細菌澱粉酶在牛類動物的飼料中的用途的製作方法

2023-06-07 02:26:26

專利名稱：：細菌澱粉酶在牛類動物的飼料中的用途的製作方法
技術領域：
：現代農業系統中的高產牛(cow)在下述條件下生長，所述條件的特徵為非常高的乳產量(奶牛(dairycow))或生長速率(肉用牛(beefcattle)),其後為同樣高的能量需求。當增加攝入超過維持水平時，飼料的利用率(utilisation)就會顯著下降。部分出於此原因，反芻動物飼料中包括了越來越易於降解的飼料，例如含澱粉原料，如基於穀類的濃縮物和全穀物青忙飼料(wholecerealsilage)。經常在排洩物(faeces)中回收含澱粉材料，這說明這些飼料組分的利用率還可進一步增加。本發明涉及細菌澱粉酶在牛類動物(bovineanimal),如奶牛和肉用牛的飼料中的用途，特別是用於改進乳產量(milkyield)、增重(weightgain)、表觀消化率(apparentdigestibility)、使用尼龍袋法(nylonbagmethod)的飼料乾物質(feedstuffdrymatter)的消失(disappearance),和/或飼料轉化率(feedconversion)。本發明還涉及組合物，如包含細菌澱粉酶的飼料添加劑和飼料，以及製備這些組合物的方法。
背景技術：
：W003/068256A1描述了用於改進反芻動物營養的澱粉酶飼料補充劑。使用的澱粉酶是由米麴黴(Aspergillusoryzae)產生的真菌澱粉酶。Tricarico等在AnimalScience2005,81:365-374描述了含有α-澱粉酶活性的米麴黴提取物對泌乳的(Iactating)荷爾斯坦因(Holstein)奶牛的瘤胃發酵(ruminalfermentation)和乳產生的影響。美國專利號3，250，622公開了特定添加劑的用途，所述添加劑含有蛋白分解酶和澱粉分解酶以及膠酶(gumase)，其與磨碎的麥芽載體密切相關，用於刺激奶牛中乳的產生。沒有指定所述酶的來源。Mora-Jaimes等(Agrociencia36(I)(2002)，31-39)研究了用澱粉酶處理的餵食羊羔的高粱穀物的性能和瘤胃發酵。Rojo等(AnimalFeedScienceandTechnology,123-124(2005),655-665)研究了來自地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)和黑麴黴(Aspergillusniger)的外源澱粉酶對瘤胃澱粉消化和羊羔性能的影響。W001/41795A1涉及蛋白酶和季氨羧酸內鹽的組合在球蟲病(coccidiosis)和細菌感染的治療和/或預防中的用途。而且還要求保護通常的動物增重的改進。可以包括木聚糖酶和/或澱粉酶。提到了來自枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)的α-澱粉酶。雖然也提到了反芻動物，然而所有實例都涉及肉用子雞(broilerchick)。本發明的目的是提供可替代的、優選改進的澱粉酶，其可以通過改進飼料利用率、乳產量和/或增重而減輕上述問題。此外，或者可選地，本發明的澱粉酶可以具有改進的性質，如劑量響應曲線(dose-responseprofile)、pH曲線、粒化穩定性(pelleting-stability)、溫度穩定性、膽汁鹽(bile-salt)穩定性、蛋白酶穩定性,和/或比活性。此外，或者可選地，本發明的澱粉酶能夠降解瘤胃(rumen)、大腸和/或小腸中的澱粉。發明簡述本發明涉及至少一種細菌澱粉酶在牛亞科動物(animalofthesubfamilyBovinae)的飼料中的用途，特別是用於改進乳產量、增重、飼料消化率和/或飼料轉化率(FCR)。本發明還涉及至少一種細菌澱粉酶在組合物製備中的用途，所述組合物用於牛亞科動物的飼料中。此外，本發明涉及飼料添加劑組合物，其包含至少一種細菌澱粉酶，連同至少一種選自維生素和/或礦物質的額外組分。最後，本發明涉及組合物，其包含至少一種細菌澱粉酶，連同至少一種選自乾草(hay)、草料(forage)、粗飼料(roughage)和/或飼料濃縮物(feedconcentrate)的額外組分。這種組合物的實例是飼料濃縮物和全混合日糧(totalmixedration)(TMR)。具體地，本發明涉及如下各項:1.細菌澱粉酶在牛亞科動物的飼料中的用途。2.項I的用途，用於改進乳產量、體重增加和/或飼料轉化率。3.項I的用途，用於改進乳產量、表觀消化率，和/或使用尼龍袋法的飼料乾物質消失。4.項I的用途,其與纖維素酶組合使用。5.項4的用途，用於改進乳產量和/或背脂厚度。6.細菌澱粉酶在用於牛亞科動物飼料的組合物的製備中的用途。7.製備用於牛亞科動物的飼料中的組合物的方法，所述方法包括向至少一種飼料組分中添加細菌澱粉酶的步驟。8.項7的方法，所述方法還包括添加纖維素酶。9.增加牛亞科動物乳產量的方法，所述方法包括向動物飼料中添加細菌澱粉酶的步驟。10.項9的方法，其還包括向動物飼料中添加纖維素酶。11.增加牛亞科動物的背脂厚度的方法，所述方法包括向動物飼料中添加與纖維素酶組合的細菌澱粉酶的步驟。12.增加牛亞科動物的體重增加和/或飼料轉化率的方法，所述方法包括向動物飼料中添加細菌澱粉酶的步驟。13.改進牛亞科動物的飼料乾物質的消失和/或表觀消化率的方法，所述方法包括向動物飼料中添加細菌澱粉酶的步驟。14.飼料添加劑組合物，其包含細菌澱粉酶，連同選自維生素和礦物質的至少一種額外組分。15.項14的飼料添加劑，其還包含纖維素酶。16.項15的組合物，其為礦物質預混物、維生素預混物，或包括維生素和礦物質的預混物。17.組合物，其包含細菌澱粉酶，以及至少一種選自乾草、草料、粗飼料和/或濃縮物的額外的組分。18.項17的組合物，其還包含纖維素酶。19.項17的組合物，其為富含澱粉酶的濃縮物。20.項17的組合物，其為富含澱粉酶的全混合日糧。21.項17-20中任一項的組合物，其包含玉蜀黍和/或高粱。22.項21的組合物，其包含玉蜀黍。發明詳述在本上下文中，澱粉酶是催化澱粉和其它直鏈和支鏈寡糖和多糖的內-水解的酶。在具體的實施方案中，根據本發明使用的澱粉酶具有α-澱粉酶活性，g卩，催化寡糖和多糖中1，4-α_糖苷鍵的內水解。α-澱粉酶以隨機方式作用於，例如澱粉、糖原和相關的多糖和寡糖，釋放α-構型中的還原基團。在優選的實施方案中，本發明的澱粉酶是Ct_澱粉酶(系統名稱:1，4_a-D-匍聚糖葡聚糖水解酶)。在其它實施方案中，本發明的澱粉酶屬於澱粉酶的EC3.2.1組，如EC3.2.1.1(α-澱粉酶)、EC3.2.1.2(β-澱粉酶)、EC3.2.1.3(葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶、澱粉葡糖苷酶或葡糖澱粉酶)、EC3.2.1.20(α-葡糖苷酶)、EC3.2.1.60(葡聚糖I,4-α-麥芽四糖水解酶(glucanl,4_a-maltotetraohydrolase))、EC3.2.1.68(異澱粉酶)、EC3.2.1.98(葡聚糖1，4-α-麥芽己糖酶)或EC3.2.1.133(葡聚糖1，4-α-麥芽糖水解酶)。在優選實施方案中，根據本發明使用的澱粉酶可分類為(或者分類為)屬於EC3.2.1.1組。EC號是指來自NC-1UBMB的EnzymeNomenclature(酶命名法)1992，AcademicPress,SanDiego,California,其包括分別在Eur.J.Biochem.1994，223，1-5;Eur.J.Biochem.1995,232,1-6;Eur.J.Biochem.1996,237,1-5;Eur.J.Biochem.1997,250，1-6;andEur.J.Biochem.1999，264，610-650出版的補遺1-5。命名法定期地補充和更新，參見例如在http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index,html的全球資訊網。可以用任何合適的試驗確定澱粉酶活性。通常，pH試驗和溫度試驗可以適用於所述的酶。PH值試驗的實例為pH2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll或12。溫度試驗的實例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95°C。優選的pH值和溫度在生理範圍內，如3、4、5、6、7或8的pH值，和30、35、37或40°C的溫度。優選的試驗方法是本文實施例5中的KNU(S)法。另一個優選的試驗方法是本文實施例6中的還原糖法。可選地，可以使用下述澱粉酶試驗方法:底物=Phadebas片劑(PharmaciaDiagnostics;交聯的不溶性藍色澱粉聚合物,其與牛血清白蛋白和緩衝物質混合，並製成片劑)。試驗溫度:37°C。試驗pH:4.3(或7.0，如果期望的話)。反應時間:20分鐘。在懸浮於水中後，用α-澱粉酶水解澱粉，得到可溶的藍色片段。在620nm測定所得的藍色溶液的吸光度，其是α-澱粉酶活性的函數。一個真菌α-澱粉酶單位(IFAU)是在標準的試驗條件下每小時分解5.26g澱粉的酶量。優選的澱粉是Merck,Amylum可溶的Erg.B.6，批號9947275。對試驗更詳細的描述，APTSMYQ1-3207，可應要求從NovozymesA/S,Krogshoejvej36,DK_2880Bagsvaerd,Denmark獲得。在具體的實施方案中，明確定義了澱粉酶，所述澱粉酶以加入到飼料中的形式存在，或者以包括於飼料添加劑中的形式存在。明確定義指，澱粉酶製備物為蛋白質基礎上的至少50%純度。在另外的具體實施方案中，澱粉酶製備物為至少60、70、80、85、88、90、92、94或者至少95%純。可以通過本領域已知的任何方法，例如通過SDS-PAGE，或者通過大小排阻色譜(參見W001/58275的實施例12)來確定純度。定義明確的澱粉酶製備物具有優勢。例如，要劑量正確地(dosecorrectly)將澱粉酶加入飼料就容易得多，所述澱粉酶基本不含幹擾或者汙染的其它酶。術語劑量正確地具體指目的是獲得一致而恆定的結果，和獲得根據期望的效果優化劑量的能力。具有這種數量級的純度的澱粉酶製備物可以使用重組的產生方法獲得，但是它們不那麼容易獲得，而且當用傳統的發酵方法產生時，各批次之間的差別要高得多。本發明的澱粉酶的分離、純化和濃縮可以通過常規方法進行。例如，可以通過常規步驟從發酵液中回收澱粉酶，所述常規步驟包括，但不限於離心、過濾、萃取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱，並通過本領域已知的各種方法進一步純化，所述方法包括，但不限於色譜(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE，或提取(參見，例如，ProteinPurification,J.-C.Janson和LarsRyden編，VCHPublishers,NewYork,1989)。可如本領域已知的將純化的澱粉酶配製成適用於動物飼料和/或動物飼料添加劑的液體或固體產品。根據本發明使用的細菌澱粉酶以有效量包括於牛飲食或牛飼料添加劑中。現在期望的是，有效量低於IOOOmg酶蛋白每kg飲食乾物質(ppm)，優選低於800、600、500、400，或低於300ppm。在優選的實施方案中，澱粉酶的劑量低於200mg酶蛋白每kg飲食乾物質，優選低於150、100、90、80、70、60或低於50ppm。在甚至更優選的實施方案中，澱粉酶的劑量低於40、35、30、25或低於20ppm。在最優選的實施方案中，澱粉酶的劑量低於15、12、10、9、8或低於7mg酶蛋白每kg飲食乾物質。另一方面，有效量可以高於0.0lmg酶蛋白每kg飲食乾物質，優選高於0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30,0.35,0.40,0.45,0.50,0.75、1、2、3或高於4mg酶蛋白每kg飲食乾物質(ppm)。因此，優選劑量範圍的非限定性實例為:0.10-50mg酶蛋白/kg，優選0.50-10、1-9、2-8、3-8，或4-711^酶蛋白/kg。優選劑量範圍的其它實例(均以PPm表示)為:1-35、1-30、2-25、3-20和4-15。為了確定每kg飼料的澱粉酶蛋白mg數,從飼料組合物純化澱粉酶,使用期望的澱粉酶方法確定純化後的澱粉酶的比活性。也可以使用相同的方法同樣地確定飼料組合物的澱粉酶活性，根據這兩個確定結果，計算以mg澱粉酶蛋白每kg飼料表示的劑量。將同樣的規則應用於確定飼料添加劑中的澱粉酶蛋白mg數。當然，如果樣品使用了用於製備添加劑或飼料的澱粉酶，可以由此樣品確定比活性(不需要從飼料組合物或添加劑中純化澱粉酶)。為了對細菌進行分類學上的分類和鑑定，必須參照Bergey’sManualofSystematicBacteriology(1986),vol2,ISBN0-683-0783o可供選擇地，可以使用為人所熟知的16SrRNA序列分析(參見例如Johansen等，Int.J.Syst.Bacteriol,1999,49，1231-1240，特別是1233頁第二欄的方法部分)；或者可以諮詢分類學專家，例如，來自DSMZ或其它公認的保藏機構的分類學專家。如在本文中使用的，術語細菌指示了澱粉酶源自細菌。術語「源自」包括可以獲得或者獲得自野生型的細菌菌株，以及它們的變體的酶。變體可以具有至少一個胺基酸殘基的至少一個取代、插入和/或缺失。術語變體還包括重排體(shuffIant)、雜合體(hybrid)、嵌合酶和共有酶(consensusenzyme)。可以用本領域已知的任何方法產生變體，所述方法如定點突變、隨機突變、共有衍生方法(consensusderivationprocess)(EP897985)和基因重排(W095/22625，W096/00343)等。就本目的而言，當使用至少一種細菌澱粉酶進行變體的設計、衍生或製備時，澱粉酶變體可以稱為(qualifyas)細菌的。術語細菌的指的不是可能的重組產生宿主，而只是指澱粉酶編碼基因的宿主起源。根據本發明使用的澱粉酶優選源自芽孢桿菌屬(Bacillus)的菌株，如解澱粉芽抱桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、環狀芽抱桿菌(Bacilluscirculans)、Bacillushalmapalus、地衣芽抱桿菌(Bacilluslicheniformis)、巨大芽抱桿菌(Bacillusmegaterium)、芽孢桿菌屬的菌種(Bacillussp.)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)和枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis);優選來自解澱粉芽抱桿菌、Bacillushalmapalus、地衣芽孢桿菌、芽孢桿菌屬的菌種和嗜熱脂肪芽孢桿菌的菌株；更優選來自解澱粉芽孢桿菌、Bacillushalmapalus、芽孢桿菌屬的菌種和嗜熱脂肪芽孢桿菌；甚至更優選來自解澱粉芽孢桿菌、Bacillushalmapalus、芽孢桿菌屬的菌種和嗜熱脂肪芽孢桿菌；最優選來自嗜熱脂肪芽孢桿菌。根據本發明使用的澱粉酶的非限定性實例是源自下述的那些:地衣芽孢桿菌，如Swissprot入口名(entryname)AMY_BACLI,初級登錄號P06278;解澱粉芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY_BACAM，初級登錄號P00692；巨大芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY_BACME，初級登錄號P20845;環狀芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY_BACCI，初級登錄號P08137;嗜熱脂肪芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY_BACST，初級登錄號P06279。另一個實例源自枯草芽孢桿菌，如Swissprot入口名AMY_BACSU，初級登錄號P00691。就本發明而言,優選的澱粉酶是下述商業產品中包含的澱粉酶:BAN、Stainzyme、TermamylSC、Natalase和Duramyl(全部來自Novozymes)。根據本發明使用的更特定的澱粉酶實例是包含於商業的ValidaseBAA和ValidaseHT產品中(來自ValleyResearch)的澱粉酶。根據本發明使用的澱粉酶的更進一步的具體實例是包含於下述商業產品中的澱粉酶:Clarase、DexLo,GC262SP、G-ZymeG990、G-ZymeG995、G-ZymeG997、G-ZymeG998、HTAA>0ptimax7525、PurastarOxAm>PurastarST、SpezymeAA>SpezymeAlpha、SpezymeBBA>SpezymeDeltaAA>SpezymeDBA、SpezymeEthyl>SpezymeFred(GC521)>SpezymeHPA、SpezymeExtra和Ultraphlow(全部來自Genencor)；ValidaseHT340L、ValleyThin340L(全部來自ValleyResearch)；Avizymel500>Dextro300L>Kleistase>Maltazyme>Maxamyl>Thermozyme>Thermatex>StarzymeHT120L、StarzymeSuperCone,和Ultraphlo0本發明還涉及:澱粉酶在牛亞科動物飼料中的用途，所述澱粉酶具有與SEQIDN0:2的胺基酸1-481具有至少65%同一1丨生的胺基酸序列；這種澱粉酶在製備組合物中的用途，所述組合物用於牛亞科動物的飼料中；飼料添加劑組合物，其包含這種澱粉酶，以及選自維生素和/或礦物質的至少一種額外組分(additionalingredient);和組合物(例如飼料組合物)，其包含這種澱粉酶以及選自乾草、草料、粗飼料和/或飼料濃縮物的至少一種額外組分。優選地，在飼料中的用途是(i)改進乳產量、增重和/或飼料轉化率(FeedConversionRatio)；(ii)改進乳產量、表觀消化率和/或使用尼龍袋法的飼料乾物質的消失；(iii)與纖維素酶組合。(iii)的用途可以是(iv):改進乳產量和/或背脂厚度(backfatthickness)。優選地，飼料添加劑包含纖維素酶。更優選地，飼料添加劑是預混物(premix),如礦物質預混物、維生素預混物，或包括維生素及礦物質的預混物。飼料組合物優選還包含纖維素酶。飼料組合物可以是富含澱粉酶的濃縮物(concentrate)、富含澱粉酶的全混合日糧,和/或可以包含玉蜀黍(maize)和/或高粱,優選玉蜀黍。本發明還涉及製備組合物的方法，所述組合物用於牛亞科動物的飼料中，所述方法包括向至少一種飼料成分中加入澱粉酶的步驟，所述澱粉酶具有與SEQIDNO:2的胺基酸^81有至少65%同一性的胺基酸序列。優選地，所述方法還包括加入纖維素酶。本發明還涉及增加牛亞科動物的乳產量的方法，所述方法包括向動物飼料中加入澱粉酶的步驟，所述澱粉酶具有與SEQIDNO:2的胺基酸1-481有至少65%同一性的胺基酸序列。優選地，所述方法還包括向動物飼料中加入纖維素酶。本發明還涉及增加牛亞科動物的背脂厚度的方法，所述方法包括向動物飼料中加入澱粉酶與纖維素酶組合的步驟，所述澱粉酶具有與SEQIDNO:2的胺基酸1-481有至少65%同一'丨生的胺基酸序列。本發明還涉及改進表觀消化率、使用尼龍袋法的飼料乾物質的消失，增加增重和/或改進牛亞科動物的飼料轉化率的方法，所述方法包括向飼料或飼料添加劑中加入澱粉酶的步驟，所述澱粉酶具有與SEQIDNO:2的胺基酸1-481有至少65%同一性的胺基酸序列。將本發明的胺基酸序列(「發明序列」；例如，SEQIDNO:2的胺基酸1_481)和不同的胺基酸序列(「外源序列」)之間的同一性程度計算為:兩個序列比對中完全匹配的數目，除以「發明序列」的長度或「外源序列」的長度中最短的。將結果用百分比同一性表示。作為實例，下面是SEQIDNO:2的胺基酸1-481(「發明序列」)與SEQIDN0:4(「外源序列」)的比對的部分:SEQ2,I481IAAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKG49____11111111111Ij:11..I.::.::1:1I…I1:1:1:1j1:1ISEQ4IHHNGTNGTMMQYFEWYLPNDGNH麗RLRSDASNLKDKGISAVWIPPAWKG50當「發明序列」和「外源序列」在重疊的相同位置具有同樣的胺基酸殘基時，即發生了完全匹配(在比對實例中，完全匹配的胺基酸殘基下面用「|」表示)。實例中完全匹配的數目是28。序列的長度是序列中胺基酸殘基的數目(例如，具有SEQIDNO:2的胺基酸1_481的序列的長度是481)。在實例中，發明序列的長度是49，而外源序列的長度是50。在實例中，重疊是上面序列的胺基酸序列「AAPFAYKG」;或者下面序列的胺基酸序列「HNGT—AWKG'在這個實例中沒有缺口(缺口用表示)。因此，上述實例中表示的兩個部分序列的同一性為:(28(完全匹配)/49(最短序列的長度))X100%=57.14%。因此，在具體的實施方案中，通過下述方法確定多肽的胺基酸序列與(或對於)SEQIDNO:2的胺基酸I至481的同一性的百分比:i)使用具有BL0SUM62取代矩陣，缺口開放罰分為10，而缺口延伸罰分為0.5的Needle程序比對兩個胺基酸序列；ii)計數比對中完全匹配的數目；iii)將完全匹配的數目除以兩個胺基酸序列中最短者的長度，和iv)將iii)中除法的結果轉化成百分比。在優選的實施方案中，澱粉酶具有與SEQIDNO:2的胺基酸1_481有至少66、67、68或者至少69%同一性的胺基酸序列。在另一個優選的實施方案中，澱粉酶具有與SEQIDNO:2的胺基酸1-481有至少70、75、80或者至少85%同一性的胺基酸序列。在進一步優選的實施方案中，澱粉酶具有與SEQIDNO:2的胺基酸1-481有至少90、92、95、97或者至少99%同一性的胺基酸序列。在可供選擇的實施方案中，澱粉酶具有與SEQIDNO:2的胺基酸1-481有至少60、61、62、63或者至少64%同一性的胺基酸序列。在下文中，與SEQIDNO:2的胺基酸1_481具有特定的％同一性(例如，至少65%同一'I"生)的澱粉酶稱為同源澱粉酶(homologousamylase)。同源澱粉酶的非限定性實例是:源自解澱粉芽孢桿菌的澱粉酶，如Swissprot入口名AMY_BACAM,初級登錄號P00692(SEQIDNO:7)，和以商品名BAN由NovozymesΑ/S銷售的商業澱粉酶；源自地衣芽孢桿菌的澱粉酶，如Swissprot入口名AMY_BACLI，初級登錄號P06278(SEQIDNO:8)，和以商品名DURAMYL由NovozymesΑ/S銷售的商業澱粉酶；源自芽孢桿菌屬菌種的澱粉酶，如以商品名STAINZYME由NovozymesA/S銷售的商業澱粉酶；源自Bacillushalmapalus的澱粉酶，如以商品名NATALASE由NovozymesΑ/S銷售的商業澱粉酶；和源自嗜熱脂肪芽孢桿菌的澱粉酶，如Swissprot入口名AMY_BACST，初級登錄號P06279(SEQIDNO:9)，和以商品名TERMAMYLSC由NovozymesA/S銷售的商業澱粉酶。同源澱粉酶的其它非限定性實例是:具有、包含或者由SEQIDNO:2的胺基酸1-481、1-484、1-486或者1-513組成的澱粉酶(其中「I」指成熟多肽的起始胺基酸，Ala，參見序列表)；具有、包含或者由SEQIDNO:4的胺基酸1_483組成的澱粉酶；具有、包含或者由SEQIDNO:5的胺基酸1_483組成的澱粉酶；具有、包含或者由SEQIDNO:6的胺基酸1_481組成的澱粉酶(其中「I」指成熟多肽的起始胺基酸，Val，參見序列表)；具有、包含或者由SEQIDNO:7的胺基酸1_483組成的澱粉酶(其中「I」指成熟多肽的起始胺基酸，Val，參見序列表)；具有、包含或者由SEQIDNO:8的胺基酸1_483組成的澱粉酶(其中「I」指成熟多肽的起始胺基酸，Ala,參見序列表);和具有、包含或者由SEQIDNO:9的胺基酸1_515組成的澱粉酶(其中「I」指成熟多肽的起始胺基酸，Ala,參見序列表)；以及保持澱粉酶活性的任何上述澱粉酶的片段或變體。片段是從氨基和/或羧基末端缺失一個或幾個(more)胺基酸的多肽。優選地，片段包含至少450個胺基酸殘基，更優選至少460個胺基酸殘基，甚至更優選至少470個胺基酸殘基，和最優選至少480個胺基酸殘基。其它優選的片段包含至少481、483、484或至少513個胺基酸殘基。SEQIDN0:2的澱粉酶具有酶活性的片段的實例是具有其中的胺基酸1_481、1_484和1-486的序列。變體可以是包含保守取代、缺失和/或插入一個或幾個胺基酸的保守型變體，例如不顯著影響蛋白質摺疊和/或活性的小插入或取代；通常為I至大約30個胺基酸的小缺失；小的氨基或羧基末端延伸，如氨基末端甲硫氨酸殘基；多至大約20-25個殘基的小接頭肽；或通過改變淨電荷或其它功能來促進純化的小延伸，如多組氨酸序列(polyhistidinetract)、抗原表位(antigenicepitope)或結合域。保守取代的實例是在以下組之內:鹼性胺基酸組(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸組(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸組(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性胺基酸組(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸組(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小胺基酸組(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)。本發明的澱粉酶的保守型變體的非限定性實例包括小的氨基末端插入(延伸)，例如I或2個胺基酸殘基，如Ala，或Ala-Ala。可供選擇地，變體可以併入胺基酸改變，所述改變具有這樣的性質以使多肽的物理化學性質改變。例如，胺基酸改變可改進多肽的熱穩定性，改變底物特異性，改變最適PH坐寸ο在任何上述胺基酸序列中胺基酸取代、缺失和/或插入的總數是最多40、38、36、35、32、30、25、20或15個。優選地，取代、缺失和/或插入的總數是最多10，優選9，更優選8,更優選7,更優選最多6,更優選最多5,更優選4,甚至更優選3,最優選2,和甚至最優選1在具體的實施方案中，根據本發明使用的澱粉酶是制粒穩定的(pelletingstable)和/或熱穩定的。酶的解鏈溫度(meltingtemprature)(Tm)是其熱穩定性的量度。本發明的澱粉酶可以具有至少75°C、76°C、77°C、78°C、79°C、80°C、81°C、82°C、83°C、84°C、85°C、86°C、87°C、88°C、89°C、90°C、91°C、92°C、93°C、94°C或者至少95°C的Tm，如通過差示掃描量熱法(DSC)所確定的。在IOmM磷酸鈉、50mM氯化鈉緩衝液，PH7.0中進行DSC。掃描速率恆定，例如1.5°C/min。掃描間隔可為20至100°C。可以選擇另一種緩衝液用於掃描，例如pH5.0、5.5、6.0或pH6.5的緩衝液。在進一步可選的實施方案中，可以使用更高或更低的掃描速率，例如較低的掃描速率1.4°C/min>1.3°C/min>1.2°C/min>1.1°C/min>1.0°C/min或者0.9°C/min。在另一個優選的實施方案中，根據本發明使用的澱粉酶在pH7.0和37°C具有相對於最適pH和37°C時的活性至少35%的活性。更優選地，在pH7.0和37°C的活性是最適pH和37°C時活性的至少40、45、50、55、60、65、70或至少75%(參見實施例6的表6)。在另一個優選的實施方案中，本發明的澱粉酶在pH7.0和37°C和存在5mM膽汁鹽時具有相對於最適PH和37°C、不存在膽汁鹽時的活性至少25%的活性。更優選地，在PH7.0和37°C、存在5mM膽汁鹽時的活性是最適pH和37°C、不存在膽汁鹽時活性的至少30、35、40、45、50、55、60或者至少65%(參見實施例6的表7)。在進一步優選的實施方案中，本發明的澱粉酶在pH7.0和37°C時的比活性是相對於澱粉酶TERMAMYLSC在pH5.0和37°C時的比活性的至少10%，更優選至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65，或者至少70%(參見實施例6的表8)。在另一個優選的實施方案中，本發明的澱粉酶在pH7.0和37°C，存在5mM膽汁鹽時的比活性是相對於澱粉酶TERMAMYLSC在pH5.0和37°C，存在5mM膽汁鹽時的比活性的至少10%，更優選至少15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70，或者至少75%(參見實施例6的表9)。可以使用還原糖法合適地確定上述優選實施方案中提及的活性，例如，如實施例6中所述，使用優選的臘質玉米(waxycorn)作為底物。實施例6中描述了詳細的步驟。在另一個具體的實施方案中，根據本發明使用的澱粉酶在存在蛋白酶時是穩定的。蛋白酶的實例是消化蛋白酶，和飼料蛋白酶如在例如WOO1/58275、WOO1/58276、W02004/111220,2004/11122UW02004/072221和TO2005/035747中描述的蛋白酶。消化蛋白酶的實例是胰酶(pancreatin)和胃蛋白酶(pepsin)。可以通過下述方法確定蛋白酶穩定性:在期望的pH(例如pH3、4或5)在緩衝液中將0.5mg/ml純化的澱粉酶蛋白質在存在蛋白酶(例如胃蛋白酶，70mg/l)時溫育期望的時間(例如30、45、60、90或120分鐘)，然後將PH提高至期望的pH(例如pH4、5、6或7)，並使用例如本文實施例6的還原糖法測定殘餘活性。殘餘的澱粉酶活性優選為相對於對照(未用蛋白酶處理的樣品)的至少20%，優選至少30、40、50、60、70、80或至少90%。本發明的澱粉酶可以與纖維素酶組合使用。術語「與……組合」具體包括下述情況:兩種酶都有活性，並且同時或者在時間上有重疊地發揮它們的作用，優選同時發揮作用，但也可包括酶逐個作用。在本上下文中，纖維素酶是催化纖維素、地衣澱粉(Iichenin)和穀類β_D_葡聚糖中l，4-13-D-葡糖苷鍵的內水解的酶。其它名稱是，例如，內切-1，4-β-D-葡聚糖酶、β-1，4-葡聚糖酶；和β_1，4-內切葡聚糖水解酶。系統名稱是1，4-(1，3;1，4)-0-0-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。在優選的實施方案中，本發明的纖維素酶分類(或可分類)為EC3.2.1.4(酶命名法1992，見上文)。可以用任何適當的方法確定纖維素酶活性。通常地，試驗-pH和試驗-溫度可以適合於所研究的酶。試驗111值的實例是？!12、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。試驗-溫度的實例是30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95°C。優選的pH值和溫度是在生理範圍內，如PH值為3、4、5、6、7，或8，和溫度為30、35、37，或40°C。優選的纖維素酶源自木黴屬(Trichoderma)的菌株,優選裡氏木黴(Trichodermareseei),更優選CELLUCLAST纖維素酶(或其纖維素酶組分)，其商業上可從NovozymesA/S獲得。纖維素酶組分的實例是纖維二糖水解酶I和II(CBH1、CBHII)，以及內切葡聚糖酶I和II(EG1、EGII)。術語「源自」的意思如上面(澱粉酶部分)所述，且包括野生型纖維素酶，以及其變體和片段。在本h下f中，牛亞科動物(也稱作牛類(bovines)，或牛類動物(bovineanimals))指動物界(kingdomofAnimalia)、脊索動物門(phylumofChordata)、哺乳動物綱(classofMammalia)、偶蹄動物目(theorderofArtiodactyla)和牛科(familyofBovidae)的動物。生物學的亞科包括約24種中型到大型的有蹄動物(ungulate)，包括家牛(domesticanimal)、野牛(Bison)、水牛(WaterBuffalo)、犛牛(Yak)和四角與螺旋角的玲羊(four-hornedandspiral-hornedantelope)。一般特性包括偶蹄(cloven-hoof)和通常有真正的角的物種的至少一個性徵(sex)。優選的屬包括四角玲屬(Tetracerus)、藍牛屬(Boselaphus)、水牛屬(Bubalus)、牛屬(Bos)、中南大羚屬(Pseudoryx)、非洲裡予牛屬(Syncerus)、美洲裡予牛屬(Bison)、藪玲屬(Tragelaphus)和大玲羊屬(Taurotragus)。最優選的屬是牛屬，其中包括下述種:歐洲野牛(Bosprimigenius(原牛)，滅絕))、白臀野牛(Banteng)(爪睡野牛(Bosjavanicus))、白肢野牛(Gaur)(大額牛(Bosfrontalis))、耗牛(野耗牛(Bosmutus))、家牛(普通牛(Bostaurus)、瘤牛(Bosindicas)(今天經常當作原牛)，和林牛(Fouprey)(柬埔寨野牛(Bossauveli))。就本目的而言，家牛是最優選的種。就本目的而言，術語包括所有種類的家牛，和所有生產類型的牛，特別是奶牛和肉用牛。牛類是反芻動物，其特徵在於與單胃動物相比具有額外的發酵能力。例如，牛和羊在皺胃(abomasum)前有三個前胃(fore-stomach)。功能上最重要的是瘤胃，其作為飼料儲存和發酵室。通過大量而複雜的厭氧微生物(細菌、原生動物(protozoa)和真菌)進行發酵過程。這些能夠降解除了蛋白質和澱粉之外的細胞壁物質，因此使反芻動物吞咽飼料材料並其中受益，所述飼料材料不會在皺胃或小腸中降解。這包括例如乾草、其它草料和富含細胞壁物質的青貯。瘤胃中發酵的產物是短鏈脂肪酸(SCFA)，其作為反芻動物中的初級能量來源，和氣體，如甲烷和二氧化碳。因此在體外瘤胃系統中，經常用產生氣體的體積作為對給定飼料的可發酵性的量度，將體外產生氣體增加作為改進的飼料降解和增加的能源可用性的量度。大多數體外系統包括使用新鮮採樣的瘤胃流體，通常採自羊(she印)或牛(cow)。最佳的乳生產需要充足的能量攝入，並且因此優選奶牛良好的飼料利用。對於獲得肉用牛的最佳增重同樣如此。期望的是，根據本發明使用的澱粉酶改進食用澱粉在瘤胃中的降解，特別是降解緩慢的澱粉(如玉蜀黍澱粉，其未進行熱處理和/或包含大顆粒，或馬鈴薯澱粉)，由此向瘤胃微生物及反芻動物本身貢獻更多的能量(以短鏈脂肪酸的形式)。還期望的是，根據本發明使用的澱粉酶促進旁路澱粉(即通過瘤胃而到達小腸的澱粉)在小腸中的降解，和/或增加葡萄糖的吸收，從而通過最小化大腸中的微生物降解和在排洩物中排出澱粉來利用(salvage)能量。期望的是，觀察到的澱粉降解的改進將向牛提供更多的能量，從而增加乳產量或增重。在本發明的細菌澱粉酶的用途的具體實施方案中，參考本文的實施例2，平均氣體產生量(GP)為至少0.9ml，其使用本文實施例1的修正HFT方法並使用TMR作為底物。無論澱粉酶的劑量如何，優選在最優劑量，使用同樣的方法確定。在優選的實施方案中，平均氣體產生量(如上述所確定)為至少1.0、1.5、2.0、2.5、3.0或至少3.5ml。如可從實施例2中所見的,真菌澱粉酶導致充分低於(wellbelow)0.9ml的氣體產生量。這意味著真菌澱粉酶顯然不會使澱粉在瘤胃中消失。這個觀察結果得到了Tricarico等(AnimalScience2005,81:365-374)的證實，他們觀察到在泌乳奶牛中同樣有這種情況，並在瘤胃中插入導管引導補加AMAIZE的飼料(andruminalIycannulatedsteersthefeedofwhichwassupplementedwithAMAIZE)(參見摘要)。觀察到的本發明細菌澱粉酶引起的氣體產生量增加實際可以理解為澱粉降解的改進，可從實施例4中見到。因此，在具體的實施方案中，參照實施例4，使用本文實施例1的修正HFT方法以TMR作為底物並培育4小時，與沒有外源澱粉酶的對照相比較，根據本發明使用的細菌澱粉酶能減少殘餘澱粉的量。可以如實施例4中所述確定殘餘澱粉。在另一個具體的實施方案中，根據本發明使用的細菌澱粉酶至少部分地降解已經存在於牛類動物瘤胃中的澱粉。上面提及的至少0.9ml平均氣體產生量可以理解為存在於底物中的澱粉至少5%的降解。因此，根據本發明使用的細菌澱粉酶優選降解底物(或飲食，或飼料組合物)中至少5%(w/w)的澱粉，更優選至少6、7、8、9、10、11、12、13、14或者至少15%的澱粉，後面的百分比對應於1.8ml的平均氣體產生量。在其它優選的實施方案中，澱粉酶降解至少20、22、24、26、28或者至少30%的澱粉。優選的底物是TMR，例如，如實施例1中所述。就本目的而言，改進的乳產暈指下述之一:(i)每日乳產生量增加的體積(I/天);(ii)每日乳產生量增加的重量(kg/天)每日產生的kg乳相對於以kg表示的乾物質攝入的增加的比例(kg乳/gDMI)；(iv)每日產生的乳脂肪的增加的重量(kg/天)；(v)每日產生的乳蛋白質的增加的重量(kg/天)；(vi)每日3.5%脂肪修正的乳(佰tcorrectedmilk)的增加的產生量(kg/天)；和/或(vii)每日乳固體增加的產生量,其中術語「乳固體」包括乳糖、脂肪、蛋白質和乳糖的總量。增加的乳產量還可以表示為每日產生的乳糖的增加的重量(kg/天)，或者(ix)每日增加的4%脂肪修正的乳(kg/天)，例如，計算如下:(0.4Xkg乳產量)+(15Xkg乳脂肪)。當下述情況時可以獲得增加的乳產量，例如，乳的乾物質含量增加(例如更多的脂肪或蛋白質)而無伴隨的體積增加，體積增加而無乾物質的增加，和體積以及乳的乾物質含量都增加。在具體的實施方案中，參照本文實施例7，(a)相對於未添加澱粉酶的對照，每日乳產生量(kg/天)增加至少1%，優選2、3、4、5、6、7、8或至少9%；(b)相對於未添加澱粉酶的對照，每日乳產生量(kg/天)相對於乾物質攝入量(DMI)(kg/天)的比例(kg乳/kgDMI)改進至少1%,優選至少2、3或者至少4%；(C)相對於未加澱粉酶的對照，每日產生的乳脂肪的重量(kg/天)改進至少1%，優選至少2、3、4、5、6、7或者至少8%；(d)相對於未加澱粉酶的對照，每日產生的乳蛋白質的重量(kg/天)改進至少1%，優選至少2、3、4、5、6、7、8或者至少9%；(e)相對於未加澱粉酶的對照，每日3.5%(或者4%)脂肪修正的乳產生量(kg/天)改進至少1%，優選至少2、3、4、5、6、7、8或者至少9%;和/或(f)相對於未加澱粉酶的對照，3.5%(或者4%)脂肪修正的乳產生量(kg/天)提高至少1%，優選至少2、3、4或者至少5%。實施方案(a)-(f)優選指如下面FCR段落中所述的牛試驗(cow-trial)。飼料轉化率(FCR)說明如何有效地利用飼料。FCR越低，飼料利用得越好。可以根據牛試驗確定FCR，所述試驗包括:第一處理，其中將根據本發明使用的澱粉酶以期望濃度(例如，6或30mg酶蛋白質每kg飼料,優選每kg飼料乾物質(DM))加入動物飼料,和未向動物飼料中加入澱粉酶的第二處理(對照)，每個處理由四頭或七頭牛(優選奶牛)組成，牛在畜舍(barn)(優選具有散養畜欄(freestall))中圈養,配備Calan門(Calangate)用於測定個體的飼料攝入，用TMR飲食飼養牛，其中優選包含50%濃縮物(主要由玉米粉(cornmeal)、粗小麥粉(wheatmiddling)、含可溶物的幹酒糟(distiller，sdriedgrainwithsolubles)和大豆粉(SBM)組成)、37%玉米青忙、7%苜猜半乾青忙(alfalfahaylage)和6%苜蓿乾草，將FCR計算為相對於以kg每天每隻牛(可選地，對於增重為kg每隻牛)表示的乳產量(或者可選地，增重)的以kg/牛(優選kgDM/牛)表示的進行期望時間的試驗(例如第一、第二、第三或第四個21天時間，或者全部84天時間)的飼料攝入，相對於第二處理的FCR，第一處理的FCR得到改進。為了解詳情，參見實施例7。在具體的實施方案中，同對照相比，FCR改進(即，減少)至少1.0%，優選至少1.5%、1.6%、1.7%、1.8%、1.9%、2.0%、2.1%、2.2%、2.3%、2.4%或者至少2.5%。在進一步具體的實施方案中，同對照相比，FCR改進(即減少)至少2.6%、2.7%、2.8%、2.9%或者至少3.0%。在更進一步的具體實施方案中，同對照相比，FCR改進(即減少)至少3.1%、3.2%、3.3%、3.4%、3.5%、3.6%、3.7%或者至少3.8%。可供選擇地，改進是相對於對照組而言，對照組接受劑量為240DU/kgTMR乾物質的AMAIZE澱粉酶。改進的遭重指相對於未加澱粉酶的對照，改進的每日、每周、每兩周或每月的增重(用g或kg每個相對時間段表示)。這優選在如上面FCR段落中所述的試驗中確定。在具體的實施方案中，本發明的澱粉酶改進飼料的表觀消化率(例如，與未加澱粉酶的對照相比)。特別地，本發明的澱粉酶可以改進乾物質消化率、中性洗滌劑纖維消化率和/或有機物消化率。此外，本發明的澱粉酶可以改進澱粉消化率和/或粗蛋白質消化率。例如，本發明的澱粉酶將(i)乾物質消化率改進至少1%，更優選至少2、3、4、5、6、7、8或者至少9%；(ii)中性洗滌劑纖維消化率改進至少2%，更優選至少4、5、10或者至少20%，甚至更優選至少25、30或者至少35%；(iii)有機物消化率改進至少1%，更優選至少2、3或者至少4%，甚至更優選至少5、6或者至少7%；(iv)澱粉消化率改進至少1%，更優選至少2%；和/或(V)粗蛋白質消化率改進至少1%，更優選至少2、3、4、5或者至少6%。可以根據牛試驗確定如上概述的表觀消化率，所述試驗包括:第一處理，其中將根據本發明使用的澱粉酶以期望濃度(例如，6或30mg酶蛋白質每kg飼料)加入動物飼料，和未向動物飼料中加入澱粉酶的第二處理(對照)，每個處理由六頭牛，例如公牛或母牛，優選奶牛組成，牛在畜舍(優選具有散養畜欄)中圈養，配備Calan門用於測定個體的飼料攝入，用TMR飲食飼養牛，其中優選包含50%濃縮物(主要由玉米粉、粗小麥粉、含可溶物的幹酒糟和大豆粉(SBM)組成)、37%玉米青貯、7%苜蓿半乾青貯和6%苜蓿乾草，用對應於階段4(四個21天時間)的最後一周中的平均每天攝入的量再飼養8天，從第5天至第8天通過直腸觸診(rectalpalpation),每8小時(優選每天取樣點間隔增加I小時)收集排洩物定時採集樣本(grabsample)(約300g),直至每頭牛收集到總共12個樣本,取TMR的樣本(來自每組)和每天的飼料殘渣(ort)(對每頭牛)，將所有的排洩物、TMR和飼料殘渣樣本匯集到一起(分別針對每頭牛)，在60°C強迫通風烘箱中乾燥48小時，碾磨樣本通過Ι-mm篩子，分析乾物質(DM)、酸性洗滌劑纖維(ADF)和中性洗滌劑纖維(NDF)，例如，如Goering,H.K.,VanSoest,P.J.,1970在AgricultureHandbookN0.379中所述，分析樣本的氮(N)(例如，使用ElementorVarioMaxCNAnalyzer),和灰分含量(在馬弗爐(mufflefurnace)中600°C5小時)，使用不可消化的NDF作為標記，計算總消化道的表觀消化率。優選地，在使用Daisy-1I溫育箱(AnkomTechnology,Macedon,NY,US)體外瘤胃培育120小時後，確定不可消化的NDF(Goering和VanSoest,1970)，瘤胃流體來自用對照飲食飼養的牛。更多細節參見實施例8和表11。在另一個具體的實施方案中，本發明的澱粉酶可以改進粗纖維、粗蛋白質、有機物和/或粗脂肪的總消化道表觀消化率(例如，與未加澱粉酶的對照相比較)。例如，本發明的澱粉酶可以改進下述的表觀消化率:(i)將粗纖維的表觀消化率改進至少1%，更優選至少2，或者至少3%；(ii)將粗蛋白的表觀消化率改進至少1%；(iii)將有機物的表觀消化率改進至少1%，更優選至少2或至少3%;和/或(iv)將粗脂肪的表觀消化率改進至少1%，更優選至少2、3、4或者至少5%。可以根據體內牛研究確定總消化道表觀消化率，所述研究使用三頭未泌乳的牛(GermanHolstein),和兩個處理，即加入50mg酶蛋白質(EP)每kg乾物質(DM),和未加酶的對照。向每日日糧(例如，由44%玉米青貯、18%草青貯、9%乾草和29%基於玉米的濃縮物組成的TMR)中加入酶。優選在連接有空調的畜舍(20°C)中在橡膠墊上安置牛，單獨飼養，可自由取水。實驗可以持續2個階段，每階段25天(共50天)；在每個階段中，前14天用於適應，而後11天用於採樣。每頭牛優選每天在7:OOh和16:OOh餵5.5kg(DM)TMR，並在早晨餵食後2小時餵0.5kg(DM)乾草。此外，優選施用100g/d礦物質預混物。從第22天至第25天，在8:30通過直腸觸診對每頭牛收集排洩物定時採集樣本(約200g)。可將TiO2用作標記以計算總消化道的表觀消化率。如本領域通常的情況，可通過在105°C乾燥直至無進一步的重量損失(通常為24小時)來確定DM。要了解更多詳細內容，參見實施例9和表16。在進一步的實施方案中，本發明的澱粉酶改進在尼龍袋中培育過程中飼料中乾物質(DM)的消失,例如從下述詞料中消失,如玉米粒(corngrain)、大麥、玉米青忙和/或TMR0例如，在培育時間2小時後，玉米粒、大麥、玉米青貯和TMR中DM消失分別為至少1%(優選至少5、10、15、20、25、30或者至少35%)、至少1%(優選至少2、4、6、8或者至少10%)、至少1%(優選至少2或者至少3%)，和至少1%(優選至少2或者至少3%)。作為另一個實例，在培育時間4小時後，玉米粒、大麥、玉米青貯和TMR中DM消失分別為至少1%(優選至少5、10、15,20,25或者至少26%)、至少1%(優選至少2、4或者至少6%)、至少1%(優選至少2或者至少3%)，和至少1%(優選至少2或者至少3%)。作為進一步的實例，在培育時間8小時後，玉米粒和大麥中DM消失分別為至少1%(優選至少5、10、15、20、25、30或者至少33%)，至少1%(優選至少2%)。可以在上述體內試驗(在總消化道表觀消化率的情況)中，使用為人所熟知的尼龍袋技術確定飼料乾物質的消失，所述尼龍袋技術可以參考實施例9，並在實施例9中詳細描述。要獲得更進一步的詳細內容，參見實施例9和表12-15。在進一步的實施方案中，本發明的澱粉酶與纖維素酶組合(i)改進乳產量(kg/d),優選在泌乳早期(earlylactationstage)(例如,在分娩後第I天至14天)，更優選不改變乳組成；和/或(ii)改進背脂厚度，優選在分娩後140天或140天之後。可以使用兩組，在體內飼養試驗中在9個月內確定乳產量和背脂厚度，其中每組由例如220頭奶牛(GermanHolstein)組成。優選將奶牛安置在具有條縫地板(slottedfloor)的小(cubical)畜舍中。實驗階段優選包括分娩前的三周和分娩後的20周。用全混合日糧(TMR)飼養牛(優選一天八次)，所述TMR未補加酶(對照)，或者補加了合適劑量的酶(例如對應於25mg酶蛋白質(EP)/kgTMR乾物質(DM)的澱粉酶，和1.4ml/kgTMR纖維素酶，或者與澱粉酶相似的量(EP/kg))。可以在餵食前立即將酶噴灑在TMR上。TMR的主要組分是玉米青貯、草青貯和濃縮物(可以在農場上混合)，而且乾物質含量可為約50%。優選每天在旋轉式擠奶間(milkingparlour)中對牛擠3次奶。定期在試驗中評估個體乳產量和組成，以及背脂厚度。要獲得更詳細的內容，參見實施例10和圖1和2。就本目的而言，認為術語飼養(feed)和餵養(fodder)同義。關於牛類如牛的想I料組成，以及其組分，牛類飲食通常由易降解的部分(稱作濃縮物)和富含纖維較不容易降解的部分(稱作乾草、草料或粗飼料)組成。乾草由乾燥的草、豆類或全穀類組成。草其中包括梯牧草屬(timothy)、黑麥草屬(ryegrass)、羊茅屬(fescue)。豆類其中包括三葉草(clover)、紫花苜猜(lucerne)或苜猜、豌豆(pea)、豆(bean)和野豌豆屬(vetch)。全穀類其中包括大麥、玉蜀黍、燕麥、高粱。全穀類的其它實例是小麥和黑麥。就本目的而言，認為術語玉蜀黍和玉米同義。其它飼料作物(foragecrop)包括甘鹿(sugarcane)、羽衣甘藍(kale)、油菜(rape)和甘藍(cabbage)。塊根作物(rootcrop),如蕪菁(turnip)、蕉青甘藍(swede)、飼用甜菜(mangel)、飼料甜菜(fodderbeet)和糖用甜菜(sugarbeet)(包括糖用甜菜楽;和甜菜糖蜜)也用來飼養反芻動物。更進一步的作物是塊莖，如馬鈴薯、木薯和甘薯。青貯是富含纖維部分(例如來自草、豆類或全穀類，全植物或其部分，例如玉蜀黍)的窖存形式(ensiledversion)，用受控的厭氧發酵方法(天然發酵或添加劑處理)處理具有高含水量的物質。濃縮物主要由穀類(如包括啤酒麥芽糟(brewer’sgrain)和酒糟的大麥、玉蜀黍、小麥、高粱、燕麥和/或黑麥)，但是也經常包含富含蛋白質的飼料組分，如大豆(優選大豆粉)、油菜籽、棕櫚仁、棉籽和向日葵。還可以用全混合日糧(TMR)飼養牛，其中將所有的飲食組分，例如草料、青貯濃縮物和預混物(例如礦物質、維生素)在提供之前混合。參照實施例3，在具體的實施方案中，本發明的飼料組合物包括TMR、濃縮物、玉蜀黍、大麥、黑麥、小麥、燕麥和/或馬鈴薯。在優選的實施方案中，飼料組合物包含玉蜀黍和高粱中的至少一種(或者包括玉蜀黍和/或高粱)，最優選玉蜀黍。術語如「玉蜀黍」、「大麥」、「馬鈴薯」等，包括全植物或其部分，以及各種源自其中的製備物和物質，其中包括葉、花、莖(stalk)、根、果實、核(kernel)、穀粒、粗粉和澱粉。此外，這些植物部分可按原樣(以天然形式)使用，乾燥、壓碎、浸泡，或者作為青貯(非限定性列表)。在進一步特定的實施方案中，本發明的飼料組合物是富含澱粉酶的濃縮物或者富含澱粉酶的全混合日糧(TMR)，其中澱粉酶是根據本發明使用的細菌澱粉酶，如上文所述。可將濃縮物制粒，並且在制粒前或制粒後加入澱粉酶。濃縮物還可以是醪濃縮物(mash-concentrate)。此外,可將根據本發明使用的澱粉酶添加至任何其它飼料組分或組合物，例如混合的，或者作為表面飾料(top-dressing),或者可將其包括在飼料添加劑中，例如通過如下所述的預混物。除了如上所述根據本發明使用的澱粉酶之外，本發明的飼料添加劑組合物包含選自維生素和礦物質的至少一種額外組分。例如，本發明的飼料添加劑可以包括(i)至少一種維生素，(ii)至少一種礦物質，或者(iii)至少一種維生素和至少一種礦物質。至少一種維生素可以是脂溶性或者水溶性。脂溶性維生素的實例是維生素A、維生素D3、維生素E和維生素K，例如維生素K3。水溶性維生素的實例是維生素B12、生物素和膽鹼(choline)、維生素B1、維生素B2、維生素B6、煙酸、葉酸和泛酸(panthothenate),例如D-泛酸鈣。至少一種礦物質可以是常量(macro)礦物質和/或痕量礦物質。痕量礦物質的實例是錳、鋅、鐵、銅、碘、硒和鈷。常量礦物質的實例是鈣、磷和鈉。預混物是本領域中公認的術語用於某些飼料添加劑。它們可以是固體或液體的。礦物質預混物是意欲向動物飼料添加的組合物，且其包含期望種類和量的礦物質，特別是痕量礦物質。維生素預混物是意欲向動物飼料添加的組合物，其包含期望種類和量的維生素。一些預混物包括維生素和礦物質。本文實施例12中包括了用於牛的這種組合的預混物的實例。本發明還涉及要求保護的用途、方法和組合物，其中本發明的細菌澱粉酶與下述組合使用:(i)用於反芻動物的其它酶，如蛋白酶、肌醇六磷酸酶、細胞壁降解酶，如木聚糖酶、纖維素酶，和/或內切葡聚糖酶；(ii)瘤胃素(Rumensin)(莫能菌酸鈉(monensinsodium));和/或(iii)泰樂菌素(Tylan)(泰樂菌素(tylosin))。本發明進一步通過如下實施例描述，不應將所述實施例看作為對本發明範圍的限制。實施例用作緩衝劑和底物的化學物質是至少試劑級的商業產品。實施例1:修正的HohenheimForage值測試(HFT)HohenheimForage值測試(HFT)由Menke等(1979)，J.Agric.Sc1.Camb.93,217-222:「當在體外用瘤胃液體培育反芻動物飼料時，根據氣體產生量估計反會動物飼料的消化率和可代謝的能量含量(Theestimationofthedigestibilityandmetabolizableenergycontentofruminantfeedingstuffsfromthegasproductionwhentheyareincubatedwithrumenliquorinvitro)，，，由Steingass，H.(1983):BestimmungdesenergetischenFutterwertesvonwirtschaftseigenenFuttermittelnausderGasbildungbeiderPansensaftfermentationinvitro」，HohenheimUniversitat3Fak.Agrarwiss.Dissertation,和由Steingass等，於TierernahrungI4；pp251-270(1986):」SchatzungdesenergetischenFutterwertesausderinvitromitPansensaftbestimmtenGasbildungundderchemischenAnalyse.1.UntersuchungenzurMethodeGbersn描述。它的目的主要是根據氣體產生量估計用於乳產生時飼料中用於泌乳的淨能量。這個測試的本修正版本用於測試瘤胃體外系統中外源酶的效果。簡言之，在玻璃注射器中將飼料底物與瘤胃液體和適當的緩衝液混合物的組合物一起稱重。用緊密配合但可移動的活塞將玻璃注射器封閉，使產生的氣體的體積增加。將注射器在39°C溫育4小時。測定產生氣體的量並用於轉換公式中(參見實施例2中的公式)。試劑大量兀素溶液(masselementsolution):6.2g磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.6g七水合硫酸鎂(MgS04*7H20)9ml濃磷酸(lmol/1)溶於蒸餾水中，加至IL(pH約1.6)緩衝溶液:35.0g碳酸氫鈉(NaHCO3)4.0g碳酸氫銨((NH4)HCO3)溶於蒸餾水中，加至1L。痕量元素溶液:13.2g二水合氯化鈣(CaCl2*2H20)10.0g四水合氯化錳(II)(MnCl2*4H20)1.0g六水合氯化鈷(II)(CoC12*6H20)8.0g氯化鐵(III)(FeCl3*6H20)溶於蒸餾水中，加至100ml鈉鹽溶液:IOOmg鈉鹽溶於蒸餾水中，加至IOOml還原溶液:先將3ml氫氧化鈉(c=lmol/l),然後將427.5mg水合硫化鈉(Na2S*H20)加入71.25mlH2O中。在將溶液加至培養基溶液之前不久(shortlybefore)製備溶液酶緩衝液:10.88g三水合乙酸鈉(CH3C00Na*3H20)5.88g二水合氯化鈣(CaCl2*2H20)0.1gBSA(牛血清白蛋白)溶於蒸餾水中，加至21，用乙酸調節至pH=5.8設備:注射器(玻璃注射器，100ml，1/1用毛細管基底表示刻度(graduatedwithcapillarybase))矽試管(用於每個注射器，約50mm)，將其拖至(pullover)毛細管底部並用夾子(clamp)封閉用於65個注射器的帶有能量單元的轉子，約I轉每分鐘具有通風設備的培養箱(精度+0.5°C，內部最小尺寸:70cm*70cm*50cm)精密天平或分析天平抽吸泵(例如手動的、適用於摩託車的氣泵)，用於去除瘤胃中的物質，回流閥(returnvalve)、洗漆瓶(washingflask)具有塞子的進料瓶(2L)，用於收集瘤胃液體裝有工藝(technical)二氧化碳、具有減壓閥的氣瓶注滿瘤胃液體的設備，其由:半自動吸液管(50ml)、WoulfT瓶(2L)、磁力攪拌器、具有循環泵的恆溫器和PVC盆(bowl)(IOL)組成步驟底物:底物(飼料)是全混合日糧，其由44%標準濃縮物(商業上可從theUniversityofHohenheim,Institutfiir丨iei'ernShrung獲得)、6%標準乾草(商業上可從theUniversityofHohenheim,InstitutfiirTiereiT^ihrung獲得)、37%玉蜀黍青忙和13%草青忙，均在65。C乾燥(兩種青忙都來自Village-Neuf,St.LouisCedex,France的農場)。用實驗室用壓榨機將所有組分碾碎通過1.5mm篩子，然後混合形成TMR。樣品稱重:將乾物質含量為400mg的飼料準確稱重至36個注射器的每個注射器中。這些注射器中的15個是底物對照，顯示沒有酶作用時的氣體產生量。其餘21個注射器用於酶樣品(7個注射器用於I個酶樣品)。然後向注射器插入先用凡士林塗抹的活塞。也對其它28個注射器進行這種處理，這28個注射器包含具有瘤胃液體的24ml培養基溶液，但是沒有任何底物樣品。7個注射器的氣體產生量代表僅來自瘤胃液體的氣體產生量的平均值。其餘21個注射器是不加任何底物的酶對照。當用凡士林塗抹活塞時，注射器的摩擦阻力降低。此外，注射器是防水而且氣密的。在充滿瘤胃液體之前，所有注射器都保留於39°C培養箱中。鈉溶液的製備:以下述順序將組分在Woulff瓶中混合:711ml水0.18ml痕量元素溶液355.5ml緩衝溶液355.5ml大量元素溶液將成品溶液(completedsolution)加溫至39°C(水浴或具有恆溫器的PVC盒)，並通過磁力攪拌器保持均一。首先，加入1.83ml鈉鹽溶液。始終通過浸沒的軟管(submergedhose)向培養基溶液中燻(fumigate)C02。在36°C,加入全部還原溶液。指示劑從藍色變成紅色，再變成無色。當指示劑變成無色時加入瘤胃液體。首先用浸沒的軟管將CO2通氣繼續15分鐘，在注入注射器的過程中，抬升軟管使液體保持以CO2飽和。瘤胃液體的提取:在早晨飼餵測試動物(主要是安置瘻管的(fistulated)羊，有時是牛)之前，將瘤胃液體提取至預熱的21進料瓶中，將進料瓶用作收集容器。使用鬆散編織的亞麻袋過濾瘤胃流體，輕柔地轉移至保溫瓶中，並在運送至實驗室過程中小心地阻止進入空氣。在持續攪拌和通入CO2的情況下，向約1400ml培養基溶液加入750ml瘤胃液體。注入注射器:以相對於酶緩衝液的一定比例稀釋待測試的酶。將酶加入相應的注射器中準確的0.4ml溶液中，由此使酶溶液必須完全覆蓋底物。在將培養基溶液和瘤胃液體的混合物均質化後，用半自動吸液管將24ml置於每個注射器中，之前在培養箱中將注射器加溫高至39°C。這代表18ml培養基溶液和6ml瘤胃液體的體積。然後，通過小心振蕩去除所有氣泡。同時，用這種方式打碎所有飼料塊。在蓋上夾子後，在活塞的水平面，加入(register)不含任何氣體相的準確體積的液體。將注射器直接置於預熱培養箱(39°C)的轉子中。溫育和確定氣體體積:在溫育過程中，注射器必須在轉子中保持水平位置。應將傳遞調至一轉每分鐘。在溫育過程中，培養箱中的溫度應該保持在39°C+0.5。C。四個小時後，完成溫育。通過仔細讀出活塞在校準標度(calibrationscale)的位置來測定氣體形成。此外，通過小心地旋轉，檢查活塞未卡住。通過兩個標度線之間的插值，可以達到高達+0.5ml的讀數精度。實施例2:體外的澱粉酶測試在實施例1的體外反芻動物模型中，測試了幾種細菌澱粉酶，並用於與三種真菌澱粉酶比較。每個實驗重複多次(「η」)。從NovozymesA/S,Krogshoejvej36,2880Bagsvaerd,Denmark獲得下述澱粉酶:BAN240L、STAINZYME12L、TERMAMYLSCL、NATALASE200L、DURAMYL300LDX和FUNGAMYLSOOLoWValleyResearchInc.,3502NorthOliveRoad,SouthBend,IN46628,US獲得VALIDASEBAA和VALIDASEFAA澱粉酶。從Alltech(AlltechInternationalHeadquarters,303ICatnipHillPike,Nicholasville,KY40356,US)獲得AMAIZE澱粉酶。結果示於下面的表I中，作為平均氣體產生量(GP)。與未加外源酶(ml/%)的對照相比較，以絕對數值以及以％給出GP。為了修正用於由酶製備物中可用的底物(例如蛋白質和配製物質，如葡萄糖和蔗糖)產生的氣體，在HFT系統中溫育包含酶和瘤胃流體的酶對照樣品，而不是飼料底物。如下計算酶對飼料底物(Delta-G)的作用，基本上按照Wallace等在J.Anim.Sc1.2001，79:1905-1916中所建議的:Delta_G=(SE-SC)-(RFE-RFC)，其中SE=瘤胃流體、飼料底物和酶，SC=瘤胃流體和飼料底物，RFE=瘤胃流體和酶，和RFC=瘤胃流體。在表I中，每種澱粉酶的劑量表不為以mg每kg底物表不的粗蛋白(CP),和以mg每kg底物表示的酶蛋白(EP)。用燃燒法測量粗蛋白(CP)，其中大體上C02、H2O,NOx和N2通過不同種類的過濾裝置，去除氮之外的所有氣體，然後用熱導池在氦載體中測量氮。為此根據製造商的說明使用LECOFP-528氮分析儀。將粗蛋白計算為氮(N)乘以因子6.25，即粗蛋白(g/kg)=N(g/kg)X6.25。還可以用凱氏定氣法(Kjeldahlmethod)(A.0.A.C.,1984,OfficialMethodsofAnalysis第14版，AssociationofOfficialAnalyticalChemists,WashingtonDC)確定氮含量。根據所研究酶的酶活性和比活性確定酶蛋白(EP)，參照實施例5的α-澱粉酶方法。表I權利要求1.細菌澱粉酶在牛亞科動物的飼料中的用途。2.權利要求1的用途，用於改進乳產量、體重增加和/或飼料轉化率。3.權利要求1的用途，用於改進乳產量、表觀消化率，和/或使用尼龍袋法的飼料乾物質消失。4.權利要求1的用途，其與纖維素酶組合使用。5.權利要求4的用途，用於改進乳產量和/或背脂厚度。6.細菌澱粉酶在用於牛亞科動物飼料的組合物的製備中的用途。7.製備用於牛亞科動物的飼料中的組合物的方法，所述方法包括向至少一種飼料組分中添加細菌澱粉酶的步驟。8.權利要求7的方法，所述方法還包括添加纖維素酶。9.增加牛亞科動物乳產量的方法，所述方法包括向動物飼料中添加細菌澱粉酶的步驟。10.權利要求9的方法，其還包括向動物飼料中添加纖維素酶。11.增加牛亞科動物的背脂厚度的方法，所述方法包括向動物飼料中添加與纖維素酶組合的細菌澱粉酶的步驟。12.增加牛亞科動物的體重增加和/或飼料轉化率的方法，所述方法包括向動物飼料中添加細菌澱粉酶的步驟。13.改進牛亞科動物的飼料乾物質的消失和/或表觀消化率的方法，所述方法包括向動物飼料中添加細菌澱粉酶的步驟。14.飼料添加劑組合物，其包含細菌澱粉酶，連同選自維生素和礦物質的至少一種額外組分。15.權利要求14的飼料添加劑，其還包含纖維素酶。16.權利要求15的組合物，其為礦物質預混物、維生素預混物，或包括維生素和礦物質的預混物。17.組合物，其包含細菌澱粉酶，以及至少一種選自乾草、草料、粗飼料和/或濃縮物的額外的組分。18.權利要求17的組合物，其還包含纖維素酶。19.權利要求17的組合物，其為富含澱粉酶的濃縮物。20.權利要求17的組合物，其為富含澱粉酶的全混合日糧。21.權利要求17-20中任一項的組合物，其包含玉蜀黍和/或高粱。22.權利要求21的組合物，其包含玉蜀黍。全文摘要本發明涉及細菌澱粉酶在牛類動物的飼料中的用途，具體地涉及至少一種細菌澱粉酶在牛亞科反芻動物的飼料中的用途，特別是用於改進乳產量，所餵飲食的表觀消化率、飼料乾物質的消失、體重增加，和/或飼料轉化率(FCR)。牛類動物的實例是奶牛和肉用牛。本發明還涉及這些澱粉酶在飼料和飼料添加劑如預混物、濃縮物和全混合日糧(TMR)中的用途。澱粉酶可以與纖維素酶組合使用，以改進乳產量和/或背脂厚度。優選的澱粉酶源自Bacillushalmapalus、地衣芽孢桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌，並且優選與嗜熱脂肪芽孢桿菌澱粉酶同源。文檔編號A23K1/165GK103120264SQ20131005484公開日2013年5月29日申請日期2007年7月12日優先權日2006年7月13日發明者沃爾夫岡.斯坦伯格,艾爾姆加德.艾米格,威比.格裡特索,莫滕.費希爾申請人:諾維信公司,DsmIp資產公司