一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法
2023-05-29 17:31:01
專利名稱：一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，具體涉及一種檢測基因突變的螢光定量PCR試劑盒 及其檢測方法，特別涉及一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
Ras癌基因參與人類腫瘤的發生發展，最初是在急性轉化性逆轉錄病毒實驗中從 Harvey、Kirsten兩株大鼠肉瘤病毒中克隆出來的轉化基因，自1982年Weinberg等人發 現人的膀胱癌細胞中有活化的H-ras基因後，引起了人們對ras癌基因在人類腫瘤發生發 展過程中所起的作用的極大關注。ras基因家族與人類腫瘤相關的基因有三種——H-ras, K-ras和N-ras，分別定位在11、12和1號染色體上。其中，K-Ras則對人類癌症影響最大， 它好像分子開關當正常時能控制調控細胞生長的路徑；發生異常時，則導致細胞持續生 長，並阻止細胞自我毀滅。研究人員發現K-Ras蛋白並不是永遠位於細胞膜上，它的位置受 到蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的控制。他們發現PKC使磷酸分子與K_Ras結合即 磷酸化，這種磷酸化過程導致K-Ras與細胞膜的結合減弱而改變位置，並移至內質網、高爾 基體和粒線體等位置。K-Ras 基因突變不但導致非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC, 30%由K-Ras基因突變引起)，還誘髮結腸癌和胰腺癌。KRAS基因突變發生在腫瘤惡變 的早期，並且原發灶和轉移灶的KRAS基因高度保持一致。大腸癌患者KRAS突變率為 30%-35%,而沒有發生突變的正常kras基因佔大多數，約60%。所有轉移性結直腸癌患 者都應檢測KRAS基因狀態，只有KRAS野生型患者才建議接受EGFR抑制劑治療。一是所有轉移性結直腸癌患者都應檢測KRAS基因狀態，二是只有KRAS野生型患 者才建議接受EGFR抑制劑如西妥昔單抗和帕尼單抗(包括單藥或與化療聯合)治療。那 麼，KRAS對臨床實踐的影響究竟有多大？美國喬治敦大學馬歇爾一言以蔽之在結直腸癌 的治療中，結直腸癌從此「一分為二」:KRAS基因是野生型還是突變型，使傳統意義上的一種 疾病被分成兩種獨立的疾病。KRAS突變型結直腸癌患者約佔40 %，這類患者不能從抗EGFR 治療中獲益，反而徒增不良反應危險和治療費用；而其餘60%左右的KRAS野生型患者就很 有可能從這類藥物治療中獲益。靶向治療已經成為腫瘤臨床治療的重要手段。表皮生長因子受體(EGFR)是靶向 治療的主要作用靶點。FDA已經批准的作用於EGFR的靶向藥物包括抗EGFR單克隆抗體藥愛 必妥(Erbitux/ 西妥西單抗 /Cetuximab，默克)、帕尼單抗(Panitumumab/Vectibix, Amgen 和尼妥珠單抗(Nimotuzumab)，以及EGFR酪氨酸激酶抑制劑易瑞沙(Iressa/吉非替尼/ Gefitinib，阿斯利康)和特羅凱(Tarceva/厄羅替尼/Erlotinib，羅氏製藥)。但是，臨床 試驗表明這些靶向藥物僅對部分病人有顯著療效。進一步的研究發現腫瘤組織中KRAS基 因發生突變(體細胞突變)的病人對此類靶向藥物完全耐藥。因此，檢測病人KRAS基因是 否突變成為決定能否使用EGFR靶向藥物的必要前提條件。
目前，檢測K-Ras基因突變的方法是傳統的直接測序法。直接測序法的結果雖然 具有客觀性和特異性，但是它卻存在以下缺點1、檢測周期長(從標本送檢到得出結果最短要24-48個小時左右)。2、操作過程複雜，且要涉及到PCR擴增後的操作，因此易被汙染，造成結果的不理
術g
；o3、測序結果的判讀較複雜、費時(當樣本量大時，此點尤為突出)。4、檢測的敏感性不夠高KatSuhiko等人曾在2005年8月份出版的《Lung Cancer))(《肺癌》)上報導，如果突變基因的含量佔基因組DNA總量的10%以下時，則用直 接測序法檢測不到突變樣本的存在。5、一次實驗檢測的樣本量有限，最多只能8-24例。6、不安全整個實驗過程要用到多種有毒物質，如EB、丙烯醯胺等，對操作者和環 境都有危害。7.費用較高(每個位點約需200元)。
發明內容
為克服上述技術缺陷，本發明的目的之一是提供一種K-Ras基因突變分型螢光定 量PCR檢測試劑盒。本發明的K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒，包括PCR混合反應液、肽 核酸(PNA)探針、突變型KRas-Allglo 螢光探針和陽性對照樣品。所述肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示SEQ ID NO AO :PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，。所述PCR混合反應液中含PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物的序 列如SEQ ID NO A1所示，所述PCR反向引物的序列如SEQ ID NO A2所示SEQ ID NO A1 :5，-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3，；SEQ ID NO A2 :5，-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，。所述突變型KRas-Allglo 螢光探針包括如 SEQ ID NO A3、SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5、SEQ IDN0 B6 所示的序列中的一種或 多種SEQ ID NO A3 (GAT-12 密碼子)SEQ ID NO A4 (GTT-12 密碼子)SEQ ID NO A5 (GCT-12 密碼子)SEQ ID NO B3 (GAC-13 密碼子)SEQ ID NO B4 (TGT-12 密碼子)SEQ ID NO B5 (AGT-12 密碼子)SEQ ID NO B6 (CGT-12 密碼子)
5』 -MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3『； 5， -JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3' 5， -SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，； 5』 -MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3' 5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3' 5』 -URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3『； 5， -SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，當所述突變型KRas-Allglo 螢光探針包括如SEQ ID NO A3,SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5所示的序列中的一種或多種時，所述陽性對照樣品是存在K-Ras基因第12號密碼子 三種突變類型(GAT，GTT和GCT)的混合質粒基因組DNA。該突變型KRas-Allglo 螢光探針 檢測的是K-Ras基因第12密碼子三種鹼基置換突變(GGT — GAT，GGT — GTT，GGT — GCT)。
當所述突變型KRas-Allglo 螢光探針包括如SEQ ID NO B3、SEQ ID N0B4、SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6所示的序列中的一種或多種時，所述陽性對照樣品是存在K_Ras基因 第13號密碼子一種突變類型(GAC)和第12密碼子三種突變型(TGT、AGT和CGT)的混合質 粒基因組DNA。該突變型KRas-Allglo 螢光探針檢測的是K_Ras基因第13密碼子一種鹼 基置換突變(密碼子13GGC — GAC)，第12密碼子三種鹼基置換突變(密碼子12GGT — TGT， GGT — TGT 禾口 GGT — CGT)。 本發明的第二個目的是提供一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測方法。該 方法具體是先針對K-Ras基因設計一對PCR引物和肽核酸探針，針對K-Ras基因突變位點 分別設計Allglo 螢光探針，反應體系中加入PCR反應液、PCR引物、肽核酸探針和Allglo 螢光探針進行螢光定量PCR的檢測。所述的肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示SEQ ID NO AO :PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，。所述的PCR 引物如 SEQ ID NO A1 和 SEQ ID NO A2 所示SEQ ID NO A1 :5，-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3，；SEQ ID NO A2 :5，-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，。所述的Allglo 螢光探針包括如 SEQ ID NO A3,SEQ ID NO A4、SEQ ID N0A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5 和 SEQ ID NO B6 所示的序列中的一種或多種。SEQ ID NO A3 (GAT-12 密碼子)SEQ ID NO A4 (GTT-12 密碼子)SEQ ID NO A5 (GCT-12 密碼子)SEQ ID NO B3 (GAC-13 密碼子)SEQ ID NO B4 (TGT-12 密碼子)SEQ ID NO B5 (AGT-12 密碼子)SEQ ID NO B6 (CGT-12 密碼子)
5』 -MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3『； 5， -JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3' 5， -SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，； 5』 -MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3' 5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3' 5』 -URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3『； 5， -SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，其中，SEQID NO A3、SEQ ID NO A4、SEQ ID NO A5 是檢測 K-Ras 基因第 12 密碼 子三種鹼基置換突變(GGT — GAT, GGT — GTT, GGT — GCT) ；SEQ IDN0 B3、SEQ ID NO B4、 SEQ ID NO B5和SEQ ID NO B6是檢測K-Ras基因第13密碼子一種鹼基置換突變(密碼 子13GGC — GAC)，第12密碼子三種鹼基置換突變(密碼子12GGT — TGT，GGT — AGT和 GGT — CGT)。Allglo 螢光探針SEQ ID NO A3的5'和3，端均標記MAR(螢光報告/淬滅基 團)；Allglo 螢光探針SEQ ID NO A4的5'和3，端均標記JUP(螢光報告/淬滅基團)； Allglo 螢光探針SEQ ID NO A5的5'和3，端均標記SAT (螢光報告/淬滅基團)。Allglo 螢光探針SEQ ID NO B3的5'和3，端均標記MAR(螢光報告/淬滅基團)；Allglo 螢光 探針SEQ ID NO B4的5'和3，端均標記JUP(螢光報告/淬滅基團)；Allglo 螢光探針 SEQ ID NO B5的5'和3，端均標記URA(螢光報告/淬滅基團)。Allglo 螢光探針SEQ ID NO B6的5'和3，端均標記SAT(螢光報告/淬滅基團)。優選的，反應體系之一包括(l)PCR混合反應液、(2)肽核酸(PNA)探針、(3)突變 型KRas-Allglo 螢光探針和⑷陽性對照樣品。該體系檢測的是K-Ras基因第12密碼子 三種鹼基置換突變(GGT — GAT, GGT — GTT, GGT — GCT)。
其中，(1) PCR混合反應液中含PCR正向引物和PCR反向引物，PCR正向引物的序列 如 SEQ ID NO A1 所示:SEQ ID NO A1 :5，_TTA GCT GTA TCGTCAAGG CAC TC_3，;PCR 反向引 物的序列如SEQ ID NO A2所示:SEQ ID N0A2 :5，_GCC TGC TGA AM TGA CTG AAT ATA-3，。(2)肽核酸探針抑制K-Ras基因突變區野生型基因擴增的PNA序列，其序列如SEQ ID NO AO 所示:SEQ ID NO AO :PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，。(3)突變型 KRas-Allglo 螢光探針包括如 SEQ ID NO A3、SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5所示的序列SEQ ID NO A3 (GAT-12 密碼子)5，-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3，；SEQ ID NO A4 (GTT-12 密碼子)5，-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3，；SEQ ID NO A5 (GCT-12 密碼子)5，-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，；(4)陽性對照樣品是存在K-Ras基因第12號密碼子三種突變類型(GAT，GCT和 GTT)的混合質粒基因組DNA。優選的，反應體系也可以為包括(l)PCR混合反應液、⑵肽核酸(PNA)探針、(3) 突變型KRas-Allglo 螢光探針和⑷陽性對照樣品。該體系檢測的是K-Ras基因第13密 碼子一種鹼基置換突變(密碼子13GGC — GAC)，第12密碼子三種鹼基置換突變(密碼子 12GGT — TGT, GGT — AGT 和 GGT — CGT)。其中，(1) PCR混合反應液中含PCR正向引物和PCR反向引物，PCR正向引物的序列 如 SEQ ID NO A1 所示:SEQ ID NO A1 :5，_TTA GCT GTA TCGTCAAGG CAC TC_3，;PCR 反向引 物的序列如 SEQ ID NO A2所示:SEQ ID N0A2 :5，_GCC TGC TGA AM TGA CTG AAT ATA-3' (2)肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示SEQ ID NO AO :PNA probe-5' -CCTACGCCACCAGCTCC-3』。(3)Allglo 螢光探針包括如 SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID N0B5、SEQ ID NO B6所示的序列SEQ ID NO B3 (GAC-13 密碼子)5，-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3，；SEQ ID NO B4 (TGT-12 密碼子)5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3，；SEQ ID NO B5 (AGT-12 密碼子)5，-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3，；SEQ ID NO B6 (CGT-12 密碼子)5，-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，；(4)陽性對照樣品是存在K-Ras基因第13號密碼子一種突變類型(GAC)和第12 密碼子三種突變型(TGT，AGT和CGT)的混合質粒基因組DNA。優選的，反應體系為15 u 1,PCR引物各0. 15 ill (終濃度20 u M), Allglo 螢光探 針探針各0. 2 ill (終濃度20 ii M)，PNA探針0. 3 ill (終濃度20 y M)，模板DNA 2. 5 u 1 (終 濃度 100-300ng/u 1), PCR 反應液 7. 5 yl，加入 ddH20 至 15 yl。綜合Allglo 探針的優勢和定量PCR技術特點，與PCR-SSCP測序等方法比較，本 技術用PNA增敏的FQ-PCR檢測K-Ras基因的突變具有以下優勢1、特異性強設計的Allglo 探針分別針對KRAS基因第12和第13密碼子的七種 特異突變序列，能特異的與PCR擴增的特異突變產物雜交；Allglo 探針提高TM值(可高 達10°C以上)，可以抑制非特異性PCR產物擴增；另外本發明技術在PCR反應液中加入野生 型K-Ras基因肽核酸序列(PNA)，通過抑制野生型基因組產物擴增而富集突變型擴增，也提 高檢測的特異性；
2、檢測敏感性高本發明技術在PCR反應液中加入野生型K-Ras基因肽核酸序列 (PNA)，通過抑制野生型產物擴增富集突變型擴增，提高檢測敏感性；由於探針更短，可以達 到15-16mer ；Allglo 探針兩端螢光即可相互粹滅，水解後又可報告螢光，也提高了檢測靈 敏度。本技術檢測K-Ras突變基因組DNA敏感度為(即突變基因組DNA達到基因總 DNA的即可檢出)；直接測序法檢測K-Ras突變基因組DNA敏感度為20-30% (即突變 基因組DNA達到基因總DNA的20-30%才能檢出)；表1列示不同檢測方法對結直腸癌組織 K-Ras基因突變檢測的靈敏度表 1 3、可以進行KRAS突變型基因組定量檢測；測序和其它方法均不能實現對K-Ras基 因突變基因組的真正定量檢測；4、本技術對標本DNA獲取的質量要求較低，無論是石蠟組織還是新鮮組織，都能 取得理想的檢測結果；直接測序法一般需要新鮮冰凍組織，檢測步驟繁瑣送檢標本-提取 DNA-定性PCR擴增-驗證PCR產物-純化PCR產物-直接測序；5、檢測時間短(從標本送檢到得出結果可在3個小時以內完成)；測序方法最快 需要24-48小時才能出結果；6、操作過程簡單，並且從PCR反應開始，就是在封閉的體系中完成擴增和實時測 定，大大降低了汙染的可能性，因此也就降低了結果偏差的機率(比較如下所示)。7、結果判讀明確、直觀(比較如下所示)；若需要亦可對結果進行定量分析。直接 測序法結果的判讀需將測序峰形圖人工讀出序列，再將所讀出的序列結合基因庫中的原 始序列一起分析，從而得到結果，螢光定量PCR法結果的判讀在域值線以上有擴增曲線的 標本均為陽性標本，結果判讀非常簡單，直觀。8、檢測的樣本量大，一次最多可檢測384例；直接測序法一次試驗最多可檢測 8-12 例。9、安全整個體系中不包含有毒有害物質，對操作員和環境都無危害。本發明的試劑盒能快速、準確、高敏感度的檢測各種癌組織中K-Ras基因特定位 點突變。本發明採用了 PNA技術合成覆蓋K-Ras基因檢測位點(第12和13密碼子)的肽核酸序列，結合採用了最新發展的Allglo 螢光探針技術。肽核酸(PNA，Peptide Nucleic Acid)是近十幾年發展起來的以中性醯胺鍵為骨 架的脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA)類似物，以中性醯胺鍵為骨架併兼有多 肽和核酸性質的獨特化合物，其特點是1、可以高度親和並序列特異地與DNA和RNA結合， 與核酸的雜交能力強於核酸間的雜交能力，形成的雜交複合物具有相當高的熱穩定性以及 獨特的耐離子強度變化性質；2、熱穩定性高於核酸間的雜交體；3、抗酶解能力極強，由於 其非肽和非核酸的結構特點，蛋白酶和核酸酶均不能降解PNA。目前，PNA被廣泛用於化學、 生物學、反義藥物、分子識別、遺傳診斷等領域。它能夠與DNA和RNA特異性地結合從而可 以製備PNA探針，與DNA探針相比，其雜交的穩定性和特異性增加且能在低鹽濃度下進行雜 交，可大大提高微生物學檢測和醫療診斷的效率和靈敏度。Allglo 探針是美國AlleLogic Biosciences公司推出的最新一代螢光定量探 針，它擁有普通Taqman、Taqman-MGB及分子信標(molecular beacon)探針所有優點，去掉 了目前這幾種探針的最大弊端，能夠大大提高螢光定量PCR技術的研究和應用。Allglo 探針打破傳統Taqman探針的一端報告基團一端粹滅基團的限制，利用美 國AlleLogic Biosciences公司生物化學專家大量研究開發的、獲得美國專利技術的幾種 常用波長的特製螢光染料，該系列染料標記在oligo上面互相互為報告及粹滅基團，而且 上面含有特殊的可以大大提高TM值的化學基團，可以大大提高探針特異性，經同類比較， 雜交特異性大大超過Taqman及Taqman-MGB，在雜交水解之後兩端標記的染料又全部變為 報告基團，大大提高螢光增量。其優勢在於，可提高TM值(可高達10°C以上)，探針更短， 可以15-16mer，可以適用於A、T含量比較高的序列設計探針，大大提高探針配對和非配對 的TM值差異，加大多重螢光定量PCR的選擇5-7種專利螢光選擇，適用於所有品牌螢光定 量PCR儀所有通道；每種染料即是報告基團又是粹滅基團，打破傳統Taqman探針，因為波長 原因標記選擇困難，不受粹滅基團波長的限制；提高信噪比無背景螢光，空間距離近，更 好的淬滅效果，探針兩端螢光即可相互粹滅，水解後又可報告螢光。本發明的肽核酸(PNA)和Allglo 探針增敏的K-Ras基因突變螢光定量PCR檢測 試劑盒是針對K-Ras基因熱點突變區的檢測而設計的，包括K-Ras基因第12、13密碼子的 共7種突變基因型。該試劑盒包括PCR混合反應液、優選的，包括兩種螢光定量反應液，螢光 定量反應液的特徵是均含有正、反引物和Allglo 螢光探針，抑制KRAS突變區野生型基因 組PCR擴增的PNA序列，陽性對照樣品，只是Allglo 螢光探針針對的突變位點有所區別， 相應的陽性對照樣品也有所不同而已。在本發明中，提供的兩端都標有螢光發光基團MAR的特異性螢光探針，在探針完 整時(隨機狀態和無PCR產物雜交狀態)，則探針兩端MAR螢光染料均不發出螢光。當特異 的PCR產物與Allglo 探針發生雜交反應時，Taq酶同時也把探針裂解，則探針兩端標記的 MAR螢光染料改變為雜交消化形態而發出螢光。由於標記Allglo 探針兩端的MAR互相互 為報告及粹滅基團，而且上面含有特殊的可以大大提高TM值的化學基團，可以大大提高探 針特異性，經同類比較，雜交特異性顯著超過Taqman及Taqman-MGB，在雜交水解之後兩端 標記的染料又全部變為報告基團，大大提高螢光增量。報告基團所釋放出來的螢光就可以 被內置在定量檢測儀內的螢光計檢測到。PCR每經過一個循環，螢光信號也和目的片段一 樣，有一個同步指數增長的過程，螢光信號的強弱就代表了模板DNA的拷貝數的多少。因此本發明不僅可用於簡單的定性檢測，亦可用做樣本具體含量的定量檢測。
圖1是用螢光定量PCR檢測腸癌陽性樣本的KRAS基因第12密碼子三種鹼基置換 突變的擴增曲線圖；圖2是用螢光定量PCR檢測腸癌陽性樣本的KRAS基因第13密碼子一種鹼基置換 突變和第12密碼子兩種鹼基置換突變的擴增曲線圖。
具體實施例方式為使本發明更加容易理解，下面將進一步闡述本發明的具體實施例。收集臨床病理診斷為腸腺癌(CRC)的80例患者的蠟塊組織，所有患者術前均未接 受過西妥昔單抗(cetuximab)治療。從蠟塊中提取基因組DNA供以下的實驗應用。實施例1 用螢光定量PCR(FQ-PCR)檢測KRAS基因第12密碼子四種鹼基置換突 變(密碼子 I2GGT — GAT，GGT — GTT，GGT — GCT)。設計能特異性檢測上述三種鹼基置換突變的特異性Allglo 螢光定量檢測探針 各一條及PCR引物一對，各探針、引物序列分別具體如下PNA 序列為 PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，，如序列表中 SEQID NO AO 所 示； 針對GAT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針序列為 5，-MAR-TGGAGCTGATGGCG-MAR-3，，如序列表中 SEQ ID NO A3 所示；針對GTT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針序列為 5，-JUP-GTTGGAGCTGTTGGCGT-JUP-3，，如序列表中 SEQ ID NO A4 所示；針對GCT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針序列為 5，-SAT-TGGAGCTGCTGGCGT-SAT-3，，如序列表中 SEQ ID NO A5 所示；PCR 正向引物序列為:5，-TTA GCT GTA TCG TCAAGG CAC TC-3，，如序列表中 SEQ ID NO Al 所示；PCR反向引物序列為5'-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，，如序列表中 SEQ ID NO A2 所示。其中，PNA序列是抑制K-Ras基因突變區野生型基因擴增，針對GAT-12密碼子的突 變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針的5』和3』端均標記MAR(螢光報告/淬滅基團)；針 對GTT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針的5』和3』端均標記JUP (熒 光報告/淬滅基團)；針對GCT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 的螢光定量檢測探針的 5』和3』端均標記SAT (螢光報告/淬滅基團)。陽性對照樣品是存在K-Ras基因第12號 密碼子3種突變類型(GAT，GCT和GTT)的混合質粒基因組DNA。優化反應體系進行FQ-PCR的檢測反應體系為15 μ 1，PCR正向引物和PCR反 向引物各0. 15μ1(終濃度20μΜ)，三種突變型KRAS-Allglo 的螢光定量檢測探針 各0. 2 μ 1 (終濃度20 μ M)，PNA探針0. 3 μ 1 (終濃度20 μ M)，模板DNA 2. 5 μ 1 (終濃 度100-300ng/y 1)，PCR反應混合液(CS PCR Master Mix，購自上海超市生物技術公 司)7. 5 μ 1，補加ddH20至總體積為15 μ 1。螢光定量反應在ΑΒΙ7900檢測儀上進行。反應條件為95 °C變性5分鐘，95 °C 30秒，60 V 30秒，72 °C 1分鐘，擴增反應40循環。結果為在80例樣本中共檢測出9例樣本發生KRAS基因第12密碼子GGT — GAT 突變，5例樣品發生KRAS基因第12密碼子GGT — GTT突變，2例樣本發生KRAS基因第12密 碼子GGT — GCT突變。部分陽性樣本見圖1，圖IA示KRAS基因第12密碼子GGT — GAT突 變的部分樣品陽性擴增曲線；圖IB示KRAS基因第12密碼子GGT — GTT突變的部分樣品陽 性擴增曲線；圖IC示KRAS基因第12密碼子GGT — GCT突變的部分樣品的陽性擴增曲線。實施例2 用螢光定量PCR檢測KRAS基因第13密碼子一種鹼基置換突變(密碼子 13GGC — GAC)，第12密碼子三種鹼基置換突變(密碼子12GGT — GCT，GGT — AGT，GGT — CGT)設計能特異性檢測上述四種鹼基置換突變的特異性Allglo 螢光定量檢測探針 各一條及PCR引物一對，各探針、引物序列分別具體如下PNA 序列為 PNA probe-5，-CCTACGCCACCAGCTCC-3，，如序列表中 SEQID NO AO 所 示；針對GAC-13密碼子的突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針序列為 5，-MAR-AGCTGGTGACGTAGGC-MAR-3，，如序列表中 SEQ ID NO B3 所示；針對TGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針序列為 5，-JUP-GTTGGAGCTTGTGGCGT-JUP-3，，如序列表中 SEQ ID NO B4 所示；針對AGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針序列為 5，-URA-TGGAGCTAGTGGCGT-URA-3，，如序列表中 SEQ ID NO B5 所示；針對CGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針序列為 5，-SAT-TTGGAGCTCGTGGCGT-SAT-3，；如序列表中 SEQ ID NO B6 所示；PCR 正向引物序列為5'-TTA GCT GTA TCG TCA AGG CAC TC-3，，如序列表中 SEQ ID NO Al 所示；PCR反向引物序列為5'-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AAT ATA-3，，如序列表中 SEQ ID NO A2 所示。其中，PNA序列是抑制K-Ras基因突變區野生型基因擴增，針對GAC-13密碼子的 突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針B3的5，和3，端均標記MAR(螢光報告/淬滅基 團)；針對TGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 螢光定量檢測探針B4的5』和3』端均標 記JUP (螢光報告/淬滅基團)；針對AGT-12密碼子的突變型KRAS-Allglo 的螢光定量檢 測探針B5的5』和3』端均標記URA(螢光報告/淬滅基團)。針對CGT-12密碼子的突變型 KRAS-Allglo 的螢光定量檢測探針的5』和3』端均標記SAT(螢光報告/淬滅基團)。陽 性對照樣品B是存在K-Ras基因第13號密碼子一種突變類型(GAC)和第12密碼子三種突 變型(TGT，AGT和CGT)的混合質粒基因組DNA。優化反應體系進行FQ-PCR的檢測反應體系為15 μ 1，PCR正向引物和PCR反 向引物各0. 15μ 1(終濃度20μΜ)，四種突變型KRAS-Allglo 的螢光定量檢測探針探 針各0. 2 μ 1 (終濃度20 μ M)，PNA探針0. 3 μ 1 (終濃度20 μ M)，模板DNA2. 5 μ 1 (終濃 度100-300ng/y 1)，PCR反應混合液(CS qPCR Master Mix，購自上海超市生物技術公 司)7. 5 μ 1，補加ddH20至總體積為15 μ 1。螢光定量反應在ΑΒΙ7900檢測儀上進行。反應 條件為95 °C變性5分鐘，95 °C 30秒，60 V 30秒，72 °C 1分鐘，擴增反應40循環。結果為在80例樣本中共檢測出2例樣本發生KRAS基因第13密碼子GGC — GAC突變，1例樣品發生KRAS基因第12密碼子GGT — TGT突變，1例樣本發生KRAS基因第12 密碼子GGT — AGT突變。本組病例沒有發現KRAS基因第12密碼子GGT — CGT突變。部分 陽性樣本見圖2 圖2A示KRAS基因第13密碼子GGC — GAC突變的部分樣品陽性擴增曲線； 圖2B示KRAS基因第12密碼子GGT — TGT突變的部分樣品陽性擴增曲線；圖2C示KRAS基 因第12密碼子GGT — AGT突變的部分樣品的陽性擴增曲線。上述結果表明本發明的FQ-PCR法檢測腫瘤組織KRAS基因突變不僅是快速、高效 的，而且其結果的判讀非常明確、直觀，結果亦是可靠、特異的，結果可靠性的驗證可見該實 驗的實驗數據。最後所應當說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非對本發明保 護範圍的限制，儘管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當 理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質 和範圍。序列表 一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒及其檢測方法10PatentIn version 3. 2117DNA 人工序列 AO1cctacgccac cagctcc17117DNA 人工序列 Al2ttagctgtat cgtcaaggca ctc23124DNA 人工序列 A23gcctgctgaa aatgactgaa tata24114DNA 人工序列 A34
tggagctgat ggcg
1
17
DNA
人工序列A4
5
gttggagctg ttggcgt
1
15
DNA
人工序列A5
6
tggagctgct ggcgt
1
16
DNA
人工序列B3
7
agctggtgac gtaggc
1
17
DNA
人工序列B4
8
gttggagctt gtggcgt
1
15
DNA
人工序列B5
9
tggagctagt ggcgt
1
16
DNA
人工序列B6
10
ttggagctcg tggcgt
權利要求
一種K Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於，包括PCR混合反應液、肽核酸探針、突變型KRas AllgloTM螢光探針和陽性對照樣品。
2.根據權利要求1所述的K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於， 所述肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示。
3.根據權利要求1所述的K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於， 所述PCR混合反應液中含PCR正向引物和PCR反向引物，所述PCR正向引物的序列如SEQ ID NO Al所示，所述PCR反向引物的序列如SEQID NO A2所示。
4.根據權利要求1所述的K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於， 所述突變型 KRas-AllgloTM 螢光探針包括如 SEQ ID NO A3、SEQID NO A4、SEQ ID NO A5、 SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5禾口 SEQ ID NO B6所示的序列中的一種或多種。
5.根據權利要求4所述的K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於， 當所述突變型KRas-AllgloTM螢光探針包括如SEQ ID NO A3、SEQID NO A4和SEQ ID NO A5所示的序列中的一種或多種時，所述陽性對照樣品是存在K-Ras基因第12號密碼子三種 突變類型(GAT，GCT和GTT)的混合質粒基因組DNA。
6.根據權利要求4所述的K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒，其特徵在於， 當所述突變型 KRas-AllgloTM 螢光探針包括如 SEQ ID NO B3、SEQID NO B4、SEQ ID NO B5 和SEQ ID NO B6所示的序列中的一種或多種時，所述陽性對照樣品是存在K-Ras基因第13 號密碼子一種突變類型(GAC)和第12密碼子三種突變型(TGT、AGT和CGT)的混合質粒基 因組DNA。
7.一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測方法，其特徵在於，針對K-Ras基因設計 一對PCR引物、肽核酸探針，並針對K-Ras基因突變位點分別設計AllgloTM螢光探針，反應 體系中加入PCR反應液、PCR引物、肽核酸探針和AllgloTM螢光探針進行螢光定量PCR的 檢測。
8.根據權利要求7所述的一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測方法，其特徵在 於，所述的肽核酸探針的序列如SEQ ID NO AO所示。
9.根據權利要求7所述的一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測方法，其特徵在 於，所述的PCR引物如SEQ ID NO Al和SEQ ID NO A2所示。
10.根據權利要求7所述的一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測方法，其特徵在 於，所述的 AllgloTM 螢光探針包括如 SEQ ID NO A3、SEQ ID N0A4、SEQ ID NO A5、SEQ ID NO B3、SEQ ID NO B4、SEQ ID NO B5禾口 SEQ IDNO B6所示的序列中的一種或多種。
全文摘要
本發明提供了一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測試劑盒，包括PCR混合反應液、肽核酸探針、突變型K-Ras-AllgloTM螢光探針和陽性對照樣品。本發明還提供了一種K-Ras基因突變分型螢光定量PCR檢測方法先針對K-Ras基因設計一對PCR引物和肽核酸探針，針對K-Ras基因突變位點分別設計AllgloTM螢光探針，反應體系中加入PCR反應液、PCR引物、肽核酸探針和AllgloTM螢光探針進行螢光定量PCR的檢測。本發明採用了PNA技術，結合AllgloTM螢光探針技術，能快速、準確、高敏感度的檢測各種癌組織中K-Ras基因突變位點，時間短、操作簡單、判讀明確、直觀、安全。
文檔編號C12Q1/68GK101899496SQ20091003980
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月27日 優先權日2009年5月27日
發明者石大陸 申請人:廣州達健生物科技有限公司