用於高半胱氨酸和胱硫醚的酶促循環測定的製作方法

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專利名稱：用於高半胱氨酸和胱硫醚的酶促循環測定的製作方法
相關專利申請本申請是2000年11月1日提交的美國專利申請序列號09/704,036的部分繼續申請，該專利申請要求1999年11月2日提交的臨時專利申請序列號60/163,126和2000年5月10日提交的序列號60/203,349的權利，前面各申請的內容和講授納入本文供參考。
序列列表與本發明有關的含21種序列的序列列表以計算機可讀的ASCII文檔形式納入本文供參考並附加兩張(2)根據37CFR 1.821(c)的原始光碟、其根據37CFR 1.821(e)的相同拷貝以及一張(1)其根據37CFR 1.52(e)的相同拷貝。
發明的背景人血漿中高半胱氨酸的高水平與冠心病、中風、動脈硬化和其它疾病的風險增加相關。結果需要篩選此胺基酸量提高的一般群體。為使大規模測試高半胱氨酸可行，需要開發新和花費更少的測定。
常規測量血漿高半胱氨酸是通過高壓液相層析(HPLC)和氣相層析/質譜(GC/MS)，花費超過100美金每測定，使這些物理分離方法對於廣泛群體研究花費太高。例如，可製備尿或血液樣品用於胺基酸層析，通過HPLC分離和檢測來測量L-高半胱氨酸。Fiskerstrand等.(Clin.Chem.，39263-271(1993))描述了測定L-高半胱氨酸的方法，用螢光標記血清硫醇，接著通過HPLC分離和檢測來自多種其它含硫化合物的高半胱氨酸衍生物。然而，這種方法通常費時、昂貴且不易為許多實驗室所採用。
也開發了間接免疫測定高半胱氨酸，然而這些抗體方法仍相對昂貴，約24美金每測試。一種特定間接免疫測定使高半胱氨酸酶促轉變成腺苷高半胱氨酸且腺苷高半胱氨酸的量通過競爭性ELISA(酶聯免疫測定)確定，使用抗腺苷高半胱氨酸抗體(例如參見美國專利5,827,645，其內容納入本文供參考)。
已開發間接酶測定用於定量L-高半胱氨酸。例如，酶S-腺苷-高半胱氨酸水解酶和腺苷加入測試樣品。反應混合物中所得腺苷濃度或濃度變化用作樣品中高半胱氨酸起始濃度的指示。
也報導了直接酶測定用於測量高半胱氨酸。通常，這些操作使高半胱氨酸不可逆地轉變成其它可定量的化合物。例如，酶高半胱氨酸脫水酶用於從高半胱氨酸中去除巰基。然後測量取出的巰基部分的濃度。此時和其它，酶用於高半胱氨酸測定的主要缺點是所用酶與其它含硫的高半胱氨酸相關胺基酸和化合物反應，導致背景高且不一致以及血漿的高半胱氨酸測量不精確。
已報導酶促(或酶)循環測定用於很少量的分析物。在酶促循環測定中，使用兩種或多種酶活性，重複利用底物且不可逆地轉變測量的化合物。催化使用「化合物」以控制轉變成測定中定量化合物的速度。結果，感興趣的分析物保持穩態濃度，濃度足夠低以產生準一級(pseudo-first order)反應速度。因此分析物穩態濃度與總體測定的速度線性相關。通過測量反應速度可容易地確定分析物的量。酶促循環測定有時稱為「擴增」測定，因為方法通常使分析物的測量敏感性增加100到1000倍。測量中的擴增是不減少化合物的穩態濃度的直接結果。沒未報導酶促循環測定用於測量高半胱氨酸。
本發明提供花費較少的酶促循環測定用於高半胱氨酸和/或胱硫醚，提供的樣品通量高於目前採用的診斷測定。此外，發明提供重組生產酶的方法和載體以及評估樣品中高半胱氨酸和胱硫醚的量的測試試劑盒，酶可用於生產測定試劑。
發明的概述本發明提供酶促循環測定用於評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。測定利用高半胱氨酸和L-絲氨酸反應通過酶胱硫醚β-合酶(CBS)或其衍生物形成胱硫醚，通過胱硫醚β-裂合酶(CBL)使胱硫醚酶促轉變成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。測定提供高半胱氨酸和/或胱硫醚的穩態濃度，穩態濃度與與總體反應速度線性相關。樣品中確定的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量以形成的丙酮酸和/或氨的量或從反應混合物中取出的絲氨酸的量為基礎。用本發明測定的能測試溶液可包括血液、血清、血漿、尿和其它生物樣品的實驗室樣品。此外，可測試任何其它液體樣品。
在一個實施方案中，本發明提供評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量的方法，包括步驟
(a)含高半胱氨酸和/或胱硫醚溶液接觸(進行二硫化物還原步驟前和/或後)CBS或其衍生物、L-絲氨酸和CBL或其衍生物以形成反應混合物，接觸時間足以催化高半胱氨酸循環轉變成胱硫醚且胱硫醚再轉變成高半胱氨酸並產生丙酮酸和氨；(b)確定反應混合物中存在的丙酮酸和/或氨的量；(c)在形成的丙酮酸和/或氨量的基礎上評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。
更特別的是，方法通過加入便宜的胺基酸L-絲氨酸提供高半胱氨酸量的評估。反應混合物中存在的丙酮酸量可以一些方法測量。在本發明的一個特定實施方案中，乳酸脫氫酶(LDH)或其衍生物和NADH(還原的煙醯胺輔因子)或其衍生物存在於反應混合物中。NADH存在時，LDH使丙酮酸轉變成乳酸，NADH氧化成NAD+(氧化的煙醯胺輔因子)。
NADH氧化成NAD+可通過本領域一些已知的方法測量，包括在340nm監控反應混合物。也可通過氧化染料以產生可觀察的顏色變化來監控NAD+的產生。優選用於本發明的染料包括但不限於5，5』-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、甲基紫精或任何這些染料的衍生物。溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量以觀察到的顏色強度與標準曲線相比為基礎，標準曲線構建用於已知濃度分析物的樣品。
在另外的實施方案中，丙酮酸氧化酶和辣有過氧化物酶在過氧化氫和色原存在時用於檢測樣品中存在的丙酮酸量。N-乙基-N-2-羥基3-磺丙基)-m-甲苯胺鈉(TOOS)和其它N-乙基-N-(2-羥基3-磺丙基)-苯胺衍生物是此比色反應的優選色原。如上所述，樣品中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量以觀察到的顏色強度與標準曲線相比為基礎，標準曲線構建用於已知濃度分析物的樣品。
溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量也可在反應混合物中存在的氨量基礎上測量。確定溶液中氨濃度的方法有很多。在本發明的一個特定實施方案中，測量氨量使用普遍可用的標準氨傳感器。
在另一個實施方案中，本發明涉及評估樣品中高半胱氨酸和/或胱硫醚量的方法，包括步驟溶液接觸還原劑，接觸時間足以還原大體上所有的高半胱氨酸且使溶液中存在的其它二硫化物還原成高半胱氨酸。還原劑處理也可用於釋放高半胱氨酸，高半胱氨酸經二硫鍵附於溶液中存在的蛋白質和/或其它分子。還原後，溶液然後接觸CBS或其衍生物、L-絲氨酸和CBL或其衍生物，接觸時間足以催化高半胱氨酸循環轉變成胱硫醚且胱硫醚轉變成高半胱氨酸並產生丙酮酸和氨。為評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量，反應混合物中存在的丙酮酸和/或氨量可如上確定。用於本發明的優選還原劑包括氫硼化鹽和硫醇還原劑。適用於本實施方案的典型硫醇還原劑包括二硫赤蘚糖醇(DTE)、二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇(βME)、tris-(羧乙基)磷化氫鹽酸鹽(TCEP)或硫代乙酸或它們的衍生物等。
在另外一個評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量的實施方案中，溶液可用胱硫醚γ-裂合酶(CGL)或其衍生物預處理足夠的時間以通過胱硫醚轉變成α酮戊二酸從反應混合物中去除任何胱硫醚。胱硫醚去除後，胱硫醚γ-裂合酶從反應混合物中去除或破壞。在一個典型的實施方案中，破壞胱硫醚γ-裂合酶通過加熱溶液足夠的時間以大體上去除其酶活性。胱硫醚γ-裂合酶也可在不溶底物或表面上固定，例如容易去除微粒或珠。
在本發明另一個實施方案中，提供評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚量的方法，包括使溶液與L-絲氨酸和CBS或其衍生物及CBL或其衍生物反應，CBL固定在固體表面上。固體表面可以是例如紙、濾紙、尼龍、玻璃、陶瓷、矽石、氧化鋁、硅藻土、纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和它們的衍生物。固體表面可以是測試容器的側面和底部或可以是加入測試容器的物質。在較佳實施方案中，固體表面包括加入測試容器的珠。
用於本發明的CBS或其衍生物、CBL或其衍生物、胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物可作為粗提物從細胞獲得。在本發明的一個實施方案中，胱硫醚β-合酶(CBS)或其衍生物、胱硫醚β-裂合酶(CBL)和/或胱硫醚γ-裂合酶(CGL)純化自人、酵母或細菌細胞。在本發明的一個特別較佳實施方案中，編碼酶的基因被分離或合成且在宿主細胞中表達為重組蛋白。特別優選的是編碼親和標記的DNA序列加入基因構建物以協助純化和/或檢測重組產生的酶。重組方法也可用於提供融合蛋白，在單個蛋白質中包括CBS和CBL的酶活性。也可包含親和標記作為部分融合蛋白構建物以協助純化融合蛋白。
本發明也提供評估樣品中高半胱氨酸量的方法，此測定形式與高半胱氨酸/轉錄因子複合體的量相關，複合體結合共有多核苷酸結合序列。在特定實施方案中，方法包括使樣品接觸還原劑一段足夠時間以從任何相關蛋白質中釋放高半胱氨酸；在有助於複合體形成的條件下還原高半胱氨酸接觸高半胱氨酸代謝物結合轉錄因子，樣品與共有多核苷酸序列混合，序列由高半胱氨酸/轉錄因子複合體特異識別；從結合共有多核苷酸序列的高半胱氨酸/轉錄因子複合體的量評估樣品中存在的高半胱氨酸量。可應用於方法的還原劑包括二硫赤蘚糖醇(DTE)、二硫蘇糖醇(DTT)、β-巰基乙醇、tris-(羧乙基)磷化氫(TCEP)或硫代乙酸或各自的任何鹽等。高半胱氨酸代謝物結合/轉錄因子包括識別共有多核苷酸序列的大腸桿菌MetR，例如SEQ ID NO11所述多核苷酸序列(Marconi等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，1751057-1063(1991))或其衍生物。
本發明的另一個實施方案提供的測試試劑盒包括保持待評估溶液的容器以及提供有助於高酶活性條件所需的任何緩衝液、輔助物質和溶劑，評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚、L-絲氨酸、CBS或其衍生物、CBL或其衍生物的量。測試試劑盒可進一步包括乳酸脫氫酶或其衍生物和NADH或其衍生物。當氧化可包括時，NADH可在340nm直接測量或用能提供顏色改變的染料。高半胱氨酸和/或胱硫醚的量與吸光度測量隨著時間的變化相關。
在一個較佳實施方案中，提供的酶固定於固體支持物。固體支持物可包括保持測試樣品的容器表面或可以是珠或其它加入容器的物品。在本發明的另一個實施方案中，可提供胱硫醚γ-裂合酶作為部分試劑盒以在酶促循環測定前從測試溶液中去除任何胱硫醚。在加入高半胱氨酸酶促循環的剩餘成分前，大體上所有的胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物活性必須從反應混合物中去除或破壞。
發現發明的優選測定可在相對短的時間段和用相對少量的酶完成，使測定有顯著的商業優勢。例如，優選測定涉及反應混合物的產生，混合物包括含高半胱氨酸的樣品、絲氨酸、CBS、CBL、乳酸脫氫酶、NADH和還原劑如DTE、DTT，混合物中CBS/CBL比例從約1∶1到25∶1，更優選從約1∶10，最優選從約2∶1到5∶1。有利的是，已發現還原劑可與檢測系統(即乳酸脫氫酶和NADH)一起存在而沒有不利影響測定。因此，進行發明的測定可沒有單獨的還原步驟，從而減少總測定次數。因而，當許多樣品通過在容器(如分光光度樣品池)中連續產生反應混合物測定時，混合物由樣品、絲氨酸、CBS、CBL、乳酸脫氫酶、NADH和還原劑組成，評估產生反應混合物中存在的丙酮酸量是通過監控NAD+隨著時間的產生，各自反應-產生步驟間的時間間隔可以短至10-50秒，特定樣品的總反應時間至約20分鐘。特定樣品的總反應時間更優選至約15分鐘，更加優選至約13分鐘。較慢儀器的每小時總樣品數可以是約15-30個，但對於更快儀器高達200-400個。在此優選測定中，製備的第一種反應混合物包括樣品、絲氨酸、乳酸脫氫酶、NADH和還原劑，適當溫育一段時間以釋放樣品中以結合、氧化和/或游離狀態存在的大部分(優選所有)高半胱氨酸(總高半胱氨酸)。因此，加入CBS和CBL以完成反應混合物並起始高半胱氨酸和/或胱硫醚的酶促循環。
在另一個較佳實施方案中，胱硫醚可用於產生酶測定的校準物(因為酶促循環測定使高半胱氨酸和胱硫醚互變)。換句話說，多種已知水平的胱硫醚可用於測定系統以「校準」或「標準化」測定和/或可定量樣品結果的儀器。在此實施方案中，已知濃度的胱硫醚加入生物樣品，然後進行用於一個其它實施方案的測定。結果用於確定校準線，由於兩條線間的高度相關性，校準線然後用於確立高半胱氨酸線。另外，已知水平的胱硫醚可用作質量控制測量，以確保測定正常地工作。在此質量控制實施方案中，這些「已知」水平的胱硫醚作為未知樣品被測定，結果與它們已知(預期)值比較以確保測定系統正常地發揮功能。
優選測定是用分離(純化)CBL和CBS酶完成的，這些酶與選自SEQ ID Nos.19和20的酶有至少約80％(優選至少約90％)的序列同一性。如本文所用，「序列同一性」如本領域已知，指兩種或多種蛋白質或多肽序列或兩種或多種多核苷酸序列間的關係，即參考序列和與參考序列比較的特定序列。確定序列同一性通過在最佳排列序列以產生最高程度序列相似性後比較特定序列和參考序列，序列相似性由這些序列串間的配對確定。這樣排列時，序列同一性在位置-位置基礎上確定，例如如果核苷酸或胺基酸殘基在特定位置相同，序列在此位置「相同」。然後這種位置同一性的總數除以參考序列中的核苷酸或殘基總數以給出％序列同一性。序列同一性可通過已知方法計算，包括但不限於《計算分子生物學》(ComputationalMolecular Biology)，Lesk，A.N.，主編.，Oxford University Press，NewYork(1988)，《生物計算信息學和基因組計劃》(BiocomputingInformatics andGenome Projects)，Smith，D.W.，主編.，Academic Press，New York(1993)；《計算機分析序列數據》(Computer Analysis of Sequence Data)，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，主編.，Humana Press，New Jersey(1994)；《分子生物學的序列分析》(Sequence Analysis in Molecular Biology)，von Heinge，G.，Academic Press，New York(1987)；《序列分析引物》(Sequence AnalysisPrimer)，Griboskov，M.和Devereux，J.，主編.，M.Stockton Press NewYork(1991)；Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，481073(1988)，所講授的納入本文供參考。設計確定序列同一性的優選方法以給出測試序列間的最大配對。確定序列同一性的方法編纂入可公開獲得的電腦程式，程序確定特定序列間的序列同一性。這種程序的例子包括但不限於GCG程序包(Devereux，J.，等.，Nucleic Acids Research，12(1)387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等.，J.Molec.Biol.，215403-410(1990)。BLASTX程序可公開獲得自NCBI和其它來源(BLAST手冊，Altschul，S.等.，NCVINLM NIH Bethesda，MD20894，Altschul，S.F.等.，J.Molec.Biol.，215403-410(1990)，所講授的納入本文供參考)。這些程序用默認間隔重量最佳排列序列以便產生特定和參考序列間最高水平的序列同一性。例如，多核苷酸的核苷酸序列與參考核苷酸序列有至少95％的「序列同一性」，則特定多核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同，除非特定多核苷酸序列可包括多達5個點突變每100個參考核苷酸序列的核苷酸。換句話說，核苷酸序列相對參考核苷酸序列有至少95％同一性的多核苷酸中，參考序列中多達5％的核苷酸可缺失或由另外核苷酸取代，或者參考序列中多達5％總核苷酸的一些核苷酸可插入參考序列。這些參考序列的突變可在參考核苷酸序列的5』或3』末端位置或末端位置間任何地方發生，單獨散布在參考序列的核苷酸中或在參考序列的一個或多個毗連基團中。類似地，具有特定胺基酸序列的多肽與參考胺基酸序列有至少例如95％的「序列同一性」，則多肽的特定胺基酸序列與參考序列相同，除非特定多肽序列可包括多達5個胺基酸改變每100個參考胺基酸序列的胺基酸。換句話說，為獲得與參考胺基酸序列有至少95％序列同一性的特定多肽序列，參考序列中多達5％的胺基酸殘基可缺失或由另外胺基酸取代，或者參考序列中多達5％總胺基酸殘基數的一些胺基酸可插入參考序列。這些參考序列的改變可在參考胺基酸序列的氨基或羧基末端位置或這些末端位置間任何地方發生，單獨散布在參考序列的殘基中或在參考序列的一個或多個毗連基團中。優選的是，不相同的殘基位置由保守性胺基酸取代區別。然而，在確定序列同一性時，保守性取代不包括作為配對。
用於本發明的試劑包括CBS、CBL、L-絲氨酸、LDH、NADH、DTE、βME、DTT、TCEP、硫代乙酸和CGL。用於本發明的CBS酶濃度範圍從約0.1到約100KU/l。CBS濃度更優選從約0.5到約75KU/l，更加優選從約1到約50KU/l。CBS濃度最優選從約1到約30KU/l。用於本發明的CBL酶濃度範圍從約0.01到約100KU/l。CBS濃度更優選從約0.05到約50KU/l，更加優選從約0.1到約30KU/l。CBS濃度最優選從約0.1到約15KU/l。L-絲氨酸可以約1μM到約50mM的終濃度存在。L-絲氨酸更優選以約10μM到約40mM的終濃度加入，更加優選約100μM到約20mM的終濃度。加入的L-絲氨酸終濃度最優選從約0.2mM到約10mM。當用於任何實施方案時，LDH以約30到約5000U/L的終濃度存在於反應混合物中。反應混合物中存在的LDH終濃度更優選從約30到約3000U/L，更加優選從約50到約2500U/L。反應混合物中存在的LDH終濃度最優選從約100到約2000U/L。另外，當NADH用於任何實施方案時，反應混合物中存在的NADH量可在約0.1mM到約2mM間變化。反應混合物中存在的NADH終濃度更優選從約0.1mM到約1.5mM，更加優選約0.1到約1mM間。反應混合物中存在的NADH終濃度最優選從約0.2到約0.8mM。當DTE用於本發明時，它的終濃度範圍可從約0.01mM到約100mM。DTE濃度範圍更優選從約0.01mM到約50mM，更加優選從約0.1mM到約25mM。DTE終濃度範圍最優選從約0.1mM到約10mM。類似地，當DTT用於本發明時，它的終濃度範圍可從約0.01mM到約100mM。DTT濃度範圍更優選從約0.01mM到約50mM，更加優選從約0.1mM到約25mM。DTT終濃度範圍最優選從約0.1mM到約10mM。最後，當CGL用於本發明時，它的終濃度範圍可從約0.1KU/l到約100KU/l。CGL範圍更優選從約0.5KU/l到約75KU/l，更加優選從約1KU/l到約50KU/l。CGL終濃度範圍最優選從約1KU/l到約30KU/l。
在一些較佳實施方案中，試劑1的緩衝液是pH8.4的250mM TRIS。然而，當TRIS用作緩衝液時，pH範圍可從7.0-9.0。pH範圍更優選從7.5-8.5，更加優選從8.1-8.5。使用濃度增加的TRIS通過協助維持更恆定的pH來改進測定一致性，因為它是更濃縮的緩衝液。另外，CBS和CBL在此優選pH範圍中顯然更具活性，尤其從約pH8.1-8.5。
本發明也提供用混濁樣品同樣工作很好的測定。通過加入脂肪酶和α-環糊精到R1來減少濁度問題。這些有助於降低濁度，這是通過甘油三酸酯被脂肪酶水解成甘油和游離脂肪酸以及通過α-環糊精與游離脂肪酸形成複合體。加入這兩種成分有助於在加入試劑3前澄清反應混合物。用EDTA取代脂肪酶和α-環糊精提供另一種精確分析混濁樣品的方法。
本發明的另一個變化是測試不同體積的試劑的效果。這些變化對測定的精確性沒有顯著作用。
本發明也測試不同去汙劑和其濃度的效果。例如，Genapol X-80可以約0.05-0.5％的濃度存在於試劑1。濃度更優選在0.1-0.5％間，更加優選在0.2-0.4％間。測試其中3個濃度(0.1％、0.3％和0.5％)，0.3％的濃度提供最精確的結果。Brij-35也在試劑1中變化濃度。Brij-35可用於本發明，在R1中的濃度約0.01-0.5％。此濃度範圍更優選從約0.015到約0.1％，更加優選從約0.020到約0.030％。測試的濃度(0.025％、0.05％、0.1％和0.5％)中，用0.025％濃度獲得最精確的一致的結果。
本發明也測試用Tris(2-羧乙基磷化氫)鹽酸鹽(TCEP)取代還原劑DTE，TCEP在純化水中穩定一段延長的時間。這種取代使試劑空白反應從約12-15mA/分鐘減少到約4-5mA/分鐘，使此測定的精確度更高。當TCEP用於本發明時，它的濃度範圍可從約6-53mM。此濃度範圍更優選從約10-45mM，更加優選從約20-30mM。在此專利申請測試的濃度中，26.44mM提供最精確的測定結果。
含試劑3的混合物組成也變化。例如，Tris緩衝液被磷酸緩衝液取代且甘油加入緩衝液。磷酸鹽在約50mM到約500mM範圍的濃度，pH7.6有效。甘油濃度範圍從約0.5％到15.0％(v/v)。磷酸鹽和甘油用於提供酶更長的半衰期，這用TRIS緩衝液是不可能的。
本發明的一個優點是它可使用任何一些儀器。例如，該測定適合在2種不同儀器Hitachi 911和Beckman CX5上測試。注意到用任一種機器獲得精確和一致的結果。另外，測定可僅用2種試劑進行，通過在儀器要求基礎上將R1和R2成分以正確比例混合。
最後，本發明適用於單校準點。重要的是，來自單校準點的結果和多點校準曲線一樣精確。
附圖的概述

圖1描述了吸光度相對時間圖，用丙酮酸水溶液(5-100μM)獲得，證明丙酮酸的定量。試劑成分描述於表1且儀器設置描述於表2。
圖2描述了吸光度值相對已知量丙酮酸(0-100μM)作圖的標準曲線。測定時間是5分鐘；圖3描述了吸光度相對時間圖，用胱硫醚水溶液(0-100μM)獲得。測量胱硫醚是通過CBL將胱硫醚酶促轉變成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。
圖4描述了胱硫醚測定標準曲線，用胱硫醚水溶液(0-100μM)獲得。反應時間是5或20分鐘；圖5描述了吸光度相對時間圖，證明CBS/CBL/丙酮酸氧化酶/過氧化物酶循環和信號系統。胱硫醚溶解於水以製備1和100μM間的濃度標準；圖6描述了吸光度相對時間圖，證明CBS/CBL/丙酮酸氧化酶/過氧化物酶循環和信號系統。高半胱氨酸溶解於水以製備0和100μM間的濃度標準；圖7描述了用高半胱氨酸水溶液(0-100μM)獲得的典型校準曲線，使用CBS/CBL/PO/HRP循環和檢測系統；
圖8描述了用高半胱氨酸水溶液(0-100μM)獲得的典型吸光度相對時間圖，使用沒有二硫蘇糖醇的CBS/CBL/LDH系統；圖9描述了用高半胱氨酸水溶液(0-100μM)獲得的典型吸光度相對時間圖，使用有二硫蘇糖醇的CBS/CBL/LDH系統；圖10描述了有或沒有二硫蘇糖醇時高半胱氨酸濃度(0-100μM)相對吸光度的校準圖。反應時間是5分鐘；圖11描述了用CBS/CBL/LDH酶循環系統獲得的定量結果間的相互關係，系統用DTT作為還原劑測量人血漿樣品中的高半胱氨酸，與Abbott IMx高半胱氨酸方法所得定量結果相比較；圖12描述的相關圖闡明本發明測定(y)相對商業購買IMx測定(x)間的相互關係，如實施例7所述；圖13描述的相關圖闡明本發明測定(y)相對常規HPLC測定(x)間的相互關係，如實施例7所述；圖14描述的相關圖闡明IMx測定(x)和HPLC測定(y)間的相互關係，如實施例7所述；圖15描述了吸光度相對時間的圖，用於實施例9所述無DTT的丙酮酸測定。
圖16描述了吸光度相對時間的圖，用於實施例9所述含DTT的丙酮酸測定。
特定實施方案的描述本發明提供均相酶循環測定用於評估樣品中的高半胱氨酸量。酶循環維持高半胱氨酸的穩態水平且進一步增加測試高半胱氨的敏感性。此外，本發明提供基因和表達載體以重組產生用於本發明的酶。也提供測試試劑盒用於評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。
高半胱氨酸在細胞中作為中間胺基酸存在，在甲硫氨酸代謝成半胱氨酸時產生。一般，體內產生的高半胱氨酸通過兩條途徑之一被迅速代謝(1)與絲氨酸縮合以形成胱硫醚或(2)轉變成甲硫氨酸，正常情況下其在體內的濃度(以及它的氧化形式高半胱氨酸)低。健康成人的平均血漿高半胱氨酸水平男性約為12μM，範圍從約8.6到約17.1μM，女性為10μM，範圍從約3.9到16.8μM(Vester等.，Eru.J.Clin.Chem.Biochem.，29549-554(1991)；Jacobsen等.，Clin.Chem.，40873-881(1994))。
近來，已確定生物樣品中高半胱氨酸水平的量在一些情況中具有臨床重要性。血液中高半胱氨酸量增加與動脈硬化症的發展相關(Clarke等.，NewEng.J.Med.，3241149-1151(1991))。同樣，現在認為中等高半胱氨酸血症(homocysteinemia)是心血管病的危險因子。正常成人中發現的正常高半胱氨酸範圍的精確性很重要，因為已確定的心臟病危險顯著增加，僅超過正常濃度30％會使相關危險因子增加3.4倍(Stampfer等.，JAMA 268877-881(1992))。
如本文所用，術語「評估」包括定量和定性確定測試溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。如本文所用，「溶液」或「測試溶液」指臨床或生物液體樣品或組織提取物，可包括例如血液、血液衍生物如血漿、或尿等。
酶CBS存在時，含高半胱氨酸的樣品與L-絲氨酸反應以形成胱硫醚。胱硫醚然後可用第2種酶CBL轉變成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。同時用這些合成代謝和分解代謝酶操作的結果是「無效循環」，其中(1)胱硫醚和高半胱氨酸連續互變，(2)絲氨酸被降解以及(3)產生丙酮酸和氨。
與高半胱氨酸相比，使用相對高濃度的絲氨酸提供有助於總反應速度的條件，總反應速度遵循準一級動力學，直接取決於反應中高半胱氨酸和胱硫醚的量。如果胱硫醚濃度與高半胱氨酸濃度相比低許多，總反應速度會隨著高半胱氨酸量而線性變化。通過測量絲氨酸減少或者丙酮酸或氨的增加，未知溶液或樣品中高半胱氨酸的量可通過與對照反應進行相同酶反應比較來確定，對照反應包括已知濃度的高半胱氨酸。本發明的酶促循環方法提供擴增過程，產生的最終產物量遠大於測試溶液即血液中可能的高半胱氨酸量。因此，確定反應產生的丙酮酸或氨量的測定不必須很敏感且可通過技術人員已知的現有方法測量。
丙酮酸通常通過酶轉變成乳酸來測量，用乳酸脫氫酶或其衍生物。此酶促轉變反應需要輔因子NADH(還原的煙醯胺輔因子)或其衍生物，NADH轉變為NAD+(氧化的煙醯胺輔因子)。通過測量340nm的吸光度可監控反應。如本文所用，關於輔因子的術語「衍生物」指鹽、溶劑化物和其它化學修飾形式，這些形式保持整體輔因子活性，但在水溶液中穩定性擴展。衍生物可包括但不限於NADH的乙醯衍生物，包括3-吡啶醛-NADH、3-乙醯吡啶-NADH、3-硫代煙醯胺-NADH等(參見例如美國專利5,801,006)。
其它確定NADH或其衍生物氧化的簡便測定包括例如螢光測量，如Passoneau等.，《酶促分析，實踐指南》(Enzymatic Analysis，A Practical Guide)，219-222頁(1993)所述(納入本文供參考)。在另一個實施方案中，NADH或其衍生物在乳酸脫氫酶存在時與丙酮酸反應以形成NAD+，氧化時NAD+進一步與能產生顏色變化的染料反應，優選在可見範圍。染料的顏色變化可用於確定NADH氧化成NAD+的總量，與酶促循環反應形成的丙酮酸量相符合。可用於本發明的染料例子包括但不限於5，5』-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、甲基紫精或各自的衍生物。
丙酮酸也可在用丙酮酸氧化酶或其衍生物的反應中測量，存在過氧化物酶即辣奶過氧化物酶等。例如通過氧化縮合水溶性氫供體確定轉變成過氧化氫的丙酮酸量，此供體提供有色化合物用於光度測定過氧化物濃度。特別優選的氫供體提供穩定的顏色反應產物，包括N-烷基-N-磺丙基苯胺衍生物的水溶性衍生物，即N-乙基-N-(2-羥基3-磺丙基)-m-甲苯胺(TOOS)的鈉鹽(Tamaoku等.，Chem.Pharm.Bull.302492-2497(1982))。H2O2的量也可電勢測量。這包括安培計和電位計測量。測定高半胱氨酸和/或胱硫醚的量由過氧化物量的相關性確定，過氧化物通過丙酮酸氧化酶在規定時間段從丙酮酸轉化產生。
氨也可用不同方法測量，包括使用氨傳感器(Willems等.，Clih.Chem.342372(1988)。氨也可用已知比色技術檢測。例如，樣品中產生的氨能反應形成有色產物，形成可分光光度檢測的產物。納入本文供參考的《酶促分析方法》(Methods ofEnzymatic Analysis)(Bergmeyer)11049-1056(1970)所述方法取決於次氯酸鹽存在時氨與苯酚在鹼性條件反應形成有色染料靛酚。硝普鈉可用作催化劑。也可使用修改的方法，例如使用多種衍生物。有色最終產物形成的量與氨濃度成正比，因而與高半胱氨酸成正比。其它方法可包括例如微擴散分析(Seligson等.，J.Lab.Clin.Med.，.49962-974(1957)、陰離子交換技術(Forman，Clin.Chem.10497-508(1964)和多種酶方法(參見例如Mondzac等.，J.Lab.Clin.Med.，.66526-531(1979))。
評估高半胱氨酸和/或胱硫醚量的酶促循環方法減少其它先前測定法中的困難，其中背景化合物和背景反應產生「噪音」。在本發明測定中，可加入大量廉價胺基酸如L-絲氨酸以使L-絲氨酸全轉變成丙酮酸和氨。在較佳實施方案中，可使用250μM或更高的絲氨酸濃度，隨後轉變成丙酮酸和氨。血漿通常含約100μM絲氨酸。此內源絲氨酸的量對於本測定不重要，因為該測定測量轉變的速度受高半胱氨酸量的限制而不是絲氨酸量的限制。不預期約0.1mM到10mM的L-絲氨酸濃度影響所示測定的敏感性或精確性。
此外，本發明酶促循環方法提供的L-絲氨酸轉化的速度取決於準一級反應中的高半胱氨酸濃度。正常血液丙酮酸水平通常在約0.4和2.5mg/100ml間(Lehniger，AL.《生化原理》(Principles of Biochemistry).1982.WorthingtonPublishers，Inc.707頁，納入本文供參考)，與約45-284μM相符合。此丙酮酸濃度可提供較小背景測量，但本測定測量隨著時間的變化並能方便調節用於溶液中起始水平的丙酮酸。另外，丙酮酸可在乳酸脫氫酶或其它酶溫育前去除。更重要的是，半胱氨酸和其它攜帶硫的化合物如血液不顯著有助於酶促循環反應，因此被認為是系統中不重要的嘈音。
在本發明的另一個實施方案中，可處理樣品以去除胱硫醚提高高半胱氨酸測量的精確性。作為一個特定例子，處理包括胱硫醚γ-裂合酶接觸溶液使胱硫醚轉變成α-酮戊二酸(不參與上述酶促循環的化合物)。進行酶促循環測定以評估高半胱氨酸量前，胱硫醚γ-裂合酶必須從樣品中去除或破壞，即通過熱等。
發明的此特定實施方案也可用於評估胱硫醚的量，通過在進行酶促循環測定前比較胱硫醚γ-裂合酶處理和未處理樣品中丙酮酸和/或氨的產生速度的差異。因此，本發明可用於確定未知樣品中胱硫醚的量，即使樣品包含高半胱氨酸。
在一些生物樣品如血液中，高半胱氨酸通常經二硫鍵結合蛋白質、硫醇和其它細胞成分。一般，處理樣品可用還原劑如硼氫化鈉或硼氫化鉀；硫醇如二硫赤蘚糖醇、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、巰基乙酸或穀胱甘肽；或者磷化氫或三烷基磷化氫如三丁基磷化氫和tris(2-羧乙基)磷化氫(TCEP)等，以釋放結合和二硫鍵連接的高半胱氨酸。先前測定法需要抗體用於檢測步驟，必須改變反應混合物的氧化還原條件(大部分抗體用二硫鍵結合)。然而，本方法中不需要洗滌或改變氧化還原條件，因為所用CBS和CBL在還原條件下具有活性。因此，本發明測定所需步驟少於許多現有技術的免疫測定。
在一個典型實施方案中，樣品包括血液、血液部分、血清、血漿或尿，用還原劑處理且直接測定高半胱氨酸。也優選在測定前加熱樣品，用於加速釋放高半胱氨酸並使降解酶和其它可幹擾測定的因子失活。用於高半胱氨酸測定的血液樣品的一般處理對於其它方法領域的技術人員已知，其它方法如HPLC測試。
CBS和CBL是自然界中常見的酶。人和酵母使用CBS合成甲硫氨酸；CBS的人cDNA可取代啤酒酵母中的CBS基因(Kruger等.，Hum.Molec.Genet.，41155-1161(1995))。CBL在許多細菌中發現，包括大腸桿菌(Laber等.，FEBS Lett.，37994-96(1996)。CBS和CBL基因的完整DNA序列在這些生物體和其它種類中已知，為給熟練的分子生物學家提供了易克隆或合成這些基因或其衍生物的來源。
如本文所用，關於酶的「衍生物」指通過胺基酸加入、缺失、取代和/或修飾產生的突變體；通過重組和/或DNA改組產生的突變體；鹽、溶劑化物和酶的其它化學修飾形式，修飾形式保持分離的天然酶的酶活性。通過DNA改組產生用於本發明的衍生酶的方法描述於美國專利5,605,793(納入本文供參考)。即使沒有克隆，兩種酶從一些不同生物體中純化。參見例如Ono等.，Yeast.，10333-339(1994)；Dwivedi等.，Biochemistry 213064-3069(1982)，納入本文供參考。在本發明的一個較佳實施方案中，提供遺傳修飾的生物體以產生CBS或其衍生物和產生CBL或其衍生物，它們可用於酶促循環測定以提供成本降低的試劑且純化酶更容易。
類似地，關於核苷酸序列的術語「衍生物」指通過核苷酸加入、缺失、取代和/或修飾和/或組合化學產生的變體和突變體；通過重組和/或DNA改組產生的突變體；鹽、溶劑化物和序列的其它化學修飾形式，修飾形式保持所需序列的活性如MetR的結合特性。當使用修飾的衍生序列時，序列優選與原始序列有至少約60％的序列同一性。此同一性更優選為至少約70％，更加優選為至少約85％。這些序列最優選與原始序列有至少約95％的序列同一性。
CBS基因和釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的完整基因組已被測序。同樣，CBL基因和大腸桿菌的剩餘基因也已知。因此，使用分子生物領域的普通技術，編碼CBS和CBL的基因可在兩種生物體中克隆和表達。已知純化兩種酶的發表方法，使用標準蛋白質純化方法。然而各酶可構建作為融合蛋白，包括例如協助活性酶溶解和/或重摺疊的另一種蛋白質部分或可加入協助純化的胺基酸序列。加入用於純化的胺基酸序列例子包括親和標記如聚-His，或可加入穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)以在單個親和柱上更迅速純化蛋白質。儘管酶不需要純化均勻用於本發明的診斷測試，蛋白酶和其它使絲氨酸轉變成丙酮酸的活性可通過純化降低到不重要水平。
此外，酶濃度一般在反應期間和長期保存時產生穩定性較高的酶活性。CBS和CBL來自除了釀酒酵母和大腸桿菌外的生物體，特別是嗜熱生物，預期是具更高穩定性的酶來源。也可選擇與高半胱氨酸親和性較高的分離酶。另外，酵母CBS和細菌CBL的蛋白質工程可產生商業性質改進的酶，包括較高親和性、較快反應速度、較易純化和保存時較長的半衰期。
類似地，胱硫醚γ-裂合酶(CGL)在許多種類中詳細描述(參見例如Yamagata等.，J.Bacteriol.，1754800-4808(1993)，納入本文供參考)。操作編碼CGL的基因可通過標準重組方法進一步遺傳修飾並插入宿主細胞以開發較高水平的生產菌株。
重組表達CBS、CBL和CGL基因是典型的。這些方法可提供大量純化酶且基因可被修飾，例如加入特定肽序列(親和標記)以表達能用於親和純化的酶。通過在重組酶表達中使用親和標記，可大大簡化這些酶的純化和固定，降低成本。親和標記在本領域已知，包括但不限於如聚-組氨酸、GST(穀胱甘肽-S-轉移酶)、p-標記、「標誌」、c-myc序列等。標記廣泛用於親和純化重組表達的蛋白質，許多可商業購買。
在一個較佳實施方案中，CBS和CBL固定於固體表面，以維持酶活性和保持高半胱氨酸不直接與蛋白質相互作用的方式。通過高密度固定酶，不同蛋白質間的擴散距離相對溶液中的酶減少。結果，測定的總反應速度大大增加，因為一種酶的產物與另一種酶反應且反之亦然。加速反應速度是由於中間物濃度的局部提高，固定使中間物與下一個酶更接近。增加高半胱氨酸測定速度可以是診斷產品市場性的重要因素，因為CBS和CBL的Km在毫摩爾範圍中，但高半胱氨酸的血液濃度約為10μM。已知擴散-限制反應需要高濃度的酶以提供快速的反應速度。在循環測定中固定酶克服這兩種酶對它們各自底物低親和性可能產生的困難。
在另一個較佳實施方案中，CBS和CBL固定作為融合蛋白。兩種不同蛋白質彼此的距離和方向可在融合基因表達載體的構建中控制。通過使兩種活性適當位於融合蛋白中，高半胱氨酸和胱硫醚互變能在蛋白質內很迅速發生，因為擴散距離可在兩個活性中心間最小化。因此，高半胱氨酸在整體酶促循環反應中表現像輔因子，從L-絲氨酸產生丙酮酸和氨。
本發明的酶促循環測定可以一些測定模式提供。最簡單的測定模式提供的試劑溶液包括L-絲氨酸、CBS或其衍生物、CBL或其衍生物、最優化酶反應所需的多種緩衝液和輔助物質。在本發明的一個特別較佳實施方案中，CBS或其衍生物、CBL或其衍生物固定於固體表面。
酶固定於固體表面同時保持大體上所有酶活性在本領域熟知。用於固定的一些方法包括共價結合、物理吸收、截留和電化學沉積。作為一個例子，戊二醛用於固定肌酸酐脫氨酶和穀氨酸氧化酶到丙胺衍生控制的孔玻璃珠(Rui等.，Ann.NYAcad.Sci.，672264-271(1992))。其它例子包括但不限於用碳二亞胺使酶共價附於琥珀酸衍生玻璃珠(Rui等.，同上)、用異或同-雙功能交聯試劑(如SPDP、N-琥珀醯亞胺基3-(2-二硫代吡啶)丙酸鹽；SMPT、琥珀醯亞胺氧羰基-α-甲基-α-(2-二硫代吡啶)-甲苯；DSP、二硫雙(琥珀醯亞胺基丙酸鹽)(succinimidylpropionate)；DTSSP、3，3』-二硫雙(磺基-琥珀醯亞胺基丙酸鹽)；DSS、二琥珀醯亞胺基辛二酸酯等)使酶通過例如氨或巰基共價附於衍生固體表面(Wilson等.，Biosens.Bioe lectro.，11805-810(1996))。
如本文所用，「固體表面」可包括多孔或非多孔水不溶性物質，能具有任何形狀如條、杆狀顆粒，包括珠等。合適材料在本領域熟知且可包括例如紙、濾紙、尼龍、玻璃、陶瓷、矽石、氧化鋁、硅藻土、纖維素、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚氯乙烯和它們各自的衍生物。固體表面可以是測試容器的側面和底部或可以是加入測試容器的物質。在一個較佳實施方案中，固體表面包括加入測試容器的珠。
酵母和細菌都具有將L-絲氨酸轉變成丙酮酸的酶，活性有時稱為絲氨酸脫氨酶或絲氨酸脫水酶。很好確立的突變方法可用於大幅降低或除去這些活性，活性可顯著地產生高半胱氨酸測定中的背景。尤其是可遺傳操作釀酒酵母以去除絲氨酸脫氨酶活性，此活性對於(1)異亮氨酸合成和(2)以絲氨酸作為碳或氮源生長是必需的，使用稱為「基因破壞」的簡單方法。通過缺失酵母chal基因去除主要的絲氨酸脫氨酶活性，從而去除循環測定的一個潛在背景問題。此外，chal缺失可用於選擇CBS-CBL融合蛋白並用於遺傳改造這些融合蛋白。chal缺失菌株不能以絲氨酸作為唯一碳或氮源生長。CBS-CBL融合基因能互補缺失，只要有高半胱氨酸作為「輔因子」，因為循環系統產生的最終結果與絲氨酸脫氨酶相同。因此，chal缺失可用於選擇和維持改進的CBS-CBL融合，特別是如果融合基因群被突變並置於單拷貝載體或酵母染色體上。在絲氨酸培養基上生長較快或高半胱氨酸需求減少的細胞可包含的突變編碼較快速酶或對高半胱氨酸和胱硫醚親和性較高的蛋白質。
本發明也提供另外方法評估樣品中高半胱氨酸的量，使用代謝物結合轉錄因子。當代謝物結合轉錄因子結合它們各自的代謝物時，因子複合體結合特異受體多核苷酸序列。可監控轉錄因子複合體結合其受體共有序列並與樣品中存在的代謝物量相關。
本領域已知的一些轉錄因子與小分子或代謝物相聯時，結合特異DNA結合位置。例如，大腸桿菌有操縱子調節元件，轉錄因子MetR調節響應於結合高半胱氨酸的Met操縱子(Cai等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，16379-83(1989))。MetR或其衍生物調節基因如MetE(不依賴cobolamin的甲硫氨酸合酶)、MetH(依賴cobolamin的甲硫氨酸合酶)和GlyA(絲氨酸氫化酶)。MetR和其衍生物優選在高半胱氨酸存在時結合其共有DNA序列且缺乏高半胱氨酸時不存在於細胞胞質中。高半胱氨酸存在時結合MetR可用於評估懷疑含高半胱氨酸的樣品中高半胱氨酸的量。
在發明的一個特定實施方案中，測定包括多核苷酸序列編碼固定於固體支持物的MetR受體多核苷酸的共有序列，固定的方式能接近共有受體序列以結合MetR。
核苷酸可以是例如GTTAATGTTGAACAAATCTCATGTTGCGTG(SEQ ID NO11)處理樣品如血漿、血液或尿以在樣品混合試劑溶液前釋放任何結合蛋白質的高半胱氨酸，溶液包括緩衝劑中的MetR，存在固定共有受體序列時，在有助於形成複合體的條件下。溫育階段後，洗滌固體支持物以去除未結合試劑且評估保持結合固體支持物的MetR量。確定保持結合固體表面的MetR量通常可以是ELISA、表面胞質基因組共振即BIACORE或簡單的標準蛋白質測定，此量與樣品中存在的高半胱氨酸量相關。
處理樣品以釋放高半胱氨酸可用還原劑完成。上述一些試劑在本領域熟知。通常樣品混合含足夠量還原劑的緩衝溶液以從樣品中存在的任何相關蛋白質中釋放大體上所有高半胱氨酸。普遍使用的還原劑包括但不限於硼氫化鈉和硼氫化鉀、β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、巰基乙酸或穀胱甘肽；或者膦或三烷基膦，如三丁基膦和tris(2-羧乙基)膦(TCEP)等。
也可修飾MetR蛋白質以摻合可檢測標記，如生色團、螢光團等，以改進測定的速度和敏感性。加入可檢測標記能減少進行測定所需時間段，這是通過去除一些樣品處理步驟，例如另外的洗滌步驟。摻合的螢光團發出波長被寡核苷酸吸收到共有結合序列的光，能測量螢光能量轉移以定量蛋白與共有序列的結合。可用於測量螢光轉移的方法包括例如螢光共振能量轉移(FRET)或鄰近閃爍測定。通過在結合結構域中加入另外可檢測標記對MetR結合共有序列另外修飾也可改進測定的特異性。
此外，確定肽序列(親和標記)可加入MetR蛋白質以協助純化和檢測。親和標記在本領域已知且包括但不限於例如聚-組氨酸、strep-標記、「標誌」、c-myc序列等。標記廣泛用於親和純化重組表達的蛋白質，許多可商業購買。另外，改進重組表達MetR的結合親和性的突變改變可用於提供其它的測定試劑。
在本發明的一個單獨實施方案中，樣品中高半胱氨酸的量可通過樣品中高半胱氨酸的酶利用來確定。細胞代謝中高半胱氨酸轉化通常從高半胱氨酸的巰基殘基中釋放質子。釋放此質子用於測量高半胱氨酸對大腸桿菌cobolamin依賴的甲硫氨酸合酶的結合親和性(Jerret等.，Biochemistry，3615739-15748(1997))。蛋白質如甲硫氨酸合酶催化的酶反應一般需要輔因子或另外的底物已完成反應。如果這些輔因子和底物不存在，高半胱氨酸仍結合酶。在本方法中，測量釋放的質子去除酶反應釋放的質子，推動反應趨向消耗樣品中存在的高半胱氨酸。測量與釋放質子相關的pH變化確定樣品中高半胱氨酸的量。例如在一個較佳實施方案中，不依賴cobolamin的甲硫氨酸合酶可用於測定。
為方便起見，本發明所用試劑可在用於測定方法的測試試劑盒中提供。典型試劑盒包括容納測試溶液的小型組合容器、L-絲氨酸、CBS或其衍生物、CBL或其衍生物、最佳反應條件所需的輔助緩衝液和物質。重要的是，多種防腐劑和/或穩定劑也能包括在任何/所有試劑盒試劑和/或酶中以延長半衰期以及樣品測定的「聯機」壽命。試劑盒可進一步包括還原劑或CGL以在循環測定前預處理樣品。此外，試劑盒可包括乳酸脫氫酶、NADH和氧化時能觀察到顏色改變的染料。
在合適情況下，試劑盒中一種或多種試劑可在溶液中提供(有或沒有防腐劑和/或穩定劑)或作為乾粉，通常凍幹，包括賦形劑、防腐劑和/或穩定劑，溶解時可提供具合適濃度的試劑溶液以根據本發明進行測定。為提高發明的多功能性，試劑可在相同或不同容器中以小型組合提供，從而提供顯著最優化方法和測定的試劑比例。試劑可各自在不同容器中或多種試劑能在一個或多個容器中結合，這取決於試劑的穩定性。為方便起見，本發明測定方法所用試劑可以預定量提供。測試試劑盒也能包含書面說明，指導如何使用試劑和/或如何進行特定測定，例如以包裝插入物形式。
提供以下例子用於闡述，而不用於限制。
實施例1大腸桿菌胱硫醚β-裂合酶基因的克隆和表達在此例子中，使用標準PCR過程克隆大腸桿菌CBL基因。分離基因插入具親和標記序列(6HIS)的表達載體中，表達蛋白用親和柱純化。宿主細胞中大量CBL酶活性用表達載體構建物轉化，從細胞裂解物中純化。
大腸桿菌胱硫醚β-裂合酶(CBL，EC 4.4.1.8)基因的克隆標準PCR過程使用擴展高保真PCR系統(Roche Biochemicals)，用於擴增大腸桿菌CBL基因，用ONE SHOT TOP10感受態大腸桿菌細胞(Invitrogen)作為基因組DNA來源。用於CBL克隆的PCR引物序列如下(CBL N-末端引物5』-CGACGGATCCGATGGCGGACAAAAAGCTTG-3』；SEQ ID NO1)和(CBL C-末端引物5』-CGCAGCAGCTGTTATACAATTCGCGCAAA-3』；SEQ ID NO2)。PCR擴增的CBL基因產物然後通過瓊脂糖凝膠電泳純化，用BamHI和PvuII限制性內切酶消化，再次通過瓊脂糖凝膠電泳純化。然後純化的大腸桿菌CBL基因連接入凝膠純化、BamHI/PvuII消化的pRSETB蛋白質表達載體(Invitrogen)。所得構建物提供T7轉錄啟動子控制下的CBL基因，與氨基末端6個組氨酸(6HIS)殘基前導序列(後稱為6HISCBL)框內克隆，可方便表達、親和純化和免疫染色分析來自大腸桿菌細胞的重組6HISCBL蛋白。列出大腸桿菌胱硫醚β-裂合酶(CBL)基因的DNA序列(SEQ IDNO21)。也列出克隆的大腸桿菌胱硫醚β-裂合酶(CBL)蛋白質序列(SEQ IDNO19)，它具有氨基-(NH3)-末端6個組氨酸(6HIS)親和標記，由CBL基因克隆入pRSETB細菌表達質粒產生。
胱硫醚β-裂合酶蛋白表達和純化pRSETB(6HISCBL)質粒構建物轉化入BL21(DE3)pLysS大腸桿菌菌株(Invitrogen)，在LB/瓊脂平板上塗布，平板含(100μg/ml氨苄青黴素、35μg/ml氯黴素)，然後37℃培養過夜。然後轉移單細菌菌落並在含100ml LB生長培養基的燒瓶中生長過夜，培養基含氨苄青黴素和氯黴素。然後100ml過夜培養物加入多個含1L新鮮LB生長培養基的燒瓶，培養基含氨苄青黴素，使培養物生長直到A600為0.6(約2.5小時)。為誘導CBL蛋白表達(由T7啟動子驅動)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)然後加入生長培養基至0.1到1mM終濃度。CBL酶輔因子吡哆醛5』-磷酸(PLP)也在誘導中加入生長培養基至100μM終濃度。監控細胞生長和6HISCBL蛋白表達5小時後，大腸桿菌細胞通過離心收集、重懸浮、在無EDTA的完整蛋白酶抑制劑(Roche Biochemicals)存在時加入BUGBUSTER蛋白質提取試劑(Novagen Inc.)來裂解，如廠商規程所述。然後細胞裂解物用DNase I處理，通過離心澄清並上樣到親和柱，柱含聚-His蛋白質純化樹脂(RocheBiochemicals)。然後柱用10床體積的平衡緩衝液(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl)洗滌，接著用5床體積的洗脫緩衝液1(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl、10mM咪唑；EB1)、5床體積的洗脫緩衝液2(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl、50mM咪唑；EB2)和5床體積的洗脫緩衝液3(50mM KPi，pH7.8、0.5M NaCl、500mM咪唑；EB3)洗脫。然後純化過程各步驟中所取樣品通過變性蛋白凝膠電泳(SDS-PAGE)分析並用考馬斯亮藍染色或用綴合小鼠免疫球蛋白的單克隆抗聚組氨酸過氧化物酶進行蛋白質印跡分析檢測，如廠商所述(Sigma)。
發現純化6HISCBL蛋白主要在洗脫緩衝液2和3(EB2和EB3)中洗脫。含CBL的洗脫物然後用離心過濾室(Amicon)濃縮且在4℃對貯存緩衝液(50mMTrisHCl，pH8、100mM NaCl、5mM PLP)透析過夜，等分並在-80℃冷凍保存。然後純化均一的CBL酶濃度在280nm消光係數和43，312 Da亞基重量的基礎上計算(Clausen等.Biochem.3612633-42(1997))。純化6HISCBL的典型產量在20-30mg6HISCBL每克大腸桿菌細胞團範圍中。
CBL活性測定從pRSETB(6HISCBL)質粒構建物表達的親和純化重組6HisCBL蛋白的CBL活性如前所述進行(Clausen等.Biochem.3612633-42(1997)，納入本文供參考)。簡單地，測定混合物在1mL的終反應體積中含100mM Tris/HCl(pH8.5)、5mM L-胱硫醚、1mM 5，5』-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DNTB；Ellman試劑)和6HisCBL酶。反應後記錄412nm吸光度隨著時間的增加。相同酶反應也在具已知底物濃度的樣品上進行以產生標準曲線。完整細胞裂解物中檢測到的大體上所有CBL活性被恢復並發現存在於重組6HisCBL酶的實驗純化樣品中，酶產生自pRSETB(6HisCBL)質粒構建物。
實施例2酵母胱硫醚β-合酶(CBS)基因在酵母中的克隆和表達在此例子中，PCR方法用於從酵母中克隆CBS基因。含CBS基因的PCR片段插入有和沒有親和標記的表達載體，標記加入有助於表達基因產物的純化。
釀酒酵母的實驗室菌株(5153-11-1(his3 met2))用作CBS基因來源。細胞在YEPD上32℃生長，離心，用水洗滌並轉移到200μl酵母質粒緩衝液(100mM NaCl、10mM Tris(pH8)、1mM EDTA、0.2％SDS)中。細胞懸浮液與等體積的0.45mm玻璃珠混合併以高速渦旋3×30秒。液體通過移液管除去且在microfuge中離心2分鐘以去除細胞碎片。上清用PCI(酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和氯仿提取。加入氯化鈉(5M)(約20μl)，DNA用等體積異丙醇沉澱。
此基因組酵母DNA通過PCR用引物CI-001(CGGGGATCCTGATGCATGCATGATAAGGA；SEQ ID NO3)和CI-012(CGGCATTACCGTTTCACTAATTTATTG；SEQ ID NO4)擴增，引物是發表的酵母CBS結構基因側翼核苷酸序列。引物CI-001(SEQ ID NO3)包含在CBS基因的非翻譯3』側上發現的BamHI位點。為將BamHI序列加入PCR片段的5』側，基因進一步通過PCR用CI-001(SEQ ID NO3)和CI-002(GTTGGATCCGGCATTA CCGTTTCAC；SEQ ID NO5)擴增。所得PCR產物是約1937個鹼基對的DNA序列，包括1512個編碼CBS蛋白的鹼基對。在編碼序列側翼的另外DNA包括酵母CBS基因的天然啟動子和轉錄終止序列。
一個強啟動子插入CBS基因上遊以促進蛋白質高水平表達。酵母TPI1啟動子在標準PCR反應中從相同基因組酵母DNA克隆，使用引物CI-009(GGTGGATCCATCAATAGATACGTA CGTCCT；SEQ ID NO6)和CI-010(TTTTAGTTTATGTATGTGTTTTTTG；SEQ ID NO7)。為使CBS編碼區附於TPI1啟動子，使用銜接引物CI-011(AACACATACATAAACTAAAAATGACTAAATCTGAGCAGCAA；SEQ ID NO8)，它包含TPI1啟動子的20個鹼基和CBS基因的前21個鹼基。上面獲得的CBS序列通過PCR用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-011(SEQ IDNO8)擴增。所得PCR產物與來自上面的TPI1啟動子產物混合，混合物通過PCR用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-009(SEQ ID NO6)擴增以產生命名為「TPICBS」的融合基因，基因包括TPI1啟動子、CBS編碼序列和CBS轉錄終止子。
CBS和TPICBS PCR產物各自在編碼區的5』和3』側包括BamHI位點。這些PCR產物用PCR WIZARD PREP(Promega)根據廠商建議純化，用BamHI切割。所得BamHI核苷酸片段在1％瓊脂糖TBE凝膠上跑並用NA45紙(SS)純化。酵母、大腸桿菌穿梭載體C1-1在四環素抗性基因中具有獨特BamHI位點，用於表達CBS基因。C1-1載體用BamHI切割並根據廠商說明(Roche Biochemicals)用蝦鹼性磷酸酶處理。CBS和TPICBS BamHI片段連接入線性化C1-1載體。連接反應轉化到TOP10細胞(Invitrogen)中，細胞在LB氨苄青黴素板上平板培養。抗氨苄青黴素的轉化子轉移到LB amp和LB tet平板以確定四環素敏感克隆。從LBamp平板選擇一些tet-敏感菌落，在LB amp平板上生長過夜，通過質粒DNA的鹼裂解法進一步加工。DNA用BamHI切割並在1％瓊脂糖膠上分離以確定哪個質粒含CBS或TPICBS插入物。
攜帶插入物的C1-1質粒轉化到酵母菌株INVSc-1中，它是可從Invitrogen公司購買的二倍體菌株。INVSc-1在LEU2基因的2個拷貝中都有突變且需要來自C1-1質粒的LEU2基因以在無亮氨酸的培養基上選擇性生長。INVSc-1用C1-1相關質粒轉化，根據廠商說明使用Invitrogen的酵母轉化試劑盒。此試劑盒包括用消解酶產生細胞的原生質球，接著鈣處理用於DNA轉化。轉化子在合成培養基上平板培養，培養基含1M山梨糖醇、酵母氮基礎組分和酵母補充物，除了亮氨酸。32℃培養3天後，轉化子在覆蓋瓊脂中可見。
聚-組氨酸附於胱硫醚β-合酶用於酵母表達編碼6個組氨酸的DNA序列在CBS和TPICBS載體構建物中加入CBS編碼區的3』末端。通過用引物CI-017(ATGATGATGATGATGATGACCTGCT AAGTAGCTCAGTAA；SEQ ID NO9)擴增來自上面的CBS PCR片段，聚組氨酸的編碼序列加入原始CBS克隆。所得PCR產物包括天然CBS啟動子區、CBS編碼區以及進一步的甘氨酸和6個組氨酸殘基編碼序列。加入甘氨酸殘基以增加翻譯後聚-his肽的空間靈活性。聚-his CBS PCR產物從原始CBS DNA膠純化，其後用引物CI-002(SEQ ID NO5)和CI-017(SEQ ID NO9)連續2次PCR擴增以實際上去除原始CBS DNA。
類似地，來自上面的TPICBS PCR產物用引物CI-009(SEQ ID NO6)和CI-017(SEQ ID NO9)擴增。PCR產物是凝膠純化，並用CI-009(SEQ ID NO6)和CI-017(SEQ ID NO9)重擴增2次以大幅減少輸入TPICBS DNA序列。
CBS基因也通過PCR用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-018(CATCATCATCATCATCATTAAATAAGAACCCACGCT；SEQ ID NO10)擴增以產生具TAA終止密碼子的聚-組氨酸序列，接著是轉錄終止序列。此約190bp的短PCR產物(「終止子」)也是凝膠純化並通過PCR用相同引物克隆。聚-his CBS和「終止子」片斷結合在一個PCR反應中，使用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-002(SEQ ID NO5)。所得擴增產生名為「CBSH」的核酸分子，包括天然CBS啟動子、完整CBS編碼區、一個另外的甘氨酸殘基、具終止密碼子的6個組氨醯殘基以及CBS轉錄終止子。
同樣，聚-his TPICBS和終止子片斷結合在一個PCR反應中，使用引物CI-001(SEQ ID NO3)和CI-009(SEQ ID NO6)。所得名為「TPICBSH」的核酸產物與CBSH序列相同，除了TPI1啟動子取代天然CBS啟動子。CBSH和TPICBSH(各包含聚-組氨酸親和標記序列)用BamHI切割並連接入C1-1，如以上適合於CBS和TPICBS序列。連接混合物轉化入INVSc-1。Tet-敏感菌落通過限制性酶分析檢測適當的克隆基因插入C1-1中。
實施例3酵母胱硫醚β-合酶(CBS)基因在大腸桿菌中的克隆、表達和純化在此例子中，標準PCR和分子生物學技術用於克隆釀酒酵母(INVSc1)胱硫醚β-合酶(CBS)基因作為具氨基-末端穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)的融合蛋白。加入此穀胱甘肽-S-轉移酶區域可從大腸桿菌培養基中單步親和純化CBS蛋白，也能協助活性形式酶的溶解和/或促進適當重摺疊。
克隆釀酒酵母的實驗室菌株(INVSc1)(Invitrogen)用作CBS基因來源。INVSc1酵母單菌落在100μl去離子水中煮沸5分鐘，在等體積0.45mm玻璃珠存在時迅速渦旋2分鐘。1微升此細胞裂解物然後用作酵母CBS基因的PCR擴增的DNA來源，使用引物CI-024(GCGGGTCGACTATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCC；SEQ IDNO12)和CI-025(GCGTGCGGCCGCGTTATGCTAAGTAGCTCAG；SEQ IDNO13)，引物包含發表CBS基因的側翼序列和克隆到pGEX-6P-2(AmershamPharmacia)表達載體的限制性位點。所得PCR產物(約1548bp)然後通過瓊脂糖凝膠分離和純化，DNA提取用商業試劑盒(Roche)。純化PCR產物所含CBS基因側翼有SalI(5』末端)和NotI(3』末端)限制性酶位點，然後被消化(通過SalI和NotI)、凝膠純化、連接入pGEX-6P-2表達載體(Amersham Pharmacia)。限制性酶圖譜用於確認PCR擴增的DNA作為酵母CBS基因的同一性。描述了克隆釀酒酵母胱硫醚β-合酶(CBS)基因的DNA序列(SEQ ID NO14)。也描述了克隆釀酒酵母CBS的蛋白質序列(SEQ IDNO20)，此序列由於克隆到細菌表達載體pGEX-6P-2的結果附著具有氨基-(NH3)-GST融合蛋白。
表達和純化含克隆酵母CBS基因的pGEX6P-2表達載體(如上所述)轉化到TOP10大腸桿菌細胞(Invitrogen)中。挑出單菌落且細胞培養物在含100μg/ml氨苄青黴素的LB培養基中30EC生長直到600nm吸光度達到約0.5 OD。為誘導GST-CBS融合蛋白表達(由tac啟動子驅動)，異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)加入生長培養基至0.1mM終濃度。CBS酶輔因子吡哆醛5』-磷酸也在誘導中加入生長培養基至100μM終濃度。然後誘導細胞在30℃生長另外21小時，接著離心收集。
然後如廠商(Amersham Pharmacia)規程所述，用穀胱甘肽瓊脂糖4B親和樹脂親和純化GST-CBS蛋白。簡單地，細胞懸浮於磷酸緩衝鹽水(PBS)並在冰上由超聲波破壞。然後TritonX-100加至0.1％的終濃度(v/v)，超聲處理物在室溫搖30-45分鐘。細胞裂解物然後通過離心清除不溶碎片，用DNase I處理，上樣到穀胱甘肽瓊脂糖4B親和樹脂柱。非特異結合的蛋白質用10柱體積PBS洗去，然後所需GST-CBS蛋白從親和樹脂洗脫，洗脫是通過加入5柱體積的洗脫緩衝液(50mMTris，pH8、1.4mMβ-巰基乙醇(BME)、100mM NaCl、0.1％(v/v)TritonX-100、50mM還原型穀胱甘肽)。純化GST-CBS融合蛋白然後通過考馬斯藍染色的SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉，聚丙烯醯胺凝膠電泳)確認。然後洗脫的GST-CBS透析到貯存緩衝液(50mM TrisHCl，pH8、100mM NaCl、5μM PLP)，等分並在-80℃冷凍保存。然後純化GST-CBS的濃度用MICRO BCA蛋白測定試劑盒(Pierce Chemical)確定。純化GST-CBS的典型產量在5-10mg GST-CBS每克大腸桿菌團範圍中。
CBS活性測定純化酵母GST-CBS融合蛋白的CBS活性如Kashiwamata和Greenberg(Biomchem.Biophy.Acta 212488-500(1970))所述進行。此測定以CBS從絲氨酸和高半胱氨酸合成胱硫醚的能力為基礎。然後分光光度確定CBS形成的胱硫醚量，通過檢測455nm的茚三酮反應色原並與標準曲線比較，標準曲線用已知胱硫醚濃度的樣品產生。CBS活性也通過下文所述酶測定或技術人員熟知的其它測定來確定。
實施例4ADH2CYS4融合構建物的構建酵母胱硫醚β-合酶在酵母中的表達和純化在此例子中，強啟動子ADH2插入CYS4基因上遊且構建與酵母CBS基因的融合以促進較高蛋白質表達。ADH2啟動子由Adrlp調節，當酵母細胞在含葡萄糖的培養基中生長時被抑制，當細胞在非發酵性碳源中生長時去抑制。如果超量產生蛋白質對細胞致死，這可調節表達。
ADH2CYS4基因的構建酵母基因組DNA用引物CI-029(CTATATCGTAATAATGACTAAATCTGAGCAGCAAGCCG ATTCA；SEQ ID NO15)和CI-017(ATGATGATGATGATGATGACCTCGTAAGTAGCTCAGTAA；SEQ ID NO9)擴增以產生所有沒有終止密碼子和轉錄終止子的CYS4基因。除了CYS4基因的前10個密碼子，CI-029(SEQ ID NO15)引物包含克隆ADH2啟動子區域的至少13個鹼基。引物CI-017(SEQ IDNO9)具有CYS4基因最後6個密碼子的序列，終止密碼子加甘氨醯殘基和6個組氨醯殘基除外。所得PCR產物包括CYS4編碼區以及的甘氨酸和6個組氨酸殘基的進一步編碼序列。加入甘氨酸以增加翻譯後聚-his肽的空間靈活性。「終止子」片段通過擴增相同基因組DNA產生，使用引物CI-018(CATCATCATCATCATCATAAAT000AAGAACCCACGCT；SEQ ID NO10)和CI-040(AGGGCTCGAGGATCCCGGGGGTGCTATTATGAATGCACGG；SEQ ID NO16)以產生具TAA終止密碼子的聚-組氨酸序列，接著是轉錄終止子。CI-029/CI-017 PCR反應產生約1530bp的片段而CI-018/CI-040反應產生約331bp的片段。通過混合它們的PCR產物並用引物CI-029/CI-040擴增連接這兩個片段。所得產物命名為CYS4H且長度約1861bp。
為連接ADH2啟動子到CYS4H基因片段，首先用引物CI-027(CGGGGATCCGACGTTTTGCCCGCAGGCGGGAAACC，SEQ ID NO17)和引物CI-028(AGATTTAGTCATTATTACGATATAGTTAATAGTTGATAG；SEQ ID NO18)從相同酵母基因組DNA產生PCR產物，用於產生ADH2啟動子序列。引物CI-028(SEQ ID NO18)包含CYS4基因編碼區的前12個核苷酸。因此，在引物CI-028(SEQ ID NO18)和CI-029(SEQ ID NO15)間有25個各自產物中互補DNA的核苷酸。ADH2 PCR產物與CYS4H片段混合併用引物CI-027(SEQ ID NO17)和CI-040(SEQ ID NO16)擴增，用於產生約2201bp的產物片段命名為ADH2CYS4H。這些PCR產物各自通過限制性內切酶分析確認。
ADH2CYS4H產物克隆到YEp24，這是用BamHI切割DNA和用T4 DNA連接酶連接。連接產物轉化入大腸桿菌(TOP10；Invitrogen)細胞並在LB-瓊脂加氨苄青黴素板上平板培養。質粒根據廠商建議用質粒製備試劑盒(Roche)從推定重組子中製備，通過限制性內切酶分析。發現具有正確插入的克隆質粒轉化入釀酒酵母(BJ5460)且在補充2％葡萄糖的無尿嘧啶合成完全培養基(SC-ura)上平板培養。2天後推定重組子在相同類型平板上重劃線培養以分離菌落。通過在SC-ura加2％乙醇和1％蛋白腖中生長誘導細胞，通常補充0.1％葡萄糖以使細胞能在24小時內生長。生長過夜後，細胞通過離心收集且細胞沉澱保存於-70℃直到裂解。通過細胞沉澱重懸浮於0.05體積的裂解緩衝液原始體積來裂解細胞。玻璃珠然後加入緩衝液的彎液面。
全部懸浮液渦旋1分鐘，各4次。渦旋之間，細胞在冰上冷卻1分鐘。裂解物轉移到新管並以10,000xg離心10分鐘。登清的裂解物在His-樹脂柱(Roche)上分層，根據廠商建議純化蛋白質。部分純化的蛋白質在3次洗脫中回收。
實施例5高半胱氨酶測定模式的非循環部分的例子在此例子中，證明丙酮酸和胱硫醚測定的非循環部分。
丙酮酸測定丙酮酸本發明提供高半胱氨酸測量，其基礎是用酶CBS和CBL使高半胱氨酸循環產生丙酮酸和氨。預測丙酮酸和氨產生的速度與樣品中原始高半胱氨酸濃度成正比。用適當酶測量此速度提供均一高半胱氨酸方法的可能。
在發明的一方面，開發了丙酮酸定量的高度敏感方法。在此方法中，丙酮酸氧化酶使丙酮酸轉變成乙醯磷酸、二氧化碳和過氧化物。過氧化物酶隨後使過氧化物、TOOS和4-氨基安替比林轉變成顯示最大吸收接近550nm的色原。此色原的摩爾吸收率很高，約36L mol-1cm-1。
使用表1所示試劑和表2所列Cobas FARA(Roche，Basel，Switzerland)儀器參數，丙酮酸易通過早期-讀數空白和終點反應在約5-10分鐘內以μM範圍測量。含水校準物的吸光度相對時間圖示於圖1。實際校準曲線示於圖2。
胱硫醚測定通過CBL加入上述丙酮酸試劑來測量胱硫醚。CBL使胱硫醚轉變成高半胱氨酸、丙酮酸和氨。丙酮酸然後如上所述測量。用於測量胱硫醚的試劑組成示於表3。測量可用任何合適儀器進行。在本例子中，使用Cobas FARA(Roche，Basel，Switzerland)。典型的反應參數示於表4。圖3描述了吸光度相對時間圖，用胱硫醚水溶液獲得。反應在少於10分鐘內到達終點。

圖4描述了用胱硫醚的水溶液獲得的標準曲線。這些曲線至少在0-100μM的胱硫醚濃度範圍是線性的。形成的發色團穩定約15-20分鐘。然而，如果測定的樣品的所含胱硫醚濃度高10-20倍，發色團明顯有些不穩定。
在一些實驗中，絲氨酸包括在反應混合物中。250μM水平的絲氨酸沒有表現出顯著效果。；較高水平的絲氨酸也為本測定耐受。絲氨酸的非幹擾性是一個重要的觀察，因為高半胱氨酸測定需要絲氨酸存在。
實施例6高半胱氨酸的酶循環測定在此例子中，提供確定高半胱氨酸濃度的酶循環系統，使用丙酮酸氧化酶/過氧化物酶信號系統或乳酸脫氫酶信號系統。
循環的證明CBS/CBL/PO/HRP酶循環系統證明了循環系統，其中反應用高半胱氨酸或胱硫醚起始。這些實驗中所用的試劑成分示於表5。樣品與試劑1混合後，單獨加入CBS和絲氨酸，試劑1含所有其它成分。相關Cobas FARA參數示於表6。胱硫醚或高半胱氨酸溶於水以製備適當濃度的標準。時間相對吸光度圖示於圖5和6。在3到6分鐘遲滯時間後，圖為線性。典型的高半胱氨酸校準曲線(圖7)儘管不完全線性，可用於在合適樣品中定量高半胱氨酸濃度。使用合適曲線-配合技術。
二硫鍵還原高半胱氨酸很少以還原、非二硫鍵狀態存在於人血漿中。大部分高半胱氨酸經二硫鍵偶聯到蛋白質或小分子。需要這些化合物的二硫化物還原以釋放高半胱氨酸用於通過任何確定總高半胱氨酸的方法測量。此例子證明使用還原劑與用乳酸脫氫酶和NADH的系統相容。可能的候選還原劑包括DTE、DTT、n-乙醯半胱氨酸、硫基乙酸、TCEP等。為在本發明方法中使用這些化合物，需要精確調節還原劑濃度和儀器參數。一些還原劑的早期指示會阻礙丙酮酸氧化酶或辣根過氧化物酶作用，導致研究下述另外的丙酮酸檢測系統。
循環的證明CBS/CBL/LDH系統丙酮酸在酶乳酸脫氫酶存在時與NADH反應以產生乳酸和NAD。定量丙酮酸可通過測量在340nm的吸光度減少。NADH的摩爾吸收率比過氧化物酶產生的色原小約6倍。然而，這不影響本發明的系統，因為CBL/CBS高半胱氨酸循環能產生相對大量的丙酮酸。
用於產生圖8、9、1011所示數據的試劑系統包括HEPES緩衝液(pH7.2)中的絲氨酸、CBL和乳酸脫氫酶，作為第一種試劑。然後順次加入TRIS緩衝液(pH8.5)中的NADH和CBS。然而，所有成分可不同組合以形成2或3種試劑高半胱氨酸測量系統。試劑濃度示於表7且Cobas FARA參數示於表8。調節NADH濃度以提供足夠線性，同時血漿樣品在340nm吸收。
分析水溶液系統對於檢測水溶液中高半胱氨酸表現較好。典型的吸收相對時間圖示於圖8和9。這些圖是線性，明顯的延滯期少或沒有。NADH消失速度相對高。此外，高半胱氨酸濃度相對吸光度的校準圖在0-100μM樣品濃度範圍為線性(圖10)。因此，校準僅需要一個校準物如25μM以及試劑空白。
高半胱氨酸溶液在不同濃度製備以證明方法在2-20μM高半胱氨酸濃度範圍的表現。DTT存在和缺乏時的結果示於表9。如上所述，DTT用於減少樣品(如血清、血漿等)中的二硫鍵。DTT不顯著幹擾乳酸脫氫酶催化反應。
分析以人血漿為基礎的對照產物本文證明了CBS/CBL/LDH循環系統的精確性能，使用Bio-Rad Co.生產的以人血漿為基礎的高半脫氨酸對照產物。使用不同濃度DTT，改變溫育時間以獲得最佳高半胱氨酸回收。用1.6-3.2mM濃度DTT溫育5-15分鐘時間產生的高半胱氨酸測量很好的在多種其它方法特定的範圍內。
人血漿樣品高半胱氨酸循環測定證明用DTT作為還原劑的人血漿樣品性能良好。結果與獨立實驗室用Abbott IMx高半胱氨酸方法獲得的結果很一致(圖11)。此實驗所用Cobas FARA參數示於表10且試劑成分示於表7。在此測定中，使用含水高半胱氨酸校準物(25μM)。以水為基礎樣品的吸光度相對時間圖在DTT缺乏時為線性且在DTT存在時接近線性。然而，用血漿樣品獲得的圖不同，即前3分鐘後不是線性。在表7和表10概括的條件下，循環似乎隨著時間逐步減慢。然而，圖11所示相關性研究證明測試人血清樣品時，本方法(概括於表7和表10)與IMx所得的結果相對緊密一致。
在一個較佳實施方案中，速度在反應起始後前3分鐘測量。系統的另外最優化包括鹽和去汙劑濃度變化，可能使含水和血漿樣品性能更一致。當成分結合到2或3種試劑混合物中時，測定同樣精確。
實施例7高半胱氨酸測定的比較在此例子中，測試了根據發明的一個較佳實施方案並與兩個現有測定比較，即常規HPLC技術和商業購買的IMx測定。
發明的測定用表11所示3種試劑完成。第一種試劑R1開始以粉末形式且重建到1.5g粉末每100mL水的水平。總測定試劑盒也包括人血漿基質中以不同水平猛增的校準物以及加工人血漿基質中組成的2個對照樣品，校準物含L-胱硫醚。
進行此測定時，使用商業購買的Cobas MIRA儀器。Cobas MIRA軟體能進行50個可程序化、25秒的循環。尤其是儀器根據表12的參數編程。在循環1中，30μL樣品加入樣品池，接著加入25μL衝洗水和90μL液體試劑R1。在循環2開始時，加入25μL試劑SR1與另外的25μL衝洗水。隨後，混合物可溫育15個循環(6.25分鐘)以使還原劑釋放任何結合的高半胱氨酸並破壞任何內源存在的丙酮酸。此時，加入35μL CBS/CBL酶試劑與另外的15μL衝洗水。循環18和32間隨著時間測量的340nm吸光度減小，作為樣品中高半胱氨酸的測量。樣品加入和最終吸光度讀數間的總測定時間是32個循環或13分鐘20秒。由於多個樣品平行運行，另外的樣品結果通過MIRA以約每30-90秒1次的速度產生，這取決於運行長度和所用儀器校準物的數量。使用類似編程參數，此測定可適合甚至更快的儀器(如RocheINTEGRA，Hitachi，ACE等)，能產生甚至更高的通量速度。
總共24個樣品用發明測定和比較的已知測定來測試。下表13列出使用這三種方法得到的高半胱氨酸濃度。圖12-14是描述表13結果的各相關圖。如可見到的，發明方法與IMx和HPLC緊密相關，通常與IMx更一致。然而，本方法花費低許多，運行較快，可用一般商業購買的化學分析器進行。
如表14所示，發明表現出非常好的運行間精確性。通常高半胱氨酸濃度約為7-20μmol/L時，發現運行內濃度變化CV小於4％。
實施例8試劑濃度變化的效果在此例子中，實施例7中所述的發明優選測定用改變一些試劑成分進行，即LDH、NADH和絲氨酸。這是為了確定這些試劑成分的最佳量。測定如上所述進行，各成分濃度有變化。表15列出這些測試的結果。
表15所示結果能選擇最終試劑成分水平，提供具最小空白速度的適當敏感性，同時也嘗試將試劑成本減少到最低程度。
實施例9R1製劑變化對循環測定的效果此例子確定pH變化的效果，改變pH是通過將緩衝液變為pH8.4的250mM TRIS並加入脂肪酶和α-環糊精到試劑1。進行這些製劑變化後，然後測試該測定的性能。表16詳細描述了用於這些實驗的試劑成分。
表16.CBS/CBL/LDH循環系統試劑成分
通過將試劑1的緩衝液變為pH8.4的250mM TRIS，改進測定一致性。這是因為CBS和CBL在pH8.4明顯更活醯且循環速度增加到3倍。
加入脂肪酶和α-環糊精以對付有時在臨床實驗室遇到的混濁(脂血症)樣品相關問題。當樣品取自的病人在取血樣前不久進食過或病人患的某些疾病過程正在進行中，可能產生這種樣品。混濁可幹擾此測試結果，通過在340nm產生高吸光度從而儀器不能準確測量NADH轉變成NAD所產生的吸光度小變化。混濁也可強烈地幹擾此測試結果，通過測量NADH到NAD轉化中隨著時間的改變。例如，如果混濁量減少，340nm的吸光度也降低，因為光散射小。此效果加大丙酮酸降低引起的吸光度減小，所得高半胱氨酸確定可能顯著太高。脂肪酶和α-環糊精加入R1降低樣品的混濁，大概通過脂肪酶水解甘油三酸酯為甘油和游離脂肪酸以及游離脂肪酸與α-環糊精形成複合體。因此，混濁反應混合物在加入SR2(R3)時清除，加入SR2(R3)用於精確測量丙酮酸產生速度。許多混濁反應混合物的340nm吸光度迅速減小且幾分鐘內水平消失。高半胱氨酸結果精確。然而，一些混濁樣品在加入SR2(R3)前沒有完全清除，因而一些樣品的結果有點不精確。儘管如此，使用脂肪酶和α-環糊精似乎是混濁樣品獲得準確結果的一種很有希望的方法。
除了試劑構成的變化，體積也變化以評估它們對測定性能的效果。這些變化反映在表17中，它顯示Cobas MIRA的典型循環參數。這些變化後，對86個人樣品進行相關性研究，結果示於表18。
實施例10使用其它去汙劑和它們的濃度變化在此例子中，不同去汙劑與EDTA組合使用作為R1成分。已知EDTA穩定脂質顆粒。此外，當樣品混濁時目標是獲得精確結果。尤其是研究去汙劑Brij-35和Genapol X-80。發現EDTA在2.5mM濃度特別有效，在分析脂血症的樣品時有助於使混濁變化引起的吸光度非特異減小到最低程度。去汙劑濃度也如表19和20所示變化。試劑R1的一種優選組成示於表21。Brij-35以0.025％v/v水平存在且EDTA以2.5mM存在。脂肪酶和α-環糊精不存在，因為EDTA存在時獲得混濁樣品精確性似乎不需要它們。Brij-35(0.025％)也加入SR2(R3)，取代Triton X-100。這可能是一種有前途的取代，因為一些國家認為Triton X-100對環境有害。表22顯示用優選試劑成分進行的相關性研究的結果。
表19.改變的Genapol X-80濃度
表20.R1中改變的Brij-35濃度
表22.最佳改進的相關性數據
當Brij-35和EDTA取代Triton X-100和脂肪酶加α-環糊精時，清除一些混濁反應混合物。然而，也許沒有同樣使用脂肪酶和α-環糊精的情況多。重要的是，340nm的吸光度用零變化速度迅速穩定。然後加入SR2(R3)時，準確測量丙酮酸產生的速度，甚至在樣品看上去像牛奶的情況中獲得精確結果。當加入R1和SR2(R3)間的時間縮短2-4分鐘時也如此，這對於將本發明的高半胱氨酸測定應用於其它自動儀器是必需的。
實施例11將還原劑變為TCEP和改變TCEP濃度的結果對於此例子，還原劑DTE用tris-(2-羧乙基磷化氫)鹽酸鹽(TCEP)取代。TCEP的優點是在純化水中穩定時間延長。TCEP取代DTE使試劑空白反應從約12到15mA/分鐘減小到約4到5mA/分鐘。較低試劑空白能使高半胱氨酸測定更精確。為發現此高半胱氨酸測定的最佳TCEP濃度，測試了濃度範圍。這些實驗的結果示於表23。
表23.R1中改變的TCEP濃度高半胱氨酸結果(μmol/L)
TCEP濃度A＝6.3mM；B＝13.85mM；C＝26.44mM；D＝32.74mM；E＝39.03mM；F＝52.88mM
實施例12確定將R3緩衝液變為磷酸鹽並加入甘油到緩衝液的效果為獲得穩定性更長和與測定相容性的酶混合物，酶製劑變為半衰期顯著長於前面製劑的混合物。重要的變化包括用磷酸鹽取代Tris緩衝液並加入甘油到緩衝液。使用濃度範圍從50mM到500mM的pH7.6磷酸鉀和濃度範圍從0.5％到15.0％(v/v)的甘油。這些變化使半衰期在4℃從幾周顯著增加到超過1年。在優選形式中，磷酸鉀範圍可從約50mM到250mM。磷酸鉀範圍可更優選從約75mM到150mM。此實驗中特別有效的磷酸鉀濃度是100mM。甘油範圍可從約1-15％。此範圍更優選從約5-13％。此實驗中特別有效的甘油範圍是10％。
實施例13使用不同儀器獲得的結果為確定所有測定變化產生的總體改進，通過特異於儀器的書面操作對一些儀器進行精確評估。表24列出Roche Hitachi 911根據本發明所用參數和設置且表25列出用Beckman CX-5時的相同參數和設置。下表顯示這些精確測試的結果。這些結果顯著優於測定早期製劑所得結果。在Hitachi 911(表26)和Beckman CX-5(表27)儀器中，所示各樣品運行20X並確定運行內精確度。低達5.92μmol/L的樣品C.V.百分比為3.31％且範圍在23.01μmol/L到25.4μmol/L的樣品為1.9％到2.03％。7.3％和2.6％間的總精確度(表28)用高半胱氨酸值為4.6μmol/L和27.0μmol/L的樣品在Cobas MIRA Plus上獲得。各樣品重複2次運行，2X每天，總共20天。
表24.Roche Hitachi 911的Catch高半胱氨酸方法參數
對於此實驗，通過R1與去離子水以9到8.1的比例混合製備T1。試劑T2和T4分別與試劑SR1和SR2相符合。
表25.Beckman CX-5的Catch高半胱氨酸方法參數
對於此例子，通過R1與去離子水以9到8.1的比例混合製備A。試劑B和C分別與MIRA試劑SR1和SR2相符合。
表26.Hitachi 911的運行內精確度
表27.Beckman CX-5的的運行內精確度
表28.Roche MIRA-Plus的總精確度
實施例14測定對2-試劑系統的適應性本發明也適用於僅使用2種試劑的系統。這使發明適應範圍更廣的儀器，包括僅能使用2種試劑的儀器。表29顯示2-試劑系統的試劑成分且表30顯示測定如何在化學分析儀上進行的MIRA-Plus參數。表31顯示用3-試劑系統相對2-試劑系統所獲得的比較數據。
表31.2-試劑系統相對3-試劑系統的比較
實施例15本發明對使用單點校準的適應性本發明的高半胱氨酸測定也適用於單校準點，零校準器作為空白。下表32顯示在Mira儀器上進行單點校準的參數。下面的數據(表33)顯示在斜率平均模式中使用單點校準產生的結果與使用多點校準曲線大體上相同。
表33.單點相對多點校準
實施例16WO 00/28071所述高半胱氧酸測定的研究PCT出版物WO 00/28071詳細描述了兩種高半胱氨酸測定。在「第一個實施方案」中，測定是沒有還原步驟進行的。為將此方法轉變成用於人血漿高半胱氨酸測量，必須結合單獨的脫機(off-line)或均勻還原步驟。出版物WO 00/28071描述了一個單獨的脫機還原步驟，也許是因為使用丙酮酸氧化酶循環系統。此步驟需要分析還原樣品前的20分鐘溫育，這大幅增加總測定時間和勞動成本。此外，如果樣品要在臨床實驗室中分析超過一個分析物，主要血清或血漿樣品必須分成兩等分，一個用於高半胱氨酸測試，一個用於任何其它有序實驗室測試。相反，由於使用LDH循環系統(實施例7)，本發明能還原高半胱氨酸。
在實施例16(表34)中，顯示DTT確實幹擾WO 00/28071的「第二個實施方案」所述丙酮酸氧化酶檢測系統。特別，使用「第二個實施方案」所述試劑和DTT組合物，有和沒有DTT的測定用Cobas FARA儀器相對已知丙酮酸標準(12.5、25和50μmol/L)進行。在DTT測試情況中，40μL的各標準混合30μL DTT溶液，接著溫育100秒。然後，加入90μL丙酮酸氧化酶試劑並溫育30秒。然後在30、60、90、120、150、180和220秒取吸光度讀數。在「無DTT」測試中，進行相同過程，除了沒有DTT加入。表34列出用210秒讀數的此實驗結果。圖15和16進一步闡述此測試結果。
表1
MEA＝單乙醇胺 ToSA＝對-甲苯磺酸NMEA＝N-甲基乙醇胺NDSA＝1，5-萘二磺酸DMSO＝二甲基亞碸EBSA＝4-乙苯基磺酸 DMAc＝二甲基乙醯胺DBSA＝十二烷基苯磺酸序列表110G.川崎(KAWASAKI，GLENN)H.K.韋伯(WEBB，HEATHER K.)J.歐文斯(OVENS，JEFFREY)R.裡德克(LIEDTKE，RAYMOND)D.弗裡斯特(FOREST，DOREEN)M.萊加茲(LEGAZ，MARK)G.羅森(LAWSON，SOBOMABO)120用於高半胱氨酸和胱硫醚的酶促循環測定1303086515060/163,1261511999-11-0215009/704,0361512000-11-0115060/203,3491512000-05-1016021170PatentIn version 3.1210121130212DNA213人工的220
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221misc feature223人工序列的描述PCR引物40018agatttagtc attattacga tatagttaat agttgatag 3921019211428212PRT213大腸桿菌Escherichia coli)40019Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Met Ala Ser Met Thr
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Asp Glu Asn Ser Lys Leu Ser Asp Leu Asn Arg Phe Phe Glu Lys Asn705 710 715 720Ser Ser Ala Val Ile Thr Asp Gly Leu Lys Pro Ile His Ile Val Thr725 730 735Lys Met Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Ala Met Thr Lys Ser Glu Gln Gln740 745 750Ala Asp Ser Arg His Asn Val Ile Asp Leu Val Gly Asn Thr Pro Leu755 760 765Ile Ala Leu Lys Lys Leu Pro Lys Ala Leu Gly Ile Lys Pro Gln Ile770 775 780Tyr Ala Lys Leu Glu Leu Tyr Asn Pro Gly Gly Ser Ile Lys Asp Arg785 790 795 800Ile Ala Lys Ser Met Val Glu Glu Ala Glu Ala Ser Gly Arg Ile His805 810 815Pro Ser Arg Ser Thr Leu Ile Glu Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile820 825830Gly Leu Ala Leu Ile Gly Ala Ile Lys Gly Tyr Arg Thr Ile Ile Thr835840 845Leu Pro Glu Lys Met Ser Asn Glu Lys Val Ser Val Leu Lys Ala Leu850 855 860Gly Ala Glu Ile Ile Arg Thr Pro Thr Ala Ala Ala Trp Asp Ser Pro865 870875 880Glu Ser His Ile Gly Val Ala Lys Lys Leu Glu Lys Glu Ile Pro Gly885890 895
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210212111188212DNA213大腸桿菌(Escherichia coli)40021atggcggaca aaaagcttga tactcaactg gtgaatgcag gacgcagcaa aaaatacact 60ctcggcgcgg taaatagcgt gattcagcgc gcttcttcgc tggtctttga cagtgtagaa 120gccaaaaaac acgcgacacg taatcgcgcc aatggagagt tgttctatgg acggcgcgga 180acgttaaccc atttctcctt acaacaagcg atgtgtgaac tggaaggtgg cgcaggctgc 240gtgctatttc cctgcggggc ggcagcggtt gctaattcca ttcttgcttt tatcgaacag 300ggcgatcatg tgttgatgac caacaccgcc tatgaaccga gtcaggattt ctgtagcaaa 360atcctcagca aactgggcgt aacgacatca tggtttgatc cgctgattgg tgccgatatc 420gttaagcatc tgcagccaaa cactaaaatc gtgtttctgg aatcgccagg ctccatcacc 480atggaagtcc acgacgttcc ggcgattgtt gccgccgtac gcagtgtggt gccggatgcc 540atcattatga tcgacaacac ctgggcagcc ggtgtgctgt ttaaggcgct ggattttggc 600atcgatgttt ctattcaagc cgccaccaaa tatctggttg ggcattcaga tgcgatgatt 660ggcactgccg tgtgcaatgc ccgttgctgg gagcagctac gggaaaatgc ctatctgatg 720ggccagatgg tcgatgccga taccgcctat ataaccagcc gtggcctgcg cacattaggt 780gtgcgtttgc gtcaacatca tgaaagcagt ctgaaagtgg ctgaatggct ggcagaacat 840ccgcaagttg cgcgagttaa ccaccctgct ctgcctggca gtaaaggtca cgaattctgg 900aaacgagact ttacaggcag cagcgggcta ttttcctttg tgcttaagaa aaaactcaat 960aatgaagagc tggcgaacta tctggataac ttcagtttat tcagcatggc ctactcgtgg 1020ggcgggtatg aatcgttgat cctggcaaat caaccagaac atatcgccgc cattcgccca 1080caaggcgaga tcgattttag cgggaccttg attcgcctgc atattggtct ggaagatgtc 1140gacgatctga ttgccgatct ggacgccggt tttgcgcgaa ttgtataa 1188
權利要求
1.一種評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚量的酶促循環測定，其特徵在於，所述測定包括(a)含高半胱氨酸和/或胱硫醚的溶液接觸胱硫醚β-合酶或其衍生物、L-絲氨酸和胱硫醚β-裂合酶或其衍生物以形成反應混合物，接觸時間足以催化高半胱氨酸循環轉變成胱硫醚且胱硫醚再轉變成高半胱氨酸並產生丙酮酸和氨；(b)確定反應混合物中存在的丙酮酸和/或氨的量；(c)在產生的丙酮酸和/或氨量的基礎上評估溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，L-絲氨酸加入反應混合物至終濃度至少約1μM到約50mM。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述L-絲氨酸加入反應混合物至終濃度至少約10μM到約40mM。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，丙酮酸的量通過丙酮酸酶促轉變成乳酸來確定。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，丙酮酸轉變成乳酸是通過加入乳酸脫氫酶或其衍生物以及NADH或其衍生物。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述乳酸脫氫酶加入反應混合物至終濃度至少約30U/l到約5000U/l。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述乳酸脫氫酶加入反應混合物至終濃度至少約30U/l到約3000U/l。
8.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述NADH加入反應混合物至終濃度至少約0.1mM到約2mM。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述NADH加入反應混合物至終濃度至少約0.1mM到約1.5mM。
10.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，NADH或其衍生物氧化成NAD+或其衍生物的總量是通過NAD+或其衍生物與氧化時能進行顏色變化的染料反應確定的。
11.如權利要求10所述的方法，其特徵在於，所述染料選自5，5』-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、甲基紫精或各自的衍生物。
12.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，丙酮酸的量是通過丙酮酸酶促轉變成過氧化氫確定的。
13.如權利要求12所述的方法，其特徵在於，所述酶是丙酮酸氧化酶。
14.如權利要求13所述的方法，其特徵在於，測定進一步包括過氧化物酶和水溶性氫供體，供體提供氫時形成可分光光度檢測的穩定有色產物。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於，水溶性氫供體是N-烷基-N-磺丙基苯胺的衍生物。
16.如權利要求15所述的方法，其特徵在於，N-烷基-N-磺丙基苯胺是N-乙基-N-(2-羥基3-磺丙基)-m-甲苯胺的鈉鹽。
17.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，進一步包括用還原劑處理溶液的步驟，處理時間足以還原大體上所有任何高半胱氨酸且溶液中存在的含半高半胱氨酸的混合二硫化物還原成高半胱氨酸。
18.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述處理步驟在步驟(a)-(c)前進行。
19.如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述還原劑包括硼氫化鹽或硫醇還原劑。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於，所述還原劑選自β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP或硫代乙酸或各自的衍生物。
21.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述二硫蘇糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
22.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述二硫赤蘚糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
23.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述硫代乙酸存在的量從約0.2mM到約3mM。
24.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述β-巰基乙醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
25.如權利要求20所述的方法，其特徵在於，所述TCEP存在的量從約6mM到約53mM。
26.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，確定氨量通過氨傳感器、微擴散測定、比色測定或酶測定。
27.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，進一步包括用試劑處理溶液的步驟，試劑包括胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物，處理時間足以使溶液中存在的任何胱硫醚轉變成α-酮戊二酸。
28.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，所述處理步驟步驟(a)-(c)前進行。
29.如權利要求27所述的方法，其特徵在於，進一步包括去除大體上所有胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物活性的步驟，它在所述處理步驟後並在步驟(a)-(c)進行前。
30.如權利要求29所述的方法，其特徵在於，所述胱硫醚γ-裂合酶活性通過加熱去除。
31.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物或胱硫醚β-裂合酶或其衍生物作為分離自真核細胞或原核細胞的提取物提供。
32.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述真核細胞包括酵母細胞。
33.如權利要求32所述的方法，其特徵在於，所述酵母細胞包括釀酒酵母。
34.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述原核細胞包括細菌細胞。
35.如權利要求34所述的方法，其特徵在於，所述細菌細胞選自大腸桿菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)或鳥博德特氏菌(Bordetella avium)細胞。
36.如權利要求31所述的方法，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物或胱硫醚β-裂合酶或其衍生物從所述提取物中充分分離。
37.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物或胱硫醚β-裂合酶或其衍生物通過重組表達基因產生，基因編碼胱硫醚β-合酶或其衍生物或胱硫醚β-裂合酶或其衍生物。
38.如權利要求37所述的方法，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物和胱硫醚β-裂合酶或其衍生物作為融合蛋白產生。
39.如權利要求38所述的方法，其特徵在於，所述融合蛋白表達自重組產生的基因，基因包括胱硫醚β-合酶或其衍生物的編碼區，與含編碼胱硫醚β-裂合酶或其衍生物的基因區操作地相聯。
40.如權利要求39所述的方法，其特徵在於，所述融合蛋白固定在固體支持物上。
41.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶加至約0.1KU/l到約100KU/l的終濃度。
42.如權利要求41所述的方法，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶加至約0.5KU/l到約75KU/l的終濃度。
43.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述胱硫醚β-裂合酶加至約0.01KU/l到約100KU/l的終濃度。
44.如權利要求43所述的方法，其特徵在於，所述胱硫醚β-裂合酶加至約0.05KU/l到約50KU/l的終濃度。
45.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述反應混合物包括緩衝液。
46.如權利要求45所述的方法，其特徵在於，所述緩衝液可操作用於維持所述反應混合物的pH在約7到約9間。
47.如權利要求45所述的方法，其特徵在於，所述緩衝液選自HEPES、TRIS和磷酸鹽。
48.如權利要求47所述的方法，其特徵在於，所述TRIS的pH約8.4。
49.如權利要求45所述的方法，其特徵在於，進一步包括加入甘油到所述緩衝液的步驟。
50.如權利要求49所述的方法，其特徵在於，所述緩衝液濃度從約0.5％到約15.0％v/v。
51.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，進一步包括減少所述溶液濁度的步驟。
52.如權利要求51所述的方法，其特徵在於，進一步包括使所述溶液接觸脂蛋白清除劑的步驟。
53.如權利要求51所述的方法，其特徵在於，所述試劑包括脂肪酶和α-環糊精。
54.如權利要求52所述的方法，其特徵在於，所述脂蛋白清除劑在所述反應混合物中。
55.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述反應混合物接觸去汙劑。
56.如權利要求55所述的方法，其特徵在於，所述去汙劑可操作用於減少所述溶液的濁度。
57.如權利要求55所述的方法，其特徵在於，所述去汙劑選自Triton X-100、Brij-35和Genapol X-80。
58.如權利要求57所述的方法，其特徵在於，所述去汙劑是Genapol X-80。
59.如權利要求58所述的方法，其特徵在於，所述Genapol X-80存在的濃度從約0.05到約0.5％uμmol/L。
60.如權利要求57所述的方法，其特徵在於，所述去汙劑是Brij-35。
61.如權利要求60所述的方法，其特徵在於，所述Brij-35存在的濃度從約0.01到約0.5％μmol/L。
62.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述反應混合物包括磷酸鹽。
63.如權利要求62所述的方法，其特徵在於，所述磷酸鹽存在的濃度範圍從約50mM到約500mM。
64.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述反應混合物包括EDTA。
65.如權利要求64所述的方法，其特徵在於，所述EDTA存在的濃度從約0.5mM到約10mM。
66.如權利要求65所述的方法，其特徵在於，所述EDTA存在的濃度從約2mM到約3mM。
67.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述反應混合物包括至少2種試劑組合物。
68.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述溶液體積從約10μl到約40μl。
69.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述測定在臨床化學分析儀上進行。
70.如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述測定不需要脫離儀器步驟。
71.一種用於評估樣品溶液中高半胱氨酸量的測試試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括胱硫醚β-合酶或其衍生物、L-絲氨酸、胱硫醚β-裂合酶或其衍生物。
72.如權利要求71所述的測試試劑盒，其特徵在於，進一步包括容納所述樣品的容器。
73.如權利要求71所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶存在的終濃度從約0.1到約100KU/l。
74.如權利要求73所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶存在的終濃度從約0.5到約75KU/l。
75.如權利要求71所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述L-絲氨酸存在的終濃度從約1μM到約50mM。
76.如權利要求75所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述L-絲氨酸存在的終濃度從約10μM到約40mM。
77.如權利要求71所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述胱硫醚β-裂合酶存在的終濃度從約0.01到約100KU/l。
78.如權利要求77所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述胱硫醚β-裂合酶存在的終濃度從約0.05到約50KU/l。
79.如權利要求71所述的測試試劑盒，其特徵在於，進一步包括乳酸脫氫酶或其衍生物以及NADH或其衍生物。
80.如權利要求79所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述乳酸脫氫酶存在的終濃度從約30到約5000U/l。
81.如權利要求80所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述乳酸脫氫酶存在的終濃度從約30到約3000U/l。
82.如權利要求79所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述NADH存在的終濃度從約0.1mM到約2mM。
83.如權利要求82所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述NADH存在的終濃度從約0.1mM到約1.5mM。
84.如權利要求71所述的測試試劑盒，其特徵在於，進一步包括氧化時能進行顏色變化的染料。
85.如權利要求84所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述染料選自5，5』-二硫雙(2-硝基苯甲酸)、2，6-二氯苯靛酚、四唑氮化合物、吩嗪硫酸甲酯、甲基紫精或各自的衍生物。
86.如權利要求71所述的測試試劑盒，其特徵在於，進一步包括單獨的容器，所述單獨容器含還原劑。
87.如權利要求86所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述還原劑包括硼氫化鹽或硫醇還原劑。
88.如權利要求87所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述還原劑選自β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP或硫代乙酸或各自的任何鹽。
89.如權利要求88所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述二硫蘇糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
90.如權利要求89所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述二硫赤蘚糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
91.如權利要求88所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述硫代乙酸存在的量從約0.2mM到約3mM。
92.如權利要求88所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述β-巰基乙醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
93.如權利要求88所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述TCEP存在的量從約6mM到約53mM。
94.如權利要求71所述的測試試劑盒，其特徵在於，進一步包括胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物。
95.如權利要求72所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶或其衍生物、胱硫醚β-裂合酶或其衍生物、胱硫醚γ-裂合酶或其衍生物、乳酸脫氫酶或其衍生物固定在所述容器內。
96.一種評估樣品中高半胱氨酸量的方法，其特徵在於，所述方法包括(a)使樣品接觸還原劑，接觸時間足以從高半胱氨酸結合蛋白中釋放還原高半胱氨酸；(b)在有助於所述還原型高半胱氨酸和所述高半胱氨酸代謝物結合轉錄因子間形成複合體的條件下，使所述還原型半胱氨酸接觸高半胱氨酸代謝物結合轉錄因子；(c)所述樣品與共有多核苷酸序列或其衍生物混合，序列由所述高半胱氨酸/轉錄因子複合體或其衍生物特異識別，以便使所述高半胱氨酸/轉錄因子複合體結合所述共有多核苷酸序列；(d)確定由共有多核苷酸序列結合的高半胱氨酸/轉錄因子複合體的量。(e)使所述樣品中存在的高半胱氨酸量與所述確定量相互關聯。
97.如權利要求96所述的方法，其特徵在於，所述還原劑包括硼氫化鹽或硫醇還原劑。
98.如權利要求97所述的測試試劑盒，其特徵在於，所述還原劑選自β-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP或硫代乙酸或各自的任何鹽。
99.如權利要求96所述的方法，其特徵在於，所述高半胱氨酸代謝物結合轉錄因子包括MetR或其衍生物。
100.如權利要求96所述的方法，其特徵在於，所述共有多核苷酸序列包括SEQID NO11的多核苷酸序列或其衍生物。
101.如權利要求96所述的方法，其特徵在於，所述高半胱氨酸/轉錄因子複合體的確定量通過螢光確定。
102.如權利要求96所述的方法，其特徵在於，所述方法在適於檢測所述信號的分析儀上進行。
103.如權利要求96所述的方法，其特徵在於，所述方法用一種儀器進行。
104.一種評估樣品中高半胱氨酸量的測定，其特徵在於，所述測定包括步驟產生反應混合物，包括所述樣品、絲氨酸、乳酸脫氫酶、NADH和能釋放樣品中蛋白質-結合高半胱氨酸的還原劑、或它們各自的衍生物；溫育反應混合物，溫育時間足以還原大部分所述蛋白質-結合的高半胱氨酸；加入酶混合物，包括胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂合酶或它們各自的衍生物，使高半胱氨酸循環轉變為胱硫醚且胱硫醚再轉變成高半胱氨酸，伴隨丙酮酸產生；和測量隨著時間產生的NAD+生成或NADH的消失，作為樣品中高半胱氨酸的測量。
105.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述L-絲氨酸加入反應混合物至終濃度至少約1μM到約50mM。
106.如權利要求105所述的測定，其特徵在於，所述L-絲氨酸加入反應混合物至終濃度至少約10μM到約40mM。
107.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述乳酸脫氫酶加入反應混合物至終濃度至少約30U/l到約5000U/l。
108.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述乳酸脫氫酶加入反應混合物至終濃度至少約30U/l到約3000U/l。
109.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述NADH加入反應混合物至終濃度至少約0.1mM到約2mM。
110.如權利要求109所述的測定，其特徵在於，所述NADH加入反應混合物至終濃度至少約0.1mM到約1.5mM。
111.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶存在的終濃度從約0.1到約100KU/l。
112.如權利要求111所述的測定，其特徵在於，所述胱硫醚β-合酶存在的終濃度從約0.5到約75KU/l。
113.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述胱硫醚β-裂合酶存在的終濃度從約0.01到約100KU/l。
114.如權利要113所述的測定，其特徵在於，所述胱硫醚β-裂合酶存在的終濃度從約0.05到約50KU/l。
115.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述測定在多達15分鐘的時間段中完成。
116.如權利要求115所述的測定，其特徵在於，所述測定在約5-12分鐘的時間段中完成。
117.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述還原劑選自二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP和其組合。
118.如權利要求117所述的測定，其特徵在於，所述二硫蘇糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
119.如權利要求118所述的測定，其特徵在於，所述二硫赤蘚糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
120.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述測定在臨床化學分析儀上進行。
121.如權利要求104所述的測定，其特徵在於，所述測定在單個儀器上進行。
122.一種評估樣品中高半胱氨酸量的測定，其特徵在於，所述測定包括步驟產生反應混合物，包括所述樣品、絲氨酸、胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂合酶或它們各自的衍生物，使高半胱氨酸循環轉變為胱硫醚且胱硫醚再轉變成高半胱氨酸，伴隨丙酮酸產生，胱硫醚β-合酶與胱硫醚β-裂合酶的比例範圍從約1∶1到25∶1；和評估所述反應混合物中存在的丙酮酸量，通過加入乳酸脫氫酶和NADH到所述反應混合物並監控所述反應混合物中隨著時間產生的NAD+或NADH的消失。
123.如權利要求122所述的測定，其特徵在於，所述測定包括在所述乳酸脫氫酶和NADH存在時加入還原劑到反應混合物的步驟，以減少樣品中至少部分蛋白質-結合的高半胱氨酸。
124.如權利要求123所述的測定，其特徵在於，所述還原劑選自二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇、TCEP或硫代乙酸和其組合。
125.如權利要求123所述的測定，其特徵在於，所述二硫蘇糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
126.如權利要求125所述的測定，其特徵在於，所述二硫赤蘚糖醇存在的量從約0.2mM到約3mM。
127.如權利要求122所述的測定，其特徵在於，所述測定在多達20分鐘的時間段中完成。
128.如權利要求127所述的測定，其特徵在於，所述測定在多達15分鐘的時間段中完成。
129.如權利要求122所述的測定，其特徵在於，所述測定在臨床化學分析儀上進行。
130.如權利要求122所述的測定，其特徵在於，所述測定在單個儀器上進行。
131.一種連續測定含許多液體高半胱氨酸樣品的方法，其特徵在於，所述測定包括步驟(a)產生反應混合物，通過將所述樣品之一與絲氨酸、胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂合酶、乳酸脫氫酶、NADH和能釋放樣品中蛋白質-結合的高半胱氨酸的還原劑、或它們各自的衍生物一起置於容器中；(b)在所述反應混合物中使高半胱氨酸循環轉變為胱硫醚且胱硫醚再轉變為高半胱氨酸，伴隨丙酮酸產生；(c)評估反應混合物中存在的丙酮酸量，通過監控其中隨著時間的NAD+的產生或NADH的消失；(d)對各所述樣品重複步驟(a)-(c)，各所述樣品的反應混合物-產生步驟間的時間間隔多達約15分鐘。
132.如權利要求131所述的方法，其特徵在於，所述時間間隔多達約13分鐘。
133.如權利要求131所述的方法，其特徵在於，所述方法包括步驟首先產生第一種反應混合物，含所述樣品、絲氨酸、乳酸脫氫酶、NADH和所述還原劑，使所述第一種反應混合物溫育一段時間以釋放大部分所述蛋白質-結合的高半胱氨酸，之後加入所述胱硫醚β-合酶和胱硫醚β-裂合酶。
134.如權利要求131所述的方法，其特徵在於，所述反應混合物中胱硫醚β-合酶與胱硫醚β-裂合酶的比例從約1∶1到25∶1。
135.如權利要求134所述的方法，其特徵在於，所述比例從約1∶1到10∶1。
136.如權利要求131所述的方法，其特徵在於，所述方法在臨床化學分析儀上進行。
137.如權利要求131所述的方法，其特徵在於，所述方法在單個儀器上進行。
138.一種分離酶，其特徵在於，所述酶與選自SEQ ID No19和20的酶有至少約80％的序列同一性。
139.一種分離酶，其特徵在於，所述酶選自SEQ ID No19和20。
140.一種使用胱硫醚作為高半胱氨酸測定校準物的方法，其特徵在於，所述方法包括步驟(a)取已知濃度的胱硫醚；(b)加入所述已知濃度到生物樣品；(c)用含脫硫醚的所述樣品在酶反應中，使胱硫醚轉變為高半胱氨酸且高半胱氨酸再轉變為胱硫醚，伴隨丙酮酸和氨的產生；(d)測量產生的丙酮酸和氨的量；和(e)使用所述測量的丙酮酸或氨的量作為所述高半胱氨酸測定的參考標準。
141.一種控制涉及高半胱氨酸的酶反應總體速度的過程，其特徵在於，高半胱氨酸不被酶反應消耗且高半胱氨酸的穩態濃度與這種酶反應總體速度成正比。
142.一種使用胱硫醚作為高半胱氨酸測定校準物的方法，其特徵在於，所述方法包括步驟加入胱硫醚到高半胱氨酸測定；和使用所述測定結果作為高半胱氨酸校準物。
全文摘要
本發明提供酶促循環測定用於評估溶液中高半胱氨酸和/或胱硫醚的量，如血液、血液衍生物或尿。測定包括步驟含高半胱氨酸和/或胱硫醚溶液接觸CBS或其衍生物、L－絲氨酸和CBL或其衍生物以形成反應混合物，接觸時間足以催化高半胱氨酸形式循環轉變成胱硫醚且胱硫醚再轉變成高半胱氨酸並產生丙酮酸和氨；確定反應混合物中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量；在形成的丙酮酸和/或氨量的基礎上確定溶液中存在的高半胱氨酸和/或胱硫醚的量。也提供CBS或其衍生物和CBL或其衍生物的表達載體和分離過程以及進行測定的測試試劑盒。在較佳實施方案中，測定可用最少的酶在15分鐘或更少進行中。
文檔編號C12Q1/32GK1612937SQ02826808
公開日2005年5月4日 申請日期2002年11月6日 優先權日2001年11月6日
發明者H·K·韋伯, J·歐文斯, R·裡德克, D·弗裡斯特, M·萊加茲, G·川崎, S·羅森 申請人:凱奇股份有限公司