利用基於α病毒且靶向高親和性層粘連蛋白受體的載體進行腫瘤治療的製作方法

2023-05-29 17:31:16

專利名稱：利用基於α病毒且靶向高親和性層粘連蛋白受體的載體進行腫瘤治療的製作方法
技術領域：
本發明涉及癌症的病毒載體療法，特別是相對於體內的正常細胞來說，可以一種特異性方式來誘導腫瘤細胞凋亡。
背景技術：
癌症基因治療在很大程度上受益於一種載體(vector)的提供，這種載體具有一種高效率的基因表達能力並且具有靶向腫瘤細胞的能力。已經開發了大量的轉染系統來傳遞異源基因進入體內腫瘤以研究癌症基因治療，但是所有這些系統都有局限性。例如，因為逆轉錄病毒載體可以介導穩定的基因傳遞，同時可能具有低的免疫原性，所以它們已經被用作基因傳遞；然而，它們的傳遞效率相對較低(見，例如，Di Ianni等J.Hematother.Stem.Cell Res.，1999，8645-652；Morling等，Gene Ther.，1995，2504-508；Lam等，Hum.Gene Ther.，1996，71415-1422；Kume等，Stem Cells，1999，17226-232)，而且微生物系變異也是一個潛在的問題(見Thompson，Science，1992，2571854)。另外，逆轉錄病毒載體(只有少數例外)易被人類血液中的血清組分裂解(見Miyao等，Hum Gene Ther，1997，81575-1583；Russell等，Hum Gene Ther，1995，6635-641和Rother等，J Exp Med，1995，1821345-55)。這一點很大程度地限制了它們在體內的應用。腺病毒載體似乎可以更有效地進行體內基因的傳遞，但是這些載體只能以一種局限性的方式應用，這是因為它們缺乏通過血流被傳遞的能力(見Duncan等，J GenVirol.，1978，4045-61；Alemany等，J Gen Virol.，2000，81 Pt 112605-2609和Alemany等，Nat Biotechnol.，2000，18723-727)，並且由於腺病毒蛋白的高免疫原性而可能會對病人造成毒性(見Ginsberg，Bulletin ofthe New York Acad.Med.，1996，7353-58和Sparer等，J.Virol.，1997.712277-2284)。
儘管有上述這些進展，但是癌症仍舊是一個需要新的解決方案的主要的公共健康問題。目前，發展治療載體的努力在於解決載體安全性和治療基因表達有效性的問題。
α病毒載體的許多性質使它們成為其它正在開發的病毒衍生的基因傳遞系統的所希望的替代選擇，這些性質包括如下能力(i)快速地設計表達構建物，(ii)生產高效價感染粒子原種，(iii)感染不分裂細胞，和(iv)獲得高水平的表達(Strauss and Strauss，Microbiol.Rev.1994，58491-562；Liljestrm等，Biotechnology 1991，91356-1361；Bredenbeek等，Semin.Virol.1992，3297-310；Xiong等，Science 1993，2431188-1191)。缺陷型的辛德比斯病毒載體已經用來保護哺乳動物免受原生寄生蟲，蠕蟲寄生蟲，體外寄生蟲、真菌、細菌和病毒損害(PCT公開號WO 94/17813)。
對於一種編碼委內瑞拉馬腦炎(VEE)的cDNA和製備減毒的外衣病毒的方法已有描述(美國專利號5,185,440)。缺陷型辛德比斯病毒載體已經通過將異源序列插入到基因組的結構區域中製備得到了(美國專利號5,217,879)。另外，基於具有異源序列的新德比斯缺陷型幹擾(DI)粒子的RNA載體也已有描述(美國專利號5,091,309)。α病毒，特別是塞姆利基森林病毒，被用於醫療中來傳遞編碼外源性RNA的異源基因，例如，一種抗原的抗原決定部位或決定簇(PCT公開號WO 95/27069和WO95/07994)。也已經公開了從一個α病毒鹼基序列的下遊異源序列的增強的表達載體(PCT公開號WO 95/31565)。基於α病毒的載體也用於免疫蛋白產生或蛋白序列表達(PCT公開號WO 92/10578)。一種用於α病毒載體的cDNA構建物可以被引入並在動物或人類細胞中轉錄(PCT公開號WO95/27044)。
辛德比斯病毒是α病毒屬中的一員，自其發現以來從1953年開始在世界各地對其已經進行了廣泛的研究(見Taylor等，Egypt.Med Assoc.，1953，36489-494；Taylor等，Am.J.Trop.Med Hyg，1955，4844-862和Shah等，Ind.J.Med.Res，1960，48300-308)。像許多其它α病毒一樣，辛德比斯病毒可以通過蚊向脊椎動物宿主傳遞。α病毒體由一種殼核組成，裡面包裹著一脂質雙層，在其上具有包膜蛋白。包膜蛋白是與宿主細胞受體結合的媒介，由此導致病毒體的胞吞作用。胞吞後，殼核(衣殼蛋白和染色體組病毒RNA的一種複合物)沉積入宿主細胞的細胞質。辛德比斯病毒基因組是一種11703n的單鏈49S RNA(Strauss等，1984，Virology，13392-110)，在5』末端蓋帽並在3』末端聚腺苷醯化。基因組RNA是(+)-義的並具傳染性，在受感染的細胞中作為mRNA。基因組RNA的翻譯產生了非結構蛋白，nsP1，nsP2，nsP3和nsP4，它們被生產作為聚蛋白並且是經過蛋白水解加工的。感染早期，非結構蛋白，可能與宿主一起利用基因組(+)-義RNA作為模板來生成一個全長的、互補(-)鏈RNA。(-)鏈是合成全長基因組RNA的模板。(-)鏈上的一個內部啟動子被用於亞基因組的26S mRNA的轉錄，此mRNA和三分之一的基因組RNA的3』末端是共線性的。這一26S亞基因組mRNA被翻譯來產生一種結構聚蛋白，它經歷共翻譯和翻譯後裂解來生產結構蛋白C(殼體)，E2和E1(包膜)。殼體蛋白C使基因組RNA包殼來形成殼核。這些與細胞表面結合病毒包膜蛋白的胞漿功能域相互作用，導致了殼核包裹入包含包膜蛋白的膜雙層和病毒體後代從受感染細胞出芽。辛德比斯病毒感染已經顯示在宿主細胞內誘導細胞凋亡(Levine等，Nature，1993，361；739-742；Jan AND GRIFFIN，J.Virol.，1999，7310296-10302)。
雖然基於辛德比斯病毒的基因轉導在體外已經有了很好的研究(見Straus等，Microbiol.Rev.，1994，58491-562；Altman-Hamamdzic等，Gene Ther.，1997，4；815-822；Gwag等，Mole.Brain Research.，1998，6353-61；Bredenbeek等，J Virol，1993，67；6439-6446；Liljestrom等，Biotechnology，1991，91356-1361；Piper等，Meth.Cell Biol.，1994，4355-78和Grusby等，Proc Natl.Acad.Sci U S A.，1993，903913-3917)，並且有許多關於在體內辛德比斯病毒轉移入中樞神經系統的報導(Duncan等，J Gen Virol.，1978，4045-61；Alemany等，J Gen Virol.，2000，81 Pt 112605-2609和Alemany等，Nat Biotechnol.，2000，18723-727)和抗原呈遞細胞(見Tsuji等，J Virol，1998，726907-6910；Hariharan等，J Virol，1998，72950-958；Pugachev等，Virology，1995，212587-594和Xiong等，Science，1989，2431188-1191)的報告，但是在體內辛德比斯病毒系統的應用很受限制。
然而，基於辛德比斯病毒的載體的應用的一個主要的缺點在於這些載體被認為缺乏有用的靶細胞特異性(在本發明之前)。對於哺乳動物細胞而言，至少一種辛德比斯病毒受體是一種先前被認為是高親和性的層粘連蛋白受體(HALR)的蛋白，它的廣分布和高保存性可能是病毒有廣泛宿主範圍的部分原因(Strauss and Strauss，1994，supra；Wang等，J.Virol.1992，664992-5001)。因此人們考慮希望能通過改變辛德比斯病毒載體的向性來達到向特定靶細胞類型的基因傳遞的特異性(見PCT公開號WO 98/44132)。這種向性的改變暗示著需要內源性的病毒向性的消融和新向性的引入，例如，通過設計一個包括一個蛋白A的IgG結合域的嵌合的病毒包膜蛋白。
在成熟的辛德比斯病毒體內，一個(+)-義病毒基因組RNA和殼體蛋白C複合來形成被有兩個整體膜糖蛋白的脂質雙層包圍的二十面體的殼核，E1和E2埋置在其中(Strauss and Strauss，1994，supra)。雖然E1和E2形成了一個作為一個單元起作用的異質二聚體，但是E2結構域似乎對於與細胞的結合尤其重要。能夠中和病毒感染性的單克隆抗體(mAbs)通常是E2種特異性的，在E2中，而不是在E1中的突變通常與改變的宿主範圍和毒性有關(Stanley等，J.Virol.1985，56110-119；Ohnsted等，Virology1986，148245-254；Polo等，J.Virol.1988，6221242133；Lustig等，J.Virol.，1988，622329-2336)。一種辛德比斯病毒突變體也被鑑別了出來，它包含一個在E2中的插入部分並顯示與哺乳動物細胞的缺陷型結合(Dubuisson等，J.Virol.1993，673363-3374)。
總而言之，在此領域仍需要有效的癌症治療方法。特別是，此領域需要一種有效的治療，它特異性地靶向並破壞腫瘤細胞而對於正常細胞沒有重大的不利的後果。本發明滿足了此領域的所有這些及其它需求。
發明概述本發明提供了一種治療患腫瘤的哺乳動物(例如人類)的新方法，與具有相同品系的正常細胞相比，此腫瘤表達較高水平的高親和性層粘連蛋白受體(HAIR)。本發明的方法包括向患此腫瘤的哺乳動物施用治療腫瘤有效量的一種載體以治療腫瘤，其中的載體同HALR具有一種優先的親和性。優選地，此載體是一種基於病毒的載體。當在這裡公開時，用在本發明方法中的優選的基於病毒的載體是一種基於α病毒的載體(例如，一種複製缺陷型基於α病毒的載體)，更優選地，一種複製缺陷型基於辛德比斯病毒的載體。
當在這裡公開時，除了同HALR具有天然親和性和天然細胞凋亡誘導功能的基於α-病毒的載體，本發明的載體可以從任何能被有效改造成與HALR具有一種優先的親和性和具有抗腫瘤活性的粒子或病毒衍生而來。因此，在一個單獨的實施方案中，本發明包括一種治療患腫瘤的哺乳動物的方法，利用與HALR具有一種優先親和性並編碼一個抗腫瘤基因的載體。在這裡公開時，這種抗腫瘤基因可以是自殺基因、細胞凋亡誘導基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列或免疫原性肽編碼序列。在一種優選的實施方案中，這種抗腫瘤基因是一種細胞凋亡誘導基因或一種細胞因子編碼基因。
在另一實施方案中，本發明提供了一種利用基於α病毒的載體治療一種患腫瘤的哺乳動物(例如人類)的方法，其中載體沒有被修飾來特異性地靶向腫瘤細胞。優選基於α病毒的載體是一種辛德比斯病毒載體，更優選是一種複製缺陷型基於辛德比斯病毒的載體。在這裡公開時，基於α-病毒的載體可以被修飾來編碼一種異源抗腫瘤基因。
本發明也包括一種利用被修飾為靶向一特定腫瘤的基於α病毒的載體來治療患腫瘤哺乳動物的方法。因此，當在這裡公開時，本發明方法中使用的載體可以被修飾來編碼一種分子，此分子特異性地與腫瘤細胞中的配體相互作用。根據具體的實施方案，載體可以被改造來編碼，例如，包含一個腫瘤特異性受體結合序列的嵌和的包膜蛋白，與腫瘤特異性結合位點有親和性的肽模擬物，識別一種腫瘤特異性抗原的免疫球蛋白分子或它的片段，或可與抗病毒受體(例如，抗-HALR)抗體一同施用的蛋白A的IgG-結合域。
本發明的方法可以被用來治療各種腫瘤和轉移瘤，這一點在發明詳述和實施例部分說明。在一特殊的實施方案中，本發明的方法被用來治療實體瘤，特別是肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌、腦惡性腫瘤(例如成神經細胞瘤、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、成神經管細胞瘤、星形細胞瘤、聽覺神經瘤、少突神經膠質細胞瘤和腦脊膜瘤)、乳腺癌、肺癌(例如小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、卵巢腺癌、結腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
按照本發明，抗腫瘤載體優選地通過胃腸外途徑施用給哺乳動物，例如，腹膜內給藥。
本發明進一步提供了證據，即如果接受治療的哺乳動物具有至少部分的免疫系統功能，則此公開的治療腫瘤的方法(特別是用α病毒載體)是特別有效的。在一具體實施方案中，本發明提供了在功能性自然殺傷(NK)細胞的存在下利用基於辛德比斯病毒的載體的治療腫瘤的方法更有效的證據。
本發明還提供殺死腫瘤細胞的方法(體內或體外)，包括使腫瘤細胞和殺死腫瘤細胞有效量的載體接觸，其中的載體與HALR具有優先的親和性並且可以或可以不編碼一種異源抗腫瘤基因。優選地，載體是一種複製缺陷型基於α病毒的載體，更優選地是一種複製缺陷型基於辛德比斯病毒的載體。
此外，本發明還有利地提供了治療患腫瘤的哺乳動物用的藥物組合物，包括一個載體和一種藥學上可接受的媒介物(carrier)(為了便於區別，在本文中，將vector譯作載體，而將carrier譯作媒介物)或稀釋劑，其中的載體具有同HALR優先的親和性並能有效地殺死腫瘤，前提是，如果載體是一種基於α病毒的載體，它沒有被修飾用來靶向一種腫瘤特異性細胞決定簇。這些藥物組合物可被用來治療與具有相同品系的正常細胞相比表徵為提高的水平的HALR表達的各種腫瘤和轉移瘤。在這裡公開時，本發明的載體可以從與HALR無天然親和性的粒子或病毒(如逆轉錄病毒或腺病毒)衍生得到，通過修飾它們的靶向分子使其包含辛德比斯病毒包膜蛋白的HALR結合域。可選擇的，載體可以是一種基於α病毒的載體，更優選的是一種複製缺陷型辛德比斯病毒的載體，它具有天然靶向性，並且沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細胞決定簇。
本發明的藥物組合物中使用的載體可以被修飾來包含一種異源抗腫瘤基因，例如但不限於自殺基因、細胞凋亡誘導基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列或免疫原性肽編碼序列。在一個優選的實施方案中，這種抗腫瘤基因是一種細胞凋亡誘導基因或一種細胞因子編碼基因。
本發明的組合物可以被用來治療各種實體瘤，特別是肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌、腦惡性腫瘤(例如成神經細胞瘤、成膠質細胞瘤、神經膠質瘤、成神經管細胞瘤、星形細胞瘤、聽覺神經瘤、少突神經膠質細胞瘤和腦脊膜瘤)、乳腺癌、肺癌(例如小細胞肺癌和非小細胞肺癌)、卵巢的惡性腺瘤、結腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
在一個獨立的實施方案中，本發明的組合物，特別是包含α病毒載體的組合物，如果施用給具有至少一種部分的免疫系統功能的哺乳動物(例如通過胃腸外途徑)會特別有效，優選包含功能性天然殺傷(NK)細胞的免疫系統。
本發明達到了發明的這些和其它的目標，這一點在發明詳述和實施例(包括附圖)中會更詳細地描述。


圖1.基於辛德比斯病毒表達和輔助載體的代表圖示。SinRep/LacZ是一種基於辛德比斯病毒的表達載體，它包括包裝信號、用於複製RNA轉錄物的非結構蛋白基因和LacZ基因。DH-BB是一個親本的輔助質粒，它包括用來包裝辛德比斯病毒基因組必需的結構蛋白(殼體、E3、E2、6K和E1)的基因。縮寫詞PSG，辛德比斯病毒亞基因組啟動子；C，殼體；NSP1-4，非結構蛋白基因1-4；POLY A，聚腺苷酸化信號。沒有顯示的是SinRep/Luc和SinRep/IL12載體，它們與SinRep/LacZ基本相似。SinRep/Luc包括一個編碼螢火蟲螢光酶基因(Luc)而不是LacZ的DNA片段(亞克隆至SinRep載體的Xba I位點)。SinRep/IL12包含鼠的IL12α-亞單位和β-亞單位基因(亞克隆至在Sph I位點下遊的Mlu I位點和Stu I位點)和一個位於Sin Rep/LacZ原始亞基因組啟動子下遊的第二亞基因組啟動子DNA。
發明詳述本發明有利地利用簡單的α病毒載體和現有的抗腫瘤載體來進行有效的抗腫瘤治療。本發明部分是基於這樣一個意想不到的發現，即一種複製缺陷型α病毒載體是一種有效的抗癌治療劑。因此，本發明提供一種利用一種基於α病毒的載體治療患腫瘤哺乳動物(如人類)的方法，其中的載體沒有被修飾去特異性地靶向腫瘤。優選地，基於α病毒的載體是一種基於辛德比斯病毒的載體，更優選地，是一種複製缺陷型基於辛德比斯病毒的載體。
特別地，本發明部分是基於這樣一個對一種複製缺陷型辛德比斯病毒載體的觀察，它其中的結構基因被刪除並被例如與一種鄰近編碼序列5』末端的辛德比斯病毒亞基因組和一種在編碼序列3』末端的多聚腺苷酸化信號操作性地相聯繫的一種異源報告基因(例如β-半乳糖苷酶或螢光素酶)所替代，它能夠有效地在體內靶向腫瘤細胞。已經出乎意料地發現未被進行關於靶向的修飾的辛德比斯載體，顯示與體外或體內生長的腫瘤細胞的高親和性並且能夠有效地誘導導致腫瘤衰退的它們的死亡，並使試驗的患腫瘤的動物具有長的存活期(甚至在缺少任何異源抗腫瘤基因有效負荷的情況下)。
在這方面，本發明提供一種出乎意料地有效的利用病毒載體與標準基因治療相違背的方法。在基因治療中，載體是一種輸送治療基因的介質。在癌症基因治療的情況下，治療基因對腫瘤細胞產生不利影響。用於癌症基因治療的典型治療基因(「腫瘤治療基因」)的例子包括但不限於，腫瘤抑制基因(如p53和RB)；抗致癌基因細胞內抗體(如抗-Ras和抗-Raf抗體)；一種能夠酶促地將一種前藥轉化成對腫瘤細胞有毒的一種化合物的蛋白(如單純皰疹病毒胸苷激酶[HSV-tk]，它與更昔洛韋形成一種毒素)；水痘帶狀皰疹病毒胸苷激酶[VZV-tk]，它與6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷形成一種毒素；或一種細菌的胞嘧啶脫氨酶，它與5-氟胞嘧啶形成一種毒素)；或一種能夠提高抗腫瘤免疫性的免疫刺激蛋白(如FLT-3配體、GM-CSF、II-2、IL-7、IL-12和IL-13)。雖然本發明載體中的任何這種「腫瘤治療基因」的存在都能夠提高抗腫瘤作用(如通過比較一種編碼一種標記基因[LacZ]的載體和一種編碼一種細胞因子基因[IL12]的載體所示；見實施例1，下文)，但是在此公開時如果載體是一種天然凋亡的α(病毒載體，則這種基因的存在對於獲得治療有效性不是必需的。因此，本發明的基於辛德比斯病毒的載體根本不需要攜帶任何異源編碼序列。然而，在一個具體的實施方案中，本發明的用於治療的活性辛德比斯病毒載體編碼一種異源標記基因，如β-半乳糖苷酶、螢光素酶或潮黴素-EGFP。在另一個實施方案中，這些載體編碼一種異源抗腫瘤治療基因，例如一種細胞凋亡誘導基因或一種細胞因子編碼基因。
本發明第一次利用一種α病毒(特別是辛德比斯病毒)對腫瘤細胞(特別是與具有相同品系的正常細胞相比表達更高水平高親和性層粘連蛋白受體(HALRs)的腫瘤細胞)的天然親和性。術語「高親和性層粘連蛋白受體」即「HALR」具有本領域所知的普通含義，即可以作為辛德比斯病毒進入細胞的受體的Mr67,000層粘連蛋白受體(見Wang等，J.Virol.1992，664992-5001；Strauss等，Arch.Virol.Suppl.1994，9473-84)。基於這一發現，很清楚的是修飾任何載體使其靶向HALR都在本發明的範圍內。
因此，本發明提供治療患腫瘤的哺乳動物(如人類)的方法，在該患者中，與相同品系的正常細胞相比，表達高水平高親和性層粘連蛋白受體(HALR)。所述方法包括給予患腫瘤的哺乳動物治療腫瘤有效量的載體，其中所述載體優先親合HALR。該載體衍生自被有效改性而對HALR具有優先親合性並具有抗腫瘤活性的任何粒子或病毒。
儘管，不被任何具體的理論所限制，但是先前沒有一同考慮的三項觀察，可以說明本發明的基於辛德比斯載體治療的顯著的抗腫瘤效果的原因。第一，HALR可以作為辛德比斯病毒進入多數物種細胞的受體(Wang等，J.Virol.，1992，664992-5001；和Strauss等，Arch.Virol.Suppl.，1994，9473-484)。第二，廣泛認為HALR(Mr 67,000)的表達在多種癌症中有顯著地提高(Menard等，Breast Cancer Res.Treat，1998，52137-145)。實際上，在提高的Mr 67,000 HALR表達與多種癌症相關乳腺癌(Menard等，1998，supra；Paolo Viacava等，J.Pathol.，1997，18236-44；Martignone等，J.Natl.Cancer Inst.，1993，85398-402)、甲狀腺癌(Basolo等，Clin.CancerRes.，1996，21777-1780)、結腸癌(Sanjuan et al，J Pathol.，1996，179376-380)、前列腺癌(Menard S等，Breast Cancer Res.Treat，1998，52137-145)、胃癌(de Manzoni等，Jpn J Clin.Oncol.，1998，28534-537)、胰腺癌(Pelosi et aL，J Pathol.，1997，18362-69)、卵巢癌(Menard等，BreastCancer Res.Treat，1998，52137-145和Van den Brule等，Eur J Cancer，1996，32A1598-1602.)、黑素細胞癌(Taraboletti等，J Natl.Cancer Inst.，1993，85235-240)、肺癌(Menard等，Breast Cancer Res.Treat，1998，52137-145)、肝癌(Ozaki等，Gut，1998，43837-842)、子宮內膜癌和子宮癌(van den Brule等，Hum Pathol，1996，271185-1191)。實際上，超過4000例的通過免疫組織化學研究的不同器官中不同腫瘤的數據表明都與HALR在侵入、轉移和腫瘤生長中的作用相符(Menard等，Breast Cancer Res.Treat.，1998，52137-145)。天然的血液生成的辛德比斯載體能夠容易地在血液循環中移動，並是表達提高了的水平的HALR的生長和轉移腫瘤的發源地。最後，眾所周知辛德比斯病毒能使哺乳動物細胞更高程度的凋亡(Levine等，Nature 1993，739-742；Jan等J Virol.，1999；10296-10302；Jan等J Virol.，2000 6425-6432)。細胞死亡在感染幾小時後開始，事實上到48-96小時所有被感染細胞都死亡了(Sawai等，Mol Genet Metab.1999，6736-42；Griffin等，Ann.Rev.，1997，Microbiol.51565-592)。
雖然HALR參與以辛德比斯病毒介導的腫瘤細胞感染中的證據有些牽強，但是本發明的基於辛德比斯病毒的載體和其它基於α病毒的載體與其它腫瘤特異性細胞內決定簇(例如受體)相互作用卻是可能的。換句話說，儘管公開的載體優先靶向表達增強水平的HALRs的腫瘤細胞，但這可能反映出細胞的一種特徵，而不一定是載體感染細胞的機制。本發明包含任何這種涉及以α病毒介導的感染和腫瘤細胞細胞毒性的機制。
如上所述，如果需要的話，本發明的載體也可以攜帶一種或多種能夠用來提高細胞毒性的基因的有效負荷。因此，本發明進一步涉及利用載體來傳遞抗腫瘤治療基因。
重要的是，與腫瘤細胞相比，本發明的載體(特別是辛德比斯載體)，好像在體內不會感染正常細胞至相同的程度。這一點允許了在載體治療中的不同的效應，例如，被辛德比斯載體感染產生腫瘤細胞死亡會導致腫瘤消失，但對於被治療者的其它組織和器官沒有明顯的有害作用。這一現象可以通過此觀察解釋，即與正常細胞相對比腫瘤細胞中增高數量的HALR導致在腫瘤細胞上有高數量的暴露的即未佔據的受體(Liotta，L.A.CancerResearch，1986，461-7；Aznavoorian等，1992，Molecular Aspects ofTumor Cell Invasion and Metastasis，pp.1368-1383)。例如，已經證明與良性損傷相比，乳腺癌和結腸癌組織包括更高數量的暴露的(未佔據的)HALR受體(Liotta等，1985，Exp.Cell Res.，156117-26；Barsky等，Breast CancerRes.Treat.，1984，4181-188；Terranova等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1983，80444-448)。這些在正常細胞中未發現的、多餘的未佔據的HALR受體可以被用來與辛德比斯病毒結合感染和誘導細胞死亡。
公認具有未修飾的細胞特異性的複製缺陷型辛德比斯病毒載體具有內在的抗腫瘤活性，這允許利用辛德比斯載體的大量的其它的重要性質。因此，辛德比斯載體顯示基因傳遞的極高的有效性。它們是(+)-鏈RNA病毒，通過一個在受感染的細胞的細胞質中的擴增過程，它可以在感染後的幾個小時內表達每細胞105或更高活性的RNA種。RNA擴增的這一水平也允許傳遞的基因產品的非常高水平的表達，這將依次導致不是病毒的凋亡性質的延長的表達(Levine等，1993，Nature，361739-742；Jan等，JVirol.，1999，7310296-10302；Jan等，J Virol.，2000，746425-6432；Balachandran等，J.Virol.，2000，741513-1523)。基於在實驗室中處理α病毒和其它蟲媒病毒的推薦(The Subcommittee on Arbovirus LaboratorySafety of the American Committee on Arthropod-Borne Viruses.Am.J.Trop.Med.Hyg，1980，291359-1381)，辛德比斯被認為是相當安全的。大多數α病毒需要3級規範和防範和/或接種疫苗，然而辛德比斯只需要2級規範和防範，這歸因於那些感染不致病或導致自我限制性疾病的病毒。這裡舉例說明的從辛德比斯衍生得到的複製缺陷型辛德比斯載體更安全，這是因為它們感染和複製引起病毒血或疾病的能力實際上是不存在的。感染和複製引起病毒血的能力只能通過重組獲得，它能被縮小和監控。辛德比斯載體也避免了與染色體整合相關的潛在的併發症(Xiong等，Science，1989，2431188-1191)。近來的方法中使設計新的能夠非複製感染的辛德比斯載體更加容易並進一步提高了載體的安全性(Straus等，Microbiol.Rev.，1994，58491-562，1994)。因為辛德比斯病毒是一種產自血液的病毒(Turrell，1988，CRC Press，Inc.Boca Raton，FL)並且可以穿過血腦屏障((Altman-Hamamdzic等，Gene Ther.，1997，4；815-822)，因此基於這種病毒的載體是少數可獲得的能夠在血流中移動至機體的各種細胞的載體之一。在這方面，它們具有優於許多其它載體的重要優點並且例如可以被用來治療腦惡性腫瘤(例如成神經細胞瘤、成膠質細胞瘤、膠質神經瘤、成神經管細胞瘤、星形細胞瘤、聽覺神經瘤、少突神經膠質細胞瘤和腦脊膜瘤)。
除了「天然靶向」的基於α病毒的載體之外，本申請也公開了誘導腫瘤壞死的基於α病毒的載體，它攜帶更多特異性的腫瘤靶向分子，例如，包括一種腫瘤特異性受體結合序列的嵌合的包膜蛋白，與腫瘤特異性結合位點具有親和性的肽模擬物，識別腫瘤特異性抗體的免疫球蛋白分子/片段或可與抗病毒受體(例如抗-HALR)抗體一同施用的蛋白A的IgG結合域。在一個具體實施方案中，本發明提供基於辛德比斯的載體，由於經修飾的嵌合的E2包膜蛋白的存在此載體特異性地靶向腫瘤細胞，例如包括五種高同源58胺基酸長蛋白A的Fc IgG結合域中的一種或多種，即域E、D、A、B、C或域Z，一種設計的B域的類似物，包括兩個胺基酸替代Alal-＞Val和Gly29-＞Ala(見共同擁有的PCT公開號WO98/44132；Uhlen等，J.Biol.Chem.，1984，2591695；Moks等，Eur.J.Biochem.，1986，156637-43)。在另一個實施方案中，本發明提供了包括嵌合的包膜蛋白的基於辛德比斯病毒的載體，它被修飾成包括一個能夠結合其它種類的在靶腫瘤細胞表面表達高水平的決定簇的區域(例如，EGF受體在許多癌症細胞上超表達或αvβ3整聯蛋白在黑素瘤細胞上超表達，見Dmitriev等，J.Virol.，2000，6875-84；Bonnie等，Virol.，2000，269717)，或可選擇的，一個與在特異性癌細胞類型(例如，乳腺癌中的導管上皮細胞)上在一個相對較高的水平上表達的受體相互作用的區域。因此，在一個具體的實施方案，本發明提供包括通過α和β-hCG序列的插入修飾的嵌合的E2包膜蛋白的基於辛德比斯病毒的載體(被本發明的發明人在Sawai和Meruelo公開，1998，Biochem.Biophys.Res.Com.，248315-323)，並且具有選擇性地感染和向絨膜癌細胞以及其它具有LH/CG受體的腫瘤細胞(但是不向缺乏這些受體的細胞)傳遞一種報告基因的能力。
與許多其他包含嵌合的靶向分子的病毒載體相反，本發明的包含嵌合的E2蛋白的基於α病毒的載體對於插入到E2嵌合的蛋白中的異源靶向片段的特異性結構和/或尺寸是高度耐受的。這一性質似乎歸因於E2和E1蛋白在細胞靶向和融合中功能角色的分離。特別的，已經建立了更廣泛的試驗表明E2蛋白主要與病毒和細胞表面受體的結合有關，然而病毒的侵入則主要與低pH值誘導在E1中的融合域的暴露，然後是和內體的膜融合、胞吞入披網格小泡並轉移入核內體有關(Hoekstra等，Biosci Rep.，1989，9273-305；Kielian and Helnius，pp.91-119，In S.Schlesinger and M.J.Schlesinger(ed.)，The Togaviridae and Flaviviridae.Plenum PublishingCorp.，New York，1986；Kielian等，J.Virol.，1990，644614-24；Marsh，Biochem J.，1984，2181-10；Stegmann等，Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem.，1989，18187-211；Helenius et aL，J.Cell Biol.，1980，84404-20；Marsh等，Cell，1983，32931-940)。
本發明的嵌合的包膜蛋白載體的腫瘤特異性靶包括但不限於任何腫瘤細胞特異性蛋白、肽、低聚核苷酸、脂類、多糖和小分子量配體。
最重要的是，本發明並不限於天然靶向的α病毒衍生的抗腫瘤載體。如在這裡說明的那樣，使用本領域公知的方法，本發明的載體可以從病毒衍生得到(例如逆轉錄病毒、腺病毒、與腺相關的病毒、慢病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、杆狀病毒、乳頭瘤病毒等等)或與HALR不具有天然親和性的非病毒顆粒(例如脂質體、微球體、蛋白基體等)，通過修飾它們的靶向分子來包含辛德比斯病毒包膜蛋白的HALR結合域(優選的是E2的HALR結合域)，或識別HALR的免疫球蛋白片段，或可以與抗-HALR抗體一同施用的蛋白A的IgG結合域，或層粘連蛋白(或其中的HALR結合部分)。例如，在一個具體的實施方案中，發明提供一種抗腫瘤的基於腺病毒的載體，該載體中的編碼殼體蛋白纖維的末端結的序列被刪除以除去與CAR和其它腺病毒受體的天然結合性，而同時地插入負責與HALR結合的序列(見，例如Alemany等，Nat.Biotechnol.，2000，18723-727)。在另一個可選擇的實施方案中，腫瘤特異性基於腺病毒的載體同一種重組生產的雙特異性雜合銜接蛋白一同施用，此蛋白包括CAR蛋白氨基末端的細胞外域(見例如Dmitriev等，J.Virol.，2000，746875-84；Ebbinghaus等，J.Virol.，2001，75480-489)和一個辛德比斯病毒E2的HALR結合域，或一個識別HALR的免疫球蛋白片段，或可以和抗-HALR抗體一同施用的蛋白A的IgG結合域。在另一個實施方案中，本發明相似地提供了基於逆轉錄病毒的抗腫瘤載體，由於用HALR結合域替代了env蛋白(例如在基於鼠的白血病逆轉錄病毒(MLV)的載體的env的N-末端區域)的受體結合域此載體已經改變了靶向性質(見e.g.，Ohno and Meruelo，Biochem.Mol.Med.，1997，62123-127)。
總的來說，本發明有利地提供了一種治療患腫瘤哺乳動物的方法，其中腫瘤細胞與具有相同品系的正常細胞相比表達更高水平的HALR。不同水平的HALR導致靶介導的傳遞，就是說本發明載體與腫瘤細胞優先結合。「更高水平」的表達在這裡通常指被腫瘤細胞(與非腫瘤細胞相比)表達的水平和產生的這種優先的結合，例如至少高3倍的結合，優選至少高30倍結合，最優選的至少高300倍的結合。腫瘤細胞表達增高的水平可以用一個絕對尺度來評價，就是說，相對於任何其它所述的表達HALR的非腫瘤細胞，或以一種相對的尺度，就是說相對於與轉化的癌細胞有相同品系的未轉化的細胞的表達水平(例如，在黑素瘤情況下的黑素細胞，在肝癌情況下的肝細胞，在卵巢腺癌情況下的卵巢內皮細胞，在腎癌情況下的腎內皮細胞或腎上皮細胞)。
一般定義術語「載體」，「克隆載體」，「表達載體」和「輔助載體」指這樣的載體，即通過將一種DNA或RNA序列(例如一種外源基因)引入一種宿主細胞，以便促進表達(例如轉錄和/或翻譯)引入的序列。載體包括質粒、噬菌體、病毒等。在關於本發明的病毒載體描述中使用的，「表達載體」最通常是一般被用作指一種能夠感染宿主細胞的載體，然而術語「輔助載體」被用來指能夠介導「表達基因」適當包裝入病毒類顆粒的載體。
在此使用的術語「異源序列或基因」指一種核酸(RNA或DNA序列)，它沒有被發現與特定分子的核酸序列(例如一種α病毒基因組)有天然的聯繫。相似的，術語「異源蛋白或肽」指一種沒有天然存在於α病毒基因組中的編碼的蛋白、肽和/或核酸序列。在本發明的含義內，一種包含在基於α病毒的載體中的異源基因典型地是一種非病毒的基因。然而，此術語也包括α病毒序列，此序列已經被用來引起核酸一級序列的變化(例如核酸缺失、替換和/或增加)和/或在天然的(例如自然發生)病毒分子上的定位的人工處理改變了。本發明優選的異源基因包括但不限於報告基因(例如β-半乳糖苷酶和螢光素酶基因)、抗腫瘤基因(例如自殺基因、細胞凋亡誘導基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列或免疫原性肽編碼序列)和編碼腫瘤靶向分子的基因(例如編碼包含一種腫瘤特異性受體結合序列的嵌合的包膜蛋白的基因、編碼與腫瘤特異性結合位點具有親和性的肽模擬物的序列、編碼識別腫瘤特異性抗原的免疫球蛋白分子/片段的基因，或編碼可以和抗病毒的受體[如抗-HALR]抗體一起施用的蛋白A的IgG結合域的基因)。
在此使用的術語「感染的」，當用來描述一種基於α病毒的RNA分子時，是指一種自我複製並在宿主細胞中提供轉錄的RNA分子。術語「複製」，當與一種α病毒基因組RNA或一種重組的基於α病毒的載體RNA分子一同使用時，指利用(-)-鏈RNA作為模板產生(+)-鏈RNA全長等同物。
在此使用的術語「轉染」被理解為包括任何例如但不限於吸附、微量注射、電穿孔、脂轉染等將一種外源核酸分子引入一個宿主細胞的方法。術語「轉染的」或「轉化的」，當用來描述一種細胞時，指一種包括一個外源引入的核酸分子的細胞和/或一種遺傳組成已經通過引入一種外源核酸分子改變的細胞。
在此使用的術語「優先的結合」或「優先的親和性」指病毒載體與一種給定的細胞受體(例如HALR)相互作用的能力，由此導致表達這種受體的細胞的感染增加。接下來，本發明的載體與HALR受體具有優先的親和力，將會特別有效地感染表達增加數量的HALR的腫瘤細胞。
在此使用的術語「腫瘤」指一種包括生長失控的轉染細胞的一種惡性的組織。腫瘤包括白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、漿細胞瘤和其它類似瘤；和實體瘤。本發明可以治療的實體瘤的實例包括肉瘤和癌，例如但不限於纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀上皮細胞癌、基底細胞癌、表皮樣癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽導管癌、絨膜癌、精原細胞瘤、胚胎性癌、維爾姆斯氏瘤、子宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽覺神經瘤、少突神經膠質細胞瘤、腦脊膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、神經膠質瘤和成視網膜細胞瘤。如上所述，本發明的方法依賴於治療靶向的腫瘤細胞的HALR表達。
術語「腫瘤特異性細胞決定簇」或「腫瘤特異性靶」在這裡被用來廣義的定義一種腫瘤細胞表面的任何分子，此分子可以被本發明的載體用來選擇性的或優先的靶向此細胞。本發明載體對應的腫瘤特異性細胞決定簇包括但不限於任何腫瘤細胞表面蛋白、肽、低聚核苷酸、脂類、多糖和一種小分子配體。本發明優選的腫瘤特異性細胞決定簇是腫瘤特異性細胞膜蛋白例如ErbB受體、Melan A[MART1]、gap100、酪氨酸酶、TRP-1/gp75和TRP-2(在黑素瘤中)；MAGE-1和MAGE-3(在膀胱、頭部、頸部和非小細胞癌中)；HPV EG和E7蛋白(在子宮頸癌中)；粘蛋白[MUC-1](在乳腺癌、胰腺癌、結腸癌和前列腺癌中)；前列腺特異性抗原[PSA](在前列腺癌中)；胚胎癌抗原[CEA](在結腸癌、乳腺癌和胃腸道癌中)、LH/CG受體(在絨膜癌中)和這種共有的腫瘤特異性抗原如MAGE-2、MAGE-4、MAGE-6、MAGE-10、MAGE-12、BAGE-1、CAGE-1、2、8、CAGE-3到7、LAGE-1、NY-ESO-1/LAGE-2、NA-88、GnTV和TRP2-INT2等。與相同品系的正常細胞相比在特定的腫瘤細胞表面被在較高的水平表達的HALR和其它決定簇(e.g.，EGF受體或αvβ3整聯蛋白)也包括在術語「腫瘤特異性細胞決定簇」中。
在此使用的術語「哺乳動物」具有它普通的含義，並且特別地包括靈長類，更特別地包括人類。其它可以被治療的患腫瘤的哺乳動物包括但不限於犬、貓、齧齒動物(racine、鼠科動物、狼等)、馬、牛、綿羊、山羊和豬類。
術語「患者」在這裡使用時指一種脊椎動物，優選一種哺乳動物(例如齧齒動物如鼠)。特別的，此術語指人類。
術語「約」或「大約」通常指對於測定的數值和方法的類型而言在一個可接受的誤差範圍內。例如，它可指在一個給定值或範圍的20％內，更優選在10％內，最優選在5％內。可選擇的，尤其在生物體系中，術語「約」指約在一個對數值(即數量級)內，優選在給定值的上下100％內(within afactor of two of a given value)。
術語「治療」當用在這裡時指緩解或減輕患者的疾病的至少一種症狀。在本發明的含義內，術語「治療」也可以指延長潛伏期，即一種疾病在感染和臨床表現之間的時期。術語「保護」當用在這裡時指適當的預防或治療(或它們兩者)一患者的疾病的發展或繼續。在本發明的含義內，疾病是癌症。
短語「藥學上可接受的」，當述及本發明的組合物使用時指這種組合物的分子實體和其它組份，當施用給人時它們是生理上可耐受且通常不產生不適當的反應。優選在這裡使用時，術語「藥學上可接受的」指聯邦或國家政府的管理機構批准的，或列在美國藥典中或其它公認的藥典中的用於哺乳動物(更特別是人類)的。
術語「治療有效的」應用於劑量或量時指一種化合物或藥物組合物的量，當施用於需要此化合物或藥物組合物的哺乳動物時，此量足夠產生所需的活性。在當關於本發明的病毒載體描述中使用的術語「治療有效量/劑量」指當施用於哺乳動物時，載體或包括載體的藥物組合物足夠產生有效的抗腫瘤反應的量/劑量。
術語「抗體」使用其最廣的含義，並且具體不僅涵蓋單獨的天然抗體也涵蓋單克隆抗體(包括激動劑和拮抗劑抗體)和具有多表位特異性的抗體組合物和抗體片段(例如Fab、F(ab′)2、scFv和Fv)，只要它們具有所需的生物活性即可。
術語「先天免疫」或「天然免疫」指先天的免疫應答，它不被與抗原的在先接觸所影響。先天的免疫的保護機制之二包括，天然殺傷(NK)細胞，它破壞微生物和特定的腫瘤細胞並攻擊特定的病毒感染細胞，和炎性反應，它動用白細胞(如巨噬細胞和樹枝狀的細胞)來吞噬侵入者。
載體本發明最優選的載體是基於α病毒的載體，特別是複製缺陷型天然靶向的基於辛德比斯病毒的載體，本發明在體外、體內和離體的其它優選的載體是病毒載體，例如逆轉錄病毒(包括慢病毒)、皰疹病毒、腺病毒、與腺相關的病毒、痘苗病毒、乳頭狀瘤病毒、埃-巴二氏病毒(EBV)、杆狀病毒和其它具有或被修飾成有所需的細胞向性(就是說優先地與高親和性層粘連蛋白受體(HALR)結合)的重組體病毒。
在現有技術中已知構建和利用病毒載體的方法(見，例如Miller andRosman，Bio Techniques 1992，7980-990)。根據本發明，在本領域技術範圍內可以應用傳統的分子生物學，微生物學和重組DNA技術。這些技術是公知的並且在文獻中已經說明的很充分。見如Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗室手冊，第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(在此稱″Sambrook等，1989.″)；DNA克隆一種實踐途徑，卷I和II(D.N.Glover ed.1985)；低聚核苷酸合成(M.J.Gait ed.1984)；核酸雜交[B.D.Hames S.J.Higginseds。(1985)]；轉錄和翻譯[B.D.Hames S.J.Higgins，eds.(1984)]；動物細胞培養[R.I.Freshney，ed.(1986)]；固定細胞和酶[IRL Press，(1986)]；B.Perbal，分子克隆實驗指南(1984)；F.M.Ausubel等(eds.)，分子生物學流行草案，John Wiley Sons，Inc.(1994)。
各種公司生產商用病毒載體，包括但不限於Avigen公司(Alameda，CA；AAV載體)，細胞Genesys(Foster City，CA；逆轉錄病毒、腺病毒、AAV載體和慢病毒載體)，Clontech(逆轉錄病毒和杆狀病毒載體)，Genovo公司.(Sharon Hill，PA；腺病毒和AAV載體)，Genvec(腺病毒載體)，IntroGene(萊頓，荷蘭；腺病毒載體)，分子醫學(逆轉錄病毒、腺病毒、AAV和皰疹病毒載體)，Norgen(腺病毒載體)，牛津生物醫學(牛津，英國；慢病毒載體)和轉基因(斯特拉斯堡，法國；腺病毒、牛痘、逆轉錄病毒和慢病毒載體)。
優選地，本發明的病毒載體是複製缺陷型，就是說，它們不能在靶細胞中自主地複製。優選地，複製缺陷型病毒是一種極小的病毒，也就是它只保留了它的基因組的序列，此序列對於靶細胞識別和病毒基因組的殼體化是必需的。複製缺陷型病毒在引入一個細胞以後是不感染的。複製缺陷型病毒載體的使用允許在一個特定的，固定的區域施用給細胞，而不必擔心載體是否會感染其它細胞。因此，一個具體的組織能被特定的靶向。除了複製缺陷型α病毒載體外，特定載體的實例包括但不限於缺陷型皰疹病毒載體(見例如Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.1991，2320-330；專利公布RD 371005 A；PCT公開號WO 94/21807和WO 92/05263)，缺陷型腺病毒載體(見例如Stratford-Perricaudet等，J.Clin.Invest.1992，90626-630；La Salle等，Science 1993，259988-990；PCT公開號WO94/26914，WO 95/02697，WO 94/28938，WO 94/28152，WO 94/12649，WO95/02697和WO 96/22378)和缺陷型與腺有關的病毒載體(Samulski等，J.Virol.1987，613096-3l01；Samulski等，J.Virol.1989，633822-3828；Lebkowski等，Mol.Cell.Biol.1988，83988-3996；PCT公開號WO91/18088和WO 93/09239；美國專利號4,797,368和5,139,941；歐洲專利公開號EP 488 528)。
這一點在上面已說明，可以實施各種策略來將載體靶向到HALR，包括但不限於通過將一個HALR結合序列(例如一種辛德比斯病毒E2蛋白)引入病毒來做病毒載體的假型；通過修飾病毒的殼體或包膜蛋白來包括一個HALR結合序列；通過利用一個可以與載體和HALR結合的雙特異的試劑；或利用這些途徑的結合。
基於腺病毒的載體。腺病毒是真核DNA病毒，它可以被修飾成能有效地將本發明的一種核酸傳遞給多種類型的細胞。存在各種血清型的腺病毒。在這些血清型中，在本發明的範圍內優先選擇利用2型或5型人類腺病毒(Ad 2或Ad 5)或動物來源的腺病毒(見PCT公開號W094/26914)。這些可以用在本發明範圍內的動物來源腺病毒包括犬的、牛的、鼠的(例如Mavl[Beard等，Virology，1990，7581])綿羊的、豬的、鳥的和猿源(例如SAV)的腺病毒。優選動物來源的腺病毒是一種犬的腺病毒，更優選的是一種CAV2腺病毒(例如曼哈頓或A26/61株[ATCC保藏號VR-800])。各種的複製缺陷型腺病毒和最小的腺病毒載體已有描述(PCT公開號WO94/26914、WO95/02697，WO94/28938，WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697、WO96/22378)。根據本發明的複製缺陷型重組腺病毒可以通過任何本領域技術人員已知的技術方法來製備(Levrero等，Gene，1991，101195；EP公開號185 573；Graham，EMBO J.，1984，32917；Graham等，J.Gen.Virol.，1977，3659)。利用標準的分子生物學技術回收和純化重組的腺病毒，這對於本領域普通技術人員來說是眾所周知的。
基於與腺有關的病毒的載體。與腺有關的病毒(AAV)是具有相對較小的尺寸的DNA病毒，它能夠通過一個穩定且位點特異性的方式整合入它們感染的細胞的基因組。它們能夠感染廣譜的細胞而對細胞生長、形態學和分化不產生任何誘導作用，並且它們似乎與人類病理學無關。AAV基因組已經被克隆，排序和表徵。用來在體外和體內轉移基因的由AAV衍生的載體的利用已有描述(見PCT公開號WO 91/18088和WO 93/09239；美國專利號4,797,368和5,139,941；EP公布號488 528)。本發明的複製缺陷型重組AAV可以通過將一個包含目標核酸序列(此序列側面與兩個AAV反向末端重複(ITR)區域連接)的質粒和一個攜帶AAV殼體化基因(rep和cap基因)的質粒共轉染入一個被一種人類輔助病毒(如一種腺病毒)感染的細胞系來製備。然後將生產的AAV重組體用標準技術純化。
逆轉錄病毒載體。在另一實施方案中，本發明提供逆轉錄病毒載體，例如，在Mann等，Cell 1983，33153；美國專利號4,650,764，4,980,289，5,124,263和5,399,346；Markowitz等，J.Virol.1988，621120；EP公布號453 242和178 220；Bernstein等Genet.Eng.1985，7235；McCormick，BioTechnology 1985，3689；和Kuo等，1993，Blood，82845中描述的。逆轉錄病毒是整合病毒，它感染分化的細胞。逆轉錄病毒基因組包括兩個LTR，一個殼體化的序列和三個編碼區域(gag、pol和env)。複製缺陷型非感染的逆轉錄病毒載體被操縱以破壞病毒包裝信號，但是保留需要用來包裝共引入病毒的結構基因，此病毒被設計包含異源基因和包裝信號。因此，在重組的複製缺陷型逆轉錄病毒載體中，gag、pol和env基因通常被全部或部分的刪除並且被一個目標異源核酸序列取代。這些載體可以從不同類型的逆轉錄病毒來構建，例如HIV(人免疫缺陷病毒)、MoMuLV(鼠莫洛尼白血病病毒)、MSV(鼠莫洛尼肉瘤病毒)、HaSV(哈維肉瘤病毒)、SNV(脾壞死病毒)、RSV(魯斯氏肉瘤病毒)和弗羅德病毒。適合的包裝細胞系已經在先前的技術中描述了，特別是，細胞系PA 317(美國專利號4,861,719)；PsiCRIP細胞系(PCT公開號WO 90/02806)和GP+envAm-12細胞系(PCT公開號WO 89/07150)。另外，重組逆轉錄病毒載體可以包含在用來抑制轉錄活性的LTR的修飾和可能包含部分gag基因的廣泛的殼體化序列(Bender等，J.Virol.1987，611639)。重組的逆轉錄病毒載體用本領域普通技術人員已知的標準方法來純化。
逆轉錄病毒載體也能被DNA病毒引入，它允許逆轉錄病毒複製一個周期和放大轉染效率(見PCT公開號WO 95/22617，WO 95/26411，WO96/39036，WO 97/19182)。
在本發明的一個特別的實施方案中，慢病毒載體可以在許多組織類型中被用作直接傳遞和持續表達一種轉基因的藥物，組織類型包括腦、視網膜、肌肉、肝和血液。逆轉錄病毒載體的亞型可以有效地轉導這些組織中的分化和不分化的細胞並且維持目標基因長期表達(綜述可參見Naldini，Curr.Opin.Biotechnol.1998，9457-63；Zufferey等，J.Virol.1998，729873-80)。慢病毒包裝細胞系在本領域中是可獲得的並普遍已知的。
非病毒載體。在另一實施方案中，本發明提供能被引入體內的非病毒載體，只要這些載體包括特異性地結合HALR的靶向的肽、蛋白、抗體等即可。例如，合成的陽離子脂類(能被用來製備在體內轉染一個攜帶一種抗腫瘤治療因子的載體的脂質體)的組合物在Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1987，847413-7417；Felgner and Ringold，Science 1989，337387-388；Mackey，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988，858027-8031和Ulmer等，Science 1993，2591745-1748中已有描述。用來傳遞核酸的有用的脂類化合物和組合物已有描述，例如在PCT公開號WO 95/18863和WO96/17823中和在美國專利號5,459,127中。靶向肽(例如，層粘連蛋白或HALR結合層粘連蛋白肽)和蛋白(例如抗-HALR抗體)或非肽分子可以和脂質體共價地(例如，將肽與磷脂或膽固醇接合，也見Mackey等，supra)或非共價地(例如經由一個膜結合域或部分插入到雙層膜中)偶合。
α病毒載體，特別是辛德比斯病毒載體α病毒在本領域是眾所周知的，其包括但不限於馬腦炎病毒、塞姆利基森林病毒和相關的種屬；辛德比斯病毒和重組體或未分組的種屬(見Strauss and Strauss，Microbiol.Rev.1994，58491-562，Table 1，p.493)。
優選本發明的α病毒被作為一個複製缺陷型病毒來製備。當在這裡使用時，術語「複製缺陷型病毒」具有它通常的含義，就是說由於它的基因組被修飾，所以此病毒是繁殖機能不全的。因此，一旦這種重組的病毒感染一個細胞，其結果只能是表達任何包括在它的基因組中的病毒和異源蛋白，並且在辛德比斯和其它α病毒的情況下，誘導細胞凋亡。在一個具體的實施方案下，本發明的複製缺陷型基於α病毒的載體包括編碼非結構蛋白的基因並且對於RNA轉錄和基因表達是自給自足的。然而，這些載體缺乏編碼結構蛋白的基因，因此一種輔助基因組是必需的以使它們被包裝入傳染的顆粒。除了提供治療學上安全的載體，結構蛋白的移去增加了這些載體併入超過6kb的異源序列的能力。在另一實施方案中，本發明的繁殖機能不全的α病毒載體被間接地得到，例如通過移除包裝信號，從而使結構蛋白被包裝入從包裝細胞系釋放的病毒體。
因為辛德比斯病毒不會引起重大的健康危害，所以它也可以以繁殖機能不全的形式使用。換句話說，不像大部分病毒載體，使辛德比斯病毒載體有缺陷或複製機能不全不是必需的，雖然對於嚴格的安全原因來說這是優選的。因此，本發明既包括複製缺陷型又包括有繁殖能力的辛德比斯病毒載體。
如上所述，α病毒，特別是辛德比斯病毒載體，天然地可以誘導細胞凋亡，也叫作「程序性細胞死亡」。細胞凋亡是一種內在的細胞過程，它導致核的破壞、DNA消化和最終的細胞壞死和消融。本發明的有促使細胞凋亡潛力的載體可以利用在組織培養物中的細胞來試驗(例如，任何在實施例1中討論的宿主細胞，下文)。
各種用來製備本發明α病毒載體的方法都是本領域已知的。在基於辛德比斯病毒載體的情況下，一般而言，載體製備包括一種具有包含辛德比斯非結構基因的蓋帽mRNA的包裝細胞系以及，可選擇的，一種在辛德比斯亞基因組啟動子控制下的異源基因和一個表達辛德比斯結構基因的輔助質粒載體的共轉染(見圖1)。蓋帽mRNA可以通過體外轉錄來生產。
各種細胞系可以被用作包裝細胞。這些包括哺乳動物的細胞系例如CHO(中國倉鼠卵巢)、BHK(嬰兒倉鼠腎臟)、HuH7(人類肝細胞癌)等。這些細胞系的一個缺點是辛德比斯病毒載體的生產誘導細胞凋亡，結果是在共轉染後的幾小時或幾天內包裝細胞破壞。因此，新的包裝細胞必須在一個正在進行的(ongoing)基礎上製備。另外，由哺乳動物細胞產生的基於辛德比斯病毒的載體似乎能有效地與帶陰電荷的葡糖胺聚糖硫酸乙醯肝素相互作用導致增加的病毒清除和下降的感染性(見，如Byrnes and Griffin，2000，J.Virol.，74644-651)。
為了避免這些問題，目前的發明人已經發展了一種從昆蟲細胞衍生的辛德比斯病毒包裝細胞系，優選C6/36蚊細胞(共同擁有懸而未決的PCT申請號PCT/US02/，[代理人內部參考號5986/2H995-WO0]，與此申請在同一日期提交，題目為「用作α病毒載體連續生產的包裝細胞系」，基於美國臨時專利申請序列號60/279,048，2001年3月27日提交，它們都特別在這裡全文併入參考)。為了產生昆蟲包裝細胞系，本發明發明人已經穩定地將C6/36細胞用兩個DNA載體進行了轉化，一個編碼用來複製病毒RNA的非結構基因nsp 1-4，另一個(輔助)編碼結構蛋白(殼體蛋白C、E1、E2、E3和6K)和包裝信號。本發明的發明人出乎意料地發現，這些昆蟲衍生的包裝細胞基本上能抵抗辛德比斯載體的誘導細胞凋亡的性質並且能被設計來建立長期的產生載體的培養物，這些培養物產生始終如一的高病毒滴度。除了C6/36蚊細胞外，用在本發明中的其它昆蟲細胞系的非限制實例包括u4.4細胞、HiRh FiveTM細胞、施奈德氏果蠅細胞系2、Spodoptera frugiperda SF9細胞和C7-10細胞。
在各種情況下，通過本領域已知的任何技術，可以從包裝細胞培養物上清液中收穫包含複製缺陷型病毒基因組的α病毒、特別是辛德比斯病毒體，將其濃縮並純化。這些技術包括但不限於離心和超速離心；在離子交換、分子排阻、疏水相互作用和親水相互作用或其它類型柱上的色譜法；過濾和超濾；親合純化或本領域已知的各種其它技術。本發明的分離的病毒體可以保存在溶液中或優選凍幹並以粉末形式保存。
抗腫瘤治療基因本發明的治療載體可以攜帶一種抗腫瘤治療基因，這一點在這裡公開。特別是，因為本發明的α病毒載體，尤其是辛德比斯病毒載體能攜帶一種治療基因有效負載，所以它們可以被修飾來包含任何如下所述的基因療法。
在這裡使用的術語「抗腫瘤基因治療」指靶向一種腫瘤的基因治療，這會引起腫瘤壞死、凋亡、生長調節，也就是腫瘤衰退或抑制。抗腫瘤基因治療的實例包括但是決不限於一種自殺基因的引入、一種凋亡基因的引入、一種腫瘤抑制基因的引入和一種致癌基因拮抗基因的引入。優選的抗腫瘤基因由免疫刺激基因補充來增強免疫效應細胞(包括動員樹狀細胞)對腫瘤的募集和活化。
因此，「基因治療」特別地指傳遞一種編碼效應分子的基因進入細胞，在此情況下，進入腫瘤細胞。
自殺基因療法。編碼能夠給予腫瘤細胞對化學治療物質敏感性的酶的基因(自殺基因)的引入已經被證明是一種有效地抗腫瘤基因療法。本發明提供了一種治療癌症的方法，部分地通過引入一個基因載體，編碼一個能夠酶促地轉化一種前藥(一種無毒的化合物)成一種有毒的化合物的蛋白。在本發明的方法中，治療用的核酸序列是一種編碼一個產物的核酸，其中產物在它自己或其它藥物的存在下引起細胞死亡。這種治療用的核酸的一個有代表性的例子是一種編碼單純皰疹病毒(HSV-tk)的胸腺嘧啶核苷激酶的核酸。另外的例子是水痘帶狀皰疹病毒(UZV-tk)的胸腺嘧啶核苷激酶和細菌的基因胞嘧啶脫氨酶。
本發明方法中有用的前藥是任何可以被轉化為一種有毒的產品的物質，也就是對腫瘤細胞有毒的那些。這種前藥的有代表性的例子是更昔洛韋，它在體內被HSV-tk轉化成一種有毒的化合物(Chen等，Cancer Res.1996，563758-3762)。其它有代表性的前藥的實例包括無環鳥苷，FIAU[1-(2-脫氧-2-氟-p-D-呋喃阿拉伯糖基)-5-碘代尿嘧啶]，6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷(被VZV-tk轉化)和5-氟胞嘧啶(通過胞嘧啶脫氨酶轉化)。
前藥，可以被具有本領域普通技術的醫生容易地施用給患者。利用本領域已知的方法，這些醫生也將能夠決定施用前藥的最合適的劑量和途徑。例如，更昔洛韋優選地以約1-20mg/天/kg體重的劑量施用；阿昔洛韋以約1-100mg/天/kg體重的劑量施用，FIAU以約1-50mg/天/kg體重的劑量施用。
細胞凋亡誘導、抗致癌基因和腫瘤抑制基因療法。在許多癌症類型中腫瘤的發生和惡化都與致癌基因(例如ras、myc)和腫瘤抑制基因(Rb、p53)的突變有關。許多途徑正在追蹤，利用包括單克隆單鏈抗體、反義低聚核苷酸、核糖酶、類似物和免疫原性肽的抗致癌基因和/或腫瘤抑制效應分子(Chen，Mol.Med.Today 1997，3160-167；Spitz，等，Anticancer Res.1996，163415-3422；Indolfi等，Nat.Med.1996，2634-635；Kijima等，Pharmacol.Ther.1995，68247-267；PCT公開號WO 94/24297和WO97/16547；法國專利申請號FR 08729)。這些分子特異性地抑制腫瘤生長和增加腫瘤細胞中細胞凋亡率。它們的作用機制需要抑制或抗致癌基因分子的持續存在以持續的應答，然而，它們還沒有顯示出會誘導腫瘤特異性免疫，它具有必須用來保護抵抗疾病的復發的記憶潛力。這些腫瘤生長特異性策略與免疫刺激療法的結合將會在細胞衰退和誘導保護性免疫應答上產生協同作用。
免疫刺激療法。本發明也提供免疫細胞刺激，例如一種樹狀細胞(DC)活動法，來產生一種強抗腫瘤免疫應答。術語「樹狀細胞(DC)動員劑」指一種活化DC機能活動的分子。一種眾所周知的DC動員劑是flt-3配體(flt-3L)。基於抗腫瘤的免疫治療功效能通過多種細胞因子的加入被增強。細胞因子例如IL-12放大抗原呈遞和DC的免疫調製的能力並且抑制腫瘤血管發生，這一點能連續地誘導腫瘤的免疫敏感性。相反的，細胞因子例如IL-7在體內會誘導更強的T細胞應答和有效地逆轉T細胞缺陷。當在這裡公開時，其它細胞因子，例如粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-2、IL-3、IL-4、TNF-α和c-kit配體也能與DC動員劑結合使用。
這些細胞因子可以以可溶的或微粒包裹的蛋白形式施用或通過將基因引入病毒或非病毒載體(包括本發明的載體)來施用。這種細胞因子的全身傳遞和局部抗腫瘤基因療法一起使用會增加這些細胞因子在腫瘤中的分布，這一點在T細胞缺陷的長期逆轉和有效的腫瘤應答中可能需要。這些細胞因子，取決於施用的方式，會在用作有效的抗腫瘤免疫應答的免疫炎性反應中起關鍵的作用。
腫瘤生長抑制劑。在這裡使用的術語「腫瘤生長抑制劑」指一種抑制腫瘤生長的蛋白，例如但不限於幹擾素(IFN)-γ、腫瘤壞死因子(TNF)-α、TNF-β和相似的細胞因子。可選擇的，一種腫瘤生長抑制劑可以是一種腫瘤生長因子的拮抗劑。這種拮抗劑包括但不限於腫瘤生長因子(TGF)-β和IL-10拮抗劑。本發明包括全身地將腫瘤生長抑制蛋白給藥或可選擇地通過基因治療。
抗血管發生因子。腫瘤血管發生是腫瘤生長的一個不可缺少的部分，並且多種的靶向來抑制血管發生的治療劑作為癌症治療劑正在開發中。抗血管發生治療主要是逆轉了腫瘤的生長/凋亡平衡和誘導休眠。一旦這些治療劑給藥被停止，血管發生能夠重新開始，腫瘤生長繼續進行。抗血管發生是一種強大的機制來特異地減少腫瘤的體積而不會在病人身上產生不利的副作用。由抗血管發生誘發的休眠治療通過減少腫瘤、改變腫瘤微環境、消除免疫抑制作用和使腫瘤對免疫調節的清除更敏感而為其它治療計劃方案的成功鋪平了道路。
「抗血管發生因子」是一種抑制血管發生的分子，特別地阻止內皮細胞遷移。這些因子包括但不限於抑制性的血管發生蛋白的片段(例如尿激酶的氨基末端片段[PCT公開號WO 93/15199])；制管張素(O′Reilly等，Cell1994，79315-328)；內皮生長抑素；血管發生因子受體的可溶形式，例如尿激酶受體或FGF/VEGF受體(Wilhem等，FEBS Letters]994，337131-134)；阻塞內皮細胞生長因子受體的分子(O′Reilly等Cell 1997，88277-285；O′Reilly，Nat.Med.1996，2689-692)和Tie-1或Tie-2抑制劑。本發明包含全身地來施用抗血管發生因子或可選擇的通過基因治療。優選用在本發明中的抗血管發生因子是一種蛋白或多肽，其被包含在本發明載體中的一個基因編碼。
載體治療如上所述，本發明的基於α病毒的載體，特別是基於辛德比斯病毒的載體可以被用來治療各種癌症。本發明的基於非α病毒的載體也可以治療各種其腫瘤細胞表達提高的HALR水平的癌症。
可以將如上所述得到的分離並優選純化的病毒載體能配製進一個藥物組合物中來施用給病人。在此使用的「藥物組合物」包活性藥物(即病毒載體)和一種藥學上可接受的媒介物(carrier)、賦形劑或稀釋劑。短語「藥學上可接受的」指分子和組合物，當施用給人類時，該分子和組合物是生理上可耐受的並且一般不會產生過敏或相似的不適當的反應(例如胃腸不適眩暈等)。優選在此使用的術語「藥學上可接受的」指由聯邦或政府部門管理機構批准的或列在美國藥典或其它公認的藥典的那些可用於動物、更優選用於人身上的那些。術語「媒介物」指一種稀釋劑、輔料、賦形劑或用於化合物給藥的賦形劑。這些藥物媒介物可以是無菌的液體，例如水和油，包括石油、動物油、植物油或合成油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等。優選採用水或鹽水溶液以及葡萄糖和甘油溶液作媒介物，特別對於注射用溶液。適合的藥物媒介物在E.W.Martin著的「Remington'sPharmaceutical Sciences」中有描述。
用於人類治療時，病毒載體應依照食品藥品監督管理局(FDA)制定的生產規範(GMP)標準來製備。質量保證(QA)和質量控制(QC)標準將包括測試病毒的複製能力(如果病毒載體是複製缺陷型)、活性(病毒顆粒的集落形成單位[CFU]，通過引起細胞凋亡或致細胞病變作用(CPE)來測試，或通過一種標記基因例如β-半乳糖苷酶的表達來測試)，毒性和其它標準指標。
為了治療腫瘤細胞，藥物組合物可以以任何能夠允許載體向腫瘤細胞自動導引的途徑給藥。優選以胃腸外途徑給藥，包括，但不限於靜脈內、小動脈內、肌肉內、皮內、皮下、腹膜內和心室內給藥。當在這裡公開時，病毒載體也可以通過鼻內的或口服途徑給予患腫瘤的動物(見Hardy，InThe ArbivirusesEpidemiology and Ecology，Ch.4，pp.87-126)。然而，重要的是，與基因治療中的其它病毒載體相比，施用本發明的HALR靶向的α病毒和非α病毒載體不必定位在腫瘤上。實際上，本發明優點中的一個即是載體對於癌細胞(甚至是對不能用標準技術定位或切除的微轉移瘤)的高特異性和親和性。
在本發明的療法中，一種治療學上有效量的載體被施予給一個病人。在此使用的術語「治療有效量」指足夠減少至少約15％、優選至少50％、更優選至少90％、最優選預防(宿主在臨床上顯著缺乏活性、功能和應答症狀)的量。或者，治療有效量為足以引起宿主臨床有意義的狀態的改善的量。具體而言，治療有效量為引起一種或多種下述情況的量腫瘤細胞凋亡；腫瘤細胞壞死；腫瘤轉移的消除或預防；腫瘤生長速率的降低；腫瘤大小降低或腫瘤收縮；皮膚腫瘤疤的形成；腫瘤的消除；癌症的緩解；癌症復發時間的延長及病人存活期的延長。載體治療的頻率和劑量可以由普通臨床醫生利用標準劑量-反應技術來決定，但是通常在每天、每周、每兩周或每月至少兩次、並優選至少三次給藥，每劑量106到1012病毒體。
結合療法疫苗為了增加腫瘤抗原特異性免疫應答，可以在系統中引入定義是與腫瘤相關的抗原(TAA)來特異性地增加抗原的水平。這些TAA能作為蛋白，肽或作為被本發明病毒載體編碼的異源基因被引入。用這些抗原誘導的免疫會在DC動員和抗腫瘤基因治療方案期間或其後出現。實質上，這一策略增強了特異性抗原的有效的免疫應答以及總的免疫應答。特異性免疫會導致免疫增強細胞因子的表達，它會促進對由腫瘤壞死因子釋放的抗原的應答。這種免疫可以與免疫激活細胞因子(蛋白或基因)結合來進一步提高效果。
除了定義的基於抗原的疫苗，許多疫苗策略正在實驗室和臨床開發。一個在動物模型上充分研究的策略是利用細胞因子基因(例如，IL-2、GM-CSF、IL-12、IL-4)和一些關鍵的輔助刺激分子基因(例如B7.1、B7.2)來改變同體的或異體的腫瘤細胞。這些基因改變了的腫瘤疫苗證明了利用免疫的機制來破壞外周的耐受性和無反應性的概念(Clary等CancerGene Ther.1997，497-104；Gilboa，Semin.Oncol.1996，23101-107)。其它相似的途徑包括利用腫瘤溶胞產物，蛋白或RNA脈衝的DC和腫瘤細胞與DC融合來誘導一種有效的腫瘤免疫應答。所有這些途徑由一個普遍的主題，就是將抗原的分子傳遞到DC來誘導這些抗原對T細胞的有效的處理和呈遞。由於這些主題基於DC的提供，因此，預期DC動員會增加這些途徑中觀察到的效果。
化學治療劑、輻射療法和外科手術(腫瘤切除術)。雖然本發明的方法在抑制腫瘤生長和轉移上是有效的，但是本發明的載體和方法最好與其它治療形式一起使用，包括但不限於外科手術、輻射療法、化學治療和其它基因治療。例如，本發明載體可以與一氧化氮抑制劑一同施用，這些抑制劑具有血管收縮的活性，因此可以減少血液流向腫瘤。在另一個實施方案中，本發明的載體可以和化學治療劑一起施用，例如但不限於紅豆杉醇、泰索帝和其它紫杉類(例如在美國專利號4,857,653；4,814,470；4,924,011；5,290,957；5,292,921；5,438,072；5,587,493；歐洲專利號0 253 738；和PCT公開號WO 91/17976，WO 93/00928，WO 93/00929和WO 96/01815中公開的)或其它化學治療劑，例如順鉑(和其它鉑嵌入化合物)、依託泊苷和依託泊苷磷酸酯、博萊黴素、絲裂黴素C、CCNU、阿黴素、柔紅黴素、伊達比星、異環磷醯胺等。
實施例下面的實施例說明了本發明，但是不限制本發明的範圍。
實施例1辛德比斯載體介導有效的抗腫瘤活性材料和方法細胞系。嬰兒倉鼠腎臟(BHK-21，ATCC保藏號CCL-10)和卵巢癌(ES-2，ATCC保藏號CRL-1978)細胞從美國典型培養物保藏中心(ATCC，馬納薩斯，VA)處得到，並保存在補充有5％胎牛血清(FBS，GeminiBioproducts，Inc.，Calabasas，CA)的最低必需α-改良培養基(αMEM，JRH Bioscience，Lenexa，KS)中。一種人肝細胞癌細胞系HuH7從H.Yamamoto博士(Hyogo醫學院，日本)處得到，並保存在補充有10％FBS的Dulbecco氏改良Eagle氏培養基(DMEM，JRH生物科學，Lenexa，KS)中。HT29人類結直腸腺癌細胞(ATCC登記號HTB-38)從ATCC獲得，並保存在補充有10％FBS的McCoy′s 5A培養基(Iwakata Gracemodification，Mediatech，Inc，Herndon，VA)中。CFPAC-1胰癌細胞(ATCC保藏號CRL-1918)、SKOV-3卵巢腺癌細胞(ATCC保藏號HTB-77)和A431表皮樣癌細胞(ATCC登記號CRL-2592)從ATCC得到並保存在補充有10％FBS的DMEM/低改良培養基中。A498腎癌細胞(ATCC登記號HTB-44)、HT1197膀胱癌細胞(ATCC登記號CRL-1473)和LS174T結腸癌細胞(ATCC保藏號CL-188)從ATCC得到並保存在補充有10％FBS含Earle′s鹽和L-穀氨酸鹽的最低必需培養基Eagle(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)中。所有上述基礎培養基都補充有100μg/mL的青黴素-鏈黴素(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)和0.5μg/ml兩性黴素(Mediatech，Inc.，Herndon，VA)。
載體。圖1是衍生的辛德比斯病毒的表達和輔助載體的圖示(也見Bredenbeek等，J.Virol.，1993，676439-6446，Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)。一種基於辛德比斯病毒表達載體的SinRep/LacZ編碼病毒包裝信號、複製DNA轉錄物所必需的非結構蛋白nsp1-4、用作亞基因組轉錄的病毒啟動子和LaeZ報告基因。一種輔助質粒DH-BB編碼辛德比斯結構基因，即殼體(C)、E3、E2、6K和E1，它們是病毒包裝所必需的。沒有顯示在圖1中的還有在本實施例中使用的兩個其它基於辛德比斯病毒的表達載體，SinRep/Luc和SinRep/IL12。為了構建SinRep/IL12載體，一種包括螢火蟲螢光素酶基因(Luc)的DNA片段從pGL3質粒(Promega Co.，麥迪遜，WI)Nhe I位點和Xba I位點被切離出來並被亞克隆入SinRep載體(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)的Xba I位點。為了構建SinRep/IL12載體，一種包含兩個亞基因組啟動子(SinRep/2PSG)的辛德比斯載體首先是通過將第二亞基因組啟動子DNA插入到原始亞基因組啟動子的多克隆位點(MCS)下遊來構建。脫氧寡核苷酸包括PSG序列5′-CGCGTAAAGCATCTCTACGGTGGTCCTAATAGTGCATG-3′(SEQ ID NO1)在連接到用MluI和Sph I消化的SinRep質粒之前被退火到它的互補序列5′-CACTATTAGGACCACCGTCGAGATGCTTTA-3′(SEQ ID NO2)。鼠IL12α-亞單位基因(mP35，ATCC保藏號87596)和IL12β-亞單位基因(mP40，ATCC登記號87595)分別被亞克隆入SinRep/2PSG的Mlu I位點和Stu I位點(Sph I位點下遊)，最終的構建物被命名為SinRep/IL12。
用於辛德比斯病毒生產的體外轉錄和轉染。用於體外轉錄的質粒用QIAGEN質粒試劑盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)來製備。將質粒DH-BB、SinRep/LacZ和SinRep/IL12利用XhoI限制性內切酶來線性化。因為Luc基因包括一個內在的Xho I位點，所以將質粒SinRep/Luc利用NotI限制性內切酶來線性化。線性化的質粒進一步用苯酚/氯仿抽提純化，然後用乙醇沉澱。在體外，從SP6啟動子開始，利用InvitroScript CapKit(Invitrogen Co.，Carlsbad，CA)或mESSAGE mMACHINETM高產量蓋帽RNA轉錄試劑盒(Ambion Inc.，Austin，TX)來進行轉錄反應，從而生產大量蓋帽mRNA轉錄物。在1％瓊脂糖凝膠上檢查mRNA的質量。對於共轉染輔助DH-BB和SinRep/LacZ、SinRep/Luc或SinRep/IL12入BHK細胞，可採用前面所述的電穿孔法(Ohno等，Nature Biotechnol.，1997，15763-767)。電穿孔細胞被轉入10mi包含5％FBS的αMEM中並溫育12小時。然後用磷酸緩衝鹽水(PBS)洗滌細胞並在1Oml不含FBS的Opti-MEMI培養基(GIBCO-BRL)中溫育。在24小時後，採集培養物上清液並將等分試樣在-80℃儲存。
感染測定和病毒定量。病毒上清液稀釋液(300μl)被加入到在12孔板中的2×105細胞中。在室溫下溫育1小時，將細胞用PBS洗滌並在培養基中溫育24小時。用X-gal染色來評價病毒感染將被感染的細胞在包含0.5％戊二醛的PBS中固定20分鐘，然後用PBS洗滌三次；然後將細胞用包含1mg/ml X-gal(5-溴-4-氯-β-D-呋喃半乳糖苷，Fisher Scientific)、5mM高鐵氰化鉀、5mM亞鐵氰化鉀和1mM MgSO4的PBS在37℃染色3小時。病毒滴度以每毫升LacZ集落形成單位(CFU)表示。CFU依據細胞被X-gal染為藍色的數目來定義。對於SinRep/IL12載體，相對的CFU用RT-PCR來決定，RT-PCR具有與辛德比斯基因組RNA5′-AGCTTCCCGCAATTTGAGGT-3′(序列識別號3)、5′-ACGCATGGGGCAGACACAAT-3′(序列識別號4)有特異性的引物對。病毒RNA從300μl包括SinRep/LacZ(對照)或SinRep/IL12載體和1ml TRIzolTM試劑(GIBCO BRL)的Opti-MEM培養基來純化。在用乙醇沉澱後，所有RNA樣品在50μl不含核糖核酸酶的水中懸浮。利用PlatinumTM定量的RT-PCR ThermoScripTM一步系統(GIBCO BRL)來進行RT-PCR。相對的CFU通過比較SinRep/LacZ RNA和SinRep/IL12RNA的系列稀釋液的RT-PCR帶強度來獲得。然後，將RT-PCR結果與對SinRep/LacZ的X-gal染色分析結果相聯繫。SinRep/Luc載體的滴度通過用300μl含病毒的Opti-MEM系列稀釋液感染BHK細胞在12孔板上分析。經過整晚的溫育後，從各樣品中得到的細胞溶胞產物的螢光酶活性用一種LUMI-ONE手提式螢光計(Bioscan，Inc.，華盛頓，DC)測定30秒。
辛德比斯感染性體外分析。為了評價辛德比斯病毒對倉鼠和人細胞的感染性，將300μl SinRep/LacZ或SinRep/Luc病毒與2×105BHK、HuH7、LS174T、ES-2、HT29、CFPAC-1、PC-3、HuH7、SKOV-3、A498、HT1197或A431細胞一起在12孔板中溫育，MOI約為100。第二天，用X-gal染色法或Steady-GloTM螢光酶分析系統(Promega Co.)來分析細胞。在Steady-GloTM螢光酶分析中，將細胞吸出，並加入200μl基礎培養基和200μl Steady-GloTM試劑。在輕柔搖動下將細胞溫育5分鐘直到它們從板上分離下來。然後將細胞溶菌產物轉移到12×47mm2比色皿中(PharMingen Co.)，利用一個LUMI-ONE手提式螢光計(Bioscan，Inc.，Washington，DC)測定每一個的螢光酶活性30秒。對每個細胞系，做2-4個獨立的實驗。
辛德比斯感染後細胞存活力分析。在第0天，將300μl包含約107SinRep/LacZ載體的培養基加入到2×105BHK、CFPAC-1、ES-2、HT29、LS174T或SKOV-3細胞中，並在12孔板中培養一個小時。將板用PBS衝洗，再加入1ml基礎培養基並溫育。在指定的天(第0天、1天、2天、3天、4天)，收集細胞培養基，留在板中的細胞用200μl 1×胰蛋白酶EDTA(Mediatech，Inc.)進行胰蛋白酶化。將從培養基和板中獲得的細胞合併，在600rcf(相對離心力)下離心5分鐘。將細胞沉澱再懸浮於100μl PBS中，將10μl懸浮液轉移到90μl臺盼藍溶液(Mediatech Inc.)中。用血細胞計數法來對10μl臺盼藍細胞混合物進行計數並利用下列公式來計算存活力透明細胞/(透明細胞+藍細胞)×100％。
動物模型和體內轉染。所使用的所有具有嚴重結合免疫有缺陷(SCID)的小鼠(C.B-17-SCID或C.B-17-SCID/BG)都是從TACONIC(GERMANTOWN，NY)處獲得的，並且在試驗開始時都是6-8周齡。BHK和ES-2細胞都是作為皮下的腫瘤從5×106細胞的原始接種體生長起來的。在大約10天後，腫瘤達到至少1cm2的大小，治療開始並指定為第1天。將患腫瘤的小鼠分成三個組對照組(n＝5)，SinREP/LacZ組(n＝5)和SinREP/IL12組(n＝5)。將0.5CC包含107-108CFU的SinREP/LacZ載體或SinREP/IL13載體的OPTI-MEM皮下注射(I.P.)到各試驗組中。對照組不進行治療或注射PBS。每天測量腫瘤的尺寸並用公式計算(長，cm)×(寬，cm)×(高，cm)。SinREP/IL12載體製劑在OPTI-MEM中含有高水平的MIL12(10ng/ml)。
至於人類腫瘤模型，4×106腫瘤細胞例如LS174T、HT29和CFPAC-1都在治療前作為皮下腫瘤生長大約4周。將患腫瘤的小鼠分成對照組(未治療)和實驗組(每天用0.5cc包含107-108CFU病毒的SinNREP/LacZ治療)。每天利用公式(長，cm)×(寬，cm)×(高，cm)計算腫瘤大小。LS174T試驗和CFPAC-1試驗在對照和試驗組中都有4隻小鼠，而HT29試驗在對照和試驗組中都有5隻小鼠。
肝HuH7腫瘤用先前描述的方法建立(Kozlowski等，Cancer Res.，1984，443522-3529)。將SCID小鼠(6周齡；Taconic，Germantown，NY)被麻醉，並穿過皮膚和腹膜在左側橫腹部做一個橫向的切口，露出脾利用一個27.5規格的針(Becton Dickenson)通過脾門給小鼠門靜脈注射在包括10％PBS的250μl DMEM中的2×106HuH7細胞。在腫瘤注射八個星期後，當腫瘤可觸知時，通過i.p.給小鼠注射250μl辛德比斯載體一次或連續三天。對照組小鼠採用同樣的方法注射Opti-MEM。在這項實驗中，在最後一次注射後的第二天，將所有小鼠處死。
β-gal免疫染色。β-半乳糖苷酶蛋白(β-gal)的免疫組織化學的檢測在福馬林固定、石蠟包埋的組織上進行，採用標準鏈黴抗生物素辣根過氧化物酶複合物，利用3，3-二氨基聯苯胺(DAB)作為一種發色原和一種自動化的免疫色料(NexES，Ventana Medical Systems，Tucson，AZ檢測)。並採用適當的陽性對照(用β-半乳糖苷酶轉染的細胞系)和陰性對照。簡要地，使轉染的細胞系在合適的條件下生長到細胞密度約為106細胞/ml。輕輕壓擠這些細胞並重新懸浮於少量的培養基中。向該懸浮液中加入等比例的纖維蛋白和凝血酶，形成一種纖維蛋白/凝血酶/細胞凝塊，將其固定在10％中性緩衝的福馬林中。肝/腫瘤標本被從動物中切離出來並固定在10％中性緩衝福馬林中。細胞凝塊和組織都在福馬林中固定12小時並處理用來進行石蠟包埋。製備5μm厚的組織切片，放在靜電電荷的玻璃載玻片上並在60℃烘烤過夜。玻片用二甲苯衝洗三次脫蠟，然後用梯度乙醇(100％、90％和70％)再水合。對於每一樣品，一個玻片用蘇木精和曙紅染色，而其它的玻片通過用一種抗-β-半乳糖苷酶小鼠單克隆抗體(BIODESIGN，Kennebunk，ME)對細胞進行染色來進行β-gal檢測，所述抗體以1∶50稀釋溫育過夜後使用。β-gal蛋白的細胞定位在胞漿。
β-gal分析。組織中β-gal蛋白的表達利用All-in-OneTMβ-gal分析試劑盒(PIERCE，Rockford，IL)來研究。利用使用B型研杵(30擊)的玻璃Pyrex勻漿器使組織在3ml PBS中形成均勻分布的微粒。將攪勻的樣品在1000rcf 4℃離心10分鐘。收集上清液，將沉澱部分再懸浮在2ml PBS中，收集等分試樣，作為組織成分。將每份50μl的等分試樣與50μlβ-gal分析試劑在一個96孔板的孔中混合。在37℃溫育30分鐘後，利用一個分光光度計在405nm處讀取吸光度。每一蛋白濃度通過BIORAD試劑(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)來確定，每100μg蛋白校準結果。
數據統計分析。體外感染數據利用標準學生t檢驗來分析。從不同小鼠模型中獲得的腫瘤大小數據，利用Macintosh使用GraphPad Prism 3.0版的雙因素重複測量方差分析法來分析。每一因素變化的顯著性通過F比值來測定，F比值等於(特異性因素的均方)/(剩餘均方)。F值以下列形式出現F(因素df，殘餘df)，其決定F分布。P值是計算為正無窮大的F比值的特殊的F分布的積分。例如，測定如果SinRep/LacZ引起了顯著的BHK腫瘤的減少，那麼因素SinRep/LacZ的F比值是F(1，32)＝5.915，並且基於F(1，32)分布的P值是0.0208，它小於0.05。因此，SinRep/LacZ在BHK腫瘤上的效果被認為是顯著的。另一方面，因為F(32，32)＝0.3712並且P＝0.9968，所以由不同的個體患者引起的效果是不顯著的。
兩因素之間相互作用的統計學分析也可以通過F比值來測定。如果從SinRep/LacZ和治療時間得到的結果是相加的，那麼在這兩個因素之間沒有相互作用。如下所公開的，比較未治療動物和用SinRep/LacZ治療的動物的腫瘤大小的縮減量，在SinRep/LacZ和治療時間之間的交互作用是有顯著性差異的(F(7，32)＝5.14，P＝0.0005)。相反，當將用SinRep/LacZ治療的動物與用SinRep/IL12治療的動物比較時，在病毒和治療時間之間沒有顯著的交互作用(F(14，60)＝0.8290，P＝0.6303)，說明腫瘤消退的相同的動力學。
結果辛德比斯載體在體外感染許多人腫瘤細胞系。基於辛德比斯病毒的載體SinRep/LacZ(圖1)(它攜帶β-半乳糖苷酶(LacZ)基因)和SinRep/Luc(它攜帶螢火蟲螢光酶(Luc)基因)，有效地感染大多數試驗的人腫瘤細胞系LS174T(結腸)、ES-2(卵巢的)、HT29(結腸)、CFPAC-1(胰腺的)、PC-3(前列腺)、HuH7(肝)和SKOV-3(卵巢的)。SinRep/Luc也顯示低、但卻是顯著的對A498(腎)和HT1197(膀胱)細胞(P＜0.0001)的感染性，並且顯示中等水平的對A431(表皮樣癌)細胞(P＜0.0001)的感染性。所有人細胞系都在約100MOI被感染並且在第二天分析在細胞溶胞產物中的標記酶(β-gal)活性，如材料和方法部分所述。上述人腫瘤細胞系的模擬感染導致非常低的約150的相對螢光單位(RLU)讀數。
在腫瘤細胞感染後辛德比斯病毒誘導細胞死亡。由於病毒誘導的細胞凋亡，哺乳動物細胞的辛德比斯病毒感染先前已經被報導有極強的細胞毒性(LEVINE等，NATURE，361739-742，1993；JAN AND GRIFFIN，J.VIROL.7310296-10302，1999；JAN等，J.VIRIL.，746425-6432，2000；BALACHANDRAN等，J.VIROL.，741513-1523，2000)。為了確定對於腫瘤細胞的這一觀察，本發明發明人在將不同腫瘤細胞系感染後，用臺盼藍排除分析試驗了不同腫瘤細胞系的變化。在用約100MOI的辛德比斯載體SinRep/LacZ感染6種不同的腫瘤細胞系後，在一個5天周期(第0天-第4天)後快速細胞死亡發生。BHK細胞對於SinRep/LacZ誘導的細胞凋亡是非常敏感的，並且它們中的大多數在感染後兩天死亡。在ES-2細胞上觀察到了相似的結果。LS174T、CFPAC-1、HT29和SKOV-3細胞還需要兩或三天才達到在BHK細胞上觀察到的相同的細胞死亡水平。在對照試驗中，所有細胞系都只在培養基中溫育，沒有顯著的細胞死亡現像。
在體內辛德比斯載體顯示抗腫瘤效應。為了評價辛德比斯載體的抗腫瘤效應，將5×106BHK細胞皮下接種到具有嚴重混合免疫缺陷型(SCID)的小鼠(8-10周齡)的右下腹部。BHK的選擇基於它們對於辛德比斯病毒感染和辛德比斯誘導的細胞死亡的高易感性。在接種10天後，BHK腫瘤通常已長到1cm2大小。然後將小鼠分成試驗和對照組。實驗組接受攜帶β-半乳糖苷酶報告基因的約107SinRep/LacZ載體或攜帶兩個編碼鼠IL12亞單位(mP35和mP40)基因的SinRep/IL12載體的腹腔內(i.p.)注射，一周五次注射入左腹部(遠離腫瘤的位點)，而對照組小鼠不接受治療或被注射PBS。在治療的第12天，將所有對照組小鼠處死，因為此時腫瘤負擔已開始損害它們的行走能力和其它功能。相反，實驗組中的小鼠在治療的第6到7天開始顯示腫瘤減小。重複測定的雙向方差分析(RM雙向方差分析)表明，辛德比斯載體顯著地減小了BHK腫瘤尺寸。實際上，大多數BHK腫瘤小鼠在治療30天後都變得沒有腫瘤了。雖然SinRep/LacZ和SinRep/IL12具有抗腫瘤活性的相似的動力學，但是與SinRep/LacZ相比，SinRep/IL12對於BHK細胞具有更高的抗腫瘤活性(P＝0.0167)。
給另一組小鼠植入5×106BHK細胞，在7天後腫瘤長大至約5×5mm2。將患腫瘤的小鼠分為對照組(不治療)和實驗組(每天用SinRep/LacZ治療)，在連續治療三天後，製備對照組和試驗組的腫瘤切片。用蘇木精和曙紅染色表明出現了兩個顯著不同的腫瘤組；一組中，大約90-95％的腫瘤壞死，而另一組大約30％的腫瘤壞死(分別相應於治療的和未治療的腫瘤)。治療的腫瘤比未治療的腫瘤小。血管供應用對因子VIII的免疫組織化學來證明。這些血管的尺寸為中等尺寸至小尺寸，並且在存活的腫瘤區域有小尺寸的血管。壞死的腫瘤細胞被曙紅染色，並且失去了細胞組織和細胞膜。未治療腫瘤的壞死區域是集中的，然而，在被治療的腫瘤中，大多數都是存活細胞的一個邊的壞死。免疫組織化學β-半乳糖苷酶(β-gal)染色只在被治療的動物和壞死區域獲得。在活的腫瘤區域沒有檢測到β-gal。另外，β-gal-陽性染色的面積相應於因子VIII陽性染色的面積，證明辛德比斯病毒存在並通過血液通道被傳送到腫瘤。此外，壞死和β-gal的分布表明，有活力的辛德比斯病毒只存在於被治療腫瘤的周圍。在被治療的腫瘤中，強烈但受限的通道(Tunnel)陽性信號在被治療腫瘤的有活力區和壞死區邊緣被觀察到。在對照腫瘤中，在對照腫瘤的有活力的-壞死邊界上的凋亡信號不那麼強烈，並且是更加彌散的。而且，大量的尖銳並清晰的凋亡體在被治療腫瘤的邊界區域被觀察到。在控制和治療腫瘤的中心壞死區域都沒有觀察到通道信號。
SinRep/IL12載體的注射也導致了在SCID小鼠上BHK腫瘤的減小(P＝0.0167)。
也皮下接種人腫瘤細胞LS174T(結腸)、HT29(結腸)和CFPAC-1(胰腺)，並在治療前使其生長到一定的尺寸。用SinRep/LacZ對實驗組進行治療，一周五次，對照組不接受治療或注射PBS。在具有BHK腫瘤的實驗中，在SCID小鼠中治療引起了顯著的LS174T和CFPAC-1腫瘤減小(P＜0.0001)。治療約兩周後，辛德比斯載體在LS174T和CFPAC-1腫瘤中引起顯著的腫瘤生長抑制，並且許多無腫瘤的小鼠也對治療產生相應。SinRep/LacZ的抗腫瘤活性雖然較低但仍是非常有顯著性的(P＜0.0001)。基於RM雙向方差分析，所有人類腫瘤模型表明在不同的個體患者之間沒有顯著性差異。
辛德比斯病毒能夠靶向SCID小鼠肝中的HuH7腫瘤。HuH7肝腫瘤通過穿過脾門的門靜脈植入肝細胞癌HuH7細胞(2×106)來誘導。在大約8個星期後，腫瘤已明顯可觸及，對小鼠i.p.注射(1或3次)SinRep/LacZ載體。用SinRep/LacZ載體治療患腫瘤的小鼠一次或連續三天，在最後一次注射後的第二天，將小鼠處死。在正常肝組織和未感染的對照部分的腫瘤中沒有發現β-gal陽性細胞。在只用辛德比斯載體感染了一次的肝腫瘤中也沒有清晰地檢測到β-gal。然而，在連續三天感染的肝腫瘤中很容易檢測到。在用SinRep/LacZ注射三次的腫瘤中，也可以觀察到壞死。
在另一個實驗中，在一次或三次治療後，對β-gal蛋白在各種組織中的表達進行定量。與前面的實驗相同，在一次感染小鼠和對照小鼠的腫瘤細胞之間沒有顯著的差異，但是接受三次治療的小鼠比對照組小鼠的腫瘤細胞上清液中顯示12到18倍高的β-gal水平，比組織樣品顯示19到38倍高的水平。無論動物是接受了一次還是三次辛德比斯載體注射，在肝、心臟、肺、腎和睪丸中β-gal的活性均沒有顯著地升高。在被注射小鼠的腦中觀察到了低但卻顯著的β-gal水平。儘管對腦細胞具有感染性，但是所有接受了一次和三次SinRep/LacZ注射的小鼠都能保持健康並且沒有異常行為。
NK細胞提高辛德比斯載體的抗腫瘤效應。在C.B-17-SCID小鼠和C.B-17-SCID/bg小鼠中誘導皮下BHK腫瘤。C.B-17-SCID/bg同C.B-17-SCID類似，僅是除了缺乏T和B細胞之外，還包括beige(bg)常染色體隱性突變，它產生削弱的巨噬細胞趨向性和活動性，並且缺乏天然殺傷(NK)細胞。與SCID/bg相比，在SCID小鼠中用辛德比斯載體進行的每天治療似乎更有效(P＞0.0001)。因此，只在SCID小鼠中獲得了腫瘤的完全退化。
討論在這裡公開的結果表明，基於辛德比斯病毒的複製缺陷型載體(即SinRep/LacZ、SinRep/Luc和SinRep/IL12)能夠在體外和體內感染廣譜的人腫瘤細胞。如在本實施例中公開的那樣，辛德比斯載體不但在體外在各種哺乳動物腫瘤細胞系中而且在體內在人或齧齒動物源的移入的腫瘤中均可以誘導凋亡。因此，即使不加入任何外源性基因，基於辛德比斯病毒的載體本身也能夠作為抗惡性腫瘤的治療劑。
的確，在本研究中，引入辛德比斯載體在體內產生了BHK腫瘤細胞的高度凋亡和壞死並伴隨著腫瘤的完全衰退。用辛德比斯載體進行多次注射(從三次到超過十五次)治療，對實驗動物沒有顯現出毒性，這表明這些載體介導腫瘤細胞的選擇性感染。實際上，在心臟、肺、正常肝臟細胞和腎中沒有觀察到顯著的感染。雖然能探測到很少量的腦感染，但是在成年(6-8周齡)實驗小鼠中沒有引起可觀察到的臨床CNS紊亂，已知它們能抵抗辛德比斯病毒誘導的神經毒性作用(Griffin，J.Infect.Dis.，133456-464，1976)。
當在這裡進一步公開時，在經用SinRep/LacZ載體三次注射進行治療後對BHK腫瘤進行免疫染色證明，在腫瘤外圍出現廣泛的壞死區域。這與由缺氧和營養不良引起的在腫瘤中心看到的典型壞死相反，由缺氧和營養不良引起的在腫瘤中心看到的典型壞死可以容易地在未治療小鼠中看到。進一步，在腫瘤中感染載體和血管的共定位證明，辛德比斯病毒的由血液而生的特徵在載體運輸中起了很重要的作用。
載體在血液中的清除率是另一個重要的因素，它決定了由載體介導的腫瘤靶向的成功。最廣泛使用的病毒載體，即逆轉錄病毒載體和腺病毒載體在血流中是不穩定的(Miyao等，Hum.Gene Ther.，81575-1583，1997；Russell等，Hum.Gene Ther.，6635-641，1995，Rother等，J.Exp.Med.，1821345-1355，1995；Alemany等，J.Gen.Virol.，812605-2609，2000)。相反，由血液產生的α病毒，包括辛德比斯病毒和基於辛德比斯病毒的載體，在血流中是穩定的(Byrnes and Griffin，J.Viroi.，74644-651，2000；Bernard等，Virology，27693-103，2000；Klimstra等，J.Virol.，727357-7366，1998)。
儘管體外辛德比斯在各種細胞系中誘導的感染性和細胞毒性是相似的，但是在體內觀察到了抗腫瘤活性的差異。這些差異可能由腫瘤組織中血管數目和透過性的不同、HALR的水平不同和/或對病毒具有特異性的另外的腫瘤受體的存在所導致。
如下公開的體內試驗結果表明，除了辛德比斯感染誘導的腫瘤細胞的直接殺死外，宿主的免疫系統、特別是天然殺傷(NK)細胞(對於先天的免疫是很重要的)對於腫瘤消除也有貢獻。實際上，NK細胞對於腫瘤(Gumperzand Parham，Nature，378245-248，1995；Trinchieri，Adv.Immunol.，47187-376，1989)和被病毒感染的細胞(Biron等，Annu.Rev.Immunol.，17189-220，1999)的細胞毒性是眾所周知的。有人還認為，當宿主抗病毒機制被激活時，可以發出信號，例如幹擾素，它導致NK細胞激活(Biron等，1999，supra)。NK細胞激活也可能由腫瘤細胞壞死導致的炎症和細胞內容物的釋放激活。已經表明，IL12為一種潛在的NK細胞刺激因子，並且表明，施用IL12能產生對抗某些實體瘤的強有力的抗腫瘤和抗轉移的活性(Biron等，1999，supra；Brunda等，J.Exp.Med.1781223-1230，1993；Nastala等，J.Immunol.，1531697-1706，1994；Takeda等，J.Immunol.，1563366-3373，1996；Tsung等，J.Immunol.，1583359-3365，1997)。當在這裡公開時，與不編碼IL12的辛德比斯載體(SinRep/LacZ)相比，編碼IL12的重組辛德比斯載體(SinRep/IL12)具有提高的抗腫瘤細胞毒性。因為本發明的辛德比斯載體在一個很高的水平上表達外源基因，所以其他抗腫瘤治療基因例如腫瘤抑制基因、細胞毒素和細胞因子基因可能是增加辛德比斯載體的抗腫瘤效力的理想候補物質。
上述在體內實驗中使用的SCID小鼠(它缺乏B和T細胞)不能確切地證明是細胞毒性T細胞和中和抗體是增加還是降低本發明的辛德比斯載體的抗腫瘤活性。然而，即使這些免疫細胞具有負面的影響，這些影響還是可以被容易地減少。例如，先前報導的成功用基於α病毒載體的連續接種表明，載體注射後引出的中和抗體的水平可以被合適的載體設計減少(Kamrud等，Virology，263209-219，1999；Pushko等，Virology，239389-401，1997；Pushko等，Virology，239389-401，1997)。
證明基於辛德比斯病毒的載體可以天然靶向腫瘤(可能利用了在腫瘤與正常細胞中存在的HALR表達的天然差異)。除了辛德比斯載體這一天然的優點外，靶向的辛德比斯載體還可以識別細胞型或腫瘤特異性細胞表面分子，它保留了高感染性和滴度，也已由本發明人開發(見例如Ohno等，Nat.Biotechnol.，15763-767，1997)，並且可能允許體內靶向的進一步提高。上面提供的實驗數據表明，無論是單獨還是結合其他治療形式，辛德比斯載體均是有效的癌症基因治療的新工具。
實施例2利用辛德比斯載體來治療人類腫瘤複製缺陷型基於辛德比斯病毒的載體SinRep/LacZ和SinRep/IL12按照實施例1的描述來製備並對患有晚期(轉移性)黑素瘤或晚期(轉移性)腎、腦、結腸、前列腺、膀胱、肺或卵巢癌的病人靜脈內給藥(約500μl載體製劑，107CFU/ml)。治療每周進行5次，持續三周或更多星期。腫瘤的尺寸通過MRI和CAT掃描持續不斷的監測，然後進行腫瘤壞死的組織學分析和腫瘤細胞轉移行為的活組織檢查(當可能的時候)。
* * *本發明不限於在這裡描述的具體的實施方案的範圍。實際上，除了在這裡描述的，從前述的說明和附圖中，各種關於本發明的修改對於本領域技術人員而言是顯而易見的。這些修改也包括在權利要求範圍內。
還可以理解，所有鹼基對的大小和胺基酸的大小、合成濃度以及分子量和摩爾數值均是近似的，僅是用於說明。
所有在此引用的專利、申請、出版物、實驗方法、文獻和其他材料都在此併入本文中作參考。
權利要求
1.一種治療患腫瘤的哺乳動物的方法，該方法包括向患有此腫瘤的哺乳動物施用治療腫瘤有效量的一種基於α病毒的載體，其中的載體沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細胞決定簇。
2.根據權利要求1的方法，其中的載體是一種基於辛德比斯病毒的載體。
3.根據權利要求1的方法，其中的載體是一種複製缺陷型α病毒。
4.根據權利要求3的方法，其中的複製缺陷型α病毒是一種複製缺陷型辛德比斯病毒。
5.根據權利要求1的方法，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
6.根據權利要求1的方法，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
7.根據權利要求6的方法，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細胞凋亡誘導基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
8.根據權利要求6的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細胞凋亡誘導基因。
9.根據權利要求6的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細胞因子編碼基因。
10.根據權利要求1的方法，其中的哺乳動物具有至少一種部分地功能免疫系統。
11.根據權利要求1的方法，其中的哺乳動物是人類。
12.根據權利要求1的方法，其中的腫瘤是一種實體瘤。
13.根據權利要求12的方法，其中的實體瘤選自肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌、腦惡性腫瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌、結腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
14.根據權利要求1的方法，其中的載體通過胃腸外給藥。
15.一種治療患腫瘤的哺乳動物的方法，該方法包括向患此腫瘤的哺乳動物施用治療腫瘤有效量的一種複製缺陷型基於辛德比斯病毒的載體，其中的載體沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細胞決定簇。
16.根據權利要求15的方法，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
17.根據權利要求15的方法，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
18.根據權利要求17的方法，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細胞凋亡誘導基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
19.根據權利要求17的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細胞凋亡誘導基因。
20.根據權利要求17的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細胞因子編碼基因。
21.根據權利要求15的方法，其中的哺乳動物具有至少一種部分地功能免疫系統。
22.根據權利要求15的方法，其中的哺乳動物是人類。
23.根據權利要求15的方法，其中的腫瘤是一種實體瘤。
24.根據權利要求23的方法，其中的實體瘤選自肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌，腦惡性腫瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌、結腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
25.根據權利要求15的方法，其中的載體通過胃腸外給藥。
26.一種治療患腫瘤的哺乳動物的方法，與具有相同品系的正常細胞相比此腫瘤表達較高水平的高親和性層粘連蛋白受體(HALR)，該方法包括向患有此腫瘤的哺乳動物施用治療腫瘤有效量的一種載體，此載體同高親和性層粘連蛋白受體(HALRs)具有一種優先的親和性。
27.根據權利要求26的方法，其中的載體是一種基於病毒的載體。
28.根據權利要求27的方法，其中的基於病毒的載體是一種基於α病毒的載體。
29.根據權利要求26的方法，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
30.根據權利要求26的方法，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
31.根據權利要求30的方法，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細胞凋亡誘導基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
32.根據權利要求30的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細胞凋亡誘導基因。
33.根據權利要求30的方法，其中的抗腫瘤基因是一種細胞因子編碼基因。
34.根據權利要求26的方法，其中的哺乳動物具有至少一種部分地功能免疫系統。
35.根據權利要求26的方法，其中的哺乳動物是人類。
36.根據權利要求26的方法，其中的腫瘤是一種實體瘤。
37.根據權利要求36的方法，其中的實體瘤選自肝癌、黑素瘤、表皮樣癌、胰腺癌，腦惡性腫瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢腺癌、結腸癌、前列腺癌、膀胱癌和腎癌。
38.根據權利要求26的方法，其中的載體通過胃腸外給藥。
39.一種治療患腫瘤的哺乳動物的藥物組合物，包括一種基於α病毒的載體和一種藥學上可接受的媒介物或稀釋劑，其中的載體沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細胞決定簇。
40.根據權利要求39的藥物組合物，其中的載體是一種複製缺陷型α病毒。
41.根據權利要求40的藥物組合物，其中的複製缺陷型α病毒是一種複製缺陷型辛德比斯病毒。
42.根據權利要求39的藥物組合物，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
43.根據權利要求39的藥物組合物，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
44.根據權利要求43的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細胞凋亡誘導基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
45.根據權利要求43的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因是一種細胞凋亡誘導基因。
46.根據權利要求43的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因是一種細胞因子編碼基因。
47.一種治療患腫瘤哺乳動物的藥物組合物，該組合物包括一種複製缺陷型基於辛德比斯病毒的載體和一種藥學上可接受的媒介物或稀釋劑，其中的載體沒有被修飾來靶向一個腫瘤特異性細胞決定簇。
48.根據權利要求47的藥物組合物，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
49.根據權利要求47的藥物組合物，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
50.一種用來治療患腫瘤的哺乳動物的藥物組合物，該組合物包括一種載體和一種藥學上可接受的媒介物或稀釋劑，其中的載體對HALR具有一種優先的親和性並且能有效地殺死腫瘤，條件是如果載體是一種基於α病毒的載體，那麼它不被修飾來靶向一種腫瘤特異性細胞決定簇。
51.根據權利要求50的藥物組合物，其中的載體是一種基於病毒的載體。
52.根據權利要求51的藥物組合物，其中的基於病毒的載體是一種基於α病毒的載體。
53.根據權利要求50的藥物組合物，其中的載體不被修飾來攜帶一種抗腫瘤基因。
54.根據權利要求50的藥物組合物，其中的載體編碼一種抗腫瘤基因。
55.根據權利要求54的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因選自自殺基因、細胞凋亡誘導基因、腫瘤抑制基因、致癌基因拮抗基因、免疫刺激基因、腫瘤抑制因子效應基因、反義低聚核苷酸編碼序列、核糖酶編碼序列和免疫原性蛋白編碼序列。
56.根據權利要求54的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因是一種細胞凋亡誘導基因。
57.根據權利要求54的藥物組合物，其中的抗腫瘤基因是一種細胞因子編碼基因。
全文摘要
本發明涉及利用優先地靶向腫瘤細胞的載體治療腫瘤的方法和組合物。具體而言，本發明涉及基於α病毒(優選基於辛德比斯病毒)的載體和基於非α病毒的載體，它們對於高親和性層粘連蛋白受體(HALR)具有優先的親和性。這些載體有效地靶向腫瘤並且具有引起腫瘤壞死的能力。
文檔編號A61K48/00GK1520303SQ02807228
公開日2004年8月11日 申請日期2002年3月27日 優先權日2001年3月27日
發明者D·梅魯埃洛, D 梅魯埃洛 申請人:紐約大學