植物系統中外來核酸和多肽的產生的製作方法

2023-06-12 09:39:06 5

專利名稱：植物系統中外來核酸和多肽的產生的製作方法
技術領域：
無
背景技術：
藥品的成本相當高且正在不斷升高。除成本高外，一些藥品的供應還受到限制，這 使得這些藥品無法為每一位有需要的患者所用。由於成本和可用性阻礙了藥品於貧困群體 中的分配，故這對於發展中國家來說是一個特別值得關注的問題。若干因素導致藥品生產的高成本，並且引起消費者購買醫藥品的價格升高。引起 此問題的最主要因素為生產所述產品的經濟方式的缺乏。對於基於蛋白質和肽的藥物來說 尤其如此。對於一些藥物，另一因素在於無法經口投與治療有效量的藥劑。許多醫藥品只 能通過注射到身體特定部位來投與。舉例來說，治療過敏症或傳染性疾病的一些免疫藥物需要通過注射投與。諸如人類生長激素和胰島素等蛋白質和肽類藥品通常只能通過注射投 與。引起許多藥品成本的另一因素在於其在醫院或分配場所的傳遞。尤其在炎熱天氣，傳 遞和存儲藥品需要昂貴的製冷設備。由於所述設備通常難以得到，故這在發展中國家是主 要問題。已經在多種宿主中產生藥用蛋白質和肽。已經在包括原核生物(諸如大腸桿菌 (Escherichia coll)和枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis))和真核生物(諸如酵母、真 菌、昆蟲細胞、動物細胞和轉基因動物)的異源表達系統中產生許多治療性蛋白質。細菌表 達系統相對易於操作且產物的產率較高。然而，哺乳動物蛋白通常需要大規模的翻譯後修 飾來達到功能活性，這就成為細菌表達系統的限制因素。諸如哺乳動物、人類和昆蟲細胞培 養系統等細胞培養系統對於產生複雜蛋白質較為便利。然而，較長的交貨期、較低的產品回 收率、可能出現的病原轉移以及較高的資本和生產成本都提出了嚴肅的問題。轉基因動物 可以提供對於複雜蛋白質的無限量供應。不幸的是，這一系統受產生新穎且經改進產物所 耗費的較長時間以及病原轉移到人類個體中的風險的限制。在原核和真核細胞中產生藥用蛋白質和肽的經濟和生物化學限制(包括高生產 成本、低產率、分泌問題、蛋白質加工中的不當修飾、按比例擴大到較大體積的困難以及汙 染)已驅使研究人員研究植物作為新穎宿主，以便以預期降低的成本大規模產生蛋白質和 肽。轉基因植物中蛋白質的產生例如描述於美國專利第5，750，871號、第5，565，347號、第 5，464，763號、第5，750，871號和第5，565，347號中。儘管植物的大量生長和採集比原核和 真核細胞便宜，但植物細胞中外來基因的表達通常較低。此外，採集植物通常需要例如通過 去除葉片、使莖與根分離或去除根來破壞植物。所述破壞通常會引起起始植株部分枯萎和 植物凋亡的過程。經歷凋亡的植物會在開始蛋白質純化之前產生引起轉基因表達的蛋白質 降解的蛋白酶。即使是直接消費植物，所表達的藥用蛋白質的活性也可能因採集誘導的細 胞間降解機制而降低。與在露天生長的轉基因植物中產生外來蛋白相關的另一主要問題在於與野外植 物異花授粉的可能性，這使得可能會使外來蛋白進入食物鏈。圍繞針對轉基因植物的農業 實踐的政府規章的複雜性使得難以批准將新穎轉基因植物用於農業用途。此外，戶外環境 無法控制，使得難以保證外來基因的適當生長、發育和對其表達的調控。舉例來說，實際上 無法在戶外環境中進行熱誘導型、光誘導型、激素誘導型或化學誘導型啟動子的誘導。當 然，也無法控制戶外溫度和光照水平。另外，噴到植物上的激素或化學品很可能不在植株上 分散，而是經風和雨分散到環境中。噴灑農田的成本也相當高。需要產生蛋白質或多肽的改進系統。還特別需要在植物中產生蛋白質或多肽的改 進系統。舉例來說，需要用於在植物中產生藥用蛋白質且在採集後減少所表達蛋白質的細 胞間降解的量的受控可調控系統。

發明內容
本發明提供在植物中產生蛋白質或多肽(和/或核酸)、尤其藥用蛋白質或多肽的 系統。一方面，本發明提供在植物中迅速表達蛋白質或多肽的系統。因此，在一些實施例 中，本發明提供蛋白質或多肽在幼苗中的表達。在一些實施例中，所述幼苗為發芽幼苗。在一些實施例中，可以消費或採集活的幼苗(例如發芽幼苗)。在一些實施例中，植物是在封 閉式可調控環境(例如室內)中生長(例如從種子生長)。在一些實施例中，根據本發明產生的蛋白質或多肽是在植物細胞中由人工引入植物中的核酸構築體表達。在一些實施例中，根據本發明產生的蛋白質或多肽是在植物細胞 中由具有植物病毒特徵的RNA翻譯。在一些實施例中，這些特徵包括自我複製、細胞到細胞 運動、系統性運動和其組合，或選自由自我複製、細胞到細胞運動、系統性運動和其組合組 成的群組。在一些實施例中，RNA自我複製並且能夠細胞到細胞運動，但無法在植株中系統 性運動。在一些實施例中，根據本發明產生的蛋白質或多肽是在植物細胞中由在農桿菌 (Agrobacterium)中複製的核酸構築體表達。在一些實施例中，本發明利用在農桿菌中復 制且還含有引導具有植物病毒特徵的RNA表達的啟動子的構築體。在一些實施例中，所述 RNA包括編碼所關注的蛋白質或多肽的序列。因此，在本發明一些實施例中，在植物中通過 包括將在農桿菌中複製且還含有引導具有植物病毒特徵的RNA表達的啟動子的載體引入 植物細胞中的方法來產生所關注的蛋白質或多肽，所述RNA無法在植株中系統性運動，但 能夠自我複製且所述RNA另外編碼所關注的蛋白質或多肽。在本發明一些實施例中，當利用在農桿菌中複製的構築體時，通過農桿菌滲透法 將所述構築體引入植物細胞中。儘管本文中主要參考本發明用於產生藥用蛋白質的用途來描述本發明，但本發明 通常用於產生基本上任何所關注的核酸(DNA和/或RNA)和/或蛋白質，而不受有關核酸 或蛋白質的特定用途的限制。舉例來說，可以產生在多種工業過程或生物修復過程的任一 種中使用的酶(例如，降解汙染物的酶)。因此，即使未明確指出，但本發明和權利要求書中 的描述應視為適用於任何所關注的核酸或蛋白質，包括具有治療應用的核酸或蛋白質，以 及不具有治療應用的核酸或蛋白質。在某些實施例中，所述蛋白質在營養上並非重要蛋白 質。在本文中未提及的情況下，本發明可以排除任何特定蛋白質。在本發明任何方面中，在其某些實施例中，所關注的核酸或蛋白質在表達其的細 胞中經轉錄後和/或翻譯後加工。在本發明某些實施例中，所關注的蛋白質是由表達其的 細胞分泌。舉例來說，所述蛋白質通常可以包含分泌信號序列，或可以修飾編碼所述蛋白質 的核酸的編碼區以使其包括編碼分泌信號序列的一部分。所屬領域中眾所周知分泌信號序 列。在本發明任何方面中，在其某些實施例中，可以改變編碼所關注的蛋白質的異源 序列以使用與天然存在的序列中存在的密碼子不同的密碼子，從而改進在常見植物和/或 特定物種的植物中的表達。舉例來說，可以將所述序列密碼子優化以便在特定物種中表達。 所屬領域中已知進行密碼子優化的方法。本發明還提供含有如本文所述的表達構築體的植物、含有所述植物的組合物、從 所述植物中分離的蛋白質/多肽製劑、含有所述從所述植物中分離的蛋白質/多肽的組合 物、進行所述分離的方法，和使用所述經分離蛋白質/多肽(或含有其的組合物)的方法， 包括利用在植物中表達的醫藥學活性蛋白質治療哺乳動物的方法。定義對有需要的個體「投與」醫藥學活性蛋白質或多肽意思為，以使所述蛋白質的治療功效保持足以對所述宿主提供所需有益作用的時間長度的方式對所述個體提供醫藥學活 性蛋白質。術語「動物」涵蓋所有脊椎動物(生活型)，人類、牛、綿羊、豬、犬科、貓科、雪貂、齧 齒動物、靈長類動物、魚類、鳥類(例如家禽)等。在一些實施例中，所述動物為哺乳動物。 在一些實施例中，所述動物為人類。根據本發明，多肽或蛋白質的「特徵部分」為具有含有連續胺基酸伸長或一起為蛋 白質或多肽的特徵的連續胺基酸伸長的集合的蛋白質或多肽。在一些實施例中，各所述連 續伸長通常將含有至少2、5、10、15、20或更多個胺基酸。一般來說，特徵部分為除上文所述 的序列一致性外與相關完整蛋白質共有至少一個功能特徵的部分。在一些實施例中，特徵 部分可具生物活性。
如本文所使用的術語，蛋白質或多肽「域」通常是指，當產生而遠離蛋白質或多肽 序列的剩餘部分時保持三維完整程度和/或結構的蛋白質或多肽序列區段。如所屬領域已 知，許多蛋白質和多肽具有域結構。在一些實施例中，域具有活性(例如，結合、催化活性 等)。在一些實施例中，域具有免疫原性。免疫原域至少與單表位一樣大，且通常比單表位 大；在一些實施例中，免疫原域除表位外還含有足夠的序列以確保所述表位的正確呈遞。「表達」是指內源基因或轉基因在植物(例如，幼芽)中的轉錄和/或翻譯。可將 或可不將轉基因整合到植物的基因組DNA中。舉例來說，「表達」是指細菌、質粒或病毒核酸 中存在的基因在植物中的轉錄和/或翻譯，而不管是否將所述細菌、質粒或病毒核酸整合 到植物的基因組DNA中。所述基因可以為對於細菌、質粒或病毒而言為異源的基因。「表達盒」或「表達載體」是指能夠引導特定核苷酸序列在適當宿主細胞中表達的 DNA序列(或在RNA病毒或RNA質粒的情況下為RNA序列)。舉例來說，表達盒可以包括可 操作地連接到所關注的核苷酸序列的啟動子，其視情況可操作地連接到3'序列，諸如3' 調控序列或終止信號。表達盒通常還可以包括當需要任何核苷酸序列時進行所述序列的適 當翻譯所需的序列。編碼區通常編碼所關注的蛋白質，但也可編碼所關注的功能性RNA，例 如反義RNA或抑制特定基因表達的不翻譯RNA。包括所關注的核苷酸序列的表達盒可為嵌 合體，意思是指所述核苷酸序列包括一個以上不同來源的DNA序列，其是通過重組DNA技術 融合在一起，產生天然不存在且尤其在將要表達所述序列的植物中不存在的核苷酸序列。 表達盒還可以為天然存在但以重組方式獲得的適用於異源表達的表達盒。然而，通常表達 盒關於宿主為異源的，亦即，表達盒的特定DNA序列在宿主細胞中天然不存在且必須通過 轉化事件引入宿主細胞或宿主細胞的始祖細胞中。表達盒中的核苷酸序列的表達受組成性 啟動子或只有當宿主細胞暴露於某些特定外部刺激物時才起始轉錄的可誘導啟動子控制。 在多細胞有機體(諸如植物)的情況下，啟動子也可對特定組織、器官或發育階段具特異 性。通常將核表達盒插入植物核基因組中並且其能夠引導植物的核基因組表達特定核苷酸 序列。通常將質粒表達盒插入植物質粒基因組中並且其能夠引導植物的質粒基因組表達特 定核苷酸序列。在質粒表達盒的情況下，對於由質粒基因組表達核苷酸序列來說，將需要其 它元件，例如核糖體結合位點，或阻止質粒RNA多聚腺苷酸化和隨後降解的3'莖-環結構。 在本發明某些實施例中，利用包含作為最小啟動子(諸如TATA元件)的啟動子的表達盒， 且反式活化因子(trans-activating factor)的存在可能為引導核苷酸序列表達、尤其引 導高水平表達所必需。舉例來說，表達盒可包含結合轉錄活化子的DNA區。所述表達盒和其中的啟動子稱為「可活化的」。「食物」或「食品」為可由人類或其它動物攝取的液體或固體製劑。優選所述術語 包括可直接新鮮提供給人類和/或其它動物的生植物或活植物(例如，發芽幼苗)製劑。從 植物獲得的材料意欲包括可由人類或其它動物攝取的整個可食用植物。所述術語還可包括 任何經加工植物(例如，發芽幼苗)與餵給人類和其它動物的營養載劑。加工步驟可包括 食品或飼料工業中常用的步驟。所述步驟包括(但不限於)濃縮植物的固體物質以例如形 成顆粒、產生糊狀物、乾燥或凍幹；或者可以通過將植物切割、搗碎或研磨達到各種程度，或 通過提取植物的液體部分以產生湯汁、糖漿或汁液來製造。加工步驟還可包括蒸煮(例如 燻蒸)植物(例如發芽幼苗)。「基因」為編碼所關注的蛋白質或多肽(或RNA)的序列。基因可包括相關調控序 列。基因的編碼序列可以轉錄成RNA，諸如mRNA、rRNA、tRNA、snRNA、正義RNA或反義RNA。 然而，如所屬領域技術人員所了解，「基因」還可以為RNA(例如病毒RNA載體中的基因)。 「調控序列」的實例為啟動子序列、5'和3'不翻譯序列以及終止序列。此外，還可以包括 內含子和外顯子。在某些實施例中，基因為編碼序列且相關調控序列為異源序列。如本文所使用，「異源序列」意思指具有不同的天然來源或合成來源。舉例來說，如 果將核酸引入宿主細胞中且宿主細胞天然不含有所述核酸中存在的某些或全部序列，那麼 就稱這些序列(和/或核酸)關於所述宿主細胞為異源的。所引入的核酸可包括異源啟動 子、異源編碼序列或異源終止序列。另外，轉化核酸可為完全異源的或者可包括任何可能的 異源與內源核酸序列的組合。類似地，異源是指由相同天然來源的細胞類型得到且插入相 同天然來源的細胞類型中，但以非天然狀態(例如不同拷貝數)存在或在不同調控元件控 制下的核苷酸序列。術語「異源」適用於細胞，包括植物和細菌細胞，且也適用於質粒、質體 禾口病毒。「宿主細胞」為引入核酸以供表達的細胞。通常所述引入需要人工操作。「無活性表達盒」或「無活性表達載體」為包含無活性或沉默的外來核酸序列的DNA 或RNA序列，其能夠在活化後引導所關注的核酸或多肽的表達。一般來說，無活性表達盒 具有如上文所述的表達盒特性，但編碼所關注的核酸或多肽的序列不可操作地連接到啟動 子，例如，其可通過插入核酸區與啟動子(或另一調控元件)分開。可操作連接是在重組事 件後發生，由此隨後發生表達。所述表達盒被稱為「可活化的」。術語「可誘導啟動子」意思指由直接或間接增加啟動子活性的特定刺激物的存在 或不存在啟始的啟動子。所述刺激物的一些非限制性實例包括熱、光、發育調控因子、損傷、 激素和化學品(例如小分子)。光誘導型啟動子的一個實例為核糖-5-磷酸羧化酶啟動 子。化學誘導型的啟動子也包括受體介導的系統，例如從其它有機體得到的系統，諸如類固 醇依賴性基因表達、Lac阻遏物系統，和W097/13864(以引用的方式併入本文中)中所述的 利用來自果蠅(Drosophila)由保幼生長激素和其激動劑介導的USP受體的表達系統，以及 (例如)如W096/27673(也以引用的方式併入本文中)中所述利用受體組合的系統。其它 化學誘導型的啟動子包括誘導子誘導的啟動子、安全劑誘導的啟動子以及可由某些醇和酮 誘導的alcA/alcR基因活化系統(W093/21334 ；卡迪克(Caddick)等人(1998)自然一生物 技術(Nat. Biotechnol.) 16 :177_180，其內容是以引用的方式併入本文中)。損傷誘導型啟 動子包括蛋白酶抑制劑的啟動子，例如來自馬鈴薯的蛋白酶抑制劑II啟動子，和損傷反應路徑中所涉及的其它植物來源的啟動子，諸如聚苯基氧化酶、LAP和TD的啟動子。例如參 看蓋茲(Gatz) 「基因表達的化學控制(ChemicalControl of Gene Expression) 」，植物生 理與分子生物學學報(Ann. Rev. Plant Physiol. PlantMol. Biol.) (1997)48 :89_108，其以 引用的方式併入本文中。其它可誘導的啟動子包括植物來源的啟動子，諸如系統獲得抗性 路徑中的啟動子，例如I3R啟動子。應注意，當在本文中論述可誘導啟動子時，可活化啟動子 和表達盒可以類似形式用於本發明的某些實施例中。「標記基因」為編碼可選擇或可篩選的特性的基因。「醫療食品」包括供個體食用或飲用且對所述個體具有治療作用的組合物。醫療 食品例如包括已產生藥用蛋白質或多肽的植物(例如，發芽幼苗)或由其得到的植物物質。 醫療食品可單獨攝取或可與醫藥領域中眾所周知的醫藥組合物一起投與。醫療食品還包括 供非人類動物用的等效的飼料。「可操作地連接」是指核酸元件的締合。舉例來說，可操作地連接到編碼蛋白質的 異源DNA的啟動子促進對應於異源DNA的功能性mRNA的產生。如果定位調控DNA序列與 編碼RNA或蛋白質的DNA序列，以致所述調控DNA序列影響所述編碼DNA序列的表達，那麼 認為所述調控DNA序列「可操作地連接到」所述DNA序列或與所述DNA序列「締合」。「經口投與」醫藥學活性肽或蛋白質主要是指通過口、優選通過食用的方式投與， 而且其意欲包括將所述肽或蛋白質提供到宿主的胃部或消化道的任何投藥。在優選實施例 中，經口投與導致醫藥學活性蛋白質與腸黏膜接觸。「醫藥學活性核酸」為編碼醫藥學活性蛋白質的核酸，或其自身具有醫藥學活性， 例如其具有一種或一種以上醫藥學活性，諸如針對醫藥學活性蛋白質所述的活性。舉例 來說，核酸可為RNA幹擾(RNAi)因子的一個或一個以上鏈。所述因子包括靶向靶轉錄物 (例如傳染源的轉錄物或個體的內源性疾病相關轉錄物)的短幹擾RNA(SiRNA)，或短髮夾 RNA (shRNA)，或 siRNA 前體，或微 RNA 樣 RNA。當將「醫藥學活性蛋白質或多肽」以治療有效量投與宿主時，其以積極方式幫助或有助於宿主病狀。醫藥學活性蛋白質或多肽對疾病具有康復治療或減輕特性，並且可以投 藥以改善、減輕、緩解、逆轉疾病或病症的一種或一種以上症狀、延緩其發作或減輕其嚴重 程度。醫藥學活性蛋白質或多肽可具有預防特性且可用於延緩疾病發作，或者當疾病出現 時減輕所述疾病或病理病狀的嚴重程度。術語「醫藥學活性蛋白質或多肽」包括整個蛋白 質或多肽並且還可以指其醫藥學活性片段。其還可以包括蛋白質或肽的醫藥學活性類似物 或者所述蛋白質或肽的片段的類似物。術語「醫藥學活性蛋白質或多肽」也可以指協作或 協同作用以提供治療益處的多種蛋白質或肽。應注意，術語「醫藥學活性蛋白質或多肽」尤 其包括包含疫苗抗原的蛋白質，亦即，對個體投與蛋白質引起宿主的部分或全部預防性免 疫反應。在本發明某些實施例中，免疫反應防止個體受傳染源(例如病毒、細菌、真菌或原 生動物病原體)影響。疫苗抗原的實例包括B型肝炎表面抗原(HbsAg)、大腸桿菌熱敏性腸 毒素、狂犬病毒糖蛋白和諾瓦克病毒衣殼蛋白(Norwalkvirus capsid protein)。在本發明 其它實施例中，免疫反應防止個體受非傳染性病狀或疾病影響或者減輕所述病狀或疾病的 至少一種病徵或症狀的嚴重程度。就這一點看，所關注的疾病包括(但不限於)癌症和自 體免疫疾病。術語「醫藥學活性蛋白質或多肽」包括使個體部分或完全耐受暴露於將另外 引起過敏(allergic或anaphylactic)反應的過敏原的蛋白質。
如本文所使用，「啟動子」為起始相關DNA序列轉錄的DNA序列。啟動子區還可包 括充當基因表達的調控子(諸如活化子、增強子和/或阻遏子)的元件。「調控元件」是指涉及賦予核苷酸序列的表達的序列。調控元件包括5 『調控序列，諸如可與所關注的核苷酸序列連接的啟動子；3'序列，諸如3'調控序列或終止信號。調 控元件通常還涵蓋核苷酸序列適當翻譯所需的序列。「小分子」通常小於約1千道爾頓(kilodalton)並且為生物、有機或甚至無機化合 物(例如順鉬(cisplatin))。所述小分子的實例包括養分，諸如糖和糖衍生物(包括磷酸 鹽衍生物)、激素(諸如植物激素赤黴酸或脫落酸)和合成小分子。「特異性調控」是指如與非特異性作用相比，小分子優先影響一個啟動子而非啟動 子組的轉錄(諸如增強或減弱細胞內的全局轉錄)的能力。「發芽幼苗」或「幼芽」為來自種子或根的幼枝，優選新近發芽的種子。在一些實 施例中，本發明的發芽幼苗為可食用發芽幼苗或幼芽(例如苜蓿芽、綠豆芽、蘿蔔芽、麥芽、 芥菜芽、菠菜芽、胡蘿蔔芽、甜菜芽、洋蔥芽、大蒜、芹菜芽、大黃芽；葉子，諸如捲心菜芽或萵 苣芽、水田芥或水芹芽；藥草芽，諸如歐芹或三葉草芽、花椰菜芽、西蘭花芽、大豆芽、小扁豆 芽；可食用花芽，諸如向日葵芽等)。根據本發明，發芽幼苗可發育到兩葉期。通常，本發明 的幼芽為2到14天大。「實質上分離，，在本文中多次使用，且通常是指使蛋白質或多肽與不相關或汙染組 分(例如植物結構蛋白和代謝蛋白)分離的至少部分純化。所屬領域眾所周知分離和純化 蛋白質或多肽的方法。「轉化」是指將核酸引入細胞中，尤其將DNA分子穩定整合到所關注有機體的基因組中。


圖1為使用基於植物病毒的載體表達外來基因的不同策略的示意圖。圖2為AIMV和TMV基因組的示意圖。圖3為經Av/A4和Av/GFP接種的本塞姆氏菸草(Nicotiana benthamiana)植株 中重組GFP表達的Western印跡的圖。圖4為在經活體外GH轉錄物感染的本塞姆氏菸草植株中產生人類生長激素(hGH) 的Western印跡的圖。圖5為大葉芥菜(Brassica juncea)中表達重組蛋白的轉化構築體的示意圖。圖6為在HSP18. 2啟動子控制下表達人類生長激素的轉基因大葉芥菜的免疫印跡 圖。圖7描述含有靶基因的各種農桿菌構築體的示意圖。圖7A 載體pBIV，其中靶基 因整合於植物啟動子(IV =任何植物啟動子、人工啟動子，或在植物細胞中起作用的其它 啟動子，例如，諸如花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus)的植物病毒的啟動子) 與nos終止子之間；圖7B 載體pBIV-GUS，其中⑶S基因插入pBIV中。圖7C :pBIV_病毒 載體+靶，其中載有靶基因的病毒載體或複製子(例如，病毒基因組或基因組部分)插入 PBIV中；圖7D 載體pBIV-病毒載體+GFP，其中GFP為由插入pBIV中的病毒載體或複製子 攜帶的靶基因。將圖7C和7D中所述的載體視為「發射」載體，這是因為，在引入植物細胞後，其「發動」產生病毒序列(至少在發射所述序列到其中的特定植物細胞的情況下，其自我複製)。圖8顯示在用pBIV-GUS農桿菌滲透幼芽後進行的⑶S染色。圖8A顯示綠豆芽的 染色；圖8B顯示葫蘆巴芽的染色。圖9顯示在用pBIV-GUS農桿菌滲透芸苔幼芽後進行的⑶S染色。圖9A顯示染色 結果；圖9B為列出不同類型的幼芽的表，測試其表達藉助農桿菌構築體所傳遞的蛋白質或 多肽的能力，所述農桿菌構築體包括引導載有編碼所關注的蛋白質或多肽的基因的病毒序 列表達的啟動子。圖10顯示在經pBI121/D4-GFPC3滲透後隨時間流逝本塞姆氏菸草中GFP的表達。圖11顯示由滲透含有病毒載體(含編碼hGH的序列)的農桿菌所引起的植物中 hGH表達的western印跡分析。道數第1道分子量標準品(ladder)；第2道50ng hGH ；第 3道經pBI121/D4-HGH 6dpi 1 2稀釋液滲透的植物樣品；第4道經pBI121/D4_HGH6dpi 1 10稀釋液滲透的植物樣品；第5道經PBI121/D4-HGH 6dpi 1 50稀釋液滲透的植物樣 品；第6道經pBI121/D4-HGH 6dpi 1 100稀釋液滲透的植物樣品；第7道來自健康植物 的植物樣品；第8道來自滲透pBI121的葉片的植物樣品；第9道來自感染D4-HGH的植物 13dpi的植物樣品；第10道來自感染D4-HGH的克隆根系的樣品。對於植物樣品將一片 葉片(約5mg組織)在100 μ L布氏緩衝液(Bradley buffer)和拉氏裝載緩衝液(Laemmli loading buffer)中研磨。每道裝載10yL。因此，對於第3_6道，此主要樣品經稀釋。圖12顯示利用水栽法生長的本塞姆氏菸草植株中IA_2ic蛋白質的表達第1道 IA-2ic標準品；第2道神奇標記(Magic Marker)；第3道注射有農桿菌的土壤生長植株； 第4、5道滲透後4天的水栽法生長植株；第6、7道滲透後6天的水栽法生長植株。圖13描述根據本發明利用的用於將發射載有所關注的靶蛋白的病毒序列的農杆 菌載體傳遞到幼苗中的農桿菌滲透系統的一個實施例。圖14說明在經歷使用圖13的系統進行的農桿菌滲透法的各種豌豆品種中檢測到 的地衣聚糖酶活性。圖15繪示經歷使用圖13的系統進行的農桿菌滲透法的斑點豌豆的GFP表達和植 株生長。圖16繪示經歷使用圖13的系統進行的農桿菌滲透法的某些斑點豌豆的組織特異 性和滲透後最佳天數。圖17描述可用於與根據本發明某些實施例的所關注的蛋白質或多肽融合的地衣 聚糖酶載體分子。圖A表示來自熱纖梭菌(Clostribium thermocellum)的b_l，3_l，4-葡 聚糖酶的示意性描述。圖B表示環狀交換的LicKM載體的示意性描述。在各圖中，垂直影 線對應於催化域的N末端區，且虛線框對應於催化域的C末端區。圖18表示發射載體PBID4的示意圖。圖19為從靶基因優化到純化終產物的過程中所涉及的各步驟的示意性描述，所 述終產物易於根據本發明的一個特定實施例存儲。圖20描述用於從植物播種到組織採集的步驟的自動操作的設備設計。如所述，預 計所述模塊將佔據約40英尺乘以約70英尺的地板面積且為約32英尺高。所示系統包括 以下通過傳送帶連接的組件中央棚架單元，其中保持各步驟間的植株；播種單元、真空滲透和漂洗單元以及組織採集單元。
具體實施例方式蛋白質或多肽本發明適用於在植物系統中產生任何蛋白質或多肽(或任何功能型DNA或RNA分 子)。如上文所述，在某些實施例中，本發明針對藥用蛋白質的產生，但本發明不受核酸或蛋 白質的特定用途的限制。舉例來說，可以產生在多種工業過程或生物修復過程的任一種中 使用的酶(例如，降解汙染物的酶)。因此，即使未明確指出，但本發明和權利要求書中的描 述應視為適用於所關注的任何核酸或蛋白質，包括具有治療應用的核酸或蛋白質，以及不 具有治療應用的核酸或蛋白質。在某些實施例中，蛋白質為在營養上不重要的蛋白質。在 本文中未提及的情況下，本發明可以排除任何特定蛋白質。通常，所表達的蛋白質或多肽不為自然界中的植物中所表達的蛋白質或多肽。即 使根據本發明，所述蛋白質或多肽為自然界中的植物中所表達的蛋白質或多肽，其通常在 幼苗組織中是以高於在自然界中相當的組織中所存在的濃度表達。舉少數實例來說，本發明可用於產生所關注的藥用蛋白質，包括(但不限於)激 素(胰島素、甲狀腺激素、兒茶酚胺、促性腺激素、促激素、催乳素、催產素、多巴胺、牛生長 激素、瘦素等)、生長激素(例如人類生長激素)、生長因子(例如表皮生長因子、神經生長 因子、類胰島素生長因子等)、生長因子受體、細胞激素和免疫系統蛋白(例如，白細胞介 素、集落刺激因子(CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子 (GM-CSF)、促紅細胞生成素、腫瘤壞死因子(TNF)、幹擾素、整合素、地址素、選擇素、歸巢受 體、T細胞受體、免疫球蛋白、水溶性主要組織相容性複合體抗原、免疫活性抗原(諸如細 菌、寄生蟲或病毒抗原或過敏原)、自身抗原、抗體)、酶(組織型纖溶酶原活化物、鏈激酶、 膽固醇生物合成或降解、類固醇合成酶、激酶、磷酸二酯酶、甲基化酶、去甲基化酶、脫氫酶、 纖維素酶、蛋白酶、脂肪酶、磷脂酶、芳香化酶、細胞色素、腺苷酸或鳥苷酸環化酶、神經氨酸 酶等)、受體(類固醇激素受體、肽受體)、結合蛋白(類固醇結合蛋白、生長激素或生長因 子結合蛋白等)、轉錄和翻譯因子、癌蛋白或原癌蛋白(例如細胞周期蛋白)、肌蛋白(肌球 蛋白或原肌球蛋白等)、菌蛋白、神經活性蛋白、腫瘤生長抑制蛋白(血管抑素或內皮抑素， 二者都抑制血管新生)、抗菌蛋白(殺菌/通透性增加蛋白)、結構蛋白(諸如膠原蛋白、絲 蛋白、纖維蛋白原、彈性蛋白、微管蛋白、肌動蛋白和肌球蛋白)、血液蛋白(凝血酶、血清白 蛋白、VII因子、VIII因子、胰島素、IX因子、X因子、組織型纖溶酶原活化物、C蛋白、溫韋 伯氏因子(von ffilebrand factor)、抗凝血酶III、葡糖腦苷脂酶、促紅細胞生成素、粒細胞 集落刺激因子(GCSF)或修飾因子VIII、抗凝劑(諸如水蛭素(huridin))等。在一些特定實施例中，利用本發明來產生抗原蛋白或多肽。舉例來說，可利用 本發明產生由受傳染個體的免疫系統識別的傳染性有機體的蛋白(或其部分)。所述蛋 白質或多肽可在研發防止相關有機體感染的疫苗方面特別有用。舉少數實例來說，可根 據本發明的系統產生來自炭疽(anthrax)(炭疽芽胞桿菌(Bacillus anthracis)；例如 LF、PA)、霍亂(霍亂弧菌(Vibrio cholerae))、巨細胞病毒(cytomegalovirus)、腸毒素 型大腸桿菌菌株(enterotoxigenic strains of E. coli)、口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus)、B型肝炎(例如B型肝炎表面抗原HBsAg)、C型肝炎(例如HCV核心蛋白)、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)(例如 Tat、Rev、Nef、 gpl60、gpl20等)、人乳頭瘤病毒(例如E7、E6)、流感病毒(例如HA、NA)、瘧疾(malaria) (惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)；例如 Pfs25、Pfs28、Pfs48/45、Pfs230)、麻 疹病毒、諾瓦克病毒、鼠疫(plague)(鼠疫桿菌(Yersiniapestis)；例如Fl、LcrV)、 (Pseudomonas aeruginosa) > E ^ ^！ # (rabies virus)、 Bf 叭 it ☆ # _ 毒(respiratory syncytial virus)(例如 F 蛋白、G 蛋白)、鼻病毒(rhinovirus)、輪 狀病毒(rotavirus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、傳染性胃腸炎病毒 (transmissible gastroenteritisvirus) ^Iflji, (trypanosomes)(布氏If!蟲(Trypanosoma brucei)；例如a -微管蛋白、0 -微管蛋白)、結核病(tuberculosis)、SARS等的有用的抗 原蛋白。在一些特定實施例中，利用本發明產生多聚體蛋白複合物，例如包括免疫球蛋白， 諸如抗體(即單克隆抗體)。舉少數實例來說，可根據本發明的系統產生抗PA、抗LF、抗NA、 抗TNFa、抗白細胞介素12等。更為普遍的是，可根據本發明製備針對與諸如以下疾病相關 的抗原的單克隆抗體癌症(例如急性髓系白血病(AML)、乳癌、結腸直腸癌、慢性淋巴細 胞白血病(CLL)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin' s lymphoma)、腎細胞癌、實體腫瘤)、 炎症和自體免疫病症(例如哮喘、克隆氏病(Crohn' s disease)、糖尿病、移植物抗宿主 疾病(器官排斥)、炎症性腸病、紅斑狼瘡、多發性硬化、牛皮癬、牛皮癬關節炎、風溼性關節 炎、血栓症、血管炎等)、傳染性疾病(例如炭疽(炭疽芽胞桿菌)、霍亂(霍亂弧菌)、巨細 胞病毒、腸毒素型大腸桿菌菌株、口蹄疫病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人類免疫缺陷 病毒、人乳頭瘤病毒、流感病毒、瘧疾(惡性瘧原蟲)、麻疹病毒、諾瓦克病毒、鼠疫(鼠疫杆 菌)、綠膿桿菌、狂犬病毒、呼吸道合胞體病毒、鼻病毒、輪狀病毒、金黃色葡萄球菌、傳染性 胃腸炎病毒、錐蟲(布氏錐蟲)、結核病、SARS)等。在一些特定實施例中，利用本發明來產生hGH、自體免疫疾病的自體抗原(例如針 對糖尿病的IA-2ic)、流感病毒抗原、炭疽抗原、HPV抗原、流感病毒抗體等(參看實例)。在本發明的一些實施例中，產生全長異源蛋白。也就是說，在幼苗中完整產生自然 界中存在或者已在另一情況下製備或設計的蛋白質。在一些所述實施例中，所產生的蛋白 質無任何其它序列。在其它實施例中，僅產生一部分蛋白質，通常為具有已知所需活性的一 部分(例如，抗原蛋白的表位、酶蛋白的活性域等)。在一些實施例中，所產生的部分為蛋白 質或多肽的特徵部分。在一些實施例中，所產生的部分包含表位。在一些實施例中，所產生 的部分包含免疫原域。在一些實施例中，所產生的部分包含蛋白質域。在本發明的一些實施例中，產生蛋白質或多肽與其它蛋白質或多肽序列的融合 體。如所屬領域已知，可出於多種原因中的任一種使用融合體。舉例來說，可將打算在幼 苗(例如發芽幼苗)中產生的蛋白質或多肽與一種或一種以上便利檢測和/或分離的部 分融合。舉例來說，可能將所關注的蛋白質或多肽與針對可用抗體或其它特異性配體且 可用於便利分離或純化的已知抗原表位融合。另外或其它，可將所關注的蛋白質或多肽 與具有規定三維結構的另一多肽融合例如以賦予所關注的蛋白質或多肽以所需的三維排 列。作為另一實例，可將所關注的蛋白質或多肽與一種或一種以上將引導其在植物細胞 中亞細胞定位(或分泌)的部分融合。尤其當所關注的蛋白質或多肽為蛋白質抗原(例 如用於製備亞單位疫苗)時，通常將需要產生與載體分子融合的蛋白質，以例如增強表
14達、穩定性和/或免疫原性和/或協助分離或純化。所屬領域已知的某些例示性融合搭 配物例如包括抗體表位(例如His標籤等)、免疫原性載體蛋白、霍亂毒素、熱敏性腸毒素 等(例如參看維拉(Vella)等人，生物技術(Biotechnology) 20:1，1992 ；凱利(Kelly)等 人，免疫學(Immuology) 113:163，2004 ；巴特利(Buttery)等人，倫敦皇家內科醫師學會 雜誌(JR Coll Phuysicians Lond) 34:163，2000 ；傑卡布遜(Jacobson)等人，Minerva 兒 科雜誌(Minerva Peditr.) 54:295，2002 ；德茲堡(Dertzbaugh)等人，傳染與免疫學雜誌 (Infect Immunol.)61:48，1993 ；納薩爾(Nashar)等人，疫苗(Vaccine) 11 235，1993 ；裡 傑維斯特(Liljeqvist)等人，免疫方法雜誌(J. Immunol. Methods) 210 125，1997 ；斯塔 爾(Stahl)等人，美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci. USA)86:6283，1989 ；尤裡奇 (Ulrich)等人，病毒研究進展(Adv. Virus Res.) 50:141，1998 ；史密斯(Smith)等人，病毒 學(Virology) 348:475，2006 ；特爾本(Turpen)等人，生物技術(Biotechnology) 13 53， 1995)。本發明所涵蓋的一種特殊的融合搭配物為熱穩定蛋白，諸如來自熱纖梭菌 (Clostridium thermocellum)的地衣聚糖酶B(例如參看2003年5月22日申請的美國臨時 專利申請案60/472，495，和2004年5月24日申請且於2005年3月24日以W02005/026375 公開的PCT申請案US04/016452)。全長地衣聚糖酶(約35kDa)是由信號肽、催化域、富集 Pro-Thr框和錨定域(參看圖17)組成。根據本發明，融合蛋白中可缺失富集Pro-Thr框和 錨定域。另外，天然信號肽可經在植物中操作者置換。所述地衣聚糖酶的催化域具有環結構，將其分成兩個區N末端區(N:胺基酸 32-84)和C末端區(C:胺基酸85-246)。這兩個區可在環結構處分開且環狀交換以使所述 分子更易於接受插入而不影響酶活性。在這兩個區之間的接點處引入多克隆位點(MCS)， 並且將6XHis標籤和序列KDEL分別放於經交換載體的3'末端處以便利在內質網中的 純化和保留。圖17)繪示分子量為約27kDa的經修飾地衣聚糖酶(LicKM ；基因庫登陸號 DQ776900)的示意圖。靶蛋白或多肽序列可表達為N或C末端融合體和/或MCS中的內部 融合體(允許同時表達多個靶的特徵)。LicKM使得融合體成為規模從小肽到多達約IOOkDa或更高的全長蛋白的分子。 LicKM可在高溫(65°C )下保持其酶活性，此為通常也適用於融合體的特性。由於在65°C 下進行10分鐘的熱處理可去除多達50%的汙染植物蛋白，故這一特徵使得能夠容易且成 本有效的回收靶蛋白。在純化期間，可以通過監測地衣聚糖酶活性來追蹤LicKM融合蛋白。 LicKM作為載體分子的用途提供其它優勢，包括可用於增強表達和併入所關注的多個多肽 (例如，多疫苗抗原決定簇)。植物本發明的教示適用於多種不同植物。一般來說，能夠表達如本文所述的所引入的 構築體的任何植物都適用於本發明中。在許多實施例中，將需要使用幼苗以便改進蛋白質/ 多肽的產生速度。如本文所述，在許多實施例中，利用發芽幼苗。如所屬領域中已知，大部 分幼芽快速生長，從而由存儲的種子產生可食用植物。然而，所屬領域技術人員將了解，術 語「發芽幼苗」在本文中更常用於指幼苗，而不管品種是否通常歸類為「幼芽」。生長足夠長 時間以具有充足綠色生物質從而允許引入和/或表達如本文所提供的表達構築體的任何 植物(應意識到，相關時間可視所述表達構築體的傳遞和/或表達模式而變化)可視為本文中的「發芽幼苗」。在本發明許多實施例中，利用可食用植物(即，將要投與蛋白質或多肽的個體可食用(對所述個體無毒)的植物)。在某些優選實施例中，本發明的植物可為芸苔屬或擬南芥屬。適於轉化且作為發 芽幼苗食用的一些適當植物包括苜蓿、綠豆、蘿蔔、小麥、芥菜、菠菜、胡蘿蔔、甜菜、洋蔥、大 蒜、芹菜、大黃、多葉植物(諸如捲心菜或萵苣、水田芥或水芹)、藥草(諸如歐芹、薄荷或三 葉草)、花椰菜、西蘭花、大豆、小扁豆、可食用花(諸如向日葵等)。已測試多種植物物種在本發明實踐中的適應性。已測試多種不同的豆類和其它物 種由農桿菌構築體(由如本文所述的農桿菌滲透法引入)發射的病毒載體產生異源蛋白質 的適用性，例如包括赤豆、苜蓿、大麥、西蘭花、比爾跳豆、蕎麥、捲心菜、花椰菜、三葉草、羽 衣甘藍、葫蘆巴、亞麻、鷹嘴豆、青豆、日本菠菜、無頭甘藍、卡姆小麥、甘藍、綠豌豆、綠豆、芥 菜、菜豆、蘿蔔、紅三葉草、大豆、斑點豌豆、向日葵、蕪菁、黃夾豆等(例如參看實例5和8圖 9等)。本發明提供意外結果，即某些豌豆品種特別適於所述操作。舉例來說，根據本發明， 比爾跳豆、青豆、綠豌豆、斑點豌豆和/或黃夾豆在本發明這一方面中特別有用。因此，在某 些實施例中，本發明提供在一種或一種以上所述植物中使用發射編碼所關注的相關蛋白質 或多肽的病毒構築體(即，具有植物病毒特徵的RNA)的農桿菌載體產生蛋白質或多肽(例 如，抗原、抗體和/或其它蛋白質)。在一些實施例中，RNA具有AlMV的特徵(和/或包括 AlMV序列)。在一些實施例中，所述RNA具有TMV的特徵(和/或包括TMV序列)。應了解，一方面，本發明提供表達所關注的靶蛋白或多肽的幼苗(例如，發芽幼 苗)。在一些實施例中，幼苗是從轉基因種子生長；本發明還提供可由本文所述的方法產生 和/或利用的種子。可使針對任何所關注的基因的轉基因種子萌芽且視情況誘導產生所關 注的蛋白質或多肽。舉例來說，可使能夠表達所關注的任何基因的種子萌芽和通過以下方 式誘導i)病毒感染；ii)農桿菌滲透；或iii)含有病毒基因組的細菌。可使能夠表達針對 任何單克隆抗體的重鏈或輕鏈的轉基因的種子萌芽且通過以下方式誘導以產生全長分子 i)病毒感染；ii)農桿菌滲透；或iii)用含有病毒基因組的細菌接種。可使能夠表達針對 包含多個組分的複雜分子(諸如slgA)中的一種或一種以上組分的轉基因的種子萌芽，且 通過以下方式用於產生全功能分子i)病毒感染；ii)農桿菌滲透；或iii)用含有病毒基 因組的細菌接種。可使來自健康非轉基因植物的種子萌芽且通過以下方式用於產生靶序 列i)病毒感染；ii)農桿菌滲透；或iii)用含有病毒基因組的細菌接種。在一些實施例中，幼苗是從非轉基因的種子生長。通常，所述幼苗將包含引導所關 注的蛋白質或多肽表達的病毒序列。在一些實施例中，所述植物還可包含農桿菌序列，視情 況包括「發射」病毒序列的序列。在植物中表達蛋白質或多肽的系統根據本發明，可使用多種不同系統中的任一種在幼苗(例如發芽幼苗)中表達蛋 白質或多肽。在一些實施例中，產生轉基因細胞系或種子，其隨後萌芽且生長一段時間，由 此在幼苗組織中(例如在發芽幼苗中)產生轉基因序列中所包括的蛋白質或多肽。產生轉 基因植物細胞和/或種子的典型技術包括根癌農桿菌(Agrobacterium tumefacien)介導 的基因轉移和基因槍法或電穿孔法。在一些實施例中，利用瞬時表達系統。在植物組織中產生蛋白質或多肽的瞬時表達的典型技術利用植物病毒。病毒轉化是一種較為快速且成本低廉的轉化胚芽和發芽幼苗 的方法，其可以在獲得產物之前採集而不存在實驗或世代的滯後。另一方面，未減毒的病毒 可感染其它植物，潛在引起環境問題。本發明提供具有病毒表達系統優勢(例如，快速表達、高產量)和農桿菌轉化優勢(例如受控投藥)的表達系統。具體來說，如下文將詳細論述，本發明提供農桿菌構築體 (即，在農桿菌中複製且因此可通過農桿菌傳遞來傳遞植物細胞的構築體)包括植物啟動 子的系統，所述植物啟動子在引入植物後，將引導載有所關注的蛋白質或多肽的基因的病 毒序列(例如，包括病毒複製序列)的表達。此系統允許在植物中受控、高水平瞬時表達蛋 白質或多肽。下文將獨立地進一步詳細論述多個不同的表達系統的實施例，其中一些表達系統 產生轉基因植物且另一些提供瞬時表達。對於任何所述技術來說，閱讀本申請案的所屬領 域技術人員將了解如何調節和優化在幼苗組織(例如發芽幼苗)中表達蛋白質或多肽的方案。農桿菌轉化農桿菌是革蘭氏陰性根瘤菌科的代表性種屬。此物種引起植物腫瘤，諸如根癌和 毛狀根疾病。在去分化植物組織(此為腫瘤的特徵)中，農桿菌產生稱為冠癭鹼(opines) 的胺基酸衍生物且經植物分解代謝。負責冠癭鹼表達的細菌基因是嵌合表達盒的控制元件 的便利來源。根據本發明，可使用農桿菌轉化系統產生僅比成熟植物早採集的幼苗(例如， 發芽幼苗，包括可食用發芽幼苗)。農桿菌轉化方法易於用於再生表達藥用蛋白的幼苗(例 如，發芽幼苗)。一般來說，用農桿菌轉化植物包括通過與載有植物/細菌載體的根癌農桿菌共培 養來轉化生長於組織培養基中的植物細胞。所述載體含有編碼藥用蛋白的基因。農桿菌將 載體轉移到植物宿主細胞中且隨後使用抗生素治療將其去除。對表達藥用蛋白的經轉化植 物細胞進行選擇，使其分化且最終再生成為完整幼株(海倫(Hellens)等人，植物分子生物 學(Plant Molecular Biology) (2000)42(819-832)；皮隆_史密茲(Pilon-Smits)等人，植 物生理學(Plant Physiolog.) (1999 年 1 月)119 (1) 123-132 ；巴菲爾德(Barfield)和普 阿(Pua)植物細胞報告(Plant Cell Reports) (1991) 10 (6/7) 308-314)；瑞瓦(Riva)等 人，生物技術雜誌(Journal of Biotechnology〗)(1998年12月15日)1 (3)，各自以引用的 方式併入本文中)。用於本發明中的農桿菌表達載體包括編碼藥用蛋白的經設計以在植物中操作的 基因(或表達盒)以及在所述表達盒上遊和下遊的伴隨序列。伴隨序列通常為質粒或病毒 來源且對所述載體提供所需特徵以將來自細菌的DNA轉移到所需植物宿主中。基礎細菌/植物載體構築體優選提供較寬宿主範圍的原核複製起點、原核可 選標記。適當的原核可選標記包括對抗生素(諸如氨比西林(ampicillin)或四環素 (tetracycline))的抗性。所屬領域眾所周知的編碼其它功能的其它DNA序列也可存在於 載體中。農桿菌介導的DNA向植物染色體轉移需要農桿菌T-DNA序列。在構築農桿菌表達 構築體時，通常去除腫瘤誘導的T-DNA基因，且用編碼藥用蛋白或多肽的序列替換。由於 T-DNA邊界序列起始T-DNA區整合到植物基因組中，故將其予以保留。如果不易於檢測藥用蛋白的表達，那麼細菌/植物載體構築體還將包括適於確定植物細胞是否已轉化的可選標 記基因，例如nptll卡那黴素(kanamycin)抗性基因。Ti序列可處於相同或不同細菌/植物載體(Ti質粒)上。Ti序列包括毒力基因， 其編碼一組引起T-DNA基因切除、轉移和整合到植物基因組中的蛋白質(斯謝爾(Schell)， 科學(Science) (1987)237:1176-1183)。適於將異源序列整合到植物基因組中的其它序列 還可包括轉座子序列等以供同源重組。某些構築體將包括編碼所關注的蛋白質的表達盒。可將一個、兩個或兩個以上表 達盒用於指定轉化過程中。重組表達盒除編碼藥用蛋白的序列外還含有至少以下元件啟 動子區、植物5'不翻譯序列、起始密碼子(視所表達的基因是否具有其自身的起始密碼子 而定)以及轉錄和翻譯終止序列。此外，本發明的表達盒或嵌合基因中可包括轉錄和翻譯 終止子。適當時，允許蛋白質加工和易位的信號分泌序列也可包括在表達盒中。多種啟動子、信號序列以及轉錄和翻譯終止子都例如描述於羅頓(Lawton)等人， 植物分子生物學(Plant Mol. Biol) (1987)9315-324或美國專利第5，888，789號中，其以 引用的方式併入本文中。另外，通常將針對抗生素抗性的結構基因用作選擇因子(弗雷利 (Fraley)等人，美國國家科學院院刊(Proc. Natl. Acad. Sci.，USA) (1983)80:4803-4807)， 其以引用的方式併入本文中。所述盒5'和3'端處獨特的限制性酶位點使得易於插入預 先存在的載體中。用於農桿菌介導的轉化的載有至少一個T-DNA邊界序列的其它二元載體系統描 述於PCT/EP99/07414中，其以引用的方式併入本文中。有關農桿菌介導的轉化的進一 步論述可見於基爾文S. B. (Gelvin, S. B.)，「農桿菌介導的植物轉化「基因操縱」工具 背後白勺生物學(Agrobacterium-Mediated Plant Transformation :the Biology behind the" Gene-Jockeying" Tool) 〃，微生物學和分子生物學綜述(Microbiology and MolecularBiology Reviews)，67 (1) 16-37 (2003)，(其以引用的方式併入本文中)，和其 中的參考文獻，所有所述文獻都是以引用的方式併入本文中；勞倫斯A(L0rence Α)、韋爾 伯特 R. (Verpoorte R.)，植物中的基因轉移和表達(Gene transfer and expression in plants.)，分子生物學方法(Methods Mol Biol.), (2004) 267:329-50，其以引用的方式並 入本文中。在本發明某些實施例中，使用除農桿菌外的細菌將核酸序列引入植物中。例 如參看布魯斯厄特W(Br00thaerts W)等人，通過不同細菌品種進行對植物的基因轉移 (Genetransfer to plants by diverse species of bacteria),自然(Nature) (2005)， 433(7026) :629-633，其以引用的方式併入本文中。由已經農桿菌(或其它細菌)感染的植物製備種子，從而引入編碼所關注的 蛋白質或多肽的所需異源基因。採集所述種子，乾燥，清潔並測試活力以及所需基因產 物的存在和表達。一經確定，就將種子儲備物存儲於適當的溫度、溼度、衛生和安全條 件下待用。隨後由經培養的原生質體再生整個植株，例如，如埃文斯(Evans)等人，植物 細胞培養手冊(Handbook of Plant Cell Cultures)，第1卷紐約麥克米倫出版公司 (MacMillanPublishing Co. New York)，1983 ；和瓦西裡 I. R. (Vasil I. R.)(編)，植物細胞 培養和體細胞遺傳學(Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants)，奧蘭多，學 術出版社(Acad.PreSS，0rlandO)，第I卷，1984，和第III卷，1986，其以引用的方式併入本文中。在某些實施例中，植株未再生成成株。舉例來說，在一些實施例中，植株僅再生到發芽幼苗階段。在其它實施例中，再生整株植物從而產生種子儲備物且由所述種子儲備物 的種子產生根據本發明使用的幼苗(例如，發芽幼苗)。根據本發明可通過農桿菌轉化可分離出原生質體並培養得到整株再生植物的所 有植物，從而回收含有編碼所關注的蛋白質或多肽的轉移基因的整株植物。已知實際上所 有植物都可由經培養細胞或組織(包括(但不限於)產生可食用幼芽的所有主要物種) 再生。一些適當的植物包括苜蓿、綠豆、蘿蔔、小麥、芥菜、菠菜、胡蘿蔔、甜菜、洋蔥、大蒜、 芹菜、大黃、多葉植物(諸如捲心菜或萵苣、水田芥或水芹)、藥草(諸如歐芹、薄荷或三葉 草)、花椰菜、西蘭花、大豆、小扁豆、可食用花(諸如向日葵等)。由經轉化細胞再生植物的方式可隨植物物種的不同而不同。然而，所屬領域技術 人員將認識到，通常首先提供含有異源基因拷貝的經轉化原生質體的懸浮液。形成愈傷組 織且可由愈傷組織誘導長出新芽且隨後生根。或者，可由原生質體懸浮液誘導胚芽形成。使 這些胚芽與天然胚芽一樣發芽以形成植物。將種子浸泡於水中或用水噴灑種子以使種子的 水分含量增加到35-45%之間，從而起始發芽。為使發芽進行下去，通常在控制溫度和氣流 條件下在水分達到飽和的空氣中保存種子。培養基通常將含有各種胺基酸和激素(諸如生 長素和細胞分裂素)。將穀氨酸和脯胺酸添加到所述培養基中也是有益的，尤其對於諸如苜 蓿等物種更是如此。長出新芽和生根通常同時發生。有效再生將視培養基、基因型和培養 歷程而定。如果控制這三個變量，那麼再生完全可再現和重複。由經轉化植物細胞生長的成熟植物是自花授精且鑑別出不分離的純合轉基因植 物。所述自交植物產生含有編碼所關注的蛋白質或多肽的轉移基因的種子。這些種子可發 芽並生長到幼苗(例如，發芽幼苗)階段以產生所關注的蛋白質或多肽。在相關實施例中，轉基因種子(載有通常整合到基因組中的編碼所關注的蛋白質 或多肽的轉移基因)可形成為種子產品並且伴隨有關如何使幼苗生長到適當階段(例如， 生長到發芽幼苗階段)以如本文所述進行採集和/或投藥或調配的說明書一起銷售。在其 它相關實施例中，包含所需特性(即，編碼所關注的蛋白質或多肽的轉移基因)的雜交或新 穎品種是由自交轉基因植物發育而來。盲接整合根據本發明，通過基因槍法或電穿孔法將DNA片段直接整合到植物細胞基因 組中也可用於將編碼所關注的蛋白質或多肽的表達構築體引入植物組織中(例如參 看，凱科特J.R. (Kikkert, J.R.)、休米斯頓(Humiston)等人，活體內細胞與發育生物 學(In VitroCellular & Developmental Biology.)植物組織培養協會雜誌(Plant Journal of the TissueCulture Association.)(1999 ￥ 1 月 /2 月)35(1):43-50 ； 倍特G. W. (Bates, G. W.)，佛羅裡達州塔拉哈西，佛羅裡達州立大學(Florida State University, Tallahassee, FL.)，分子生物技術(Molecular Biotechnology) (1994 年 10 月)2 (2): 135-145)。更具體來說，可以將含有編碼所關注的蛋白質或多肽的基因的載體通 過各種技術引入植物細胞中。如上文所述，載體可包括可用於植物細胞中的可選標記。所 述載體還可包括允許其在次級宿主中選擇和繁殖的序列，諸如含有複製起點和可選標記的 序列。通常次級宿主包括細菌和酵母。在一個優選實施例中，次級宿主為大腸桿菌，複製起點為colEl型複製起點，且可選標記為編碼氨比西林抗性的基因。所述序列已為所屬領域 眾所周知且在市面有售(例如，美國加州帕羅奧多的科隆泰克公司(Cl0ntech，Pal0 Alto, CA)或美國加州拉荷亞市的斯坦特基因公司(Stratagene，La Jolla，CA))。還可將本發明的載體修飾成中間植物轉化質粒，其含有與根癌農桿菌載體同源的 區域、來自根癌農桿菌的T-DNA邊界區和上文所述的嵌合基因或表達盒。其它載體可包括 不導致植物腫瘤的根癌農桿菌誘導質粒。
根據本發明的實施例，本發明載體的直接轉化包括通過使用微量吸管機械地轉 移重組DNA來將所述載體直接微注射到植物細胞中(例如參看，克洛斯威(Crossway)， 分子遺傳學與普通遺傳學(Mol. Gen. Genet.)，202 179-185，1985，其以引用的方式本 文中)。還可使用聚乙二醇將遺傳材料轉移到植物細胞中(例如參看，克倫斯(Krens) 等人，自然(1982)296:72-74)。引入核酸區段的另一方法為利用在小珠粒或顆粒基 質內或表面上具有核酸的小顆粒進行的高速彈道穿透(例如參看克萊恩(Klein)等 人，自然(1987)327:70-73 ；克諾德森和穆勒(Knudsen and Muller)植物學(Planta) (1991) 185:330-336))。另一種引入方法為將原生質體與其它微細胞、細胞、溶酶體或 其它可融合脂質表面體的其它實體融合(例如參看弗雷利等人，美國國家科學院院刊 (1982)79:1859-1863)。還可將本發明的載體通過電穿孔引入植物細胞中(例如參看弗洛 姆(Fromm)等人美國國家科學院院刊(1985)82:5824)。根據此項技術，在含有基因構築體 的質粒存在的情況下電穿孔植物原生質體。高場強度的電脈衝可逆地滲透生物膜，從而允 許引入質粒。經電穿孔的植物原生質體重新形成細胞壁，分裂並形成植物愈傷組織，其可再 生形成本發明的發芽幼苗。所屬領域技術人員將了解如何利用這些方法轉化可用於產生可 食用發芽幼苗的植物細胞。病毒轉化根據本發明，使用植物病毒載體來感染種子、胚芽、發芽幼苗並於其中產生外來蛋 白。就這一點來看，感染包括將病毒基因組或其部分引入細胞中的任何方法，包括(但不 限於)天然病毒感染方法、磨損、接種等。所述術語包括將基因組RNA轉錄物或其cDNA拷 貝引入細胞中。病毒基因組無需為完整基因組，但通常將含有足以允許複製的序列。所述 基因組可編碼病毒複製酶且可含有複製所需的任何順式作用核酸元件。編碼短肽以及較大 複合蛋白質的外來基因的高水平表達(例如通過菸草花葉病毒屬載體)例如描述於麥克馬 考(McCormick)等人，美國國家科學院院刊(1999)96:703-708 ；熊谷(Kumagai)等人，基因 (Gene) (2000)245:169-174 ；和韋爾奇(Verch)等人，免疫方法雜誌(J. Immunol. Methods) (1998)220，69-75，所述文獻各自以引用的方式併入本文中)。因此植物病毒載體經證實具 有表達短肽以及較大複合蛋白質的能力。在某些實施例中，利用宿主/病毒系統產生表達藥用蛋白質(諸如胰島素、GAD和 與1型糖尿病相關的IA-2)的幼苗(例如，幼芽)。由病毒感染產生的幼苗提供已經證實為 安全的所關注的蛋白質或多肽來源。舉例來說，幼芽不受動物病原體汙染。舉例來說，與煙 草不同，來自可食用幼芽的蛋白質至少在理論上可在不純化的情況下經口應用，由此顯著 降低成本。此外，由於將相關基因(編碼所關注的蛋白質或多肽)引入可在數天內生長到工 業規模的病毒中，故病毒/幼苗(例如幼芽)系統還提供用於按比例擴大且製造的較為簡易、廉價的途徑。相比之下，轉基因植物在足夠的種子或植物材料可用於大規模試驗或商業 化之前需要長達5-7年。根據本發明，植物RNA病毒具有某些優勢，這使得其成為最引人注目的用於表達 外來蛋白的載體。已確定多種植物RNA病毒的分子生物學和病理學，且存在相當多病毒生 物學、遺傳學和調控序列的知識。大部分植物RNA病毒具有較小基因組且感染性cDNA克隆 可用於便利遺傳操作。感染性病毒材料進入易感宿主細胞後，其即複製達到高水平且迅速 在整個植株內(接種後1到10天)擴散。易於經濟地從受感染組織回收病毒粒子。病毒 具有較寬的宿主範圍，使得能夠使用單一構築體來感染數種易感物種。這些特徵易於轉移 到幼芽。
圖1描述使用植物病毒表達外來基因的若干種不同策略。可通過用所需序列置 換一種病毒基因、將外來序列插入病毒基因組的適當位置處或通過將外來肽融合到病毒的 結構蛋白中來表達外來序列。此外，可組合這些方法中的任一種通過病毒重要功能的反式 互補來表達外來序列。存在多種不同的策略作為使用菸草花葉病毒(TMV)、苜蓿花葉病毒 (AlMV)和其嵌合體在受病毒感染的植物中表達外來序列的工具。AlMV基因組為雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)病毒家族的代表且由三個基 因組RNA (RNA1-3)和亞基因組RNA (RNA4)組成(圖2)。基因組RNAl和2分別編碼病 毒複製酶蛋白Pl和2。基因組RNA3編碼細胞到細胞運動蛋白P3和外殼蛋白(CP)。CP 是由基因組RNA3合成的亞基因組RNA4翻譯，且為開始感染所需。研究證實CP涉及 多種功能，包括基因組活化、複製、RNA穩定性、症狀形成和RNA包殼(例如參看，波爾 (Bol)等人，病毒學(Virology) (1971)46:73-85 ；範德沃森(Van Der Vossen)等人，病 毒學(1994)202:891-903 ；優斯波夫(Yusibov)等人，病毒學208:405-407 ；優斯波夫等 人，病毒學(1998)242:1-5 ；波爾等人，(綜述(Review)，100參考文獻(lOOrefs.)).普 通病毒學雜誌(J. Gen. Virol.) (1999)80:1089-1102 ；德格拉夫(De Graaf f)，病毒學 (1995)208:583-589 ；雅士伯(Jaspars)等人，病毒研究進展(Adv. Virus Res) (1974). 19， 37-149 ；羅斯奇-弗萊斯(Loesch-Fries)，病毒學(1985) 146:177-187 ；尼爾曼(Neeleman) 等人，病毒學(1991) 181:687-693 ；尼爾曼等人，病毒學(1993) 196:883-887 ；範德庫衣(Van Der Kuyl)等人，病毒學(1991) 183:731-738 ；範德庫衣等人，病毒學(1991) 185:496-499)。病毒粒子的包殼對於病毒從種子、胚芽或幼苗(例如，發芽幼苗)的接種部分到未 接種部分的長距離運動和系統性感染至關重要。根據本發明，接種可在植物發育的任何階 段發生。在胚芽和幼芽中，接種病毒的擴散應極快。將AlMV病毒粒子用獨特CP(24kD)包 殼，從而形成一類以上粒子。所述粒子的尺寸(30到60nm長和18nm直徑)和形狀(球形、 橢圓體或杆狀)視包殼RNA的尺寸而定。認為組裝時AlMV CP的N末端位於病毒粒子的表 面上且似乎不會干擾病毒組裝(波爾等人，病毒學(1971)6:73-85)。此外，在N末端具有額 外38個胺基酸的肽的AlMV CP在活體外形成粒子且保持生物活性(優斯波夫等人，普通病 毒學雜誌(1995)77:567-573)。AlMV具有較寬的宿主範圍，其包括多種農業上有價值的作物，包括植物種子、胚芽 和幼芽。總的來說，這些特徵使得AlMV CP成為優良的載體分子候選物，且使得AlMV成為 在處於發育的幼芽階段的植物中表達外來序列的最引人注目的候選載體。此外，當由異源 載體(諸如TMV)表達時，AlMV CP在不幹擾病毒感染性的情況下將TMV基因組包殼(優斯波夫等人，美國國家科學院院刊(1997)94:5784-5788，其以引用的方式併入本文中)。這允 許使用TMV作為與外來序列融合的AlMV CP的載體病毒。TMV(菸草花葉病毒的原型)具有由經17. OkD CP包殼的單一正義NRA組成 的基因組，所述17. OkD CP產生杆狀顆粒(300nm長)(圖2)。CP為TMV唯一的結構蛋 白且為病毒包殼和病毒在受感染宿主中長距離運動所需(塞託(Saito)等人，病毒學 (1990) 176:329-336)。183和126kD蛋白是由基因組RNA翻譯得到且為病毒複製所需(石 川(Ishikawa)等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.) (1986) 14:8291-8308)。30kD 蛋白為 病毒的細胞到細胞運動蛋白(梅西(Meshi)等人，歐洲分子生物學雜誌(EMB0J.) (1987)6 2557-2563)。運動蛋白和外殼蛋白是由亞基因組mRNA翻譯得到(亨特(Hunter)等人，自然 (1976)260:759-760 ；布恩林(Bruening)等人，病毒學(1976) 71 498-517 ；畢奇(Beachy) 等人，病毒學(1976) 73 498-50，各自以引用的方式併入本文中)。AlMV和TMV基因組的示意性描述繪示於圖2中。AlMV的RNAl和2分別編碼複製 酶蛋白Pl和P2 ；基因組RNA3編碼細胞到細胞運動蛋白P3和病毒外殼蛋白(CP)。CP是由 基因組RNA3合成的亞基因組RNA4翻譯得到。TMV的126 kD和183kD蛋白為複製所需；30kD 蛋白為病毒細胞到細胞運動蛋白，且17kD蛋白為病毒的CP。CP和30kD蛋白是由亞基因組 RNA翻譯得到。箭頭指示亞基因組啟動子的位置。花轉化可用於將編碼所關注的蛋白質或多肽的基因引入植物細胞中的其它方法包括 轉化植物的花。可通過將植物的花浸入根癌農桿菌溶液中來實現擬南芥轉化(柯蒂斯 (Curtis)和納姆(Nam)，轉基因研究(Transgenic Research) (2001 年 8 月)IOt363-37I ； 秦(Qing)等人，分子育種植物改良的新策略(Molecular Breeding =New Strategies in Plantlmprovement) (2000年2月)·(1) 67-72)。在由「浸泡」植物產生的種子群中形成經 轉化植物。在花發育的特定時間時，子房壁中存在小孔，根癌農桿菌通過所述小孔得以進入 子房內部。在進入子房內後，根癌農桿菌繁殖並轉化個別胚珠(迪斯優克斯(Desfeux)等 人，植物生理學(Plant Physiology) (2000年7月)123(3) 895-904)。經轉化胚珠在子房 內遵循種子形成的典型路徑。農桿菌介導的瞬時表達如本文所述，在本發明許多實施例中，需要在植物中迅速(例如瞬時)表達蛋白質 或多肽的系統。其中本發明提供一種實現所述在植物(尤其在幼苗，例如發芽幼苗)中快 速表達的有效系統，其利用農桿菌構築體來傳遞編碼所關注的蛋白質或多肽的病毒表達系 統。具體來說，根據本發明，製備「發射載體」，其含有包括複製序列的農桿菌序列且還 含有載有編碼所關注的蛋白質或多肽的基因的植物病毒序列(包括自我複製序列)。優選 通過允許實質上系統性傳遞的農桿菌滲透法將發射載體引入植物組織中。對於瞬時轉化來 說，發射載體的未整合T-DNA拷貝暫時保持存在於核中並且轉錄，引起載運基因的表達(卡 佩拉(Kapila)等人，1997)。與病毒載體不同，農桿菌介導的瞬時表達無法使所關注的基因 的表達系統性擴散。此系統的一個優勢在於可克隆長於2kb的基因以產生無法利用病毒載 體獲得的構築體(韋因尼特(Voirmet)等人，2003)。此外，使用所述技術，可利用一種以上 轉基因來轉化植物，致使能夠表達並組裝多聚體蛋白(例如，複合蛋白質的抗體亞基)。另夕卜，通過與不同農桿菌共滲透而進行多種轉基因共表達的可能性可由單獨滲透或使用混合 培養基來得到很好利用。在某些實施例中，發射載體包括允許在農桿菌中進行選擇(或至少檢測)和在滲 透組織中進行選擇/檢測的序列。此外，發射載體通常包括在植物中轉錄得到病毒RNA產 生隨後產生病毒蛋白的序列。另外，病毒蛋白和病毒RNA的產生引起編碼所關注的醫藥學 活性蛋白質的多個RNA拷貝的快速產生。所述產生引起在相對較短的時間內快速產生所關 注的靶蛋白質。因此可產生用於產生蛋白質的高效系統。利用病毒表達載體的農桿菌滲透技術可用於產生有限量的所關注的蛋白質，以便 在確定其是否值得產生轉基因植物之前檢驗表達水平。另外或其它，利用病毒表達載體的 農桿菌滲透技術適用於快速產生能夠作為主要生產平臺產生大量蛋白質的植物。因此，此 瞬時表達系統可在工業規模上使用。另外提供可在本發明這些和其它方面使用的多種不同農桿菌質粒、二元質粒或其 衍生物中的任一種，諸如pBIV、pBI1221、pGreen等。大量適當的載體已為所屬領域中已知， 且可根據所屬領域中已知的方法或本文所述的方法加以引導和/或修飾，以便能夠用於本 文所提供的所述方法中。圖18表示特定例示性發射載體pBID4的示意圖。此載體含有花椰菜花葉病 毒(DNA植物病毒)的35S啟動子，其驅使重組病毒基因組在引入植物中後起始轉錄；和 nos終止子，即農桿菌胭脂鹼合成酶的轉錄終止子。所述載體另外含有包括用於病毒複製 (126/183K)和細胞到細胞運動(MP)的基因的菸草花葉病毒基因組序列。所述載體另外含 有插入菸草花葉病毒基因組序列內獨特克隆位點處且處於外殼蛋白亞基因組mRNA啟動子 的轉錄控制下的編碼所關注的多肽的基因。由於此「靶基因」(即，編碼所關注的蛋白質或 多肽的基因)替換TMV外殼蛋白的編碼序列，故所得病毒載體為比含CP載體不易經歷重組 且無法在所述環境中有效擴散和存活的自我複製裸RNA。左和右邊界序列(LB和RB)劃定 在利用載有載體的重組農桿菌滲透植物後轉移到植物細胞中的發射載體區的界限。在將載 有此載體的農桿菌引入植物組織中(通常通過農桿菌滲透法進行，但另外可通過注射或其 它方式進行)後，即在LB與RB之間產生多個單鏈DNA(ssDNA)序列拷貝並於數分鐘內釋放。 隨後通過病毒複製來擴增這些已引入的序列。靶基因的翻譯導致在較短時間內積累大量的 靶蛋白或多肽。在本發明一些實施例中，農桿菌介導的瞬時表達產生每公斤植物組織多達約5g 或更多靶蛋白。舉例來說，在一些實施例中，產生每公斤植物組織多達約4、3、2、1或0.5g 靶蛋白。在一些實施例中，產生每公斤植物組織至少約20-500mg，或約50-500mg靶蛋白，或 約 50-200、或約 50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190，或約 200、 250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1500、1750、 2000、2500、3000mg或更多靶蛋白。在本發明一些實施例中，這些表達水平是在從滲透起約6、5、4、3或2周內達到。在 一些實施例中，這些表達水平是在從引入表達構築體起約10、7、5、4、3、2天或甚至1天內達 至IJ。因此，從引入(例如滲透)到採集的時間通常小於約2周、10天、1周或更少。此外，本 發明此實施例的一個極引人注目的方面為，其允許在從選擇胺基酸序列起約8周或更短時 間內(甚至包括「預備」表達研究的時間)產生蛋白質。另外，每一批蛋白通常都可在約8周、6周、5周或更短時間內產生。所屬領域技術人員將認識到，這些數量可視所使用的植物 類型而略有變化。大部分幼芽(包括豌豆)將在指定數量的範圍內。然而，本塞姆氏菸草 因生長較慢(來自小得多的種子)，而可能生長較長時間(尤其在滲透之前)。所屬領域技 術人員根據所利用的特定植物的生物學將了解其它預期的調節。本發明的發明者已使用發射載體系統以在多種不同的幼苗中產生多種靶蛋白和 多肽。本發明的發明者已意外地發現，例如包括綠豌豆、比爾跳豆、黃夾豆、斑點豌豆和青豆 在內的某些豌豆品種尤其適用於實踐本發明的這個方面(例如參看實例7)。本發明的發明者還意外地發現，各種菸草屬植物尤其適用於實踐本發明的這一方 面，尤其包括本塞姆氏菸草。所屬領域技術人員將了解，菸草屬植物通常不被視為「幼芽」。 儘管如此，本發明還教示，菸草屬幼苗(尤其本塞姆氏菸草幼苗)適用於實踐本發明。一般 來說，在實踐本發明的這一實施例時，本塞姆氏菸草植株將在滲透(例如傳遞含有發射載 體的農桿菌)之前生長一段足以允許適量生物質發育的時間。通常，所述植物在滲透之前 生長大於約3周、更通常大於約4周或介於約5-6周的時間以積累生物質。本發明的發明者還意外地發現，儘管證實TMV與AlMV序列可在所述發射載體構築 體內有效，但在一些實施例中，AlMV序列對於確保高水平產生經傳遞蛋白質或多肽特別有 效。因此，在本發明某些特定實施例中，在豌豆幼苗或菸草屬幼苗(例如，本塞姆氏煙 草)中由引導產生載有所關注的基因的AlMV序列的發射載體產生所關注的蛋白質或多肽。表達構築體適用於本發明中的表達構築體的許多特徵將特別針對對如上文所論述的特定表 達系統。然而，可適用於不同表達系統的某些方面將於此處更詳細地描述。舉一例來說，在本發明許多實施例中，將需要所關注的蛋白質或多肽(或核酸)的 表達可誘導。在許多所述實施例中，編碼所關注的蛋白質或多肽的RNA的產生(和/或反義 RNA的產生)處於可誘導(例如外源誘導型)啟動子的控制下。外源誘導型啟動子可響應 外部而非內部刺激物來增加或減少轉錄物的表達。多種環境因素可充當所述外部刺激物。 在本發明某些實施例中，轉錄受熱誘導型啟動子(諸如，熱休克啟動子)控制。外部誘導型啟動子可特別適用於受控、可調控生長環境的情形。舉例來說，使用熱 休克啟動子，可簡單地升高封閉環境的溫度以誘導相關轉錄物的表達。當然，應了解，由於 戶外溫度無法控制，故在戶外從未使用熱誘導型啟動子。當戶外溫度上升到某一程度時，啟 動子將啟始。類似地，當戶外溫度降低時，啟動子將關閉。所述溫度轉變可在一天內發生， 例如在白天使表達啟始且在夜間關閉。熱誘導型啟動子(諸如本文所述的啟動子)甚至將 不可能在溫室中使用，其易受氣候轉型的影響程度與戶外情況大致相同。基因工程改造的 植物在溫室中的生長相當昂貴。相比之下，在本發明的系統中，可以控制每一變量，從而可 在每次採集時實現最大量的表達。根據本發明利用的其它外部誘導型啟動子包括光誘導型啟動子。如果在封閉的可 調控環境中燈始終打開，那麼可保持光誘導型啟動子作為組成性啟動子。或者，可在發育期 間的特定時間時通過簡單地開燈來啟始相關轉錄物的表達。在其它實施例中，使用化學誘導型啟動子來誘導相關轉錄物的表達。根據這些實 施例，可將化學品簡單地噴霧或噴灑於種子、胚芽或幼苗(例如幼苗)上以誘導相關轉錄物的表達。可視需要精確控制噴霧和噴灑且將其引導至特定種子、胚芽或幼苗(例如幼苗) 上。封閉環境缺少將使化學品遠離預期接受者分散的風或氣流，因此化學品停留在預期的 接受者上。生長環境
本發明一方面為在受控、經調控生長條件下於植物中產生蛋白質或多肽(和/或 核酸)。根據本發明，與在幼苗(例如，發芽幼苗)中產生蛋白質或多肽相關的一個引人注 目的特徵在於，需要比當相同植物類型在成年期生長將利用的時間短的生長時間。此外，在 許多情況下，可利用比當植物生長到其完全成年的尺寸將需要的空間小的空間。一般來說， 在受控、可調控環境中表達藥用蛋白質或多肽的生長植物可以比生長基因工程改造的植物 用更少的努力、風險和調控事項較快地(由於可在較年輕時採集植物)提供藥用產物。本 發明中所使用的封閉式可調控環境減少或排除自然界異花授粉植物的風險。在本發明許多實施例中，蛋白質或多肽是在封閉系統中生長的植物中表達。所述 系統避免環境汙染的風險且還提供能夠實現重複可比較的結果的可調控、可再現環境。此 夕卜，所述系統允許需要時例如通過使用如本文所述的可誘導啟動子或其它可調控特徵實現 蛋白質或多肽表達受控誘導。在本發明某些實施例中，植物是在封閉式可調控的環境中生長。在一些實施例中， 封閉式可調控的環境為可使種子在室內生長的房屋單元或房間。可控制封閉式可調控環境 的所有環境因素。由於幼芽的生長無需光，且照明極為昂貴，故在一個特定實施例中，使植 物在不存在光的情況下於室內生長(例如，生長到發芽幼苗階段)。可在本發明的封閉式可調控環境中調控的其它環境因素包括溫度、溼度、水、養 分、氣體(例如，O2或CO2含量或空氣循環)、化學品(小分子，諸如糖和糖衍生物，或激素， 諸如植物激素赤黴酸或脫落酸等)等。在本發明許多實施例中，植物是在水栽培下生長。水栽培生長系統提供多種優 勢。舉例來說，水栽培生長系統通常需要比基於土壤的系統更小的空間來生長相同數量的 植物。養分和其它試劑通常可流過水栽培系統，使得控制生長比基於土壤的系統更容易實 現。可使水栽培生長的許多方面自動化。此外，水栽培生長植物的採集極為平常。可簡單 地通過將植物從其生長溶液中升高來予以採集。採集時無需淨化。能夠在不進行洗滌或擦 洗的情況下直接從水栽培環境採集幼苗(例如，發芽幼苗)使所採集的材料的破壞減到最 少。植物的破壞和枯萎會誘導凋亡。在凋亡期間，某些蛋白水解酶變得具有活性，其可降解 發芽幼苗中所表達的藥用蛋白質或多肽，導致蛋白質治療活性的降低。凋亡誘導的蛋白水 解能顯著降低成熟植物中蛋白質的產率。使用本發明的方法，例如由於在從植物提取蛋白 質之前不進行採集，故優選從不會誘導凋亡(即，避免凋亡)。在本發明某些實施例中，植物(例如發芽幼苗)是可在發育期間任何時間時澆水、 噴灑或噴霧的託盤中生長。舉例來說，所述託盤可配有一個或一個以上澆水、噴灑、噴霧和 排水設備，其可在發芽幼苗發育期間特定時間和達到確切量時傳遞和/或去除水、養分、化 學品等。舉例來說，種子需要足夠的水分來使其保持潮溼。過量的水分通過託盤中的孔洞 排到房間地板中的排水溝中。優選在適當時處理排水以在其再排到環境中之前去除有害的 化學品。託盤的另一優勢在於其可封閉在極小的空間內。由於幼苗(例如發芽幼苗)生長通常不需要光，故含有種子、胚芽或幼苗(例如發芽幼苗)的託盤可垂直緊密堆疊於另一 託盤的頂部，從而在特別針對這些目的而構建的房屋設施中每單位地板面積提供大量生物 質。此外，可在房屋單元內沿水平行排列託盤的堆疊。當幼苗已生長到適於採集的階段(例 如，約2天或14天或視植物的類型、所產生的蛋白質或多肽等而定為較長時間)後，即將個 別託盤通過人工或自動構件(諸如傳送帶)移到加工設施中。所屬領域技術人員易於了解適用於實踐本發明的生長條件和技術的多個方面。舉 例來說，當利用可誘導表達系統時，需要選擇誘導表達的時間以使採集時幼苗中所關注的 蛋白質或多肽的表達最大化。在特定生長階段(例如在發芽後特定天數時)時胚芽中的誘 導表達可導致採集時所關注的蛋白質或多肽的產生最大化。舉例來說，發芽後4天時由啟 動子誘導表達可導致合成比3天後或5天後由啟動子誘導表達多的蛋白質。所屬領域技術 人員將理解可通過常規實驗來實現表達的最大化。在優選實施例中，在發芽後約1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11或12天時採集幼苗，尤其發芽幼苗。在其它實施例中，使幼苗、尤其菸草 屬幼苗在發芽後生長數周。當利用組成性而非可誘導表達系統時，可在引入編碼序列後某一時間時採集幼 苗。舉例來說，如果在發育早期(例如在胚芽階段)通過病毒轉化發芽幼苗，那麼可在表達 在轉化後達到其最大量時(例如轉化後約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天時) 採集發芽幼苗。依賴於種子的發芽，也可以為幼苗在轉化後發育1、2、3個月或更長時間的 幼苗(例如幼芽)。一般來說，當開始藥用蛋白質的表達後，使種子、胚芽或幼苗(例如發芽幼苗)生 長直到表達足夠量的所關注的藥用蛋白質或多肽。在某些實施例中，足夠量為當以原樣食 用所採集的生物質時將對患者提供治療益處的量。或者，足夠量為可由生物質濃縮或純化 所述藥用蛋白質或多肽且將其調配成在投藥後對個體提供治療益處的醫藥組合物的量。在某些實施例中，在誘導藥用蛋白質表達後，使生長持續直到達到採集發芽幼苗 的發芽幼苗階段。在特別優選的實施例中，採集活發芽幼苗。採集活發芽幼苗具有若干益 處，包括最少努力和破壞。其中，本發明提供一種獨特系統，其又提供含有大量所表達的所關注的蛋白質或 多肽(和/或核酸)的幼苗生物質。不管直接消費還是加工成醫藥組合物的形式，當幼苗 (例如發芽幼苗)在封閉式可調控的環境中生長時，可以較低成本向消費者提供植物生物 質和/或生物質來源的醫藥組合物。此外，能夠控制幼苗生長的條件的事實使得產物質量 和純度恆定。本發明的封閉式可調控環境還可迴避阻止科學家在戶外生長基因工程改造的 農業產品的EPA的許多安全規章。蛋白質/多肽製備本發明提供在幼苗中產生的各種蛋白質或多肽(和/或活性核酸)製劑和調配 物。在本發明許多實施例中，所產生的蛋白質或多肽不是從植物組織中分離，而是在活幼苗(例如發芽幼苗)的情形下提供。在一些實施例中，當植物可食用時，直接提供含有 經表達的蛋白質或多肽的植物組織以供消費。因此，本發明提供含有經表達蛋白質或多肽 的可食用幼苗生物質(例如，可食用發芽幼苗)。當可食用幼苗(例如發芽幼苗)表達足夠量的藥用蛋白質或多肽且新鮮消費時，在一些實施例中，在消費發芽幼苗之前絕對不會出現採集。以此方式，確保在對需要治療的患者投與藥用蛋白質之前，不存在採集誘導的藥用蛋白質的蛋白水解降解。舉例來說，可將 準備消費的幼苗(例如，發芽幼苗)直接傳遞到患者。或者，將基因工程改造的種子或胚芽 傳遞給需要治療的患者並使其通過患者生長到發芽幼苗階段。在一個優選實施例中，對患 者或將治療患者的醫生提供基因工程改造的發芽幼苗的供給，因此可培養表達某些所需藥 用蛋白質的發芽幼苗的連續儲備物。這對於無力負擔或傳遞昂貴藥品的發展中國家人口來 說特別有意義。生長本發明的發芽幼苗的便利性使得本發明的發芽幼苗特別合乎所述發展 中國家人口需要。在一些實施例中，在消費或調配植物生物質之前，例如通過勻質化、粉碎、乾燥或 提取來進行處理。在一些實施例中，從所述生物質中分離或純化出經表達蛋白質或多肽並 將其調配成醫藥組合物。舉例來說，可將活幼苗(例如幼芽)研磨、粉碎或摻合於含有蛋白酶抑制劑的緩衝 液中以產生生物質漿液。優選緩衝液為約4°C。在某些實施例中，將生物質空氣乾燥、噴霧 乾躁、冷凍或冷凍乾燥。與成熟植物中相同，一些所述方法(諸如空氣乾燥)會導致藥用蛋 白質或多肽活性的喪失。然而，由於所利用的植物(例如發芽幼苗)極小且通常具有較大 表面積與體積比率，故這種情形不太可能發生。所屬領域技術人員將了解，可使用許多使藥 用蛋白質或多肽的蛋白水解減到最少的採集生物質的技術並將其應用於本發明中。投藥和醫藥組合物本發明提供表達醫藥學活性蛋白質或多肽的幼苗，所述蛋白質或多肽在投與有需 要的宿主時仍保持其醫藥活性。優選宿主包括脊椎動物，優選哺乳動物，更優選人類。根據 本發明，宿主包括獸類個體，諸如牛、綿羊、犬科、貓科等。在優選實施例中，將可食用幼芽以 治療有效量經口投與個體。在其它優選實施例中，提供如本文所述的醫藥製劑形式的醫藥 學活性蛋白質。可以多種方式將本發明的醫藥製劑投與宿主，諸如經口、經腸、經鼻、不經腸、肌肉 內或靜脈內、經直腸、經陰道、局部、經眼、經肺部或通過接觸施用投與。在優選實施例中，將 在幼苗(例如幼芽)中表達的藥用蛋白質經口投與宿主。在另一優選實施例中，提取和/ 或純化在幼苗(例如幼芽)中表達的醫藥學活性蛋白質並將其用於醫藥組合物的製備中。 根據常規條件和所屬領域中已知的技術分離和純化蛋白質。所述技術包括諸如提取、沉澱、 色譜法、親和色譜法、電泳等方法。本發明的組合物通常包括有效量的醫藥學活性蛋白質或多肽與一種或一種以上 有機或無機、液體或固體醫藥學適當的載劑材料。根據本發明產生的醫藥學活性蛋白質可以諸如以下劑型使用片劑、膠囊、錠劑、 分散液、懸浮液、溶液、膠囊、乳膏、油膏、氣霧劑、粉末包裝、液體溶液、溶劑、稀釋劑、表面活 性劑、等張劑、增稠劑或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑，只要所述蛋白質的生物活性不受所述 劑型破壞即可。可用作醫藥學上可接受的載劑的物質的一些實例包括(但不限於)糖，諸如乳糖、 葡萄糖和蔗糖；澱粉，諸如玉米澱粉和馬鈴薯澱粉；纖維素和其衍生物，諸如羧甲基纖維素 鈉、乙基纖維素和乙酸纖維素；粉末狀黃芪膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑，諸如可可脂和栓 劑蠟；油，諸如花生油、棉籽油、紅花油、蓖麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇，諸如丙二醇；酯，諸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩衝劑，諸如氫氧化鎂和氫氧化鋁、藻酸、無熱原質水、等滲鹽水、林格氏溶液(Ringer' s solution)、乙醇和磷酸鹽緩衝溶液；以及其它 無毒可相容潤滑劑，諸如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂；且根據配方設計師的判斷，所述組合物 中還可存在著色劑、釋放劑、塗布劑、甜味劑、調味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑(還參看 雷氏藥學大全(Remington『 s PharmaceuticalSciences)，第 15 版，E. W.馬丁 (martin) (美國賓夕法尼亞州伊斯頓市麥克出版社公司(Mack Publishing Co.，Easton PA)，1975)。 舉例來說，可藉助常規混合、制粒、糖衣丸製造、溶解、凍幹或類似方法提供醫藥組合物形式 的蛋白質。在某些實施例中，需要通過減緩經皮下或肌肉內注射的藥用蛋白質或多肽的吸收 來延長醫藥製劑的作用。這可以通過使用具有弱水溶性的結晶或非晶形物質的液體懸浮液 來實現。蛋白質或多肽的吸收速率則視其溶解速率而定，而其溶解速率又可視尺寸和形式 而定。或者，通過將蛋白質溶解或懸浮於油媒劑中來實現不經腸投與的蛋白質的延緩吸 收。通過以生物可降解聚合物(諸如聚丙交酯-聚乙交酯)形成蛋白質的微膠囊基質來制 得可注射儲槽形式。視蛋白質比聚合物的比率和所使用的特定聚合物的性質而定，可控制 釋放速率。其它生物可降解聚合物的實例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。儲槽式可注射 調配物也可通過將蛋白質封裝於與身體組織可相容的脂質體或微乳液中來製備。經腸投與的蛋白質或多肽製劑可以固體、半固體、懸浮液或乳液形式引入並且可 與諸如水、懸浮劑和乳化劑等任何醫藥學上可接受的載劑混合。還可藉助泵或持續釋放形 式投與本發明的蛋白質或多肽，尤其當投藥作為預防措施時更是如此，以便防止個體疾病 的發展或者改善或延緩已患疾病。根據本發明產生的蛋白質或多肽尤其適於以醫藥組合物形式經口投與。可投與所 採集的活幼苗(例如幼苗)或可視所需蛋白質或多肽產物的特性和所需終產物的形式而以 多種方式進行加工，例如空氣乾燥、冷凍乾燥、提取等。在某些實施例中，單獨經口攝取如上文所述的組合物或將其與食物或飼料或飲料 一起攝取。經口投與的組合物包括發芽幼苗；幼苗(例如發芽幼苗)的提取物，和從幼苗純 化的以乾粉、食品、水性或非水性溶劑、懸浮液或乳液形式提供的蛋白質或多肽。非水性溶劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油、魚油和可注射有機酯。水 性載劑包括水、水_醇溶液、乳液或懸浮液，包括生理鹽水，和經緩衝普通不經腸媒劑 (bufferedmedial parenteral vehicle),(Ringer『 s dextrosesolution)、右旋糖加氯化鈉溶液、含有乳糖或不揮發性油的林格氏溶液。乾粉的實例包括已經乾燥(例如凍幹、空氣乾燥或噴霧乾燥)的任何幼苗(例 如發芽幼苗)生物質。舉例來說，可通過將幼苗放入市售空氣乾燥器中在約華氏120度 (120degrees Fahrenheit)下空氣乾燥，直到生物質含有小於5重量％含水量。將經乾燥植 物以塊狀固體形式存儲以進一步加工或通過將其研磨成具有所需網目尺寸的粉末來進一 步加工。或者，可將冷凍乾燥用於對空氣乾燥敏感的產物。可通過將產物放入真空乾燥器 中且在真空下冷凍乾燥來對其進行冷凍乾燥直到生物質含有小於約5重量％含水量。可如 本文所述進一步加工乾燥材料。藥草製劑已為所屬領域眾所周知。可用於投與本發明的幼苗的藥草製劑包括液體和固體藥草製劑。藥草製劑的一些實例包括酊劑、提取物(例如，水溶液提取物、醇提取 物)、湯劑、乾燥製劑(例如空氣乾燥、噴霧乾燥、冷凍或冷凍乾燥)、散劑(例如凍幹散劑) 和液體。藥草製劑可以諸如膠囊、片劑、栓劑、液體劑等任何標準的傳遞媒劑提供。所屬領 域技術人員將了解可應用於本發明中的傳遞藥草製劑的各種調配物和方式。所屬領域技術人員將了解，獲得所需醫藥學活性蛋白質或多肽的特別優選的方法為提取法。可提取新鮮幼苗(例如幼苗)以從殘餘生物質中移出所需蛋白質產物，從而增 加所述產物的濃度和純度。還可在緩衝溶液中提取幼苗。舉例來說，可將新鮮採集的植物 以1比1的重量比轉移到一定量例如已經磷酸鹽緩衝液緩衝的冰冷的水中。還可視需要添 加蛋白酶抑制劑。可在將植物組織懸浮於緩衝溶液中的同時，通過用力摻合或研磨來破壞 所述植物組織並通過過濾或離心來去除所提取的生物質。可通過其它步驟來進一步純化溶 液中所載有的蛋白質產物，或通過冷凍乾燥或沉澱將其轉變成乾粉。還可通過壓榨來進行提取。可通過在壓榨機中壓榨來提取活植物，或者當其通過 密集的滾筒時通過粉碎來提取。收集從經粉碎植物壓出的流體並根據所屬領域眾所周知的 方法進行加工。通過壓榨提取允許釋放較濃形式的產物。然而，所述產物的總產率低於在 溶液中提取產物的產率。幼苗(例如發芽幼苗)提取物、散劑、乾燥製劑和經純化蛋白質產物等還可以為存 在或不存在一種或一種以上如上文所述的賦形劑的封裝形式。片劑、糖衣丸、膠囊、丸劑和 顆粒劑的固體劑型可利用諸如腸衣、控釋包衣和其它醫藥調配領域中眾所周知的包衣等包 衣和外殼製備。在所述固體劑型中，可將藥用蛋白質與至少一種惰性稀釋劑(諸如蔗糖、乳 糖或澱粉)混合。與普通實踐相同，所述劑型還可包含除惰性稀釋劑外的其它物質，例如壓 片潤滑劑和其它壓片助劑，諸如硬脂酸鎂和微晶纖維素。在膠囊、片劑和丸劑的情況下，所 述劑型還可包含緩衝劑。其可視情況含有遮光劑且還可為使其在腸道某一部分中視情況以 延緩的方式只釋放活性成分或優先釋放活性成分的組合物。可使用的包埋組合物的實例包 括聚合物質和蠟。在其它實施例中，將表達本發明的醫藥學活性蛋白質的幼苗或所述幼苗的生物質 以醫療食品的形式經口投與。所述可食用組合物如果為固體形式，那麼可通過生食消費；或 者如果為液體形式，那麼通過飲用消費。在優選實施例中，直接攝取植物材料，而無需先前 的加工步驟或後續的最低限度的烹調。舉例來說，醫藥學活性蛋白質或多肽是在可直接食 用的幼芽中表達。舉例來說，蛋白質是在苜蓿芽、綠豆芽或者菠菜或萵苣葉幼芽、豌豆幼苗 等中表達。在另一實施例中，對發芽幼苗生物質進行加工並且攝取在加工步驟後回收的材 料。優選用於本發明中的加工方法為常用於食品或飼料工業中的方法。所述方法的終 產物仍包括大量經表達的醫藥學活性蛋白質或多肽且優選便利地食用或飲用。還可將終產 物與其它食品或飼料形式(諸如鹽、載劑、風味增強劑、抗生素等)混合併且以固體、半固 體、懸浮液、乳液或液體形式消費。在另一優選實施例中，所述方法包括保存步驟，諸如巴氏 滅菌法(pasteurization)、蒸煮法或添加保存和防腐劑。可在本發明中使用和加工任何植物以產生可食用或可飲用植物物質。可通過所屬 領域中的標準方法(例如，凝膠電泳、Elisa法或Western印跡分析)使用對可食用或可飲 用幼芽製劑中的醫藥學活性蛋白質具特異性的抗體，來測試所述蛋白質的量。所述測定法可用於使所攝取的蛋白質的量標準化。舉例來說，可例如通過混合數批具有不同蛋白質含 量的產物測定和調控幼芽汁液中治療活性蛋白質的量，以致可標準化將要飲用而攝取單一 劑量的汁液數量。然而，使用根據本發明的封閉式可調控環境應使對於進行所述標準化程 序的需要減到最少。在幼苗(例如發芽幼苗)中產生且供宿主食用的醫藥學活性蛋白質或多肽是通過消化系統吸收。攝取發芽幼苗或發芽幼苗製劑、尤其完整幼芽或已經最低限度加工的幼芽 生物質的一個優勢在於，在植物細胞中提供蛋白質的封裝或分離。因此，蛋白質可在到達腸 或小腸之前，至少在某種程度上受到保護以免上消化道的消化，且可將較高比例的活性物 質用於吸收。可治療性或預防性地投與本發明的醫藥組合物。在某些優選實施例中，可使用所 述組合物治療或預防疾病(例如，延緩疾病發作)。舉例來說，可治療罹患疾病或有發展疾 病風險的個體。應了解，在尚未診斷出具有所述疾病的任何症狀的情況下，可認為個體有發 展疾病的風險。舉例來說，如果個體具有鑑別為與發展特定疾病的風險增加有關的特定遺 傳標記，那麼將認為所述個體有發展所述疾病的風險。類似地，如果個體的家族成員已診斷 患有特定疾病(例如癌症)，那麼可認為所述個體將有發展所述疾病的風險。經口投與的液體劑型包括(但不限於)醫藥學上可接受的乳液、微乳液、溶液、懸 浮液、糖漿和酏劑。除所關注的蛋白質或多肽外，液體劑型可含有所屬領域中常用的惰性 稀釋劑，諸如水或其它溶劑；增溶劑和乳化劑，諸如乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲 醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、二甲基甲醯胺、油(尤其棉籽油、花生油、玉米油、 胚芽油、橄欖油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氫呋喃基醇、聚乙二醇和聚山梨糖醇脂肪酸酯， 和其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物還可包括佐劑，諸如潤溼劑、乳化劑和懸浮劑、甜 味劑、調味劑和芳香劑。經直腸或陰道投與的組合物優選為栓劑，其可通過將本發明的組合物與適當的非 刺激性賦形劑或載劑(諸如可可脂、聚乙二醇，或栓劑蠟，其在周圍溫度下為固體但在體溫 下為液體，且因此在直腸或陰道腔內熔融並釋放活性蛋白質)混合製備得到。局部或透皮投與本發明的醫藥組合物的劑型包括油膏、糊劑、乳膏、洗液、凝膠、散 齊U、溶液、噴霧劑、吸入劑或貼片。在無菌條件下將活性蛋白質或其製劑與醫藥學上可接受 的載劑以及視需要任何所需防腐劑或緩衝劑混合。預期眼用調配物、滴耳液和滴眼液也在 本發明的範圍內。此外，本發明涵蓋使用透皮貼片，其具有對身體提供醫藥學活性蛋白質的 受控傳遞的附加優勢。所述劑型可通過將醫藥學活性蛋白質懸浮或分散於適當介質中制 得。還可使用吸收增強劑來增加醫藥學活性蛋白質穿過皮膚的通量。可通過提供速率控制 膜或通過將醫藥學活性蛋白質分散於聚合物基質或凝膠中來控制速率。組合物是以達到所需結果必需的量投與且歷時達到所需結果必需的時間。如上文 所述，在本發明某些實施例中，醫藥組合物的「治療有效量」為有效治療、減輕或預防宿主疾 病的量。因此，如本文所使用，「有效治療、減輕或預防疾病的量」是指無毒但足以治療、減輕 或預防任何宿主的疾病的醫藥組合物的量。舉一例來說，「治療有效量」可為治療、減輕或預 防糖尿病的量。所需的確切量將視個體種類、年齡和一般狀況、疾病階段、特定醫藥混合物、投藥 模式等隨個體不同而變化。優選將本發明的幼苗(例如發芽幼苗)和/或其蛋白質製劑調配成單位劑量形式以便利投藥和劑量均一性。如本文所使用，表述「單位劑量形式」是指適 於待要治療的患者的醫藥學活性蛋白質的實體離散單位。然而，應了解，優選由主治醫師在 合理的醫學判斷範圍內確定本發明組合物的總每日用量。任何特定患者或有機體的特定 治療有效劑量將視多種因素而定，包括所治療的病症和所述病症的嚴重程度；所使用的特 定化合物的活性；所使用的特定組合物；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別；患者的飲 食；患者的藥物動力學情況；投藥時間；投藥途徑；和所使用的特定化合物的排洩速率；治 療持續時間；與所使用的特定化合物組合或同時使用的藥物；和醫藥技術領域眾所周知的 類似因素。
還應了解，可將本發明的醫藥組合物用於組合療法中，也就是說，可與一種或一種 以上其它所需的治療劑或醫療程序同時、在其之前或在其之後投與醫藥組合物。用於組合 方案中的療法(治療劑或程序)的特定組合應考慮所需治療劑和/或程序的可相容性以及 所需欲達到的治療效果。還應了解，所使用的療法可對同一病症達到所需效果(例如，可將 本發明化合物與另一抗癌劑同時投與)，或其可達到不同效果。試劑盒另一方面，本發明還提供一種醫藥包裝或試劑盒，其在一個或一個以上填充有本 發明醫藥組合物的一種或一種以上成分的容器中包括本發明的活的幼苗(例如，發芽幼 苗)或含有由所述幼苗所表達的醫藥學活性蛋白質或多肽的製劑、提取物或醫藥組合物。 在某些實施例中，醫藥包裝或試劑盒包括用作組合療法的其它獲批准的治療劑。視情況與 所述容器相聯的可為政府機構規定形式的規定醫藥產品製造、使用或銷售的說明書，所述 說明書反映所述機構批准製造、使用或銷售用於人類投藥。本發明包括從幼苗(例如發芽幼苗)純化藥用蛋白質，以及使用多種植物表達系 統、最優選病毒植物表達系統(也就是說，包括病毒組分的系統)實現由幼苗(例如發芽幼 苗)產生藥用蛋白質的可提供的按比例擴大。提供在診斷試劑盒中包括針對遺傳和免疫疾 病的各蛋白質的試劑盒。在一個優選實施例中，本發明提供具有生物蛋白質測試樣品以及 測試患者血清中針對所述生物蛋白質的抗體的存在的試劑的試劑盒。舉例來說，試劑盒可 提供IA-2和GAD以及測試患者血清中針對所述蛋白質的過量抗體的存在(1型糖尿病存在 或發展的清晰指示)的試劑。本發明可擴展到提供試劑盒形式的診斷試劑。舉一非限制性實例來說，與糖尿病 的自體反應相關的蛋白質胰島素、GAD和IA-2可以口服調配物的形式提供且投藥以誘導對 這些蛋白質的口服耐受性。或者可以可注射調配物或疫苗形式提供一種或一種以上治療蛋 白質以供投與。根據優選實施例，試劑盒中將提供用於對診斷患有疾病的個體(例如糖尿 病個體)或有發展疾病(例如1型糖尿病)的風險的個體投藥的醫藥劑量或有關其的說明 書。等效物以下代表性實例意欲幫助說明本發明，且不意欲或不應將其解釋為限制本發明的 範圍。實際上，所屬領域技術人員將從本案的完整內容(包括以下實例和對本文所引用的 科技和專利文獻的參考)而對除本文顯示和描述的內容外的本發明和其許多其它實施例 的各種修飾顯而易見。還應了解，所引用的參考文獻的內容是以引用的方式併入本文中以 幫助說明技術現狀。以下實例含有重要的附加信息、範例和指導，其可用於在本發明的各個實施例和其等效內容中實踐本發明。實例實例1 在由農桿菌轉化製備的轉基因幼芽中產生藥用蛋白或多肽採集經農桿菌轉化的植物種子，乾燥、清潔並測試活力以及所需遺傳物質的存在。將種子儲備物在適當條件下存儲待用。使用時，將適量的種子浸泡於含有一定量表面除菌 劑(例如克洛克羅斯公司(Clorox))的水中達20分鐘到4小時。將種子在託盤平面上展 開，所述平面含有生長物質的供應和排水裝置。將含有種子的託盤放於處於控制溫度、光 照、入口、空氣循環、水源和排水裝置下的封閉式可調控環境中的支架上。用裝備有自動計 時器的噴霧器向託盤噴水達1到30分鐘且間隔為30分鐘到4小時，足以使種子保持溼潤。 過量的水分通過託盤中的孔洞排到房間地板中的排水溝中。使種子在受控條件下發芽並發育。將種子培養約2到14天，隨後採集並加工。在 培養過程期間的某段時間(採集前4小時到7天)，將種子暴露於可誘導已引入DNA啟動子 序列或固有DNA啟動子序列的環境條件中，從而引起發芽幼苗組織中一種或一種以上所需 蛋白質合成的增加。將培養溫度從約30°C瞬時增加到約37°C以誘導熱休克啟動子。在將幼苗培養2到14天後，通過將個別託盤在傳送帶上移到加工設施中來採集幼 苗。通過在含有蛋白酶抑制劑的磷酸鹽緩衝的溶液中進行提取來加工所採集到的幼苗。在 將幼苗懸浮於緩衝溶液中的同時通過用力摻合或研磨來破壞幼苗並通過離心移出所提取 的生物質。實例2 在經植物病毒瞬時感染的發芽幼苗中產生藥用蛋白或多肽從商業種植者合同獲得野生型種子形式的所需植物的種子。將種子儲備物在適當 的溫度、溼度、衛生和安全條件下存儲待用。使用時，將適量的種子浸泡於水中並在如上文 所述的託盤中於受控條件下培養。培養2到14天後，將含有具轉基因的病毒的溶液噴於發芽幼苗上，且另外或同時 用引起植物葉片組織機械性磨損的材料處理。在本實例中，用含有磨粒的空氣噴霧器刮擦 葉片。使病毒系統性感染植物達適當時間段(約1到約10天)並監測所需異源蛋白質的 表達。在感染幼苗達1到10天後，如上文實例1中所述採集幼苗。實例3 在本塞姆氏菸草植物中由病毒載體(AvA4)表達糖尿病相關蛋白和人類生 長激素早髮型1型或青少年糖尿病是一種影響兒童、青少年和青年的疾病。胰腺內分泌 系統的β胰島細胞響應高血糖的代謝信號產生胰島素。所述疾病的潛在病原學為β胰島 細胞受身體自身免疫系統的攻擊和破壞。患有1型糖尿病的個體產生針對至少三種通常見於所有個體體內的蛋白質(即， 胰島素、穀氨酸脫羧酶(GAD)和酪氨酸磷酸酶樣蛋白ΙΑ-2)的抗體(萊斯利(Leslie)等人， 糖尿病學(Diabetologia) (1999) 42 30-14)。在疾病發作前，可在50到75%的1型糖尿病 患者體內發現針對IA-2和GAD蛋白的自體抗體。此外，針對這些表面上普通的蛋白質的自 體抗體早在與1型糖尿病相關的典型症狀發作之前7到8年就已出現。諸如胰島素、GAD和IA-2等自體抗原適用於至少在口服耐受這些蛋白質的水平上 在易感個體體內誘導並且防止或降低會導致糖尿病發展的胰島細胞的損傷。非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)自發發展糖尿病的自體免疫形式(張(Zahang)等人，美國國家科學院院 刊(1991)88:10252-10256)。已將編碼人類胰島素的基因與霍亂毒素B亞基基因融合併且 在轉基因馬鈴薯植物中表達所得構築體。當用這些植物飼養NOD小鼠時，所述動物展現胰 島炎症的明顯降低以及糖尿病進展的延緩(荒川(Arakawa)等人，自然生物工藝學(Nat. Biotechnol) (1998) 16:934-936)。也已經在馬鈴薯植物中表達GAD蛋白。當用這些轉基因 馬鈴薯飼養NOD小鼠時，40周後其也防止或明顯延緩糖尿病發作(馬(Ma)等人，自然一醫 學(Nature Medicine)(1997)3:793-796)。在本實例中，描述表達GAD和IA-2和從植物中回收GAD和IA_2的某些非限制性 條件。使用His標籤方法來純化GAD和IA-2蛋白。原材料和蛋白質的產生是分兩個階段 發生1)在動物中進行的小規模初步研究(毫克量)；和2)中等規模的臨床試驗(克量)。
測試穩定件和運動。為進行病毒穩定性和運動測試，合成少量各構築體。每一構 築體含有與嚴格病毒基因組RNA5 』末端融合的T7或SP6RNA聚合酶啟動子以及在活體外轉 錄前用於使質粒線性化的3'末端獨特限制性位點。隨後T7或SP6RNA聚合酶產生失控轉 錄物(run-off transcript)，將其用於接種植物。在兩葉期，通過在存在磨擦劑(諸如碳化 矽粉末(320粒度；賓夕法尼亞州匹茲堡的世爾公司(Fisher，Pittsburgh，PA))的情況下， 將接種物輕柔擦於葉片表面來機械接種植物。每種構築體接種5到10株植物並且每次接 種使用1-2 μ g各RNA轉錄物。監測病毒擴散到整個植物時植物症狀的嚴重程度，並回收產 物。感染後10-15天(dpi)，從經感染的葉片樣品採集葉片樣品以評定全尺寸重組IA-2和 GAD的存在。將一部分採集的材料(10個葉片)在-80°C下冷凍並且作為種子接種物保留 以供隨後進行的所選構築體的按比例擴大生產。立即加工組織的剩餘部分。感染後15-20天，回收重組IA-2和GAD。將程序優化以回收最佳量的高純度產物 (90-95%純度)。在回收具有預期尺寸的產物並測定血清學身份(使用Western印跡法和 ELISA通過特異性抗體識別)後，通過三代健康植物測試構築體的穩定性。通過改變感染條 件或通過使用另一宿主植物，在核苷酸序列或胺基酸序列水平上解決重組病毒與在所使用 的尺寸範圍內的蛋白質的組裝、回收或穩定性問題。確定種子批次和程序以供中等規模生產。當第1階段完成時，制各少量(100 μ 1) 活體外合成的重組構築體的轉錄物並且將其用於接種10株植物。在接種後10-12天內採集 葉片，通過Western印跡法測試GAD或IA-2的存在並且在_70°C下作為種子材料存儲。將 此材料的一部分(3-4)用於接種150-200株植物(l-2kg新鮮組織)。接種後15到20天， 回收重組蛋白並將其用於功能的研究。預期平均每批60mg產物。植物接種和產物回收。使用T7RNA聚合酶和經純化質粒DNA合成含有GAD和IA_2 的重組病毒活體外轉錄物。使用RNA帽結構類似物m7G (5) ppp (5) G給轉錄物戴帽。對於接 種，將活體外轉錄產物的混合物施用於靶宿主植物的葉片，隨後用碳化矽刮擦葉片表面並 且在葉片表面上輕柔磨擦以使接種物擴散且進一步刮擦所述表面。測試產生IA-I和GAD 的植物的純度和活性。在蛋白質純化期間和之後通過ELISA測試植物產生抗原的抗體結合 能力。本塞姆氏菸草中蛋白質的表達為在病毒感染的植物中表達全長蛋白質，使用功 能互補法在本塞姆氏菸草植物中表達來自水母的綠色螢光蛋白(GFP)(圖4)。在植物到植 物傳代期間，受感染組織中苜蓿花葉病毒(Av)/GFP的量逐漸降低並且在第三次轉移後，只能檢測到Av/A4。(從環境安全性的觀點看，這是有利的。)使用本方法，每克新鮮組織可表 達平均100 μ gGFP。這一系統的重要組分苜蓿花葉病毒CP具有將不相關病毒的基因組RNA 包入受感染宿主中的感染性粒子中的能力，故其是獨一無二的。利用苜蓿花葉病毒CP的這 一獨特能力以工程改造特異性靶向所選作物物種的雜交載體。
通過Western印跡法分析經Av/A4和Av/A4GFP接種的本塞姆氏菸草植物中重組 GFP的表達(參看圖3)。通過電泳法在12% SDS-聚丙烯醯胺凝膠上分離來自如本文所述 系統性感染的葉片的蛋白質提取物，將其轉移到硝酸纖維素膜中並使其與蛋白質特異性抗 體反應。苜蓿花葉病毒CP特異性抗體識別經Av/A4或Αν/Α4與Av/A4GFP混合物接種的植 物中具有預期尺寸的蛋白質(24.0kD)。GFP特異性抗體只識別來自經Av/A4與Av/A4GFP 混合物接種的植物的提取物中的蛋白質。GFP特異性抗體不與只經Αν/Α4接種的植物中的 任何蛋白質反應。苜蓿花葉病毒CP和GFP特異性抗體都不與來自只經Av/GFP接種的植物 的提取物中的任何蛋白質反應，這表明系統運動的缺乏。也已使用此Av/A4載體系統工程改造和表達人類生長激素。用活體外轉錄物接種 本塞姆氏菸草植物並監測植物中hGH的產生。在5dpi (接種後天數)時未檢測到對所述蛋 白質的特異性信號，但在Ildpi時可在接種植物中檢測到有關hGH的信號。圖4為在感染 125C/hGH的活體外轉錄物的本塞姆氏菸草植物中產生的hGH的Western印跡。接種後24 小時分析樣品。裝載Iyg純hGH作為標準品。MWM為分子量標記。圖4的箭頭指向印跡上 由hGH特異性抗體檢測到的hGH譜帶。實例4 轉基因大葉芥菜植物中炭疽相關蛋白和人類生長激素的表達炭疽的毒力是由至少兩個主要的毒力因子引起。這些因子為幫助保護宿主中的細 菌的聚穀氨酸莢膜和三部分循環毒素(three-part circulating toxin)。炭疽毒素是由稱 SpXOl的184kb質粒編碼且由稱為保護性抗原(PA)的受體結合蛋白以及稱為水腫因子和 致死因子的兩種酶活性蛋白組成(巴特納格爾(Bhatnagar)和巴特拉(Batra)，微生物學述 評(Crit. Rev. Mirobiol.)(2001)27(3)167-200)。在本實例中，在大葉芥菜的葉片中產生兩種至少0. lmg/gm乾重濃度的無活性炭 疽毒素組分，即保護性抗原(PA)和致死因子(LF)。已將這些植物基因的密碼子使用優化 並改變胺基酸序列以使兩種毒素分子的毒性減到最小。建議將合成DNA插入能夠調控大 葉芥菜中基因表達的載體中。將PA基因改變成在314和315位缺失苯丙氨酸殘基。使LA 基因在686位或690位的組氨酸被丙氨酸取代(例如參看，西恩(Singh)等人，生物化學雜 志(J. Biol. Chem.) (1994)269:29039-29046 ；克蘭帕樂(Klimpel)等人，分子微生物學雜誌 (Mol. Microbiol.)(1994) 13 1093-1097)。轉化載體將二元載體PGREENII0229 (海倫(Hellens)等人，植物分子生物學 (PlantMolecular Biology) (2000 年 4 月)42 (6) 819-832)用於植物轉化中(參看圖 5)。 此質粒包括以下組分。l)pGREENII質粒主鏈包括在大腸桿菌和根癌農桿菌中複製所需的序 列。2)根癌農桿菌T-DNA左邊界和右邊界(LB和RB)序列為將LB與RB之間的所有序列整 合到植物基因組中所需。3)編碼卡那黴素抗性的npt基因，其用於選擇大腸桿菌和根癌農 桿菌轉化體。4)n0S-bar基因，其編碼對除草劑雙丙氨磷的抗性(使用雙丙氨磷抗性來選擇 轉基因植物)。n0S-bar基因是由植物中具有組成性活性的花椰菜花葉病毒(CAMV) 35S啟動 子轉錄，並且所述基因的轉錄是使用CaMV終止子終止。5) vir基因PA和LF的表達是由如圖5所示的CAMV35S啟動子或者擬南芥低分子量熱休克蛋白的HSP18. 2啟動子(基因庫登 錄號#X17295，基因座At5g59720)驅動(松原(Matsuhara)等人，植物雜誌細胞與分子生 物學(The Plant Journal :for Cell & Molecular Biolog) (2000 年 4 月)22(1) 79-86)。 轉錄終止是由胭脂鹼合成酶基因(nos)的終止子介導。根據不同活性選擇35S和HSP18.2 啟動子。35S啟動子在大部分植物組織中具有組成性活性。在許多情況下，35S啟動子驅動 所關注的蛋白質的高水平表達。相比之下，HSP18. 2啟動子幾乎無活性，除費通過熱休克來 激發植物。一些蛋白質的高水平表達只能使用可誘導啟動子系統來實現。載體構築和棺物轉化。使用DH5(實驗室大腸桿菌菌株)來構築載體。通過限制 性核酸內切酶作圖和測序來分析構築。在確定構築之後，使用所述載體轉化缺乏天然Ti質 粒且適於將二元載體的TDNA轉移到植物中的根癌農桿菌菌株GV3101。通過任何可用的轉 化方法，將載有轉化載體的GV3101引入花中來轉化大葉芥菜植物。
引入PA和LF基因中的修飾。對PA和LF的核苷酸序列進行修飾以在植物中表 達。天然PA的編碼序列為2295bp且天然LF為2430bp。這些序列修飾如下1)弓|入使PA 和LF作為毒素無活性的突變。使PA缺失Phe314和Phe315且使His686和His690突變成 Ala0 2)優化密碼子使用以在大葉芥菜中表達。由於大葉芥菜的密碼子使用和GC/AT比率 不確定，故引入PA和LF中的改變並不多。PA中改變4個密碼子且LF中改變7個。3)將獨 特限制性位點添加到基因的5'和3'端以供克隆到植物表達載體中。[4]添加翻譯起始的 一致序列(喬什(Joshi)等人，植物分子生物學(Plant Molecular Biology. ) (1997年12 月)35 (6):993-1001)。限制性位點和優化的翻譯起始位點描述於圖5中。5'端顯示添加 的XbaI限制性位點和植物基因的一致翻譯起始位點，其包括起始密碼子，隨後為Ala密碼 子。3'端顯示添加的SacI限制性位點。經修飾PA和LF基因是由Entelechon公司(德 國雷根斯堡(Regensburg，Germany))化學合成。第二構築也是針對PA和LF產生。第二構築體的目的在於通過靶向內質網中的 蛋白質並將其滯留於內質網中來優化PA和LF的積累4°。靶向和滯留於ER中可產生重 組蛋白的高水平積累(哈洛夫(Haseloff)等人，美國國家科學院院刊(Proceedings of theNational Academy of Sciences USA.) (1997 年 3 月 18 日)94 (6) : 2122-2127)。為達到 此目的，添加氨基末端信號序列和羧基末端ER滯留序列。信號序列包括來源於擬南芥殼多 糖酶基因的22個密碼子(哈洛夫等人，同上文)。ER滯留序列為四肽HisAspGluLeu (格莫德 (Gomord)等人，植物雜誌細胞與分子生物學(The Plant Journal :for Cell Molecular Biology.) (1997年2月)11 (2) 313-325)。通過使用由Entelechon公司生產的合成基因作 為模板進行的PCR拼接來添加信號序列(湯米(Tomme)等人，細菌學雜誌(J Bacteriol.) (1995) 177 4356-4363)。通過使用已併入HisAspGluLeu編碼序列的3 『引物的PA和LF基 因的PCR擴增來添加ER滯留序列。將經修飾PA和LF序列克隆到35S和HSP18. 2表達載 體中。克隆PA和LF各兩種經修飾型式(總計4種)。總的來說，測試8種不同的構築體。表汰轉基因的棺物的詵擇和分析。用載有轉化構築體的根癌農桿菌菌株GV3101 轉化大葉芥菜後，使植物經由其正常發育程序發展。25天內，產生成熟種子，乾燥並採集。將 種子播種於盆栽土壤中，並使幼苗生長15天。隨後將0.0058% (w/v)的雙丙氨磷(FINALE， 法納姆公司(Farnam，Inc.)，亞利桑那州菲尼克斯(Phoenix，AZ))溶液噴於各植物的葉片 上。通常在5到7天內殺死非轉基因敏感植物。通過綠色和健康外觀可顯而易見雙丙氨磷抗性植物。確認推測的轉基因植物並使用一系列方案加以分析。將使用對構築體具特 異性的寡核苷酸引物的聚合酶鏈反應用於確定推測的轉基因植物中TDNA的存在。隨後通 過使用特異性DNA探針(經修飾PA或LF基因)印跡基因組DNA來檢驗TDNA的存在。最 後，通過SDS-PAGE，隨後用考馬斯藍(Coomassie Blue)染色或免疫印跡來檢驗所關注的蛋 白質的表達。蛋白質表達的分析方案隨用於產生轉基因植物的構築體而不同。由於由35S 啟動子的表達為組成性的，故可直接分析載有35S啟動子構築體的植物。在分析前使載有 HSP18.2啟動子的植物熱休克。重組蛋白表達的動力學可能隨不同轉基因植物而不同。最 後，使用標準方法對各誘導條件進行優化。然而，對於初始分析來說，可能會進行將建立大 葉芥菜中其它重組蛋白的表達的標準化熱休克方案。
圖6繪示在HSP18. 2啟動子控制下表達人類生長激素(hGH)的轉基因大葉芥菜的 免疫印跡圖。使轉基因大葉芥菜在盆栽混合物中生長。如圖6所示，從植物中剝離重1到 3克鮮重的葉片，並將其放入含有經水潤溼的濾紙的皮氏培養皿(petri dish)中。將皮氏 培養皿覆蓋並將其放於高溼度、37°C恆溫培養箱中達1. 5小時。隨後將含有所述葉片的皮 氏培養皿從恆溫培養箱中取出，並將其放入處於100 μ mol光子HT2s-1強度的螢光下的24°C 生長室中達5小時。隨後採集植物材料並通過使用針對hGH的單克隆抗體(西格瑪化學 品公司(Sigma Chemical Co.)，產品編號G-8523)進行的免疫印跡加以分析。較低譜帶為 16kDa重組hGH。在熱休克之前未觀察到此譜帶。第8道顯示來自僅經載體轉化的轉基因 植物的結果。較高分子量譜帶為與用於檢測免疫複合物的辣根過氧化物酶連接的二級抗體 的非特異性反應。預計PA為約88kDa且LF為93kDa。在炭疽毒素表達的初始篩選後，進行對表達的更為詳細地分析。使用ELISA方法 來定量表達水平。對後續的植物子代進行進一步分析。為避免對於在後續子代中選擇轉基 因植物的需求，最終需要分離關於TDNA構築體不分離的轉基因株系。這可以通過對原代轉 基因植物進行自花授粉，將第二代植物栽培成熟並且關於雙丙氨磷抗性分離測試第三代來 實現。鑑別不分離的第二代個體。此後，形成大量不分離植物子代並且將其用於生產規模 條件(例如每月l，600Kg幹生物質)的分析。將生長為幼苗的植物的生長和誘導條件優化 以達生產規模。此時，還需要表徵良種系的插入位點和TDNA拷貝數並且在mRNA表達水平 上表徵表達。實例5 在幼芽中由含有病毒序列的農桿菌構築體表達GUS報告子將含有⑶S報告基因的pBI121轉化到根癌農桿菌LBA4404中。使細菌培養物在 含有50 μ g/ml卡那黴素、20 μ M乙醯丁香酮和IOmM MES (ρΗ5. 6)的TCB培養基中生長整夜。 將整夜培養物離心，將其以0D6QQ2. 0懸浮於MMA培養基(MS鹽、IOmMMES (pH5. 6)、200 μ M乙 醯丁香酮和2%蔗糖)中，並將其用於幼芽的真空滲透。室溫下，使各種植物的種子在振蕩平臺上的水中吸液膨潤達24小時，將其轉移到 具有潮溼濾紙的塑料容器中並在12小時白天下於21°C下培養4到6天(視植物物種而 定)。真空滲透後，將幼芽在12小時白天下於21°C下再培養48-60小時並使用X_gluc 組織化學底物原位檢測GUS活性。在37°C進行整夜染色並使植物樣品在乙醇中脫色。使用多種幼芽測試所述系統。參看圖8A和8B以及圖9。實例6 由含有病毒序列的農桿菌構築體表達糖尿病相關蛋白和人類生長激素
已在農桿菌載體中產生基於TMV的載體D4_hGH或D4-GFP。為此，首先須在 PBI121 中產生多個克隆位點。pBI121-Xbal-BamHl-Sall-Pacl-BsiWl-Stul-Xhol-Spel-Kpnl-Sacl-pBI1210使用適當的引物和PCR，產生具有這些位點的pBI121。確定所述序列 後，接著將TMV基因組序列引入此質粒中。有關D4-hGH和D4-GFP的進一步論述，也參看 2004年2月3日申請的U. S. S. N. 10/770，600和2003年2月3日申請的美國臨時申請案 第60/444，615號(以引用的方式併入本文中)以及U. S. S. N. 10/832，603和美國臨時申請 案60/546，339(以引用的方式併入本文中)。原載體D4和由其得到的載體描述於施普賽德 (Shivprasad)等人，病毒學，255 (2) 312-23，1999 中。所得質粒稱為 pBID4。將花椰菜花葉病毒的35S啟動子與TMV序列融合。由此，35S啟動子引導TMV序列的轉錄。成功併入細胞中後，產生病毒轉錄物。在本發明某些實施例中，還產生病毒複製和 在整個植物中擴散所需的組分。這些組分例如包括複製酶、運動蛋白和外殼蛋白，其可來自 TMV或各個實施例中的其它病毒(諸如苜蓿花葉病毒)。可在單獨病毒載體或質粒中提供的 TMV序列、質粒序列內編碼這些組分，或者植物可為包含編碼所述組分的轉基因的轉基因植 物。例如參看2004年2月3日申請的USSm0/770，600，其以引用的方式併入本文中。TMV序列內的亞基因組TMV啟動子引導hGH序列的轉錄。將錘頭核酶引入TMV序 列的3'端。所述核酶並非本發明所需。nos終止子(所屬領域眾所周知)為所述核酶序 列的3'端。最終載體含有D4_hGH或D4-GFP。隨後使用pBI121中的這些構築體轉化根癌農杆 菌並且用經轉化農桿菌滲透植物。由於存在複製病毒，故將植物培養2周。通過Western 印跡法分析葉片中hGH的產生。通過用長波紫外光照射植物來監測GFP表達並拍攝照片。 圖10中所示的結果表明在整個經滲透葉片中存在GFP表達。圖11中所示的使用針對hGH 的抗體進行的Western印跡分析證實，所述構築體在植物中起作用並且可以檢測到較高含 量的hGH。類似地，將IA_2ic工程改造到pBID4質粒中以產生pBID4-IA_2ic。另外，產生載 有GFP的基於AMV病毒的載體。使用所得質粒轉化農桿菌並且用經轉化農桿菌滲透水栽培 生長的本塞姆氏菸草中。簡單來說，將本塞姆氏菸草種子播種於在水栽培條件中作為養分 的1/2濃度的霍格蘭溶液(Hoagland solution)中預先潤溼的巖棉種植墊(Rockwoolslab) (18X18X1)上。在同一種溶液中將水栽培植物保持4周。隨後，在載有pBID4-IA-2ic或 載有GFP的基於AMV病毒的載體的農桿菌懸浮液(0D_0. 1)中對4周齡的植物實施真空滲 透。使細菌培養物生長並誘導整夜，隨後將細胞再懸浮於MMA培養基(MS鹽、 IOmMMES (pH5. 6)、20g/l蔗糖、200 μ M乙醯丁香酮)中直到0D_為0. 1。在輕柔振蕩下，在室 溫下將再懸浮培養物培養2-3小時，並且將水栽培本塞姆氏菸草植物放入細菌懸浮液中， 隨後在室溫下施加真空達30-60秒。迅速釋放真空以促進細菌有效注入組織中，並將經滲 透植物在1/2濃度的霍格蘭溶液養分中保持5-7天。或者，使用無針頭的IOcm2注射器將細 菌懸浮液強壓到完全膨脹的葉片的表皮內。滲透後3-6天時採集葉片並在-80°C存儲或針 對表達分析進行分析。圖12顯示表達IA-2ic的植物的western印跡分析。有關在光下經 基於AMV的GFP構築體滲透的植物的分析表明在經滲透植物的整個葉子中存在GFP表達。實例7 在豌豆品種中由含有病毒序列的農桿菌構築體表達蛋白質(綠色螢光蛋白；地衣聚糖酶)本實例描述利用載有病毒表達載體的農桿菌構築體進行的某些豌豆品種的農杆 菌滲透。圖13描述用於載有AlMV序列的農桿菌構築體的整個策略。已知AlMV具有分段 的基因組(如上文所論述)，故使用三種不同的構築體載有編碼複製酶1和2的AlMV序 列的構築體(pMOG-Rl和R2)；載有AlMV RNA3序列的構築體(pBI_RNA3)(視情況包括待表 達的所關注的基因，其通常替換RNA3中的天然AlMV外殼蛋白序列)；和載有編碼AlMV外 殼蛋白的AlMV序列的構築體(pBI-CP)。所屬領域技術人員將了解，嚴格地說，並不需要包 括編碼AlMV外殼蛋白的構築體。然而，由於外殼蛋白可促進病毒序列(且因此其所載有的 所關注的基因)的複製和/或系統性擴散，故包括所述構築體將是有用的。即使在需要確保AlMV外殼蛋白表達的情況下，也並非必需利用三種構築體。舉例 來說，或者可能會利用已關於AlMV外殼蛋白轉基因的植物，因此無需單獨提供。另外或其 它，可利用關於一種或兩種AlMV複製酶蛋白轉基因的植物。在所述植物(視情況另外關於 AlMV外殼蛋白為轉基因的)中，可利用僅載有RNA3和所關注序列基因的單一構築體以達到 類似結果。如圖13所示，在這些特定實施例中，利用表達三種不同蛋白質(S卩，綠色螢光蛋白 (GFP)、地衣聚糖酶(Lich)和地衣聚糖酶-炭疽保護性抗原融合體(Li-PA))的構築體。在圖13所涉及的特定實驗中，使至少1升各農桿菌菌株(即，各菌株載有3種構 築體pMOG-Rl與R2、pBI-RNA3/所關注蛋白質、pBI-CP中的一種)生長，將其製成球狀，並 再懸浮於MMA中達1.0的O.D.。所屬領域技術人員將了解不同植物可能需要不同的O.D.。 對於豌豆植物，如果技術可以達到，通常需要例如在1.5範圍內的較高0. D.。在圖13所涉及的特定實驗中，將載有複製酶(pMOG-Rl與R2)、外殼蛋白 (pMOG-CP)和RNA3/靶蛋白(pBI_RNA3/GFP、Lich或Li-ΡΑ)的農桿菌菌株以1:1:2的比率 組合達到1. 5L的總體積。所屬領域技術人員將了解，這些比率和體積並不重要；選擇所利 用的特定比率以反映AlMV的生活周期通常涉及比其它基因組組分高的RNA3含量。此外， 需要較高含量載有所關注的基因(即，GFP、地衣聚糖酶或地衣聚糖酶-保護性抗原基因) 的 RNA。在圖13所涉及的特定實驗中，利用如所屬領域中已知的無土壤支撐物(在此情況 下為乾酪布)使菜豆幼芽水栽培生長。將幼苗浸沒於組合農桿菌混合物中，並在_28psi下 施加真空達90秒以實現農桿菌滲透。在一些情況下，施加一次以上真空。在圖13所涉及的特定實驗中，在農桿菌滲透後，在自來水中漂洗幼苗1次，且隨後 將其放回生長空間並澆水。接著採集幼苗，匯集並進行提取。圖14-16提供根據圖13中所述的策略進行的各項實驗的結果。舉例來說，如圖14 所示，將產生地衣聚糖酶的構築體通過農桿菌滲透斑點豌豆(SP)、黃豌豆(YP)或比爾跳豆 (BP)幼苗中。在農桿菌滲透前，使幼苗在暗處生長2天(以允許發芽)且在光照下生長8 天(如由「2(8)」符號所示)。這10天之後進行如上文所述的農桿菌滲透，並使其在接種後 生長5天(dpi)，隨後檢測所產產生的蛋白質。如圖14中可看出，所有三種豌豆品種都產生 地衣聚糖酶蛋白質，但黃色豌豆的產量比斑點豌豆略高，且比爾跳豆具有略低的產量。所述 變化在熟悉在植物中表達蛋白質的技術人員的經驗範圍內；根據這些結果，將只需要常規實驗來選擇產生任何特定蛋白質的優選植物品種。總的來說，在這些豌豆幼苗系統中所觀 察到的表達水平為當在本塞姆氏菸草中表達相關蛋白(例如Lich-ΡΑ)時所觀察到的表達 水平的約1/3(未圖示)。這些幼苗優於本塞姆氏菸草的優勢在於，其可食用，由於已知所述 植物的所有組分至少對於人類無害，故其應可簡化針對所產生的醫藥學活性蛋白質的任何 所需分離。此外，其生長迅速並且價格低廉。另一方面，由於種子比常見幼苗且尤其豌豆的 種子小得多，故種子存儲也比本塞姆氏菸草簡單。如從參考圖14可看出，在這些特定實施例中，上述AlMV產生系統對於產生所關注 的蛋白質比類似的TMV系統(如本文所述)更為成功。所屬領域技術人員將了解，對於在 某些特定植物物種中產生某些特定蛋白質來說，將優選TMV系統；而在其它情況(包括所述 情況)下可優選A1MV。圖15繪示在農桿菌滲透前生長不同時間段的斑點豌豆和黃色豌豆中GFP的成功 產生。在圖15中所提供的特定實驗中，施加三次真空各歷時90秒。此外，所利用的特定再 懸浮培養基為「完全MMA」。所屬領域技術人員將了解，可另外使用多種其它滲透培養基中 的任一種(包括基本培養基MMA、AB等)並且可能會增加或降低農桿菌滲透和因此蛋白質 或多肽產生的最終效率。
圖16繪示滲透後不同時間段時斑點豌豆葉片(L)、整個幼苗(W)、根(R)或胚軸 (H)中地衣聚糖酶的表達。如可看出的，大部分表達發生在葉片中。而且，滲透後約5-7天 時此特定系統中表達最佳。預期一些變化將建立在所利用的植物的年齡和品種以及所表達 的蛋白質的基礎之上。其它類似實驗表明，舉例來說，使用缺乏5/3 『 UTR結構的pBI_CP構築體大概是通 過增加外殼蛋白(CP)的產量來增加所關注的蛋白質的產量。此外，在本系統中，9-12天齡 的植物表達最佳。總的來說，在較年輕組織中蛋白質表達水平較高，但較老組織中具有較多 生物質。其它類似實驗提出將植物暴露於24小時光照而非12/12白天/黑夜循環明顯降 低所關注的蛋白質的含量。其它類似實驗表明，在農桿菌滲透期間，將豌豆幼苗暴露於弱清潔劑大概可通過 增加成功農桿菌滲透的效率和/或程度來增加所關注蛋白質的產量。實例8 在植物中大規模產生蛋白質或多肽的模塊系統本實例描述一種技術平臺，其將使生物醫藥的製造發生巨大變化，減少批次生產 時間(在一些情況下減少到5周)。本實例中所述的特定生產系統利用農桿菌載體，在數分 鍾內將極大拷貝數的載有所關注的蛋白質或多肽的編碼序列的植物病毒RNA傳遞到幼苗 內。因此可在將農桿菌載體引入植物中的一周內，以大量植物生物質實現所關注的蛋白質 或多肽的高水平瞬時表達。本實例中所述的技術平臺適用於多種單體或多聚體蛋白，包括疫苗抗原、單克隆 抗體和其它治療劑(尤其)並且可在多種植物物種中進行。植物中的表達比在一些其它系 統中表達更適合提供正確摺疊和溶解性，且具有無動物病原體的附加優勢。在此特定實例 中，關注在幼苗中工程改造並產生疫苗抗原和單克隆抗體。如本實例中所述，將編碼所關注的蛋白質或多肽的基因克隆到組合有農桿菌和植 物RNA病毒序列元件的發射載體中。隨後使用農桿菌通過真空滲透將數百萬個發射載體拷貝引入植物中。在植物組織中，另外通過病毒複製大量擴增載體序列。隨後在引入載體後， 在不到一周的時間內由這些病毒轉錄物產生靶蛋白。應了解並非必需(但也不禁止)將農 桿菌載體整合到植物細胞中。相反，載體的農桿菌元件僅促進最終產生蛋白質的病毒RNA 的快速系統性傳遞(經由農桿菌滲透法)。可使用所述系統來產生每公斤新鮮植物組織大量(例如數百毫克量)靶蛋白。此外，由於易於得到大量種子(如所述，其無需為轉基因的)，故可實現極高容量。如本文所述，在一些情況下，產生與載體分子融合的靶蛋白或多肽，以例如使所述 蛋白質穩定和/或促進下遊加工。所述載體對於產生抗原蛋白尤其有用。特別值得關注的 載體例如包括熱穩定性蛋白，諸如2003年5月22日申請的USSN60/472，495以及2004年5 月24申請且於2005年3月24日以W005/026375公開的PCT/US04/016452中所述的蛋白 質。應注意，從這一點看，所述熱穩定性載體分子為來自熱纖梭菌的β_1，2-1，4-葡聚糖酶 (LicKM)的工程改造型式。可將靶序列迅速工程改造為與LicKM的N末端、C末端或內部融 合物。LicKM中外來序列的存在不會導致分子熱穩定性的喪失。這一特性促進容易且成本 有效地回收靶蛋白。簡單的熱處理步驟(例如在65°C下至多10分鐘)會導致去除大部分 宿主蛋白。此外，可將一種以上靶蛋白與每一 LicKM分子融合，但同時使用多個插入位點。具體來說，使來自未基因修飾的植物的種子在水栽培條件下發芽，並且在封閉式 室內植物設施中保持一段時間(例如，對於幼苗通常至多約10天；對於本塞姆氏菸草有時 為2-6周)，然後進行真空滲透。在這些條件下，每平方英尺植物生物質的產率通常為利用 在土壤中生長的植物所得到的產率的4-5倍。使用幼苗(例如，發芽幼苗)，可產生每平方 英尺具有大量(例如約IOO-IOOOkg)綠色組織的密集冠層(canopy)。舉少數實例來說，利 用諸如豌豆的幼芽通常可產生每平方英尺具有約700g綠色組織的冠層；利用本塞姆氏煙 草通常產生每平方英尺具有約200g綠色組織的冠層。所屬領域技術人員將了解其它植物 可能介於這些量之間。可通過在具有配套照明單元的棚架(1000平方英尺生長空間將在不到兩周內提 供多達4公噸生物質)上將幼苗(例如幼苗)的支架堆疊於另一所述支架上來實現極高容 量。將包含發射載體的農桿菌通過施用且隨後快速釋放真空滲透植物的所有空氣中的部 分。這迫使農桿菌滲透具有幾乎完全的葉子覆蓋的植物組織的整個冠層中。隨後，將靶蛋 白積累數天的時間(例如，約2到約14天，在一些實施例中約2到10天、3到7天、4到6 天等)。從種子到所採集的組織的整個過程通常需要數周(例如，小於6、5、4、3或2周；對 於幼苗通常約2周)。由於種子材料為非轉基因的，故種子的產生和存儲價格低廉和簡單易 懂，且對於有效按比例擴大無任何限制。因此有可能在大概數周內產生大量重組蛋白。必要時，可分離所產生的靶蛋白。加熱步驟可用於分離與熱穩定性載體融合的標 靶。其它純化法可包括各種分離和/或色譜分析步驟。舉例來說，可使用諸如硫酸銨沉澱、 PH值依賴性分離、尺寸排阻色普、離子交換色譜和親和色譜等步驟。本實例中所涵蓋的整個過程包括1)基因優化和合成；2)克隆到發射載體中；3) 植物材料和農桿菌培養物的製備；4)發芽幼苗的真空滲透；5)標靶表達；6)組織採集；和 7)標靶回收。為實現高通量生產，使這一過程的大部分自動化。具體來說，將使從非轉基 因種子播種和農桿菌培養物發酵到勻質化、澄清和均質化植物材料的體積減少的所有步驟(參看圖19)自動化。將設計和建造具有一批產生1.5公噸植物生物質能力的模塊。具體 來說，將構建圖20中概念性顯示的設備。圖20中所述的設備設計使用塔架的概念，從而使整個模塊可裝配於約5000平方 英尺的空間內。中央棚架單元提供必需的空間、光照和水源以生長1. 5公噸植物生物質。 自動監測並控制溼度、溫度和光照。在圖20所示的設計中，植物將在尺寸為1' X2'的託 盤中水栽培生長。因此，將使用約6000個託盤。可由36個可堆疊的個別存儲單元構建模 塊。各存儲單元將容納6X7X4個託盤。設計的模塊性允許可擴大生產。存在兩個將託盤 放入棚架且從棚架取出的自動機械(robot)，棚架每一側一個。自動播種是在適於水栽培生 長的材料上進行。當植物已達到適當的成熟度後，傳送帶將其輸送到滲透單元，其具有真空 室，所述真空室具有在約8小時內滲透1. 5公噸植物生物質的容量。漂洗單元將去除過量 的農桿菌培養物。在漂洗植物後，將其傳送回中央棚架單元以供數天的標靶積累。隨後，將 託盤傳送到採集植物並將其均質化的採集單元。隨後將均質化植物提取物輸送到下遊加工 單元。實例9 由含有病毒序列的農桿菌構築體表達HPV抗原可利用通過農桿菌滲透法得到的農桿菌介導的瞬時表達系統(特爾本(Turpen) 等人，1993，病毒學方法雜誌(J.Virol. Methods), 42:227) 0利用含有經工程改造以表達 LicKM-E7或LicKM-E7GGG的病毒載體的髮根農桿菌滲透本塞姆氏菸草的健康葉片。將髮根農桿菌菌株A4(ATCC43057)或根癌農桿菌(GV3103)用 構築體 pBI-D4-PRACS-LicKM-E7-KDEL、 pBI_D4_PRACS_LicKM_E7VAC、 pBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG-KDEL 和 pBI-D4-PRACS-LicKM-E7GGG_VAC 轉化。如所述使農 桿菌培養物生長並進行誘導(卡佩拉等人，1997，植物科學(Plant Sci.)，122 101)。28°C 下，使2ml引發培養物(starter-culture)(從新鮮菌落中揀選)在具有25 μ g/ml卡那黴 素的YEB(5g/l牛肉浸膏、lg/1酵母提取物、5g/l蛋白腖、5g/l蔗糖、2mM MgSO4)中生長整 夜。將引發培養物以1:500稀釋於500ml具有25 μ g/ml卡那黴素、10mM2-4(-嗎啉基)乙 烷磺酸(MES) (pH5. 6)、2mM額外MgSO4和20 μ M乙醯丁香酮的YEB中。隨後使經稀釋培養物 在28°C下生長整夜以達到約1. 7的0. D. 600。將細胞以3，000Xg離心15分鐘且將其再懸 浮於MMA培養基(MS鹽、IOmM MES (pH5. 6)、20g/l蔗糖、200 μ M乙醯丁香酮)中以達到2. 4 的0. D. 600，在室溫下保持1小時，且將其用於農桿菌滲透。使用無針頭一次性注射器將農 桿菌懸浮液注入本塞姆氏菸草葉片中。滲透後6天採集滲透的葉片。實例10 由含有病毒序列的農桿菌構築體表達炭疽抗原可利用通過農桿菌滲透法得到的農桿菌介導的瞬時表達系統來產生炭疽抗原。利 用含有經工程改造以表達LicKM或LicKM-PAD4的病毒載體的髮根農桿菌滲透本塞姆氏煙 草的健康葉片。所使用的載體為PBI-D4，即弓丨入農桿菌載體pBI 121中的病毒表達載體D4型 式。(陳(Chen)等人，2003，分子育種(Mol. Breed.)，11 :287。)將35S啟動子融合於病毒 序列的5'端。載體序列位於PBI121的BamHI與SacI位點之間。將錘頭核酶放於病毒序 列的3'端(特爾本(Turpen)等人，1993，病毒學方法雜誌(J. Virol. Methods)，42 227)。 這些構築體包括編碼LicKM-PAD4或LicKM的序列與編碼來自菸草PR-Ia蛋白的信號肽的 序列、6XHis標籤以及ER滯留錨定序列KDEL(參看SEQ ID N0. 10)的融合物。將髮根農桿菌菌株A4 (ATCC43057)用構築體pBI_D4-PRLicKM_PAD4K和pBI-D4-PRLicKMK轉化。如所述使農桿菌培養物生長並進行誘導(卡佩拉等人，1997，植物科學(Plant Sci.), 122:101)o 28°C下，使2ml引發培養物(從新鮮菌落中揀選)在具 有25 μ g/ml卡那黴素的YEB (5g/l牛肉浸膏、lg/1酵母提取物、5g/l蛋白腖、5g/l蔗糖、 2mM MgSO4)中生長整夜。將引發培養物以1:500稀釋於500ml具有25μ g/ml卡那黴素、 10mM2-4 (-嗎啉基)乙烷磺酸(MES) (ρΗ5· 6)、2mM額外MgSO4和20 μ M乙醯丁香酮的YEB中。 隨後使經稀釋培養物在28°C下生長整夜以達到約1. 7的0. D. 600。將細胞以3，OOOXg離 心15分鐘且將其再懸浮於MMA培養基(MS鹽、IOmM MES (pH5. 6)、20g/l蔗糖、200 μ M乙醯丁 香酮)中以達到2. 4的0. D. 600，在室溫下保持1小時，且將其用於農桿菌滲透。使用無針 頭一次性注射器將農桿菌懸浮液注入本塞姆氏菸草葉片中。滲透後6天採集滲透的葉片。實例11 由含有病毒序列的農桿菌構築體表達流感病毒抗原可利用通過農桿菌滲透法得到的農桿菌介導的瞬時表達系統來表達流感病毒 抗原。(特爾本等人，(1993)由創傷利用含有菸草花葉病毒的cDNA的根癌農桿菌接種 的整個植物的轉染(Transfection of whole plants from wounds inoculated with Agrobacteriumtumefaciens containing cDNA of tobacco mosaic virus)(病毒學方^去， 42:227。)利用含有經工程改造以表達LicKM-HA或LicKM-NA的病毒載體的髮根農桿菌滲 透本塞姆氏菸草的健康葉片。將髮根農桿菌菌株A4 (ATCC43057)用構築體 pBI-D4-PRACS-LicKM-HA-KDEL、 pB I-D4-PRACS-LicKM-HA-VAC、ρ B I-D4-P RAC S - LicKM-NA-KDEL 禾 P PBI-D4-PRACS-LicKM-NA-VAC轉化。如卡佩拉等人所述使農桿菌培養物生長並進行誘 導(卡佩拉 J. (Kapila J.)，德雷克 R. (De Rycke R.)，範蒙塔古 M. (Van Montagu Μ.) 和安吉儂G. (Angenon G.) (1997)針對完整葉片的農桿菌介導的瞬時基因表達系統 (AnAgrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.) 植物科學(Plant Sci.) 122，101-108)。28°C下，使2ml引發培養物(從新鮮菌落中揀選) 在具有25 μ g/ml卡那黴素的YEB (5g/l牛肉浸膏、lg/Ι酵母提取物、5g/l蛋白腖、5g/l蔗 糖、2mM MgSO4)中生長整夜。將引發培養物以1:500稀釋於500ml具有25μ g/ml卡那黴 素、10mM2-4 (-嗎啉基)乙烷磺酸(MES) (ρΗ5· 6)、2mM額外MgSO4和20 μ M乙醯丁香酮的YEB 中。隨後使經稀釋培養物在28°C下生長整夜以達到約1. 7的0. D. 600。將細胞以3，OOOXg 離心15分鐘且將其再懸浮於MMA培養基(MS鹽、IOmM MES (pH5. 6)、20g/l蔗糖、200 μ M乙 醯丁香酮)中以達到2. 4的0. D. 600，在室溫下保持1-3小時，且將其用於農桿菌滲透。使 用無針頭一次性注射器將農桿菌懸浮液注入本塞姆氏菸草葉片中。滲透後6天採集滲透的 葉片。可通過對地衣聚糖酶活性檢定和免疫印跡分析的評定針對靶抗原表達的存在篩選植 物。酶譜分析揭示在所測試的本塞姆氏菸草轉基因根中存在HA與NA嵌合蛋白的表 達。所述表達與地衣聚糖酶活性有關。與融合蛋白相關的活性譜帶顯示其比地衣聚糖酶對 照物的分子量高且與農桿菌感染後植物所表達的產物的分子量相同，證實完整融合產物的 存在。實例12 由含有病毒序列的農桿菌構築體表達流感病毒抗體其它實施例所屬領域技術人員將了解，前述代表本發明的某些優選實施例且不應將其解釋為限制如由以下權利要求書所界定的本發明精神或範圍.
權利要求
一種在幼苗中產生醫藥學活性蛋白質或多肽的方法，其包含以下步驟將豌豆幼苗與包括控制病毒序列轉錄的啟動子的農桿菌構築體融合，所述病毒序列載有編碼所關注的蛋白質或多肽的編碼序列；在足以允許從所述啟動子轉錄從而產生病毒轉錄物的條件下培養所述融合豌豆幼苗一段足以允許從所述啟動子轉錄從而產生病毒轉錄物的時間，所述病毒轉錄物包括編碼所關注的蛋白質或多肽的序列；在足以允許產生所述蛋白質或多肽的條件下培養所述融合豌豆幼苗一段足以允許產生所述蛋白質或多肽的時間。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述農桿菌構築體包含菸草花葉病毒、苜蓿花葉 病毒、花椰菜花葉病毒或上述任何組合的病毒序列。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述農桿菌構築體包含菸草花葉病毒的病毒序列。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述農桿菌構築體包含苜蓿花葉病毒的病毒序列。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述農桿菌構築體包含花椰菜花葉病毒的病毒序列。
6.根據權利要求1所述的方法，其中所述病毒序列處於花椰菜花葉病毒的35S啟動子 的控制下。
7.根據權利要求6所述的方法，其中所述花椰菜花葉病毒的35S啟動子在融合到所述 豌豆幼苗中後驅動重組病毒基因組的起始轉錄。
8.根據權利要求1所述的方法，其中所述控制病毒序列轉錄的啟動子為組成性啟動子。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述控制病毒序列轉錄的啟動子為可誘導啟動子。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述可誘導啟動子為熱休克啟動子。
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述可誘導啟動子為光可誘導啟動子。
12.根據權利要求9所述的方法，其中所述可誘導啟動子為化學可誘導啟動子。
13.根據權利要求1所述的方法，其中所述農桿菌構築體包含轉錄終止子。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述轉錄終止子為農桿菌(Agrobacterium)胭 脂鹼合成酶的轉錄終止子。
15.根據權利要求1所述的方法，其中所述農桿菌構築體包含一個或一個以上用於病 毒複製的基因。
16.根據權利要求1所述的方法，其中所述農桿菌構築體包含一個或一個以上用於細 胞到細胞運動的基因。
17.根據權利要求1所述的方法，其中所述所關注的蛋白質或多肽處於病毒mRNA啟動 子的轉錄控制下。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述病毒mRNA啟動子為外殼蛋白亞基因組 mRNA啟動子。
19.根據權利要求1所述的方法，其中所述農桿菌構築體包含左邊界和右邊界序列。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述左邊界和右邊界序列劃定在將豌豆幼苗與 所述農桿菌構築體融合後轉移到所述豌豆幼苗細胞中的所述農桿菌構築體區的界限。
21.根據權利要求1所述的方法，其中所述豌豆幼苗與多種構築體融合。
22.根據權利要求1所述的方法，其中所述豌豆幼苗選自由綠豌豆、比爾跳豆、黃夾豆、 斑點豌豆和綠豌豆組成的群組。
23.根據權利要求1所述的方法，其中所述所關注的蛋白質或多肽為胰島素。
24.根據權利要求1所述的方法，其中所述所關注的蛋白質或多肽為穀氨酸脫羧酶。
25.根據權利要求1所述的方法，其中所述所關注的蛋白質或多肽為酪氨酸磷酸酶樣 蛋白IA-2。
26.根據權利要求1所述的方法，其中所述所關注的蛋白質或多肽為綠色螢光蛋白。
27.根據權利要求1所述的方法，其中所述所關注的蛋白質或多肽為人類生長激素。
28.根據權利要求1所述的方法，其中所述所關注的蛋白質或多肽為炭疽毒素的一種 或一種以上組分。
29.根據權利要求28所述的方法，其中所述炭疽毒素的組分為保護性抗原。
30.根據權利要求29所述的方法，其中已引入使所述保護性抗原作為毒素無活性的突變。
31.根據權利要求28所述的方法，其中所述炭疽毒素的組分為致死因子。
32.根據權利要求31所述的方法，其中已引入使所述致死因子作為毒素無活性的突變。
33.根據權利要求1所述的方法，其中所述所關注的蛋白質或多肽包含地衣聚糖酶序列。
34.根據權利要求1所述的方法，其中所述融合豌豆幼苗是在水栽培生長條件下培養。
35.根據權利要求1所述的方法，其中每千克植物組織產生至少5克所述蛋白質或多肽。
36.根據權利要求1所述的方法，其中每千克植物組織產生至少約1克所述蛋白質或多肽。
37.根據權利要求1所述的方法，其中每千克植物組織產生至少約0.5克所述蛋白質或多肽。
38.根據權利要求1所述的方法，其中每千克植物組織產生至少約20-500毫克所述蛋 白質或多肽。
39.根據權利要求1所述的方法，其中所述足以允許產生所述蛋白質或多肽的時間為 從所述農桿菌構築體融合起至少約6周。
40.根據權利要求1所述的方法，其中所述足以允許產生所述蛋白質或多肽的時間為 從所述農桿菌構築體融合起至少約3周。
41.根據權利要求1所述的方法，其中所述足以允許產生所述蛋白質或多肽的時間為 從所述農桿菌構築體融合起至少約2周。41.根據權利要求1所述的方法，其中所述足以允許產生所述蛋白質或多肽的時間為 從所述農桿菌構築體融合起至少約1周。
42.根據權利要求1所述的方法，其中所述足以允許產生所述蛋白質或多肽的時間為從所述農桿菌構築體融合起至少約3天。
43.根據權利要求1所述的方法，其中所述足以允許產生所述蛋白質或多肽的時間為 從所述農桿菌構築體融合起至少約1天。
44.根據權利要求1所述的方法，其中所述幼苗為豌豆幼苗。
45.一種在菸草屬(Nicotiana)植株中產生醫藥學活性蛋白質或多肽的方法，其包含 以下步驟將菸草屬幼苗與包括控制病毒序列轉錄的啟動子的農桿菌構築體融合，所述病毒序列 載有編碼所關注的蛋白質或多肽的編碼序列；在足以允許從所述啟動子轉錄從而產生病毒轉錄物的條件下培養所述融合菸草屬幼 苗一段足以允許從所述啟動子轉錄從而產生病毒轉錄物的時間，所述病毒轉錄物包括編碼 所關注的蛋白質或多肽的編碼序列；在足以允許產生所述蛋白質或多肽的條件下培養所述融合菸草屬幼苗一段足以允許 產生所述蛋白質或多肽的時間。
全文摘要
本發明提供在幼苗中產生核酸或蛋白質的系統和方法。通常，所述幼苗是在封閉式可調控環境中生長。在一些實施例中，所述幼苗中醫藥學活性蛋白質的表達受外源誘導型啟動子或病毒啟動子控制。在一些實施例中，所述幼苗是可食用的並且能夠生食或優選採集活的幼苗以保留所述核酸或蛋白質的最大生物活性。在一些實施例中，所述幼苗為豌豆幼苗或菸草屬(Nicotiana)幼苗。
文檔編號C12N15/05GK101815784SQ200780007805
公開日2010年8月25日 申請日期2007年2月13日 優先權日2006年2月13日
發明者瓦季姆·梅特, 穆奈姆·沙勞爾, 維達季·尤西波夫, 莎伊拉賈·拉賓德拉 申請人:美國弗勞恩霍夫股份有限公司