一種基於物聯網的掌上抗生素殘留快速檢測儀的製作方法
2023-06-03 07:17:31
本發明涉及一種基於物聯網的掌上抗生素殘留快速檢測儀，屬於農產品質量安全快速檢測技術領域。
背景技術：
抗生素是一種能抑制或殺死其他微生物細胞的生理活性物質，主要由微生物產生。自20世紀30年代發現青黴素以來，現如今已被發現的抗生素有2000多種。常在奶牛中使用的抗生素主要有氨基糖苷類、β-內醯胺類、四環素類和大環內酯類等。如果人類長期食用含抗生素殘留的動物性食品後，藥物不斷在體內蓄積，會對人體產生毒性作用，增加細菌的耐藥性，引起人體的過敏和變態反應，甚至會產生致癌、致畸、致突變作用。雖然近年來國際上嚴格限制抗生素的殘留最大量，但由於其對某些作物具有生長刺激作用，所以仍有不少違章使用現象，因此實現對牛奶等食品中的抗生素殘留進行快速檢測是至關重要的。
目前抗生素殘留分析的主要方法是氣相色譜儀、液相色譜儀、氣質聯用儀、液質聯用儀等，這些方法雖然分析精度高，定量準確，但其樣品的前處理複雜、檢測耗時長、成本高、需要技術熟練的操作人員。傳統的抗生素檢測方法主要有：氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質譜聯用技術(GC/LC-MS)、毛細管電泳法(CE)、螢光分析、酶聯免疫法(ELISA)。這些方法雖然選擇性好、靈敏度高、準確度高、檢出限低，可同時檢測多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設備，樣品前處理過程繁瑣、費時，並且對分析人員的技術水平要求很高，不適於現場快速檢測。與傳統的分析方法相比，生物傳感器具有如下特點：（1）較高的選擇性，因此不需要對被測組分進行分離，即不用對樣品進行預處理。（2）結構簡單，體積小，使用方便，非常有利於農產品安全質量的快速測定。（3）可實現連續在線檢測，使食品加工過程的質量控制變得簡便。（4）響應速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，基於絲網印刷電極的適配體傳感器製作成本低，可以一次使用後拋棄。
技術實現要素：
為解決上述問題，本發明提供了一種基於物聯網的掌上抗生素殘留快速檢測儀，其特徵在於，檢測儀掌上手持，由紙過濾膜、絲網印刷電極抗生素適配體傳感器、類似USB接口的絲網印刷電極插入口、電信號採集與處理子模塊、顯示列印存儲子模塊、電源子模塊和無線數據輸出模塊組成；所述的一種基於物聯網的掌上抗生素殘留快速檢測儀，通過電信號採集裝置可檢測絲網印刷電極工作區域接觸樣品前後導致的電流信號變化，將信號送至檢測儀的數據處理模塊進行數據處理後，獲取樣品中的抗生素殘留量的信息； 所述的紙過濾膜放置於絲網印刷電極表面，紙過濾膜是帶有疏水區和親水通道的微孔濾膜，將檢測樣品滴到紙過濾膜的檢測分離區，牛奶等樣品蛋白質等由於大於分離膜的孔徑而不能透過分離膜，而小分子抗生素透過分離膜，通過通道的親水吸力進入測試區，樣品滲透到絲網印刷電極的工作表面，解決現有的抗生素殘留檢測儀需要進行樣品前處理問題；所述的紙過濾膜的製作過程如下：將一片Whatman No. 1定性濾紙切成大小為1.8 cm×2.0 cm的矩形，將兩片Whatman樣品分離膜切成大小為1.6 cm×2.0 cm的矩形。將Whatman No. 1定性濾紙的邊緣重疊在距離樣品分離膜邊緣1mm處，置於載玻片上。然後，將一個啞鈴型磁鐵放在濾紙上，通過載玻片另一側的永磁體將其暫時性吸附在濾紙表面。然後，在105~130℃，將其浸入融化的蠟中，浸漬時間1s。20s後，將定性濾紙和載玻片分離，並且將啞鈴型磁鐵從濾紙上移除。最後，通過蠟浸漬技術，使濾紙與樣品分離膜的重疊區域粘著在一起。
所述的絲網印刷電極抗生素適配體傳感器，其特徵在於，所述的絲網印刷電極適配體傳感器，其製備方法為：是在清洗活化後的絲網印刷電極表面分別先後修飾上製備的納米金-殼聚糖、納米碳纖維-納米金複合物，然後在修飾好的電極上分別滴加二茂鐵-適配體、適配體，得到檢測抗生素的適配體傳感器。所述適配體傳感器製備具體步驟如下：
1）納米金/納米金-殼聚糖複合物、納米碳纖維(NCFs)、二茂鐵(Fc)-適配體的製備；
2）清洗活化絲網印刷電極，得到預處理的絲網印刷電極；
3）將步驟1）製備得到的納米金-殼聚糖複合物和納米碳纖維/納米金分別修飾到步驟2）預處理的絲網印刷電極上，得到修飾好的絲網印刷電極；
4) 將二茂鐵-適配體、適配體分別滴加到步驟3）所得的修飾好的絲網印刷電極上，自然晾乾後得到基於絲網印刷電極的基礎適配體傳感器；
5）優化步驟4）所得的基礎適配體傳感器的三種試驗條件；
6）在步驟5）所得的最優條件下，對目標抗生素進行檢測。
所述抗生素適配體傳感器製備方法，其特徵在於，步驟1）所述納米金-殼聚糖複合物、納米碳纖維、二茂鐵-適配體分別是以殼聚糖為分散劑分散納米金，取一定濃度的納米碳纖維溶液，將二茂鐵與適配體混合得到分散均勻的懸濁液。
所述抗生素適配體傳感器製備方法，其特徵在於，步驟3）所述絲網印刷電極電極的修飾，是分別先將7 μL納米金-殼聚糖複合物、30% 納米碳纖維溶液和納米金溶液滴加到預處理的絲網印刷電極上，室溫下晾乾，分別得到納米金-殼聚糖，納米碳纖維/納米金修飾的絲網印刷電極。
所述抗生素適配體傳感器製備方法，其特徵在於，步驟4）所述在修飾好的電極上分別滴加7 μL 二茂鐵-適配體複合物、適配體溶液，是將7 μL 二茂鐵-適配體複合物滴加到納米金-殼聚糖修飾好的絲網印刷電極上，將7 μL 適配體溶液滴加到納米碳纖維/納米金修飾的絲網印刷電極上，在4℃條件下乾燥，得到兩種適配體生物傳感器。
所述抗生素適配體傳感器製備方法，其特徵在於，步驟5）所述兩種適配體生物傳感器的三種試驗條件測試底液pH值、適配體濃度、孵育時間分別進行了優化：pH值為7.0，適配體濃度為6 μM，孵育時間為60 min。
所述抗生素適配體傳感器製備方法的步驟6）所述滴加不同濃度的目標抗生素標準液，孵育 60 min，在底液中進行循環伏安法檢測。
所述的絲網印刷電極的夾持裝置，是一個類似於USB接口裝置，可以將絲網印刷電極的三電極埠直接插入，並將三電極工作表面的電化學反應產生的電流信號傳遞給電信號採集裝置；所述的電流信號採集與處理子模塊，該子模塊含有微處理器、I/V轉換電路、信號放大電路、濾波電路和A/D轉換電路，該子模塊將接收到的檢測信號經過I/V轉換、信號放大、濾波和A/D轉換處理後生成初始檢測信息，初始檢測信息被傳輸給顯示與列印子模塊和數據傳輸子模塊；所述的顯示與列印存儲子模塊，該子模塊由觸控螢幕驅動電路、列印電路、存儲器電路、存儲器、液晶觸控螢幕和微型印表機組成，該子模塊在接收到初始檢測信息後，將初始檢測信息通過存儲器電路傳輸給存儲器存儲，通過列印電路傳輸給微型印表機列印，並通過液晶觸控螢幕顯示；所述的電源子模塊，採用9V鋰電池和基於CW7805三端集成穩壓器組成，為檢測儀提供穩定的電源供給。
所述無線數據輸出模塊，採用Zigbee將檢測數據發送至農產品安全溯源物聯網資料庫。
本發明獲得有益效果如下：
現有抗生素檢測設備儀器過於笨重，體積較大，攜帶不方便，且通常需要對牛奶等樣品進行前處理，離不開實驗室條件，本發明的基於物聯網的掌上抗生素殘留快速檢測儀，使用帶有紙過濾膜的絲網印刷電極直接插入掌上檢測儀器，既解決了牛奶樣品無需前處理，將牛奶直接滴入帶有微孔濾膜的絲網印刷電極，然後將絲網印刷電極插入掌上檢測儀器，就可以完成抗生素殘留的濃度及是否超標的檢測信息。檢測儀器使用鋰電池作為電源，檢測儀隨身攜帶方便，完全不需要實驗室條件支持，使用操作簡單，且檢測數據隨時無線傳至農產品安全檢測物聯網資料庫。可以家庭使用，也可以用於生產企業自檢。
具體實施方式
下面結合實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
所述的一種基於物聯網的掌上抗生素殘留快速檢測儀，其特徵在於，檢測儀掌上手持，由紙過濾膜、絲網印刷電極適配體傳感器、類似USB接口的絲網印刷電極插入口、電信號採集與處理子模塊、顯示列印存儲子模塊、電源子模塊、和無線數據輸出模塊組成。
所述的紙過濾膜的製作方法如下：將一片Whatman No. 1定性濾紙切成大小為1.8 cm×2.0 cm的矩形，將兩片Whatman樣品分離膜切成大小為1.6 cm×2.0 cm的矩形。將Whatman No. 1定性濾紙的邊緣重疊在距離樣品分離膜邊緣1mm處，置於載玻片上。然後，將一個啞鈴型磁鐵放在濾紙上，通過載玻片另一側的永磁體將其暫時性吸附在濾紙表面。然後，在105~130℃，將其浸入融化的蠟中，浸漬時間1s。20s後，將定性濾紙和載玻片分離，並且將啞鈴型磁鐵從濾紙上移除，最後，通過蠟浸漬技術，使濾紙與樣品分離膜的重疊區域粘著在一起。
所述的絲網印刷電極抗生素適配體傳感器製備具體步驟如下：
1） 納米金/納米金-殼聚糖複合物、納米碳纖維、二茂鐵-適配體的製備：100 mL 0.01%的氯金酸（W/V）滴加到燒杯中，置於電爐上加熱，邊加熱邊攪拌直至沸騰，然後迅速加入2.5 mL 1% 檸檬酸鈉溶液，隨著反應的進行該溶液很快變成了紅寶石顏色，說明指示的金納米粒子的形成。劇烈攪拌該溶液持續1h後，得到所製備的納米金溶液；稱取0.5 g殼聚糖（CS）置於燒杯中，加入1.0 %的醋酸溶液攪拌溶解，將溶解好的溶液置於250 mL容量瓶中並定容，定容後的溶液倒入燒杯中，在磁力攪拌器下磁力攪拌10 h，得到0.2%的殼聚糖溶液；將20 mL 1％的殼聚糖（CS）乙酸溶液（W/V））攪拌加入到上述納米金溶液中得到納米金-殼聚糖複合物；1 g 二茂鐵加入到100 mL 乙醇溶液中超聲30 min，得到 1% (w/v) 二茂鐵溶液，然後將適配體溶液加入到二茂鐵溶液中，在4℃ 下攪拌混勻12h，得到二茂鐵-適配體複合物。
2）絲網印刷電極的清洗、活化：首先，將絲網印刷碳電極放入盛有1mM NaOH溶液的小燒杯中超聲清洗5min，超純水清洗，氮氣吹乾，然後，將電極放入盛有1mM HCl 溶液的小燒杯中超聲清洗5min，超純水清洗，氮氣吹乾，之後，用無水乙醇清洗電極，氮氣吹乾，最後，在pH=5的磷酸鹽緩衝液中進行電流-時間曲線掃描300s，之後，進行循環伏安曲線掃描，直至性能穩定；
3）絲網印刷電極的修飾：在絲網印刷電極上分別滴加7 μL 納米金-殼聚糖複合物、30% 納米碳纖維溶液和納米金溶液滴加到預處理的絲網印刷電極上，室溫下晾乾，分別得到納米金-殼聚糖，納米碳纖維/納米金修飾的絲網印刷電極；
4）適配體的固定：在上述的電極上滴加7 μL 二茂鐵-適配體複合物滴加到納米金-殼聚糖修飾好的絲網印刷電極上，將7 μL 適配體溶液滴加到納米碳纖維/納米金修飾的絲網印刷電極上，在室溫下乾燥，得到兩種適配體生物傳感器，並將製備好的電極放於4℃乾燥的環境中保存備用；
5）試驗條件的優化：製備一系列pH值的磷酸鹽緩衝液，pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，並分別配成了一系列的檢測底液，在這些底液中對傳感器電流值進行檢測，篩選出最佳pH值7.0；分別向電極負載2 μM、4 μM、5 μM、6 μM、8 μM的適配體，對其電流值進行檢測，篩選出最佳適配體濃度為6 μM；用同一濃度的四環素孵育時間分別控制為30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，對其電流值進行檢測，篩選出最佳孵育時間為60 min；
6）四環素的檢測：在最優條件下：pH 7.0，適配體濃度 6 μM，孵育時間60 min，在兩種適配體傳感器上對不同濃度的四環素進行電流檢測，並分別建立了建立不同四環素濃度與絲網印刷電極電流變化之間的關係曲線，進而得到不同濃度的四環素的對數值與電流峰值比率之間的線性回歸方程為y=-0.02854x - 0.02655 (R2 = 0.994， 濃度範圍10-11～10-9g/mL)，y = -0.00225x + 0.20538 (R2 = 0.997，濃度範圍10-9～10-3g/mL)。
將製作好的紙過濾膜置於製備好的絲網印刷適配體傳感器上面。
所述的掌上抗生素殘留快速檢測儀，裝置部分如下：
所述的絲網印刷電極的夾持裝置，是一個類似於USB接口裝置，可以將絲網印刷電極的三電極埠直接插入，並將三電極工作表面的電化學反應產生的電流信號傳遞給電信號採集裝置；所述的電流信號採集與處理子模塊，該子模塊含有微處理器、I/V轉換電路、信號放大電路、濾波電路和A/D轉換電路，該子模塊將接收到的檢測信號經過I/V轉換、信號放大、濾波和A/D轉換處理後生成初始檢測信息，初始檢測信息被傳輸給顯示與列印子模塊和數據傳輸子模塊；所述的顯示與列印存儲子模塊，該子模塊由觸控螢幕驅動電路、列印電路、存儲器電路、存儲器、液晶觸控螢幕和微型印表機組成，該子模塊在接收到初始檢測信息後，將初始檢測信息通過存儲器電路傳輸給存儲器存儲，通過列印電路傳輸給微型印表機列印，並通過液晶觸控螢幕顯示；所述的電源子模塊，採用9V鋰電池和基於CW7805三端集成穩壓器組成，為檢測儀提供穩定的電源供給；所述無線數據輸出模塊，採用Zigbee將檢測數據發送至農產品安全溯源物聯網資料庫。
將帶有紙過濾膜的絲網印刷電極插入掌上檢測儀器的預留插口，將牛奶等樣品放於紙微孔濾膜的兩端，1min後按下檢測按鈕，即可進行檢測。
所述的基於物聯網的掌上抗生素殘留快速檢測儀，其特徵在於，該檢測儀可用於檢測牛奶等樣品中的適配體目標抗生素殘留。
所述的一種基於物聯網的掌上抗生素殘留快速檢測儀，其特徵在於，採用本發明使用一次性可拋棄的絲網印刷電極進行檢測，操作簡單攜帶方便，且本身帶有紙過濾膜，實現了牛奶樣品無需前處理，將牛奶直接滴入帶有紙過濾膜的絲網印刷電極，然後將絲網印刷電極插入掌上檢測儀器，就可以完成抗生素殘留的濃度及是否超標的檢測信息。檢測儀器使用鋰電池作為電源，檢測儀隨身攜帶方便，完全不需要實驗室條件支持，使用操作簡單，且檢測數據隨時無線傳至農產品安全檢測物聯網資料庫。可以家庭使用，也可以用於生產企業自檢。
以上實施方式僅用於說明本發明，而並非對本發明的限制，有關技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明的精神和範圍的情況下，還可以做出各種變化和變型，因此所有等同的技術方案也屬於本發明的範疇，本發明的專利保護範圍應由權利要求限定。