編碼乙醯乳酸合酶基因的基因的製作方法

2023-06-12 15:52:41 2

專利名稱：編碼乙醯乳酸合酶基因的基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及編碼乙醯乳酸合酶的基因，乙醯乳酸合酶是支鏈胺基酸生物合成途徑中的一種限速酶。
背景技術：
乙醯乳酸合酶(下文稱為「ALS」)是支鏈胺基酸例如亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸生物合成途徑中的一種限速酶，被認為是植物生長的必需酶。另外，已知ALS存在於各種各樣的高等植物中。另外，ALS存在於各種微生物例如酶母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))、大腸桿菌(Escherichia coli)和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurlum)中。
已知在大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌中存在三種類型的ALS同工酶。這些同工酶中的每種是一種由控制酶催化活性的大分子量催化亞基和通過結合支鏈胺基酸而作為調節蛋白起作用的小分子量調節亞基構成的異寡聚體(Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998)。催化亞基分別位於Ilv IH、Ilv GM和Ilv BN操縱子上。另一方面，酵母ALS是單酶，包含一個催化亞基和一個調節亞基，在細菌中的情況也是如此(Pang等，Biochemistry，38，5222-5231)。所述催化蛋白亞基位於基因座ILV2上。
在植物中，已知ALS包含催化亞基和調節亞基，在上述微生物中的情況也是如此(Hershey等，Plant Molecular Biology，40，795-806，1999)。例如，菸草(雙子葉植物)中ALS的催化亞基由兩個基因座-SuRA和SuRB編碼(Lee等，EMBO J.7，1241-1248，1988)；玉米中ALS的催化亞基由兩個基因座-als1和als2編碼(Burr等，Trendsin Genetics7，55-61，1991；Lawrence等，Plant Mol.Biol.18，1185-1187，1992)。已完全測定了雙子葉植物包括菸草、擬南芥屬(Arabidopsis)、油菜、棉花、蒼耳屬(Xanthium)、莧屬(Amaranthus)和地膚(Kochia)的編碼催化亞基的基因的核苷酸序列(參見Chipman等，Biochim.Biophys.Acta.1385，401-419，1998和專利申請WO97/08327的PCT國際出版物的國內再版)。然而，玉米是其核苷酸序列已被完全確定的唯一單子葉植物。
已知除草劑例如磺脲除草劑、咪唑啉酮除草劑、三唑並嘧啶除草劑和嘧啶基羧基除草劑(下文稱為「PC」除草劑)通過抑制ALS而抑制植物生長(Ray，Plant Physiol.75，827-831，1984；Shaner等，Plant Physiol.76，545-546，1984；Subramanian等，Plant Physiol.96，310-313，1991；Shimizu等，J.Pestic.Sci.19，59-67，1994)。
已知對這些除草劑具有抗性的植物含有一種編碼ALS的基因，該基因包括在不同物種中保守的區域內誘導一個或兩個胺基酸取代的一個或兩個核苷酸取代。這種基因的實例包括編碼對磺脲除草劑具有特異性抗性的ALS的基因(參見Kathleen等，EMBO J.7，1241-1248，1988；Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Guttieri等，Weed Sci.43，175-178，1995；Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995和日本專利申請特開昭63-71184號)；編碼對咪唑啉酮除草劑具有特異性抗性的ALS的基因(Mourad等，Planta，188，491-497，1992；Lee等，FEBS Lett.452，341-345，1999和日本專利申請特開平5-227964號)；和編碼對磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑兩者均具有抗性的ALS的基因(參見Kathleen等，EMBO J.7，1241-1248，1988；Bemasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995；Hattori等，Mol.Gen.Genet.246，419-425，1995；Alison等，Plant Physiol.111，1353，1996；Rajasekarau等，Plant Sci.119，115-124，1996，日本專利申請特開昭63-71184號，日本專利申請特開平4-311392號和Bemasconi等，美國專利5633437，1997)。還已知顯示抗磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑兩者的ALS，顯示對PC除草劑和三唑並嘧啶除草劑有交叉抗性(Bernasconi等，J.Biol.Chem.270，17381-17385，1995)。此外，已經嘗試通過將具有顯示特異性地抗磺脲除草劑的ALS的植物與具有顯示特異性地抗咪唑啉酮除草劑的ALS的植物雜交，產生顯示抗磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑兩者的植物體(Mourad等，Mol.Gen.Genet，243，178-184，1994)。而且，已經嘗試將編碼ALS的基因人工改變成除草劑抗性基因(Ott等，J.Mol.Biol.263，359-368，1996，日本專利申請特開昭63-71184號，日本專利申請特開平5-227964號，日本專利申請特表平11-504213號)，致使已經發現單個胺基酸缺失可使ALS顯示既抗磺脲除草劑又抗咪唑啉酮除草劑(日本專利申請特開平5-227964號)。
如上所述，對具有除草劑抗性的ALS和編碼ALS的基因已經進行了積極的研究。然而，針對抗PC除草劑抗性和涉及對PC除草劑具有特異性抗性的突變型ALS基因尚未見報導。
發明概述本發明的目的是提供編碼對PC除草劑顯示極高抗性的ALS蛋白的基因、由所述基因編碼的ALS蛋白、具有所述基因的重組載體、具有所述重組載體的轉化體、具有所述基因的植物、培育所述植物的方法以及使用所述基因作為選擇標記來選擇轉化細胞的方法。
作為進行透徹的研究以達到上述目的的結果，我們發現用某種胺基酸取代野生型ALS的某個胺基酸殘基而從所述野生型ALS獲得的突變型ALS對PC除草劑顯示極高的抗性，從而完成了本發明。
(1)本發明是一種編碼以下蛋白質(a)或(b)的基因(a)一種包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的蛋白質；(b)一種包含從SEQ ID NO1的胺基酸序列由於取代、缺失或添加至少一個或多個胺基酸而獲得的胺基酸序列的蛋白質，該蛋白質具有對嘧啶基羧基除草劑的抗性以及具有乙醯乳酸合酶活性。
(2)此外，本發明是一種由(1)的基因編碼的乙醯乳酸合酶蛋白。
(3)此外，本發明是一種具有(1)的基因的重組載體。
(4)此外，本發明是一種具有(3)的重組載體的轉化體。
(5)此外，本發明是一種具有(1)的基因並且對嘧啶基羧基除草劑具有抗性的植物。
(6)本發明是一種培育(5)的植物的方法，所述方法包括在嘧啶基羧基除草劑存在下培育所述植物。
(7)本發明是一種使用(1)的基因作為選擇標記來選擇具有該基因的轉化細胞的方法。
附圖簡述

圖1顯示突變型ALS蛋白的胺基酸序列和野生型ALS蛋白的胺基酸序列之間的比較。
圖2顯示突變型ALS基因的核苷酸序列和野生型ALS基因的核苷酸序列之間的比較。
圖3是顯示抗性突變體對雙草醚(bispyribac-sodium)敏感性的特徵圖。
圖4是顯示野生型對雙草醚敏感性的特徵圖。
圖5是顯示野生型對氯磺隆(chlorsulfuron)敏感性的特徵圖。
圖6是顯示抗性突變體對氯磺隆敏感性的特徵圖。
圖7是顯示從野生型提取的粗製ALS蛋白的陰離子交換色譜的特徵圖。
圖8是顯示野生型ALS蛋白和突變蛋白對雙草醚敏感性的特徵圖。
圖9是顯示野生型ALS蛋白和突變蛋白對氯磺隆敏感性的特徵圖。
圖10是顯示野生型ALS蛋白和突變蛋白對咪唑喹啉酸(imazaquin)敏感性的特徵圖。
圖11顯示水稻(Nippon-bare)EST和玉米ALS基因之間核苷酸序列的比較。
圖12是顯示實施例4中獲得的粗製ALS對雙草醚所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖13是顯示實施例4中獲得的粗製ALS對氯磺隆所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖14是顯示實施例4中獲得的粗製ALS對嘧草硫醚(pyrithiobac-sodium)所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖15是顯示實施例4中獲得的粗製ALS對pyriminobac所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖16是顯示實施例4中獲得的粗製ALS對苄嘧磺隆(bensulfuron-methyl)所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖17是顯示實施例4中獲得的粗製ALS對乙基吡磺隆(pyrazosulfuron-ethyl)所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖18是顯示實施例4中獲得的粗製ALS對唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖19是顯示實施例4中獲得的粗製ALS對咪唑喹啉酸所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖20是顯示實施例4中獲得的粗製ALS對咪唑煙酸(imazapyr)所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖21是顯示實施例4中獲得的粗製野生型ALS、純化野生型GST-ALS和野生型無GST ALS對雙草醚所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖22是顯示實施例4中獲得的粗製突變型ALS和純化突變型GST-ALS對雙草醚所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖23是顯示實施例4中獲得的粗製突變型ALS和純化突變型GST-ALS對氯磺隆所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖24是顯示實施例4中獲得的粗製突變型ALS和純化突變型GST-ALS對咪唑喹啉酸所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖25顯示產生僅具有W548L突變的ALS基因的構思。
圖26是圖25的續圖，顯示產生僅具有W548L突變的ALS基因的構思。
圖27是顯示實施例6(2)中獲得的粗製ALS對雙草醚所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖28是顯示實施例6(2)中獲得的粗製ALS對氯磺隆所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖29是顯示實施例6(2)中獲得的粗製ALS對咪唑喹啉酸所觀察到的敏感性的特徵圖。
圖30顯示構建實施例7中構建的雙元載體的構思。
圖31是一張電泳照片，藉此證實在從大腸桿菌(E.coli)(JM109)的單個菌落中分離的質粒中有所述ALS基因插入片段，其中第1泳道表λHind III/100bp DNA標記，第2泳道表示來源於已經用保留突變型ALS基因的pMLH7133轉化的大腸桿菌的質粒，第3泳道表示來源於已經用保留野生型ALS基因的pMLH7133轉化的大腸桿菌的質粒，第4泳道表示保留GUS基因的pMLH7133(對照組)，箭頭指示插入DNA。
圖32是一張電泳照片，顯示用質粒DNA作為模板的PCR結果，其中第1泳道表示λHindIII/100bp DNA標記，第2泳道和第5泳道表示保留野生型ALS基因的pBI 121質粒(對照組)，第3泳道和第6泳道表示被認為保留突變型ALS基因的pMLH7133，第4泳道和第7泳道表示被認為保留野生型ALS基因的pMLH7133，箭頭指示PCR產物。
圖33是一張電泳照片，顯示證明ALS基因插入方向的結果，其中第1泳道表示λHindIII/100bp DNA標記，第2泳道表示保留突變型ALS基因的pMLH7133，第3泳道表示保留野生型ALS基因的pMLH7133，第4泳道表示保留GUS基因的pMLH7133(對照組)，箭頭指示PCR產物。
圖34是一幅流程圖，說明用土壤桿菌(Agrobacterium)轉化水稻植株(Nippon-bare)的方法。
圖35是一張照片，顯示由愈傷組織正進行再分化的水稻植株(Nippon-bare)。
圖36是顯示用突變型ALS基因轉化的水稻植株(Nippon-bare)愈傷組織的雙草醚敏感性的特徵圖。
圖37是顯示野生型水稻植株(Nippon-bare)愈傷組織的雙草醚敏感性的特徵圖。
圖38是一張電泳照片，顯示使用從轉化愈傷組織製備的基因組DNA進行的PCR結果，其中第1泳道表示λHindIII/100bp DNA標記，第2-7泳道表示使用來源於不同愈傷組織的基因組DNA的相應PCR結果，箭頭指示PCR產物。
圖39是顯示使用從轉化愈傷組織製備的基因組DNA作為模板通過PCR產生的PCR產物測序結果的特徵圖，其中A表示使用有義引物(3-1-4)對胺基酸殘基548周圍進行分析的結果，B表示使用反義引物(ALS-Rsp2)對胺基酸殘基548周圍進行分析的結果，C表示使用有義引物(3-1-4)對胺基酸殘基627周圍進行分析的結果，D表示使用反義引物(ALS-Rsp2)對胺基酸殘基627周圍進行分析的結果。
圖40是一張照片，顯示用突變型ALS基因轉化的水稻植株(Nippon-bare)的雙草醚敏感性的測量結果，其中A表示用突變型ALS基因轉化的水稻植株，而B表示用野生型ALS基因轉化的水稻植株。
發明詳述將給出對本發明更加詳細的解釋。
本發明的乙醯乳酸合酶蛋白(下文稱為「突變型ALS蛋白」)可以通過使在水稻植株中表達的野生型ALS蛋白中的某個位點發生突變而獲得。本發明突變型ALS蛋白的胺基酸序列以SEQ ID NO1表示。編碼本發明ALS蛋白的基因的核苷酸序列以SEQ ID NO2表示。
所述突變型ALS蛋白通過色氨酸548被亮氨酸取代、絲氨酸627被異亮氨酸取代而從野生型ALS蛋白衍生。圖1顯示突變型ALS蛋白的胺基酸序列和野生型ALS蛋白的胺基酸序列的比較結果。在圖1中，第1行的胺基酸序列表示突變型ALS蛋白，而第2行的胺基酸序列表示野生型ALS蛋白。
與編碼野生型ALS蛋白的基因相比，編碼突變型ALS蛋白的基因(SEQ ID NO2)含有取代，即編碼色氨酸548的密碼子被編碼亮氨酸的密碼子取代以及編碼絲氨酸627的密碼子被編碼異亮氨酸的密碼子取代。圖2顯示編碼突變型ALS蛋白的基因的核苷酸序列和編碼野生型ALS蛋白的基因的核苷酸序列的比較結果。在圖2中，第1行的核苷酸序列表示突變型ALS蛋白，而第2行的核苷酸序列表示野生型ALS蛋白。
可以通過將如上所述的突變引入在日本型水稻變種Kinmaze基因組DNA中存在的編碼野生型ALS蛋白的基因中，獲得編碼突變型ALS蛋白的基因。為了引入突變，可以使用已知的標準技術。例如，可以使用定點誘變。可以採用商業試劑盒例如Mutan-K(Takara Shuzo)、Gene Editor(Promega)或Exsite(Stratagene)進行定點誘變。
另外，在PC除草劑存在下通過培養對PC除草劑敏感的野生型培養細胞，然後選擇出現並顯示對所述PC除草劑有抗性的突變培養細胞，可以獲得編碼突變型ALS蛋白的基因。
首先，從對PC除草劑有抗性的突變培養細胞製備mRNA，合成cDNA，然後產生λgt 11噬菌體的cDNA文庫(該文庫被認為具有抗性特性雜合性)。然後，使用含有編碼野生型ALS蛋白的基因的一部分的核酸探針[EST(Expression Sequence Tag(已表達序列標誌)，Genband，DDBJ和EMBL登記號C72411)，得自日本型水稻變種Nippon-bare]，對所述文庫進行篩選。接著，將所得的陽性克隆的插入DNA亞克隆到pBluescript II SK+中，以測定核苷酸序列。選擇具有編碼SEQ ID NO1的胺基酸序列的插入DNA的克隆，使得能夠獲得編碼突變型ALS蛋白的基因。另外，將包含已摻入了編碼突變型ALS蛋白的基因的pBluescript II SK+的質粒根據布達佩斯條約於2000年11月2日保藏於獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心(Patent and Bio-Resource Center，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology)(Chuo-6，1-1-1，Higashi，Tsukuba-shi，Ibaraki，JAPAN)，作為pBluescript II SK+中的突變型ALS cDNA保藏(FERM BP-7348)。
與野生型ALS蛋白相比，所述突變型ALS蛋白不僅對PC除草劑具有良好的抗性，而且對磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑也具有良好的抗性。特別是，所述突變型ALS蛋白對PC除草劑具有高水平的抗性。這可以通過將編碼突變型ALS蛋白的基因摻入到例如大腸桿菌的表達載體中，然後檢查用所述表達載體轉化的大腸桿菌對所述除草劑的敏感性來確定。
PC除草劑的實例包括由以下化學式1表示的雙草醚、嘧草硫醚和pyriminobac。
雙草醚 嘧草硫醚 pyriminobac
磺脲除草劑的實例包括由以下化學式2表示的氯磺隆、苄嘧磺隆、乙基吡磺隆和唑吡嘧磺隆。
氯磺隆苄嘧磺隆 乙基吡磺隆唑吡嘧磺隆咪唑啉酮除草劑的實例包括由以下化學式3表示的咪唑喹啉酸和咪唑煙酸。
咪唑喹啉酸 咪唑煙酸用編碼突變型ALS蛋白的基因轉化靶植物，可以給所述植物賦予對PC除草劑的抗性。可以用已知的標準技術來轉化植物。例如，可以用根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)將外源基因導入靶植物細胞中。
更具體地講，將編碼突變型ALS蛋白的基因插入到含有土壤桿菌Ti質粒的T-DNA序列的雙元載體中。將Ti質粒轉化到大腸桿菌等中。然後，將由例如大腸桿菌複製的含有編碼突變型ALS蛋白的基因的雙元載體轉化到含有輔助質粒的土壤桿菌中。用所述土壤桿菌感染靶植物，然後鑑定轉化植物。當經鑑定的轉化植物是培養細胞時，則可以用已知的標準技術，將所述植物細胞再生為完整的植株。
為了用編碼突變型ALS蛋白的基因轉化靶植物，可以用已知的標準技術直接導入所述基因。用含有編碼突變型ALS蛋白的基因的表達載體轉化的方法的實例包括聚乙二醇法、電穿孔法和粒子槍法(particlegun method)。
可以將編碼突變型ALS蛋白的基因轉化到任何類型的植物例如單子葉植物和雙子葉植物中。用編碼突變型ALS蛋白的基因轉化的靶作物的實例包括水稻、玉米、小麥、大麥、大豆、棉花、油菜、甜菜和菸草。另外，草坪草、樹等也可以通過導入編碼突變型ALS蛋白的基因而被轉化。
在任一上述情況下，用編碼突變型ALS蛋白的基因轉化植物可以給所述植物賦予對PC除草劑、磺脲除草劑和咪唑啉酮除草劑的抗性。
此外，編碼突變型ALS蛋白的基因也可在植物轉化實驗中作為選擇標記使用。例如為了用目標基因轉化植物，可以將含有編碼突變型ALS蛋白的基因和目標基因的載體導入植物細胞中，然後在PC除草劑存在下培養所述植物細胞。因此，在PC除草劑存在下存活下來的植物細胞指示其含有其中導入的編碼突變型ALS蛋白的基因和目標基因。此外，目標基因和編碼突變型ALS蛋白的基因是否摻入到植物細胞染色體中，可以先通過觀察植物的表型，然後通過基因組DNA雜交或PCR檢查基因組上的這些基因存在與否而得到證實。
實施例現在，通過以下實施例進一步描述本發明，但是本發明的技術範圍不受這些實施例的限制。
實施例1抗PC除草劑的水稻(Kinmaze)培養細胞的產生除去水稻種子(變種；Kinmaze，學名Oryza sativa var.Kinmaze)的穀殼。將種子浸泡在70％乙醇中達5分鐘，然後浸泡在約5％安替佛民中達20分鐘，接著用無菌蒸餾水洗滌數次。然後，將種子在具有表1
所示組成的培養基上靜止培養。
表1
在以上培養基組成中，2，4-D是合成植物生長素。為了製備所述培養基，首先，將具有以上組成的培養基置於1L號燒杯中，然後向燒杯中加入蒸餾水至1000ml。接著，將溶液調至pH 5.7，補充3g脫乙醯吉蘭糖膠(Gelrite)。通過用微波爐加熱使Gelrite充分溶解，然後用移液管向培養瓶中每次加入30ml混合物。隨後，用三層鋁箔封上培養瓶，然後在高壓滅菌鍋中於121℃15-20分鐘加熱滅菌。最後，讓溶液冷卻至室溫，從而製備供靜止培養上述種子用的培養基。
接著，從在培養基上誘導的愈傷組織中取出胚乳部分，然後進行傳代培養。然後，將所得的愈傷組織的一部分傳代培養，也就是說，每兩周一次在補充1μM雙草醚(一種PC除草劑)的液體培養基(培養基組成與表1中所示的組成相同，但不補充Gelrite)中連續培養。2-6周後，培養細胞開始凋亡。約2個月後，從其中大多數已經死亡和變成褐色的培養細胞群體中獲得認為正在進行細胞分裂的多個不變色的細胞團。分離這些細胞團，進行培養，從而獲得在2μM雙草醚存在下可以增殖的多個細胞系。
隨後，將所得的多個細胞系在雙草醚濃度依次升高的情況下進行培養。結果，獲得在100μM雙草醚存在下可以增殖的細胞系。將雙草醚抗性培養細胞(下文稱為抗性突變體)在補充100μM雙草醚的MS-2，4-D固體培養基上傳代培養。取出一部分傳代培養抗性突變體作為樣品，將其加入到未補充雙草醚的MS-2，4-D液體培養基中，然後以8-10天的循環進行懸浮細胞培養。
將約1.5g(溼重)抗性突變體移植到補充50ml MS-2，4-D液體培養基和適當濃度的雙草醚的200ml錐形瓶中，然後在大約27℃下培養適當時間。定期測量愈傷組織的溼重。根據移植抗性突變體的溼重確定增加的相對量。另外，用不同的雙草醚濃度進行三次實驗，計算標準誤差。圖3顯示雙草醚濃度變化和抗性突變體第8天相對重量之間的關係。作為對照，用野生型(Kinmaze)進行相似的實驗。圖4顯示雙草醚濃度和第8天相對重量之間關係的測量結果。
如圖4所示，野生型的生長在補充1nM雙草醚的組中不受抑制，但在補充10nM或10nM以上雙草醚的組中受到抑制。然而，如圖3所示，抗性突變體的生長甚至在補充10μM雙草醚的組中也幾乎不受影響。
如上所述測定野生型和抗性突變體的生長率，只是用氯磺隆來代替雙草醚。圖5顯示氯磺隆濃度變化和野生型第9天相對重量之間的關係。圖6顯示氯磺隆濃度變化和抗性突變體第9天相對重量之間的關係。
如圖5所示，野生型的生長在加入1nM氯磺隆時受到抑制，表明野生型對氯磺隆比對雙草醚的敏感性更高。然而，如圖6所示，抗性突變體的生長在加入1μM氯磺隆時受到強抑制。對雙草醚和氯磺隆的敏感性在野生型和抗性突變體兩者間幾乎沒有變化，甚至經歷較長的培養時間也是如此。野生型和抗性突變體的生長率幾乎相同。
這些結果表明，所述抗性突變體具有對雙草醚的特異性抗性。而且，與野生型相比，表明所述抗性突變體已改進對氯磺隆的抗性。
實施例2從抗性突變體中部分純化的ALS酶的除草劑敏感性在本實施例中，從實施例1中獲得的抗性突變體中部分純化突變型ALS蛋白，然後檢查所得的突變型ALS蛋白的除草劑敏感性。如下部分純化突變型ALS蛋白。
首先，通過液體培養方法(不補充雙草醚)製備200g或200g以上的抗性突變體，培養基的組成與表1中所示的組成相同，但是不含Gelrite。然後，使用Hiscotron，在體積3倍於組織體積的緩衝液1[100mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.5)，含有20％(v/v)甘油、0.5mM焦磷酸硫胺素(TPP)、10μM黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、0.5mM MgCl2和體積為組織體積的1/10的聚乙烯聚吡咯烷酮，將約150g抗性突變體勻漿。勻漿液通過尼龍網過濾，然後以15,000×g離心20分鐘。向經離心的上清液中加入硫酸銨至50％飽和，然後讓其在冰中靜置約1小時。將混合物再次以15,000×g離心20分鐘，然後將沉澱部分溶於約30ml緩衝液2[10mM Tris鹽酸緩衝液(pH 7.5)，含有20％(v/v)甘油、0.5mMTPP和0.5mM MgCl2]中。將混合物再次以15,000×g離心20分鐘，然後將上清液部分上樣至Sephadex G-25(Amersham Pharmacia Biotec)上。收集通過該柱的約40ml流分作為粗製酶溶液。
接著，依照Bio-Rad Protein Assay手冊的Bradford方法，測定所述粗製酶溶液的蛋白質濃度。然後將所述粗製酶溶液通過Whatman濾膜(Whatman)過濾，然後使用FPLC裝置(Amersham Pharmacia Biotec)，將所述含適量蛋白的粗製酶溶液(10-15ml)上樣至三個垂直連接的HiTrap Q柱(Amersham Pharmacia Biotec)上。用HiTrap Q吸附蛋白質組分後，用體積3-5倍於床體積的緩衝液-2洗出非吸附流分。然後，用體積10倍於床體積的洗脫液(150ml)洗脫吸附蛋白質組分。在此，通過將線性濃度梯度(0-0.4M)的KCl溶於緩衝液-2中，製備洗脫液。含有被洗脫的蛋白質組分的洗出物以各5ml分配到多個分裝用試管中。此外，為了穩定在洗脫的蛋白質組分中所含有的ALS酶，向各個分裝用試管中預先加入了0.5ml含20mM丙酮酸鈉的緩衝液-2。
如下測定分配到各個分裝用試管的洗脫流分中所含有的突變型ALS蛋白所產生的ALS活性。通過將待測量的洗脫流分與包含20mM丙酮酸鈉、0.5mM TPP、0.5mM MgCl2、10μM FAD和20mM磷酸鉀緩衝液(pH 7.5)的溶液混合，製備測定反應中所用的反應溶液。使用1ml該反應溶液。在加入待測量的洗脫流分後，讓測定反應於30℃進行40-60分鐘。然後，通過加入0.1ml 6N硫酸(或0.25N氫氧化鈉)終止反應。
終止反應後，將反應溶液於60℃保溫10分鐘，從而使反應溶液中所含有的乙醯乳酸轉化為乙偶姻。
然後，為了定量測定反應溶液中所含有的乙偶姻，向反應溶液中加入溶於2.5N氫氧化鈉中的1ml 0.5％(w/v)肌酸和1ml 5％(w/v)α-萘酚，然後於37℃保溫10分鐘。然後通過對反應溶液吸光度(525 nm)的比色，對乙偶姻定量，從而評價ALS活性。另外，由於反應溶液含有少量的丙酮酸鈉，因此用反應時間0作為對照。
結果，OD525nm的吸光度每0.2ml反應溶液高達約7。然而，當上述測定反應用氫氧化鈉終止，並且檢查由於除ALS活性以外的活性引起的乙偶姻產生活性時，接近80％的表觀ALS活性來自不是由於突變型ALS蛋白的活性所致的直接乙偶姻產生活性。因此，採用陰離子交換樹脂，通過FPLC，將突變型ALS蛋白和其它蛋白的乙偶姻產生活性分離開來。結果，如圖7所示，檢測到兩個活性峰。
為了確定這兩個活性峰的哪一個峰對應於突變型ALS蛋白，檢查這兩個峰的乙偶姻產生活性。因而發現較早出現的峰所示流分對應於突變型ALS蛋白。
應用含有突變型ALS蛋白的酶溶液，檢查突變型ALS蛋白對雙草醚、氯磺隆和咪唑喹啉酸的敏感性。通過以與在上述測定反應中相同的方式測定ALS活性，只是在加入酶溶液之前加入一定濃度的除草劑，評價對這些除草劑中每種的敏感性。為了進行比較，以同樣的方式分離純化野生型ALS蛋白，然後用於實驗。另外，將雙草醚製成水溶液，而將氯磺隆和咪唑喹啉酸製成丙酮溶液。反應混合物中丙酮的終濃度為1％。
圖8顯示ALS活性抑制率和雙草醚濃度之間的關係。圖9顯示ALS活性抑制率和氯磺隆濃度之間的關係。圖10顯示ALS活性抑制率和咪唑喹啉酸濃度之間的關係。在圖8-10中，連接白色方塊的折線表示野生型ALS蛋白，連接黑色方塊的折線表示突變型ALS蛋白。
依照概率單位分析，計算抑制ALS活性的50％的除草劑濃度(I50)，從而計算突變型ALS蛋白的I50與野生型ALS蛋白的I50之比。
表2顯示該結果。
a)50％抑制的濃度b)根據表1中抑制活性計算I50(抗性突變體)/I50(野生型)如圖8-10和表2中所示，當與野生型ALS蛋白相比時，突變型ALS蛋白甚至在所述除草劑存在下都顯示相對高的ALS活性。尤其是，在突變型ALS蛋白和野生型ALS蛋白之間的最顯著性差異是對雙草醚除草劑的敏感性。也就是說，突變型ALS蛋白具有對雙草醚的良好抗性。
實施例3突變型ALS基因的克隆如下製備克隆編碼來自抗性突變體的突變型ALS蛋白的基因(突變型ALS基因)所用的探針。在該實施例中用作探針的部分cDNA來源於顯示與玉米ALS基因有高度同源性的水稻(Nippon-bare)。
(1)來源於顯示與玉米ALS基因有高度同源性的水稻(Nippon-bare)的部分cDNA核苷酸序列的測定作為由the Society for Techno-inmovation of Agriculture，Forestry andFisheries和National Institute of Agrobiological Sciences進行的the IneGenome Project(Ine基因組計劃)的一部分，已經測定了水稻(Nippon-bare)cDNA的部分核苷酸序列，並且已經建立cDNA的部分核苷酸序列資料庫。在該資料庫中所含有的已知約350bp的核苷酸序列的cDNA克隆(登記號C72411)顯示與玉米ALS基因有高度同源性。已對玉米ALS基因進行了全測序。
該cDNA克隆(登記號C72411)得自National Institute ofAgrobiological Sciences，如下測定核苷酸序列。在此，所述cDNA克隆包含插入到pBluescript II SK+中的ALS同系物基因，並且在大腸桿菌(E.coli)中能夠自主複製。
首先，將保留所述ALS同系物的質粒載體轉化到大腸桿菌DH5α中。將從平板中獲得的白色菌落在液體中培養，然後用標準技術從細胞中提取質粒。由於已經將所述插入DNA插入在SalI和NotI(質粒載體中多克隆位點的限制性酶)之間，因此用這兩種酶消化載體。通過瓊脂糖電泳證實插入片段。然後，使用例如RNA酶A、PEG和LiCl，通過標準技術純化所得的保留所述ALS同系物的質粒載體，然後採用引物和ABI BigDyeTerminator Cycle Sequencing Kit進行測序反應。PCR反應條件採用生產商的方案。此中所用的引物是M13引物和根據已測定的核苷酸序列設計的合成引物。通過乙醇沉澱純化所得的PCR產物，然後用ABI PRISM 310測序儀測定其核苷酸序列。
已知保留所述ALS同系物的質粒載體含有長度為1.6kb的插入DNA。將所得的保留所述ALS同系物的質粒載體用限制性酶SalI和NotI消化，然後進行電泳。因此，檢測出一條對應於pBluescript II SK+的約3kbp條帶和一條對應於所述插入DNA片段的約1.6kbp條帶(未顯示)。測定所述插入DNA部分的完整的核苷酸序列，搜索其與玉米核苷酸序列的同源性。如圖11所示，發現有84.7％同源性。由於測定ALS同系物是所述Nippon-bare變種ALS基因的部分cDNA，因此，將用SalI和NotI消化的所述插入DNA用作探針。此外，在圖11中，第一行是所述Nippon-bare變種ALS基因的部分cDNA的核苷酸序列；第二行是玉米ALS基因的部分cDNA的核苷酸序列。
(2)從抗性突變體製備mRNA首先，將用液氮冷凍的抗性突變體用研缽和研棒壓碎，然後用攪拌機充分搗碎30秒。將搗碎的粉末懸浮於提取緩衝液[(100mM Tris-HCl pH9.0、100mM NaCl、1wt％SDS、5mM EDTA)∶(β-巰基乙醇)∶(Tris飽和的苯酚)＝15∶3∶20]，然後充分攪拌。將該溶液以12,000×g離心15分鐘，然後收集上清液。向上清液中加入200ml PCI[(Tris飽和的苯酚)∶(氯仿)∶(異戊醇)＝25∶24∶1]，於4℃振搖10分鐘，以12,000×g離心15分鐘，然後收集上清液。重複該程序兩次。加入1/20體積的5M NaCl和2.2倍體積的乙醇至所得的上清液中，然後讓混合物於-80℃靜置30分鐘。通過以12,000×g離心5分鐘收集沉澱。將沉澱用70％乙醇洗滌，乾燥，然後溶於10mM β-巰基乙醇溶液中。接著，將溶液以27,000×g離心10分鐘，以除去不溶性部分。向溶液中加入1/4體積的10M LiCl，然後讓其在冰上靜置1小時。此外，將溶液以27,000×g離心10分鐘，以收集沉澱，溶於4ml H2O中，然後測量260nm的吸光度，以測定RNA的濃度。加入1/20體積的5M NaCl和2.2倍體積的乙醇至溶液中，然後讓其於-80℃靜置30分鐘。隨後，將溶液以27,000×g離心10分鐘，以收集沉澱，然後用70％乙醇洗滌，然後乾燥。將所得的產物溶於適量的H2O中，以獲得總RNA溶液。在此，於4℃進行離心。
用以下方法從總RNA中分離純化mRNA。加入相當於所提取的總RNA溶液體積的2×結合緩衝液(20mM Tris-HCl pH 7.5，10mMEDTA，1M NaCl)至所提取的總RNA溶液中。用1×結合緩衝液洗滌填充0.1g寡聚dT纖維素(Amersham Pharmacia Biotec)的柱子，然後將總RNA溶液上樣至該柱上。用1×結合緩衝液洗滌該柱後，加入洗脫緩衝液(10mM Tris-HCl pH 7.5，5mM EDTA)，以一次0.5ml收集洗出物。將通過該柱的流分上樣至另一寡dT纖維素(Amersham PharmaciaBiotec)柱上，以同樣的方式處理。根據每個流分的吸光度計算洗脫mRNA的濃度後，加入1/10體積的10M LiCl和2.5倍體積的乙醇至產物中，然後讓混合物於-80℃靜置30分鐘。接著，將混合物離心，將沉澱的級分乾燥，溶於100μl H2O中。如此獲得的mRNA通過蔗糖密度梯度離心進行大小分級分離。
將分離純化的mRNA加到裝有由25％蔗糖溶液和5％蔗糖溶液給出的密度梯度的離心管中，然後使用甩平式轉子於4℃以27,000rpm超離心15小時。離心後，以密度梯度順序以0.5ml收集各級分。測量各級分的吸光度，計算收集的mRNA的濃度，通過使用ECL試劑盒(ECL直接核酸標記和檢測系統，Amersham Pharmacia Biotec)證實ALSmRNA的存在。使用以上(1)中製備的探針於42℃雜交16小時。雜交後，用試劑盒提供的原始洗滌緩衝液於42℃洗滌兩次，每次5分鐘，然後用2×SSC溶液於42℃洗滌一次，洗滌5分鐘。用透明塑料膜包裹經洗滌的膜，將其浸入試劑盒提供的所附發光試劑中，然後對X光膠片曝光。
從抗性突變體提取約35mg總RNA，並且通過上述方法可以提取約4mg mRNA。此外，在蔗糖密度梯度離心中，發現預期陽性的級分的雜交陽性點。
當使用野生型時，除提取約7mg mRNA外，還提取了約95mg總RNA。當從野生型中提取mRNA時，使用上述方法，只是用野生型來代替抗性突變體。
(3)來源於抗性突變體的cDNA文庫的構建採用2μg以上(2)中純化的mRNA和cDNA合成試劑盒(AmershamPharmacia Biotec)，合成cDNA，致使構建一個來源於抗性突變體的cDNA文庫。
首先，用試劑盒提供的RT酶進行逆轉錄反應；用試劑盒提供的T4 DNA聚合酶進行後續互補鏈延伸反應。在互補鏈延伸反應時，加入32p-dCTP以計算cDNA合成的收率。在加入接頭後，通過體外包裝方法將合成cDNA摻入到λ噬菌體中。
加入到cDNA中的接頭是Eco Ri-Not I-Bam HI接頭(TakaraShuzo)。加入50倍於cDNA摩爾濃度的接頭至含有cDNA的溶液中。然後，加入T4 DNA連接酶(Pharmacia)至混合物中，然後於4℃進行連接反應過夜。採用AsahiPak GS 710柱(Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.)，將反應溶液上樣至HPLC，然後用波長260nm的紫外線監測洗出物。洗出物分別以0.5ml分級分離為25個流分。用Cerenkov計數器測定每個流分，收集3-4個高計數流分。用T4多核苷酸激酶(TakaraShuzo)將所述流分中所含有的接頭5』末端磷酸化，然後加入λgt 11 EcoRI臂，進行連接反應。加入GigaPack Gold III(Stratagene)至溶液中，然後在室溫下進行連接反應達2小時。反應後，加入200μl SM緩衝液和8μl氯仿至反應溶液中，從而製備噬菌體溶液。將該噬菌體溶液稀釋10倍。用1μl經稀釋的溶液感染大腸桿菌(Y-1088)，向其中加入0.7％上層瓊脂，然後將該溶液接種到LB平板上。對4-8小時後在平板上出現的噬斑數進行計數，從而測定滴度。
約74ng來源於抗性突變體的cDNA的合成通過DE 81紙和Cerenkov計數的結果得以證實。載體與加入其中的接頭連接後Cerenkov計數的結果揭示出，獲得抗性突變體的約22ng含有其中插入的插入片段的λDNA。將λDNA包裝成噬菌體，從而製備來源於抗性突變體細胞的cDNA文庫。該文庫溶液的滴度為16,600pfu/μl。
當按照上述方法用從野生型中提取的mRNA來製備cDNA文庫時，合成約38ng來源於野生型的cDNA。此外，獲得野生型的約5ng含有其中插入的插入片段的λDNA。此外，來源於野生型的cDNA文庫溶液的滴度為18,160pfu/μl。
(4)含有所述ALS基因的cDNA的篩選為了在平板上形成約20,000個噬斑，將以上(3)中製備的文庫溶液稀釋，然後將平板上來源於野生型的噬菌體和來源於抗性突變體的噬菌體分別獨立地接種到10個平板上。將噬斑轉移至硝化纖維素膜(Schleicher Schnell，PROTORAN BA85，孔徑0.45μm)上。將該硝化纖維素膜浸入變性溶液(0.5M NaCl，1.5M NaCl)，然後浸入中和溶液(0.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH 7.5，1mM EDTA)約20秒。用濾紙除去硝化纖維素膜中過量的水，然後將硝化纖維素膜於80℃烘烤2小時。另外，當用Hybond-N+(Amersham Pharmacia Biotec)來代替硝化纖維素膜時可省去烘烤步驟，並且用0.4M NaOH進行固定化達20分鐘。
用兩種不同的方法一RI和非RI，將以上(1)中製備的插入DNA標記，然後用作探針DNA。用RI標記和雜交通過以下方法來進行。首先，將約200-500ng探針DNA熱變性，然後用BcabEST DNA標記試劑盒(Takara Shuzo Co.，Ltd)標記。該標記反應後，加入試劑盒提供的緩衝液、隨機引物和32p-dCTP。隨後，加入BcaBEST，然後於65℃保溫30分鐘。隨後，加入EDTA以終止反應。將反應溶液上樣至硝化纖維素膜上，致使8片膜都含有約100ng探針。於42℃輕輕搖動下雜交過夜。雜交後，用2×SSC、0.1％SDS溶液洗滌膜三次，然後對BAS 2000成像分析儀(Fuji Photo Film Co.，Ltd.)的顯象板曝光約1小時。曝光後，用所述成像分析儀檢測陽性克隆。
用非RJ標記通過以下方法來進行。約200-500ng探針DNA熱變性後，加入ECL直接DNA/RNA標記和檢測系統(Amersham PharmaciaBiotec)中提供的DNA標記試劑(過氧化物酶)和戊二醛，然後於37℃保溫。在這種情況下，將標記探針DNA上樣至硝化纖維素膜上，致使8片膜都含有約100ng標記探針DNA。於42℃輕輕搖動下雜交過夜。雜交後，用原始洗滌緩衝液在室溫下洗滌膜三次，每次10分鐘，然後用2×SSC在室溫下洗滌膜一次達10分鐘。將膜浸入ECL試劑盒提供的發光溶液中，然後對X光膠片曝光30分鐘至3小時。
用無菌牙籤將通過雜交獲得的陽性噬菌體(初次篩選)與上層瓊脂一起刮下來，然後懸浮於200μl SM緩衝液中，從而獲得噬菌體溶液。將每個克隆的噬菌體溶液適當地稀釋，感染大腸桿菌菌株Y-1088，然後接種到LB平板上。用這些新製備的平板，同樣進行雜交(第二次篩選)。將陽性噬斑懸浮於200μl SM緩衝液中，從而獲得單個噬菌體。如果通過第二次篩選沒有分離到單個噬菌體，則進行再次稀釋，然後接種到LB平板上。隨後，進行雜交(第三次篩選)，致使獲得單個噬菌體。
接著，通過以下方法從單個噬菌體製備λDNA。將用竹籤和牙籤從陽性克隆噬斑收集的λ噬菌體接種到200μl含有5μl新宿主大腸桿菌(Y1088)懸浮液的2×YT培養基(含有10mM MgCl2和0.2％麥芽糖)中。讓產物於42℃靜置溫育過夜。然後，將培養基再次接種到1ml含有25μl宿主大腸桿菌(Y1088)懸浮液的2×YT培養基(含有10mMMgCl2和0.2％麥芽糖)中，然後振蕩培養過夜(這些步驟構成預培養過程)。將預培養溶液(10-50μl)接種到12ml含有10mM MgCl2和0.5ml大腸桿菌Y1088懸浮液的2×YT培養基中。然後，於42℃相對強振蕩下溫育過夜，直至裂解後濁度增加。培養後，加入50μl氯仿和1.2ml5M NaCl，然後於42℃振蕩下保溫10分鐘。將產物以27,000×g離心10分鐘，然後上清液轉移至新的離心管中。加入5ml 50％PEG至上清液中，然後在冰上保溫1小時或1小時以上。將產物以27,000×g離心10分鐘，然後棄去上清液。接著，再次以27,000×g離心，然後棄去液體部分。將沉澱部分懸浮於300μl含有4μgDNA酶I、20μg RNA酶A和10mM MgCl2的30mM Tris鹽酸緩衝液(pH 7.5)中。將懸浮液轉移至1.5ml試管中。將懸浮液於37℃保溫30分鐘後，加入7.5μl 20％SDS、3μl蛋白酶K(10mg/ml)和12μl 0.5M EDTA至懸浮液中，然後於55℃再保溫15分鐘。隨後，加入150μl苯酚至產物中，然後劇烈攪拌。然後用TOMY微量離心機MR-150(TOMY DIGITAL BIOLOGYCO.，LTD.)，將混合物以15,000rpm離心3分鐘，收集水層。加入800μl乙醚(向其中已加入蒸餾水，以除去過氧化物)至所收集的水層中。劇烈攪拌混合物，然後以15,000rpm離心10秒，棄去乙醚層。重複乙醚抽提步驟後，用氮氣除去在水層中殘留的乙醚。加入30μl 5M NaCl和875μl乙醇至水層中，以便快速收集沉澱的λDNA。用約1ml 70％乙醇衝洗所收集的λDNA，然後減壓乾燥約1分鐘，從而除去乙醇。將產物溶於20-50μl TE緩衝液(pH 8.0)中，從而製備λDNA溶液。
通過以下方法對所得的λDNA中的插入DNA進行亞克隆和測序。將所得的λDNA溶液(1μl)用Not I消化，以便切下插入DNA。反應溶液的組成(對於切割反應而言)按照限制性酶所附的手冊。於37℃反應約2小時後，通過用1％瓊脂糖凝膠電泳證實插入片段的大小。將含有插入DNA的λDNA(10-20μl)用Not I消化，以便切下插入DNA。用取樣用瓊脂糖凝膠分離插入DNA。從凝膠中切下相應的條帶，然後用標準技術純化插入DNA。將插入DNA在BAP處理(用來源於蝦的鹼性磷酸酶去磷酸化)後與載體以1∶1的摩爾比混合，隨後用T4 DNA連接酶於16℃連接反應2小時或2小時以上。在此，由於將用Not I切割的插入DNA用作材料，因此對用Not I切割的載體進行BAP處理。連接後，將一部分溶液與感受態細胞(DH5α)混合，然後讓其在冰上靜置30分鐘。接著，將混合物於42℃熱激30秒，然後讓其在冰上再靜置2分鐘。然後，加入SOC至混合物中，於37℃溫育1小時，接種到LB培養基平板上，在該平板上先前均勻加入100μl 2×YT(含有50μg/ml氨苄青黴素)、30μl 3％X-Gal和3μl 1M IPTG的混合物，然後於37℃培養10小時或10小時以上。將轉化白色菌落分別接種到2ml含有氨苄青黴素的LB培養基或2×YT培養基上，然後於37℃培養過夜。用標準技術從培養溶液製備質粒，並將其溶於H2O中。定量測定其DNA濃度，然後使質粒經過PCR反應以供測序。用上述方法進行PCR反應和測序。
因此，通過上述實驗獲得約2.2kb的非全長的所述ALS cDNA。由於在距該DNA 5』一側約250bp的位置存在一個Sma I位點，因此通過以下方法製備一種新探針。用宿主大腸桿菌JM109擴增含有所述約2.2kbp的pBluescript II SK+，然後採自動分離系統(KURABO PI-100)提取質粒。用Sma I直接消化該質粒。通過1％瓊脂糖電泳分離並純化所產生的約250bp片段，然後計算濃度，從而製備探針。使用該探針，再次通過使用RI的上述方法對文庫進行篩選。從如此獲得的單個噬菌體製備λDNA，用Eco RI消化λDNA溶液(1μl)，然後通過電泳證實其大小，然後在硝化纖維素膜上固定化。電泳後，將凝膠浸入含有1.5MNaCl的0.5M NaOH溶液中，然後輕輕搖動15分鐘。然後凝膠用水洗滌，浸入含有3M NaCl的0.5M Tris-HCl(pH 7.5)中，然後振搖下中和約15分鐘。將約5層厚的工業用濾紙疊在一起以製成底座。將該基底座置於覆蓋在不鏽鋼片上的20×SSC中。隨後，將經中和的凝膠、膜(已經切成一定大小，先浸入蒸餾水達10分鐘中，然後再浸入20×SSC中達10分鐘)和兩疊濾紙按順序放在底座上，在其上再放置厚度為3-4cm紙巾。先將玻璃板，再將一個輕的重物放在產物上，然後轉印約5分鐘。在凝膠和膜之間證實沒有截留的氣泡後，進行轉印約10分鐘。轉印後，將膜用透射儀進行UV處理，然後於80℃烘烤約15-30分鐘。烘烤後，與用32p標記的以上250bp探針DNA進行雜交(雜交緩衝液組成5×SSPE、0.5％SDS、5×Denharlts、鮭精(solum sperm)DNA、50％甲醯胺)。將雜交帶的放射性轉移至顯象板中，用BAS-2000分析結果。在雜交陽性的插入片段中，大量的製備顯示大小相對大的那些插入片段，然後將其亞克隆(FERM BP-7348)到已用Eco RI消化的pBluescriptII SK+中，然後通過上述方法用BAP處理。將產物轉化到大腸桿菌(JM105)中。所得的轉化體進行液體培養，然後用標準技術製備質粒。因而可用上述方法測定核苷酸序列。
結果，可以獲得含有全長突變型ALS基因的cDNA。所述cDNA的核苷酸序列示於SEQ ID NO2中。此外，可以從來源於野生型的cDNA文庫獲得一種類型的含有全長ALS基因的cDNA。圖1顯示突變型ALS基因和野生型ALS基因之間同源性比較的結果。
實施例4突變型ALS蛋白的表達將實施例3(4)中獲得的質粒用Eco RI消化，切下含有野生型ALS基因的cDNA和含有突變型ALS基因的cDNA，然後將其分別摻入到pGEX表達載體中。含有野生型ALS基因的cDNA具有一個比起始密碼子長47個核苷酸的5』非翻譯區，並將其摻入到pGEX-2T的Eco RI位點中。此外，含有突變型ALS基因的cDNA含有一個比起始密碼子長31個核苷酸的5』非翻譯區，並將其摻入到pGEX-4T-3的Eco RI位點中。
將這些載體分別轉化到大腸桿菌(JM105)中。將通過轉化獲得的菌落進行液體培養，然後提取質粒，然後根據限制性酶切模式和測序證實插入DNA的插入方向。對其中插入DNA的方向是按預期的克隆分別進行選擇，然後在2ml含有氨苄青黴素的LB培養基中於27℃振蕩培養。使用1ml該預培養溶液，在50ml或250ml含有氨苄青黴素的LB培養基中進行培養。培養過夜後，加入1mM IPTG，然後誘導GST融合蛋白的表達達3-4小時。
表3顯示在加入IPTG後進行培養3-4小時後測定ALS活性的結果。
表3
如表3所示，具有野生型ALS基因的大腸桿菌和具有突變型ALS基因的大腸桿菌均顯示其比活是不含質粒的對照組的比活的約3-4倍。在加入IPTG後將轉化大腸桿菌培養3-4小時，然後於-80℃貯存。用轉化大腸桿菌純化GST ALS融合蛋白。
通過以下方法從大腸桿菌分離和純化ALS。首先，將於-80℃貯存的轉化大腸桿菌沉澱懸浮於ALS提取緩衝液(含30％甘油和0.5mMMgCl2的磷酸鉀緩衝液(pH 7.5))中。具體地說，加入2.5ml緩衝液至從50ml培養溶液獲得的沉澱中。將懸浮液進行超聲處理(Heat Systems-Ultrasonics，Sonicator W-225R，微晶片(micro chip)，輸出控制(outputcontrol)8，約1秒間隔，兩次(每次40秒))，並且以15000×g於4℃離心20分鐘，從而獲得作為粗製酶溶液的上清液。
通過以下方法從所述粗製酶溶液中純化GST ALS融合蛋白(下文稱為GST-ALS)。將從沉澱(得自250ml培養溶液)中製備的粗製酶溶液(12.5ml)上樣至穀胱甘肽sepharose 4B親和柱(Amersham PharmaciaBiotec，床體積，約1ml，該柱先前已用10ml 1×PBS(0.14M NaCl，2.7mM KCl，10.1mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4pH7.3平衡))上。然後用10ml 1×PBS洗滌該柱，然後吸附的GST-ALS用2ml 10mM穀胱甘肽溶液洗脫(4次)。測量各個流分的GST活性和ALS活性，然後收集具有高活性的流分。另外，由於當使用ALS提取緩衝液時，上述柱的吸附率低，因此也進行以下實驗用1×PBS提取酶，讓其吸附至上述柱。按照上述方法進行ALS活性的測量和蛋白質的定量。通過使用1-氯-2，4-二硝基苯(第二個名稱簡稱為2，4-二氯硝基苯(CDNB))作為底物的方法進行GST活性的測量。使用3ml反應溶液和一種反應組成(1mMCDNB，1mM穀胱甘肽(還原型)，酶溶液，100mM磷酸鉀緩衝液(pH6.5))。在加入酶溶液後，於30℃進行增加的340nm吸光度的速率測定。以濃縮100倍的乙醇溶液製備CDNB，然後將其加入到反應溶液中。
明顯檢測不吸附到上述親和柱上的活性(ALS活性和GST活性)。然而，在用第一次和第二次穀胱甘肽洗脫洗脫出的流分中檢測出吸附到親和柱的活性中的大部分。合併得自第一次和第二次洗脫中的那些流分，以製備純化GST-ALS。
測定用凝血酶蛋白酶(25單位)於4℃消化過夜的GST-ALS作為不含GST的ALS。表4顯示用粗製酶溶液和上述親和柱在色譜分離後以及在凝血酶蛋白酶處理後的ALS活性、蛋白量和比活。
表4
所製備的ALS酶含有來源於大腸桿菌的ALS活性。然而，如表5所示，由於來源於大腸桿菌的ALS活性由ALS同工酶I產生，因此它可以通過加入1mM纈氨酸幾乎完全被抑制。
表5
*該實驗進行兩次。
實施例5突變型ALS蛋白的除草劑敏感性用實施例4中獲得的粗製酶溶液，檢查突變型ALS蛋白的除草劑敏感性。以與實施例2中所述的方法相同的方法進行除草劑敏感性試驗。在所述除草劑敏感性試驗中，用三種除草劑-雙草醚、嘧草硫醚和pyriminobac作為PC除草劑；用四種藥物-氯磺隆、苄嘧磺隆、乙基吡磺隆和唑吡嘧磺隆作為磺脲除草劑；而用兩種藥物-咪唑喹啉酸和咪唑煙酸作為咪唑啉酮除草劑。
在加入突變型ALS蛋白之前，向反應溶液中加入含有一定濃度的這些除草劑的溶液(雙草醚和嘧草硫醚是水溶液，其它的為丙酮溶液)。丙酮的終濃度為1％。另外，由於得自在大腸桿菌中表達的水稻cDNA的ALS蛋白對纈氨酸不敏感(Kil等，J.Biochem.Mol.Biol.31 287-295，1998)，因此在其中來源於大腸桿菌的ALS活性為纈氨酸所抑制的條件下進行除草劑敏感性試驗。
圖12顯示當使用雙草醚時所得的敏感性。圖13顯示當使用氯磺隆時所得的敏感性。如圖12所示，野生型ALS活性為雙草醚所抑制，而突變型ALS活性根本不受抑制。如圖13所示，對於氯磺隆，與野生型ALS蛋白的活性相比，突變型ALS蛋白對一定濃度保持較高水平的其活性，然而，當與雙草醚的情況相比時，突變型ALS蛋白的抗性為中等水平。
圖14顯示當使用嘧草硫醚作為除草劑時所得的敏感性；圖15顯示當使用pyriminobac作為除草劑時所得的敏感性；圖16顯示當使用苄嘧磺隆作為除草劑時所得的敏感性；圖17顯示當使用乙基吡磺隆作為除草劑時所得的敏感性；圖18顯示當使用唑吡嘧磺隆作為除草劑時所得的敏感性；圖19顯示當使用咪唑喹啉酸作為除草劑時所得的敏感性；圖20顯示當使用咪唑煙酸作為除草劑時所得的敏感性。在圖12-20的折線圖中，連接黑色三角的折線表示含有野生型ALS蛋白的粗製酶溶液，而連接黑色方塊的折線表示含有突變型ALS蛋白的粗製酶溶液。
如圖14-20所示，突變型ALS蛋白對每種所述除草劑都有良好的抗性，其抗性優於野生型ALS蛋白的抗性。特別是突變型ALS蛋白對PC除草劑有良好的抗性。圖12、14和15的進一步比較表明，突變型ALS蛋白對PC除草劑中的雙草醚的抗性最佳。
由於這些結果可以被認為與實施例2的結果有關聯，因此提示實施例2中改進對基於PC的除草劑的抗性的因子是所述突變型ALS基因。
此外，用實施例4中製備的純化GST-ALS和游離ALS進行除草劑敏感性試驗。圖21顯示表明野生型ALS蛋白對雙草醚抗性的結果。圖22顯示表明突變型ALS蛋白對雙草醚抗性的結果。另外，圖23顯示表明突變型ALS蛋白對氯磺隆抗性的結果。圖24顯示表明突變型ALS蛋白對咪唑喹啉酸抗性的結果。其結果示於圖21-24中的除草劑敏感性試驗在不加纈氨酸的情況下進行。此外，在圖21的折線圖中，連接黑色三角的折線表示含有野生型ALS蛋白的粗製酶溶液；連接黑色方塊的折線表示野生型GST-ALS；而連接黑色圓形的折線表示游離ALS蛋白。在圖22-24的折線圖中，連接黑色三角的折線表示含有突變型ALS蛋白的粗製酶溶液；而連接黑色方塊的折線表示突變型GST-ALS。
如圖21-24所示，純化GST-ALS也顯示與當使用粗製酶溶液的情況相似的除草劑敏感性。
實施例6突變型ALS基因中的突變部分和藥物敏感性之間的關係如圖1所示，實施例3(4)中確定的突變型ALS基因中的突變部分是W548L突變和S627I突變，在W548L突變中，野生型位置548的色氨酸(W)已突變為賴氨酸(L)，在S627I突變中，野生型位置627的絲氨酸(S)已突變為異亮氨酸(I)。為了研究這些突變對除草劑敏感性的影響，製備僅含有W548L突變或S627I突變任一種的突變型ALS基因，並且檢查具有任一種突變的ALS蛋白的除草劑敏感性。
(1)突變基因的製備如圖25和26所示，製備例如僅具有W548L突變的突變型ALS基因(下文稱為「W548L突變型ALS基因」)。首先，用名為ALS-Rsp6的有義引物(5』-CATCACCAACCACCTCTT-3』SEQ ID NO3)和名為ALS-RspF的反義引物(5』-ACACGGACTGCAGGAATA-3』SEQ ID NO4)以及用保留雙點突變型ALS基因的pBluescript II SK+(FERM BP-7348)作為模板，進行PCR，從而擴增具有W548L突變但不具有S627I突變的DNA片段(圖25)。同時，用名為ALS-RspE的有義引物(5』-TTACAAGGCGAATAGGGC-3』SEQ ID NO5)和M13R反義引物(5』-GGAAACAGCTATGACCATG-3』SEQ ID NO6)以及用保留野生型ALS基因的pBluescript II SK+作為模板，擴增含有在位置627編碼絲氨酸的區域的DNA片段(圖25)。
接著，通過採用SPR方法(基因製備方法自身聚合酶反應，其中兩個單鏈DNA在序列相互對應的末端部分結合，相互利用DNA為模板，DNA聚合酶複製DNA，形成雙鏈DNA)，通過將兩個DNA片段連接在一起，從兩個DNA片段獲得一個大的DNA片段(圖26)。所得的DNA片段用Acc I和Eco RI消化，從而獲得Acc I-Eco RI片段。在含有其中摻入的野生型ALS基因的pGEX-2T質粒(pGEX-2T-wALS)在Acc I位點消化後，用Eco RI於37℃部分消化1分鐘，從而獲得pGEX-2T質粒的部分片段(圖26)。然後，將Acc I-Eco RI片段和pGEX-2T質粒的所述部分片段連接在一起，產生具有W548L突變型ALS基因的質粒。
另外，按照製備以上W548L突變型ALS基因的方法，可以獲得僅具有S627I突變的突變型ALS基因(下文稱為「S627I突變型ALS基因」)。也就是說，以與上述W548L突變型ALS基因所用方法相同的方法，可以獲得S627I突變型ALS基因，只是在用pBluescript II SK+(FERM BP-7348)作為模板進行PCR時，用ALS-RspE和M13R作為引物，而在用保留野生型ALS基因的pBluescript II SK+作為模板進行PCR時，用ALS-Rsp6和ALS-RspF作為引物。
將具有W548L突變型ALS基因的質粒和具有S627I突變型ALS基因的質粒分別轉化到大腸桿菌菌株JM109中。對所得的大腸桿菌菌落進行ALS基因的全測序，致使可以證實W548L突變的單點突變和S627I突變的單點突變。
(2)各個突變蛋白的除草劑抗性將具有W548L突變型ALS基因的質粒或具有S627I突變型ALS基因的質粒轉化到大腸桿菌菌株JM109中。對從轉化獲得的菌落進行液體培養，以與實施例4和實施例5中所述方法相同的方法誘導GST誘導蛋白的表達，製備粗製酶溶液，然後在1mM纈氨酸存在下檢查ALS的除草劑敏感性。
圖27顯示使用雙草醚的結果。圖28和圖29顯示使用氯磺隆和咪唑喹啉酸的結果。如圖27所示，對於雙草醚，W548L突變和S627I突變的每個單點突變都賦予針對雙草醚的抗性，並且在僅W548L突變的單點突變中的抗性程度高於在僅S627I突變的單點突變中的抗性程度。
然而，顯示在這些單點突變中的抗性程度都比實施例5中所示的雙點突變的抗性程度要低若干數量級。換句話說，W548L突變和S627I突變的共存導致對雙草醚的顯著強的抗性，根據單獨的或者W548L突變或者S627I突變的情況不能預見這一點。
當使用氯磺隆時(圖28)，單獨的W548L突變賦予對氯磺隆的抗性，但單獨的S627I突變沒有賦予明顯的抗性。另外，單獨的W548L突變以及W548L突變和S627I突變兩者一起對氯磺隆抗性程度的比較揭示出，它們有相同的抗性程度。此外，當使用咪唑喹啉酸時(圖29)，結果與雙草醚的結果相似。然而，在該實施例中所使用的濃度範圍內，尚不能證實增加的抗性是由於兩個突變共存所致的延增效應。
如上所述，顯示此時發現的一個新S627I突變顯著增強由於W548L突變所致的雙草醚抗性。總之，具有W548L突變和S627I突變的ALS基因是賦予對雙草醚特異性高抗性的基因。
實施例7轉化植物的產生用實施例3(4)中測定的突變型ALS基因轉化水稻植物(Nippon-bare)，然後檢查轉化水稻植物的雙草醚抗性。
(1)其中摻入突變型ALS基因的雙元質粒的構建將實施例3(4)中獲得的突變型ALS基因摻入雙元載體pMLH7133(Mitsuhara等，Plant Cell Physiol.37 49-59，1996)中，該載體已開發用於水稻植物的轉化。
首先，如圖30所示，利用多克隆位點的限制性酶切割位點和接頭的切割位點，切下在pBluescript II SK+(FERM BP-7348)中摻入的突變型ALS基因(用Sac I消化和用Bam HI部分消化)。然後，pMLH7133用Sac I和Ban HI消化。切下pMLH7133中的GUS區，然後將pMLH7133線性化。將含有突變型ALS基因的DNA片段和其形狀為直鏈的pMLH7133連接在一起，從而獲得pMLH7133-ALS。
將所得的pMLH7133-ALS轉化到大腸桿菌菌株JM105中。將所得的單個菌落進行液體培養，然後製備質粒。通過用Sac I和Bam HI消化所製備的質粒，證實所述插入片段的存在與否(圖31)，以便選出具有突變型ALS基因的克隆。用顯示含有所述插入片段的質粒作為模板並且用提供特異性擴增突變型ALS基因的至少一部分的兩個引物組，進行PCR。此中所用的引物組是ALS-Rsp1有義引物(5』-GCTCTGCTACAACAGAGCACA-3』SEQ ID NO7)和4-83-3反義引物(5』-GCTTTGCCAACATACAG-3』SEQ ID NO8)的引物組以及3-1-4有義引物(5』-AGGTGTCACAGTTGTTG-3』SEQ ID NO9)和3-1-1反義引物(5』-GCATCTTCTTGAATGGCG-3』SEQ ID NO10)的引物組。因此，檢測到特異性片段條帶(圖32)，表明在所述pMLH7133載體中摻入了實施例3(4)獲得的突變型ALS基因。
此外，通過PCR證實突變型ALS基因是否已被正常摻入，以確定所述插入片段的插入方向和測定其序列。如下所述通過PCR證實所述插入片段的插入方向。pMLH7133-ALS用Eco RI完全消化，從而取出TNOS部分併線性化。用所述產物作為模板以及用上述ALS-Res1和4-83-3引物組以及3-1-4和3-1-1引物組，進行PCR。結果(圖33)，在預定位置證實有PCR產物的條帶，表明突變型ALS基因以正向插入。如果突變型ALS基因以反向插入，則不可能檢測到PCR產物，由於突變型ALS基因部分通過Eco RI消化從pMLH7133-ALS中被切下來，因此沒有DNA片段得到擴增。
同時，用所製備的pMLH7133-ALS作為突變型ALS基因5』一側和pMLH7133連接區的模板，進行測序。另外，由於pMLH7133-ALS導致在大腸桿菌中拷貝數低，因此，通過鹼SDS法從體積20倍於標準體積的培養溶液(相當於2ml培養溶液×20)進行製備。因此，顯示突變型ALS基因已以正向插入。
(2)將雙元載體導入土壤桿菌(Agrobacterium)中將以上(1)中獲得的雙元載體(pMLH7133-ALS)如下導入土壤桿菌中。將貯藏於-80℃的根癌土壤桿菌EHA105感受態細胞在冰上解凍，然後使用。加入pMLH7133-ALS至含有根癌土壤桿菌EHA105感受態細胞的溶液中，讓其在冰中靜置15分鐘，然後於37℃熱激5分鐘。然後，讓混合物在冰中靜置2分鐘，向其中加入1ml SOC液體培養基，然後於28℃輕輕振蕩2-4小時。接著，進行離心，棄去大部分上清液。將經沉澱的細胞懸浮於剩餘的上清液中。將懸浮液塗布到含有卡那黴素和潮黴素各50ppm的LB平板上，然後於28℃溫育2-3天，從而獲得單菌落。
(3)用導入了pMLH7133-ALS的土壤桿菌轉化水稻植物用無菌微型刮刀刮下1/2匙(2)中獲得的土壤桿菌，然後在30ml補充10mg/l乙醯丁香酮的表6中所示的AAM培養基(Falcon試管)中充分懸浮。
表6MgSO4-7H2O 250CaCl2-2H2O 150NaH2PO4-2H2O 150KCl3000Fe-EDTA 40 MnSO4-6H2O 10ZnSO4-7H2O 2 CuSO4-5H2O 0.025CoCl2-6H2O 0.025 K1 0.75H3BO3 Na2MoO4-2H2O0.25肌醇 100煙酸 1鹽酸吡哆醇 1 鹽酸硫胺素 10水解酪蛋白胺基酸 500甘氨酸 7.5L-精氨酸 176.7 L-穀氨醯胺 900L-天冬氨酸 300蔗糖 68.5葡萄糖 36pH 5.2(數字按mg/l表示)用巴氏吸管進行充分吸打，致使不含土壤桿菌塊。將所得的懸浮液置於9cm Schale中。
將由種子(Nippon-bare)誘導的並且在表7所示的N6D培養基中預培養的愈傷組織置於不鏽鋼網(或茶濾過器)中。然後將含有愈傷組織的網在土壤桿菌懸浮液中浸漬1.5-2分鐘。此時，浸漬網，致使愈傷組織完全浸入所述細菌溶液中，然後用刮刀輕輕攪拌。隨後，將不鏽鋼網置於無菌濾紙上，以除去過量的細菌溶液。將如此處理的愈傷組織置於如表8所示的2N6AS固體培養基(10mg/l乙醯丁香酮，16個愈傷組織/培養皿)，用手術膠布密封，於28℃避光條件下培養2-3天，直至一薄層細胞覆蓋愈傷組織(由於細胞生長所致)。
表7CHU粉末 1包肌醇 100煙酸 0.5鹽酸吡哆醇 0.5鹽酸硫胺素 12，4-D 2水解酪蛋白胺基酸 300甘氨酸 2脯氨酸 2827蔗糖 30000gelrite 4000羧苄青黴素 500潮黴素 50pH 5.8(數字按mg/l表示)
表8CHU粉末 1包肌醇100煙酸0.5鹽酸吡哆醇 0.5鹽酸硫胺素 12，4-D 2水解酪蛋白胺基酸300甘氨酸 2蔗糖30g葡萄糖 10ggelrite 4000乙醯丁香酮 10pH 5.2(數字按mg/l表示)在由於共培養3天一薄層細胞覆蓋愈傷組織後，用以下方法洗滌愈傷組織，以除去所述土壤桿菌。將如上所述處理的愈傷組織置於不鏽鋼網(或茶濾過器)，然後將含有愈傷組織的網浸漬在N6D液體培養基(含有500mg/l羧苄青黴素)中。連續進行培養皿的交換，直至培養基不再混濁為止。通過該處理洗去附在愈傷組織上的土壤桿菌。然後，將該網置於無菌濾紙上，以除去過量的水分。將愈傷組織置於N6D固體培養基(含有500mg/l羧苄青黴素和50mg/l潮黴素)，然後在光照條件下於28℃培養2-3周。另外，在該步驟后土壤桿菌再增殖時，以相同的方法進行洗滌，然後將愈傷組織置於新鮮培養基上。
通過在光照條件下於28℃培養2-3周進行選擇後，將愈傷組織以9個愈傷組織/培養皿移植到再分化培養基(含有250mg/l羧苄青黴素和50mg/l潮黴素)上，然後在光照條件下於28℃培養2-3周。當葉、莖和根部分分別分化1cm或更長時，將愈傷組織以2-3個愈傷組織/培養皿移植到無激素培養基(含有50mg/l潮黴素)上。隨後，當所得的植物體繁殖足以覆蓋培養皿時，將植株盤載到培養土(bon sol)中，讓其適應。移植時，將附在根上的培養基在水中全部洗去。圖34顯示上述步驟的流程。
進行上述盆栽的同時，將尚未再分化的愈傷組織部分(9個愈傷組織)(圖35)在固體培養基上傳代培養，以產生實施例1中所用的雙草醚抗性愈傷組織。所述固體培養基含有10μM雙草醚。因而，9個愈傷組織中的6個正常生長。將正常生長並且顯示雙草醚抗性的6個愈傷組織中的1個進行液體培養，然後詳細檢查對雙草醚的藥物敏感性。因此，如圖36所示，所述愈傷組織顯示的雙草醚抗性幾乎與雙點突變基因來源的雙草醚抗性Sr系相同。此外，如圖37所示，野生型水稻植株(Nippon-bare)的愈傷組織顯示雙草醚敏感性。因此，在含有10μM雙草醚的固體培養基上生長的6個愈傷組織都顯示具有強雙草醚抗性。
用DNeasy Plant Kit(QIAGEN)，從這些雙草醚抗性愈傷組織製備基因組DNA。然後，用基因組DNA作為模板，用其間鄰接所述雙點突變部分的有義引物(3-1-4SEQ ID NO9)和反義引物(4-83-3SEQ IDNO8)的引物組，進行PCR。因而，如圖38所示，正如所預期的，擴增了一種DNA片段。純化所擴增的DNA片段，然後檢查其核苷酸序列(用引物(3-1-4SEQ ID NO9)讀出有義鏈；而用引物(ALS-Rsp25』-AGTCCTGCCATCACCATCCAG-3』SEQ ID NO11)讀出反義鏈)。
圖39A和圖39B顯示分析編碼ALS蛋白的位置548的胺基酸的核苷酸周圍的核苷酸序列的結果。圖39C和圖39D顯示分析編碼ALS蛋白的位置627的胺基酸的核苷酸周圍的核苷酸序列的結果。如圖39A-D所示，對於這些系的雙點突變而言，發現野生型和突變體的異源序列。因此，表明突變型ALS基因摻入所述基因組中。另外，9個愈傷組織中的3個在10μM雙草醚存在下生長不太好。然而，認為這是由於所導入的雙點突變ALS基因的低表達量引起的。
在盆栽的80株潮黴素抗性轉化水稻植株中，在5葉期正常生長的那些水稻植株有27株已導入突變型ALS基因的植株，且有46株已導入野生型ALS基因的植株。含有其中導入的野生型ALS基因的植株往往比其中含有突變型ALS基因的那些植株生長更健壯。此時，對4株含有其中導入的突變型ALS基因的植株和5株含有其中導入的野生型ALS基因的植株進行適當選擇，並且將補充0.2％表面活性劑K的1kg a.i./ha雙草醚鹽噴灑到葉和莖上。噴灑後約40天進行生長調查的結果示於圖40中。在圖40中，植株A的長度約90cm。
如圖40所示，含有其中導入的突變型ALS基因的單株的生長几乎正常(A)，並且表明所述植株具有雙草醚抗性。用DNeasy Plant Kit(QIAGEN)，從雙草醚抗性轉化水稻植株製備基因組DNA。然後，用基因組DNA作為模板，用其間鄰接雙點突變部分的有義引物(3-1-4SEQ ID NO9)和反義引物(4-83-3SEQ ID NO8)的引物組，進行PCR。以與上述愈傷組織相同的方式檢查所得的DNA片段的核苷酸序列。因此，證實了在所述轉化水稻植株中存在雙點突變。
本文引用的所有出版物、專利和專利申請通過引用全部結合到本文中。
本發明的效應如上文詳細描述的，本發明可以提供編碼ALS酶的ALS基因，所述ALS酶對所有抑制ALS的除草劑都有良好的抗性並且顯示對PC除草劑有極高水平的抗性。
序列表110組合化學工業株式會社(KUMIAI CHEMICAL INDUSTRY CO.，LTD)120編碼乙醯乳酸合成酶的基因130PH-1273PCT150JP 2000-3626301512000-11-2916011170PatentIn Ver.2.02101211644212PRT213Oryza sativa var.Kinmaze4001Met Ala Thr Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Ser Ala Ala Ala1 5 10 15Thr Ala Lys Thr Gly Arg Lys Asn His Gln Arg His His Val Leu Pro20 25 30Ala Arg Gly Arg Val Gly Ala Ala Ala Val Arg Cys Ser Ala Val Ser35 40 45Pro Val Thr Pro Pro Ser Pro Ala Pro Pro Ala Thr Pro Leu Arg Pro50 55 60Trp Gly Pro Ala Glu Pro Arg Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala65 70 75 80Leu Glu Arg Cys Gly Val Ser Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala85 90 95Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Pro Val Ile Thr Asn100 105 110
His Leu Phe Arg His Glu Gln Gly Glu Ala Phe Ala Ala Ser Gly Tyr115 120 125Ala Arg Ala Ser Gly Arg Val Gly Val Cys Val Ala Thr Ser GlyPro130 135 140Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp Ser145 150 155 160Val Pro Met Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile Gly165 170 175Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Ile180 185 190Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg Val195 200 205Ile Gln Glu Ala Phe Phe Leu Ala Ser Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val210 215 220Leu Val Asp Ile Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Met Ala Val Pro Val225 230 235 240Trp Asp Thr Ser Met Asn Leu Pro Gly Tyr Ile Ala Arg Leu Pro Lys245 250 255Pro Pro Ala Thr Glu Leu Leu Glu Gln Val Leu Arg Leu Val Gly Glu260 265 270Ser Arg Arg Pro Ile Leu Tyr Val Gly Gly Gly Cys Ser Ala Ser Gly275 280 285Asp Glu Leu Arg Trp Phe Val Glu Leu Thr Gly Ile Pro Val Thr Thr290 295 300Thr Leu Met Gly Leu Gly Asn Phe Pro Ser Asp Asp Pro Leu Ser Leu305 310 315 320Arg Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp325 330 335
Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val340 345 350Thr Gly Lys Ile Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile355 360 365Asp Ile Asp Pro Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser370 375 380Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Gln Gly Leu Asn Ala Leu Leu385 390 395 400Gln Gln Ser Thr Thr Lys Thr Ser Ser Asp Phe Ser Ala Trp His Asn405 410 415Glu Leu Asp Gln Gln Lys Arg Glu Phe Pro Leu Gly Tyr Lys Thr Phe420 425 430Gly Glu Glu Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu435 440 445Thr Lys Gly Glu Ala Ile Ile Ala Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met450 455 460Trp Ala Ala Gln Tyr Tyr Thr Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Ser465 470 475 480Ser Ala Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ala Gly485 490 495Ala Ser Val Ala Asn Pro Gly Val Thr Val Val Asp Ile Asp Gly Asp500 505 510Gly Ser Phe Leu Met Asn Ile Gln Glu Leu Ala Leu Ile Arg Ile Glu515 520 525Asn Leu Pro Val Lys Val Met Val Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met530 535 540Val Val Gln Leu Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala Asn Arg Ala His Thr545 550 555 560
Tyr Leu Gly Asn Pro Glu Cys Glu Ser Glu Ile Tyr Pro Asp Phe Val565 570 575Thr Ile Ala Lys Gly Phe Asn Ile Pro Ala Val Arg Val Thr Lys Lys580 585 590Ser Glu Val Arg Ala Ala Ile Lys Lys Met Leu Glu Thr Pro Gly Pro595 600 605Tyr Leu Leu Asp Ile Ile Val Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met610 615 620Ile Pro Ile Gly Gly Ala Phe Lys Asp Met Ile Leu Asp Gly Asp Gly625 630 635 640Arg Thr Val Tyr21022112279212DNA213Oryza sativa var.Kinmaze4002ctcgccgccg ccgccgccgc caccacccac catggctacg accgccgcgg ccgcggccgc 60cgccctgtcc gccgccgcga cggccaagac cggccgtaag aaccaccagc gacaccacgt 120ccttcccgct cgaggccggg tgggggcggc ggcggtcagg tgctcggcgg tgtccccggt 180caccccgccg tccccggcgc cgccggccac gccgctccgg ccgtgggggc cggccgagcc 240ccgcaagggc gcggacatcc tcgtggaggc gctggagcgg tgcggcgtca gcgacgtgtt 300cgcctacccg ggcggcgcgt ccatggagat ccaccaggcg ctgacgcgct ccccggtcat 360caccaaccac ctcttccgcc acgagcaggg cgaggcgttc gcggcgtccg ggtacgcgcg 420cgcgtccggc cgcgtcgggg tctgcgtcgc cacctccggc cccggggcaa ccaacctcgt 480gtccgcgctc gccgacgcgc tgctcgactc cgtcccgatg gtcgccatca cgggccaggt 540cccccgccgc atgatcggca ccgacgcctt ccaggagacg cccatagtcg aggtcacccg 600ctccatcacc aagcacaatt accttgtcct tgatgtggag gacatccccc gcgtcataca 660ggaagccttc ttcctcgcgt cctcgggccg tcctggcccg gtgctggtcg acatccccaa 720ggacatccag cagcagatgg ccgtgccggt ctgggacacc tcgatgaatc taccagggta 780catcgcacgc ctgcccaagc cacccgcgac agaattgctt gagcaggtct tgcgtctggt 840Dtggcgagtca cggcgcccga ttctctatgt cggtggtggc tgctctgcat ctggtgacga 900attgcgctgg tttgttgagc tgactggtat cccagttaca accactctga tgggcctcgg 960
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223人工序列的描述引物4003CATCACCAAC CACCTCTT 18210421118212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4004ACACGGACTG CAGGAATA 18210521118212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4005TTACAAGGCG AATAGGGC 18210621119212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4006GGAAACAGCT ATGACCATG19210721121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4007GCTCTGCTAC AACAGAGCAC A 21
210821117212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4008GCTTTGCCAA CATACAG 17210921117212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物4009AGGTGTCACA GTTGTTG 172101021118212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物40010GCATCTTCTT GAATGGCG 182101121121212DNA213人工序列220
223人工序列的描述引物40011AGTCCTGCCA TCACCATCCA G 2權利要求
1.一種編碼以下蛋白質(a)或(b)的基因(a)一種包含SEQ ID NO1的胺基酸序列的蛋白質；(b)一種包含從SEQ ID NO1的胺基酸序列通過取代、缺失或添加至少一個或多個胺基酸而獲得的胺基酸序列、對嘧啶基羧基除草劑具有抗性以及具有乙醯乳酸合酶活性的蛋白質。
2.一種乙醯乳酸合酶蛋白，所述乙醯乳酸合酶蛋白由權利要求1的基因編碼。
3.一種重組載體，所述重組載體具有權利要求1的基因。
4.一種轉化體，所述轉化體具有權利要求3的重組載體。
5.一種植物，所述植物具有權利要求1的基因並且對嘧啶基羧基除草劑具有抗性。
6.一種培育權利要求5的植物的方法，所述方法包括在嘧啶基羧基除草劑的存在下培育所述植物。
7.一種應用權利要求1的基因作為選擇標記來選擇具有所述基因的轉化細胞的方法。
全文摘要
一種編碼針對基於PC的除草劑顯示極高抗性的ALS蛋白的基因。即一種編碼以下蛋白質(a)或(b)的基因。(a)一種包含SEQ ID NO1所示的胺基酸序列的蛋白質。(b)一種包含從SEQ ID NO1所示的胺基酸序列通過取代、缺失或添加至少一個胺基酸而獲得的胺基酸序列並且對嘧啶基羧基除草劑具有抗性以及具有乙醯乳酸合酶活性的蛋白質。
文檔編號C12N15/60GK1487998SQ01822268
公開日2004年4月7日 申請日期2001年11月16日 優先權日2000年11月29日
發明者清水力, 中山礎, 永山孝三, 福田篤德, 田中喜之, 角康一郎, 三, 之, 德, 郎 申請人:組合化學工業株式會社, 獨立行政法人農業生物資源研究所