長效人促紅細胞生成素融合蛋白及其製備和純化方法

2023-05-30 00:51:26 1

專利名稱：長效人促紅細胞生成素融合蛋白及其製備和純化方法
技術領域：
本發明涉及生物製藥領域，具體涉及一種用於治療貧血症的重組人促紅細胞生成素(rhEPO)融合蛋白rhEPO-Fc，製備和純化該融合蛋白的方法，以及該融合蛋白在醫藥中的用途。
背景技術：
紅細胞生成素(EPO)是調控人紅細胞形成的主要調節因子。EPO是一種糖蛋白，在胎兒體內由腎臟及肝臟產生，而在成人體內主要由腎臟產生。腎功能受到損害，如在慢性腎衰竭的病人中，紅細胞生成素的產生受到妨礙，可導致貧血的產生。正常人體內血液中紅細胞生成素的含量為10～18毫單位/毫升。當體內缺氧時，紅細胞生成素的含量可提高到1000倍以上。紅細胞生成素與靶細胞如骨髓細胞、脾細胞、胎兒肝細胞上的特定位點結合，從而促進紅細胞前體細胞的增殖、分化並成熟為紅細胞，增加骨髓向循環血中紅細胞的釋放量。由此可見，紅細胞生成素是一種重要的造血生長因子，對體內紅細胞的生成起著不可缺少的調控作用。
Epo為單鏈多肽，包括166個胺基酸，含兩對二硫鍵(Cys7-161和Cys29-33)以及四個潛在的糖基化位點，其中有三個N-連接位點(Asn24，Asn38，Asn83)和一個O-連接位點(Ser126)。Epo的分子量為30-34kDa，其中多肽僅為18kDa。40％糖基化的Epo的主要糖鏈結構為N-連接的複合型多糖，在Epo的生物學活性中發揮重要作用。
靶細胞受EPO刺激後先是細胞質內Ca2+的聚集。FVA細胞在4℃受高濃度EPO刺激1分鐘後，其細胞質內即有Ca2+聚集。單個紅系前體細胞受EPO刺激後細胞質中Ca2+濃度升高，這是由於細胞內Ca2+的重新分布，而不是因為細胞外Ca2+進入了細胞。EPO作用於靶細胞後的另一效應是使細胞內DNA合成增加。如無EPO存在，即使增加細胞質內Ca2+濃度，也不能使紅系前體細胞向紅系細胞分化，說明Ca2+很可能在紅系細胞的增殖和分化中起輔助作用。
此外，缺氧小鼠注射EPO後0.5-2.0小時，其脾臟中紅系造血前體細胞RNA聚合酶II活性增強，3-12小時後RNA聚合酶I活性增強，非組蛋白合成增強。12-14小時後RNA酶II活性再次增強，同時DNA聚合酶α活性增強，組蛋白合成增加。48小時後，DNA合成量達最大值。
血紅蛋白的合成也受EPO的影響，骨髓被抑制和刺激的大鼠骨髓細胞在體外培養中加入EPO後2小時，其球蛋白mRNA水平即出現差別。FAV細胞在體外經EPO刺激後6小時有β球蛋白mRNA生成，純化的CFU-E經EPO作用後不到1小時有球蛋白mRNA轉錄。以上結果表明，球蛋白基因的轉錄可能是EPO對造血細胞的最早效應。
紅細胞過多的大鼠，骨髓紅細胞生成受到嚴重抑制。這種細胞有足量的合成血紅蛋白的酶，但不能合成血紅蛋白。經EPO刺激後有膽色素原脫氨酶出現，用於血紅素合成的酶沒有變化。這一限速酶的合成在EPO刺激後20～24小時出現。
此外，FAV細胞經EPO刺激後6小時，轉鐵蛋白結合位點開始增加，到24小時後增加1倍。骨髓抑制的大鼠骨髓細胞體外培養表明，EPO可促進骨髓細胞表達一些紅細胞膜成分及一些在紅系細胞分化過程中只一過性地表達的成分，說明EPO對造血細胞有多方面的作用。
目前，EPO已經廣泛的應用於治療慢性腎衰引起的貧血。此外，EPO對改善AZT治療AIDS病人後誘導的貧血狀態有明顯作用。EPO還用於治療腫瘤引起的貧血和腫瘤化療引起的貧血、治療早產兒貧血、治療類風溼關節炎引起的貧血。在手術前給予EPO能增加病人自體血液回輸的量，在手術前後應用EPO能刺激骨髓細胞使手術中的失血得到較快的代償。
IgG類免疫球蛋白是人體血液中最豐富的蛋白，其半衰期可達21天。已有報導顯示將IgG的Fc片段與其他蛋白融合，可顯著增加該蛋白在體內的生物活性和半衰期。這種方法已經應用於一些臨床上很重要的細胞因子和可溶性受體，並獲得了成功，如sTNF-αR、LFA3、IL-2、INF-α等等。
EPO在體內的半衰期僅為4到11.2小時，對病人而言這就需要在一周內接受2～3次的注射。本發明的申請人選擇裂解活性最弱的人IgG2的Fc片段接至Epo的C-末端，構建rhEpo-Fc融合蛋白，大大提高了EPO在體內的半衰期，同時在相同分子數基礎上保持與天然Epo相似的生物學活性，並實現了融合蛋白在哺乳動物細胞CHO中的高效表達，且純化工藝簡單，利於進一步的大規模製備。

發明內容
本發明的一個方面提供了一種用於治療貧血症的重組人促紅細胞生成素(rhEPO)融合蛋白rhEPO-Fc，該多肽是包含SEQ ID NO6所示胺基酸序列的多肽，或其片段、同源物、類似物或衍生物。在一優選的實施方案中，rhEPO-Fc由SEQ ID NO6所示胺基酸序列構成。
本發明的另一個方面提供了一種編碼重組人促紅細胞生成素融合蛋白rhEPO-Fc的多核苷酸分子，其特徵在於它是與SEQ ID NO6編碼相同胺基酸序列的蛋白質、但因遺傳密碼的簡併性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
優選地，本發明的多核苷酸分子包含SEQ ID NO5所示的核苷酸序列；更優選地，本發明的多核苷酸分子是SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
本發明進一步提供含有編碼本發明多核苷酸的重組表達載體、由該重組表達載體轉化的宿主細胞，以及由該宿主細胞所衍生的新的株系或細胞系。在一優選實施方案中，本發明提供一種包含本發明多核苷酸分子的重組真核表達載體pEPO-Fc，以及含有該重組表達載體的遺傳工程宿主細胞pEPO一Fc/CHO。
本發明進一步提供製備rhEPO-Fc融合蛋白的方法，其包括在適於該融合蛋白的條件下培養用重組表達載體轉化的宿主細胞，以及從細胞培養物中回收和純化該重組融合蛋白的步驟。在一個優選的實施方案中，宿主細胞經細胞培養、離心後，上清液分別用親和層析和分子篩層析純化。在一個優選的實施方案中，親和層析是rProtein ASepharose FF親和層柱，分子篩是Superdex 200prep grade柱。
本發明進一步提供含有本發明rhEPO-Fc融合蛋白作為活性成分和藥學上可接受載體的藥物組合物，以及該藥物組合物在治療貧血症的藥物中的用途，包括慢性腎衰引起的貧血、AZT治療AIDS病人後誘導的貧血、腫瘤引起的貧血、腫瘤化療引起的貧血、早產兒貧血以及類風溼關節炎等原因引起的貧血。
本文中提到的rhEPO-Fc融合蛋白的「同源性」多肽是指，多肽本來具有rhEPO-Fc融合蛋白的胺基酸序列，但其中一個或多個胺基酸殘基已被不同的胺基酸殘基保守地取代，並且所得到的多肽可用於實施本發明。保守胺基酸取代是本領域已知的。造成這樣的取代的規則包含由Dayhof，M.D.(1978，國家生物醫學研究基金，Washington，D.C.，第5卷，增刊3)等所述的取代規則。更具體地說，保守胺基酸取代發生在與其酸性、極性或側鏈大小相關聯的胺基酸家族內。一般可將遺傳編碼的胺基酸分為四組(1)酸性胺基酸天冬氨酸、穀氨酸；(2)鹼性胺基酸賴氨酸、精氨酸、組氨酸；(3)非極性胺基酸丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)不帶電的極性胺基酸甘氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸也共同分類為芳香胺基酸。任何特定組內的一個或多個取代，例如用異亮氨酸或纈氨酸取代亮氨酸、或用穀氨酸取代天冬氨酸、或用絲氨酸取代蘇氨酸，或任何其他胺基酸殘基結構上相關的胺基酸殘基，例如有相似酸性、極性、側鏈大小的，或在其某些組合方面有相似性的胺基酸殘基取代，一般對多肽的功能或免疫原性不會有太大影響。
在本發明中，「SEQ ID NO6所示胺基酸序列的類似物」被定義為，與SEQ ID NO6相比較，具有一個或幾個胺基酸取代，刪除，轉換或增加的分子。「SEQ ID NO6所示胺基酸序列的衍生物」被定義為如下一種分子，它具有SEQ ID NO6或SEQ ID NO6類似物胺基酸序列，但是另外還具有化學修飾的一個或幾個胺基酸側鏈基團，α-碳原子，末端氨基，或者末端羧酸基。化學修飾包括增加部分化學結構，生成新鍵，和除去部分化學結構。對胺基酸側鏈基團的修飾包括賴氨酸ε-氨基的醯基化，精氨酸，組氨酸或賴氨酸的N-烷基化，穀氨酸或天冬氨酸羧酸基的烷基化，以及穀氨醯胺或天冬醯胺的脫醯氨基。末端氨基的修飾包括脫氨基，N-低級烷基修飾，N-二低級烷基修飾和N-醯基修飾。對末端羧基的修飾包括醯胺修飾，低級烷基醯胺修飾，二烷基醯胺修飾和低級烷基酯修飾。低級烷基是C1-C4烷基。並且，還可以用蛋白質化學的普通技術人員熟知的保護基，保護一個或幾個側鏈基團或末端基團。還可以使胺基酸的α-碳原子單甲基化或二甲基化。
本文所用的術語「多核苷酸分子」是指單鏈或雙鏈的DNA和RNA分子，可包含一個或多個原核序列，cDNA序列，包含外顯子和內含子的基因組DNA序列，化學合成的DNA和RNA序列，以及有義和相應的反義鏈。
生產和操作本文公開的多核苷酸分子的方法是本領域技術人員已知的，並可按照已描述的重組技術完成(參見Maniatis等，1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Ausubel等，1989，分子生物學當前技術，Greene PublishingAssociates Wiley Interscience，NY；Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約；Innis等(編)，1995，PCR策略，AcademicPress，Inc.，San Diego；和Erlich(編)，1992，PCR技術，牛津大學出版社，New York)。
本發明提供了包含編碼rhEPO-Fc融合蛋白的一種多核苷酸分子，在進一步的優選實施方案中，本發明的編碼rhEPO-Fc融合蛋白的多核苷酸分子包含選自下列成員的核苷酸序列(1)包含SEQ ID NO5的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO5所示核苷酸序列至少70％相同、優選至少80％相同、更優選至少90％相同、最優選至少95％相同的核苷酸序列；(3)在中等嚴謹雜交條件下(即在0.5M NaHPO4、7％十二烷基硫酸鈉(SDS)、1mM EDTA中於65℃與結合於濾膜的DNA雜交，並在0.2xSSC/0.1％SDS中於42℃洗滌的條件；參見Ausubel等(編)，1989，分子生物學當前技術，第1卷，Green Publishing Associntes，Inc.，and John Wiley Sons，Inc.，NY，P.2.10.3)、優選高度嚴謹雜交條件(即在0.5M NaHPO4、7％SDS、1mM EDTA中於65℃與結合於濾膜的DNA雜交，並在0.1xSSC/0.1％SDS中於68℃洗滌條件；參閱Ausubel等，1989，上述文獻)下與具有SEQ ID NO5或其互補序列的多核苷酸分子能雜交的核苷酸序列；或者(4)與SEQ ID NO6編碼相同胺基酸序列的蛋白質、但因遺傳密碼的簡併性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
可用於表達本發明的rhEPO-Fc融合蛋白序列的各種表達載體是本領域已知的，其中包括含有特定編碼序列的重組噬菌體DNA、質粒DNA和粘粒DNA表達載體。可經加工而含有本發明的多核苷酸分子的典型原核表達載體質粒包括pUC8、pUC9、pBR322和pBR329(Biorad Laboratories，Richmond，CA)、pPL和pKK223(Pharmacia，Piscataway，NJ)、pQE50(Qiagen，Chatsworth，CA)和pGEM-T EASY(Promega，Madison，WI)等。可經加工而含有本發明的多核苷酸分子的典型真核表達載體包括蛻皮激素誘導型哺乳動物表達系統(Invitrogen，Carlsbad，CA)、基於巨細胞病毒啟動子-增強子的系統(Promega，Madison，WI；Stratagene，La Jolla，CA；Invitrogen)，和基於杆狀病毒的表達系統(Promega)等。
可用於實施本發明的宿主細胞可以是真核或原核細胞。這樣的宿主細胞包括但不只限於微生物，例如用重組噬菌體DNA、質粒DNA或粘粒DNA載體轉化的細菌，或者用重組載體轉化的酵母，或者是動物細胞，如用重組病毒載體如杆狀病毒感染的昆蟲細胞，或用重組病毒載體如腺病毒或痘苗病毒感染的哺乳動物細胞等。例如，可使用大腸桿菌菌株，如DH5α菌株。真核宿主細胞包括酵母細胞，但也可有效地利用小鼠、倉鼠、牛、猴或人細胞系等哺乳動物細胞。可用於表達本發明的重組蛋白質的真核宿主細胞包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NIH/3T3等。
含有本發明多肽的藥物組合物可用於多種治療目的，本發明的藥物組合物不僅用於治療慢性腎衰引起的貧血，還可以用於治療AZT治療AIDS病人後誘導的貧血、腫瘤引起的貧血和腫瘤化療引起的貧血、早產兒貧血、類風溼關節炎引起的貧血以及在手術前給予增加病人自體血液回輸的量，在手術前後應用刺激骨髓細胞使手術中的失血得到較快的代償。
本領域技術人員可以理解，本發明的藥物組合物適用於各種給藥方式，例如口服給藥、經皮給藥、靜脈內給藥、肌肉內給藥、局部給藥、經鼻給藥等。根據所採用的給藥方式，可將本發明的多肽藥物組合物製成各種合適的劑型，其中包含至少一種有效劑量的本發明的多肽和至少一種藥學上可接受的藥用載體。
適當劑型的實例為片劑，膠囊，糖衣片劑，粒劑，口服溶液和糖漿，用於皮膚表面的油膏和藥貼，氣霧膠，鼻噴劑，以及可用於注射的無菌溶液等。
含有本發明多肽的藥物組合物可以製成溶液或者凍乾粉末以用於胃腸外給藥。在使用前可加入適當溶劑或其它可藥用的載體將粉末重新配製。液體配方一般是緩衝液、等滲溶液和水溶液。
劑型中還可含有其它常規組分，如防腐劑、穩定劑、表面活性劑、緩衝液、調節滲透壓的鹽、乳化劑、增甜劑、著色劑、調味劑等等。本發明藥物組合物中使用的穩定劑優選檸檬酸鈉、甘氨酸、甘露醇、神經節糖苷等。含有本發明藥物組合物的注射水針或凍乾粉針更優選的配方包括，rhEPO-Fc 25-500μg，NaCl 4mg，磷酸鹽3.02mg，甘氨酸5.0-20mg或甘露醇10-30mg，注射用水0.5ml。
若有特殊治療要求，本發明的藥物組合物還可包含其他活性藥理成分，這種相伴使用有利於治療。
本發明藥物組合物中多肽的用量可以在一個較大範圍內變動，本領域技術人員可以根據一些已知的因素，諸如根據疾病的種類、病情嚴重程度、病人體重、劑型、給藥途徑等因素很容易的加以確定。
本發明的優點1.在分子數相同時與天然EPO相比，具有類似的生物活性。
2.在動物的藥代試驗中顯示出顯著延長的半衰期。
3.選擇IgG2的Fc片段作為融合片段，避免副作用的產生。
4.表達量高，穩定性好，易於放大生產，成本低廉。
本發明的工程細胞連續傳代103代後，仍能穩定分泌表達rhEPO-Fc融合蛋白。通過滾瓶培養方式進行培養，用ELISA方法檢測培養上清中的表達量，統計30餘次的數據，表達量均在40～65mg/L/3d。每次細胞培養的規模都在30～40L左右。滾瓶培養方式的一個特點，就是便於在一定規模下放大生產，通常可方便地放大到350～400L。在純化方面，由於融合蛋白在細胞培養上清中含量高，而純化工藝中的rProteinA Sepharose FF親和層析步驟具有很高的純化效率，每毫升凝膠可結合50mg左右的融合蛋白，更易於放大生產。EPO-Fc融合蛋白的臨床使用劑量很小，為微克級劑量。預計每個劑量小於100μg。因此，其生產成本更為低廉。
附圖簡要說明

圖1.顯示重組質粒pEPO-Fc的構建過程。
圖2.顯示Epo的RT-PCR結果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為DNA分子量標準(Roche DNA M.W.Marker VIII)，泳道C為陰性對照，泳道1和2為RT-PCR產物。
圖3.顯示IgG2Fc的RT-PCR結果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為DNA分子量標準(Roche DNA M.W.Marker VIII)，泳道1和2為RT-PCR產物。
圖4.顯示重組質粒pUC18-Epo的酶切鑑定結果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為分子量標準，3、4、6和9分別代表3、4、6和9號克隆。
圖5.顯示重組質粒pUC18-Epo-Fc的酶切鑑定結果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為分子量標準，1、5、6、7、8、9和12分別代表1、5、6、7、8、9和12號克隆。
圖6.顯示重組質粒pEpo-Fc的酶切鑑定結果(1％Agarose電泳)。
圖7.顯示不同克隆的基因組DNA的PCR擴增結果(1％Agarose電泳)，其中泳道C1為陽性對照(以pEpo-Fc為模板)，泳道1為B4-3克隆，泳道2為A1-6克隆，泳道3為C1-5克隆，泳道4為A6-5克隆，泳道C2為陰性對照。
圖8.顯示不同克隆的總RNA的RT-PCR擴增結果(1％Agarose電泳)，其中泳道M為DNA分子量標準(1kb DNA ladder)，泳道C1為陰性對照，泳道C2為陽性對照(以pEpo-Fc為模板)，泳道1為B4-3克隆，泳道2為A1-6克隆，泳道3為C1-5克隆。
圖9.顯示純化後蛋白的電泳圖譜(12％SDS-PAGE)，其中泳道M為蛋白質分子量標準(Promega)，泳道S為純化後的樣品。
圖10.顯示rhEPO-Fc與天然rhEPO半效量比較(細胞依賴株檢測法)。
實施例實施例一Epo目的基因及人IgG2Fc片段基因的獲得我們採用RT-PCR方法從正常人血液提取的總RNA中擴增Epo的cDNA片段。根據Epo基因序列設計的引物為5』引物5』CTC CAA GCT TGC TAG CAT GGG GGT GCA CGA ATG TCC TG 3』(SEQID NO7)3』引物5』GCG GAT CCT CTG TCC CCT GTC CTG CAG GCC TC 3』(SEQ ID NO8)為了能將PCR產物直接插入克隆載體，我們在5』引物中引入了Hind III和NheI酶切位點，在3』引物中引入了BamH I酶切位點。
RT-PCR反應條件如下RT-PCR反應混合物在50℃變性30分鐘後，按下列條件進行反應逆轉錄反應94℃變性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸45秒，反應10個循環。
PCR反應94℃變性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸45秒，反應25個循環。然後68℃再延伸12分鐘。
反應完成後，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物。如圖2所示，我們得到了預計大小的DNA片段(約590bp)。經測序，擴增的Epo cDNA片段的核苷酸序列為SEQ IDNO1，其胺基酸序列為SEQ ID NO2。
同時，我們設計如下引物擴增IgG2Fc片段cDNA5』引物5』CGG GAT CCG AGC GCA AAT GTT GTG TCG AGT GC 3』(SEQ ID NO9)3』引物5』GGA ATT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AGG 3』(SEQ ID NO10)為了能將PCR產物插入克隆載體，我們在5』引物中引入了BamH I位點，在3』引物中引入了EcoR I位點。
以正常人淋巴細胞總RNA為模板，RT-PCR擴增IgG2Fc片段，反應條件如下RT-PCR反應混合物在50℃變性30分鐘後，按下列條件進行反應逆轉錄反應94℃變性30秒；55℃退火30秒；68℃延伸1分鐘，反應10個循環。
PCR反應94℃變性30秒；60℃退火30秒；68℃延伸1分鐘，反應25個循環。然後68℃再延伸12分鐘。
反應完成後，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產物。如圖3所示，我們得到了預計大小的DNA片段(約700bp)。經測序，擴增的IgG2Fc cDNA片段的核苷酸序列為SEQ ID NO3，其胺基酸序列為SEQ ID NO4。
實施例二重組質粒的構建如上所述，我們在用於擴增Epo cDNA的5』引物中引入了Hind III酶切位點，在3』引物中引入了BamH I酶切位點，這樣可將Epo的cDNA片段直接插入克隆載體pUC18的多克隆位點Hind III/BamH I中，IgG2Fc片段插入到pUC18的多克隆位點BamH I/EcoRI中，即可得到Epo-Fc融合片段。測序鑑定後，再用Nhe I和EcoR I回切插入表達載體pcDNA3.1的多克隆位點Nhe I/EcoR I中，即可得到真核表達質粒pEpo-Fc。其構建過程詳見圖1。
1.重組質粒pUC18-Epo的構建將在實施例1中擴增的Epo cDNA片段插入pUC18(市售)的Hind III/BamH I位點，將連接產物pUC18-Epo轉化大腸桿菌JM109，隨機挑選12個克隆進行篩選。重組質粒pUC18-Epo的酶切鑑定結果見圖4。3、4、6號克隆均用BamH I/Hind III回切出目的片段，選3號克隆進行測序鑑定，並用於下一步的構建。
2.重組質粒pUC18-Epo-Fc的構建以pUC18-Epo 3號克隆為基礎，將在實施例1中擴增的IgG2Fc cDNA片段插入BamH I/EcoR I位點。將連接產物pUC18-Epo-Fc轉化大腸桿菌JM109，隨機挑選12個克隆進行篩選。重組質粒pUC18-Epo-Fc的酶切鑑定結果見圖5。1、5號克隆均用BamHI/EcoR I回切出目的片段，選1號克隆送去測序鑑定。
3.插入基因片段——Epo及IgG2Fc的序列測定選擇重組質粒pUC18-Epo-Fc的1號克隆用PE公司的377全自動測序儀進行測序，經測序，插入的融合蛋白Epo-Fc片段的核苷酸序列為SEQ ID NO5，其胺基酸序列為SEQ ID NO6。測序結果表明我們所得到的重組質粒中的目的基因與發表的Epo基因與IgG2Fc基因序列一致。
4.真核表達載體pEpo-Fc的構建將Epo-IgG2Fc片段從pUC18-Epo-Fc的1號克隆切下來，插入到pcDNA3.1(市售)的Nhe I/EcoR I位點，得到重組質粒pEpo-Fc。將pEpo-Fc轉化大腸桿菌JM109，隨機挑選12個克隆進行篩選。重組質粒pEpo-Fc的酶切鑑定結果見圖6。2、3、4、5、9、10、12號克隆均用Nhe I/EcoR I回切出目的片段，選10號克隆進行下一步的CHO穩定表達株的篩選。
實施例三CHO穩定表達株(CHO-EF細胞)篩選及鑑定取10μg大量製備的實施例2中的pEpo-Fc質粒，利用脂質體Lipofectin轉染CHO細胞。兩天後按1∶5的比例傳代，加入0.4mg/ml的G418篩選，10天可見克隆形成。隨機消化144個邊緣明顯分開、細胞狀態良好的單克隆接種於6個24孔板培養(第一輪篩選)。
取三天後的培養上清用ELISA檢測融合蛋白的表達情況，從中選出表達陽性的39個克隆分別接種於2個24孔板(第二輪篩選)及1個6孔板(用於保種)，培養4天後，取上清用ELISA檢測融合蛋白的表達情況，從中選取表達較高的6個克隆A1-6、C1-5、B4-3、B5-5、A6-4、A6-5進一步用有限稀釋法進行篩選。
分別接種96孔板(5細胞/孔/200μl)(第三輪篩選)，待細胞長滿後(大約13天後)，取培養上清用ELISA檢測融合蛋白的表達情況，B4-3、A6-4、C1-5均為均一的克隆，分別挑取表達較高的6個克隆接種24孔板，各平行接2孔。待細胞長滿後，其中一孔用於保種，另一孔接種6孔板。待6孔板內的細胞長滿後，抽提基因組DNA和總RNA，用PCR鑑定整合入基因組的插入片段的存在情況，用RT-PCR鑑定插入片段的轉錄(即表達)情況。結果如圖7和8所示，B4-3、A6-4、C1-5均為正確的克隆。
分別取B4-3(C3)、A6-4(B4)、C1-5(D8)接種96孔板(1細胞/孔/200μl)(第四輪篩選)，待細胞長滿後(大約15天後)，取培養上清用ELISA檢測融合蛋白的表達情況，三個克隆均為均一的克隆，將其中表達最高的分別擴增、保種，進行下一步表達和純化。pEpo-Fc轉化CHO細胞後，將穩定表達的細胞命名為CHO-EF細胞。
實施例四製備rhEPO-Fc融合蛋白大規模培養CHO-EF細胞，經離心後上清液用1M的NaOH調節pH至7.3，用以10mMPB(pH7.3)平衡的rProtein A-Sepharose F.F.(Parmacia)親和層析柱進行吸附，再用同樣的緩衝液洗滌親和柱至280nm的OD值小於0.01。用0.05～0.1M的檸檬酸緩衝液將融合蛋白洗下，收集洗脫峰並立即用200mM Na2HPO4調節pH至7.0。樣品濃縮後，上分子篩Superdex 200prep grade柱預先用20mMPBS(含150mMNaCl，pH7.2)緩衝液平衡，將濃縮後的樣品上樣純化。純化後的蛋白電泳圖譜見圖9，純度可達到98％以上。
實施例五製備以rhEPO-Fc為活性組份的注射劑/凍幹劑配方rhEPO-Fc100mgNaCl8gNa2HPO4·12H2O 5.16gNaH2PO4·2H2O 0.874g甘氨酸 15g甘露醇 30g注射用水1000mlpH值7.2無菌過濾後分裝成0.5ml/支的注射水針劑或凍幹，製成凍乾粉針。
實施例六rhEPO-Fc在獼猴體內的藥代動力學本研究採用ELISA試劑盒測定獼猴血清中rhEPO-Fc濃度，並得出相應的藥代動力學參數。同時還進行方法學確證，包括方法回收率、精密度、準確度和靈敏度等。
1、分組和劑量該試驗共分2組，分別是陽性EPO對照組、rhEPO-Fc劑量組，每組3隻獼猴。具體分組安排如下(1)EPO對照組—皮下給藥(等摩爾劑量)，即2.5ug/kg(2)rhEPO-Fc中劑量單次給藥組-皮下單次給藥10ug/kg2、採血點設計rhEPO-Fc組於皮下給藥後4h、8h、12h、24h、36h、48h、72h、96h、120h、168h、216h採血測定血清中rhEPO-Fc的濃度；陽性EPO對照組於皮下給藥後15min、30min、45min、1h、1.5h、2h、3h、4h、8h、12h、24h採血測定血清中rhEPO-Fc的濃度。
同時，每組還要進行血液學指標的檢測，檢測時間點為48h、120h、216h、312h、384h、480h、552h和648h，檢測的血液學具體指標是網織細胞計數(RTC)、RBC和HB。
3、藥代動力學結果皮下給予陽性EPO後，2h達到最大濃度，濃度為30.4±1.8ng/ml；AUC0-24221.6±45.7ng.Equ.h·mL-1；MRT為6.9±0.4h；CL為10.2±2.0mL·h-1·kg-1；Vss為70.4±10.1mL·kg-1；消除半衰期為7.4±0.3h。
皮下給予rhEPO-Fc後，達峰時間為8h，達峰濃度為76.6±2.4ng/ml；AUC0-216為2715.1±289.0ng.Equ.h·mL-1；MRT為42.7±1.0h；CL為3.7±0.4mL·h-1·kg-1；Vss為156.9±15.6mL·kg-1；消除半衰期為33.2±4.5h。
實施例七重組人長效促紅細胞生成素(rhEPO-Fc)藥效學一、rhEPO-Fc給藥劑量設定在本試驗中我們將試驗藥rhEPO-Fc與陽性對照藥EPO進行比較。根據文獻報導並結合臨床給藥方案，選用一個有效劑量，陽性EPO暫定500U/kg.day，每周給藥三次，連續用藥四周。rhEPO-Fc的劑量範圍設定陽性藥EPO組的等摩爾量15μg/kg。作為長效製劑，rhEPO-Fc的給藥周期和頻率定為每周一次，連續給藥四周。本實驗的檢測時間點為每周檢測一次、給藥前和末次給藥後一周，進行生化和血液學指標的動態檢測，以進行時效關係的判定。
二、大鼠治療前後體重變化和體態變化試驗大鼠自每日給予腺嘌呤灌胃給藥後，前七天由於藥物作用還未體現，所以體重增加很大，後七天受腺嘌呤的作用影響，體重增加很少甚至降低。給藥第七天開始，大鼠飲水量、尿量均增加，同時伴有困盹、萎靡，活力下降；體毛逐漸乾枯、僵變，部分還出現脫毛現象。給藥rhEPO-Fc十天後，大鼠精神狀態、活動能力明顯改善，體毛開始光滑潤澤，體重明顯增加很快。
三、腎衰模型前後大鼠血液、生化學指標變化在給藥腺嘌呤7天後，所有大鼠血肌酐(Cr)和血清尿素氮(BUN)都逐漸上升，而RBC、Hb、Hct和網織紅細胞計數(RTC)等逐漸下降。20天模型建成後，與試驗前相比，Cr、BUN值有顯著增加，RBC、Hb值呈顯著下降，Hct值也降低，RTC值降低到接近0。表明腺嘌呤已經使腎功能損壞，造成貧血。
四、rhEPO-Fc對大鼠腎功能的影響腎衰模型建立後，rhEPO-Fc治療前大鼠的肌酐和血清尿素氮值見表1，治療後的見表2和表3。用rhEPO-Fc治療後，給藥組大鼠的Cr和BUN逐漸回落，但仍然明顯高於正常大鼠對照組，表明腎臟功能仍然處於衰退狀態，rhEPO-Fc不能糾正腎衰表現。
五、對腎衰大鼠貧血的治療作用經陽性對照EPO和rhEPO-Fc治療後，紅細胞、血紅蛋白和紅細胞壓積與治療前相比，均有不同程度的提高，rhEPO-Fc與對照藥治療效果一致。
表1用藥前各組的血液學和生化學指標(n＝10)

表2用藥15天後血液學和生化學指標(n＝10)

表3用藥30天後血液學和生化學指標(n＝10)

實施例八rhEPO-Fc融合蛋白與EPO體外活性比較收集UT-7細胞，用完全培養基洗滌1次，計數，調整密度至1.5×105/ml，將rhEPO-Fc和EPO稀釋至約2μM，在96孔培養板中4倍稀釋10個濃度梯度，每個稀釋度保留體積100μl，然後接種100μl細胞懸液至各個稀釋度，培養48小時後，加入5mg/ml MTT(噻唑藍)20μl，繼續培養4.5小時，小心去除150μl上清後補加相同體積的DMSO(二甲基亞碸)，充分裂解混勻，酶標儀測定OD490/655。其半效量(EC50)基本一致(見圖10)。
應當理解的是，通過上述具體的實施例，更容易理解本發明。上述實施例只是舉例描述，但是不打算將本發明限制於具體的實施方式。在閱讀了本發明的上述內容後，本領域技術人員在不背離本發明的精神和範圍的前提下，可以對本發明作出各種修改和改良，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
參考文獻1.Zheng X.X.，Steele A.W.，Hancock W.W.et al.，IL-2 receptor-targetedcytolytic IL-2/Fc fusion protein treatment blocks diabetogenic autoimmunityin nonobese diabetic mice.J.Immunol.，1999，1634041-4048.
2.Zheng X.X.，Steele A.W.，Nickerson P.W.，et al.，Administration ofnoncytolytic IL-10/Fc in murine models of lipopolysaccharide-induced septicshock and allogeneic islet transplantation.J.Immunol.，1995，1545590-5600.
3.Barouch D.H.，Crain A.，Kuroda M.J.，et al.，Augmentation of immune responsesto HIV-1 and simian immunodeficiency virus DNA vaccines by IL-2/Ig plasmidadministration in rhesus monkeys.PNAS，2000，97(8)4192-4197.
4.Sturmhoefel K.，Lee K.，Gray G.S.，et al.，Potent activity of soluble B7-IgGfusion proteins in therapy of established tumors and as vaccine adjuvant.Camcer Res.，1999，594964-4972.
5.Ferrari-Lacraz S.，Zheng X.X.，Kim Y.S.，et al.，An antagonist IL-15/Fcprotein prevents costimulation blockade-resistant rejection.J.Immunol.，2001，1673478-3485.
6.Kendall R.G.，Erythropoiet in.Clin.Lab.Haem.2001，2371-80.
7.Sytkowaki A.J.，Lunn E.D.，Davis K.L.，et al.，Human erythropoietin dimerswith markedly enhanced in vivo activity.PNAS，1998，951184-1188.
8.Dalle B.，Henri A.，Rouyer-Fessard P.，et al.，Dimeric erythropoietin fusionprotein with enhanced erythropoietic activity in vitro and in vivo.Blood.2001，973776-3782.
序列表110北京博康健基因科技有限公司120長效人促紅細胞生成素融合蛋白及其製備和純化方法16010170Patent In Version 3.02101211582212DNA213人4001atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 5822102211166212PRT213人
4002Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 16Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 32Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 48Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 64Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 96Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu112Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Aal128Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val144Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala160Cys Arg Thr Gly Asp Arg1662103211687212DNA213人4003gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc aggaccgtca 60gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc120acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa ctggtacgtg180gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt caacagcacg240ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgttgtg caccaggact ggctgaacgg caaggagtac300aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc360aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga ggagatgacc420aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga catcgccgtg480gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc catgctggac540
tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag600gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag660agcctctccc tgtctccggg taaatga6872104211228212PRT213人4004Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val 16Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 32Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 48His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 64Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 80Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 96Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro112Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln128Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val144Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val160Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro176Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr192Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val208Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu224Ser Pro Gly Lys2282105211
212DNA
213人4005atgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtggcttctcctgtccctgctgtcgctccctctgggcctcccagtcctgggcgccccaccacgcctcatctgtgacagccgagtcctggagaggtacctcttggaggccaaggaggccgagaatatcacgacgggctgtgctgaacactgcagcttgaatgagaatatcactgtcccagacaccaaagttaatttctatgcctggaagaggatggaggtcgggcagcaggccgtagaagtctggcagggcctggccctgctgtcggaagctgtcctgcggggccaggccctgttggtcaactcttcccagccgtgggagcccctgcagctgcatgtggataaagccgtcagtggccttcgcagcctcaccactctgcttcgggctctgcgagcccagaaggaagccatctcccctccagatgcggcctcagctgctccactccgaacaatcactgctgacactttccgcaaactcttccgagtctactccaatttcctccggggaaagctgaagctgtacacaggggaggcctgcaggacaggggacagaggatccgagcgcaaatgttgtgtcgagtgcccaccgtgcccagcaccacctgtggcaggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacgtgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccccgaggtccagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccacgggaggagcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaaggcctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaaaccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctaccccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacacctcccatgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga2106211396212PRT213人4006Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 16Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 32Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr lys Val Asn Phe 48Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 64Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 96Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu112Arg Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala128
Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val144Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala160Cys Arg Thr Gly Asp Arg Gly Ser Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys176Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe192Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val208Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe224Asn Trp Tyr Val Asn Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro240Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr256Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val272Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr288Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg304Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly320Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro336Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser352Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln368Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His384Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys396210721138212DNA213人工序列220
4007ctccaagctt gctagcatgg gggtgcacga atgtcctg38
210821132212DNA213人工序列220
4008gcggatcctc tgtcccctgt cctgcaggcc tc 32210921132212DNA213人工序列220
4009cgggatccga gcgcaaatgt tgtgtcgagt gc 322101021132212DNA213人工序列220
40010cgggatccga gcgcaaatgt tgtgtcgagt gc 3權利要求
1.一種重組人促紅細胞生成素(rhEPO)-Fc融合蛋白，其特徵在於該融合蛋白是包含SEQ ID NO6所示胺基酸序列的多肽，或其片段、同源物、類似物或衍生物。
2.根據權利要求1的融合蛋白，其特徵在於該融合蛋白是由SEQ ID NO6所示胺基酸序列構成的多肽。
3.一種編碼權利要求1或2融合蛋白的多核苷酸分子，其特徵在於它是選自下列核苷酸序列中的一種(1)包含SEQ ID NO5的核苷酸序列；(2)與SEQ ID NO5所示核苷酸序列至少70％相同的核苷酸序列；(3)在嚴謹雜交條件下能與SEQ ID NO5或其互補序列的多核苷酸分子雜交的核苷酸序列；(4)編碼與SEQ ID NO6相同胺基酸序列的蛋白質、但因遺傳密碼的簡併性而在序列上有所不同的核苷酸序列。
4.根據權利要求4的多核苷酸分子，其中所述的多核苷酸分子是SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
5.含有權利要求3或4的多核苷酸分子的重組表達載體。
6.根據權利要求5的重組表達載體，其中該重組表達載體是真核表達載體。
7.根據權利要求6的重組表達載體，其中該真核表達載體是pEpo-Fc。
8.含有權利要求5-7中任一項所述重組表達載體的宿主細胞。
9.根據權利要求8所述的宿主細胞，其中該宿主細胞是CHO細胞。
10.製備權利要求1或2所述融合蛋白的方法，其特徵在於該方法包括在適於表達該融合蛋白的條件下培養權利要求8或9的宿主細胞，以及從細胞培養物中回收和純化該融合蛋白的步驟。
11.純化權利要求1或2所述融合蛋白的方法，其特徵在於權利要求8或9的宿主細胞經細胞培養、離心後，上清液分別用親和層析和分子篩層析純化。
12.根據權利要求11所述的方法，其特徵在於親和層析中使用的是rProtein ASepharose FF親和層柱。
13.根據權利要求12所述的方法，其特徵在於分子篩層析中使用的是Superdex 200prep grade柱。
14.一種藥物組合物，其特徵在於該藥物組合物含有作為活性成分的權利要求1或2的融合蛋白以及藥學上可接受的載體。
15.根據權利要求14的藥物組合物，其中該藥物組合物是適於通過靜脈內、皮下、肌肉、鞘內、鼻腔黏膜、口腔黏膜等途徑給藥的劑型。
16.權利要求1或2所述的融合蛋白在製備治療貧血症的藥物中的用途。
17.根據權利要求16所述的用途，其中所述貧血症是慢性腎衰引起的貧血症、AZT治療AIDS病人後誘導的貧血、腫瘤引起的貧血、腫瘤化療引起的貧血、早產兒貧血以及類風溼關節炎引起的貧血等。
全文摘要
本發明公開了一種利用基因工程方法生產的重組人促紅細胞生成素(rhEPO)－Fc融合蛋白，編碼該融合蛋白的多核苷酸以及製備和純化該融合蛋白的方法，其中該融合蛋白由人促紅細胞生成素和人IgG2的Fc片段組成。該融合蛋白可在哺乳動物細胞中高效表達，且純化工藝簡單，利於進一步的大規模製備。本發明所獲得的rhEPO－Fc融合蛋白與天然EPO比較，具有血清半衰期更長的特點，同時在相同分子數基礎上仍保持與天然EPO相似的生物活性。可用於治療各種原因引起的貧血症，包括慢性腎衰引起的貧血、AZT治療AIDS病人後誘導的貧血、腫瘤引起的貧血、腫瘤化療引起的貧血、早產兒貧血以及類風溼關節炎引起的貧血等。
文檔編號C12N15/62GK1872881SQ200610072229
公開日2006年12月6日 申請日期2006年4月14日 優先權日2006年4月14日
發明者劉勁瑋, 韓為躍, 何凱, 劉德林, 楊立明, 陽勇 申請人:北京博康健基因科技有限公司