應用紫外線誘變甘藍型油菜離體小孢子和突變體篩選方法
2023-05-31 06:06:41
專利名稱：：應用紫外線誘變甘藍型油菜離體小孢子和突變體篩選方法
技術領域：
：本發明屬於植物細胞工程
技術領域：
，具體涉及一種應用紫外線誘變甘藍型油菜離體小孢子和突變體的篩選方法
背景技術：
用物理射線或化學誘變劑誘變油菜種子或者油菜的組織器官和單細胞是創造新種質和改良品種以及建立突變體庫的重要方法之一。但是通過誘變種子、組織器官和多細胞愈傷組織產生的突變體是突變和沒突變基因的嵌合體，隱性基因突變於當代不表現，不能識別。因此，發現和選擇穩定的突變體必須通過自交，尤其是隱性基因和多基因控制的性狀需要多代自交才能獲得基因純合、遺傳穩定的突變體。獲得突變體的周期長、費用高。用射線和化學誘變劑直接誘變單細胞小孢子，並用秋水仙鹼等染色體加倍劑處理小孢子，使其染色體二倍化。由此小孢子產生的雙單倍體植株(DH)的突變基因是純合的，突變性狀可穩定遺傳，不存在嵌合體和顯性基因掩蓋隱性基因的雜合體，不需要自交程序。加拿大的Swanson等(Swanson等,Microsporemutagenesisandselection:Canolaplantswithfieldtolerancetotheimidazolinones,TheorA卯lGenet，1989(78):525-53)用r-射線和乙基亞硝基脲和我國的和江明等(和江明等，用EMS誘變和小孢子培養快速獲得甘藍型油菜高油酸種質材料的研究，西南農業學報，2003,16(2):34-36)用甲基磺酸乙脂誘變甘藍型油菜小孢子，分別獲得抗除草劑和高油酸的突變體。西班牙的Baxro等(Barro等,DoubledhaploidlinesofBrassiescarinat3withmodifiederucicacidcontentthroughmutagenesisbyEMStreatmentofisolatedmicrospores，PlantBreeding，2001，120:262-264)用甲基磺酸乙脂誘變衣索比亞芥小孢子，使芥酸含量發生了廣泛變異。由此可見，化學誘變劑用於油菜小孢子誘變取得了好的效果。但是用化學誘變劑誘變離體小孢子的實驗操作程序過於繁瑣。小孢子被化學誘變劑處理後必須通過離心把誘變劑清除掉，再進行培養，誘導胚狀體。操作步驟多，小孢子易汙染，誘變成功率低。而且誘變劑為致癌物，在操作過程中可能汙染環境，甚至對實驗人員有毒害。其次藥品價格貴，費用高。用物理射線誘變離體小孢子操作程序簡便，尤其是採用安裝在超淨臺上的紫外燈輻照小孢子既簡便又安全。英國的Ahmad等從紫外線照射甘藍型菜離體小孢子的再生植株中獲得了抗除草劑和抗黑斑病的突變體(Ahmad等,HaploidCultureandUVMutagenesisinRapid-cycling5rass/ca朋/HAfortheGenerationofResistancetoChlorsulfuronand/4Aei-朋/'ia力i"a5s/cj'ccr/汰AnnalsofBotany,1991，67:521-525)。日本的Zhang等用紫外線處理大白菜的離體小孢子，其再生植株中出現了抗軟腐病的突變體(ZhangFeng-lan等，MicrosporeMutagenesisandInvitroSelectionforResistancetoSoftDiseaseinChineseCabbage(5!ra5^'cac棚pesWsL.ssp.Pekinensis).BreedingScience,1999，49:161-166)。西班牙的Barro等用紫外線輻照衣索比亞芥的離體小孢子，從誘變小孢子的再生植株中獲得了低硫甙和高硫武以及高芥酸突變體(Baxro等,ModificationofGlucosinolateandErucicAcidContentsinDoubledHaploidlinesof"rassic"car/朋tsbyUVTreatmentofIsolatedMicrospores.E叩hytica，2003，129:卜6)。上述結果表明，紫外線對油菜小孢子具有誘變效應，可作為油菜小孢子的誘變工具。同時上述報導為紫外線誘變油菜離體小孢子技術的深入研究奠定了基礎。但是諸研究者所使用的紫外燈功率和照射劑量率不同，離體小孢子離紫外燈的距離和輻照時間不同，測定的小孢子半致死劑量(LD5。)的照射時間差異很大。而且均沒有研究照射時間和劑量率與變異的相關性，不明確採用多大的劑量率和多長的照射時間能獲得更多的變異，至今沒有對紫外線誘變離體小孢子的理論和方法進行系統的研究，該技術還未成熟，更未程序化。我們採用安裝在超淨臺上的紫外燈對甘藍型油菜離體小孢子進行了系統地誘變研究。根據小孢子被紫外線誘變後的產胚量(以沒被誘變的小孢子的產胚量為對照)和其再生植株的突變率和突變譜確定有效的照射劑量、照射時間和照射方法，建立了油菜離體小孢子紫外線誘變方法。同時建立了誘變小孢子單倍體二倍化的雙單倍體植株(DH)再生技術，為油菜品種遺傳改良和油菜建立突變體庫創造了新種質。
發明內容本發明目的在於克服現有技術的缺陷，提出一種油菜小孢子離體紫外線(UV)誘變、創造突變體和突變體的篩選方法。本發明的技術方案和步驟如下1、分離純化小孢子在花期于田間取甘藍型油菜植株的主莖或分枝上小孢子發育到單核晚期的花蕾，用70%乙醇溶液和0.1%升汞水溶液浸泡花蕾滅菌(以下操作均在超淨臺進行)，然後用無菌水衝洗3次。滅了菌的花蕾放入無菌的試管(注以下所有器皿均無菌)中，用玻棒搗碎，並加入13%蔗糖的小孢子提取液。將搗碎的花蕾和提取液倒入裝有孔徑44"m的網篩的漏鬥中過濾，除掉萼片、花瓣等體細胞組織，將含小孢子的濾液接入離心管。將離心管放入離心機離心3次，去掉體細胞組織，獲得純化的小孢子。小孢子提取液的配製蔗糖130g加蒸餾水溶解，定溶至1000ml,pH5.8-6.0,分裝在三角瓶中，於121'C高壓蒸汽滅菌20分鐘。2、小孢子誘變和染色體加倍將步驟1純化了的小孢子懸浮在添加70mg/L秋水仙鹼的改良的NLN培養基(見Lichter，R.AntherCultureof5rsssica朋，sinaLiquidMedium.Z.Pflanze叩hysiol，1981，103:229-237)，並分裝入培養皿中。含小孢子的培養皿(不蓋蓋)置於距離紫外燈15cm位置處，照射95-100秒，然後蓋上蓋，並用石臘封膜將皿封住，放入32'C的培養箱暗培養2天，進行小孢於染色體加倍。之後將培養皿中含小孢子的培養液用吸管移入離心管離心1次，棄去秋水仙鹼的培養基，再將無秋水仙鹼的改良的NLN'培養基加入離心管，懸浮小孢子，並倒入培養皿，用石臘封膜封好蓋。本發明的改良NLN培養基配方如下KN03125mg/L，MgS04*7H20125mg/L,KH2P04125mg/L,Ca(N03)24H20750mg/L(原配方是500mg/L)，*Na2EDTA37.3mg/L，*FeS04.7H2027.8mg/L(*原配方是FeEDTA40mg/L)，MnSO,糊25mg/L(原配方是M威腿7.37mg/L)。KI0.83mg/L(原配方中沒有KI)，貼0310rag/L,2nS04.他O10mg/L,Na風'2H200.25mg/L,CoCl2.6H200.025mg/L,CuS045H200.025mg/L，肌醇lOOmg/L,煙酸5mg/L，維生素B,O.5mg/L，維生素B60.5mg/L，葉酸0.5mg/L,生物素0.05mg/L，甘氨酸5.Orag/L(原配方是2.Omg/L)，穀胱甘肽30mg/L，穀氨醯胺800mg/L,絲氨酸100mg/L:蔗糖130g/L，PH5.8-6.0，用孔徑0.22uM的微孔濾膜抽濾滅菌。紫外燈照射小包子的劑量和參數懸掛在超淨工作檯上的直管型(ZSZ30D)紫外線燈功率是30W,波長253.7nm，被照射的油菜小孢子距離紫外燈15cm。3、小孢子培養和胚狀體誘導將步驟2懸浮在無秋水仙鹼培養基中的油菜小孢子置於約25'C的培養室進行靜止暗培養。當肉眼可見的胚狀體出現後，把培養皿放入震蕩器，進行震蕩培養(50轉/分)。當胚狀體發育到魚雷後期到子葉初期時停止震蕩培養。4、誘導小植株將步驟3得到的魚雷後期至子葉初期的胚狀體接種在附加2%蔗糖的B5固體培養基(GamboryL等，NutrientsRequirementsofSuspensionCulturesofSoybeenRootCells.Exp.CellRes.1968,50:151-158)，於培養室(約25°C，光照強度3000LUX，12小時/大光照)，誘導胚狀體發芽，得到完整小植株或畸形小植株；5.誘導壯苗將步驟4的小植株或畸形小植株切除根，轉入B5壯苗培養基，誘導生根，培育壯苗。B5壯苗培養基的配製原B5培養基組分，另加0.12mg/L多效唑，原要求分析級蔗糖改用廉價食用蔗糖，蔗糖濃度2%，9g/L瓊脂，用自來水補足至l升，pH5.8-6.0，12rC高壓蒸汽滅菌20分鐘。6.油菜小孢子再生植株移栽到田間培育的油菜小孢子再生植株於5月或6月從試管中直接移栽到夏繁基地的田間，或者於10月下旬移栽到田間(湖北省武漢市)。7.突變體的選擇從苗期至結角期于田間目測確認形態變異植株，並於花期對所有誘變的油菜小孢子產生的植株套袋，迫使其自花傳粉產生自交種子。採用近紅外反射光譜儀(型號Bruker，Vector22/N)檢測自交種子中的含油量、芥酸和硫代葡萄糖甙的含量，用高效液相色譜儀(型號Waters2487-717-600)復査硫代葡萄糖甙含量，篩選品質性狀突變體。8.突變體的遺傳穩定性鑑定將形態變異體和品質變異體的種子於油菜的止常種植季節播種到田間，採用步驟7的方法進一步鑑定其遺傳穩定性。本發明的效果1.本發明的實施結果表明，紫外線對油菜離體小孢子具有較強的誘變效應。在誘變的5個品系油菜小孢子再生植株群體中，出現了雄性不育(圖2)，無花瓣(圖3)、植株的心葉紫黃色(圖4)、花瓣白色，種皮深棕色等22種變異性狀，變異率10.53-21.57%。沒有誘變(對照)的油菜小孢子再生植株出現早開花多分枝、淡黃色花、葉片淡綠、光葉、種皮深棕色等6種變異性狀，變異率為5.08-7.69%。表明本發明明顯提高了油菜突變譜和突變率(見表l)。誘變小孢子再生植株的種子品質性狀發生了廣泛變異。誘變再生的4個DH群體中低於和高於小孢子供體硫代葡萄糖甙含量的最低和最高值植株比率是25.53-78.70%,對照是13.56-23.68%。誘變再生的5個DH群體中低於和高於小孢子供體含油量的最低值和最高值的株率是22.22-59.09%,對照是9.21-19.23%。誘變再生的2個DH群體中，低於和高於小孢子供體芥酸含量的最低值和最高值的株率是38.89-46.97%,對照是18.42-20.34%(見表2-1和表2-2)。2.利用紫外燈用於油菜小孢子離體誘變具有射線源利用方便，比使用化學誘變劑對操作人員安全和簡便、省時及費用低等優點。例如，純化了的小孢子於培養皿中被照射95-100秒後，用石臘封膜封好培養皿，放入培養箱培養，誘導胚狀體，3分鐘可完成誘變流程，汙染機率低。3.本發明建立的小孢於離體誘變和植株再生體系使TILLING技術(targetinginducedlocallesionsingenomes)能在大規模的突變基因篩選中發揮應有的作用。4.本發明建立的油菜小孢子離體誘變和植株再生方法與離體抗逆境(抗冷、抗病、抗除草劑等)篩選技術結合，可以快速獲得有益種質資源。5.本發明建立的小孢子離體誘變和植株再生系統可在胚狀體階段用子葉測定篩選品質性狀突變體'從子葉提取DNA進行遺傳研究。6.本發明建立的小孢子離體誘變和植株再生技術也適用於十字花科其它作物的小孢子離體誘變和突變體篩選。圖l:本發明技術路線圖；圖2:本發明獲得的甘藍型油菜雄性不育突變株；圖3:本發明獲得的甘藍型油菜無花瓣突變株；圖4:本發明獲得的甘藍型油菜心葉紫黃色突變株。具體實施方式實施例l甘藍型油菜小孢子的分離和離體誘變在油菜的花期，於試驗田取甘藍型油菜品種中油821、華雙5號、華雙2號、華黃1號、華油8號(上述品種為中國公開推廣的甘藍型油菜品種)植株的主莖或分枝花序，帶到實驗室，選擇小孢於發育到單核晚期的花蕾，然後將花蕾放在70%乙醇水溶液中浸泡0.5-1分鐘，再於0.1%升汞水溶液中浸泡8-10分鐘(以下操作均在超淨臺進行)，隨後用無菌水衝洗3次。表面滅了菌的花蕾放入無菌的試管(以下所用器皿均經過滅菌)中，用玻棒碾碎，然後加含13%蔗糖的小孢子提取液到試管中(依花蕾的數量確定加入量)。將碾碎的花蕾和提取液倒入裝有孔徑44nm的網篩的漏鬥(下接離心管)中過濾，除掉萼片和花瓣等大體細胞組織，將含小孢子的濾液接入離心管。將離心管放入離心機離心，1000轉/pm，5分鐘。隨後用吸管吸出離心管中含體細胞組織的懸浮液，再加小孢子提取液懸浮沉澱在離心管底部的小孢子，按第一次離心的轉數和時間進行第二次離心。第三次離心，800轉/pra，3分鐘，分離出純化的小孢子。將分離純化的油菜小孢子懸浮在附加70mg/L秋水仙鹼改良的NLN培養基中，按120000/ml小孢子密度分裝在7.5ml的培養皿中，每皿6ml。然後把培養皿(不蓋蓋)放在距離紫外燈15cm處，照射95秒(在另外的實施例為IOO秒)，蓋上蓋，並用石臘封膜將皿封住，放入32'C的培養箱暗培養。小孢子提取液配製130g蔗糖加蒸餾水溶解，並加蒸餾水定溶至1000ml，pH5.8-6.0，121'C高壓蒸汽滅菌20分鐘。改良的NLN培養基配方跳125mg/L，MgS(X7H20125mg/L'KH2P04125mg/L，Ca(N03)2他0750mg/L(原配方是500mg/L)，*Na2EDTA37.3mg/L,*FeS04.7H2027.8mg/L(*原配方是FeEDTA40mg/L),MnS044H2025mg/L(原配方是MnsO，.腿7.37mg/L)，KI0.83mg/L(原配方中沒有KI)，貼0310mg/L,2nS0.,'4H20lOmg/L,Na2MA'2H200.25mg/L，CoCl2.6H200.025mg/L，CuS04'5H200.025mg/L,肌醇100mg/L，煙酸5mg/L,維生素B,0.5mg/L，維生素BeO.5mg/L，葉酸0.5mg/L，生物素0.05mg/L，甘氨酸5.0mg/L(原配方是2.Omg/L),穀胱甘肽30rag/L,穀氨醯胺800mg/L，絲氨酸100mg/L;蔗糖130g/L,pH5.8-6.0，用孔徑0.22uM的微孔濾膜抽濾滅菌。實施例2甘藍型油菜小孢子染色體加倍和胚狀體誘導將懸浮在秋水仙鹼NLN培養基經過紫外線照射的油菜小孢子在32r的培養箱暗培養2天進行染色體加倍。之後，於超淨工作檯將培養皿中含小孢子的秋水仙鹼培養基用吸管移入離心管中離心(500轉/分'3分鐘)，沉澱小孢子。再用吸管吸掉秋水仙鹼培養基，把無秋水仙鹼的改良的NLN培養基6ml加入離心管，懸浮小孢子，然後倒入直徑7.5ml培養皿，用石臘封膜封住蓋，放於約25'C的培養室靜止暗培養，誘導胚狀體。實施例3甘藍型油菜再生植株的誘導當於約25。C下暗培養的小孢子產生肉眼可見的小胚狀體時(一般在小孢子分離IO天后)，把培養皿放入震蕩器，進行震蕩培養(50轉/分)。在胚狀體發育到魚雷後期到子葉初期時停止震蕩培養'將其轉接到附加2%蔗糖的B5固體培養基，並於25'C左右的培養室培養(每天光照12小時，光照強度3000LUX)，誘導胚狀體發芽。當胚狀體產生帶葉和莖的小植株或畸形小植株時，切除這些小植株的根，然後轉入附加0.12mg/L多效唑的B5壯苗培養基，培育健壯的再生植株。上述B5壯苗培養基的配製採用原B5培養基組分，附加0.12mg/L多效唑，將原B5培養基要求的分析級蔗糖改用廉價食用蔗糖，濃度2%，用9g/L瓊脂固化，蒸餾水由自來水代替，定溶至1升，pH5.8-6.0,12rC高壓蒸汽滅菌20分鐘，備用。實施例4甘藍型油菜小孢子再生的突變植株的鑑定和選擇於10月底，用鑷子將試管中的再生植株取出，洗淨根部的培養基後立即移栽到湖北省武漢市華中農業大學試驗田。在再生植株生長期間，觀察其農藝性狀與小孢子供體植株的差異，並於花期將變異植株和所有再生植株套袋自交。於成熟期收自交種子，種子曬乾後用近紅外反射光譜儀(Bruker,Vector22/N)檢測自交種子中的含油量、芥酸和硫代葡萄糖甙等成分的含量。用高效液相色譜儀(Waters2487-717-600)複測硫代葡萄糖甙含量，篩選品質性狀變異體。篩選的農藝性狀和品質性狀發生變異的植株的種子於9月底播種到華中農業大學試驗田，進一步觀察其變異性狀是否為穩定遺傳，同時於花期對所有再生植株套袋自交，收穫的種子再次進行品質分析，鑑定其遺傳穩定性。經過兩個季節的重複鑑定，從5個誘變的品種中獲得了穩定遺傳的甘藍型油菜雄性不育植株(圖2)、無花瓣植株(圖3)和心葉紫黃色植株(圖4)，花瓣白色植株，種皮深棕色植株等22種形態性狀突變體，變異株率達10.53-21.57%。未誘變處理的小孢子(對照)產生了早花多分枝，花瓣淡黃色，葉片淡綠色等6種突變體，變異率5.08-7.69%，同時種在田間的小孢子供體植株沒有產生變異(見表l)。誘變再生的5個雙單倍體群體中低於和高於小孢子供體含油量的最低值和最高值的株率是22.22-59.09%，對照是9.21-19.23%。誘變再生的4個雙單倍體雙群體中，低於和高於小孢子供體硫代葡萄糖甙含量的最低和最高值株率是25.53-78.70%，對照是13.56-23.68%。2個群體中低於和高於小孢子供體芥酸含量的最低和最高值的株率是38.89-46.97%，對照是18.42-20.34%(見表2-1，2-2)。說明在本說明書中出現的"小孢子"、"油菜小孢子"術語就是"甘藍型油菜小孢子"，它們是指同一個試驗材料。表1紫外線誘變甘藍型油菜離體小孢子再生植株的形態變異tableseeoriginaldocumentpage8注1、對照是未經紫外線照射的小孢子再生植株。2、小孢子供體植株收穫的種子於秋天種到田間，產生的株系(每株系20株)均沒有出現變異。表2-1紫外線誘變甘藍型油菜離體小孢子再生植株的品質性狀變異tableseeoriginaldocumentpage9表2-2紫外線誘變甘藍型油菜離體小孢子再生植株的品質性狀變異tableseeoriginaldocumentpage102、從小孢子供體植株收穫的種子與誘變和對照植株種在同一田間。權利要求1、一種應用紫外線誘變甘藍型油菜離體小孢子和突變體的篩選方法，其特徵在於，用蔗糖水溶液分離甘藍型油菜小孢子，將小孢子懸浮在添加秋水仙鹼的改良的NLN培養基上進行紫外線照射及染色體加倍，將染色體加倍後的小孢子轉入改良NLN培養基上誘導成胚狀體；將再生的胚狀體轉入B5培養基誘導成雙單倍體植株，將所述的植株移栽至田間進行鑑定，篩選突變體。2、根據權利要求1所述的方法，其步驟如下(1)用含13%蔗糖的水溶液分離甘藍型油菜單核晚期的小孢子；(2)將分離出的小孢子按120000/mL密度懸浮在添加秋水仙鹼的改良NLN液體培養基上，置於超淨臺上用紫外燈照射95-100秒；(3)將紫外線處理過的小孢子置於32'C的培養箱中暗培養2天，使其染色體加倍，然後再於25'C的培養室中進行暗培養，誘導出胚狀體；(4)將步驟(3)誘導的胚狀體轉入附加2。/。蔗糖的B5固體培養基，於25'C，光照強度3000LUX，12小時/天光照下發芽，得到小植株或畸形小植株；(5)將步驟(4)的小植株或畸形小植株切除根後，轉入附加0.12mg/L多效唑，2%蔗糖的B5固體壯苗培養基上，於25'C培養成壯苗；(6)將步驟(5)的壯苗從試管中直接移栽到田間；(7)在田間觀察植株的形態特徵，選擇變異體；(8)在花期將所述的雙單倍體植株套袋自交，於成熟期收穫自交種子，檢測種子的含油量、芥酸和硫代葡萄糖甙含量，進一步篩選品質性狀變異體；(9)將產生的形態變異體和品質性狀變異體的種子於油菜種植季節播種到田間，進一步鑑定其遺傳穩定性，其中步驟(2)所述的改良的NLN培養基的組分如下KN03125mg/L,MgS04'7H20125mg/L，KH2P04125mg/L，Ca(N03)2'4H20750mg/L,Na2EDTA37.3mg/L,FeS04.7H2027.8mg/L，MnSCX4H2025mg/L，KI0.83mg/L，H3B0310mg/L，2nS04*4H2010mg/L，Na2M0O4'2^[200.25mg/L，CoCl2'6H200.025mg/L，CuS045H2O0.025mg/L，肌醇100mg/L,煙酸5mg/L，維生素B,0.5mg/L,維生素B60.5mg/L,葉酸0.5mg/L,生物素0.05mg/L,甘氨酸5.0mg/L，穀胱甘肽30mg/L,穀氨醯胺800mg/L,絲氨酸100mg/L;蔗糖130g/L。3、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，步驟(2)的秋水仙鹼添加量為70mg/L。4、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的紫外燈照射小孢子的劑量和參數是功率30W，波長253.7nm，被照射的小孢子距紫外燈15cm。5、根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，步驟(4)所述的胚狀體是魚雷後期至子葉初期的胚狀體。全文摘要本發明屬於植物細胞工程
技術領域：
，具體涉及一種甘藍型油菜離體小孢子紫外線誘變和突變體的篩選。特徵是，用蔗糖水溶液分離甘藍型油菜小孢子，將小孢子懸浮在添加秋水仙鹼改良的NLN培養基上進行紫外線照射和染色體加倍，將加倍後的小孢子轉入改良的NLN培養基上誘導出胚狀體。再將胚狀體轉入B5培養基上誘導成雙單倍體植株。將所述的植株移栽至田間進行鑑定，篩選出突變體。形態性狀突變株率為10.53-21.57％，種子中硫甙、含油量及芥酸含量的變異株率分別是25.53-78.7％，22.22-59.09％和38.89-46.97％。本發明的方法具有操作程序簡便，省時和費用低等優點。適用於十字花科作物小孢子離體誘變和突變體篩選。文檔編號C12N15/01GK101250516SQ20081004723公開日2008年8月27日申請日期2008年4月7日優先權日2008年4月7日發明者吳江生,石淑穩申請人:華中農業大學