利用酶活性的競爭性幹擾和恢復檢測被分析物的製作方法

2023-05-30 14:36:56

專利名稱：利用酶活性的競爭性幹擾和恢復檢測被分析物的製作方法
技術領域：
本發明的內容涉及利用多核苷酸和結合分子來檢測溶液中的被分析 物的方法，其中該方法利用了酶活性的竟爭性幹擾和恢復。
背景技術：
樣品中被分析物的定量和定性4全測經常用於化學和醫學領域。例如，
括，例如病毒和細菌抗原、免疫球蛋白、激素、細胞、藥物、毒素和管制 藥物。由於這些技術通常缺乏足夠的靈敏度和精密度，因此已經開發出放 大系統。
已經開發出許多不同的用於定性和定量檢測樣品中的被分析物的免
疫分析方法，如酶if關免疫吸附分析(ELISA)、》文射免疫分析(RIA)和酶 免疫分析(EIA)。例如，免疫分析可以設定為均相或異相分析，其中異相 分析為包含固相和液相的兩相分析，而均相分析是以單一相進行的。異相 分析，如ELISA是常用的，但不利的是其要求的步驟比均相分析多。而且， 除了需要額外的清洗步驟外，異相分析的缺點還在於其永遠不能真正地實 現自動化。現有的均相分析，例如酶片段互補(EFC)。 EFC是基於抗體-抗原結合的均相分析，但不利的是其靈敏度和解析度低，因為其通常只對 小抗原起作用，並且僅在具有高背景活性的分析中起作用。
問題在於當前可用的分析方法都需要有技術的技術人員，只有幾種技 術成功地適用於選擇的被分析物的檢測，並且沒有既是均相的又在各種分 析條件下對各種被分析物都靈敏的方法。因此，技術人員希望得到一種易 於使用的均相分析方法，其耗時少於異相分析，具有高靈敏度和精密度而 且能實現自動化。

發明內容
本發明提供的教導主要涉及利用多核苷酸和結合分子檢測溶液中的 被分析物的方法，其中該方法利用了酶活性的竟爭性幹擾和恢復。該教導還涉及用於實施該方法的試劑和試劑盒。
在某些實施方案中，本發明的教導涉及了測定溶液中被分析物的濃度
的方法。該方法包括選擇結合化合物；選擇被分析物的類似物並使類似物 結合到多核苷酸底物以構成試劑，用於利用期望的多核香酸反應測定分析 溶液中被分析物的含量。分析溶液中試劑與結合化合物的結合與分析溶液 中被分析物與結合化合物的結合相竟爭。該方法還包括選擇用於催化期望 的多核苷酸反應的期望的酶。
選擇並構成成分後，可以選擇該方法中使用的成分的相對用量。同樣
的酶的量:確定結合化合物與試劑的期望比率。'、、'，
然後形成分析溶液，其包含一定量的結合化合物和含量待測的被分析 物。隨後，將一定量的試劑加到分析溶液中，其中試劑的用量和結合化合 物的用量實現了結合化合物與試劑的期望比率。再向分析溶液中加入預先 選定用量的期望的酶，用於催化期望的多核苷酸反應。然後測定期望的多 核苷酸反應中期望的酶活性，來確定分析溶液中被分析物的含量。測定酶 活性的方法的例子包括但不限於技術人員所知的螢光和吸光率測定方法。
在某些實施方案中，結合化合物包括配體結合分子、抗體或細胞受體。 在某些實施方案中，類似物包含被分析物的結構或者為具有被分析物的分 子結構的化合物。在某些實施方案中，多核香酸底物包括多核苷酸引物、 多核苷酸模板或二者的組合。在某些實施方案中，多核苷酸底物為雙鏈
DNA或單鏈DNA。
在某些實施方案中，期望的多核苷酸反應包括核苷酸聚合反應、核苷 酸裂解反應或者核苷酸聚合反應和核苷酸裂解反應的組合。在某些實施方 案中，期望的多核苷酸反應包括核苷酸重組反應。
在某些實施方案中，本發明的教導涉及用於竟爭性結合分析的試劑。 該試劑可以包括結合到類似物的多核苷酸底物，並且可以選擇類似物(i) 與分析溶液中預先選定的結合化合物相結合；以及(ii)與分析溶液中被 分析物與預先選定的結合化合物的結合相竟爭。可以選擇多核苷酸底物參 與期望的多核苷酸反應，該反應通過分析溶液中結合化合物與類似物的結 合而抑制或終止。
在某些實施方案中，本發明的教導涉及用於測定分析溶液中被分析物 含量的竟爭性結合分析試劑盒。該試劑盒包含上述試劑，以及用於竟爭性
6結合分析的結合化合物，其中分析溶液中試劑與結合化合物的結合，與分 析溶液中被分析物與結合化合物的結合相竟爭。試劑盒還包括用於催化期 望的多核苷酸反應的酶，其中測定酶的活性用於確定分析溶液中被分析物 的含量。


圖1A至1C說明了根據某些實施方案，聚合酶活性的幹擾和恢復的原理。
圖2A至2C說明了根據某些實施方案，核酸外切酶活性的幹擾和恢復 的原理。
圖3A至3C說明了根據某些實施方案，聚合酶反應幹擾和核酸外切酶 幹擾的循環以及恢復循環的原理。
圖4A至4C說明了根據某些實施方案，轉移酶活性的幹擾和恢復的 原理。
圖5說明了根據某些實施方案，利用聚合酶反應幹擾的竟爭性結合分 析方法。
圖6說明了根據某些實施方案，利用核酸外切酶反應幹擾的竟爭性結 合分析方法。
圖7說明了根據某些實施方案，利用轉移酶反應幹擾的竟爭性結合分 才斤方法。
圖8說明了根據某些實施方案，如何使用實時PCR測定聚合酶反應的 抗-Dig^元體的幹擾。
具體實施例方式
本發明提供的教導主要涉及利用多核苷酸和結合分子檢測溶液中被 分析物的方法，其中該方法利用酶活性的竟爭性幹擾和恢復。本發明提供 的教導包括均相分析。
本發明的教導還涉及用於實施該方法的試劑和試劑盒。 在本發明教導的每種方法中，多核苷酸反應的程度被用於測定溶液中 被分析物的含量。在某些實施方案中，多核苷酸反應可以是使用聚合酶的 聚合反應、使用核酸外切酶的裂解反應、循環使用聚合酶和核酸外切酶的 聚合和裂解反應的循環，或重組反應。
7圖1A至1C說明了根據某些實施方案，聚合酶活性的幹擾和恢復的原 理。不想受任何理論或作用機理的限制，據信所發生的聚合酶活性的幹擾 和恢復如下圖1 (A)說明了由聚合酶106催化的聚合反應，其中多核 苷酸底物102結合類似物104。在某些實施方案中，多核苦酸底物102與 類似物104可以組合成試劑。選擇的類似物104與預先選定的結合化合物 108相結合，幹擾聚合反應。在圖1A中，聚合酶106用於聚合反應以生 成雙鏈多核苷酸112。在圖1B中，結合化合物108結合類似物104，並幹 擾聚合反應，這樣通過加入結合化合物108來抑制或終止聚合反應。在圖 1C中，被分析物IIO也能與結合化合物108結合，並與結合到結合化合物 108的類似物104相竟爭。結合的竟爭阻礙了一部分可用的結合化合物 108,從而導致某些聚合反應的恢復，生成雙鏈多核苷酸112。被分析物的 含量決定了恢復的量，因此恢復的量可以測定被分析物的含量。
圖2A至2C說明了根據某些實施方案，核酸外切酶活性的幹擾和恢復 的原理。不想受任何理論或作用機理的限制，據信發生的核酸外切酶活性 的幹擾和恢復如下圖2A說明了由核酸外切酶206催化的裂解反應，其 中多核苷酸底物202結合類似物204。所選的類似物204與預先選定的結 合化合物208相結合，幹擾裂解反應。在圖2A中，裂解反應中使用核酸 外切酶206將雙鏈多核苷酸202裂解為部分降解的多核苷酸212,最終成 為單鏈多核香酸。在圖2B中，結合化合物208結合類似物204,並幹擾 裂解反應，這樣通過加入結合化合物208來抑制或終止裂解反應。在圖2C 中，被分析物210也能與結合化合物208結合，與結合到結合化合物208 的類似物204相竟爭。結合的竟爭阻礙了 一部分可利用的結合化合物208, 從而導致某些裂解反應的恢復，單鏈多核苷酸214的生成。被分析物的含 量決定了恢復的量，因此恢復的量可以測定被分析物的含量。
圖3A至3C說明了根據某些實施方案，聚合酶反應幹擾和核酸外切酶 幹擾的循環以及恢復循環的原理。不想受任何理論或作用機理的限制，據 信所發生的聚合酶和核酸外切酶反應循環的幹擾和恢復活性如下圖3A 說明了包括採用聚合酶303的多核苷酸底物302的聚合和採用核酸外切酶 305的裂解的循環反應。如圖1和圖2所示，被選的類似物304結合到結 合化合物308。在圖3B中，所示的結合化合物308幹擾循環的兩個階段， 聚合和裂解。在圖3C中，被分析物310也能與結合化合物308結合，與 類似物304竟爭性結合到結合化合物308。該竟爭性結合阻礙了一部分可利用的結合化合物308,從而導致某些裂解反應和聚合反應的恢復，導致 多核苷酸底物302形成雙鏈多核苷酸和該雙鏈多核苦酸降解的循環增長。 被分析物的含量決定了恢復的量，故可以用恢復的量來測定被分析物的含 量。循環的作用是通過放大測得的信號來提高檢測的靈敏度，其中放大的 程度取決於檢測過程中使用的循環次數。
圖4A至4C說明了根據某些實施方案，轉移酶活性的幹擾和恢復的 原理。不想受任何理論或作用機理的限制，據信所發生的轉移酶活性的幹 擾和恢復如下圖4A說明的多核苷酸底物402是單鏈多核苷酸。單鏈多 核苷酸402為本實施例中的靶多核苷酸。轉移酶403和雙鏈多核普酸探針 405與單鏈靶多核苷酸402相結合發生重組反應，其中的靶多核苷酸402 取代FAM-標記的多核苷酸409生成重組的雙鏈多核香酸407。在圖4B中， 結合化合物408結合到類似物404,幹護O重組反應，這樣通過加入結合化 合物408來抑制或終止重組反應。在圖4C中，-故分析物410也能與結合 化合物408結合，與類似物404竟爭性結合到結合化合物408。該竟爭性 結合阻礙了一部分可利用的結合化合物408,從而導致某些重組反應的恢 復，生成重組雙鏈多核香酸407。被分析物的含量決定了恢復的量，故可 以用恢復的量來測定被分析物的含量。
本發明的內容主要涉及測定溶液中被分析物濃度的方法，該方法包括 上文討論的某些形式的反應。在某些實施方案中，期望的多核苷酸反應包 括核苷酸聚合反應、核苷酸裂解反應或者核苷酸聚合反應和核苷酸裂解反 應的組合。在某些實施方案中，期望的多核苷酸反應包括核苷酸重組反應。 在某些實施方案中，與現有可使用的均相分析相比，期望的反應獲得了明 顯更高的靈敏度，這是通過循環反應，使用實時PCR，使用序列長度超過 lkb或更長的多核苦酸底物，或它們的組合來實現的。
可以利用螢光信號的出現或消失來檢測被分析物，所述螢光信號由化 學藥品產生，如與寡核苷酸結合的染料；或者來自吸收光譜，如UV-可見 光語信號。在某些實施方案中，檢測包括識別由酶偶聯反應產生的化學發 光信號。在某些實施方案中，可以通過使用實時PCR檢測來提高檢測的靈 敏度。在某些實施方案中，可以使用化學染料，例如PICOGREEN來檢測 雙鏈多核苦酸。在某些實施方案中，用螢光素和darkquencher預先標記雙 鏈探針，這樣可以用於檢測轉移酶活性。在某些實施方案中，可以使用熒 光共振能量轉移技術(FRET)來檢測螢光信號。技術人員將認識到多種
9已知檢測系統中的任何一種都可以用於補充本發明提供的內容。
本發明提供的內容主要涉及均相分析，其中無需從其他反應成分中分 離出流體樣品就可以檢測被分析物的存在和含量。異相分析與均相分析的 區別在於，異相分析的反應介質包含至少兩個獨立的相，如具有附著的用 於結合被分析物的試劑的固相載體和含有被分析物的流體介質。
該方法包括選擇結合化合物；選擇被分析物的類似物並將類似物與多
核苷酸底物結合以構成試劑，利用期望的多核苷酸反應來測定分析溶液中 被分析物的含量。分析溶液中試劑與結合化合物的結合，與分析溶液中被 分析物與結合化合物的結合相竟爭。
技術人員將認識到，被分析物可以為流體分析樣品中可以確定其存在 和含量任何化合物。被分析物的例子包括但不限於毒素、管制藥物、激素、 小分子藥物、生物藥品、核酸、蛋白質、肽、免疫球蛋白或它們的片段、 抗原或細菌或病毒顆粒，其在免疫或其他反應中能與配體反應。
結合化合物的選擇取決於樣品中要確定和/或定量的被分析物的結構。 例如，若被分析物為抗原，抗原的抗體可以用作適合的結合化合物。若被 分析物為細胞因子，例如細胞受體可以用作細胞因子的適合的結合化合 物。因此，在某些實施方案中，結合化合物包括配體結合分子、抗體或細 胞受體。這些結合化合物的例子可以包括但不限於免疫球蛋白、維生素結
合蛋白、IL-1受體、T-細胞受體等。
結合化合物的選擇至少部分取決於結合化合物與被分析物和類似物 的相對結合親和力。以配體結合分子為例，其可以包括對另一目標化合物 具有高結合親和力的任何分子。在某些實施方案中，結合親和力的範圍為 從大約lxlO"M到大約lxlO"M、從大約lxl(^M到大約lxl(T7M、從大 約5xlO-5M到大約5xlO"M以及從大約8xl(r5M到大約2xlO-6M。
類似物的選擇也取決於樣品中要確定和/或定量的被分析物的結構。在 某些實施方案中，類似物包括被分析物的結構或為具有被分析物分子結構 的化合物。可使用本領域技術人員已知的任何方法將類似物結合到底物。 例如，類似物可以為結合到接頭的被分析物，並且接頭結合到多核苷酸底 物。但是，類似物與多核苷酸底物的結合可以使用接頭，也可以不使用接 頭，這取決於各實施方案。
多核苷酸底物的選擇應當對應於所選擇的期望的多核苷酸反應，該期 望的多核苷酸反應可以是例如聚合反應、裂解反應、聚合和裂解的循環或
10重組反應。在某些實施方案中，多核苷酸底物包括多核芬酸引物、多核苷 酸模板或者它們的組合。
在某些實施方案中，多核苷酸底物為單鏈或雙鏈的。在某些實施方案
中，多核苷酸底物為雙鏈DNA或單鏈DNA。在某些實施方案中，多核苷 酸底物可以包括RNA。在某些實施方案中，多核苦酸可以包括至少10個 核苷酸的序列。在某些實施方案中，多核香酸底物包括至少20個核苦酸、 至少30個核苷酸、至少50個核苷酸、至少75個核苦酸、至少100個核 苷酸或至少200個核苷酸的序列。事實上，在某些實施方案中，多核苷酸 底物可以更長，具有至少500個核普酸，甚至1000個核苦酸或更長的長 度。在某些實施方案中，多核苷酸底物可以包括起始區域、啟動子區域或 者它們的組合。起始區域可以包括聚合反應起始的核苷酸序列，可以在單 鏈或雙鏈多核苦酸上。啟動子區域可以指雙鏈起始區域，並且在某些實施 方案中，通過將寡核苷酸或引物退火到單鏈多核苷酸的起始區域而形成雙 鏈起始區域，其中寡核苷酸或引物是與起始區域互補的。
本領域技術人員將理解如何形成用於本發明描述的聚合反應、裂解反 應或重組反應的多核苷酸底物。在某些實施方案中，多核苷酸包括至少20 個核苦酸殘基，各殘基包括噪呤或嘧咬鹼基、糖和磷酸酯，且通常通過磷 酸二酯鍵與其他殘基相連接。核苦酸應具有包括本發明所述的起始區域的 核苷酸序列。在某些實施方案中，多核苷酸可以為具有噬菌體啟動子的雙 鏈多核苷酸，該噬菌體啟動子如T7 RNA聚合酶啟動子或QB噬菌體啟動 子。在某些實施方案中，多核苷酸可以為含有啟動區域的單鏈多核苷酸。 功能性啟動子區域可以通過將短鏈寡核苷酸引物退火到啟動區域來形成 功能性啟動子。在某些實施方案中，多核苷酸可以包含多於一個啟動子的 序列。
在某些實施方案中，類似物通過接頭連接到多核苷酸。選擇的接頭實 質上不會影響期望的聚合、裂解或重組反應，當然其不應實質上影響結合 化合物結合到類似物的能力。在某些實施方案中，可以使用生物素和/或抗 生物素蛋白作為接頭。
本發明提出的教導為技術人員提供了 一種檢測各種分析溶液中任何 一種中被分析物的含量的新方法，所述分析溶液如生物或非生物的流體樣 品。在某些實施方案中，分析為免疫分析，在某些實施方案中，樣品為血 清樣品。樣品可以為體液，例如血液、血清、血漿、脊髓液、精液、唾液、積液、分泌物、膿液、羊水、尿液、糞便、獲自濃縮的肺呼出物或分泌物 的流體、細胞組織等。在某些實施方案中，流體樣品可以為培養基、藥理 學試劑樣品、食物樣品、乳製品、水樣品等。在某些實施方案中，樣品可 以為工業流體才羊品。
在某些實施方案中，本發明提供的教導可以用於檢測目前通過異相系 統檢測的被分析物，包括免疫原性被分析物，如抗體，或非免疫原性被分
析物，如糖蛋白。以T-細胞受體為例，如CD4可以用作抗fflV抗體的結 合化合物。或者作為另一個例子，識別糖蛋白上的多糖的凝集素可以用作 糖蛋白的結合化合物。
本發明提供的教導可用於測定樣品中維生素D3的濃度。維生素D3 是一種前激素，長期以來已知其在調節體內鈣和磷水平，以及骨骼礦化中 的重要作用。在維生素D3快速擴展的研究領域中，臨床應用很大程度上 不得不受到所使用的方法的限制，同樣地，技術人員希望具有使用本發明 教導的方法來檢測維生素D3水平的能力。在某些實施方案中，被分析物 可以為維生素D3;類似物可以包括維生素D3或其書f生物，並且可以與多 核苷酸相結合以形成分析試劑；以及可以使用抗-維生素D3抗體作為結合 化合物。可以選擇KlenowDNA聚合酶用於酶反應。當抗-維生素D3抗體 結合到試劑時會阻礙Klenow酶活性。樣品中游離的維生素D3通過竟爭性 結合到抗-維生素D3抗體使Klenow酶活性恢復，Klenow酶活性恢復的量 可以確定樣品中維生素D3的含量。
藥物濫用是當今社會的重要問題，因此，本領域人員期望改進的簡單、 準確且並t確測定藥物水平的方法。然而，目前該領域內仍然Y吏用異相分析， 該領域將從本發明所教導的方法中受益。本發明提供的教導可以用於檢測 例如古柯鹼。在某些實施方案中，被分析物可以為古柯鹼；類似物可以包 括古柯鹼或其衍生物，並且可以與多核苦酸相結合以形成分析試劑；並且 抗-古柯鹼抗體可以用作結合化合物。可以選擇Klenow DNA聚合酶用於 酶反應。樣品中的古柯鹼將竟爭性結合到抗-古柯鹼抗體。恢復Klenow酶 的活性對應於樣品中古柯鹼的濃度。當抗-古柯鹼抗體結合到試劑時，會阻 礙Klenow酶活性。樣品中的游離古柯鹼通過竟爭性結合到抗-古柯鹼抗體 而恢復Klenow酶活性，Klenow酶活性恢復的量可以確定樣品中的古柯鹼 的含量。
使用本發明提供的方法，還可以容易地測定具有較大分子體積的被分析物。以鈉尿肽(BNP)和鈉尿肽原(proBNP)為例，它們可用於評估心 力衰竭、左心室功能不全和急性冠狀動力永症候群。proBNP是心臟疾病的 重要心臟標記物，技術人員期望有一種易於使用、準確且精確的檢測 proBNP的方法。在某些實施方案中，被分析物為proBNP,抗-proBNP單 克隆抗體可以用作結合化合物。而且類似物可以包含proBNP的抗原決定 簇一可以被抗-proBNP抗體識別的肽，可以與多核普酸結合形成試劑。可 以選擇Klenow DNA聚合酶用於酶反應。當抗-proBNP抗體結合到試劑時， 會阻礙Klenow酶活性。樣品中的游離proBNP也包括該抗原決定蔟，將 通過竟爭性結合到抗-proBNP抗體來恢復Klenow酶活性，Klenow酶活性 恢復的量將確定樣品中的proBNP的含量。
工業樣品還可以包含目標被分析物，同樣地，本發明教導的方法可適 用於工業樣品。例如在環境研究中，還可以用本發明檢測汙染土壤樣品中 的風化油(weathered oil )。溶劑可萃取物質(SEM)可以用於免疫動物並 在動物中形成抗體，以致於形成抗-SEM抗體。在某些實施方案中，被分 析物為SEM,類似物可以包括SEM並可以與多核苦酸相結合以形成試劑。 可以選擇Klenow DNA聚合酶用於酶反應。當抗-SEM抗體與試劑相結合 時，會阻礙Klenow酶活性。樣品中的游離SEM將通過竟爭性結合到抗 -SEM抗體而恢復Klenow酶活性，Klenow酶活性恢復的量將確定樣品中 的SEM的含量。
生物素(維生素H或B7)是與抗生物素蛋白結合的小分子， 一種具 有高親和力的四聚體蛋白。同樣地，生物素常用作與抗生物素蛋白相結合 的標記化合物。在某些實施方案中，各種被分析物中的任何一種都可以用 生物素標記，使用本發明教導的方法來定量4企測。可以選擇生物素標記的 化合物作為被分析物，類似物可以包括生物素並可以與多核苷酸相結合以 形成試劑。抗生物素蛋白可以用作結合化合物，可以選擇Klenow DNA聚 合酶用於酶反應。當抗生物素蛋白結合到試劑時，會阻礙Klenow酶活性。 樣品中游離的生物素-標記的被分析物將通過竟爭性結合到抗生物素蛋白 而使Klenow酶活性恢復，Klenow酶活性恢復的量將確定樣品中的被分析 物的含量。
在選擇並構建了用於特定用途的成分後，可以選擇成分的相對量來優 化該方法的應用。優化該方法的應用包括針對分析溶液中特定濃度的被分 析物，確定結合化合物與試劑的期望比率。該步驟包括提供預先選定的期
13望量的酶來催化期望的反應。通過確定期望的反應的動力學來選擇期望的
酶的期望用量和類型。酶的例子包括但不限於聚合酶，如DNA聚合酶和 RNA聚合酶；核酸酶，如核酸外切酶；轉移酶，如RecA, RadA， Rad51等， 其中酶可以利用寡核香酸作為底物。
建立結合化合物的系列濃度來確定結合化合物與試劑的期望比率。基 於預期的待測被分析物的濃度範圍來選擇結合化合物的濃度範圍。每種檢 測樣品分別基於每種結合化合物的濃度，包括固定量的酶和固定量的試 劑。在某些實施方案中，例如，試劑的固定量可以是與被分析物的預期量 等摩爾的試劑的量。在某些實施方案中，所使用的試劑的量可能取決於試 劑如何充分地與被分析物竟爭性結合結合化合物。
一旦針對預期的被分析物的濃度範圍確定了結合化合物與試劑的期 望比率，就可以將結合化合物與試劑的期望比率固定，繪製被分析物-濃度 標準曲線，用於測定期望的多核苷酸反應中期望的酶的活性。被分析物-濃度標準曲線可以基於具有在預期範圍內的一 系列被分析物濃度的一 系 列溶液、固定量的期望的酶、具有期望比率的固定量的結合化合物與試劑。 被分析物-濃度標準曲線可以用於確定分析溶液中被分析物的含量。
繪製出被分析物濃度標準曲線後，配製含有待測被分析物和一定量結 合化合物的分析溶液。然後向分析溶液中加入一定量的試劑，使結合化合 物與試劑達到期望的比率。再將預先選定量的期望的酶加到分析溶液中催 化期望的多核苷酸反應。然後在期望的多核苷酸反應過程中測定期望的酶 的活性，使用被分析物-濃度標準曲線確定分析溶液中被分析物的含量。
在某些實施方案中，本發明的內容涉及用於竟爭性結合分析的試劑。 該試劑可以包括與類似物結合的多核苷酸底物，可以選擇類似物(i)與分 析溶液中預先選定的結合化合物相結合；以及(ii)與分析溶液中被分析 物與預先選定的結合化合物的結合相竟爭。可以選擇多核苷酸底物參與期 望的多核苷酸反應，該反應通過在分析溶液中結合化合物與類似物相結合
而#:抑制或終止。
在某些實施方案中，本發明的內容涉及用於測定分析溶液中被分析物 的含量的竟爭性結合分析試劑盒。試劑盒包含上述的試劑，以及用於竟爭 性結合分析的結合化合物，其中分析溶液中試劑與結合化合物的結合，與 分析溶液中被分析物與結合化合物的結合相竟爭。該試劑盒還包括用於催 化期望的多核苷酸反應的酶，其中測定酶的活性可以確定分析溶液中浮皮分
14析物的含量。 實施例1
在聚合酶反應中利用抗-被分析物抗體幹擾聚合
該實施例i兌明抗4皮分析物抗體如何被用作結合分子，以劑量依賴性的
方式有意幹擾聚合酶反應中的聚合。選擇的結合分子與類似物結合，該類
似物結合到DNA模板、引物或二者，並且結合分子與類似物的結合幹擾 聚合酶反應。
選擇用於聚合酶反應的DNA模板。所選擇的DNA模板是下列的51 mer單鏈寡核香酸
ATGTCTC國3， ( SEQ ID NO:7 )
還可選擇用於該反應的引物序列。該引物序列是下列的寡核苷酸 5'-GAGACAUGG畫3， ( SEQ ID NO:4 )
類似物與本實施例中的引物相結合。採用本領域技術人員已知的方法 把尿嘧啶(U)結合到類似物。所選擇的類似物為地高辛(Dig ) ( Chevalier J.at.al. 1907)。而且如上所述，進行Dig與引物的結合來構建具有用於結 合分子的結合4立點的試劑。選擇抗-Dig抗體Fab片|更(Roche Diagnostics, 德國)作為本實施例的結合分子。
製備50(xL反應混合物，其中包含10 mM Tris-HCl ( pH 7.9 )、 50 mM NaCl、 10mMMgCl2、各種dNTP 2.5 nmol、 17nM模板/引物寡核苷酸以及 按1:200稀釋的PICOGREEN (Invitrogen, San Diego )。將Fab片段以系列 濃度加到反應混合物中，該系列濃度包括濃度為5 nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 80 nM、 160 nM和320 nM。將反應混合物在室溫下孵育5分鐘， 再力口入1單位DNA聚合酶Klenow (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)以啟動聚合酶反應。再孵育5分鐘後，通過產生的螢光來檢測DNA 聚合酶反應生成的雙鏈DNA。使用480nm激發波長在520nm波長處檢測 螢光信號(Wittwer, C.T., et. Al 1997a )。
抗-Dig抗體以劑量依賴性方式明顯抑制了 DNA聚合酶鏈反應。在雙 鏈DNA的形成過程中，累積了聚合酶反應的副產物一焦磷酸(PPi)。根 據以下原理，通過4企測所生成PPi的量來確定反應的程度
15,"nn. An。ATP硫酸化酵 一
(1) PPi + APS - ATP
(2) ATP+螢火蟲螢光素 狄絲> AMP + PPi+氧化螢光素+光
酶一無才幾焦磷酸酶催化PPi轉化為兩個當量的Pi，可以用於放大檢測 並提高檢測的靈敏度，因為一分子PPi分解為兩分子Pi。裂解的無機磷酸 鹽(Pi)與2-氨基-6-巰基-7-甲基噤呤核糖核苷(MESG)反應，由噤呤核 苷磷酸化酶(PNP)經酶催化形成核糖1 -磷酸鹽和2-氨基-6-巰基-7-甲基 。票呤。MESG的酶轉化導致最大吸光率的移位，其中最大吸光率從底物的 330nm移到產物的360nm。該分析能夠檢測到小到lmL反應混合物中的1 nMPPi，可以在6.5到8.5的pH值範圍內操作。
所釋》丈的無機磷酸鹽(Pi)還可以按以下方法4企測
a 蔗糖磷酸化酶 a a
(1) Pi+蔗糖歸稚兩一 0^-葡萄糖-1^+果糖
(2) a-D-葡萄糖小Pi葡萄糖磷鼓位酶,a_D_,_6_Pi
(3 ) a-D-葡萄糖-6-Pi+NAD(P)葡萄糖_6^脫氣酵>0_葡萄糖酸-5一內
酉旨-6-Pi十NAD(P)H
其中，在340nm處監測生成的NAD(P)H。
實施例2
在聚合酶反應中利用抗-被分析物抗體幹擾聚合來檢測樣品中被分析 物的濃度
除非另外指明，本實施例使用實施例1教導的條件和材料。實施例1 描述了在聚合酶反應中，抗-被分析物抗體如何幹擾聚合以及如何以劑量依 賴的方式幹擾聚合。本實施例說明在被分析物存在下，如何使用幹擾來檢 測樣品中^皮分析物的濃度。
製備50pL的反應混合物，其中包含10 mM Tris-HCl ( pH 7.9 )、 50 mM NaCl、 10 mM MgCl2、每種dNTP 2.5 nmol、按1:200稀釋的PICOGREEN (Invitrogen, San Diego)以及抗-Dig抗體Fab片#殳(Roche Diagnostics, Germany) 33nM。選擇被分析物以測試竟爭性結合被分析物的檢測技術。選擇Dig作為被分析物，並且向反應混合物中加入具有不同Dig被分析物 濃度的樣品來與Dig類似物竟爭性結合抗體。本實施例中所使用的Dig最 大濃度為1600nM。
如上所述，Dig被分析物的類似物也是Dig，其中該Dig結合到引物 的尿嘧啶核苷，以實現與Dig被分析物竟爭性結合抗體結合分子的目的。 濃度為17nM的模板/引物寡核苷酸，與1單位DNA聚合酶Klenow相結 合來啟動聚合酶反應。
圖5說明了根據某些實施方案，利用聚合酶反應幹擾的竟爭性結合分 析。如圖5所示，DNA聚合酶活性隨著被分析物Dig濃度的增加而增強， 相應的PICOGREEN螢光也是如此。因此，該結果表明如何通過竟爭性結 合分析來檢測被分析物的濃度，本實施例中的被分析物為Dig,所述竟爭 性結合分析包括聚合酶反應幹擾和恢復技術。
實施例3
在核酸外切酶反應中利用抗-被分析物抗體幹擾裂解 實施例1和實施例2描述了如何通過利用抗-:帔分析物抗體幹擾聚合反 應來使用竟爭性結合分析測定被分析物的濃度。本實施例使用抗-被分析物 抗體幹擾核酸外切酶裂解反應來測定樣品中被分析物的含量。
核酸外切酶反應中被裂解的底物是下列雙鏈DNA ( dsDNA)片段 正義鏈序列為
ATGTCTCTCTGAC-3， ( SEQ ID NO:5 )
用Dig在序列的3，端標記作為被分析物的類似物，其中該類似物與被分析
物竟爭性結合結合分子。
反義鏈序列為
5'國GTCAGAGAGACATGGTGGTGTTGTGGTTGGTGTGTGTTGGTTGTG TGTGGTGTTGGT-3， ( SEQ ID NO:l )
製備90)iL的反應混合物，其中包含67 mM甘氨酸-KCl (pH 9.4)、 2.5 mM MgCl2、 50ug/mL BSA、 10 nM結合dsDNA的Dig以及按1:200稀 釋的PICOGREEN( Invitrogen, San Diego )。將抗-Dig抗體Fab片段(Roche Diagnostics,德國)按照系列濃度加到反應混合物中，系列濃度包括濃度為 5nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 80 nM、 160nM和320nM。將反應混合物在室溫下孵育5分鐘，再加入2.5單位入-核酸外切酶 (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA)來啟動裂解反應，選擇性地 從5'端水解dsDNA,形成ssDNA ( Tolun, G.和Myers, R. S. 2003 )。再孵 育5分鐘後，通過4全測螢光來檢測核酸外切酶活性，其中降解的dsDNA 顯示出螢光逐漸消失。當結合分子一抗-Dig抗體Fab片段存在時，螢光信 號仍然很強，表明抗-Dig抗體幹擾入-核酸外切酶的活性並且以劑量依賴 性方式幹擾入-核酸外切酶的活性。
實施例4
在核酸外切酶反應中利用抗-被分析物抗體幹擾裂解來測定樣品中被 分析物的濃度
除非另外指明，本實施例使用實施例3教導的條件和材料。實施例3 顯示了在核酸外切酶反應中，抗-被分析物抗體如何千擾dsDNA的裂解， 以及如何以劑量依賴性方式幹擾dsDNA的裂解。該實施例說明了在糹皮分 析物存在時，如何使用幹擾來測定樣品中被分析物的濃度。
在本實施例中，上述的抗-Dig抗體首先與Dig被分析物混合，使得被 分析物阻礙抗體的程度對應於被分析物的濃度，使試劑與核酸外切酶自由 反應達到試劑不再結合抗體的程度。在這種情況下，試劑為結合到Dig類 似物的dsDNA。固定抗體的濃度，以不同的濃度加入被分析物。本實施例 中所使用的Dig的最大濃度為960 nM。
隨著被分析物濃度降低，通過核酸外切酶反應裂解的游離試劑的量也 降低。使用PICOGREEN的螢光檢測測量的是核酸外切酶活性的變化，由 此確定被分析物的濃度。
圖6說明了根據某些實施方案，利用核酸外切酶反應幹擾的竟爭性結 合分析。如圖6所示，隨著被分析物Dig濃度的增加，核酸外切酶活性增 強，正如PICOGREEN螢光相應的降低所表明的。如圖6所示，被分析物 的濃度，在本實施例中淨皮分析物為Dig,可以通過包括核酸外切酶反應幹 擾和恢復技術的竟爭性結合分析來測定。
備選地，核酸外切酶反應活性以及由此確定的被分析物濃度，還可以 通過使用dNMP (入-核酸外切酶反應的另一產物)脫氫酶偶聯NADH或 NADPH來監測。
18循環進行聚合酶-核酸外切酶反應幹擾的組合來放大檢測信號，檢測樣 品中較低濃度的被分析物
以上實施例2和實施例4利用聚合酶反應的聚合幹擾過程或核酸外切 酶反應的裂解幹擾過程中檢測的信號來確定樣品中被分析物的濃度。本實 施例說明可以利用(i)聚合酶反應中抗-被分析物抗體對聚合的幹擾，以 及(ii)核酸外切酶反應中抗-被分析物抗體對裂解的幹擾的循環來明顯放 大檢測信號，甚至以更高的靈敏度來測定樣品中的被分析物的濃度。
同樣地，本實驗表明DNA聚合酶和A-核酸外切酶可以組合形成循環 分析，該分析明顯放大了用於測定樣品中被分析物的濃度的檢測信號，甚 至可以檢測出更低濃度的被分析物。除非另外指明，本實施例使用實施例 1教導的條件和材料。
向反應混合物中同時加入1單位聚合酶和2.5單位入-核酸外切酶。由 DNA聚合酶合成的dsDNA入-核酸外切酶/人DNA糹莫板上降解並除去， 生成多個焦石克酸(PPi)、 dAMP、 dCMP、 dGMP和dTMP。多次;改大4企測 信號，分別通過PPi分析和單核苷酸分析來4企測釋放的PPi和dNMPs。
當Dig被分析物不存在時，抗-Dig抗體抑制DNA聚合酶的活性。當 加入Dig被分析物時，聚合酶和入-核酸外切酶的活性提高。因此，本實施 例說明使用PPi分析和單核苷酸分析所檢測到的信號與樣品中Dig被分析 物的含量成比例。
實施例6
在轉移酶反應中利用抗4皮分析物抗體幹"f尤重組
上述實施例2和實施例4描述了聚合或裂解反應的幹擾如何影響酶的 活性並生成用於檢測樣品中被分析物的信號。本實施例描述了在轉移酶反 應中，如何使用抗-被分析物抗體對重組的幹擾來檢測樣品中被分析物的濃 度。
選擇雙鏈探針和單鏈靶點用於重組反應。雙鏈DNA探針序列具有以 下結構
5'FAM國AAACTAATAAGATTTACA-ACAATTTCTC-3， ( SEQ ID NO:3 );和 3'-DABYL畫TTTGATTATTCT-AAATGTTGTTAAAGAG-5， ( SEQ ID NO:2 )
單鏈耙點具有與5，FAM寡核香酸相同的序列。
195，-AAACTAATAAGATTTACAACAATTTCTC-3， ( SEQ ID NO:6 ),但 是該ssDNA為與類似物結合的多核苷酸，用以提供與結合分子相結合的 位點，幹擾重組反應，轉移酶反應。在本實施例中，T"與Dig分子相結 合。
製備60pL反應混合物，其中包含70mM Tris-HCl ( pH 7.6 )、 12 mM MgCl2、 0.3mMATP， ( ATP再生系統還需要3mM磷酸烯醇式丙酮酸鹽和 30U/ml丙酮酸激酶)，4.5 uM (以核苷酸的形式)靼單鏈Dig-DNA, 3uM RecA (New England BioLabs, Ipswich, MA, USA )。將抗-Dig抗體Fab片#爻 (Roche Diagnostics,德國)按照系列濃度加到反應混合物中，系列濃度包 括濃度為5nM、 10 nM、 20 nM、 40 nM、 80 nM、 160nM和320nM。
在37。C下孵育反應混合物3分鐘，使抗體與類似物相結合，所述類似 物與單鏈靶點相結合。隨後將4.5 uM (在核香酸中)的雙鏈探針DNA加 到反應混合物中。
於37'C下再賻育3分鐘後，在RecA DNA轉移酶催化下，通過雙鏈' DNA中FAM-標記的5，-序列與不含FAM的5，-耙單鏈DNA耙序列的交換 產生螢光信號。使用4卯nm激發波長在520nm波長處監測焚光信號。當 結合分子一抗-Dig抗體Fab片段存在時，螢光信號降低，表明抗-Dig抗體 幹擾轉移酶RecA的活性，並且以劑量依賴性的方式幹擾轉移酶RecA的 活性。
實施例7
在轉移酶反應中利用抗-被分析物抗體對重組的幹擾來檢測樣品中被 分析物的濃度
除非另外指明，本實施例使用實施例6中教導的條件和材料。實施例 6描述了在轉移酶反應中，抗-被分析物抗體如何幹擾dsDNA探針和ssDNA 靶序列之間的重組反應，以及如何以劑量依賴性方式幹擾dsDNA探針和 ssDNA靼序列之間的重組反應。本實施例描述了在被分析物存在時，如何 利用幹擾來檢測樣品中被分析物的濃度。
選擇Dig作為被分析物，將含有不同濃度的Dig被分析物的樣品加到 反應混合物中，與Dig類似物竟爭性結合抗體。本實施例中所使用的Dig 最大濃度為650nM。
上述的抗-Dig抗體首先與Dig被分析物混合，使被分析物對抗體的阻礙程度與被分析物濃度相對應，使試劑與轉移酶自由反應達到試劑不與抗
體結合的程度。這種情況下，試劑為結合到Dig類似物的ssDNA。固定抗 體的濃度，隨著被分析物濃度的降低，用於RecA轉移酶反應重組的游離 試劑的量也降低，檢測520 nm的螢光測定轉移酶活性的變化，由此確定 被分析物的濃度。
圖7說明了根據某些實施方案，利用轉移酶反應幹擾的竟爭性結合分 析。如圖7所示，轉移酶活性隨著被分析物Dig濃度的增加而增強，相應 的520 nm處的焚光也是如此。因此，-故分析物的濃度，在本施實施例中 被分析物為Dig，可以通過竟爭性結合分析來測定，在本實施例中，包括 RecA轉移酶反應幹擾和恢復技術。
實施例8
在聚合酶反應中利用抗-被分析物抗體幹擾聚合一檢測結果是產物收 率而非螢光或吸光率
除非另外指明，本實施例使用實施例1使用的條件和材料。實施例1 至7表明可以檢測聚合酶活性、核酸外切酶活性或轉移酶活性並用來確定 樣品中被分析物的含量。在實施例中，使用的與被分析物濃度相關的測量 值包括PICOGREEN焚光和UV吸光率。還可以使用實時定量PCR來提 高檢測的靈壽文度和精密度。
基於新合成的DNA鏈設計PCR引物。它們僅檢測新合成的DNA。 在本實施例中，酶的活性與用Dig類似物標記的游離底物或抗-Dig抗體的 濃度相關。製備25pL的反應混合物，其中包含10mMTris-HCl(pH7.9)、 50 mM NaCl、 10 mM MgCl2、 1 mM DTT、各種dNTP2.5nmo1、 1單位Klenow DNA聚合酶、1.25單位Taq DNA聚合酶、0.1 nM DNA模板/Dig結合引物 混合物以及各種PCR引物200 nM。提供各種濃度的抗體Fab片段(Roche Diagnostics,德國),最大濃度為666nM,最小濃度約10nM。
圖8說明了根據某些實施方案，如何使用實時PCR測定抗-Dig抗體 對聚合酶反應的幹擾。如圖8所示，正如使用實時PCR檢測所確定的，聚 合酶活性隨著結合化合物(抗-DigFab片段，[AB])的濃度的增加而降低。 實時PCR測定了所形成的相關的聚合產物，其中100°/。相關的產物應對應 於反應混合物中無抗體。相關聚合產物的減少對應於所加入的抗體或結合 化合物的量增加。應注意到實時PCR提供了非常靈敏的檢測，同樣地，僅
21使用0.1 nM的多核苷酸底物。在此濃度時，10nM的抗體影響很小。因 此，實時PCR是另 一種可以用於檢測上述教導的任意一種酶活性的檢測方 法，在確定樣品中被分析物的含量時具有更高的靈敏度、精密度和準確性。 僅使用常規實驗，本領域技術人員將意識到或能夠確認，本發明描述 的特定實施方案有許多等同方式。技術人員可以在超出特定實施方案的範 圍內實踐本發明教導的概念。這樣的等同方式將包括在以下的權利要求書 中。此外，還有許多本發明教導和要求的列表和群組。技術人員將認識到 每種這樣的列表和群組包含不同的種類，並且可以通過移除或添加一個或 多個種類來修飾，因為每個本發明教導和要求的列表和群組可以不適用本 發明實施的每個可行的實施方案。序列表
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利用酶活性的竟爭性幹擾和恢復檢測被分析物
DIC08110170
US12/004,281 2007-12-20
7
Patentln version 3.3
1
56
DNA
人工序列

用於"i兌明的示例序列 1
gtcagagaga catggtggtg ttgtggttgg tgtgtgttgg ttgtgtgtgg tgttgg %
2
28
DNA
人工序列

用於"i兌明的示例序列formula see original document page 24 5
3ccaacacca cacacaacc3 acacacacc3 accacaacac cacc3tgtct ctctg3c 57
6
28
DNA
人工序列

用於說明的示例序列
6
aaactaataa gatttacaac aatttctc 28
7
<211〉 51
DNA
人工序列

用於"^兌明的示例序列 7
accaac3cc8 ca^caacca acacacacca accac肌cac caccatgtct c 51
2權利要求
1、一種測定溶液中被分析物濃度的方法，其中該方法包括選擇結合化合物；選擇被分析物的類似物，並使類似物與多核苷酸底物結合，構成利用期望的多核苷酸反應測定分析溶液中被分析物的含量的試劑；以及其中分析溶液中試劑與結合化合物的結合，與分析溶液中被分析物與結合化合物的結合相競爭；選擇期望的酶用於催化期望的多核苷酸反應；針對分析溶液中特定被分析物的濃度和預先選定的期望的酶的量，確定結合化合物與試劑的期望比率；形成包含一定量結合化合物和含量待測的被分析物的分析溶液；將一定量的試劑加到分析溶液中，其中試劑的量和結合化合物的量達到期望的結合化合物與試劑的比率；將預先選定量的期望的酶加到分析溶液中，催化期望的多核苷酸反應；以及檢測期望的多核苷酸反應中期望的酶的活性來確定分析溶液中被分析物的含量。
2、 權利要求l所述的方法，其中所述結合化合物包括配體結合分子。
3、 權利要求l所述的方法，其中所述結合化合物包括抗體。
4、 權利要求l所述的方法，其中所述結合化合物包括細胞受體。
5、 權利要求l所述的方法，其中所述類似物包含被分析物的結構。
6、 權利要求1所述的方法，其中所述類似物為具有被分析物分子結 構的化合物。
7、 權利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸底物包括多核苷酸引 物、多核苦酸模板或它們的組合。
8、 權利要求l所述的方法，其中所述多核苷酸底物為雙鏈DNA。
9、 權利要求l所述的方法，其中所述多核苷酸底物為單鏈DNA。
10、 權利要求l所述的方法，其中所述期望的多核苷酸反應包括核苷 酸聚合反應。
11、 權利要求l所述的方法，其中所述期望的多核苷酸反應包括核苷 酸裂解反應。
12、 權利要求l所述的方法，其中所述期望的多核香酸反應包括核香 酸聚合反應和核香酸裂解反應的組合。
13、 權利要求l所述的方法，其中所述期望的多核苷酸反應包括核苷 酸重組反應。
14、 一種用於竟爭性結合分析的試劑，其中該試劑包括 與類似物結合的多核苷酸底物，其中選擇的類似物(i)與分析溶液中預先選定的結合化合物相結合；並且(ii)與分析溶液中被分析物與預先 選定的結合化合物的結合相竟爭；而且其中選擇的多核苦酸底物參與期望的多核芬酸反應，該多核苷酸反應
15、 權利要求14所述的試劑，其中所述多核苷酸底物包括多核苷酸 引物、多核苦酸^^板或它們的組合。
16、 權利要求14所述的試劑，其中所述多核苷酸底物為雙鏈DNA。
17、 權利要求14所述的試劑，其中所述多核苷酸底物為單鏈DNA。
18、 權利要求14所述的試劑，其中所述結合化合物包括配體結合分子。
19、 權利要求14所述的試劑，其中所述結合化合物包括抗體。
20、 權利要求14所述的試劑，其中所述結合化合物包括細胞受體。
21、 權利要求14所述的試劑，其中所述類似物包含被分析物的結構。
22、 權利要求14所述的試劑，其中所述類似物為具有被分析物分子 結構的化合物。
23、 權利要求14所述的試劑，其中所述期望的多核苷酸反應包括核 普酸聚合反應。
24、 權利要求14所述的試劑，其中所述期望的多核苷酸反應包括核 苦酸裂解反應。
25、 權利要求14所述的試劑，其中所述期望的多核苷酸反應為核苷 酸聚合反應和核苷酸裂解反應的組合。
26、 權利要求14所述的試劑，其中所述期望的多核苷酸反應包括核 香酸重組反應。
27、 一種用於測定分析溶液中被分析物含量的竟爭性結合分析試劑 盒，該試劑盒包括權利要求14所述的試劑；用於竟爭性結合分析的結合化合物，其中分析溶液中試劑與結合化合物的結合，與分析溶液中被分析物與結合化合物的結合相竟爭；以及用於催化期望的多核苷酸反應的酶，其中測定酶活性來確定分析溶液 中被分析物的含量。
28、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑包括多核苷酸引物、 多核苷酸模板或它們的組合。
29、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑為雙鏈DNA。
30、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑為單鏈DNA。
31、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑包括具有被分析物結 構的類似物。
32、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述試劑包括具有被分析物分 子結構的類似物。
33、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述結合化合物包括抗體。
34、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述結合化合物包括配體結合 分子。
35、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述結合化合物包括細胞受體。
36、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述期望的多核苷酸反應包括 核苷酸聚合反應。
37、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述期望的多核苷酸反應包括 核苷酸裂解反應。
38、 權利要求27所述的試劑盒，其中所述期望的多核苷酸反應包括 核苷酸聚合反應和核苷酸裂解反應的組合。
39、 根據權利要求27所述的試劑盒，其中所述期望的多核苷酸反應 包括核苷酸重組反應。
全文摘要
本發明涉及利用酶活性的競爭性幹擾和恢復檢測被分析物。本發明的內容主要公開了一種測定溶液中被分析物濃度的方法。該方法包括選擇結合化合物；選擇被分析物的類似物並將類似物與多核苷酸底物結合構成試劑，利用期望的多核苷酸反應來測定分析溶液中被分析物的含量，該期望的多核苷酸反應包括聚合反應、裂解反應或重組反應。分析溶液中試劑與結合化合物的結合，與分析溶液中被分析物與結合化合物的結合相競爭。該方法還包括選擇用於催化期望的多核苷酸反應的期望的酶。還提供了試劑和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101463388SQ20081018823
公開日2009年6月24日 申請日期2008年12月19日 優先權日2007年12月20日
發明者夏東元 申請人:博爾誠(北京)科技有限公司