用於增強植物中組成型基因表達的調節性核酸分子的製作方法

2023-07-01 12:21:06

專利名稱：用於增強植物中組成型基因表達的調節性核酸分子的製作方法
用於增強植物中組成型基因表達的調節性核酸分子發明描述本發明屬於植物分子生物學領域並且提供了用於產生高表達的組成型啟動子和產生具有增強的核酸組成型表達的植物的方法，其中將增強核酸表達的核酸(NEENAs)與所述啟動子功能性連接和/或導入植物中。轉基因在植物中的表達強烈地受多種外部和內部因素影響，從而導致變動和不可預測水平的轉基因表達。經常不得不產生大量的轉化體並進行分析，以鑑定具有合乎需要的表達強度的株系。由於轉化並篩選表達強度合乎需要的株系是昂貴和耗費人力的，故需要一個或多個轉基因在植物中高表達。當不得不在轉基因植物中協調表達幾個基因以實現特定效應時，鑑於必須鑑定其中每個基因均強烈表達的植物，這個問題尤其嚴重。例如，取決於構建體設計和各個轉化事件中T-DNA插入基因座的位置效應，轉基因的表達可以顯著地變動。強啟動子可以部分地克服這些難題。然而，顯示強烈表達同時特異性合乎需要的合適啟動子的可獲得性經常是有限的。為了確保可獲得具有合乎需要的表達特異性的充足啟動子，額外啟動子的鑑定和表徵可能有助於彌合這種缺口。然而，具有相應特異性和強度的啟動子的天然可獲得性和費時的候選啟動子表徵阻礙了合適的新啟動子的鑑定。為了克服這些難題，已經顯示多樣的遺傳元件和/或基序積極地影響基因表達。 在它們當中，已經認可一些內含子作為具有改善基因表達的強大潛能的遺傳元件。雖然機制大多未知，但是已經顯示一些內含子積極地影響成熟mRNA的穩態量，這可能通過增強轉錄活性、改善mRNA成熟、增強胞核mRNA輸出和/或改善翻譯起始來影響(例如Huang和 Gorman, 1990 ；Le Hir等人，2003 ；Nott等人，2004)。由於顯示僅所選的內含子增加表達，故剪接本身很可能解釋不了觀察到的效果。將內含子與啟動子功能性連接時觀察到的基因表達增加稱作內含子介導的基因表達增強(IME)並且已經在多種單子葉植物(例如Callis等人，1987 ；Vasil等人，1989 ； Bruce等人，1990 ；Lu等人，2008)和雙子葉植物(例如Chung等人，2006 ；Kim等人，2006 ； Rose等人，2008)得到顯示。在這個方面，顯示內含子相對於翻譯起始位點(ATG)的位置對於內含子介導的基因表達增強至關重要(Rose等人，2004)。繼一些內含子增強基因表達的潛能之後，顯示這些內含子還在植物中於其原有核苷酸環境下影響組織特異性。發現報導基因表達依賴於含有多達2個內含子的基因組區域的存在(Sieburth等人，1997 ；Wang等人，2004)。也已經報導5，UTR內含子對啟動子元件的恰當功能性是重要的，這可能歸因於內含子中存在的組織特異性基因控制元件(Fu等人， 1995a ；Fu等人，1995b ；Vitale等人，2003 ；Kim等人，2006)。然而，這些研究還顯示內含子與異源啟動子的組合可能對基因表達的強度和/或特異性產生強烈的不利影響(Vitale等人，2003 ；Kim 等人，2006、W02006/003186、W02007/098042)。例如，花椰菜花葉病毒 CaMV!35S 組成型強啟動子因與芝麻&FAD2 5』 UTR內含子組合而不利地影響表達(Kim等人，2006)。 與這些觀察結果相反，一些文獻顯示通過IME增強核酸的表達而不影響相應啟動子的組織特異性(Schiinmann 等人，2004)。
在本申請中，描述了與組成型啟動子功能性連接時增強所述啟動子的表達同時不影響其特異性的其他核酸分子。在本申請中將這些核酸分子描述為「增強核酸表達的核酸」(NEENA)。內含子具有從分別的前mRNA剪接下來的內在特徵。與其相反，本申請中即將陳述的核酸不必要一定包含於mRNA中，或如果存在於mRNA中，沒有必要一定從mRNA中剪接下來，以增強源自與NEENA功能性連接的啟動子的表達。發明詳述本發明的第一實施方案包括用於產生高表達的組成型啟動子的方法，所述高表達的組成型啟動子包含與啟動子功能性連接的一個或多個增強核酸表達的核酸(NEENA)分子，所述方法包括i)具有如SEQ ID NO :1至19、優選地SEQ ID NO :1至9的任一者中所定義序列的核酸分子，或ii)具有下述序列的核酸分子，所述序列與如SEQ ID NO :1至19、優選地SEQ ID NO :1至9所定義的任一序列具有80%或更大的同一性，優選地，該同一性是85%或更大， 更優選地，該同一性是90%或更大，甚至更優選地，該同一性是95%或更大、96%或更大、 97 %或更大、98 %或更大或99 %或更大，在最優選的實施方案中，該同一性相對於如SEQ ID NO 1至19、優選地SEQ ID NO :1至9所定義的任一序列是100%，或iii) i)或ii)的核酸分子的100個或更多連續鹼基、優選地150個或更多連續鹼基、更優選地200個或更多連續鹼基、或甚至更優選地250個或更多連續鹼基的片段，所述片段具有如具備SEQ ID NO :1至19、優選地SEQ ID NO :1至9所定義任一序列的相應核酸分子那樣的增強表達活性，例如65%或更大、優選地70%或更大、更優選地75%或更大，甚至更優選地80%或更大、85%或更大或90%或更大，在一個最優選的實施方案中，95%或更大的增強表達活性，或iv)作為前文在i)至iii)下提及的核酸分子中任一者的互補物或反向互補物的核酸分子，或ν)使用由 SEQ ID NO 20 至 57、優選地如表 2 中所示 SEQ ID NO :20/21 ；26/27 ； 30/31 ；38/39 ；42/43 ；44/45 ；46/47 ；50 ；51和56/57描述的寡核苷酸引物，通過PCR可獲得的核酸分子，或vi) 100個或更多核苷酸、150個或更多核苷酸、200個或更多核苷酸或250個或更多核苷酸的核酸分子，所述核酸分子在等同於在50°C於7%十二烷基硫酸鈉(SDQ、0. 5M NaPO4UmM EDTA雜交，以及在50°〇或65°〇、優選地651於2XSSC、0. 1% SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO :1至19、優選地SEQ ID NO 1至9描述的增強轉錄的核苷酸序列或其互補物的至少50個、優選地至少100、更優選地至少150、甚至更優選地至少200、最優選地至少250個連續核苷酸的核酸分子雜交。優選地，所述核酸分子在等同於在50°C於 7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA雜交，以及在50°C或65°C、優選地65°C於 IX SSC、0. SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO :1至19、優選地SEQ ID N0:1至9描述的增強轉錄的核苷酸序列或其互補物的至少50個、優選地至少100、更優選地至少150、 甚至更優選地至少200、最優選地至少250個連續核苷酸的核酸分子雜交；更優選地，所述核酸分子在等同於在50°C於7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5M NaPO4UmM EDTA雜交，以及在50°C或65°C、優選地65°C於0. 1XSSC、0. SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO:1至19、優選地SEQ ID NO :1至9描述的增強轉錄的核苷酸序列或其互補物的至少50個、 優選地至少100、更優選地至少150、甚至更優選地至少200、最優選地至少250個連續核苷
酸的核酸分子雜交。在一個實施方案中，一個或多個NEENA相對於與NEENA功能性連接的啟動子是異源的。如以上在ν)下所述，使用如表2中所示由SEQ ID NO :20至57、優選地SEQ ID NO 20/21 ；26/27 ；30/31 ；38/39 ；42/43 ；44/45 ；46/47 ；50/51 和 56/57 所定義的寡核苷酸， 通過PCR可獲得的核酸分子是例如使用如下文實施例1中所述的條件，從來自擬南芥屬 (Arabidopsis)植物如擬南芥(A. thaliana)的基因組DNA中可獲得的。技術人員知曉變動溫度特徵、循環數和/或緩衝液組成或濃度以獲得相應的 NEENA分子。表2中描述在用於獲得相應NEENA分子的相應PCR反應中待使用的寡核苷酸的特定組合。本領域技術人員知曉用於使單向啟動子變成雙向啟動子的方法和使用啟動子序列的互補物或反向互補物以產生與原始序列具有相同啟動子特異性的啟動子的方法。用於組成型及誘導型啟動子的此類方法例如由Xie等人Q001) "Bidirectionalization of polar promoters in plants (植物中極性啟雲力子的雙向化)，，nature biotechnology 19 第677-679頁描述。作者描述了添加最小啟動子至任意給定啟動子的5』引發端足以在兩個方向獲得啟動子控制表達，同時具有相同的啟動子特異性。因而，與如上文所述NEENA功能性連接的高表達啟動子在互補或反向互補情況下是有功能的，並且因此所述NEENA在互補或反向互補情況下也是有功能的。如本文中所用的組成型啟動子意指在基本上全部植物組織中貫穿植物或其部分的基本上整個生活期限表達的啟動子。在基本上全部植物組織中表達的啟動子也可以包括在主要植物組織如葉、莖和/或根的至少兩者中並且可以在或可以不在一些或全部次要組織或細胞如表皮、氣孔、毛狀體、花、種子或分生組織中表達的啟動子。在一個優選的實施方案中，如本文中所意指的組成型啟動子至少在綠色組織如葉和莖中表達。貫穿植物或其部分的基本上整個生活期限表達的啟動子也可以包括在嫩的和已發育的組織中表達，但是可以在植物生活期限中的特定時間點或在特定條件下如在萌發和 /或衰老期間或在生物性和/或非生物性脅迫條件如真菌性或細菌性感染、乾旱、熱或寒冷下缺少表達的啟動子。在一個優選的實施方案中，貫穿植物的基本上整個生活期限表達的組成型啟動子至少在充分擴大的組織中表達直至開始衰老。原則上，NEENA可以與任意的啟動子如組織特異性、誘導型、發育特異性或組成型啟動子功能性連接。相應的NEENA將導致在與至少一種NEENA功能性連接的相應啟動子控制下的異源核酸的增強表達。增強除組成型啟動子之外的啟動子例如組織特異性啟動子的表達將給予這些啟動子的特異性。核酸在相應啟動子控制下的表達將是在無NEENA的情況下檢測不到所述核酸的轉錄物的額外組織或發育階段中可檢測的。因此，組織特異性或發育特異性或任意其他啟動子可以通過將至少一種如上文所述的NEENA分子與所述啟動子功能性連接而變成組成型啟動子。因此，本發明的另一個實施方案是提供用於將植物中有功能的任意給定啟動子的特異性通過相應啟動子與NEENA分子連接而賦予組成型啟動子的方法，其中所述NEENA分子包含如以上在i)至vi)下所述的序列。
優選地，一個或多個NEENA與任意的組成型啟動子功能性連接並且將增強在所述啟動子控制下的核酸分子的表達。待用於本發明任意方法中的組成型啟動子可以源自植物例如單子葉或雙子葉植物、源自細菌和/或病毒或可以是合成性啟動子。待使用的組成型啟動子例如是來自歐芹(P.crispum)的Pc^bi-啟動子(W0 2003102198)、來自玉米的 ZmUbi-啟動子、來自編碼腈水解酶1的擬南芥基因At3g44310的AtNit-啟動子、來自玄參 (figwort)花葉病毒的34S-啟動子、來自菸草花葉病毒的35S-啟動子、源自農桿菌的nos 啟動子和ocs啟動子、ScBV-啟動子(US 5 994 123)、SUPER-啟動子(Lee等人2007，Plant. Phys.)、來自編碼鐵氧還蛋白NADH還原酶的擬南芥基因At5g66190的AtFNR-啟動子、來自豌豆(Pisum sativum)的ptxA啟動子(W0200508M50)、來自編碼磷酸三糖易位蛋白的擬南芥基因At5g46110的AtTPT-啟動子、來自擬南芥基因At4gl4880和At4gl4890的雙向 AtOASTL-啟動子、來自編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶的擬南芥基因的Atlgl3440的PR00194 啟動子、來自編碼二磷酸果糖醛縮酶的擬南芥基因At3g5^30的PR00162啟動子、AHAS-啟動子(W020081M4%)或咖啡醯輔酶A-MT啟動子和來自稻的0sCP12 (W02006084868)。與NEENA功能性連接的本發明高表達的組成型啟動子可以用於任意植物中，所述植物包括例如苔蘚、蕨類、裸子植物或被子植物，例如單子葉或雙子葉植物。在一個優選的實施方案中，與NEENA功能性連接的本發明所述啟動子可以用於單子葉或雙子葉植物中， 優選地是作物植物如穀物、大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物、馬鈴薯、甜菜、稻、小麥、高粱、大麥、芭蕉屬植物、甘蔗、芒屬植物等。在本發明的一個優選的實施方案中，與NEENA功能性連接的所述啟動子可以用於單子葉作物植物如穀物、稻、小麥、高粱、芭蕉屬植物、芒屬植物、 甘蔗或大麥中。在一個特別優選的實施方案中，與NEENA功能性連接的啟動子可以用於雙子葉作物植物如大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物、甜菜或馬鈴薯中。如本申請中所用的高表達的組成型啟動子意指例如與NEENA功能性連接的啟動子，所述NEENA引起該啟動子在植物或其部分中增強的組成型表達，其中源自功能性連接於NEENA的相應啟動子控制下的核酸分子的RNA積累或RNA合成速率比由缺少本發明 NEENA的相同啟動子引起的表達高，優選地顯著更高。優選地，與相同條件下培育的包含不與本發明NEENA功能性連接的相同組成型啟動子的同齡對照植物相比，植物中相應核酸的 RNA的量和/或RNA合成速率和/或RNA穩定性增加50%或更大，例如100%或更大、優選地200%或更大、更優選地5倍或更大、甚至更優選地10倍或更大、最優選地20倍或更大， 例如50倍。在本文中使用時，顯著更高指技術人員知曉如何確定的統計顯著性，例如通過對相應的數據集合應用統計檢驗如t-檢驗。用於檢測由啟動子賦予的表達的方法是本領域已經的。例如，該啟動子可以與標記基因如GUS、GFP或螢光素酶基因功能性連接，並且可以在植物或其部分中測定由相應標記基因編碼的相應蛋白質的活性。作為代表性實例，下文詳細描述用於檢測螢光素酶的方法。其他方法例如是通過本領域已知的方法，例如RNA印跡分析法、qPCR、連綴(rim-on)測定法或本領域所述的其他方法測量受該啟動子控制的核酸分子的RNA穩態水平或合成速率。技術人員知曉多種用於功能性連接兩個或多個核酸分子的方法。此類方法可以包括限制性切割/連接法、不依賴連接酶的克隆法、重組工程法、重組或合成法。其他方法可以用來功能性連接兩個或多個核酸分子。本發明的又一個實施方案是用於產生植物或其部分的方法，所述植物或其部分與相應的對照植物或其部分相比具有一種或多種核酸分子的增強的組成型表達，所述方法包括步驟將包含如上文在i)至vi)下所定義核酸分子的一個或多個NEENA導入所述植物或其部分，和將所述一個或多個NEENA與啟動子、優選地組成型啟動子並且與處在所述啟動子、優選地組成型啟動子控制下的核酸分子功能性連接，其中NEENA對所述核酸分子為異源。NEENA可以相對於處在與NEENA功能性連接的所述啟動子的控制下的核酸分子為異源，或它可以相對於該啟動子和處在該啟動子控制下的核酸分子均為異源。就核酸分子或DNA而言，術語「異源的」指這樣的核酸分子，所述核酸分子有效連接於，或受到操作以變得有效連接於自然界中不與該核酸分子有效連接或自然界中與該核酸分子在不同位置有效連接的第二種核酸分子。例如，本發明的NEENA在其天然環境中與其天然啟動子功能性連接，而在本發明中，它與可以源自相同生物、不同生物或合成性啟動子如SUPER-啟動子的另一個啟動子連接。它也可以意指本發明的NEENA與其天然啟動子連接，但是處於所述啟動子控制下的核酸分子相對於包含其天然NEENA的啟動子為異源。 此外，應當理解，啟動子和/或處在與本發明NEENA功能性連接的所述啟動子控制下的核酸分子相對於所述NEENA為異源，原因是它們的序列已經受到例如突變如插入、缺失等操作， 從而啟動子和/或處在所述啟動子控制下的核酸分子的天然序列被修飾並且因此已經變得相對於本發明的NEENA為異源。也可以理解，當NEENA與其天然啟動子功能性連接，其中NEENA的位置相對於所述啟動子改變，從而該啟動子在這種操作後顯示更高表達時，該 NEENA相對於功能性連接至NEENA的核酸為異源。如本文中所意指的顯示增強的核酸分子組成型表達的植物意指與相同條件下培育的沒有與相應核酸分子功能性連接的相應NEENA的對照植物相比，具有更高的、優選地統計顯著更高的核酸分子組成型表達的植物。這種對照植物可以是野生型植物或是包含控制與本發明植物中相同的基因的相同啟動子的轉基因植物，其中所述啟動子不與本發明的 NEENA連接。產生如本文中所用的植物包括用於穩定轉化的方法，如藉助農桿菌介導的轉化、 原生質體轉化、粒子轟擊等將重組DNA構建體導入植物或其部分並且任選地隨後再生出轉基因植物。它還包括用於瞬時轉化植物或其部分的方法，如病毒感染法或農桿菌浸潤法。技術人員知曉用於穩定和/或瞬時轉化植物或其部分的其他方法。方法如育種方法或原生質體融合法可以用於本發明植物的產生並且由本發明涵蓋。本發明的方法可以應用於任意植物，例如裸子植物或被子植物，優選地是被子植物，例如雙子葉或單子葉植物，優選地是雙子葉植物。優選的單子葉植物例如是穀物、小麥、 稻、大麥、高粱、芭蕉屬植物、甘蔗、芒屬植物和短柄草屬植物(Brachypodium)，特別優選的單子葉植物是穀物、小麥和稻。優選的雙子葉植物是例如大豆、油菜籽、卡諾拉油菜、亞麻、 棉屬植物、馬鈴薯、甜菜、萬壽菊和擬南芥屬植物(Arabidopsis)，特別優選的雙子葉植物是大豆、油菜籽、卡諾拉油菜和馬鈴薯。在本發明的一個實施方案中，如上文定義的方法包括以下步驟a)將包含如上文的i)至vi)中所定義核酸分子的一個或多個NEENA導入植物或其部分，和b)將所述一個或多個NEENA整合至所述植物或其部分的基因組中，從而所述一個或多個NEENA與相對所述一個或多個NEENA為異源的優選地組成型表達的內源核酸功能性連接，和任選地c)從所述轉化的細胞再生出包含所述一個或多個NEENA的植物或其部分。NEENA可以相對於處在與NEENA功能性連接的所述啟動子的控制下的核酸分子為異源，或它可以相對於該啟動子和處在該啟動子控制下的核酸分子均為異源。可以將一個或多個NEENA分子藉助粒子轟擊法、原生質體電穿孔法、病毒感染法、 農桿菌介導的轉化法或本領域已知的任意其他方法導入植物或其部分。可以將NEENA分子導入整合例如至質粒或病毒DNA或病毒RNA中。NEENA分子也可以在導入植物或植物部分中之前包含於BAC、YAC或人工染色體上。也可以將NEENA分子作為包含NEENA序列的線性核酸分子導入，其中額外的序列可以緊鄰該核酸分子上的NEENA序列存在。毗鄰NEENA序列的這些序列可以長約20bp，例如20bp至數百鹼基對，例如IOObp或更多，並且可以促進整合至基因組中，例如通過同源重組。可以使用用於基因組整合的任何其他方法，無論它是定向整合法，如同源重組，或隨機整合法，如非常規(illegitimate)重組。可以與NEENA分子功能性連接的優選地組成型表達的內源核酸可以是任意核酸， 優選地是任意的組成型表達的核酸分子。該核酸分子可以是編碼蛋白質的核酸分子或非編碼性分子如反義 RNA、rRNA、tRNA、miRNA、ta-siRNA、siRNA、dsRNA、snRNA、snoRNA 或本領域已知的任何其他非編碼性RNA。技術人員知曉用於鑑定組成型表達的核酸分子的方法，例如通過微陣列晶片雜交、qPCR、RNA印跡分析、下一代測序法等，其中本發明的方法可以優選地應用於所述核酸分子。實施本發明方法的又一種方式可以是a)提供包含一個或多個NEENA的表達構建體，所述NEENA包含如上文i)至vi) 中所定義的與啟動子、優選地組成型啟動子並且與相對於所述一個或多個NEENA為異源並處在所述啟動子、優選地組成型啟動子控制下的一種或多種核酸分子功能性連接的核酸分子，和b)將包含所述一個或多個NEENA的所述表達構建體整合至所述植物或其部分的基因組中，和任選地c)從所述轉化的植物或其部分再生出包含所述一個或多個表達構建體的植物或其部分。NEENA可以相對於處在與NEENA功能性連接的所述啟動子的控制下的核酸分子為異源，或它可以相對於該啟動子和處在該啟動子控制下的核酸分子均為異源。表達構建體可以藉助本領域已知的任何方法整合至相應植物的基因組中。使用如粒子轟擊法或農桿菌介導的轉化法的方法時，整合可以是隨機的。在一個優選的實施方案中，整合藉助定向整合，例如通過同源重組進行。後一種方法將允許包含與NEENA功能性連接的高表達啟動子的表達構建體整合至有利的基因組區域中。有利的基因組區域例如是已知包含例如在種子中高度表達的基因的基因組區域，並且因而與顯示無轉錄活性的基因組區域相比，可以增加源自所述表達構建體的表達。
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在另一個優選的實施方案中，所述一個或多個NEENA與靠近所述異源核酸分子的轉錄起始位點的啟動子、優選地組成型啟動子功能性連接。如本文中所意指的靠近轉錄起始位點包含一個或多個NEENA與距離所述異源核酸分子的轉錄起始位點2500bp或更少、優選地2000bp或更少、更優選地1500bp或更少、甚至更優選地IOOObp或更少並且最優選地500bp或更少的啟動子、優選地組成型啟動子功能性連接。應當理解，該NEENA可以距相應啟動子的轉錄起始位點以相應距離在上遊或下遊整合。因而，一個或多個NEENA不必一定包含於處在與所述一個或多個NEENA功能性連接的優選地組成型啟動子控制下的相應異源核酸的轉錄物中。優選地，一個或多個NEENA整合在相應啟動子、優選地組成型啟動子的轉錄起始位點的下遊。轉錄起始位點下遊的整合位點可以位於5』UTR、3』UTR、外顯子或內含子中，或它可以替換內含子或部分或完全地替換處於優選地組成型啟動子控制下的異源核酸的5，UTR或3，UTR。優選地，一個或多個NEENA 整合在5』 UTR或內含子中，或所述NEENA替換內含子或部分或全部5』 UTR，最優選地，它整合在相應異源核酸的5』 UTR中。本發明的又一個實施方案包括含有一個或多個NEENA的重組表達構建體，其中所述的NEENA包含上文i)至vi)中所定義的核酸分子。重組表達構建體可以還包含與一個或多個NEENA功能性連接的一個或多個啟動子，優選地組成型啟動子和任選地一個或多個表達的核酸分子，所述核酸分子相對於所述一個或多個NEENA為異源。NEENA可以相對於處在與NEENA功能性連接的所述啟動子的控制下的核酸分子為異源，或它可以相對於該啟動子和處在該啟動子控制下的核酸分子均為異源。該表達構建體可以包含與NEENA功能性連接的啟動子、優選地組成型啟動子和待表達核酸分子的1個或多個，例如2個或更多個，例如5個或更多個，如10個或更多個組合，所述的待表達核酸分子相對於相應的NEENA為異源。該表達構建體也可以包含其他啟動子，所述的其他啟動子不包含與相對於相應的啟動子為同源或異源的待表達核酸分子功能性連接的NEENA。包含如上文定義的一個或多個重組表達構建體的重組表達載體是本發明的另一個實施方案。可以在本發明中使用的多種表達載體是技術人員已知的。用於將包含這種表達構建體的此種載體導入植物基因組中的方法和用於從轉化的細胞恢復轉基因植物的方法也是本領域熟知的，其中所述的表達構建體包含例如與NEENA功能性連接的啟動子和任選地其他元件如終止子。取決於用於轉化植物或其部分的方法，完整載體可以整合至所述植物或其部分的基因組中，或者載體的某些組分可以整合至所述基因組中，例如T-DNA。本發明中還包括轉基因植物或其部分，其包含如上文i)至vi)中所定義的一種或多種異源NEENA。如果NEENA是合成的、源自另一種生物或源自相同生物，但是其天然基因組位置與對照植物例如野生型植物相比被改變，則將NEENA理解為相對於該植物是異源的。應當理解，改變的基因組位置意指，NEENA位於另一條染色體上或位於同一條染色體上，但是脫離例如在野生型植物中其天然基因組位置101Λ或更遠，例如101Λ，優選地51Λ 或更遠，例如5kb，更優選地IOOObp或更遠，例如lOOObp，甚至更優選地500bp或更遠，例如 500bp，特別優選地IOObp或更遠，例如lOObp，最優選地IObp或更遠，例如10bp。包含如上文定義的重組表達載體或如上文定義的重組表達構建體的轉基因細胞或轉基因植物或其部分是本發明的又一個實施方案。轉基因細胞、轉基因植物或其部分可以選自細菌、真菌、酵母或植物、昆蟲細胞或哺乳動物細胞或植物。優選地，轉基因細胞是細菌、真菌、酵母或植物細胞。優選的細菌是腸桿菌屬細菌如大腸桿菌(E.coli)和農桿菌屬的細菌，例如根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)和髮根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)。優選的植物是單子葉或雙子葉植物，例如單子葉或雙子葉作物植物，如穀物、 大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物、馬鈴薯、甜菜、稻、小麥、高粱、大麥、芒屬植物、芭蕉屬植物、甘蔗等。優選的作物植物是穀物、稻、小麥、大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物或馬鈴薯。尤其優選的雙子葉作物植物是大豆、卡諾拉油菜、棉屬植物或馬鈴薯。尤其優選的單子葉作物植物是穀物、小麥和稻。源自如上文所定義的轉基因細胞或植物或其部分中的轉基因細胞培養物、轉基因種子、部分或繁殖材料是本發明的其他實施方案，其中所述的轉基因細胞或植物或其部分包含如上文在i)至vi)中定義的所述異源NEENA或如上文定義的所述重組表達構建體或所述重組載體。如本文中所意指的轉基因部分或繁殖材料包含含有相應NEENA、重組表達構建體或重組載體的全部組織和器官，例如葉、莖和果實以及用於植物繁殖和/或再生的材料如插條、接穗、壓條、枝條或幼苗。本發明的又一個實施方案是如上文在i)至vi)中定義的NEENA或如上文定義的重組構建體或重組載體用於增強植物或其部分中表達的用途。因而，本申請即將提供種子特異的和/或種子優先的增強基因表達的核酸分子， 其包含一個或多個啟動子，優選地是與一個或多個NEENA功能性連接的種子特異的和/或種子優先的啟動子。另外，提供了此類增強基因表達的核酸分子和包含此類增強基因表達的核酸分子的表達構建體、表達載體、轉基因植物或其部分和轉基因細胞的用途。本發明中還包括源自如上文定義的轉基因細胞或植物或其部分中的轉基因細胞培養物、轉基因種子、部分或繁殖材料用於生產食物、動物飼料、種子、藥物或精細化學品的用途。定義縮寫NEENA-增強核酸表達的核酸，GFP-綠色螢光蛋白，⑶S-β -葡糖苷酸酶， ΒΑΡ-6-苄氨基嘌呤，2，4-D-2，4-二氯苯氧乙酸，MS-Murashige-Skoog 培養基，NAA-I-萘乙酸，MES，2-(N-嗎啉代)-乙磺酸，IAA:卩引哚乙酸，Kan 硫酸卡那黴素，GA3-赤黴酸， Timentin 替卡西林二鈉/克拉維酸鉀，microl 微升。應當理解，本發明不限於具體的方法或方案。還應當理解本文所用的術語目的僅在於描述具體實施方案，並且不意圖限制本發明，本發明將僅受所附權利要求書限制。必須指出，如本文中和所附權利要求中所用，單數形式「一個」、「一種」和「該」包括複數指稱，除非上下文另外明確地指明並非如此。因此，例如，對「一個載體」的提及是對一個或多個載體的提及並且包括本領域技術人員已知的其等同物等。術語「約」在本文中用來指大約、大
致、左右和在......範圍內。當術語「約」與一個數字範圍聯合使用時，它通過使界限值擴
展高於和低於所述數值而修飾該範圍。通常而言，術語「約」在本文中用來通過20%、優選地10%之上或之下(更高或更低)變異而修飾高於和低於所述值的數值。如本文中所用， 詞彙「或」意指特定列出的任何一成員並且還包括該列出的成員的任意組合。在本說明書中及以下權利要求中使用時，詞彙「包含」、「包含著」、「包括」、「包括著」和「包括了」意圖指明一個或多個所述特徵、整數、組分或步驟的存在，但是它們不排除一個或多個其他特徵、 整數、組分、步驟或其組的存在或添加。為清晰起見，將本說明書中使用的某些術語如下定義並使用。反平行「反平行」在本文中指經互補性鹼基殘基之間氫鍵配對的兩個核苷酸序列，其中磷酸二酯鍵在一個核苷酸序列中以5』 -3』方向分布並且在另一個核苷酸序列中以 3』 -5』方向分布。反義術語「反義」指相對於其轉錄或發揮作用的正常方向為反向並且從而表達下述RNA轉錄物的核苷酸序列，其中所述的RNA轉錄物與宿主細胞內部表達的靶基因mRNA分子互補(例如，它可以藉助Watson-Crick鹼基配對作用與靶基因mRNA分子或單鏈基因組 DNA雜交)或與靶DNA分子(例如宿主細胞中存在的基因組DNA)互補。編碼區如本文中所用，術語「編碼區」在談及結構基因使用時，指編碼在作為 mRNA分子翻譯結果的新生多肽中存在的胺基酸的核苷酸序列。在真核生物中，編碼區在5』 側以編碼起始物甲硫氨酸的核苷酸三聯體「ATG」為界並且在3』側以特定終止密碼子的3 種三聯體(即TAA、TAG、TGA)為界。除含有內含子之外，基因的基因組形式也可以包含位於 RNA轉錄物中存在的序列的5』 -及3』 -端的序列。這些序列稱作「側翼」序列或區(這些側翼序列位於mRNA轉錄物上存在的非翻譯序列的5』或3』)。5』 -側翼區可以含有控制或影響基因轉錄的調節序列如啟動子和增強子。3』 -側翼區可以含有指導轉錄終止、轉錄後剪切和聚腺苷酸化的序列。互補的「互補的」或「互補性」指包含反平行核苷酸序列的兩個核苷酸序列，其中一旦在反平行核苷酸序列中的互補性鹼基殘基之間形成氫鍵，則所述反平行核苷酸序列能夠相互配對(通過鹼基配對原則)。例如，序列5，-AGT-3，與序列5，-ACT-3，互補。互補性可以是「部分的」或「全部的」。「部分」互補性是其中一個或多個核酸鹼基根據鹼基配對規則未匹配的情況。核酸分子之間的「全部」或「完全」互補性是其中每個核酸鹼基按照鹼基配對規則與另一個鹼基匹配的情況。核酸分子鏈之間互補性的程度對核酸分子鏈之間雜交的效率和強度具有明顯影響。如本文中所用的核酸序列「互補物」指這樣的核苷酸序列， 其核酸分子顯示與該核酸序列的核酸分子的全部互補性。雙鏈RNA 「雙鏈RNA」分子或「dsRNA」分子包含核苷酸序列的有義RNA片段和該核苷酸序列的反義RNA片段，二者均包含彼此互補的核苷酸序列，因而允許有義RNA片段和反義RNA片段配對並形成雙鏈RNA分子。內源的「內源的」核苷酸序列指存在於未轉化植物細胞的基因組中的核苷酸序列。增強的表達「增強」或「增加」核酸分子在植物細胞中的表達在本文中同等地使用，並且意指該核酸分子在應用本發明方法之後在植物、植物部分或植物細胞中的表達水平比其在應用該方法之前在植物、植物部分或植物細胞中的表達更高，或與缺少本發明重組核酸分子的參照植物相比更高。例如，參照植物包含僅缺少相應NEENA的相同構建體。如本文中所用的術語「增強」或「增加」是同義的，並且在本文中意指待表達的核酸分子的更高、優選地顯著更高的表達。如本文中所用的，「增強」或「增加」某物質(如蛋白質、mRNA或 RNA)的水平意指相對於基本上相同條件下培育的、缺少本發明重組核酸分子(例如缺少本CN 102482684 A說明書10/38
發明的NEENA分子、重組構建體或重組載體)的基本上相同植物、植物部分或植物細胞，該水平增加。如本文中所用的，「增強」或「增加」某物質(例如由靶基因表達的前RNA、mRNA、 rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或由其編碼的蛋白質產物)的水平意指相對於缺少本發明重組核酸分子的細胞或生物，該水平增加50%或更多，例如100%或更多，優選地200%或更多，更優選地5倍或更多倍，甚至更優選地10倍或更多倍，最優選地20倍或更多倍，例如50倍。可以通過技術人員熟悉的方法測定所述增強或增加。因而，可以例如通過蛋白質的免疫學檢測法確定核酸或蛋白質量的增強或增加。另外，可以使用技術如蛋白質測定法、螢光法、RNA雜交法、核酸酶保護測定法、逆轉錄法(定量RT-PCR)、ELISA(酶聯免疫吸附測定法)、蛋白質印跡法、放射免疫測定法(RIA)或其他免疫測定法和螢光激活的細胞分析(FACQ來測量植物或植物細胞中的特定蛋白質或RNA。取決於所誘導蛋白質產物的類型，也可以確定其活性或對生物或細胞表型的影響。用於確定蛋白質數量的方法是技術人員已知的。可以提到的實例是微量Biuret法(Goa J(1953) Scand J Clin Lab Invest 5 218-222)、Folin-Ciocalteau 法(Lowry OH 等人(1951) J Biol Chem 193:265-275)或測量 CBB G-250 的吸光度(Bradford MM(1976)Analyt Biochem 72 :248-254) 作為用於量化蛋白質的活性的一個實例，在下文實施例中描述螢光素酶活性檢測法。表達「表達」指基因產物的生物合成，優選地指細胞中核苷酸序列例如內源基因或異源基因的轉錄和/或翻譯。例如，在結構基因的情況下，表達涉及結構基因轉錄成mRNA 並且任選地隨後mRNA翻譯成一種或多種多肽。在其他情況下，表達可以僅指攜帶RNA分子的DNA的轉錄。表達構建體如本文中所用的「表達構建體」意指能夠指導特定核苷酸序列在適宜植物部分或植物細胞中表達的DNA序列，該DNA序列包含在導入此DNA序列的所述植物部分或植物細胞中有功能的啟動子，所述啟動子與任選地有效連接至終止信號的目的核苷酸序列有效連接。如果需要翻譯，該DNA序列一般還包含為正確翻譯所述核苷酸序列所需的序列。編碼區可以編碼目的蛋白，但也可以以有義或反義方向編碼功能性目的RNA，例如 RNAa, siRNA、snoRNA、snRNA、microRNA、ta-siRNA或任何其他非編碼的調節性RNA。包含目的核苷酸序列的表達構建體可以是嵌合的，這意指該表達構建體的組件中一者或多者相對於該表達構建體的其他組件中一者或多者是異源的。該表達構建體也可以是一種這樣的表達構建體，它天然地存在，但已經以用於異源表達的重組形式獲得。然而，一般而言，該表達構建體相對於宿主是異源，即，該表達構建體的特定DNA序列不天然存在於宿主細胞中並且必須已經通過轉化事件導入宿主細胞或該宿主細胞的祖先中。該表達構建體中的核苷酸序列的表達可以處於組成型啟動子或處於僅在宿主細胞暴露於一些特定外部刺激時才啟動轉錄的誘導型啟動子的控制下。在植物的情況下，該啟動子也可以是針對特定組織或器官或發育階段特異的。外來術語「外來」指任何核酸分子(例如，基因序列)，所述核酸分子通過實驗操作導入細胞的基因組中並且可以包括該細胞中存在的序列，只要導入的序列含有一些修飾 (例如，點突變、存在可選擇標記基因等)和因此相對於天然存在序列是不同的。功能性連接將術語「功能性連接」或「功能性連接的」理解為意指例如調節性元件(例如啟動子)與待表達的核酸序列並且根據需要與其他調節性元件(例如，終止子或 NEENA)以如此方式依次排列，從而每種調節性元件可以履行其目的功能以允許、修飾、促進或影響所述核酸序列的表達。作為同義詞，可以使用「有效連接」或「有效連接的」。可以根據所述核酸序列相對於有義或反義RNA的排列，產生表達。為此目的，不是必需要求化學意義上的直接連接。遺傳控制序列例如增強子序列也能夠從遠離的位置或甚至從其它DNA分子對靶序列產生其作用。優選的排列是這樣的排列，其中待表達的核酸序列重組地位於充當啟動子的序列之後，從而這兩個序列相互共價地連接。該啟動子序列與待重組表達的核酸序列之間的距離優選地小於200鹼基對、特別優選地小於100鹼基對、非常特別優選地小於 50鹼基對。在一個優選的實施方案中，待轉錄的核酸序列以如此方式位於啟動子之後，其中轉錄起點與本發明嵌合RNA的合乎需要的開端相同。功能性連接和表達構建體可以藉助如 (例如，在Maniatis TiFritsch EF禾口Sambrook J(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第二片反，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) ；Silhavy 等人(1984)Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) ；Ausubel 等人(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience ；Gelvin 等人(編著)(1990)Plant Molecular Biology Manual ；Kluwer Academic Publisher，Dordrecht，The Netherlands) 所述的慣用重組和克隆技術產生。然而，其他序列，例如充當帶限制性酶特定切割位點的接頭或充當信號肽的序列，也可以位於這兩個序列之間。序列的插入也可以導致融合蛋白的表達。優選地，由調節性區域例如啟動子和待表達核酸序列的連接組成的表達構建體可以以載體整合的形式存在並且被插入植物基因組，例如通過轉化法。基因術語「基因」指與能夠以某種方式調節基因產物(例如，多肽或功能性RNA) 表達的適宜調節序列有效連接的區域。基因包括DNA中位於編碼區(可讀框，0RF)之前 (上遊)和之後(下遊)的不翻譯的調節區(例如啟動子、增強子、阻抑物等)，以及在可用的情況下，在各個編碼區(例如外顯子)之間的間插序列(例如內含子)。如本文中所用的術語「結構基因」意圖指轉錄成mRNA的DNA序列，其中所述的mRNA隨後翻譯成作為具體多肽的特徵的胺基酸序列。基因組和基因組DNA 術語「基因組」或「基因組DNA，，指宿主生物的可遺傳信息。 所述基因組DNA包括胞核的DNA(也稱作染色體DNA)，還包括質體(例如，葉綠體)和其他細胞器(例如，線粒體)的DNA。優選地，術語「基因組」或「基因組DNA」指胞核的染色體 DNA。異源的就核酸分子或DNA而言，術語「異源的」指這樣的核酸分子，所述核酸分子有效連接於，或受到操作以變得有效連接於自然界中不與該核酸分子有效連接或自然界中與該核酸分子在不同位置有效連接的第二種核酸分子。包含核酸分子和與之連接的一個或多個調節性核酸分子(如啟動子或轉錄終止信號)的異源表達構建體例如是源自實驗操作的構建體，在所述構建體中，a)所述核酸分子或b)所述調節性核酸分子或c) 二者(即 (a)和(b))不位於其天然(原有)遺傳環境中或已經因實驗操作受到修飾，修飾的實例是一個或多個核苷酸殘基的置換、添加、缺失、倒位或插入。天然遺傳環境指源生物中的天然染色體基因座或指存在於基因組文庫中。在基因組文庫的情況下，優選地保留，至少部分地保留該核酸分子的序列的天然遺傳環境。該環境分布在所述核酸序列的至少一側並且具有至少50bp，優選地至少500bp，特別優選地至少1，OOObp,非常特別優選地至少5，OOObp序列長度。天然存在的表達構建體例如啟動子與相應基因的天然存在組合-在通過非天然的
14合成性「人工」方法例如誘變法修飾時變成轉基因表達構建體。已經描述了此類方法(US 5，565，350 ；WO 00/15815)。例如，與啟動子有效連接的編碼蛋白質的核酸分子相對於該啟動子視為異源，其中所述的啟動子不是該核酸分子的天然啟動子。優選地，異源DNA相對於導入該異源DNA的細胞不是內源的或不天然與該細胞相關，但是已經從另一種細胞獲得或已經合成。異源DNA還包括含有一些修飾的內源DNA序列、不天然存在的多拷貝內源DNA 序列或這樣的DNA序列，該DNA序列不與同物理連接於所述DNA序列的另一個DNA序列天然接合。通常地但不是必需地，異源DNA編碼在細胞中表達的RNA或蛋白質，而所述RNA或蛋白質正常情況下不被所述細胞產生。高表達組成型啟動子如本文中所用的「高表達組成型啟動子」意指在植物或其部分中引起組成型表達的啟動子，其中衍生自處於相應啟動子控制下的核酸分子中的RNA積累或合成速率或RNA穩定性比缺少本發明NEENA的啟動子所引起的表達更高，優選地顯著更高。優選地，相對於缺少本發明NEENA的組成型啟動子，RNA的量和/或RNA合成速率和 /或RNA穩定性增加50%或更大，例如100%或更多，優選地200%或更多，更優選地5倍或更多倍，甚至更優選地10倍或更多倍，最優選地20倍或更多倍，例如50倍。雜交如本文中所用，術語「雜交」包括「核酸分子的鏈通過鹼基配對作用與互補鏈結合的任意過程」。(J. Coombs (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York)。雜交和雜交的強度(即，核酸分子之間結合的強度)受此類因素影響，如核酸分子之間的互補性程度、所涉及條件的嚴格性、所形成雜合體的Tm和核酸分子內部的G C 比。如本文中所用，術語「Tm」用來指「解鏈溫度」。解鏈溫度是雙鏈核酸分子群體一半解離成單鏈的溫度。用於計算核酸分子的Tm的等式是本領域熟知的。如標準參考文獻所示，當核酸分子處於IM NaCl的水溶液中時，可以通過等式Tm = 81. 5+0. 41 (% G+C)計算來進行 Tm 值的簡單估計[見例如，Anderson 禾口 Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)]。其他參考文獻包括更複雜計算法，這些算法考慮了結構特徵及序列特徵以計算Tm。嚴格條件是本領域技術人員已知的並且可以在Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons，N. Y. (1989) ,6. 3. 1—6. 3. 6 中找到。「同一性」在比較兩個或多個核酸或胺基酸分子使用時，「同一性」意指所述分子的序列共有某種程度的序列相似性，即所述序列是部分相同的。為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸分子的同一性(同源性在本文可互換地使用) 百分數，將所述序列以一個序列在另一個序列下的方式書寫以最佳比較(例如，可以將空位插入蛋白質的序列或核酸的序列，旨在與另一種蛋白質或另一種核酸產生最佳比對)。隨後在對應胺基酸位置或核苷酸位置處比較胺基酸殘基或核酸分子。當一個序列中的位置由另一個序列中對應位置處的相同胺基酸殘基或相同核酸分子佔據時，則所述分子在這個位置處是同源的(即，如本上下文中所用的胺基酸或核酸「同源性」對應於胺基酸或核酸「同一性」。這兩個序列之間的同一性百分數是所述序列共有的相同位置的數值的函數(即同源性百分數=相同位置的數值/位置總數X100)。術語「同源性」和「同一性」因而視為同義詞。為確定兩個或多個胺基酸序列或兩個或多個核苷酸序列的同一性百分數，已經開發了幾個計算機軟體程序。兩個或更多序列的同一性可以用例如軟體fasta計算，其中軟體 fasta 已經以 fasta 3 版本使用(W. R. Pearson 和 D. J. Lipman, PNAS 85,2444(1988)；W. R. Pearson, Methods in Enzymology 183,63(1990) ；W. R. Pearson 禾口 D. J. Lipman，PNAS 85,2444(1988) ；W. R. Pearson,Enzymology 183，63 (1990))。用於計算不同序列的同一性的另一種有用程序是標準blast程序，其中該程序包含於Biomax pedant軟體(聯邦德國慕尼黑Biomax)中。不幸地，該程序有時產生次優結果，因為blast不總是包含主題和查詢對象的完整序列。然而，由於該程序非常高效，因而它可以用於龐大數目序列的比較。以下設置通常用於這樣的序列比較 -ρ程序名稱[字符串]；-d資料庫[字符串]；默認=nr ；-i查詢文件[File In]；默認=stdin ；-e期望值(E) [Real]；默認=10. O ；-m比對瀏覽選項0 =配對；1 =查詢-比上區域(query-anchored)，顯示同一性；2 =查詢-比上區域，不顯示同一性；3 =查詢-比上區域的屏文形式，顯示同一性；4 =查詢-比上區域的屏文形式，不顯示同一性；5 =查詢-比上區域，不顯示同一性和突然結束；6 =查詢-比上區域的屏文形式，不顯示同一性和突然結束；7 = XML Blast輸出；8 = TAB格式輸出；9帶注釋行的TAB格式輸出[整數]；默認=O ；-ο BLAST報告輸出文件[File Out]任選；默認=stdout ；-F過濾軟體查詢序列(DUST用blastn，SEG用其他方法)[字符串]；默認=T ；-G空位開口成本(零激發默認行為)[整數]；默認=O ；-E開口延伸成本(零激發默認行為)[整數]；默認=O ；-X X空位比對的下降值(比特)(零激發默認行為)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0， 全部其他方法15[整數]；默認=O ；-I在定義行中顯示GI' [T/F]；默認=F;_q核苷酸錯配罰分(僅blastn)[整數]；默認=_3 ；-r核苷酸匹配回報(僅blastn)[整數]；默認=1 ；-ν顯示對(V)的單-線描述的資料庫序列數[整數]；默認=500 ；-b顯示對(B) 的比對結果的資料庫序列數[整數]；默認=250 ；-f延伸命中的閾值，若為零，則默認； blastpll, blastn O, blastx 12, tblastn 13 ；tblastx 13, megablast O[整數]；默認= O ；-g執行空位比對(對tblastx不可用)[T/F]；默認=T ；-Q查詢使用的遺傳密碼[整數]；默認=1;_D DB遺傳密碼子(僅用於tblast[nx])[整數]；默認=1 使用的處理器數目[整數]；默認=1 ；"O kqAlign文件[File Out]任選；-J相信查詢定義行[T/F]； 默認=F ；-M矩陣[字符串]；默認=BL0SUM62 ；-W字大小，如果為零，則默認(blastn 11， megablast 28，全部其他方法3)[整數]；默認=O ；-z資料庫的有效長度(對於真實大小， 使用零)[Real]；默認=O ；-K來自保持區域的最佳命中數(默認關閉；若使用，則推薦值為 100)[整數]；默認=0;-P O用於多重命中；1用於單一命中[整數]；默認=0;-Y搜索空間的有效長度(對真實大小，使用零)[Real]；默認=O ；-S針對資料庫搜索的查詢鏈(對於 blast [nx]和tblastx) ；3用於兩者，1是頂端，2是底部[整數]；默認=3 ；-T產生HTML輸出結果[T/F]；默認=F ；-1限制資料庫搜索至GI 』 s列表[字符串]任選；-U使用FASTA 序列的較低事件過濾作用[T/F]任選；默認=F ；-y無空位延伸的X下降值(比特)(0. O激發默認行為)；blastn 20,megablast 10，全部其他方法7 [Real]；默認=0. O ；-Z最終空位比對的X下降值(比特)(0. O激發默認行為)；blastn/megablast50, tblastx 0，全部其他方法25 [整數]；默認=O ；-R PSI-TBLASTN檢查點文件[File In]任選；_n MegaBlast搜索[T/F]；默認=F ；-L查詢序列上的位置[字符串]任選；-A多重命中窗口大小，如果為零，則默認(blastn/megablast 0，全部其他方法40[整數]；默認=0 移碼罰分(00F算法用於blastx)[整數]；默認=0 ；-t允許tblastn中用於聯繫HSP的最大內含子的長度 (0取消連接聯繫)[整數]；默認=0。
通過使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法獲得高質量的結果。因而，優選基於所述算法的程序。有利地，可以用程序PileUp(J. Mol. Evolution.， 25,351 (1987), Higgins 等人，CABIOS 5,151(1989))或優選地用均基於 Needleman 和 Wunsch 算法(J. Mol. Biol. 48 ；443 (1970))的程序 「Gap」 與 「Needle」 和基於 Smith 和 Waterman (Adv. App 1. Math. 2 ； 482(1981))算法的"BestFit」 進行序列的比較。「Gap」 禾口 "BestFit"是 GCG 軟體包[Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA53711 (1991) ；Altschul 等人(Nucleic Acids Res. 25，3389(1997))， "Needle」 是歐洲分子生物學開放軟體包(The European Molecular Biology Open Software Suite(EMBOSS))的部分(Trends in Genetics 16 (6)，276 (2000))。因而，優選地，用程序「Gap」或「Needle」在所述序列的整個範圍內進行確定序列同一性百分數的計算。用於比較核酸序列的以下標準調整用於「Needle」:矩陣EDNAFULL，空位罰分10. 0，延伸罰分0. 5。用於比較核酸序列的以下標準調整用於「Gap」:空位權重50，長度權重3，平均匹配10. 000，平均錯配0. 000。例如，將聲稱在核酸水平與序列SEQ ID NO 1具有80 %同一性的序列理解為意指，通過上述程序「Needle」以設置的上述參數與序列SEQ ID NO :1所代表的序列比較時具有80%同一性的序列。優選地，在查詢序列例如SEQ ID NO :1的完整長度上計算同一性。內含子指基因內部的DNA區段(間插序列)，該DNA區段不編碼該基因產生的蛋白質的部分，並且從該基因轉錄的mRNA中在該mRNA從細胞核輸出之前剪切下來。內含子序列指內含子的核酸序列。因而，內含子是DNA序列的這些區域，它們隨編碼序列(外顯子)一起轉錄但是在成熟mRNA形成期間被除去。內含子可以位於實際編碼區內部或位於前mRNA(未剪接的mRNA)的5』或3』非翻譯前導序列中。初級轉錄物中的內含子被切下並且編碼序列同時且精確地連接以形成成熟的mRNA。內含子和外顯子的交界形成剪接位點。 內含子的序列始於⑶並止於AG。另夕卜，在植物中，已經描述AU-AC內含子的兩個實例來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)的RecA樣蛋白基因第14內含子和G5基因第7內含子是AT-AC含子。含有內含子的前mRNA具有3種短序列，連同其他序列，這些短序列對於精確剪接內含子是必需的。這些序列是5』剪接位點、3』剪接位點和分支點。mRNA剪接是除去初級mRNA轉錄物中存在的間插序列(內含子)並接合或連接外顯子序列。這又稱作順式剪接作用，所述順式剪接作用將相同RNA上的兩個外顯子接合，同時除去間插序列(內含子)。內含子的功能性元件包含由剪接體的特定蛋白質組分(例如其剪接內含子末端處的共有序列)識別並結合的序列。功能性元件與剪接體的相互作用導致從不成熟mRNA除去內含子序列和外顯子序列的再接合。內含子具有3種短序列，這些短序列對於精確剪接內含子是必需的，但是並非足夠的。這些序列是5』剪接位點、3』剪接位點和分支點。分支點序列是在植物中剪接過程和剪接位點選擇方面重要的。分支點序列通常位於3』剪接位點上遊10-60個核苷酸處。同基因的除可以因存在或不存在異源DNA序列而不同之外，在遺傳上相同的生物(例如植物)。分離的如本文中所用的術語「分離」意指材料已經通過人工取出並且離開其原來的天然環境存在並且因此不是自然界的產物。分離的材料或分子(如DNA分子或酶)可以以純化的形式存在或可以存在於非天然環境中如例如存在於轉基因宿主細胞中。例如，活植物中存在的天然存在多核苷酸或多肽不是分離的，然而與該天然系統中一些或全部共存物質分開的相同多核苷酸或多肽是分離的。此類多核苷酸可以是載體的一部分和/或此類多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，和是分離的，因為這種載體或組合物不是其最初環境的一部分。優選地，術語「分離的」相對於核酸分子使用時，如在「分離的核酸序列」中， 指被鑑定並且與該核酸序列天然來源中通常與其接合的至少一種雜質性核酸分子分開的核酸序列。分離的核酸分子是這樣的核酸分子，其在與自然界中找到該核酸分子的形式或環境不同的形式或環境下存在。相反，未分離的核酸分子是以其在自然界中存在的狀態所找到的核酸分子如DNA和RNA。例如，在宿主細胞染色體上相鄰基因附近找到給定的DNA序列(例如，基因)；作為與編碼多種蛋白質的眾多其他mRNA的混合物，在細胞中找到RNA序列，如編碼特定蛋白質的特定mRNA序列。然而，包含例如SEQ ID NO :1的分離的核酸序列包括例如在細胞中通常含有SEQ ID NO :1的此類核酸序列，其中所述核酸序列位於不同於天然細胞的染色體或染色體外位置中，或側翼分布有不同於自然界中存在的核酸序列。分離的核酸序列可以以單鏈或雙鏈形式存在。當分離的核酸序列用來表達蛋白質時，該核酸序列將最少含有有義鏈或編碼鏈的至少一部分(即，該核酸序列可以是單鏈的)。備選地， 它可以含有有義鏈和反義鏈(即，該核酸序列可以是雙鏈的)。最小啟動子在缺少上遊激活情況下無活性或啟動子活性大大降低的啟動子元件，尤其是TATA元件。在合適的轉錄因存在下，最小啟動子發揮作用以引起轉錄。NEENA 參見「增強核酸表達的核酸」。非編碼術語「非編碼」指核酸分子中不編碼所表達蛋白質的部分或全部的序列。 非編碼序列包括但不限於內含子、增強子、啟動子區、3』非翻譯區和5』非翻譯區。增強核酸表達的核酸(NEENA)術語「增強核酸表達的核酸」指這樣的序列和/或核酸分子，其是具有在與NEENA功能性連接的啟動子的控制下增強核酸表達的內在特性的特定序列。不同於啟動子序列，NEENA本身不能驅動表達。為了履行增強與NEENA功能性連接的核酸分子表達的職能，NEENA本身應當與啟動子功能性連接。與本領域已知的增強子序列的區別在於，NEENA以順式方式而不以反式方式起作用，並且必需靠近待表達核酸的轉錄起始位點存在。核酸和核苷酸術語「核酸」和「核苷酸」指天然存在的或合成的或人工核酸或核苷酸。術語「核酸」和「核苷酸」包括處於單鏈或雙鏈、有義或反義形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其任何核苷酸類似物和聚合物或雜合體。除非另外說明，特定核酸序列也隱含地包括其保守方式修飾的變體(例如簡併密碼子置換)和互補序列，以及明確指出的序列。術語「核酸」在本文中與「基因」、「DNA」、「mRNA」、「寡核苷酸」和「多核苷酸」互換地使用。核苷酸類似物包括在鹼基、糖和/或磷酸酯的化學結構中具有修飾的核苷酸，所述修飾包括但不限於5-位置嘧啶修飾、8-位置嘌呤修飾、胞嘧啶環外環胺處的修飾、5-溴-尿嘧啶置換等；和2'-位置糖修飾，包括但不限於糖修飾的核糖核苷酸，其中2' -OH由選自 H、OR、R、滷素、SH、SR、NH2、NHR、N 或CN的基團替換。短髮夾RNA(shRNA)也可以包含非天然元件如非天然鹼基，例如，肌苷和黃嘌呤，非天然糖，例如，2'-甲氧基核糖，或非天然磷酸二酯鍵，例如甲基磷酸酯、硫代磷酸酯和肽。核酸序列短語「核酸序列」指從5』 -端至3』 -端讀取的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的單鏈或雙鏈聚合物。它包括染色體DNA、自我複製型質粒、DNA或RNA的感染性聚合物、和主要發揮結構性作用的DNA或RNA。「核酸序列」也指代表核苷酸的縮寫、字母、字符或字的連續串。在一個實施方案中，核酸可以是「探針」，所述探針是相對短的核酸，通常長度小於100個核苷酸。經常地，核酸探針具有約50個核苷酸長度至約10個核苷酸長度。 核酸的「靶區域」是核酸中被鑑定為有目標的部分。核酸的「編碼區」是核酸的部分，其中置於適宜的調節性序列控制下時，所述部分以序列特異性方式轉錄和翻譯以產生特定的多肽或蛋白質。稱該編碼區編碼這種多肽或蛋白質。寡核苷酸術語「寡核苷酸」指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA)或其模擬物的低聚物或聚合物，以及具有類似發揮作用的非天然存在部分的寡核苷酸。此類修飾或取代的寡核苷酸因合乎需要的特性，例如增強的細胞攝取、增強的核酸靶親和力和在核酸酶存在下增加的穩定性而經常優選地勝過其天然形式。寡核苷酸優選地包括通過鍵(例如，磷酸二酯鍵)或取代鍵(substitute linkage)相互共價偶聯的兩個或多個核苷酸單體 (nuc1eomonomer)0突出端「突出端」是雙鏈寡核苷酸分子的5』 -或3』 -羥基端上相對短的單鏈核苷酸序列(也稱作「延伸」、「伸出端」或「粘末端」)。植物通常理解為意指能夠光合作用的任何真核單細胞或多細胞生物或其細胞、組織、器官、部分或繁殖材料(如種子或果實)。為本發明的目的，包括植物界(Plant Kingdom)的全部屬和物種的高等和低等植物。優選地一年生、多年生、單子葉和雙子葉植物。該術語包括成熟植物、種子、幼苗和籽苗及其衍生部分、繁殖材料(如種子或微孢子)、 植物器官、組織、原生質體、愈傷組織和其他培養物(例如細胞培養物)，和歸併成產生功能單元或結構單元的任何其他類型的植物細胞。成熟植物指在除籽苗之外的任何目的發育階段的植物。籽苗指在早期發育階段的年幼不成熟植物。一年生、二年生、單子葉和雙子葉植物是用於產生轉基因植物的優選宿主生物。基因的表達在全部觀賞植物、用材樹或觀賞樹、花、切花、灌木或草坪草中是更進一步有利的。可以用舉例方式、但非限制方式提到的植物是被子植物、苔蘚植物例如獐耳細辛屬(Hepaticae)(地錢類(liverwort))和蘚綱(Musci)(蘚類植物)；蕨類植物如蕨類、木賊類和石松類；裸子植物如松柏類植物、 蘇鐵植物、銀杏(ginkgo)和買麻藤科(Gnetaeae)植物；藻類如綠藻綱(Chlorophyceae)、 褐藻綱(Phaeophpyceae)、紅藻綱(Rhodophyceae)、粘藻綱(Myxophyceae)、黃藻綱 (Xanthophyceae) > iiig^ (Bacillariophyceae) ( iiig^l )禾0 (Euglenophyceae)。 優選地用於食物或飼料目的的植物，如豆科(Leguminosae)如豌豆、苜蓿和大豆；禾本科 (Gramineae)如稻、玉米、小麥、大麥、高粱、黑麥、黑小麥或燕麥；傘形科(Umbelliferae)， 具體地是胡蘿蔔屬(Daucus)(非常特別地是物種胡蘿蔔(carota))和芹屬(Apium)(非常特別地是物種旱芹(Graveolens dulce (celery)))及眾多其它植物；茄科(Solanaceae)， 特別地是番茄屬(Lycopersicon)，非常特別地是物種番茄(tomato)，和茄屬(Solanum)， 非常特別地是物種馬鈴薯(tomato)和茄子(aubergine)和眾多其它植物(如菸草 (tcAacco))，和辣椒屬(Capsicum)，非常特別地是物種辣椒(Capsicum annum (pepper)) 物種及眾多其它植物；豆科(Leguminosae)，特別地是大豆屬(Glycine)，非常特別地是物種大豆(soybean)、苜蓿、豌豆、紫花苜蓿、菜豆或花生及眾多其它植物；和十字花科(Brassicacae)，特別地是芸苔屬(Brassica)，非常特別地是物種歐洲油菜(oilseed rape)、芸苔(beet)、甘藍(Brassica oleracea cv Tastie (捲心菜))、花椰菜(Brassicaoleracea cv Snowball Y (花挪菜))禾口花蓮甘藍(oleracea cv Emperor (broccoli))；禾口擬南芥屬，非常特別地是物種擬南芥及眾多其它植物；菊科(Compositae)，具體地是萵苣屬(Lactuca)，非常特別地是物種萵苣(lettuce)及眾多其它植物；菊科(Asteraceae)如向日葵、萬壽菊、萵苣或金盞花及眾多其它植物；葫蘆科(Cucurbitaceae)如甜瓜、西葫蘆/ 南瓜或夏南瓜，和亞麻。更優選地是棉屬植物、甘蔗、大麻、亞麻、辣椒和多種樹、堅果和藤本 (wine)物種。多肽術語「多肽」、「肽」、「寡肽」、「多肽」、「基因產物」、「表達產物」和「蛋白質」在
文中互換地使用，用來指連續胺基酸殘基的聚合物或低聚物。前蛋白正常情況下靶向細胞器如葉綠體並且仍包含其轉運肽的蛋白質。初級轉錄物如本文中所用的術語「初級轉錄物」指基因的不成熟RNA轉錄物。「初級轉錄物」例如仍包含內含子和/或仍不包含聚腺苷酸尾或帽結構和/或是缺少對其作為轉錄物正常發揮作用必需的其他修飾，例如修剪或編輯。啟動子術語「啟動子」或「啟動子序列」是等同物並且如本文中所用的，指與目的核苷酸序列連接時能夠控制目的核苷酸序列轉錄成RNA的DNA序列。此類啟動子可以例如在以下公共資料庫中 http//www, grassius. org/grasspromdb. html、http://mendel. cs. rhul. ac. uk/mendel. php ？ topic = plantprom、http://ppdb. gene, nagoya-u. ac. jp/ cgi-bin/index. cgi找到。其中所列的啟動子可以用於本發明的方法並且在此引用而包括。 啟動子位於由該啟動子控制轉錄成mRNA的目的核苷酸序列的5』 (即，上遊)，靠近其轉錄起始位點，並且為RNA聚合酶和用於轉錄起始的其他轉錄因子的特異性結合提供位點。所述啟動子包含靠近轉錄起始位點例如至少101Λ，例如51Λ或21Λ。它也可以包含靠近轉錄起始位點至少1500bp，優選地至少lOOObp，更優選地至少500bp，甚至更優選地至少400bp，至少 300bp，至少200bp或至少lOObp。在又一個優選的實施方案中，啟動子包含靠近轉錄起始位點至少50bp，例如至少25bp。啟動子不包含外顯子和/或內含子區或5』非翻譯區。啟動子可以例如相對於相應植物為異源或同源。如果多核苷酸序列源自外來物種，或如果來自相同物種，但從其原有形式中被修飾，則它相對於某生物或第二多核苷酸序列為「異源」。例如，與異源編碼序列有效連接的啟動子指編碼序列來自不同於衍生該啟動子的物種中，或， 如果來自相同物種，編碼序列與該啟動子不天然接合(例如基因修飾的編碼序列或來自不同生態型或品種的等位基因)。合適的啟動子可以源自其中應當出現表達的宿主細胞的基因或源自該宿主細胞的病原體(例如，植物或植物病原體如植物病毒)。植物特異性啟動子是適於調節植物中表達的啟動子。這種啟動子可以源自植物，也可以源自植物病原體，或它可以是由人設計的合成性啟動子。如果啟動子是誘導型啟動子，則轉錄的速率應答於誘導劑而增加。另外，啟動子可以以組織特異性或組織優先的方式受到調節，從而它僅僅或優勢地在特定組織類型如葉、根或分生組織中轉錄所接合的編碼區方面有活性。用於啟動子時，術語「組織特異性」指這樣的啟動子，該啟動子能夠指導目的核苷酸序列在特定類型的組織(例如，花瓣)中選擇性表達，同時相同目的核苷酸序列在不同類型組織(例如，根) 中相對缺少的表達。可以例如通過這樣的方式評價啟動子的組織特異性將報導基因與該啟動子序列有效連接以產生報導構建體，將報導構建體導入植物的基因組，從而該報導構建體整合至所產生的轉基因植物的每種組織中，並且檢測報導基因在轉基因植物的不同組織中的表達(例如，檢測mRNA、蛋白質或由報導基因編碼的蛋白質的活性)。相對於報導基因在其他組織中的表達水平，檢測到該報導基因在一種或多種組織中的更大表達水平表明該啟動子對其中檢測到更大表達水平的組織是特異性的。用於啟動子時，術語「細胞類型特異的」指這樣的啟動子，該啟動子能夠指導目的核苷酸序列在特定類型的細胞中選擇性表達，同時相同目的核苷酸序列在相同組織內部的不同類型細胞中相對缺少的表達。用於啟動子時，術語「細胞類型特異的」還意指能夠促進目的核苷酸序列在單一組織內部的某區域中選擇表達的啟動子。使用本領域熟知的方法，例如GUS活性染色法、GFP蛋白法或免疫組織化學染色法，可以評估啟動子的細胞類型特異性。談及啟動子或源自啟動子的表達時，術語「組成型」意指能夠指導有效連接的核酸分子在刺激物(例如，熱休克、化學品、光等)不存在下在大部分植物組織和細胞中貫穿植物或植物部分的基本上整個生活期限轉錄的啟動子。一般而言，組成型啟動子能夠指導轉基因在基本上任何細胞和任何組織中的表達。啟動子特異性談及啟動子時，術語「特異性」意指由相應啟動子引起的表達的樣式。特異性描述了植物或其部分的組織和/或發育狀態，在其中該啟動子引起處於相應啟動子控制下的核酸分子表達。啟動子的特異性也可以包含環境條件，在所述環境條件下可以激活或下調該啟動子，如由生物脅迫或環境脅迫如寒冷、乾旱、受傷或感染誘導或阻遏。純化如本文中所用，術語「純化的」指從其天然環境取出、分離或分開的分子，即核酸序列或胺基酸序列。「基本上純化的」分子至少60%沒有、優選地至少75%沒有和更優選地至少90%沒有與它們天然結合在一起的其他組分。純化的核酸序列可以是分離的核酸序列。重組就核酸分子而言，術語「重組」指通過重組DNA技術產生的核酸分子。重組核酸分子也可以包括本身不存在於自然界中但是被人修飾、改變、突變或操縱的分子。優選地，「重組核酸分子」是在序列方面與天然存在的核酸分子有至少一個核酸不同的非天然存在的核酸分子。「重組核酸分子」也可以包括「重組構建體」，其包含不天然地以這種順序存在的一系列核酸分子，所述核酸分子優選地有效地連接。用於產生所述重組核酸分子的優選方法可以包括克隆技術、定向或非定向誘變法、合成或重組技術。有義術語「有義」理解為意指核酸分子，其具有與靶序列互補或相同的序列，例如與蛋白質轉錄因子結合和參與給定基因表達的序列。根據一個優選的實施方案，該核酸分子包含目的基因和允許表達該目的基因的元件。顯著的增加或減少大於測量技術中固有誤差幅度的增加或減少，例如在酶活性或在基因表達方面，優選地是對照酶的活性或對照細胞中的表達增加或減少約2倍或更多，更優選地增加或減少約5倍或更多，並且最優選地增加或減少約10倍或更多。小核酸分子「小核酸分子」理解為由核酸或其衍生物如RNA或DNA組成的分子。 它們可以是雙鏈或單鏈的，並且其長度在約15和約30bp之間，例如在15和30bp之間，更優選地在約19和約^bp之間，例如在19和^bp之間，甚至更優選地在約20和約25bp之間，例如在20和25bp之間。在一個特別優選的實施方案中，寡核苷酸的長度在約21和約 24bp之間，例如在21和Mbp之間。在一個最優選的實施方案中，小核酸分子的長度是約 2Ibp 和約 24bp，例如 2Ibp 和 24bp。基本上互補的在最廣意義上，本文中就核苷酸序列相對於參比或靶核苷酸序列而言使用時，術語「基本上互補的」意指這樣的核苷酸序列，其具有在基本上互補的核苷酸序列和所述參比或靶核苷酸序列的完全互補序列之間至少60%，更希望地至少70%，更
21希望地至少80%或85%，優選地至少90%，更優選地至少93%，仍更優選地至少95%或 96 %，仍舊更優選地至少97 %或98 %，依舊更優選地至少99 %或最優選地100 %的同一性百分數(後者等同於本上下文中的術語「同一的」)。優選地，在至少19個核苷酸長度、優選地至少50個核苷酸長度、更優選地核酸序列的全部長度範圍內針對所述參比核苷酸序列評估同一性(如果不是，則另外在下文說明)。使用威斯康辛大學GCG的默認GAP分析， GAP 的 SEQWEB 應用，基於 Needleman 和 Wunsch 算法(Needleman 和 Wunsch(1970) J Mol. Biol. 48 :443-453;如上文定義)實施序列比較。與參比核苷酸序列「基本上互補的」核苷酸序列與該參比核苷酸序列在低嚴格性條件、優選地中等嚴格性條件、最優選地高嚴格性條件(如上文定義)下雜交。轉基因如本文中所用的術語「轉基因」指通過實驗操作導入細胞的基因組中的任何核酸序列。轉基因可以是「內源DNA序列」或「異源DNA序列」(即，「外來DNA」)。術語 「內源DNA序列」指這樣的核苷酸序列，其天然存在於導入該核苷酸序列的細胞中，只要它相對於天然存在序列不含有一些修飾(例如，點突變、存在可選擇標記基因等)。轉基因的當提及生物時，術語「轉基因的」意指用重組DNA分子轉化生物，優選地穩定轉化生物，其中所述重組DNA分子優選地包含與目的DNA序列有效連接的合適啟動子。載體如本文中所用，術語「載體」指能夠運輸已經與之連接的另一個核酸分子的核酸分子。一種類型的載體是基因組整合的載體，或「整合的載體」，所述載體可以整合至宿主細胞的染色體DNA中。另一個類型的載體是游離型載體，即，能夠進行染色體外複製的核酸分子。本文中將能夠指導與它們有效連接的基因表達的載體稱作「表達載體」。在本說明書中，「質粒」和「載體」互換地使用，除非從上下文顯而易見並非如此。設計旨在體外或體內產生如本文所述RNA的表達載體可以含有被任何RNA聚合酶識別的序列，所述的RNA聚合酶包括線粒體RNA聚合酶、RNA pol I、RNA pol II和RNA pol III。這些載體可以用來在根據本發明的細胞中轉錄想要的RNA分子。將植物轉化載體理解為適用於植物轉化過程中的載體。野生型就生物、多肽或核酸序列而言，術語「野生型」、「天然」或「天然來源」意指所述生物是天然存在的或是在至少一種天然存在生物中可獲得的，其沒有被改變、突變或由人類操作。
實施例化學品和常用方法除非另外說明，如(Sambrook等人，1989)所述為本發明的目的進行克隆過程，包括限制性消化、瓊脂糖凝膠電泳、核酸的純化、核酸的連接、細菌細胞的轉化、選擇和培養。使用Sanger技術(Sanger等人，1977)，用雷射螢光DNA測序儀(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)進行重組DNA的序列分析。除非另外描述，從Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, St. Louis, USA)、Promega (Madison, WI, USA)、Duchefa (Haarlem, The Netherlands)或hvitrogen (Carlskid，CA，USA)獲得化學品和試劑。限制性核酸內切酶來自 New England Biolabs (Ipswich, MA, USA)或 Roche Diagnostics GmbH(Penzberg, Germany) ο 寡核苷酸由 Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Germany)合成。實施例1 從具有組成型表達的基因鑑定增強核酸表達的核酸(NEENA)
1. 1從擬南芥(A. thaliana)基因鑑定NEENA分子使用公開可獲得的基因組DNA序列(例如http //www. ncbi. nlm. nih. gov/ genomes/PLANTS/PlantList. html)禾口轉錄物表達數據(例如 http //www, weigelworld. org/resources/microarray/AtGenExpress/)，選擇源自高度表達性組成型基因的擬南芥 (Arabidopsis thaliana)轉錄物中的一組18個潛在NEENA候選物用於詳細分析。此外，該分析中還包括源自歐芹的推定的NEENA分子。候選物命名如下表1 組成型 NEENA 候選物(NEENAc)。
權利要求
1.用於產生高表達組成型植物啟動子的方法，包括將一個或多個增強核酸表達的核酸 (NEENA)分子與啟動子功能性連接，其中所述增強核酸表達的核酸(NEENA)分子相對於所述啟動子是異源的，其包含i)具有如SEQID NO :1至19、優選地SEQ ID NO :1至9中所定義序列的核酸分子，或ii)具有與SEQID NO 1至19、優選地SEQ ID NO :1至9具備至少80%同一性的序列的核酸分子，或iii)i)或ii)的核酸分子的100個或更多連續鹼基的片段，所述片段具有如具有SEQ ID NO 1至19、優選地SEQ ID NO :1至9的序列的相應核酸分子那樣的增強表達活性，或iv)作為前述在i)或ii)下提及的任一核酸分子的互補物或反向互補物的核酸分子，或ν)使用表 2 中所示的由 SEQ ID NO 20 至 57、優選地 SEQ ID NO 20/21 ；26/27 ；30/31 ； 38/39 ；42/43 ；44/45 ；46/47 ；50 ；51和56/57描述的寡核苷酸引物，通過PCR可獲得的核酸分子，或vi)核酸分子，其在等同於50°C於7%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0. 5MNaP04UmM EDTA雜交，以及5(rC於2XSSC、0.1%SDS中洗滌的條件下與包含由SEQ ID NO 1至19、優選地SEQ ID NO :1至9或其互補物描述的增強轉錄的核苷酸序列的至少50個連續核苷酸的核酸分子雜交。
2.用於產生植物或其部分的方法，所述植物或其部分與相應的對照植物或其部分相比具有一種或多種核酸分子的增強的組成型表達，所述方法包括步驟a)將包含權利要求1的i)至vi)中所定義核酸分子的一個或多個NEENA導入所述植物或其部分；禾口b)將所述一個或多個NEENA與組成型啟動子和與處在所述組成型啟動子控制下的核酸分子功能性連接，其中NEENA對所述核酸分子為異源。
3.根據權利要求1和2所述的方法，包括步驟a)將包含權利要求1的i)至vi)中所定義核酸分子的一個或多個NEENA導入植物或其部分，和b)將所述一個或多個NEENA整合至所述植物或其部分的基因組中，從而所述一個或多個NEENA與相對所述一個或多個NEENA為異源的內源組成型表達的核酸功能性連接，和任選地c)從所述轉化的細胞再生出包含所述一個或多個NEENA的植物或其部分。
4.根據權利要求1至3所述的方法，包括步驟a)提供包含一個或多個NEENA的表達構建體，所述NEENA包含權利要求1的i)至vi) 中所定義的、與組成型啟動子和與相對於所述一個或多個NEENA為異源並處在所述組成型啟動子控制下的一種或多種核酸分子功能性連接的核酸分子，和b)將包含所述一個或多個NEENA的所述表達構建體整合至所述植物或其部分的基因組中，和任選地c)從所述轉化的植物或其部分再生出包含所述一個或多個表達構建體的植物或其部分。
5.根據權利要求1至4所述的方法，其中所述植物是單子葉或雙子葉植物。
6.根據權利要求5所述的植物，其中所述植物是雙子葉植物。
7.根據權利要求5所述的植物，其中所述植物是單子葉植物。
8.根據權利要求1至7所述的方法，其中所述一個或多個NEENA與靠近所述異源核酸分子的轉錄起始位點的組成型啟動子功能性連接。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述一個或多個NEENA與距離所述異源核酸分子的轉錄起始位點2500bp或更少、優選地2000bp或更少、更優選地1500bp或更少、甚至更優選地IOOObp或更少並且最優選地500bp或更少的組成型啟動子功能性連接。
10.根據權利要求1至9所述的方法，其中所述一個或多個NEENA與核酸分子的翻譯起始位點上遊的組成型啟動子功能性連接，所述核酸分子的表達處在所述組成型啟動子的控制下。
11.根據權利要求1至10所述的方法，其中所述一個或多個NEENA與核酸分子的5』UTR 內部的組成型啟動子功能性連接，所述核酸分子的表達處在所述組成型啟動子的控制下。
12.包含一個或多個NEENA的重組表達構建體，所述的NEENA包含權利要求1的i)至 vi)中所定義的核酸分子。
13.根據權利要求12所述的包含一個或多個NEENA的重組表達構建體，其包含權利要求1的i)至vi)中所定義的核酸分子，所述核酸分子與一個或多個組成型啟動子和與相對於所述一個或多個NEENA為異源的一種或多種表達的核酸分子功能性連接。
14.重組表達載體，其包含根據權利要求12或13所述的一個或多個重組表達構建體。
15.轉基因植物或其部分，其包含權利要求1的i)至vi)中所定義的一種或多種異源 NEENA。
16.轉基因細胞或轉基因植物或其部分，其包含權利要求14中所述的重組表達載體或根據權利要求12或13所述的重組表達構建體。
17.根據權利要求16所述的轉基因細胞、轉基因植物或其部分，其選自或衍生自細菌、 真菌、酵母或植物。
18.根據權利要求17所述的轉基因植物或其部分，其中所述植物或其部分是雙子葉植物。
19.根據權利要求17所述的轉基因植物或其部分，其中所述植物或其部分是單子葉植物。
20.衍生自根據權利要求15至19所述的轉基因細胞或植物或其部分的轉基因細胞培養物、轉基因種子、部分或繁殖材料，其包含權利要求1的i)至vi)中所定義的所述異源 NEENA、權利要求12或13的重組表達構建體或權利要求14的重組載體。
21.權利要求1的i)至vi)中所定義的NEENA或權利要求12至14中任一項所定義的重組構建體或重組載體的用途，用於增強在植物或其部分中的表達。
22.權利要求20中所述的衍生自轉基因細胞或植物的轉基因細胞培養物、轉基因種子、轉基因植物、部分或繁殖材料的用途，用於食物、動物飼料、種子、藥物或精細化學品的生產。
全文摘要
本發明屬於植物分子生物學領域並且提供了用於產生高表達的組成型啟動子的方法和產生具有增強的核酸組成型表達的植物的方法，其中將增強核酸表達的核酸(NEENAs)與所述啟動子功能性連接和/或導入植物中。
文檔編號C12N15/82GK102482684SQ201080038708
公開日2012年5月30日 申請日期2010年8月11日 優先權日2009年8月31日
發明者E·杜維尼哥, J·M·庫恩, L·P·洛亞爾, M·西伯特 申請人:巴斯夫植物科學有限公司