,631,734；5,143,854號和PCT專利公開號WO 90/15070；WO 95/11995和WO 92/10092)。
在玻璃上光指示組合合成的寡核苷酸陣列能用自動磷酯醯氨化學和晶片遮蓋技術來進行，該技術與在計算機晶片產業中的光刻技術相似。典型地，玻璃表面用包含功能基團的矽烷試劑來衍生化，如由光敏保護基團保護的羥基或胺基。光分解作用通過照相平版遮蓋選擇性地用於暴露功能性基團，然後其迅速與引入的5′-光保護核苷磷酯醯氨來反應。磷酯醯氨只在照亮的那些位點反應(所以用去除光敏保護基團來曝光)。所以，磷酯醯氨僅加到前一步驟選擇曝光的那些區域。重複這些步驟，直至在固相表面上合成出預期的序列陣列。
設計遮蓋以減少合成循環次數的算法如Hubbel等，美國專利第5,571,639號和美國專利第5,593,839號所述。如美國專利第5,571,639號所述，計算機系統可用於選擇在片基上的核酸探針並設計陣列排布。
另一種合成高密度陣列的方法如美國專利第6,083,697號所述。通過使用輻射起始的催化系統，該方法利用了新的化學擴增過程從而輔助合成多聚物序列。該方法包括使用光敏化合物，其用作催化劑以促進多聚物序列形成的方式來化學改變合成的中間體。該光敏化合物包括一般被稱為輻射活化的催化劑(RAC)化合物，和更特異的光活化催化劑(PAC)。RAC本身能化學改變合成中間體或它們能活化自催化化合物，其能以合成中間體與後加的合成中間體或其他化合物結合的方式來化學改變合成中間體。
通過向機械限制流徑的支持物上的細胞遞送單體來以組合的方式合成陣列。參見Winkler等，EP 624,059。也可通過用噴墨印表機將單體試劑點樣到支持物上來合成陣列。參見Pease等，EP 728,520。
根據現有技術和此處進一步描述的方法來製備cDNA探針，如用序列特異性引物來進行RNA的反轉錄PCR(RT-PCR)。能化學合成寡核苷酸探針。可從諸如GenBank、其他公共資料庫或文獻來獲得製備探針的基因或cDNA的序列。
核酸探針可以是天然的核酸，化學修飾的核酸，如，包含核苷酸類似物，只要它們具有活化的符合連接化學的羥基。保護基團本身可以是對光不穩的。可選地，保護基團在某些化學條件下可以是不穩定的，如酸。在該示例中，固相支持物的表面能包含依曝光而能產生酸的組合物。所以，片基區域的曝光在該區域產生了酸，在曝光區域去除了保護基團。而且合成方法能用3′-保護的5′-0-磷酯醯氨-活化的脫氧核酸。在該情況下，以5′至3′方向合成寡核苷酸，形成了自由的5′端。
用能製造成千寡核苷酸的96孔自動多路寡核苷酸合成儀(A.M.O.S.)來合成陣列上的寡核苷酸(Lashkari等，PNAS 937912，1995)。
可以理解通過有目的的應用來影響寡核苷酸設計。例如，所有探針期望可具有相似的熔融溫度。因此，調節探針的長度從而使陣列上所有探針的熔融溫度都很近似(可以理解在不同探針具有不同GC含量的情況下，需要不同探針的不同長度來獲得特定的T[m])。儘管在探針設計中熔融溫度為基本要考慮的內容，但其他因素任選用於進一步調節探針的構建，如選擇抗引物自互補等。
陣列，如微陣列，可以在為以後應用而製備或購買後方便地儲存。在合適的條件下，特定陣列能儲存至少約6個月並可以儲存多至1年或更長。陣列一般儲存於約-20℃至室溫之間的溫度下，而陣列優選封存於諸如袋的塑料容器中並避光。
6.3.3將靶核酸與微陣列雜交 下一步是在足以使靶核酸與陣列的探針結合的條件下，將靶核酸與陣列接觸。在有選的具體實施方式
中，在足以使靶核酸與陣列上的探針發生雜交的條件下，將靶核酸與陣列接觸靶核酸，選擇雜交條件從而提供與其水平的雜交特異性。
陣列與靶核酸的接觸包括用包含靶核酸的水介質與陣列接觸。根據特定的陣列構型以各種不同的方式來獲得接觸。例如，當陣列只包括「平皿狀」剛性片基表面上的大小分離式探針，可通過僅僅將陣列放在含靶核酸溶液的容器裡來完成接觸，如聚乙烯袋等。在其它具體實施方式
中，當陣列放入2個剛性平皿包圍的分離介質中時，就存在通過電泳法遞送靶核酸的機會。可選地，當陣列裝入具有流體入口和出口端的生物晶片設備中時，能將靶核酸溶液導入到小室中，在該小室中通過入口端引入靶分子樣品，可以手動或用自動設備來進行流體導入。在多孔的具體實施方式
中，靶核酸溶液導入到包含陣列的反應室中，可以手動進行，如用吸液管，或用自動流體處理設備。
靶核酸溶液和探針的接觸將保持足夠的時間以使靶和探針發生結合。儘管要依賴探針和靶的性質，接觸一般要保持從約10分鐘至24小時的時間，通常約30分鐘至12小時，更通常為約1小時至6小時。
當使用商品化的微陣列時，由生產商提供足夠的雜交條件。當使用非商品化的微陣列時，根據以下雜交指導以及大量關於使用微陣列的公開文獻所述的雜交條件來確定足夠的雜交條件。
選擇最優的核酸雜交和洗滌條件從而使探針「特異地結合」或「特異地雜交」於特定的陣列位點，即探針雜交、複合或結合於具有互補核酸序列的序列陣列的位點上，但不雜交於非互補核酸序列的位點上。此處所用的一個聚核苷酸序列被認為與另一個互補，這時，如果較短的聚核苷酸小於或等於25個鹼基時，則利用標準鹼基配對規則就可使得沒有錯配存在，或者如果較短的聚核苷酸大於25個鹼基時，則有不超過5％的錯配。優選地，聚核苷酸是完全互補的(沒有錯配)。能容易地證實通過進行包括陰性對照的雜交試驗，能使特定雜交條件導致特定的雜交。
在允許基本特異性雜交的條件下進行雜交。探針長度和GC含量決定了雜交的Tm，所以雜交條件對要獲得探針對模板核酸特異性雜交來說是必要的。這些因素對於所屬領域技術人員來說是公知的，並也能在試驗中測試。大量的核酸雜交指南可在Tijssen(1993)，″Laboratory Techniques in biochemistry and molecularbiology-hybridization with nucleic acid probes″中發現。一般而言，選擇的嚴謹條件比在特定離子強度和pH下特定序列的熱熔點(Tm)低約5℃。Tm指(在特定離子強度和pH下的)溫度，在該溫度下50％的靶序列全匹配的探針雜交。選擇的高嚴謹條件等與特定探針的Tm點。有時術語″Td″用於定義溫度，在該溫度下至少一半探針從完全匹配的靶核酸上解離下來。在任何情況下，可用大量估計Tm或Td的預估技術，其一般如在前的Tijssen所述的。典型地，預計雙鏈形式的G-C鹼基對比Tm高3℃，而預計A-T鹼基對高約2℃，理論上最大值至多約80-100℃。可是，有更複雜的Tm和Td模型可用，其適於解釋G-C堆積作用、溶劑效應、預計試驗溫度等。例如，可將探針設計成具有解離溫度(Td)為約60℃，可使用以下公式設計Td＝(((((3x#GC)+(2x#AT))x37)-562)/#bp)-5；其中#GC、#AT和#bp分別為涉及探針與模板DNA退火中的鳥嘌呤-胞嘧啶鹼基對數、腺嘌呤-胸腺嘧啶鹼基對數和總鹼基對數。
完全匹配的二聚體和錯配的二聚體之間的穩定性差異可能是相當小的，尤其在僅有一個鹼基錯配時，兩者之間的相互差異小至0.5度(參見，Tibanyenda，N.等，Eur.J.Biochem.13919，1984和Ebel，S.等，Biochem.3112083，1992)。更重要的是，能理解當同源區域的長度增加時，對於整個二聚體穩定性，單個鹼基錯配的效應減少了。
核酸雜交的理論和實踐如S.Agrawal(編)Methods in MolecularBiology，第20卷；和Tijssen(1993)″Laboratory Techniques inbiochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acidprobes″中所述，並如″Overview of principles of hybridization and thestrategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，紐約的第二章第I部分提供了對核酸雜交的基礎指導。
某些微陣列有「活性」性質，即，它們提供了發生在每個特定微位置上的雜交反應(或任何其他親和性反應)所有方面的獨立控制。這些設備提供了一種新的影響雜交反應的機制，其被稱為電子嚴謹控制(ESC)。這些活性設備能在每個微位置上電子化地產生「不同的嚴謹條件」。所以，最好能在相同的混合溶液中進行所有雜交。這些測試如Sosnowski等，美國專利第6,051,380號所述。
在優選的具體實施方式
中，在雜交期間，利用去汙劑(如C-TAB)或阻斷劑(如精子DNA、cot-1 DNA等)來減少背景信號從而減少非特異性結合。在特別優選的具體實施方式
中，在約0.5mg/ml DNA(如青魚精子DNA)中進行雜交。雜交中使用阻斷劑對所屬領域技術人員來說是公知的(如參見，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，第24卷Hybridization With Nucleic Acid Probes，P.Tijssen，編Elsevier，N.Y.，(1993)的第8章)。
根據靶核酸上使用的特定標記，該方法在檢測步驟前可再或不進一步包含未結合標記去除的步驟。例如，在某些測試形式(如″同源測試形式″)中，僅在與探針特異結合的靶上產生了可檢測信號。如此，在這些測試形式中，不需要未結合標記去除的步驟就可檢測雜交形式。在其它具體實施方式
中，使用的標記可產生信號，而無論靶是否與其探針特異結合，在這些具體實施方式
中，未結合標記的靶從支持物表面上去除。去除未結合標記的靶的一種方法是進行公知的洗滌技術，其中為去除未結合標記的靶而使用的各種洗滌溶劑和規程是所屬領域技術人員公知的，並可以使用。可選地，用電泳法去除未結合標記的靶。
當用相同標記檢測所有靶序列時，為每種生理來源使用不同的陣列(其中可包括在不同時間使用相同陣列)。通過為不同的靶群體(代表試驗的每個不同生理來源)使用不同的和可分辨的標記，以上方法可改變以提供多重分析。按照多重方法，同時為每個不同的靶群體使用相同的陣列。
在另一個具體實施方式
中，利用電荷偶聯設備(CCD)成像照相機來實時監視雜交(Guschin等，Anal.Biochem.250203，1997)。在光纖維束上合成陣列使讀數變得簡單和靈敏(Healy等，Anal.Biochem.251270，1997)。在另一個具體實施方式
中，利用僅激活結合在表面上的螢光基團的隱失波效應，在微陣列上進行實時雜交檢測，而不需要洗滌(如參見，Stimpson等，PNAS 926379，1995)。
6.3.4檢測雜交的核酸和分析微陣列的結果 以上步驟導致在陣列表面上產生出靶核酸的雜交形式。用基於靶核酸特定標記而選擇的特定檢測形式以各種方式檢測或使這些形式可視化。代表性的檢測方法包括閃爍計數，放射自顯影，測量螢光，比色測定，測量光發射、光散射等等。
一種檢測方法包括陣列掃描儀，其商品可從Affymetrix(SantaClara，CA)處獲得，如417TM陣列儀、418TM陣列掃描儀或AgilentGeneArrayTM掃描儀。該掃描儀由裝有WindowsR界面和易用軟體工具的系統計算機來控制。輸出是16-bit位的.tif文件，其能直接輸入或直接以各種應用軟體來讀取。優選的掃描設備如美國專利第5,143,854和5,424,186號所述。
當使用螢光標記的探針時，用掃描共聚焦雷射顯微鏡檢測轉錄陣列每個位點上的螢光發射。在一種具體實施方式
中，使用合適的激發線路，可為所用的2個螢光基團中的每一個各自進行掃描，可選地，可用雷射使得在兩個特異於2個螢光基團的波長處同時使標本發光並同時分析2個螢光基團發出的光(參見Shalon等，Genome Research 6639-645，1996)。在優選的具體實施方式
中，用雷射螢光掃描儀和可控制X-Y相的計算機和顯微鏡來掃描陣列。用多線路、混合氣體雷射器獲得2個螢光基團的連續激發並通過波長分開發射光並用光電倍增管來檢測。在一個使用了螢光靶核酸的具體實施方式
中，用雷射器激發螢光標記的靶來掃描陣列，其中靶與探針陣列區域雜交，然後用電荷偶聯設備(″CCD″)對大範圍陣列掃描成像。螢光雷射掃描設備如上述Schena等所述。可選地，光纖維束如Ferguson等，Nature Biotech.141681-1684，1996所述，其可用於監視mRNA豐度水平。
在數據收集操作後，數據一般進行數據分析操作。為輔助樣品分析操作，設備讀數器讀出的數據一般用數字計算器來分析。典型地，計算機會有合適的程序接受並儲存設備的數據並分析和報告收集的數據，如，背景的減少，多色圖像的去卷積，標記或去除人工產物，適當校驗對照，標準化信號，解釋螢光數據從而確定雜交靶的量，標準化背景和單鹼基錯配雜交，等等。在優選的具體實施方式
中，系統包含了檢索功能，使人們檢索特定模式，如，與差異基因表達相關的模式，如在患有認知功能障礙的病人樣品的表達譜和相應正常個體表達譜之間的。系統優選能使人們檢索超過2個樣品間的基因表達的模式。
需要分析數據的系統為可視、可處理並可分析基因表達數據的普通、靈活的系統。這種系統優選包括瀏覽和操作表達數據的圖形用戶界面，其使用戶選擇性地觀看和突出顯示感興趣的基因。系統也優選包括排序和檢索功能並優選可為普通用戶所用，其可安裝PC，Mac或Unix工作站。系統中也優選包括聚類算法，其在質量上比現有的更有效。優選分級調節這種算法的精度，從而使聚類的詳細水平能按需有系統地精選。
可用大量算法分析基因表達譜的數據，如，進行類型比較。在一些具體實施方式
中，按需把共調解的基因分組。這就能比較大量譜了。鑑定這些基因組別的優選具體實施方式
包括聚類算法(對於聚類算法的綜述，如參見，Fukunaga，1990，Statistical Pattern Recognition，第2版，Academic Press，San Diego；Everitt，1974，Cluster Analysis，LondonHeinemann Educ.Books；Hartigan，1975，ClusteringAlgorithms，紐約Wiley；Sneath和Sokal，1973，NumericalTaxonomy，Freeman；Anderberg，1973，Cluster Analysis forApplications，Academic Press紐約)。
聚類分析用於幫助減少複雜的成千時間曲線模式，減少成較少的有代表性的聚類。一些系統允許基於序列的基因的聚類化和可視化。其他系統允許基於其他基因特徵的聚類化，如，它們的表達水平(如參見，美國專利第6,203,987號)。其他系統允許時間曲線的聚類化(如參見，美國專利第6,263,287號)。用hclust規則進行聚類分析(如參見，軟體包S-正的″hclust″規則，MathSoft，Inc.，Cambridge，Mass.)。
在一些特定的具體實施方式
中，按照它們轉錄的共變化程度，大概為共調節，來進行基因分組，如美國專利第6,203,987號所述。具有共變化轉錄體的基因組別的術語稱為「基因集」。聚類分析或其他統計分類方法能用於分析與各種混亂體系相對應的基因轉錄的共變化，如，由疾病或藥物造成的。在一個特定的具體實施方式
中，聚類算法應用於表達譜來構建「相似樹」或」聚類樹″，其與由所顯示共調節量決定的基因相關。基因集定義處於聚類樹的分枝上，通過了分枝層次中不同水平的聚類樹。
在一些具體實施方式
中，基因表達譜轉變成投射狀的基因表達譜。投射狀的基因表達譜集中了基因集表達的值。在一些具體實施方式
中，通過在每個基因集中平均化基因的表達水平來獲得該轉變。在另一些具體實施方式
中，可使用其他線性投射過程。投射操作表示在較小和更有生物學意義的坐標集上的譜，通過在每個細胞成分集中平均化其來減少測量錯誤的效應並幫助譜的生物學解釋。
能比較的值包括整體表達水平；平均表達水平，如，其可來自不同實驗、相同個體的不同樣品或不同個體的樣品；以及表達水平率。
6.3.5微陣列的數據分析方法 優選用計算機系統將一種或多種能上調認知功能障礙抑制的基因的表達水平與沒有認知功能障礙抑制的參考表達水平作比較，如，患有疾病或正常個體的表達水平。在一個具體實施方式
中，能從2個樣品中獲得一種或多種表達水平，而這2個表達水平集導入計算機系統進行比較。在一個優選的具體實施方式
中，一個一種或多種表達水平的集合導入計算機系統與計算機系統中已有的值進行比較，或者導入計算機可讀形式中以後再導入計算機系統。
在一個具體實施方式
中，本發明提供了本發明基因表達譜數據或至少一個能上調個體中認知功能障礙抑制的基因的表達水平對應值的計算機可讀形式。值可以是實驗中獲得的mRNA表達水平，如，微陣列分析。值也可以是相對於參考基因標準化的mRNA表達水平，其表達在多種條件下的多種細胞中為恆定的，如，GAPDH。在其它具體實施方式
中，計算機中的值為不同樣品中標準化或未標準化mRNA水平間的比率或差異。
計算機可讀介質可包含至少2、至少3、至少5、10、20、50、100、200、500或更多個基因的值。在一個優選的具體實施方式
中，計算機可讀介質包含至少一個表達譜。
基因表達數據可以是表格的形式，如Excel表格。數據可以是單獨的或其可以是較大資料庫的一部分，如可包含其他表達譜，如公共用的資料庫。計算機可讀形式可以位於計算機中。在另一個具體實施方式
中，本發明提供能顯示基因表達譜數據的計算機。
本發明提供兩種或多種細胞或組織樣品中可比較單個基因表達水平的方法。在一些具體實施方式
中，可比較多個基因的表達水平。例如，至少2、至少3、至少5、10、20、50、100、200、500或更多個基因的表達水平。在具體實施方式
中比較表達譜。
在一個具體實施方式
中，本發明提供確定能上調認知功能障礙抑制的一種或多種基因的表達水平間相似性的方法。方法優選包括在第一個樣品中獲得能上調認知功能障礙抑制的一種或多種基因的表達水平，並將這些值輸入計算機，所述計算機包括(i)包含記錄的資料庫，該記錄包含未處理的對照樣品中一種或多種基因表達水平的相應值，以及(ii)處理器指令，如用戶界面，其能接受選擇一個或多個值來與儲存在計算機中的數據進行比較。計算機可進一步包含將比較數據轉化成圖或表或其他輸出形式的工具。
在一個具體實施方式
中，本發明提供一種系統，其包含接收一個或多個基因的基因表達數據的工具；將所述一個或多個基因之一的基因表達數據與普通參考框架進行比較的工具；以及呈現比較結果的工具。該系統可進一步包含聚類數據的工具。
在另一個具體實施方式
中，本發明提供一種分析基因表達數據的電腦程式，其包括(i)接收多個基因的基因表達輸入數據的計算機編碼以及(ii)將所述多個基因之一的所述基因表達數據與普通參考框架進行比較的計算機編碼。
本發明也提供了一種機器可讀的或計算機可讀的介質，其包括進行如下步驟的程序說明(i)將查詢細胞中能上調NMD抑制的一個或多種基因表達水平的多個相應值與包含一個或多種參考細胞的參考表達記錄和細胞類型注釋的資料庫進行比較；以及(ii)在表達水平相似性基礎上，顯示與查詢細胞最相似的細胞。
2個生物樣品中的相對表達水平，如mRNA豐度，能被計分為混亂度(相對豐度有差異)或不混亂的(即，相對豐度是相同的)。例如，混亂度可以是2種來源的RNA間表達水平的差異因子約為25％(1種來源的RNA比另一來源的豐度高25％)，更通常約50％，更通常的因子約2(2倍豐度)，3(3倍豐度)或5(5倍豐度)。混亂度能用計算機來計算並表示比較結果。
優選地，除了將混亂度鑑定為正或負的，確定混亂度的大小是有益的。如上所述，通過計算差異標記所用的2種螢光基團的發射率，或所屬領域技術人員顯而易見的類似方法，來進行這個。
計算機可讀介質可進一步包含表達水平或表達譜標示符的指針，如從哪個來源獲得的，如從哪個病人獲得的。標示符能反映疾病期、病人接受的治療或任何其他表達水平來源的說明。
操作中，文中本發明系統的接收基因表達數據的工具、比較基因表達數據的工具、顯示工具、標準化工具和聚類工具能包括一個帶有此處所述各個功能的編程計算機，其帶有硬體或硬體和軟體；能在此進行特異性鑑定操作的邏輯電路或編程計算機的其他成分，其由電腦程式控制；或編碼了可執行指令的計算機儲存器，這些指令代表了電腦程式，能使計算機以此處所述的特定方式來起作用。
所屬領域技術人員會理解本發明的系統和方法可應用於各種系統，包括運行MS-DOS或Microsoft Windows的IBM-兼容個人電腦。另外，個人電腦會有所有與該系統相關的硬體或軟體成分從而用戶會有可能的存儲器、網絡連接、列印能力和各種計算機語言的編程能力。有了合適的計算機系統，用戶首先能往計算機系統中裝載表達譜數據，美國專利第6,203,987號。基因集譜的定義裝載入存儲介質或遠程計算機的存儲器中，優選通過網絡載入動態基因集資料庫系統。接著用戶運行投射軟體，進行將表達譜轉化成投射表達譜的步驟。然後顯示投射表達譜。
在另一個示例的實施方案中，用戶首先將投射譜導入儲存器。然後用戶將參考譜導入儲存器。接下來，用戶運行比較軟體，進行客觀比較譜的步驟。
7.篩選能促進或保持認知功能的化合物 通過本發明指導，利用本發明的體外和體內篩選方法能鑑定調節與認知功能相關的基因表達的試劑。
本發明提供了鑑定用於促進或保持哺乳動物認知功能的試劑的方法，如，鼠和人。在一個方面，篩選方法包括進行鑑定試劑的方法，所述試劑能調節編碼穀氨酸轉運蛋白的基因的表達或調解由該基因編碼的穀氨酸轉運蛋白的活性，如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4或EAAT5。為了簡化，以下所寫的″EAAT″指EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5中的每一個，指包括所有基因/蛋白質的組，並指所有小組組合(如，EAAT1和EAAT2)。可選地，篩選方法包括進行鑑定試劑的試驗，所述試劑能調節天冬氨酸氨基轉移酶的表達。
許多不同篩選規程可用來鑑定試劑，所述試劑能調節哺乳動物細胞中的EAAT和/或天冬氨酸氨基轉移酶的表達水平(如鼠細胞、非人靈長類細胞或人細胞)。一般而言，篩選方法包括篩選多種試劑(「測試試劑」)來鑑定能改變EAAT活性或水平的試劑，可通過諸如但不限於，結合到EAAT多肽，阻止抑制劑與EAAT多肽結合，或增加EAAT基因的表達。另外，篩選方法包括篩選多種試劑來鑑定能改變天冬氨酸氨基轉移酶活性或水平的試劑，可通過諸如但不限於，結合到天冬氨酸氨基轉移酶多肽，阻止抑制劑與天冬氨酸氨基轉移酶多肽結合，或增加天冬氨酸氨基轉移酶基因的表達。
「測試試劑」包括各種普通類型的化合物，其包括但不限於，小有機分子、已知藥物、多肽；碳水化合物，如寡糖和多糖；聚核苷酸；脂或磷脂；脂肪酸；類固醇或胺基酸類似物。可從文庫中得到測試試劑，如天然產物文庫和組合文庫。許多不同類型的文庫可從商業渠道獲得而且製備文庫的方法如PCT公開WO 93/06121，WO 95/12608，WO 95/35503，WO 94/08051和WO 95/30642所述。另外，已知自動測試的方法能允許短期內篩選幾千種化合物。
某些篩選方法包括篩選能增加細胞中EAAT和/或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白表達或活性的化合物。這些方法能包括進行基於細胞的測試，其中將測試化合物與一種或多種表達EAAT基因或蛋白質的細胞接觸，然後檢測EAAT表達(如EAAT的RNA水平)或活性的改變。另一種方法包括進行基於細胞的測試，其中將測試化合物與一種或多種表達天冬氨酸氨基轉移酶基因或蛋白質的細胞接觸，然後檢測天冬氨酸氨基轉移酶表達(如天冬氨酸氨基轉移酶的RNA水平)或活性的改變。所以，在具體實施方式
中，方法包括將細胞與測試試劑接觸並確定在有測試試劑存在的情況下，基因的表達水平是否改變，其中表達的改變(如增加)顯示測試試劑能用於促進或保持認知功能。能在體外、體內或離體接觸細胞。典型地，相對於缺少測試化合物的表達，表達增加至少約10％、至少約20％、至少約50％、至少約75％或至少約100％。
在具體實施方式
中，本發明提供一種篩選試劑以確定其能用於減少認知功能障礙的方法，該方法通過提供能表達穀氨酸轉運蛋白或哺乳動物神經細胞所表達的天冬氨酸氨基轉移酶基因的細胞，將細胞與測試試劑接觸；並在存在測試試劑的情況下，確定穀氨酸轉運蛋白(如EAAT1、EAAT2、EAAT3、EAAT4和EAAT5之一種或多種)和/或天冬氨酸氨基轉移酶(AT)的活性或表達水平是否增加了，其中該增加顯示了測試試劑能用於促進或保持認知功能。通過已知技術來評估表達，包括檢測EAAT或AT mRNA比率或豐度的改變。穀氨酸轉運蛋白的蛋白質活性能由現有方法來評估，包括測定3H-穀氨酸攝入細胞的攝入量(Lin等，Nature 41084-88，2001)。天冬氨酸氨基轉移酶蛋白質活性能由現有方法來評估，包括在存在NADH的情況下的蘋果酸脫氫酶的偶聯反應(Karmen，J Clin Invest 34131，1955；Amador和Wacker，Clin Chem 8343，1962)。
通常該測定包括比較相對於相似細胞或沒有接觸測試化合物的細胞(即對照細胞)的測試細胞中的活性或表達。在相關的具體實施方式
中，測試化合物給藥給多細胞生物(如動物)。EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶成分可以完全是細胞或多細胞生物內源產生的，或可以是重組細胞或轉基因生物的，其中包含一種或多種重組表達的EAAT和/或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白。利用公開的基因和蛋白質序列以及常規方法來表達重組的EAAT和/或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白(如參見，Ausubel等，Current Protocols In Molecular Biology，GreenePublishing and Wiley-Interscience，紐約(2002年重版))。
利用表達EAAT和/或天冬氨酸氨基轉移酶基因的細胞類型可以進行試驗，在各種具體實施方式
中，包括培養的細胞(如基本培養基上的細胞或建立的細胞系)和體內細胞。示例的細胞包括神經元、神經膠質細胞、混合的神經培養劑或細胞，在所述細胞中EEAT和/或天冬氨酸氨基轉移酶基因的表達是由重組表達所誘導的。這些細胞(如基本培養基)可從胚胎海馬中獲得。許多其他合適的細胞或細胞系對從業人員來說是已知的。
試劑對細胞中或體外系統中EAAT和/或天冬氨酸氨基轉移酶基因表達的影響能與基線值作比較，基線值一般是沒有測試試劑的細胞或體外系統的表達水平。也可以為不表達EAAT和/或天冬氨酸氨基轉移酶的細胞確定表達水平，定作陰性對照。另外，這些細胞一般與測試細胞具有實質上相同的遺傳性質。
其他基於細胞的測試有報告測試，其不必用表達EAAT和/或天冬氨酸氨基轉移酶的細胞來進行。這些測試中的某些用異源核酸構建體來進行，該構建體包括EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶基因啟動子，該啟動子可操作地與編碼可檢測產物的報告基因相連。EAAT基因啟動子在大多數情況下位於轉錄起始位點上遊(或5′)約300至1000 bp的區域中，例如Su等，PNAS 1001955-1960，2003所述的。天冬氨酸氨基轉移酶基因啟動子在大多數情況下位於轉錄起始位點上遊(或5′)約300至1000 bp的區域中，例如Obaru等，J Mol Biol.20013-22，1988所述的。某些EAAT和天冬氨酸氨基轉移酶基因啟動子如GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和科學文獻所述。能用許多不同的報告基因。示例的報導基因包括綠色螢光蛋白、J-葡糖苷酸酶、氯黴素乙醯基轉移酶、螢光素酶、J-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶等等。在這些測試中，帶有報告構建體的的細胞與測試化合物接觸。測試化合物使得可檢測的報告基因表達，所述化合物是要麼通過與之結合而活化啟動子或引發級聯反應產生活化啟動子的分子。各種不同類型的細胞可用於報告測試中(如真核細胞，如酵母、COS、CHO、HepG2和HeLa細胞系)。
鑑定能增加EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白質活性的試劑也可包括篩選能結合EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白質的化合物，至少一些這樣鑑定出的化合物可能是EAAT或冬氨酸氨基轉移酶的調節因子。在這些篩選中鑑定的前導化合物能用作合成更具活性的類似物的基礎。所以，在一個方面，本發明提供了一種篩選試劑以確定其用於減輕認知功能障礙的方法，該方法通過(a)將EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶基因編碼的多肽或表達這種多肽的細胞與測試化合物接觸，和(b)確定多肽是否與測試化合物結合。這種結合顯示了測試試劑能用於減輕認知功能障礙。結合試驗通常包括將EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶多肽與一種或多種測試化合物接觸並給予足夠的時間使蛋白質和測試化合物形成結合複合體。確定測試化合物直接結合EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶多肽的能力，可通過諸如將化合物於放射性同位素或酶標記偶聯來完成，從而通過檢測複合物中標記的EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶多肽來確定化合物與EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶多肽的結合。用大量已確立的任何分析技術來檢測形成的任何結合複合物。蛋白質結合試驗包括但不僅限於測量共沉澱、在非變性SDS聚丙烯醯胺凝膠上共轉移以及Western印跡上共轉移的方法(如參見，E.C.Hulme，1992，A Practical Approach/The Practical Approach Series(Series Eds D.Rickwood和BD Hames)中的″受體-配體相互作用″，IRL Press at Oxford University Press)。用於這些試驗的EAAT(或天冬氨酸氨基轉移酶)多肽可以是純化的或重組的。如上所指出的，EAAT(或天冬氨酸氨基轉移酶)蛋白質的重組表達和純化能用常規方法來完成。
EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白能在體內與一種或多種細胞和細胞外分子(如，但不僅限於，肽、蛋白質、激素、協同因子和核酸)相互作用，這些分子在此被稱為「結合體」。已知有方法來鑑定其天然的EAAT體內結合體，如雙和三雜交試驗(如參見。美國專利第5,283,31號；Zervos等，1993，Cell 72223-232；Madura等，1993，J.Biol.Chem.26812046-12054；Bartel等，1993，Biotechniques 14920-924；Iwabuchi等，1993 Oncogene 81693-1696；BrentW094/10300)。這些EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白質結合體可涉及由EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白或EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白介導信號途徑的下遊元件所造成的信號傳遞，或可選地，發現可以是EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白的抑制劑。通過本發明的應用可設計現有測試用以鑑定能調節(如，如正向或負向影響)EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白質及其結合體之間相互作用的化合物。典型地，能干擾EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白質及其結合體之間相互作用的化合物的試驗包括製備包含EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白質及其結合體的反應混合物，在一定條件下並給予足夠的時間使2種產物相互作用並結合，進而形成複合物。為了測試試劑的抑制能力，在存在和缺少測試化合物的情況下製備反應混合物。在本發明的範圍內也包括直接檢測的方法，該方法無需進一步樣品處理就在同質或異質性試驗中檢測EAAT或天冬氨酸氨基轉移酶蛋白質及其天然結合體和/或測試化合物之間的相互作用。例如，可用螢光能量轉移技術(如參見，Lakowicz等，美國專利第5,631,169號；Stavrianopoulos等，美國專利第4,868,103號)。
在一個方面，上述試驗鑑定的試劑可以給藥給實驗動物以測定它們認知促進和保持活性(如參見以下實施例)。
在一個方面，本發明描述了一種篩選用於促進哺乳動物認知功能的化合物的方法，通過向哺乳動物給藥測試化合物，在給藥所述測試化合物後，確定哺乳動物中一種或多種EAAT或AT基因的表達水平，將基因的表達水平與沒有給藥測試化合物的哺乳動物神經組織中的參考表達水平進行比較，並確定基因表達水平與相應參考水平的差異，其中差異顯示了測試化合物為促進認知功能的候選治療劑。方法也可進一步包括將基因表達水平與給藥了頭孢曲松或丙戊酸的哺乳動物神經組織中的參考水平進行比較的步驟。在一個具體實施方式
中，哺乳動物為大鼠，如老年大鼠。
8.治療方法和組合物 本發明另一個具體實施方式
與具有任何上述治療效果的藥物或無菌組合物以及藥學上可接受載體的給藥有關。這些藥物組合物可包含分子，如小分子，其能有益地調節與衰老期間保持或促進認知功能相關的基因表達。
發明人出人預料地發現了在大腦神經元和神經膠質細胞周圍的細胞外空間中，包括突觸間隙和突觸外空間，減少L-穀氨酸水平與衰老期間保持或促進認知功能相關。在一個方面，本發明提供一種保持或促進哺乳動物認知功能(如，治療與衰老有關的認知功能障礙)的方法，通過增加腦細胞穀氨酸轉運蛋白的表達來進行。在相關的方面中，本發明提供一種減輕哺乳動物與衰老相關的認知功能障礙的方法，其通過增加腦細胞表達的穀氨酸轉運蛋白的活性來進行。
在一個方面，通過向哺乳動物給藥小分子來增加穀氨酸轉運蛋白的表達或活性。示例的小分子包括頭孢菌素及其類似物或衍生物、丙戊酸及其類似物或衍生物、MS-153及其類似物衍生物和促代謝穀氨酸受體(mGluR的；參見以上Aronica等所述)的激動劑。小分子可直接增加轉運蛋白的表達或活性(如通過與轉運蛋白的編碼基因的啟動子相互作用，或通過與蛋白質產物本身相互作用)或間接進行(如增加蛋白質的表達或活性，所述蛋白質能刺激轉運蛋白的表達或活性，或者減少蛋白質的表達或活性，所述蛋白質能抑制轉運蛋白的表達或活性)和PACAP(″垂體腺苷酸環化酶活化因子多肽″)。
其它能增加穀氨酸轉運蛋白表達或活性的示例化合物包括利多卡因(Do等，Anesth Analg.2002 951263-8″The effects of lidocaine onthe activity of glutamate transporter EAAT3the role of proteinkinase C and phosphatidylinositol 3-kinase″) 和激酶抑制劑(如Conradt，J Neurochem.1997681244-51″Inhibition of thehigh-affinity brain glutamate transporter GLAST-1 via directphosphorylation″)。
示例說明但不作為限制的示例的治療化合物在以下章節會有更詳細的描述。
8.1示例的治療組合物 示例的小分子，其能有益地調節與衰老期間促進或保持認知功能相關的基因(如EAAT基因)表達，其包括式I與頭孢菌素有關的化合物
其中，每個符號獨立表示 L為O或S； R為H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基、芳烷基、-OCH2CO2H； R1為-(CH2)n-C(O)X 其中 X為OH、NR2、SH、O-鹼金屬或-OC(CH3)OC(O)OCH(CH3)2； 和 n為0-6並且包括0和6的整數； R2為H、C1-10烷基、C2-8鏈烯基或-(CH2)a-W-R3 其中R3為H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)NR2、芳基、芳烷基或A； W為O、S或NR4；和 a為1-6並且包括1和6的整數； 其中R4為H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、芳基、芳烷基或R3和R4一起可形成未取代的或取代的雜烷基或雜芳基環；
線表示單或雙鍵； R5為R1、H、SO3H、芳基、C1-10烷基、芳烷基；或當
線為雙鍵時，R5選自＝CHCH2CO2H和＝NR； m為0或1；和 A為式Ia的芳基或雜芳基
其中，每個符號獨立表示 J為O、S、NR6或CR6；和 y為1或2； 其中R6為電子對、H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基或-NR2；或A為式Ib或Ic的雜環烷基
其中，每個符號獨立表示 J為O、S或NR；和 X為O或H2。
式I所述特定類型的化合物包括″頭孢曲松″，其指廣譜的頭孢菌素抗生素，(6R，7R)-7-[2-(2-氨基-4-噻唑基)乙醛醯氨基]-8-氧代-3-[[(1，2，5，6-四氫-2-甲基-5，6-二氧代-旁-三嗪-3-基)硫基]甲基]-5-硫雜-1-氮雜二環[4.2.0]辛-2-烯-2-甲酸，72-(Z)-(O-甲基肟)，二鈉鹽，倍半水合物。頭孢曲松可從Roche的商業渠道獲得，商品名為Rocephin。製備化合物分子式的方法可在例如，美國專利第5,574,155；5,739,346；5,856,502；5,869,649；5,945,414；5,945,532 6,090,801號中找到。頭孢曲松衍生物包括任意第三代頭孢菌素，其能殺死好氧的革蘭氏陰性桿菌。第三代頭孢菌素的例子有頭孢磺吡苄、頭孢氨噻、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢哌酮、拉氧頭孢和頭孢他啶。
其他能有益地調節與衰老期間促進或保持認知功能相關的基因(如EAAT基因)表達的小分子的例子包括與丙戊酸有關的式II的化合物
其中，每個符號獨立表示 X為-OH、C1-10烷氧基、-O-鹼金屬、-N(R1)2、-SH或-S-C1-10烷基； R為直鏈或支鏈C1-30烷基；和 R1為H、C1-10烷基、C2-10鏈烯基、C2-10炔基、芳基或芳烷基； 條件是R可以是未取代的或由一個或多個-OH、C1-10烷氧基、-N(R1)2、-SH、-S-C1-10烷基或芳基取代。
式II所述特定類型的化合物包括″丙戊酸″，其指抗痙攣的藥物2-丙基戊酸，其與增加大腦γ-氨基丁酸(GABA)的濃度有關。在此也列出丙戊酸其他名稱或說明，如DepakoteTM、ValproateTM、ValreleaseTM和丙戊酸鈉。製備化合物分子式的方法可在例如，美國專利第4,558,070；4,595,695；4,654,370；4,895,873；4,913,906；5,017,613；5,019,398；5,049,586；5,162,573；5,440,023；5,856,569；6,131,106和6,610,326號中找到。
其他能有益地調節與衰老期間促進或保持認知功能相關的基因(如EAAT基因)表達的小分子的例子包括與(R)-(-)-5-甲基-1-煙醯基-2-吡唑啉有關的式III的化合物
其中，每個符號獨立表示 R為H、C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基； R1為H、C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基； R2為包含1-4個雜原子的雜環或雜芳基環，雜原子選自N、O或S； L為O、S或NR；和 X為CR2、O或S。
式III所述特定類型的化合物包括(R)-(-)-5-甲基-1-煙醯基-2-吡唑啉(MS-153)。
還包括在本發明方法中的有藥學上可接受的加成鹽和式I、II和III化合物的複合物。在化合物可有一個或多個手性中心的情況下，除非特別指明，本發明包括每個獨特的外消旋化合物和每個獨特的未外消旋的化合物。在化合物有不飽和碳-碳雙鍵的情況下，順式(Z)和反式(E)異構體都包括在本發明的範圍之內。在抑制劑以互變異構體的形式存在的情況下，如酮-烯醇互變異構，如
和
，每種互變異構體的形式都被認為包括在本發明的範圍之內，無論存在於等式或以合適R′取代來形成一種形式。任何取代基在任何一個符號位的意義是獨立表義的，或任何其他取代基的意義，在任何其他符號位也是如此。
也包括在本發明的方法中的有式I、II和III化合物的前藥。
本發明所用的藥物組合物可以通過任何途徑給藥，包括但不限於，口服、靜脈內、肌肉內、動脈內、脊髓內、 鞘內、心室內、經過皮膚、皮下、腹膜內、鼻內、腸道、局部、舌下或直腸給藥的方法。
組合物可以單獨或與至少一種其他試劑聯合給藥，如與穩定化合物，其可包含於任何無菌、生物相容的藥物載體中給藥，載體包括但不限於，鹽水、緩衝鹽液、葡萄糖和水。組合物可以單獨或與其他試劑、藥物或激素聯合向患者給藥。
本發明組合物所含的某些化合物可以以特定幾何或立體異構體的形式存在。另外，本發明的聚合物也可以有光學活性。本發明涵蓋了所有這些化合物，包括順-和反-異構體、R-和S-對映異構體、非對映異構體、(D)-異構體、(L)-異構體、其外消旋混合物和其他混合物，都落入本發明的範圍之內。其他不對稱的碳原子可存在於取代基中，如烷基。所有這些異構體及其混合物都要包含在本發明中。
例如，如果需要本發明化合物的特定對映異構體，可以通過非對稱合成或通過手性輔助化合物衍生來製備，其中最終非對映異構體混合物被分離並裂解輔助基團從而提供純的所需的對映異構體。可選地，當分子包含諸如氨基的鹼性基團或諸如羧基的酸性基團時，用合適的光學活性酸或鹼來形成非對映異構體，接著溶解非對映異構體，從而通過現有的分級結晶或層析法來處理，接著獲得純的對映異構體。
為了本發明的目的，根據CAS版，Handbook of Chemistry andPhysics，67版.，1986-87，內封面的元素周期表來鑑定化學元素。也是為了本發明的目的，術語″碳氫化合物″指包括所有具有至少一個氫和一個碳原子的所有允許的化合物。在廣義的方面，允許的碳氫化合物包括無環和環狀、分支和未分支、碳環和雜環、芳香族和非芳香族的有機化合物，其可以被取代或未被取代。
8.2治療組合物 在此所述的組合物的預期的等價物包括相當於此處組合物的並與其具有相同共性的組合物，其中取代基或成分進行一種或多種簡單的變化而又不為感興趣的組合物的特性帶來不利影響。
除了活性成分，如一種或多種治療劑，本發明的藥物組合物可以包含合適的藥學上可接受的載體，其包含能幫助活性化合物製備成藥學上使用的製劑的賦形劑和輔劑。更詳細的配伍和給藥技術可在最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Easton，Pa.)中找到。
用現有藥學上可接受載體與口服的藥物組合物配伍，以適合的劑量口服給藥。這些載體能使藥物組合物配成片劑、丸劑、糖錠、膠囊、液體、凝膠、糖漿、膏劑、懸浮劑等等，由患者來攝取。
通過將活性化合物與固相賦形劑組合併最終處理成來獲得口服的藥物製劑並最終處理成顆粒狀混合物(任選在磨碎後)從而獲得片劑或糖錠的核心。如需要，可加入合適的輔劑。合適的賦形劑包括碳水化合物或蛋白質填料，如糖，其包括乳糖、蔗糖、甘露糖和山梨醇；澱粉，其來自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其他植物；纖維素，如甲基纖維素、羥基丙基甲基-纖維素或羧甲基纖維素鈉；樹膠，包括阿拉伯膠和黃芪膠；和蛋白質，如明膠和膠原蛋白。如果需要，加入破碎或增溶的試劑，如交聯的聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂和褐藻酸或其鹽，如褐藻酸鈉。
糖錠的核心可與合適的包衣聯合使用，如濃縮的糖溶液，其也可包含阿拉伯膠、滑石粉、聚乙烯基吡咯烷酮、聚羰乙烯膠、聚乙烯基乙二醇和/或二氧化鈦，紫膠漆溶液，和合適的有機溶劑或溶劑混合物。染料或色素也可加入到片劑或糖錠包衣中從而區分產物或表徵活性化合物的量，即劑量。
能口服使用的藥物製劑包括由明膠製成的適合推送的膠囊，以及由明膠和包衣製成的密封軟膠囊，如甘油或山梨醇。適合推送的膠囊能包含與填料或粘合劑混合在一起的活性成分，如與乳糖或澱粉，潤滑劑，如滑石粉或硬脂酸鎂，並任選有穩定劑。在軟膠囊中，活性化合物可溶於或懸浮於合適的液體中，如脂肪油，液體，或液體的聚乙烯基乙二醇，並混有或沒有穩定劑。
適合胃腸外給藥的藥物配方可以以水溶液配伍，優選以生理相容的緩衝液，如Hanks溶液，Ringer溶液，或生理鹽水。注射懸浮水劑可包含增加懸浮液粘性的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。另外，活性化合物的懸浮液可以製備成合適的注射懸浮油劑。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油，如芝麻油或合成脂肪酸酯，如乙基油酸，甘油三酯或脂質體。非脂聚陽離子氨基聚合物也可用於遞送。任選地，懸浮液液可包含合適的穩定劑或試劑以增加化合物的溶解性並能製備高濃度溶液。
對於局部或鼻部給藥，適合穿過特定屏障的滲透劑用於配方中。這些滲透劑一般是公知的。
本發明藥物組合物可以現有已知的方式來製備，如通過常規的混合、溶解、制粒、製糖錠、細磨、乳化、制膠囊、包埋或凍幹過程的方式。
藥物組合物可製成鹽並與許多酸一起形成，包括但不限於，鹽酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、蘋果酸和琥珀酸。相對於那些相應的游離鹼的形式。鹽傾向於更易溶於水或其他質子化溶劑中。在其他情況下，優選的製劑可以是凍乾粉，其可包含以下之任意或全部1mM至50mM的組氨酸，0.1％至2％蔗糖和2％至7％甘露糖，其pH範圍為4.5至5.5，其與前面的緩衝液組合使用。
製備出藥物組合物之後，可將它們置於合適的容器中並標記能用於明確病情的治療。對於頭孢曲松的給藥，例如，這樣的標記將包括用量、頻率和給藥方法。
適用於本發明的藥物組合物包括組合物，其中包含有效量的活性成分以獲得要求的目的。確定有效劑量完全在所屬領域技術人員的能力範圍中。
對於任何化合物，最初可在細胞培養試驗中估算有效治療劑量，如根據上述的Aronica等的方法，或在動物模型中估算，如在小鼠、大鼠、兔、狗或豬中。動物模型也可用於確定給藥的和時濃度範圍和途徑。如此述所述，尤其優選的動物模型使用有行為特點的鼠。然後可用這些信息確定人中的有用劑量和給藥途徑。
有效治療劑量指活性成分的量，例如頭孢曲松、頭孢曲松類似物、頭孢曲松衍生物、丙戊酸、丙戊酸類似物、丙戊酸衍生物、MS-153、MS-153類似物或MS-153衍生物，其能改善症狀或病情。可通過標準藥學流程在細胞培養中或用實驗動物來確定療效和毒性，如通過計算ED50(在群體的50％中有效治療的劑量)或LD50(使群體的50％致死的劑量)統計值。療效比毒效的劑量比率為治療參數，其能以LD50/ED50來表示。優選顯示大的治療參數的藥物組合物。細胞培養試驗和動物研究中獲得的數據用於闡明人所用的劑量範圍。這些組合物中所含的劑量優選處於循環濃度的範圍內，其包括很小的ED50或沒有毒性。根據所用的劑量形式、患者的敏感性和給藥途徑，劑量可在該範圍內變化。
由從業人員根據與需要治療的個體相關的因素來確定精確的劑量。調節劑量和給藥以提供足夠的活性部分的水平或保持預期的效果。要考慮的因素包括認知功能障礙的程度、個體的健康概況、年齡、體重、個體的性別、給藥的時間和頻率、藥物組合、反應敏感性、以及對治療的反應。根據特定配方的半衰期和清除率，長效的藥物組合物的給藥可以每3至4天，每周，或每兩周一次。
根據給藥途徑，普通劑量可在約0.1μg至100,000μg間變化，總劑量至多約1克。特定劑量和遞送方法的指導已在文獻中提供了並一般可供所屬領域從業人員使用。
為了在中樞神經系統的靶上取得治療效果，所述靶如EAAT1、2、3、4或5，本發明方法中所用的化合物在外周給藥時應當能容易地穿過血腦屏障。可是，不能穿過血腦屏障的化合物人能通過諸如心室內給藥途徑直接有效地進入中樞神經系統。
術語″藥學上可接受的鹽″為公認的表述，其指化合物的相對無毒的、無機和有機酸加成鹽，包括例如，本發明組合物所包含的那些。
術語″藥學上可接受的載體″為公認的表述，其指藥學上可接受的的材料、組合物或載體，如液體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包裝膠囊的材料，它們涉及運載或運輸任何特定組合物或其成分，從身體的一個器官或部分運至身體的另一個器官或部分。每種載體必須是「可接受的」，其意義為能與特定組合物及其成分相容並對患者無害。一些可用作藥學上可接受載體的材料的例子包括(1)糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)澱粉，如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；(3)纖維素及其衍生物，如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)粉狀黃芪膠；(5)麥芽；(6)明膠；(7)滑石粉；(8)賦形劑，如可可油和栓劑的蠟；(9)油，如花生油、棉子油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(10)乙二醇，如丙烯基乙二醇；(11)多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙烯基乙二醇；(12)酯，如乙基油酸和乙基月桂酸；(13)瓊脂；(14)緩衝劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)褐藻酸；(16)無熱原的水；(17)等滲鹽水；(18)Ringer溶液；(19)乙基乙醇；(20)磷酸緩衝液；和(21)其他用於藥物配方中的無毒相容的物質。
術語″系統給藥″、″系統地給藥″、″外周給藥″和″外周性給藥的″為公認的表述，其指除了直接向中樞神經系統給藥外，向個體給藥組合物、治療或其他材料，從而使之能進入患者的系統，並由此影響代謝和其它類似過程，例如，皮下給藥。
術語″腸胃外給藥″和″腸胃外給藥的″為公認的表述，其指除了腸道和局部給藥之外的給藥模式，通常通過注射進行，其包括但不僅限於，靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、被膜內、眼眶內、心臟內、皮內、腹膜內、經過氣管、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、脊柱內、以及胸骨內注射和輸液。
9.實施例 本發明，如一般所述的那樣，可以容易地通過參考以下實施例來理解，包括的實施例僅僅為了說明本發明的某些方面和具體實施方式
，其並不以任何方式來限制本發明。
9.1表徵年輕、年老有障礙的(AI)和年老無障礙的(AU)動物 9.1.1 Morris水迷宮(MWM)和輻射臂狀迷宮(RAM)的受試者 我們用MWM對9隻年輕(4-6個月)和18隻年老(25-27個月)無病的雄性Long-Evans鼠進行行為測試並用相同的動物進行微陣列分析。另外10隻年老的鼠在MWM中測試，然後在RAM中進行訓練和測試，經過兩項任務用以評估對認知功能中個體差異的測試-再測試的可靠性。
9.1.2 Morris水迷宮的設備 MWM的設備由注水(27℃)的大圓形池(直徑1.83m；高度0.58m)組成，其中通過添加無毒色素或一些其他物質來使之不透明。在典型的「隱藏平臺」版任務中，訓練鼠尋找偽裝的白色逃跑平臺(高度34.5cm)，該平臺位於迷宮一個四分之一部分的中心，低於水平面僅1.0cm。該平臺能縮進桶的底部或在行為測試期間從迷宮外面升至其正常位置。該平臺的位置在一個實驗至另一個實驗中保持恆定。因為沒有位置線索來標記平臺的位置，所以鼠從池子周邊任何起始位置上有效定位的能力依賴於使用迷宮周圍的信息。迷宮用綴有白色圖案的黑色帘布來包圍以提供空間線索構造。第二個平臺(高37.5cm)，其表面為黑色，在線索訓練期間將其升至高於水面2cm，使用人物版本來控制不與認知相關的因素。鼠在池中的行為用懸掛在池中央2.5m上面的照相機來記錄，照相機與視頻跟蹤系統(HVS高級圖像跟蹤器VP200)和運行HVS軟體的PC計算機相連，它們由Richard Baker的HVSImage，Hampton，英國開發。
9.1.3 Morris水迷宮過程 針對認知的衰老效應的靈敏度並針對遠系繁殖的Long-Evans鼠的年老群體中個體差異的可靠測量，我們優化了MWM規程(GallagherM，Burwell R，Burchinal M.Behav.Neurosci.107618-626；1993)。
鼠每天接受3項試驗，試驗之間間隔60秒，連續進行8天。在每個訓練試驗中，鼠從池周邊四個空間等分的起始位點之一釋放入迷宮。起始位點在試驗之間發生變化，因此防止使用響應策略(如，總是從起始位置左拐來定位逃離平臺)。如果鼠在任何試驗中在90秒內沒有定位出逃離平臺，則實驗人員向鼠指示平臺，其中保持30秒。每6次試驗包括一個探測試驗以評估迷宮中空間偏好的發展。在這些試驗中，鼠在平臺縮回池底時遊30秒，到時平臺升至其普通位置來完成逃離試驗。在用隱藏平臺來完成規程中，用可視的平臺來評估鼠的線索學習。在一個6個訓練試驗期中，該平臺的位置在各個試驗之間發生改變。
按照分析訓練試驗和探測試驗成績的目的，我們用接近的動物位置。通過取樣迷宮中動物的位置(10X/秒)來獲得接近測定值從而提供在平均1秒內逃離平臺的距離記錄。對於探測試驗和訓練試驗，執行糾正過程從而使試驗成績相對無偏差，該偏差由池周邊各個起始位置到目標的差異而造成的。在進行該糾正中，為每此試驗計算平均遊速(路徑長度/潛伏期)。然後在計算試驗成績前，從記錄中減去以該速度從試驗中所用的起始位置遊到目標所需的時間，即在訓練試驗中的累積距離和探測試驗中目標的平均距離。所以，設計用接近測量獲得的得分來反映搜索錯誤，代表了最佳搜索的偏差，即至目標的直接路徑並在探測試驗期間在該位置緊鄰處搜索。
9.1.4 Morris水迷宮分析 編譯視頻追蹤的計算機記錄以提供迷宮中每個鼠成績數據。用變化分析來分析對訓練試驗和探測試驗的測定值。
9.1.5 Morris水迷宮的數據結果 隱藏、偽裝平臺中的訓練成績在年輕和年老組的鼠之間有差異[F(1，23)＝12.69，p＜.002]。對於可視平臺中的線索訓練試驗，組之間沒有產生差異。在線索訓練中逃離的潛伏期為年輕的平均是9.36秒，而年老鼠是10.60秒。
以內插值替換的探測試驗中的平均接近測量值用於對每個單個受試者計算空間學習指數，其具體如Gallagher M，Burwell R，BurchinalM.Behav.Neurosci.107618-626；1993所述。當鼠快速學會搜索接近其位置的平臺時，其空間指數低。總體來說，年老的鼠與年輕的有差異[F(1，23)＝15.18，p＜.001]。相對於年輕學習群體的學習指數譜，年老的鼠分成無障礙或有障礙的。處在年輕鼠的標準範圍內(指數得分＜241)的年老的鼠定為年老無障礙的(圖1)。指數得分處於年輕成績範圍之外的餘下的年老個體定為年老有障礙的。
9.1.6輻射臂狀迷宮的設備 升高的八臂狀輻射迷宮的每個臂(7×75cm)從八邊形中心平臺(30cm直徑，51.5cm高)的每個面上突出來。臂上的清晰側面牆有10cm高並以65°夾角形成槽。食物孔(4cm直徑，2cm深)位於每個臂的末端。樹脂玻璃構建的塊(30cmH×12cmW)安置以阻擋任何臂的入口。在圍繞設備的室中提供了許多其它的迷宮線索並通過高過頭的固定設備來照明。
9.1.7輻射臂狀迷宮流程 首先讓鼠在8分鐘期間習慣於迷宮，連續進行4天。在這些期間的每一個中，在RAM上散布著獎勵食物，最初放在平臺中心和臂上，然後漸進地就放到臂上了。在該習慣階段後，使用標準訓練規程，其中食物小球位於每個臂的末端。鼠每天接受一次試驗，進行18天；當所有8個食物小球都被獲取了或已進行了16個選擇或過去了15分鐘，則終止每天的試驗。錯誤包括回到已經取掉食物的臂上(所有4個爪子都抓在臂上)。該階段結束後，通過在試驗期間加入延遲來增加要求記憶力的任務。堵住每個試驗中3個臂的開口。封閉的臂的特性和構造在試驗之間發生改變。使鼠在5個臂上獲取食物，所述的臂在試驗一開始就允許進入。然後從迷宮中去除鼠60秒，在此時間中去除迷宮上的障礙，由此允許進入所有8個臂。然後將鼠放回平臺中心，使其獲取剩下的獎勵食物。
9.1.8輻射臂狀迷宮分析 在測試試驗中用60秒使記憶力發生錯誤，這時鼠回到5個在延遲前已訪問過的臂中的一個。在4個連續的測試試驗中計算每隻鼠的成績的平均值。利用參數統計(非配對的t-測驗)來比較年輕和年老組之間的成績。利用相關性分析(Pearson氏r)來檢測年老鼠(N＝10)在Morris水迷宮(學習指數得分)和輻射臂狀迷宮(記憶力錯誤)間成績的關係。
9.1.9輻射臂狀迷宮的結果 在RAM的延遲版中的年輕成年鼠的成績以延遲間隔的函數變化，變化範圍在60秒至8小時(Chappell等Neuropharmacology 37481-488，1998)。以前在MWM中表徵的年老鼠相對於年輕鼠，在60秒延遲後發生了更多的記憶力錯誤(p＜.025)。平均年輕鼠發生0.17個錯誤，而年老的鼠平均發生1.52個錯誤。可是，10隻年老的鼠在RAM中顯示出廣泛範圍的成績。發現在最初的MWM表徵和在RAM中記憶力成績顯著相關(r值＝.82，數據如圖2所示)。
9.2年輕、年老有障礙(AI)和年老無障礙(AU)動物中的基因表達分析 9.2.1從有行為特徵的動物中製備RNA 27隻有行為特徵的鼠(數據如圖1所示)用過量的戊巴比妥鈉(100mg/kg)殺死。從兩側分離海馬並凍存(-80℃)。稱重每個動物的海馬並在合適體積的苯酚-鳥糞胺異硫氰酸(Trizol試劑；1ml每100mg的組織中最少用1ml體積)中均漿。用氯仿(每ml的Trizol用200μl)抽提每個樣品並用異丙醇沉澱。空氣乾燥RNA小球並重懸於DEPC處理水溶液中。所有樣品儲存於-80℃。根據廠商說明，用Qiagen′s Rneasy少量RNA提取試劑盒來進一步純化一部分RNA並接著儲存於-80℃。通過測定260nm處的吸收光來定量樣品並用260nm和280nm處的吸收比率來確定純度。通過瓊脂糖凝膠電泳來確證樣品的完整性和濃度。掃描瓊脂糖凝膠的照片，利用NIH-成像來轉化並定量像素。然後如果需要，可調節濃度。
對於基因微陣列分析，匯總同一表型的3種(為Y，AI或AU)鼠的樣品來對3種GeneChip
/表型的樣品大小產生獨立的微陣列分析。根據MWM中空間學習指數獲得的行為特徵，匯總組織到表I中。
表I 9.2.2反轉錄和與微陣列的雜交 用Affymetrix Enzo生物陣列高產RNA轉錄標記系統製備用於雜交的cRNA標記探針。將RNA反轉錄成cDNA並轉化成生物素標記的cRNA。反轉錄之前，加入每種標記系統所提供的內在標準以測試RNA。然後在進行實驗性GeneChip
雜交前，在對照晶片上測試cRNA以保證反轉錄和標記是最優的。將cRNA應用於U34A AffymetrixGeneChip
陣列中。這些陣列包括7000個鼠的表達基因和1000個EST的特異序列，並包括最近開發的、較小的神經科學基因微陣列上的所有基因。基因晶片應用流體儀自動將標記的導入到基因陣列上並在基因晶片雜交箱中進行雜交。用以共聚焦雷射掃描為基礎的基因陣列掃描儀來檢測並定量每個寡聚體集合的雜交信號。
9.2.3微陣列的數據分析 基因晶片分析套件和Affymetrix MAS4.0以及更近開發出的MAS5.0算法用於我們的數據分析。兩個算法都有默認的初始值，其基於已知的陰性基因和每個晶片的平均信號強度。基於由Affymetrix預先確定的寡核苷酸集合的標準化和計數方法被用於基因晶片間的比較。兩個算法都產生與每個表達基因相對應的完全匹配(PM)的寡聚物的每個集合的表達水平值，該值是相對於不匹配(MM)的寡聚物的集合的，設計用來計算抑制完全匹配的cRNA雜交所需改變的鹼基。MAS4.0經驗算法用原始數據來產生平均差異調用，其提供了每個基因的PM寡聚物相對於對照MM寡聚物的雜交信號強度的測量方法。存在(P)，邊際(M)，或缺少(A)的絕對調用是以PM寡聚物的數量為基礎的，其與MM寡聚物正相關。MAS5.0統計算法基本根據相同類型的比較但應用統計方法來產生p值以增強當前反映的表達水平高於背景的調用可能性。另外，將統計學標準應用於信號算法以計算雜交信號強度，其要能最小化每個探針的PM和MM寡聚物內逸出值的影響。體現表達水平的數據中的基本差異由2個算法來生成，其就是設計MAS5.0來減少陰性表達水平，該陰性表達水平會導致高估2個比較組間改變了表達水平的基因數量。總的來說，從每個寡聚物集合用MAS5.0得來的信號小於用MAS4.0的。
我們的模型的能力部分在於比較Y，AU和AI這3組的能力，從而鑑定那些基因，所述基因會在年輕和年老的海馬之間產生改變並由此一般與衰老過程相關，並鑑定那些區分AU和AI鼠的基因。通過該過程鑑定出的基因特異地與衰老-認知功能障礙或保持認知功能相關。
在此處產生的公開數據中，我們進行了一系列分析步驟以鑑定3個年老和認知功能障礙模型的信息基因集。集合1包括感興趣的基因，其不同於年輕的而只有年老的功能。集合2包括感興趣的基因，其在有障礙的年老鼠中相對於年輕和年老無障礙的產生了改變。集合3(被稱為年老無障礙的基因)由基因組成，所述基因在年老無障礙的中相對於年輕和年老有障礙的產生了改變，並因此可以與衰老誘導的認知功能保持有關。在MAS5.0分析前從完整微陣列數據集中產生出每種集合，然後用相似的算法進行效果大小分析。
在此處我們描述了產生集合3(年老無障礙的基因)的步驟，其中包括了穀氨酸轉運蛋白。在第一步中，晶片上所有探針集合的值代表年輕鼠(N＝3)中的基因表達並檢測年老有障礙(N＝3)的檢測標準。從進一步考察中去掉所有用MAS5.0分析的絕對調用中未達到檢測標準的探針對的集合。然後行簡單的效果分析以確定晶片上2組(年輕和年老有障礙的)的值的效果大小相差不超過1.0。所有探針集達到所有檢測標準和匯總在比較組中的標準(年輕和年老有障礙的效果大小相差不超過1.0或更大)。對這些匯總的年輕和年老有障礙的集合與年老無障礙晶片的相應探針集進行簡單的效果分析。簡單效果分析產生384個探針集，代表能保持衰老誘導的認知功能的「感興趣的基因」，效果大小為1.25或更大。顯著性推論統計測試的有力分析表明微陣列試驗的樣品大小(3個年老無障礙的晶片和6個匯總比較組的晶片)能以p＜.05檢測到80％強的基因有2.5或更大的效果大小差異。現在接下來用9個年老無障礙的和每個比較組(年輕和年老有障礙)中有9個受試者的樣品大小進行的分析中，預計效果大小為1.25及以上的會有80％的統計學可能。
9.2.4微陣列的結果 在人和齧齒動物神經系統中檢測到了穀氨酸轉運蛋白的差異表達(圖3)。這些轉錄子中的2個沒有在海馬結構中表達(EAAT4和EAAT5)。剩下的3個轉錄子在神經元和神經膠質細胞中有不同的細胞位置模式，其都在海馬中表達。在GLT-1具有5.87(年老無障礙基因的效果大小分析中的最大值)效果大小的微陣列數據集和GLAST中年老無障礙基因(集合3)的效果大小分析中，第二個穀氨酸轉運蛋白具有1.93的效果大小(圖4)。在兩種情況下，相對於匯總比較的年輕和年老有障礙的，穀氨酸轉運蛋白mRNA都在無障礙年老的鼠中增量。如微陣列實驗設計有力分析所預期的，相對於比較年輕和年老有障礙的，GLT1 mRNA顯著增加了(p＜.0002)。在相似的分析中，GLAST也顯著增加了(p＝.0484；圖4)。
相對於年輕和年老有障礙的，年老無障礙的天冬氨酸氨基轉移酶mRNA的差異也顯示了穀氨酸在年老並保持認知功能的鼠中也受差異調節。天冬氨酸氨基轉移酶是一種細胞外穀氨酸失活的主要機制，其探針集顯示相對於不互相有差異的Y+AI，在AU鼠中有顯著的增長。mRNA的效果大小為2.58。
微陣列上的探針集為鑑定了的垂體腺苷酸環化酶活化因子多肽的基因(PACAP；GenBank登錄號AI227715；EST224410)，其調節穀氨酸轉運和代謝(Figiel和Engele，J.Neurosci.153596-3605，2000)。相對於比較年輕和年老有障礙的鼠，PACAP mRNA在年老無障礙的中顯著升高了(效果大小為3.29，t＝4.13，p＜.005；圖4)。
因為PACAP受體是顯示脫敏作用的類型，所以β-抑制蛋白2mRNA的強烈增加可對穀氨酸轉運蛋白起作用。β-抑制蛋白2具有雙重功能，即受體內吞作用和通過同一受體來介導信號級聯反應(Wei等，PNAS，100；10782-7，2003；Aha等，PNAS，100；1740-4，2003；如，GenBank登錄號XM_345084)。相對於比較年輕和年老有障礙的，年老無障礙鼠中β-抑制蛋白2的探針集顯示出顯著的升高(效果大小＝2.78，t＝2.59，p＜.05)。
9.2.5原位雜交組化分析 接下來用獨立的動物集合(每組N為3或4)利用海馬切片進行原位雜交組化分析。
9.2.6原位雜交探針的製備 我們有反轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)來產生與穀氨酸轉運蛋白相對應的特異探針，其中通過微陣列分析已鑑定了該蛋白在AU鼠海馬中起上調作用。年老鼠(具有(AU)得分或不在(AT)年輕動物得分內的動物集)海馬中製得的RNA用寡聚T和反轉錄酶來進行反轉錄。然後將該cDNA用作正義和反義寡聚物探針(表II)在第一輪PCR反應中的模版來擴增雙鏈與下述特定穀氨酸轉運蛋白對應的cDNA。使用標準PCR條件(94℃初始變性4分鐘，72℃退火40秒，35個循環為94℃變性30秒，55℃退火30秒並72℃延伸30秒，72℃最後延伸4分鐘並降溫至4℃)。PCR的整個產物在溴化乙錠-瓊脂糖凝膠上進行電泳以確證產生了合適大小的探針。用每個擴增出的cDNA和延長的寡聚物(表II)進行第二輪PCR反應，所述寡聚物包括與SP6啟動子序列相應的正義寡聚物加上最初用於延伸每種穀氨酸轉運蛋白PCR產物的正義寡聚物，以及包括T7啟動子序列和最初每種穀氨酸轉運蛋白反義寡聚物的反義寡聚物。這分別用正義和反義鏈上的SP6和T7啟動子產生出特異性穀氨酸轉運蛋白cDNA。用乙醇沉澱收集PCR產物並用自動DNA測序儀和SP6引物來確證核苷酸序列。
確證了序列的與每種穀氨酸轉運蛋白相對應的帶有SP6和T7啟動子位點的PCR產物用於體外DNA直接轉錄出每種第二輪穀氨酸轉運蛋白PCR產物的正義和反義RNA。進行體外轉錄反應，使用了每種PCR產物，SP6或T7聚合酶(每種探針的分別反應中所用的每個酶)，未標記的核苷三磷酸和高度特異活性的35S標記的尿苷三磷酸。這些反應產生了3种放射性標記的反義穀氨酸轉運蛋白探針，其通過鹼基配對特異識別組織切片中每種不同的穀氨酸轉運蛋白mRNA，並產生了相應的正義探針，其包含與穀氨酸轉運蛋白mRNA相同的序列，其不能與mRNA進行鹼基配對並用作陰性對照。反義探針與Y，AU和AI鼠中能代表整個海馬部分的海馬冷凍切片一起溫浴。正義探針與海馬較少選擇的區域一起雜交，但足以確證均一的陰性雜交信號並確認用反義探針所得的雜交信號的特異性。在雜交並洗滌後，將切片放到X射線膠片上並進行標準定量自動射線照相(Bizon 2001)來定量信號。
用於衍生模板來製備穀氨酸轉運蛋白原位雜交組化的正義和反義RNA探針的寡聚物如表II所述。
表II 9.2.7製備用於原位雜交組化的組織 11隻有行為特徵的鼠(n＝4年輕的和n＝7年老的)用過量戊巴比妥鈉(100mg/kg)並用4％溶於0.1M pH 7.4磷酸緩衝液(PPB)的多聚甲醛心臟灌輸殺死。在7點至10點間進行所有的灌輸。固定後，從頭蓋骨中取出大腦並立即從周圍組織中切出左右測海馬體。切出的海馬體在PPB中固定24小時，溶於包含20％蔗糖的PPB防凍液中24小時，在粉狀乾冰上以「伸展的」方向冷凍，並儲存於-80℃，直至進一步處理。
每個動物海的馬狀突起用冷凍顯微切片機進行切片，按經度軸切成冠狀(25mm)，並收集進冰冷的PPB中。自由流動的組織切片用含0.75％甘氨酸的0.1M pH，7.2的磷酸緩衝液(PB)洗滌，並用0.1M PB單獨洗滌以除去多餘的固定劑。切片在37℃以蛋白質酶K(在含0.05％SDS的0.1M Tris緩衝液中有1mg/ml)處理30分鐘，在含0.25％乙酸酐的0.1M pH 8.0三乙醇胺中乙醯化，並用2X檸檬酸鈉緩衝液(SSC；1XSSC＝0.15M氯化鈉和0.015M檸檬酸鈉，pH 7.0)衝洗。然後在60℃雜交組織42-44小時，雜交液包含50％甲醯胺，1X Denhardt溶液，10％葡聚糖硫酸酯，4XSSC，0.25mg/ml酵母tRNA，0.3mg/ml青魚精子DNA，100mm二硫蘇糖醇(DTT)，以及合適的35S-標記的cRNA，其終濃度為1X107 CPM/ml。雜交後，用4XSSC以30分鐘間隔洗滌切片2次，在50％甲醯胺/2XSSC於60℃洗滌一次，然後於37℃用核酶(在含1mM乙烯基-二氨基四乙酸的10mM Tris緩衝液中有20mg/ml)處理30分鐘。進一步洗滌組織切片，用遞減的SSC緩衝液洗滌，其中含100mM DTT，直至最終用0.1XSSC洗滌，並將其放於明膠包被的載波片上進行膠片放射自顯影。空氣乾燥的海馬體切片用14C-標準(American RadiolabeledChemicals，Inc.，St.Louis，MO)至β-max超膠片(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，New Jersey)曝光24-72小時。喙冠狀切片的曝光時間為110-130小時。用GBX顯象劑處理膠片並用Kodak快速定影劑定影。
通過膠片放射自顯影光密度分析用MCID成像系統(ImagingResearch，St.Catherine′s，Ontario，加拿大)來定量原位雜交標記。對於每張曝光的組織切片膠片，線性化膠片密度並將其校正到相對14C-標準。計算值(mCi/克蛋白質)，取6-8個組織切片的多次測量的平均值。每組中每隻鼠平均的雜交信號強度取平均值以獲得組平均值±標準差。用一路ANOVA進行統計比較。對於所有的統計測驗，95％的置信水平(p＜0.05)被認為是顯著的。
9.2.8原位雜交組化的結果 相對於年輕和年老有障礙的，GLT1的豐度在年老無障礙的中顯著較大(p＜.03)，而且也發現了有較大的GLAST mRNA的趨勢(p＝.089；圖5)。表示用於原位雜交的鼠的認知狀態的學習指數得分與微陣列研究中的動物的相似；年老無障礙(182，223，240)、年輕(177，219，200，227)和年老有障礙(290，285，297，298)。
在微陣列數據集和原位數據集中，第三個穀氨酸轉運蛋白mRNA(EAAC1)的值對於無障礙年老的組在數量上高於比較年輕和年老有障礙的鼠，但那些差異並不在統計學上顯著。微陣列中一個探針集(AF038571)的mRNA顯示相對於年老有障礙的，在年老無障礙中EAAC1顯著升高。在EAAC1的第二個探針集中的mRNA顯示有相同的趨勢(年老無障礙的大於年老有障礙，p＝.09)。
9.3用頭孢曲松保持認知功能 9.3.1頭孢曲松對年輕鼠GLTI mRNA的處理效果 年輕鼠每天肌肉注射200mg/kg的頭孢曲松(N＝2)或其載體(N＝3)，持續一周。殺死後，切下海馬並冷凍。
9.3.2實時反轉錄-PCR法來定量GLT-1 mRNA 9.3.2.1製備用於實時RT-PCR的RNA 從用頭孢曲松或鹽水處理的動物(每種條件3隻年輕動物)的右側海馬處用Trizol試劑提取RNA並通過Qiagen Rneasy柱純化，其方式與微陣列實驗中所用的過程完全一樣。在確定濃度和完整性後(用微陣列RNA相同的方式)，樣品稀釋到每微升50ng的濃度。在總體積10μl中用Applied Biosysten′s Taqman反轉錄試劑以以下條件反轉錄100ng的該樣品lx反轉錄緩衝液，0.5mM每種dNTP，5.5mMMgCl2，1.25單位/μL的Multiscribe反轉錄酶，0.4單位/μL的Rnase抑制劑，和2.5μM寡聚dT引物。在室溫溫浴樣品10分鐘，接著於48℃45分鐘，然後於95℃5分鐘。樣品稀釋到1∶20和1∶100以用於實時PCR反應。通過合併從2個分別的動物的海馬體中提取純化的RNA來產生標準RNA並反轉錄該RNA，條件與上述實驗樣品的完全一樣，除了500ng RNA用於50μl的反應中。通過連續稀釋將標準cDNA稀釋到1∶20，1∶100，1∶500和1∶2500。另外，200ng標準RNA置於20μl反應中，使用以上相同的條件除了省略反轉錄酶。該樣品被稱為非RT樣品，包括其是要顯示RNA樣品本身背景活性。該樣品連續稀釋至1∶20和1∶100。
9.3.2.2實時PCR PCR反應在三溫容器中進行，每個GLTla，GLT1和GAPDH的cDNA樣品使用2種不同的濃度，即cDNA稀釋度為1∶20和1∶100。PCR反應中的cDNA最終濃度為100pg/μl和20pg/μl，而且其是由RNA輸入濃度外推得來的。在所有4個稀釋度應用標準來獲得外推為100pg/μl、20pg/μl、4pg/μl和0.8pg/μl的終濃度。PCR反應混合物利用Invitrogen的Platinum定量PCR試劑盒來以相同的引物和探針集組裝所有樣品，然後為每個cDNA以每種濃度裝在分開的管裡。然後將cDNA加入混合物中，然後將其分裝於3個實時PCR管中的每一個中。在RotorGene 3000(Corbett Research)中以以下條件進行所有反應50℃ 2分鐘，95℃ 5分鐘，然後進行95℃ 25秒和60℃60秒的45個循環。在GAPDH的Joe頻道和GLT1和GLT1a探針/引物集的FAM/SYBR頻道上獲得數據。對所有的運行都使用尖峰抑制和動態管標標準化。GLT1或GLTla和GAPDH的實時PCR偶爾在分開的運行中進行。
對於GAPDH，優化的反應條件是0.6單位Platinum Taq DNA聚合酶，20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，200μM dGTP，200μMdATP，200μM dCTP，400uM dUTP，0.4單位UDG，4.5mM MgCl2，200nM正向引物，200nM反向引物，50nM用5′端的Vic和3′端的TAMRA淬滅基團標記的探針。引物和探針可從Applied Biosystems(Cat#4308313)處獲得；序列未知，但擴增長度為177bp。
對於GLT1，優化的反應條件是0.6單位Platinum Taq DNA聚合酶，20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，200μM dGTP，200μMdATP，200μM dCTP，400uM dUTP，0.4單位UDG，6.0mM MgCl2，50nM正向引物，200nM反向引物，50nM探針。擴增長度為65bp。正向引物為5′GAG CTG GAC ACC ATT GAC TC 3′而且反向引物為5′GAC TGC GTC TTG GTC ATT TC 3′。探針為5′CAA CAC CGAATG CAC GAA GAC ATC 3′，標記有5′6-fam和3′tamra。
對於GLT 1a，優化的反應條件是0.6單位Platinum Taq DNA聚合酶，20mM Tris-HCl(pH 8.4)，50mM KCl，2000M dGTP，200μMdATP，200μM dCTP，400 uM dUTP，0.4單位UDG，6.0mM MgCl2，200nM正向引物，200nM反向引物，100nM探針。擴增長度為76bp。正向引物為5′ATG AGT GCA AGG TAA CTC TGG 3′而且反向引物為5′TCA CGT TTC CAA GGT TCT TC 3′。探針為5′CCA ATG GAAAGT CAG CTG ACT GCA 3′，標記有5′6-fam和3′BHQ1(黑洞淬滅基團1)。
9.3.2.3實時PCR的數據分析 用DDCt法確定GAPDH和GLT1或GLTla的比較量(Livak和Schmittgen，Methods 25402-408 2001)。所有反應的初始值設在0.05螢光單位上並用Rotorgene軟體來確定每個樣品的Ct。確定每個GLT1cDNA在每個濃度的平均Ct值並扣除GAPDH的平均值。如果GAPDH值大於15％或低於平均GAPDH值，則棄去樣品。在用藥物處理的動物中，GLT1 mRNA平均增加1.34倍，而在用藥物處理的動物中，GLTla mRNA平均增加1.27。這些值與微陣列中觀察到的AU鼠GLT1的完全改變一致，其增加了1.31。
9.4頭孢曲松處理對年老鼠的RAM成績的影響 在MWM中表徵認知狀態之後，將無障礙的年老鼠分配到2種處理條件之一中(200mg/kg的對照載體或頭孢曲松)，條件根據它們MWM鼠學習值得分來定。最初在兩種處理條件下的鼠用RAM任務來訓練(適應、無延遲版、然後60秒延遲)。然後每日在早上(8:00-9:00AM)注射載體或藥物。每日，鼠接受輻射臂狀迷宮的測試，其中延遲擴大到3小時。在第8-10天(注射7天之後)，在3小時延遲時進行關鍵的測試。相對於同時測試的年輕組，接受載體的年老鼠的記憶力錯誤顯著升高。相對於接受載體的年老鼠，接受藥物給藥的年老鼠只有較少的錯誤(圖6)。該初始飛行評估使用了3隻用藥物處理的鼠和4隻載體處理的年老鼠，該評估用其他有行為特徵的鼠來重複進行以將樣本大小增加到每組7-8隻鼠。
9.4.1頭孢曲松處理對年老鼠的GLTI mRNA的影響 完成RAM測試時，處死接受了載體和藥物處理的年老鼠。冷凍切下的海馬並儲存(-80℃)來分析GLT1 mRNA，這在用其他年老鼠重複完成行為測試時進行。如果藥物處理增加了GLT1 mRNA，如預期的以相同劑量對年輕鼠進行藥物處理的效果那樣，則進行微陣列分析用以比較用頭孢曲松處理的年老有障礙鼠和對照年老有障礙個體的基因表達譜。
9.4.2頭孢曲松處理對MWM測試-再測試的影響 在標準MWM規程中表徵年老鼠並在幾周或幾月後在新的空間環境中用MWM進行測試，就獲得了測試-再測試的可靠性。用MWM可在再測試中評估化合物改善患認知功能障礙的年老鼠功能的臨床前效果。通過2個任務(RAM和MWM)處理的有效性強化了藥物對認知功能作用的證據，該作用不依賴於2個任務間有區別的其他成分(如，成績的運動基礎)。
9.5用其他化合物改善並保持認知功能 該工作包括向年輕鼠給藥測試化合物或載體，從而建立一種療法以改善或保持認知功能。測試化合物包括丙戊酸，調節促代謝穀氨酸受體(mGluR)活性的化合物以及調節垂體腺苷酸環化酶活化因子多肽(PACAP)表達的化合物。MWM中表徵的年老有障礙鼠分配接受藥物或載體治療並在RAM中測試。穀氨酸轉運蛋白表達和其他基因譜的分析，如mGluR表達和活性，PACAP表達或β抑制蛋白2表達，它們之後在完成行為測試時進行。
9.6等價物 儘管描述了個別發明特定的具體實施方式
的時候，但以上說明是示例性的而不是限制性的。依據本說明書的論述，本發明的許多變體對所屬領域技術人員來說變得顯而易見了。所附的權利要求不是要要求保護所有這些具體實施方式
和變體，而是通過參考權利要求以來確定本發明的全部範圍，以及等價體和說明書以及這些變體的全部範圍。
在此所提及的所用公開文獻和專利其全文都納入本文參考，如同每一個公開文獻或專利都明確並各自納入參考。在發生衝突的情況下，以本申請，包括在此的任何定義為準。
本申請引用的每篇參考文獻的內容全文，包括公開文本、專利和專利申請，在此都納入參考。
權利要求
1. 能刺激穀氨酸轉運蛋白基因的神經組織表達的化合物在製備用於治療哺乳動物認知功能障礙的藥物中的應用。
2. 權利要求1的應用，其中所述穀氨酸轉運蛋白基因是EAAT2/GLT1或EAAT1/GLAST。
3. 權利要求1的應用，其中所述化合物具有下式
其中，每個符號獨立表示
R為H、C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基；
R1為H、C1-C10烷基、C2-C10鏈烯基、C2-C10炔基、芳基或芳烷基；
R2為包含1-4個雜原子的雜環或雜芳基環，雜原子選自N、O或S；
L為O、S或NR；和
X為CR2、O或S。
4. 權利要求3的應用，其中所述化合物是(R)-(-)-5-甲基-1-煙醯基-2-吡唑啉。
5. 權利要求1的應用，其中所述化合物具有下式
其中，每個符號獨立表示
L為O或S；
R為H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基、芳烷基、-OCH2CO2H；
R1為-(CH2)n-C(O)X
其中
X為OH、NR2、SH、O-鹼金屬或-OC(CH3)OC(O)OCH(CH3)2；和
n為0至6並且包括0和6的整數；
R2為H、C1-10烷基、C2-8鏈烯基或-(CH2)a-W-R3
其中
R3為H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、-C(O)NR2、芳基、芳烷基或A；
W為O、S或NR4；和
a為1-6並且包括1和6的整數；
其中
R4為H、C1-10烷基、-C(O)C1-10烷基、芳基、芳烷基或R3和R4一起可形成未取代的或取代的雜烷基或雜芳基環；
線表示單或雙鍵；
R5為R1、H、SO3H、芳基、C1-10烷基、芳烷基；或當
線為雙鍵時，R5選自＝CHCH2CO2H和＝NR；
m為0或1；和
A為式Ia的芳基或雜芳基
其中，每個符號獨立表示
J為O、S、NR6或CR6；和
y為1或2；
其中R6為電子對、H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、芳基或-NR2；
或A為式Ib或Ic的雜環烷基
其中，每個符號獨立表示
J為O、S或NR；和
X為O或H2。
6. 權利要求5的應用，其中所述化合物不是頭孢曲松。
7. 權利要求1的應用，其中所述化合物具有下式
其中，每個符號獨立表示
X為-OH、C1-10烷氧基、-O-鹼金屬、-N(R1)2、-SH或-S-C1-10烷基；
R為直鏈或支鏈C1-30烷基；和
R1為H、C1-10烷基、C2-10鏈烯基、C2-10炔基、芳基或芳烷基；
條件是R可以是未取代的或被一個或多個-OH、C1-10烷氧基、-N(R1)2、-SH、-S-C1-10烷基或芳基取代。
8. 權利要求7的應用，其中所述化合物不是丙戊酸。
9. 權利要求1-8任一項的應用，其中所述哺乳動物是人。
10. 權利要求1-8任一項的應用，其中所述認知功能障礙是輕度認知功能障礙、年齡相關的認知衰退或記憶力喪失。
11. 權利要求1-8任一項的應用，其中所述認知功能障礙是阿耳茨海默症。
12. 權利要求1-11任一項的應用，其中所述化合物是通過一種篩選用於保持或促進認知功能的化合物的方法而鑑定的，所述方法包括以下步驟(a)向哺乳動物給藥測試化合物；(b)在給藥所述測試化合物後，確定所述哺乳動物神經組織中穀氨酸轉運蛋白基因的表達水平；(c)將所述基因的所述表達水平與其在沒有給藥所述測試化合物的哺乳動物神經組織中的參考表達水平相比較；和，(d)確定所述基因的表達水平是否與其相應的參考表達水平不同。
13. 一種篩選用於促進認知功能的化合物的方法，其包括以下步驟
(a)向哺乳動物給藥測試化合物；
(b)在給藥所述測試化合物後，確定所述哺乳動物神經組織中穀氨酸轉運蛋白基因的表達水平；
(c)將所述基因的所述表達水平與其在沒有給藥所述測試化合物的哺乳動物神經組織中的參考表達水平相比較；和，
(d)確定所述基因的表達水平是否與其相應的參考表達水平不同，其中所述差異顯示測試化合物是促進認知功能的候選治療劑。
14. 一種篩選用於促進哺乳動物認知功能的化合物的方法，其包括以下步驟
(a)將測試化合物與表達穀氨酸轉運蛋白基因的細胞接觸；和
(b)確定所述基因的表達水平是否通過將所述細胞與所述測試化合物接觸而改變，所述改變如果存在則顯示所述化合物有促進哺乳動物所需認知功能的能力。
全文摘要
本發明的發明名稱是治療認知功能障礙的靶位。本發明涉及鑑定涉及認知功能障礙的基因的方法和用於治療認知功能障礙的組合物。本發明還涉及能刺激穀氨酸轉運蛋白基因的神經組織表達的化合物在製備用於治療哺乳動物認知功能障礙的藥物中的應用。
文檔編號A61K31/546GK101249091SQ20081008253
公開日2008年8月27日 申請日期2003年11月24日 優先權日2002年11月22日
發明者M·加拉赫爾, P·K·倫德 申請人:約翰斯·霍普金斯大學