四氟苄基衍生物及含有其成分的用於治療和預防中樞神經系統的急慢性神經變性疾病的...的製作方法

2023-05-29 16:36:21

專利名稱：四氟苄基衍生物及含有其成分的用於治療和預防中樞神經系統的急慢性神經變性疾病的 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及四氟苄基衍生物以及將其作為藥物有效成分的藥物組合物，更具體地，涉及一種對神經病學疾病和眼科疾病的治療和預防具有醫療效果的新型四氟苄基衍生物。
背景技術：
當代醫學的進步延長了人類的生命，而由此導致老年急慢性神經性疾病的上升，例如阿耳茨海默氏症、中風、帕金森症等。這些神經性疾病以疾病進程中特定神經元變性的不斷發展為特徵。由於成熟神經元細胞在其死亡後不能再生，在上述神經性疾病中神經元的死亡可能導致大腦基本功能(包括識別、感覺和行動功能)的不能治癒的損傷以及由此產生的經濟和社會的過重負擔。
在各種神經性疾病中，興奮毒性(exicitotoxicity)、氧化應激(oxidativestress)和細胞凋亡(apoptosis)被認為是神經元死亡的主要途徑，並通過各途徑特定的信號傳導途徑進行傳播。
穀氨酸鹽作為有興奮性神經遞質通過N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導緩慢興奮突觸傳遞和通過海人藻酸(kainate)或α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異噁唑丙酸(AMPA)受體介導快速興奮突觸傳遞。神經元在靜息狀態時，Mg2+以電位調控(voltage-dependent)方式阻塞NMDA受體通道。當刺激(物)引起膜去極化時，Mg2+從上述NMDA通道中被釋放出來，使得該通道容許Ca2+和Na+通過。NMDA受體的活化作用在包括學習和記憶的生理過程中起著重要的作用[Siegel G.J.et al.，Basic Neurochemistry，6thedition，Lippincott WilliamsWilkins，315-333(1999)]。除了生理作用，NMDA受體的短時過度活化作用能造成迅速發展的神經元死亡，而近20年來對NMDA受體介導的神經毒性的機理進行了廣泛的研究。
在1969年，Olney等人報導口服monodium穀氨酸鹽造成了小鼠和猴子大腦中神經元細胞的死亡[Olney，J.W.和Sharpe，L.G.，Science，166386-388(1969)；Olney，J.W.和Ho，O.L.，Nature，227(258)609-611(1970)]，表明穀氨酸鹽(所述興奮性神經遞質)介導了癲癇中神經元的興奮性和死亡[Olney，J.W.，Int.Rev.Neurobiol.，27337-62337-362(1985)]。通過NDMA受體的活化作用並依靠Ca2+的進入，穀氨酸鹽的給藥可導致培養的腦皮質神經元的死亡[Choi，D.W.，J.Neurosci.，7(2)369-379(1987)]。穀氨酸鹽的神經毒性(或興奮毒性)被認為是中風和癲癇中神經元死亡的主要途徑[Choi.D.W.，Neuron，1623-634(1988)]。大腦血液供應的中斷導致氧和葡萄糖的缺乏，致使能量(ATP)不足、依賴ATP的離子通道的功能紊亂及增加穀氨酸鹽釋放的膜去極化作用。能量缺乏也降低了神經膠質細胞對穀氨酸鹽的攝取。因此，穀氨酸鹽在突觸間隙中不正常地累積[Choi，D.W.and Rothman，S.M.，Annu.Rev.Neurosci.，13171-182(1990)；Benveniste，H et al.，J.Neurochem.，43(5)1369-1374(1984)]。過度累積的穀氨酸鹽主要通過NMDA受體的活化作用導致神經元細胞的死亡。實際上，據報導給予NMDA受體拮抗劑可減少缺氧-缺血腦損傷後的神經元死亡[Goldberg，M.P.et al.，J.Pharmac.Exp.Ther.，243784-791(1987)；Simon et al.，Science 226850-852(1984)；Sheardown，M.J.et al.，Science 247571-574(1990)]。
廣泛的證據表明興奮毒性還促成神經變性疾病中神經元的死亡。亨廷頓症(HD)的關鍵病理特徵包括GABAergic神經元的變性和紋狀體(striatal)區域的NADPH含心肌黃酶的神經元的選擇性捨棄。在紋狀體內注射NMDA或喹啉酸(NMDA受體激動劑)後觀察到這些HD的病理特徵[Ferrante，R.J et al.，Science，230(4625)561-563(1985)；Beal，M.F.et al.，Nature，321(6066)168-171(1986)；Koh，J.Y.et al.，Science，234(4772)73-76(1986)]。肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)伴隨著上運動神經元和下運動神經元的變性，其特徵為神經性萎縮、虛弱和肌束抽搐。儘管ALS的發病機理有待於解答，但人們推測興奮毒性參與了ALS過程。尤其是ALS患者表現出穀氨酸鹽的合成和運輸的缺陷和細胞外穀氨酸鹽水平的升高[Rothstein，J.D.，Clin.Neurosci.，3(6)348-359(1995)；Shaw，P.J.andInce，P.G.，J.Neurol.，244 Suppl 2S3-14(1997)]。
儘管NMDA受體介導的興奮毒性是中風和神經變性疾病的成因，NDMA受體拮抗劑的治療潛力受制於在大腦中的意料不到的副反應。尤其是NDMA受體拮抗劑的全身給藥削弱了大腦的正常功能，並可造成成年大鼠大腦的大範圍神經元損傷[Olney et al.，Science 2441360-1362(1989)]。上述神經精神病理學副作用是由高親和性的NMDA受體拮抗劑(如苯環己哌啶)和相關的NMDA受體拮抗劑(如MK-801(地佐環平(dizocilpine maltate)、替來他明(tiletamine)和克他命)產生的，且可通過給予具有低親和性和快速動力學反應的通道阻斷型NMDA受體拮抗劑來克服[Rogawski，Amino Acids 19133-149(2000)]。
自由基介導神經性疾病及全身性組織損傷中發生的神經元死亡[Halliwell，B.and Gutteridge，J.M.，Mol.Aspects.Med.，8(2)89-193(1985)；Siesjo，B.K.et al.，Cerebrovasc.Brain Metab.Rev.，1(3)165-211(1989)；Schapira，A.H.，Curr.Opin.Neurol.，9(4)260-264(1996)]。自由基是在缺氧-缺血或外傷性大腦及脊髓損傷後在腦的變性區域產生的。清除自由基的抗氧化劑或操作(maneuvers)能夠降低由缺氧-缺血或外傷性損傷造成的大腦損傷。[Flamm，E.s.et al.，Stroke，9(5)445-447(1978)；Kogure，K.et al.，Prog.Brain Res.63237-259(1985)；Chan，P.H.J.Neurotrauma.，9 Suppl 2S417-423(1992)；Faden，Pharmacol.Toxicol.7812-17(1996)]。廣泛的證據表明自由基在神經變性疾病中大腦變性區域內產生自由基，其產生可能由於ALS中的Cu/Zn超氧化物歧化酶的點突變[Rosen et al.，Nature 36259-62(1993)]，還原穀胱甘肽、穀胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的減少，帕金森症中塞梅林氏神經節(substatia nigra)中鐵的增加[Sofic，E.et al.，J.Neural Transm.，74199-205(1988)；Fahn，S.and Cohen，G.，Ann.Neurol.，32(6)804-812(1992)]，脂質、核苷酸及蛋白的氧化，變性的神經組織中鐵的增加，由患阿耳茨海默氏症大腦中的β-澱粉狀蛋白產生的自由基[Schubert，D.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(6)1989-1993(1995)；Richardson，J.S.et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.777362-367(1996)]，以及HD中線粒體的功能障礙[Dexter，D.T.et al.，Ann Neurol.32SupplS94-100(1992)]。因此，抗氧化劑對此類神經變性疾病具有神經保護作用[Jenner，Pathol.Biol.(Paris.)4457-64(1996)；Beal，Ann.Neurol.38357-366(1995)]。
鋅(Zn2+)是一種過渡金屬，其在大腦中大量存在並起到動力學作用。在細胞內部，鋅與金屬蛋白結合控制蛋白的酶活性和結構穩定性。此外，鋅通過與各種轉錄因子結合來調節基因的表達。在CNS中，鋅位於穀氨酸鹽能性(glutamatergic)神經元的突觸終端，以活性依賴的形式被釋放，並調節各種神經遞質受體及離子通道的活性。
在癲癇、缺血、外傷和阿耳茨海默氏症(AD)中觀察到Zn2+介導神經變性過程。將海人藻酸(誘發癲癇的興奮毒素)進行中樞給藥，引起Zn2+遷移進入幾個前腦區域的後突觸變性神經元中。在缺血性和外傷性腦病中也發現鋅遷移到鄰近神經元中，對其遷移的阻塞可抑制神經元細胞的死亡[Frederickson，C.J.and Bush，A.I.，Biometals.14353-366(2001)；Weiss et al.，Trend.Pharmacol.Sci.21395-401(2001)]。已知鋅通過Ca2+可透過的NMDA和AMPA/KA受體、電位開關的Ca2+通道或鋅運輸蛋白質進入神經元，並通過產生活性氧類物質的NADPH氧化酶的活化作用來誘導神經元的死亡。在AD的細胞外斑(extracellular plaque)和變性神經元中發現Zn2+，其很可能參與AD中神經元的變性[Suh et al.，Brain Res.852274-278(2000)；Bush et al.，Science 2651464-1467(1994)；Lee et al.，Proc.Natl.acad.Sci.U.S.A.997705-7710(2002)]。因此，已經提出將抑制鋅的釋放和毒性作為治療和預防阿耳茨海默氏症的新策略[Fredrickson andBush，Biometals；14353-66(2001)]。
如上所述，在神經系統的各種急性和神經變性疾病中，NMDA受體-介導的興奮毒性、氧化應激和鋅參與引起神經元的死亡。因此，需要發展阻斷每種神經元死亡途徑的有效治療藥物來治療此類災難性的神經性疾病。
我們曾研究並開發了對興奮毒性或氧化應激具有多重神經保護效果的神經保護藥物，並成功地發明了可用於治療中風、外傷和某些神經變性疾病的四氟苄基衍生物。
發明公開由本發明人進行的關於治療中樞神經系統紊亂的研究形成了本發明，研究發現了對神經性疾病的細胞培養和生物模型中出現的各種形式的神經元死亡具有神經保護活性的新型四氟苄基衍生物。
因此，本發明的一個目的是提供一種新型四氟苄基衍生物。
本發明的另一目的是提供用於治療和預防神經性疾病和眼科疾病的藥物學上有效的組合物。
本發明的一個方面提供一種以如下化學式1表示的新型四氟苄基衍生物[化學式1] 其中，R1、R2和R3為氫或滷素，R4為羥基、烷基、烷氧基、滷素、滷代烷氧基、烷醯氧基(alkanoyloxy)或硝基，及R5為羧酸、C1-C4烷基取代的羧酸酯、醯胺(carboxyamide)、磺酸、滷素或硝基。
本發明的另一個方面，提供了一種用於治療和預防神經性疾病和眼科疾病的藥物組合物，其包括所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
本發明提供一種以如下化學式1表示的新型四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽。
其中，R1、R2和R3為氫或滷素，R4為羥基、烷基、烷氧基、滷素、滷代烷氧基、烷醯氧基或硝基，及R5為羧酸、C1-C4烷基取代的羧酸酯、醯胺、磺酸、滷素或硝基。
在本文中，烷基基團為C1-C4烷基，且優選為C1-C2烷基。上述烷基具體包括甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基或叔丁基。
烷氧基基團為C1-C4烷氧基，且優選為C1-C2烷氧基。上述烷氧基具體包括甲氧基、乙氧基或丙氧基。
滷素可以被氟、氯、溴或碘取代。
烷醯氧基是指C2-C10的烷醯氧基，優選為C3-C5的烷醯氧基。上述烷醯氧基具體包括乙醯氧基(ethanoyloxy)、丙醯氧基(propanoyloxy)或環己基碳醯氧基(cyclohexanecarbonyloxy)。
在羧酸酯中的碳可以被甲基、乙基、異丙基或丁基所取代的。
化學式1中所示的化合物中特別重要的化合物如下2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄氨基)苯甲酸(在下文中用「2-羥基-TTBA」表示)，2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基苄氨基)苯甲酸，2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄氨基)-2-三氟甲基苯甲酸，2-硝基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚，2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚(在下文中用「2-氯-TTP」表示)，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲醯胺(在下文中用「2-羥基-TTA」表示)，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯磺酸(在下文中用「2-羥基-TTS」表示)，
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸甲酯，2-乙醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(在下文中用「2-乙基-TTBA」表示)，2-丙醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(在下文中用「2-丙基-TTBA」表示)，或2-環己基碳醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(在下文中用「2-環己基-TTBA」表示)。
但是，上述化合物僅是本發明的代表，本發明還可包括更多化合物。
本發明提供如化學式1所示的四氟苄基衍生物，及用於治療和預防神經性疾病和眼科疾病的包括藥物可接受的鹽形式的上述有效成分的藥物組合物。
作為用於醫藥用途的藥物，化學式1所示的化合物的鹽是無毒的，並且是藥物可接受的。可以應用各種鹽來製備藥物可接受的鹽，包括本發明的無毒化合物。
本發明化合物的藥物可接受的鹽包括鹼金屬(如鋰、鈉或鉀)，和鹼土金屬(如鈣或鎂)。通過將藥物可接受的無毒酸(如鹽酸、富馬酸、馬來酸、琥珀酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、碳酸或磷酸)的溶液與本發明的化合物反應製備酸加合鹽。
本發明的化學式1化合物可以用於治療腦血管和神經系統疾病和症狀中的常規或病理性神經變性疾病。具體而言，上述化學式1所示的化合物用於預防和治療血栓栓塞、缺血性中風、出血性中風、腦血管痙攣、腦老化、外傷性腦損傷、外傷性脊髓損傷、心搏停止、動脈低血壓(hypotention)、低血糖症、缺氧症和組織缺氧。此外，本發明的化學式1化合物可有效地用於緩解神經變性疾病，如亨廷頓症、阿耳茨海默氏症、老年痴呆、Pick′s症、Korsakov′s綜合症、小腦退化症(olivopontocerebellardegeneration)、肌萎縮性脊髓側索硬化(ALS)、帕金森症、唐氏綜合症、戊二酸血症(Glutaric acidaemia)、癲癇症、多發梗塞性痴呆(multi-infarctdementia)和腦炎。他們被用於治療眼科疾病，如青光眼、黃斑變性、糖尿病性視網膜病變、眼色素層炎。此外，他們被用於預防和治療藥物成癮、抑鬱症和疼痛。
本發明的組合物可進行口服給藥、靜脈內注射或非口服給藥，並可以製成各種形式，如片劑、膠囊、粉劑、顆粒劑、無菌溶液、懸浮液或直腸給藥的栓劑。可以使用藥物載體加上藥物稀釋溶液將所述組合物的主要有效成分製成固體片劑，所述載體(如常用的片劑成分)例如玉米糊精、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、脫鈣磷酸鹽(decalciumphosphate)或樹脂。應用適當工業領域中公知的塗覆方法等可將本發明中藥物組合物的片劑或丸劑製成方便給藥的緩釋形式。例如，片劑或丸劑可以由內部給藥成分和外部給藥成分組成。可以在所述片劑或丸劑的內部給藥成分之外包裹外部給藥成分。本發明組合物的用於口服給藥或注射的液體形式包括溶液、適當調節口味的糖漿、水溶性懸浮液、非水溶性懸浮液、食用油製成的乳狀液(所述食用油包括棉油、芝麻油、椰子油或花生油)、酏劑及類似藥物載體。在製造水溶性懸浮液中可以使用黃 膠、阿拉伯膠、褐藻酸鈉鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或合成或天然橡膠(如明膠)作為適當的分散或懸浮助劑。
根據各種相關因素如疾病、年齡、性別、體重和患者疾病的程度等來確定治療神經變性的藥量。
可以通過如下反應方案來合成本發明的四氟苄基衍生物。但是，所述方案中所示的化合物僅是本發明的代表，本發明可包括更多化合物。
所述的四氟苄基衍生物由下列反應合成。首先，將3位和4位氫分別被R5和R4所取代的硝基苯化合物在3大氣壓下氫化12小時(反應條件a)。所生成的苯胺化合物與2，3，5，6-四氟-4-甲基苄基溴，在DMF中在三乙胺存在的條件下反應12小時，獲得目標物四氟苄基衍生物(反應條件b)。
在上述方案中，R1、R2和R3表示氫或滷素；R4表示羥基、烷基、烷氧基、滷素、滷代烷氧基、烷醯氧基、硝基；R5表示羧酸、羧酸酯、醯氨、磺酸、滷素和硝基基團。
為合成R4為羥基，且R5為醯胺基的化合物，首先通過在催化量的c-H2SO4存在下與三氟甲基乙酸酐反應將5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟苄氨基)苯甲酸上的羥基和胺基用三氟取代基保護起來(反應條件a)。然後，將所生成的2-羧基-5-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄基]-(2，2，2-三氟乙醯基)氨基]苯基酯化合物與SOCl2反應，其後與碳酸銨反應獲得2-氨基甲醯基-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄基-(2，2，2-三氟乙醯基)氨基]苯基酯化合物(反應條件b)，然後將其用HCl溶液水解獲得目標醯胺化合物(反應條件c)。在此方案中，R1、R2、R3和R4是相同基團，其為上文所定義的，而R5為C1-C4取代的烷基基團。
合成實施例1
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(2-羥基-TTBA)的製備在室溫和氮氣環境下，將5-氨基水楊酸(1.02g，6.66mmole，購自Aldrich Chemical Company，USA，A7，980-9)和三乙胺(1ml)溶於乾燥的DMF(80ml)中，向溶液中加入2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.23g，7.18mmole)(Aldrich，40，640-6)。將反應混合物在室溫條件下攪拌2小時，然後在真空下除去溶劑。用乙酸乙酯將反應混合物稀釋，然後用乙酸乙酯萃取反應混合物。有機層用水和鹽水洗滌，其後用無水MgSO4乾燥。蒸出溶劑後，殘餘物在醚/正己烷(1∶10)中重結晶，獲得白色固體物質2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸1.60g(收率64％)。
mp 179℃，1H-NMR8.0(s，1H)，7.3(d，1H)，6.7(t，1H)，5.5(s，2H)，IR(KBr壓片)3386，1741，1500cm-1，C15H8F7NO3的元素分析

合成實施例2
2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備按照與合成實施例1相似的步驟，使用5-氨基-2-硝基苯甲酸(1.03g，5.65mmole)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.01g，6.04mmole)(ACROS，33074-0010)，獲得淺黃色固體2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸1.50g(收率76.3％)。
mp 121℃，1H-NMR8.0(d，1H)，7.3(s，1H)，6.7(d，1H)，5.5(s，2H)，IR(KBr壓片)3417，1703，1504cm-1，C15H7F7N2O4的元素分析

合成實施例3
2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備按照與合成實施例1相似的步驟，使用5-氨基-2-氯苯甲酸(1.02g，5.94mmole)(ACROS，32525-5000)，DMF(50ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.16g，6.99mmole)，獲得淡棕色固體2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸2.04g(收率85.5％)。
mp 58℃，1H-NMR7.26(d，1H)，7.24(s，1H)，6.7(d，1H)，4.12(s，2H)，IR(KBr壓片)3402，1720，1494，1434，929cm-1，HPLC(0.01％TFA-乙酸乙酯(TFA-ethyl acetate)∶0.1％TFA-水＝80∶20，Rt＝4.2分)97％純度，C15H7ClF7NO4的元素分析

合成實施例3
2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備(4-1)5-氨基-2-溴苯甲酸的製備將溶於甲醇中的2-溴-5-硝基苯甲酸(1.10g，4.06mmol)(Aldrich，38，184-5)和活化的Pd-C(43.62mg，0.41mmol)(Aldrich，20，569-9)混合物在30psi的氫氣壓力下氫化4小時。混合物過濾後，將濾液濃縮獲得淺黃色固體5-氨基-2-溴苯甲酸0.80g(收率91.2％)。
IR(KBr壓片)3111，2558，2499，1716，1676cm-1。
(4-2)2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備按照與合成實施例1相似的步驟，通過使用由合成實施例(4-1)製備的5-氨基-2-溴苯甲酸(1.05g，6.12mmole)、DMF(50ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.16g，6.99mmole)，獲得淺黃色固體2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸2.02g(收率76.9％)。
mp 70℃，1H-NMR7.42(d，1H)，7.3(s，1H)，6.9(d，1H)，5.5(s，2H)，IR(KBr壓片)3438，1695，1491，1425，939cm-1，HPLC(0.1％TFA-乙酸乙酯∶0.1％TFA-水＝80∶20，Rt＝4.5分)99％純度，C15H7BrF7NO2的元素分析

合成實施例5
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基苄氨基)苯甲酸的製備按照與合成實施例1相似的步驟，通過使用4-甲基-2，3，5，6-四氟-苄基溴(1.23g，7.18mmole)(Aldrich，40，646-6)代替2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴，獲得白色固體2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基苄氨基)苯甲酸1.60g(收率64.0％)。
mp 212℃，1H-NMR8.0(s，1H)，7.3(d，1H)，6.7(t，1H)，5.5(s，2H)，2.2-2.3(s，3H)，IR(KBr壓片)3386，1741，1500cm-1，C15H11F4NO3的元素分析

合成實施例6
2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備(6-1)2-甲基-5-硝基苯甲酸的製備在0℃下，向溶有2-甲基苯甲酸(3.05g，22.3mmole)(ACROS，13904-0010)的c-HNO3(20ml)中小心加入濃H2SO4(15ml)。所得溶液在100-120℃回流5小時。待反應混合物冷卻至室溫，加入50ml碎冰。將所得沉澱過濾，水洗並乾燥，獲得3.90g(收率97.5％)2-甲基-5-硝基苯甲酸白色固體。
IR(KBr壓片)1531，1350cm-1。
(6-2)5-氨基-2-甲基苯甲酸的製備按照與合成實施例(4-1)相似的步驟，通過使用由合成實施例(6-1)製備的2-甲基-5-硝基苯甲酸(4.10g，22.6mmole)，獲得2.01g(收率60.0％)5-氨基-2-甲基苯甲酸白色固體。
IR(KBr壓片)3437，3336，1633，1400cm-1。
(6-3)2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備按照與合成實施例1相似的步驟，通過使用5-氨基-2-甲基苯甲酸(2.06g，15.0mmole)、DMF(60ml)、TEA(4ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(5.52ml，17.7mmole)，獲得1.50g(收率27.0％)2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸黃色固體。
mp 84℃，1H-NMR7.32(s，1H)，7.3(d，1H)，6.9(d，1H)，5.5(s，2H)，2.2(s，3H)，IR(KBr壓片)3417，1716，1496cm-1，C16H10F7NO2的元素分析

合成實施例7
2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備
(7-1)2-甲氧基-5-硝基苯甲酸的製備按照與合成實施例(6-1)相似的步驟，通過使用2-甲氧基苯甲酸(2.10g，13.79mmole)(ACROS，17375-2000)，獲得2.50g(收率97.0％)2-甲氧基-5-硝基苯甲酸白色固體。
IR(KBr壓片)3099，2986，2965，1736，1547cm-1。
(7-2)5-氨基-2-甲氧基苯甲酸的製備按照與合成實施例(4-1)類似的步驟，通過使用由合成實施例(7-1)製備的2-甲氧基-5-硝基苯甲酸(4.10g，22.6mmole)，獲得1.90g(收率98.0％)5-氨基-2-甲氧基苯甲酸棕色固體。
IR(KBr壓片)1394，1220cm-1。
(7-3)2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備按照與合成實施例1相似的步驟，通過使用5-氨基-2-甲氧基苯甲酸(2.10g，12.7mmole)、DMF(50mL)、TEA(6ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(2.00ml，14.0mmole)，得到1.50g(收率31.5％)2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸黃色固體。
mp 94℃，1H-NMR 7.42(s，1H)，6.4(d，1H)，6.2(d，1H)，5.5(s，2H)，3.73(s，3H)，IR(KBr壓片)3429，1730，1496cm-1。
C16H10F7NO3的元素分析

合成實施例8
5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)-2-三氟甲氧基苯甲酸的製備(8-1)5-硝基-2-三氟甲氧基苯甲酸的製備表2

-4-三氟甲基苄氨基)苯酚微紅色固體。
mp 126-128℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ4.23(d，2H)，6.93(m，2H)，7.12(s，1H)，13C NMR(DMSO-D6)δ36.36，105.48，120.63，122.64，123.32，136.17，140.86，142.34，144.06，144.83，146.44，151.23，IR(純的)3391，3255，1545，1339cm-1，C14H7F7N2O3的元素分析

合成實施例10
2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚的製備按照與合成實施例1相似的步驟，通過使用4-氨基-2-氯苯酚(3.00g，19.6mmole)、DMF(80ml)、TEA(0.5ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.40g，8.36mmole)，獲得2.00g(收率76.0％)的2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚黃色固體。
mp 52℃，1H-NMR(CDCl3)6.9(d，1H)，6.7(s，1H)，6.5(d，1H)，4.4(s，2H)，IR(KBr壓片)3382，1687，1617，1586cm-1，C14H7F7ClNO的元素分析

合成實施例11
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲醯胺的製備
(11-1)2-羧基-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄基]-(2，2，2-三氟乙醯基)氨基]苯基三氟乙酸酯的製備在10℃和氮氣環境下，向2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸(2.00g，5.12mmole)和三氟乙酸酐(15ml)溶液中加入C-H2SO4(0.50ml)。反應混合物在室溫下攪拌20分鐘，然後用冰(10g)冷卻。真空除溶劑後，將殘餘物溶於乙酸乙酯(50ml)中。有機層用下列物質洗滌，水(20ml×2)、10％NaHCO3(20ml×3)、0.5N HCl(20ml×2)和水(20ml)。該有機層用無水Na2SO4乾燥。蒸出溶劑後，殘餘物在乙酸乙酯/己烷(1∶10)中重結晶，獲得1.40g(收率47％)的2-羧基-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄基]-(2，2，2-三氟乙醯基)氨基]苯基三氟乙酸酯黃色固體。
mp 174-180℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ5.16(d，2H)，6.94(d，1H)，7.44(d，1H)，7.81(s，1H)，13C-NMR(DMSO-d6)δ43.03，113.2，114.3，117.2，117.8，118.9，128.7，130.2，135.5，141.8，143.8，144.3，146.2，146.3，155.2，155.5，161.6，170.5，IR(純的)1711，1673，1498，1331，724cm-1。
(11-2)2-氨基甲醯-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基-(2，2，2-三氟乙醯基)氨基]苯基三氟乙酸酯的製備在40℃和氮氣環境下，向2-羧基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基-(2，2，2-三氟乙醯基)氨基)苯基三氟乙酸酯(600mg，1.05mmole)的無水二氯甲烷(15ml)溶液中加入SOCl2(1.18ml，21.0mmole)。反應混合物攪拌1小時後，真空除去溶劑。所得殘餘物用無水二氯甲烷(60ml)溶解，並加入碳酸銨(分析含量＞30％，2.00g)。反應混合物攪拌1小時後，過濾除去剩餘的碳酸銨。有機層水洗(40ml×3)，然後用無水Na2SO4乾燥。蒸出溶劑後，殘餘物在二氯甲烷/己烷(1∶10)中重結晶，獲得370mg(收率61％)的2-氨基甲醯-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基-(2，2，2-三氟乙醯基)氨基]苯基三氟乙酸酯白色固體。
mp 179-180℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ5.05(d，2H)，6.91(d，1H)，7.20(d，1H)，7.62(s，1H)，13C NMR(DMSO-d6)δ42.31，114.05，114.39，117.25，118.28，118.60，127.47，128.43，134.14，141.66，143.72，144.20，146.26，155.48，161.19，170.32，IR(純的)3415，3202，1692，1673，1498，1331cm-1。
(11-3)2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲醯胺的製備在40℃和氮氣環境下，向溶於甲醇(8ml)和水(3ml)的2-氨基甲醯-4-[2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基-(2，2，2-三氟乙醯基)氨基]苯基三氟乙酸酯(300mg，0.52mmole)溶液中加入c-HCl(2.0ml)。將反應混合物攪拌24小時後，真空除去有機溶劑。殘餘物用乙酸乙酯(20ml×3)萃取。有機層用水洗，其後用無水Na2SO4乾燥。蒸出溶劑後，殘餘物在二氯甲烷/己烷中重結晶，獲得120mg(收率60％)的2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲醯胺白色固體。
mp 143-145℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ4.37(s，2H)，6.63(d，LH)，6.76(d，1H)，7.14(s，1H)，13C NMR(DMSO-d6)6 36.25，111.20，112.36，117.44，121.71，123.29，123.46，139.87，141.61，143.55，145.86，146.07，153.12，171.56，IR(純的)3453，3415，3202，1692，1673，735cm-1。
合成實施例12
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯磺酸的製備按照與合成實施例1相似的步驟，通過使用4-氨基-2-羥基苯磺酸(1.00g，5.30mmole)、DMF(10ml)、TEA(1.0ml)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(0.88g，5.30mmole)，獲得0.61g(收率28.0％)的2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯磺酸黃色固體。
mp約300℃，1H-NMR(DMSO-D6)δ4.28(s，2H)，5.58(m，2H)，6.82(s，1H)，13C NMR(DMSO-D6)δ32.08，106.41，111.39，112.10，119.15，119.33，119.51，126.11，135.09，137.17，139.17，139.70，139.89，140.40，140.59，141.61，IR(純的)3427，3227，1492，1331，1196，1135，628cm-1。
合成實施例13
2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸甲酯的製備(13-1)5-氨基-2-羥基苯甲酸甲酯的製備在0℃條件下，向5-氨基水楊酸(3.00g，19.6mmole)的甲醇(80ml)溶液中加入c-H2SO4(8ml)。將反應混合物回流6小時後，真空除去溶劑。所得殘餘物用乙酸乙酯和水分層。有機層用水洗滌(40ml×3)，並用無水MgSO4乾燥。蒸出溶劑後，將殘餘物在乙酸乙酯/己烷中重結晶，獲得2.50g(收率76％)的5-氨基-2-羥基苯甲酸甲酯的黃色固體。
1H-NMR(CDCl3)δ7.2(s，1H)，6.7(d，1H)，6.6(d，1H)，IR(KBr壓片)3406，3327，2950，1672，1616，1492，1440，788cm-1。
(13-2)2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸甲酯的製備按照與合成實施例1相似的步驟，通過使用5-氨基-2-羥基苯甲酸甲酯(2.00g，11.9mmole)、DMF(60ml)、TEA(0.5ml)和2，3，5，6-四氟-4-甲基苄基溴(2.60g，14.3mmole)，獲得3.20g(收率85.0％)的2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸甲酯淺黃色固體。
mp127℃，1H-NMR(CDCl3)δ7.15(s，1H)，6.9(d，1H)，6.7(d，1H)，4.5(s，2H)，3.9(s，3H)，IR(KBr壓片)3382，1687，1617，1586cm-1，C16H10F7NO3的元素分析

合成實施例14
2-乙醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備(14-1)5-叔丁氧基羰基氨基-2-羥基苯甲酸的製備室溫下，將溶於DMF(20.0ml)的5-氨基水楊酸(1.01g，6.59mmole)、Di-BOC(2.87g，13.1mmol)和TEA(1.0ml)的混合物攪拌2小時。將反應混合物濃縮後，殘餘物溶於乙酸乙酯。將有機層水洗並用無水Na2SO4乾燥。在蒸出溶劑後，將殘餘物在乙酸乙酯/己烷中重結晶，獲得1.42g(收率84％)的5-叔丁氧基羰基氨基-2-羥基苯甲酸白色固體。
mp282℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，1.4～1.6(s，9H)，13C NMR(DMSO-d6)δ171.93，156.50，152.97，131.06，126.36，119.39，117.03，113.13，79.05，28.42。
(14-2)2-乙醯氧基-5-叔丁氧基羰基氨基苯甲酸的製備向溶有5-叔丁氧基羰基氨基-2-羥基苯甲酸(1.02g，4.02mmole)的DMF(20.0ml)溶液中加入乙醯氯(39mg，4.83mmole)和碳酸鉀(555mg，4.02mmole)。將反應混合物在室溫下攪拌4小時。反應混合物濃縮後，將殘餘物溶於乙酸乙酯中。有機層用水和鹽水洗滌，並用無水Na2SO4乾燥。蒸出溶劑後，殘餘物在乙酸乙酯/己烷中重結晶，獲得0.62g(收率52％)的2-乙醯氧基-5-叔丁氧基羰基氨基苯甲酸白色固體。
mp76-78℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，2.0～2.1(s，3H)，1.4～1.6(s，9H)，13C NMR(DMSO-d6)δ171.88，165.59，156.49，144.71，131.27，124.06，79.64，28.441，21.13。
(14-3)2-乙醯氧基-5-氨基苯甲酸的製備將2-乙醯氧基-5-叔丁氧基羰基氨基苯甲酸(1.01g，3.42mmole)溶於TFA/CH2Cl2(20.0ml.1∶1v/v)中，在室溫下將混合物攪拌30分。混合物濃縮後，將殘餘物溶於乙醚中。將剩餘的殘渣在乙酸乙酯/己烷中重結晶，獲得0.65g(收率97％)的2-乙醯氧基-5-氨基苯甲酸白色固體。
mp133-136℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.5～7.6(s，1H)，7.2～7.3(d，1H)，7.0～7.1(d，1H)，2.1～2.2(s，3H)，13C NMR(DMSO-d6)δ170.83，165.57，143.40，124.41，123.45，121.09，118.64，113.98，30.98。
(14-4)2-乙醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備按照與合成實施例1相似的步驟，通過使用由合成實施例(14-3)製備的2-乙醯氧基-5-氨基苯甲酸(0.81g，4.10mmole)、DMF(15ml)、TEA(0.1ml)、四丁基碘化銨(5mg)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.02ml，6.15mmole)，獲得0.92g(收率53.0％)的2-乙醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸白色固體。
mp185-187℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ21.6(s，3H)，4.46(s，2H)，6.82(d，1H)，6.88(d，1H)，7.17(s，1H)，13C NMR(DMSO-d6)δ21.64，3637，114.36，116.97，123.94，127.78，124.81，141.40，142.44，144.44，145.04，145.84，146.85，166.35，170.18，IR(KBr壓片)3410，1747，1705，1489cm-1，C17H10F7NO4的元素分析

合成實施例15
2-丙醯氧基-5-(2、3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備
(15-1)5-叔丁氧基羰基氨基-2-丙醯氧基苯甲酸的製備依照與合成實施例(14-2)相似的步驟，通過使用丙醯氯(446mg，4.82mmole)，獲得0.71g(收率57.0％)的5-叔丁氧基羰基氨基-2-丙醯氧基苯甲酸白色固體。
mp137-142℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，2.5～2.6(t，2H)，1.4～1.6(s，9H)，1.0～1.2(q，3H)，13C NMR(DMSO-d6)δ172.689，165.598，152.804，144.674，137.287，124.045，79.618，28.358，27.259，9.080。
(15-2)5-氨基-2-丙醯氧基苯甲酸的製備按照與合成實施例(14-3)相似的步驟，通過使用5-叔丁氧基羰基氨基-2-丙醯氧基苯甲酸(1.01mg，3.26mmole)，獲得0.67g(收率97.0％)的5-氨基-2-丙醯氧基苯甲酸白色固體。
mp213-220℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.5～7.6(s，1H)，7.2～7.3(d，1H)，7.0～7.1(d，1H)，2.4～2.6(t，2H)，1.0～1.2(q，3H)，13C NMR(DMSO-d6)δ172.78，165.35，145.54，137.100，124.90，124.76，124.23，121.72，27.32，9.10。
(15-3)2-丙醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備按照與合成實施例(14-4)相似的步驟，通過使用由實施例(15-2)中製備的5-氨基-2-丙醯氧基苯甲酸(0.32g，1.53mmole)、DMF(10ml)、TEA(0.05ml)、四丁基碘化銨(3mg)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(0.38ml，2.30mmole)，獲得0.34g(收率51.0％)的2-丙醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸白色固體。
mp188-191℃，1H-NMR(丙酮-d6)δ1.17(t，3H)，2.06(q，2H)，4.67(s，2H)，6.94(m，2H)，7.37(s，1H)，
13C NMR(丙酮-d6)δ8.65，27.41，36.34，114.76，117.27，123.57，124.16，124.59，141.56，142.44，145.29，145.31，165.29，172.77，IR(KBr壓片)3414，1745，1702，1491cm-1，C18H18F7NO4的元素分析

合成實施例16
2-環己基碳醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備(16-1)5-叔丁氧基羰基氨基-2-環己基碳醯氧基苯甲酸的製備按照與合成實施例(14-2)相似的步驟，通過使用環己基碳醯氯(707mg，4.82mmole)，獲得0.72g(收率49.0％)的5-叔丁氧基羰基氨基-2-環己基碳醯氧基苯甲酸白色固體。
mp68-74℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.9～8.0(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.8～6.9(d，1H)，2.4～2.6(t，1H)，1.0～2.0(m，19H)。
(16-2)5-氨基-2-環己基碳醯氧基苯甲酸的製備按照與合成實施例(14-3)相似的步驟，通過使用5-叔丁氧基羰基氨基-2-環己基碳醯氧基苯甲酸(1.01mg，2.78mmole)，獲得0.70g(收率96.0％)的5-氨基-2-環己基碳醯氧基苯甲酸白色固體。
mp116-121℃，1H-NMR(DMSO-d6)δ7.5～7.6(s，1H)，7.4～7.5(d，1H)，6.9～7.0(d，1H)，2.4～2.6(t，1H)，1.0～2.0(m，10H)，13C NMR(DMSO-d6)173.87，170.74，165.60，160.09，158.61，158.27，143.14，140.71，130.03，124.66，123.44，121.70，119.12，118.61，113.81，42.42，31.25，28.94，25.65，22.38，14.29。
(16-3)2-環己基碳醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸的製備按照與合成實施例(14-4)相似的步驟，通過使用由合成實施例(16-2)製備的5-氨基-2-環己基碳醯氧基苯甲酸(1.03g，3.95mmole)、DMF(15ml)、TEA(0.10ml)、四丁基碘化銨(10mg)和2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄基溴(1.01ml，5.92mmole)，獲得0.95g(收率49.0％)的2-環己基碳醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸白色固體。
mp190-193℃，1H-NMR(丙酮-d6)δ1.20～1.57(m，6H)，1.64～1.81(m，4H)，2.53(m，1H)，4.67(s，2H)，6.90(d，1H)，6.96(d，1H)，7.36(s，1H)，13C NMR(丙酮-d6)δ25.57，26.07，36.23，43.13，114.67，117.21，122.21，122.36，124.45，124.56，142.32，142.74，144.21，145.24，146.82，165.29，173.96，IR(KBr壓片)3402，1724，1707，1491cm-1，C22H18F7NO4的元素分析

附圖的簡要說明通過下面結合附圖的詳細說明，可以更清楚地理解本發明的上述及其它目的、特徵及其它優點，其中

圖1a.2-羥基-TTBA對NMDA-誘導的興奮毒性的作用將小鼠皮質細胞培養物(DIV 12-14)暴露於300μM NMDA中10分鐘，單獨地或含有3-300μM的2-羥基-TTBA。24小時後，通過測量釋放到浸泡介質中的LDH的水平來分析神經元的死亡狀況(平均數±SEM(每種條件n＝9-12個培養孔)，調節LDH的平均流出值，假清洗24小時後(＝0)，以及持續暴露於500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA(方差分析)和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖1b.2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環己基-TTBA對NMDA-誘導的興奮毒性的作用。
將小鼠皮質細胞培養物(DIV 12-14)暴露於300μM NMDA中10分鐘，單獨地(□)或含有3-300μM的2-羥基-TTS(●)、2-羥基-TTA(○)、2-乙基-TTBA()、2-丙基-TTBA()或2-環己基-TTBA(■)。24小時後，通過測量釋放到浸泡介質中的LDH的水平來分析神經元的死亡狀況(平均數±SEM(每種條件n＝9-12個培養孔)，調節LDH的平均流出值，假清洗24小時後(＝0)，以及持續暴露於500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖2a.2-羥基-TTBA阻斷NMDA進程對處於-60mV的皮質神經元使用300μM NMDA可引起通常的NMDA-誘導的內向進程(NMDA進程)。連續使用各種濃度的2-羥基-TTBA能以濃度依賴的方式(n＝8)降低由300μM NMDA引起的響應。圖上顯示了2-羥基-TTBA對NMDA進程的劑量響應關係；其IC50值接近35μM，且希爾係數(Hill coefficient)為0.91。
圖2b.用2-羥基-TTBA預處理不影響NMDA進程。
將皮質神經元用100μM 2-羥基-TTBA處理，徹底洗滌，其後應用300μM NMDA。用2-羥基-TTBA預處理不影響NMDA-誘導的內向進程(inward currents)，表明只有當受體被激動劑(n＝6)活化時2-羥基-TTBA才發揮其阻斷作用。
圖3a.2-羥基-TTBA對FeCl2誘導的氧化應激的作用。
將小鼠皮質細胞培養物(DIV 12-14)持續暴露於50μM Fe2+，單獨地或含有0.1-100μM的2-羥基-TTBA(●)或trolox(維生素E的具有膜透過性的形式)(○)。24小時後，通過測量釋放到浸泡介質中的LDH的水平來分析神經元的死亡狀況(平均數±SEM(每種條件n＝9-12個培養孔)，調節LDH的平均流出值，假清洗24小時後(＝0)，以及持續暴露於500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖3b.2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環己基-TTBA對FeCl2誘導的氧化應激的作用。
將小鼠皮質細胞培養物(DIV 12-14)持續暴露於50μM Fe2+，單獨的(◆)或含有1-30μM的2-羥基-TTS(●)、2-羥基-TTA(○)、2-氯-TTP()、2-乙基-TTBA()、2-丙基-TTBA(■)或2-環己基-TTBA(□)之中。24小時後通過測量釋放到浸泡介質中的LDH的水平來分析神經元的死亡狀況(平均數±SEM(每種條件n＝9-12個培養孔)，調節LDH的平均流出值，假清洗24小時後(＝0)，以及持續暴露於500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖4.2-羥基-TTBA對SNP-誘導的氧化應激的作用。
將小鼠皮質細胞培養物(DIV 12-14)持續暴露於5μM硝普鈉(SNP)，單獨地(●)或含有0.1-10mM的阿司匹林(○)、1-100μM的trolox()或0.1-10μM的2-羥基-TTBA()。24小時後，通過測量釋放到浸泡介質中的LDH的水平來分析神經元的死亡狀況(平均數±SEM(每種條件n＝9-12個培養孔)，調節LDH的平均流出值，假清洗24小時後(＝0)，以及持續暴露於500μM NMDA(＝100))。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖5.2-羥基-TTBA對鋅毒性的作用。
將小鼠皮質細胞培養物(DIV 12-14)暴露於300μM Zn2+，單獨地或含有3-300μM的2-羥基-TTBA之中30分鐘。24小時後，通過測量釋放到浸泡介質中的LDH的水平來分析神經元的死亡狀況(平均數±SEM(每種條件n＝9-12個培養孔)，調節LDH的平均流出值，假清洗24小時後(＝0)，以及持續暴露於500μM NMDA(＝100))。
圖6a.2-羥基-TTBA的自由基清除活性將2-羥基-TTBA(●)或trolox(○)與溶於乙醇中的100μM 1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazil)(DPPH，一種穩定的自由基)反應10分鐘。通過測定在517nm處DPPH水平的下降來確定其自由基清除活性。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖6b.2-羥基-TTS、2-羥基-TTA或2-氯-TTP的DPPH分析。
將2-羥基-TTS(●)、2-羥基-TTA(○)、2-氯-TTP()或對照組()與100μM溶於乙醇中的DPPH反應。通過測定在517nm處DPPH水平的下降來確定自由基清除活性。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖7a.2-羥基-TTBA降低ALS動物模型的脊髓神經元的死亡。
對過表達變異型SOD1-G93A的肌萎縮性脊髓神經側索硬化(ALS)小鼠從兩個月時開始給予媒介物(A)或2-羥基-TTBA(B，10mg/kg/天通過飲水)8周，其由曙紅染色的脊髓切片的明亮背景的顯微照片。
圖7b.2-羥基-TTBA降低ALS動物模型的脊髓神經元的死亡。
對使用媒介物(對照組)或2-羥基-TTBA處理的ALS小鼠脊髓的(灰質)背角和(灰質)腹角用曙紅染色，通過對其存活的神經元進行計數(平均數±S.E.M(每種條件n＝5隻動物))來分析圖7a.中的變性神經元。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用獨立t-測試(independent t-test)p＜0.05。
圖8a.2-羥基-TTBA腹膜內給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動脈和兩條頸總動脈對成年大鼠造成暫時腦缺血60分鐘，在再灌注(reperfusion)後5分鐘、30分鐘或1小時腹腔內注射媒介物或50 mg/kg 2-羥基-TTBA。在用2％的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride)(TTC)對腦部切片染色24小時後分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝8-11隻大鼠)。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖8b.2-羥基-TTBA腹膜內給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動脈和兩條頸總動脈對成年大鼠造成暫時腦缺血60分鐘，在再灌注後5分鐘腹腔內注射媒介物(對照組)或50mg/kg或100mg/kg 2-羥基-TTBA。在用2％的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)對腦部切片染色24小時後分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝7-8隻大鼠)。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖8c.2-羥基-TTBA靜脈內注射給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動脈和兩條頸總動脈對成年大鼠造成暫時腦缺血60分鐘，在閉塞後30分鐘或再灌注後5分鐘、30分鐘、1小時、2小時或4小時靜脈內注射媒介物(對照組)或5mg/kg 2-羥基-TTBA。24小時後分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝8-11隻大鼠)。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖8d.2-羥基-TTBA靜脈內注射給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動脈和兩條頸總動脈對成年大鼠造成暫時腦缺血60分鐘，在再灌注後5分鐘靜脈內注射媒介物(對照組)或1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg或20mg/kg的2-羥基-TTBA。24小時後分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝8-10隻大鼠)。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖8e.2-羥基-TTBA口服給藥降低腦缺血性損傷。
通過閉塞右中腦動脈和兩條頸總動脈對成年大鼠造成暫時腦缺血60分鐘，在再灌注後5分鐘口服給予媒介物(對照組)或10mg/kg或20mg/kg的2-羥基-TTBA。24小時後分析梗塞體積，平均值±SEM(每種條件下n＝8-10隻大鼠)。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖9a.在全腦缺血後恢復流通72小時時2-羥基-TTBA對線粒體ROS形成的作用。
在外科失血前24小時將染色體示蹤劑(Mitotracker)CM-H2X ROS注射入大鼠側腦室，其後動物接受10分鐘的短暫前腦缺血，在再灌注後5分鐘腹膜內注射媒介物(對照組)或2-羥基-TTBA(50mg/kg)。2小時後分析線粒體ROS水平，平均值±S.E.M.(在每種條件下，從海馬結構(hippocampal formation)的CA1部分隨機選取n＝50-70個神經元)。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用獨立t-測試p＜0.05。
圖9b.在全腦缺血後恢復流通72小時時2-羥基-TTBA預防CA1部分的神經元死亡。
成年大鼠經受10分鐘的短暫全腦缺血，在再灌注後5分鐘腹膜內注射媒介物(對照組)或2-羥基-TTBA(50mg/kg)。三天後通過對甲酚紫染色的存活神經元進行計數來分析CA1中變性的神經元數量(平均值±S.E.M)。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用獨立t-測試p＜0.05。
圖10a.2-羥基-TTBA降低MPTP注射三天後塞梅林氏神經節中多巴胺能神經元的死亡。
明亮背景的顯微照片顯示，C57/BL6小鼠的假手術對照組(A)或每天單次注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP，40mg/kg，SC)(單獨地(B)，或在MPTP給藥之前腹腔內注射(每天兩次)2-羥基-TTBA(C，25mg/kg；D，50mg/kg))三天後用抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體進行免疫染色(immunostained)的塞梅林氏神經節中多巴胺能神經元。
圖10b.2-羥基-TTBA降低MPTP注射三天後塞梅林氏神經節中多巴胺能神經元的死亡。
在如上文所述每天單次注射(MPTP，40mg/kg，SC)(單獨地或結合使用2-羥基-TTBA進行預處理)三天後在塞梅林氏神經節切片中TH-陽性的多巴胺能神經元的量。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
圖10c.2-羥基-TTBA降低MPTP注射七天後塞梅林氏神經節中多巴胺能神經元的死亡。
明亮背景的顯微照片顯示，C57/BL6小鼠的假手術對照組(A)或每天單次注射1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP，40mg/kg，SC)(單獨地(B)或在MPTP給藥之前腹腔內注射(每天兩次)2-羥基-TTBA(C，25mg/kg；D，50mg/kg))七天後用抗酪氨酸羥化酶(TH)抗體免疫染色的塞梅林氏神經節中的多巴胺能神經元。
圖11.2-羥基-TTBA防止外傷性損傷後脊髓的(灰質)背角神經元中線粒體ROS的產生。
成年大鼠在脊髓T8節段上受到壓迫性外傷(單獨(對照組)或在損傷後立即注射2-羥基-TTBA(50mg/kg，ip)和染色體示蹤劑CM-H2X ROS)。動物在兩天後安樂死，脊髓切片用NeuN抗體(神經元標記蛋白)進行免疫染色，通過檢測氧化的染色體示蹤劑CM-H2X的螢光強度來分析背角神經元(DHN)中線粒體ROS的水平，平均值±S.E.M.[每種條件下的大鼠n＝12(每隻大鼠5個脊髓切片)]。*表示明顯不同於媒介物對照組，5使用獨立-t測試p＜0.05。
通過使用2-羥基-TTBA、2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA和2-環己基-TTBA的實驗性實施例對本發明進行了如下具體描述，上述化合物的製備如合成實施例中所述。
但下面所描述的實施例僅是本發明代表，其還可包括更多的實施例。
實施例1
神經元和神經膠質的混合皮質細胞培養物為進行混合神經元-神經膠質培養，從14-16天的乳鼠(E14-16)的大腦中分離出小鼠大腦皮質，輕輕粉碎並接種在用100μg/ml聚-D-賴氨酸和4μg/ml昆布氨酸預塗覆的24孔塗板上(2×105細胞/板)。將培養物保持在37℃、潮溼的、5％CO2氣體環境中。平面培養基包括添加有5％馬血清、5％胎牛血清、26.5mM碳酸氫鹽、2mM穀氨酸鹽和21mM葡萄糖的Eagles最低必需培養基(MEM，Earles鹽，未供給穀氨酸鹽)。
體外培養7-8天後(DIV 7-8)，用10μM阿拉伯呋喃糖苷(arabinofuranoside)胞嘧啶(Ara-C)來終止神經膠質的過度生長。對DIV12-15皮質細胞培養物進行藥物處理。在如前所述的神經中毒損傷24小時後，通過檢測釋放到浸泡介質中的乳酸脫氫酶(LDH)的量來評價全部的神經元細胞損傷[Koh and Choi，J Neurosci Methods 2083-90，1987]。
實施例2
2-羥基-TTBA、2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環己基-TTBA對興奮毒性的抑制效果在如實施例1所述的混合神經元-神經膠質培養DIV 13-15時，將皮質細胞培養物暴露於300μM NMDA中10分鐘，單獨地或結合3-300μM2-羥基-TTBA、10-300μM 2-羥基-TTS、30-300μM 2-羥基-TTA、30-300μM2-乙基-TTBA、10-300μM 2-丙基-TTBA或10-300μM 2-環己基-TTBA。24小時後，通過測量釋放到浸泡介質中的LDH的量來評價神經元的死亡狀況。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
將皮質細胞培養物暴露於300μM NMDA中10分鐘，使神經元在其後的24小時中大幅死亡(約75-80％的神經元死亡)。在劑量為10-300μM時，2-羥基-TTBA以藥物依賴的方式阻斷NMDA-誘導的神經元死亡(圖1a)。
同時給予30-300μM劑量的2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環己基-TTBA也預防了NMDA-誘導的神經元死亡(圖1b)。
實施例3
2-羥基-TTBA對NMDA-誘導的內向進程的阻斷作用如上文所述在室溫下對皮質細胞培養物進行全細胞記錄[Seo et al.，J.Pharmacol.Exp.Ther.，299377-384(2001)]。對保持在-70mV的培養的皮質神經元使用300μM NMDA後立即引起通常的NMDA-誘導的內向進程(NMDA進程)。使用2-羥基-TTBA浴能夠立即以劑量依賴方式抑制NMDA-引起的進程(n＝7-15神經元/條件，IC50值＝30.55±2.96μM)(圖2a)。單獨使用100μM 2-羥基-TTBA對進行中的進程沒有效果，並對隨後用300μM NMDA處理後的細胞響應的效果很小(圖2b)，這表明只有當NMDA受體被活化時(n＝6)2-羥基-TTBA才表現出拮抗作用。
實施例4
2-羥基-TTBA、2-羥基-TTA、2-羥基-TTS、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環己基-TTBA阻斷氧化性神經元死亡(4-1)抑制FeCl2誘導的自由基毒性將混合的皮質細胞培養物(DIV 13-15)持續暴露於50μM FeCl2(其通過Fenton反應產生羥基自由基)，單獨地或結合指定劑量的2-羥基-TTBA、2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA、2-環己基-TTBA或trolox(一種維生素E類似物)。24小時後，通過上述LDH分析來分析神經元細胞的死亡。*表示明顯不同於媒介物對照組(FeCl2)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
暴露於FeCl2中的神經元細胞培養物在其後的24小時中發生大幅的神經元死亡。2-羥基-TTBA和trolox以劑量依賴方式預防FeCl2-誘導的自由基神經毒性。然而，在預防自由基神經毒性方面2-羥基-TTBA比trolox強30倍(圖3a)。此外，2-羥基-TTBA的合成衍生物(2-羥基-TTS、2-羥基-TTA、2-氯-TTP、2-乙基-TTBA、2-丙基-TTBA或2-環己基-TTBA)在預防FeCl2-誘導的自由基神經毒性中顯示出比trolox更強的神經保護作用(圖3b)。
(4-2)抑制SNP(硝普鈉)細胞毒性將混合的皮質細胞培養物持續暴露於5μM SNP(一氧化氮(NO)給體)，單獨地或包含0.1-10μM 2-羥基-TTBA、1-10μM trolox或100-10,000μM阿司匹林之中。24小時後，通過LDH分析來分析神經元細胞的死亡。*表示明顯不同於媒介物對照組(SPN)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
給予SNP造成全部神經元細胞死亡和一些神經膠質細胞死亡。在2-羥基-TTBA和trolox存在下SPN毒性被徹底阻斷。在預防NO毒性上前者比後者強100倍。阿司匹林作為2-羥基-TTBA的一種結構組分不會降低SNP的細胞毒性。
(4-3)抑制鋅神經毒性為誘導鋅(Zn2+)神經毒性，在HEPES-緩衝控制鹽溶液(HCSS)中將混合的皮質細胞培養物暴露於100μM ZnCl230分鐘，單獨地或包含3-300μM 2-羥基-TTBA，所述緩衝溶液包括120mM NaCl、5mM KCl、1.6mMMgCl2、2.3mM CaCl2、15mM葡萄糖、20mM HEPES和10mM NaOH。暴露後，將培養物洗滌3次，並用調節至25mM葡萄糖和26.2mM碳酸氫鈉的MEM進行替換。24小時後，通過分析LDH來分析神經元細胞的死亡。*表示明顯不同於媒介物對照組(SNP)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
同時用2-羥基-TTBA進行處理，在10-300μM劑量時以劑量依賴的方式預防鋅-誘導的神經元死亡(圖5)。
(4-4)2-羥基-TTBA、2-羥基-TTA、2-羥基-TTS或2-氯-TTP的DPPH分析為檢驗清除自由基的效果，將1-100μM 2-羥基-TTBA、2-羥基-TTA、2-羥基-TTS、2-氯-TTP或trolox與溶於乙醇的100μM DPPH(2，2-二苯基-1-苦基偕腙肼自由基，一種穩定的自由基)反應。孵育30分鐘後，通過分光光度計檢測517nm處DPPH吸收的相對減少，平均值±SEM(每種條件下n＝3試管)。*表示明顯不同於媒介物對照組(單獨DPPH)，使用ANOVA和Student-Neuman-Keuls檢驗p＜0.05。
與抗氧化劑trolox比較，2-羥基-TTBA在較低的劑量時可降低DPPH水平，表明2-羥基-TTBA是強於trolox的直接抗氧化劑(圖6a)。其它合成衍生物也能降低DPPH的水平(圖6b)。
實施例5
2-羥基-TTBA預防ALS小鼠的脊髓神經元的死亡具有G93A人SOD1突變的轉基因小鼠(B6SJL-TgN(SODL-G93A)1Gur)(ALS的動物模型(ALS小鼠))是從Jackson Laboratories(ME，USA)獲得的。通過飲用水瓶對2個月的野生型及ALS轉基因小鼠給藥2-羥基-TTBA(10mg/kg每天)8周。然後使動物安樂死，並通過蘇木精和曙紅染色對脊髓進行處理用於組織學檢驗。嗜曙紅染色顯示，未經2-羥基-TTBA處置的ALS小鼠的脊髓運動神經元(對照組)明顯發生變性，而該變性在2-羥基-TTBA處置的ALS小鼠中降低(圖7a)。
通過對灰質腹角(VH)和背角(DH)的嗜曙紅神經元進行計數來分析變性神經元的數量。給予2-羥基-TTBA顯著預防了ALS小鼠脊髓灰質背角和腹角神經元的變性(圖7b)。*表示明顯不同於媒介物對照組，使用獨立t-測試p＜0.05。
實施例6
2-羥基-TTBA預防缺氧-缺血性腦損傷(6-1)誘導大鼠的短暫局部腦缺血用水合三氯乙醛將Sprague-Dawley大鼠麻醉，並如前所述通過閉塞其中腦動脈(MCAO)使其產生局部腦缺血[Tamura et al.，J.Cerebr.BloodFlow Metab.153-60(1981)]。通過使3mm直徑的穿顱術喙(craniotomyrostral)到達卵圓孔將兩條頸總動脈(CCAs)和右中腦動脈(rMCA)暴露在外科顯微鏡下。用顯微夾子將CCAs和rMCA閉塞。60分鐘後釋放所述夾子，並在顯微鏡下觀察rMCA中血流的恢復。
(6-2)60分鐘MCAO後2-羥基-TTBA減少梗塞體積對動物進行MCAO 60分鐘，單獨或在再灌注後指定時間點給予2-羥基-TTBA(50mg/kg，i.p.)。注射鹽水作為對照組。24小時後使動物安樂死，取出其大腦並在腦基質中按冠狀線方向切割成7個2mm的切片。將腦切片置於2％的2，3，5，-三苯基氯化四氮唑溶液中，然後在10％福馬林中過夜。檢測梗塞形成區域(用白色標出)(TINA圖像分析系統)，並通過加和連續2mm厚的切片中顯白色的梗塞體積來計算梗塞形成的體積，平均值±SEM(每種條件n＝8-12隻大鼠)(圖8a)。注意到在再灌注後達1小時延遲給予(ip)2-羥基-TTBA，顯著減少梗塞體積。較高劑量的2-羥基-TTBA(100mg/kg，ip)也表現出相似的抵禦60分鐘MCAO的保護作用(圖8b)。
進行額外的實驗來檢驗靜脈注射2-羥基-TTBA(5mg/kg)抵禦60分鐘MCAO的效果。再灌注後在指定的時間點將2-羥基-TTBA給藥。再灌注後達4小時延遲注射2-羥基-TTBA顯著減少了60分鐘MCAO後24小時內形成的梗塞體積，平均值±SEM(每種條件n＝8-12隻大鼠)(圖8c)。
靜脈注射2-羥基-TTBA的劑量-響應實驗顯示，在低至1mg/kg的劑量時2-羥基-TTBA可減少梗塞體積。當劑量高於2.5mg/kg時觀察到2-羥基-TTBA的保護效果，平均值±SEM(每種條件n＝8-12隻大鼠)(圖8d)。
同樣檢驗了口服給予2-羥基-TTBA的保護效果。尤其是再灌注後5分鐘給予2-羥基-TTBA(10或20mg/kg，p.o.)能減少60分鐘MCAO後24小時的梗塞體積，平均值±SEM(每種條件n＝8-12隻大鼠)(圖8e)。
實施例7
2-羥基-TTBA預防短暫前腦缺血後的CA1神經元細胞死亡
(7-1)誘導大鼠全腦缺血將雄性成年Sprague-dawley大鼠(250-300g)用三氯乙醛麻醉，並如上文所述接受四血管閉塞(封閉兩條頸總動脈和椎動脈)[Pulsinelli andBrierley，stroke 10267-272(1979)]。
(7-2)2-羥基-TTBA抑制全腦缺血後線粒體ROS的形成大鼠接受腦室內注射0.4nmol染色體示蹤劑CM-H2X ROS。24小時後，大鼠接受四血管閉塞10分鐘。再灌注後，大鼠立即接受腹膜內注射鹽水(對照組)或2-羥基-TTBA(50mg/kg)。2小時後通過測定線粒體中氧化的染色體示蹤劑CM-H2X ROS的螢光強度來分析線粒體的ROS水平。給予2-羥基-TTBA減少了短暫全腦缺氧後2小時線粒體ROS的產生。
(7-3)2-羥基-TTBA抑制短暫前腦缺血後CA1區域的神經元細胞死亡對接受四血管閉塞10分鐘的大鼠隨後給予鹽水(對照組)或2-羥基-TTBA(50mg/kg，ip)。3天後使動物安樂死，並在蘇木精和曙紅染色後分析CA1區域的神經元死亡(平均值±SEM，每種條件n＝12隻大鼠)。給予2-羥基-TTBA預防短暫全腦缺血後發展的延時神經元細胞死亡(圖9b)。*表示明顯不同於對照組，使用獨立t測試p＜0.05。
實施例8
2-羥基-TTBA抑制MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)注射後塞梅林氏神經節中多巴胺能神經元的死亡(8-1)2-羥基-TTBA抑制多巴胺能神經元C57/BL6小鼠(雌性，8周)接受注射40mg/kg MPTP(s.c.)，單獨地或每天每12小時在MPTP注射前30分鐘給予25或50mg/kg 2-羥基-TTBA(ip)。3或7天後，所有動物用三氯乙醛麻醉，並先後用PBS和4％多聚甲醛進行穿心灌注。立即取出大腦並在固定劑(fixative)中浸泡8-10小時。將所述固定劑用30％蔗糖代替，在4℃孵育2天，並在-70℃儲存。用滑動式切片機(TPI，Inc.，MO)將所述大腦切割成厚度為30μm的切片。然後將切片在4℃儲存於0.1M磷酸鹽緩衝溶液(pH 7.4，30％(v/v)甘油，30％乙二醇)中直到使用。將所述切片用抗-TH(酪氨酸氫化酶)抗體進行免疫染色，用二氨基聯苯胺(diaminobenzidine)著色，其後在光學顯微鏡下觀察分析多巴胺能神經元的變性。
用MPTP處理的小鼠在其後的3天中在塞梅林氏神經節中顯示出顯著的多巴胺能神經元變性。所述的腹膜內注射2-羥基-TTBA顯著減少了多巴胺能神經元的變性(圖10a和10b)。在給予MPTP 7天後同樣觀測到2-羥基-TTBA的保護作用(圖10c和10d)。
實施例9
外傷性脊髓損傷後抑制脊髓中線粒體ROS的產生通過壓迫背部脊髓使Sprague-Dawley大鼠(250-300g，雌性)遭受外傷性脊髓損傷。將脊髓T8節段在背側暴露以20g力壓迫10分鐘，然後立即將線粒體CM-H2X ROS注射入脊髓中。將2-羥基-TTBA(50mg/kg，ip)或媒介物對照組(對照組)與線粒體CM-H2X ROS一起注射。如上文所述，在用抗-NeuN抗體(神經元特異性標記物)進行免疫標記，48小時後分析灰質背角神經元中線粒體ROS的水平。給予2-羥基-TTBA顯著減少外傷性脊髓損傷後脊髓神經元中線粒體ROS的產生(圖11)(平均值±SEM，每種條件N＝12隻大鼠)。*表示明顯不同於對照組，使用獨立t測試p＜0.05。
綜上所述，本發明的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽可用作NMDA受體拮抗劑、抗氧化劑和鋅神經毒性抑制劑。
可應用四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽的具體疾病如下所述。
下列應用實施例是本發明的部分實施例。本發明不限於應用實施例。
應用實施例1中風腦血液供應中斷或中風主要通過在突觸間隙中由穀氨酸鹽(興奮性神經遞質)累積誘導的CA2+-透過性穀氨酸鹽受體的過度活化來誘導神經元死亡。大量文獻表明NMDA受體拮抗劑減少由缺血性中風(佔中風的80％)引起的神經元細胞死亡[Simon et al.，Science，226850-852(1984)；Park etal.，Ann Neurol.，24543-551(1988)；Wieloch，Science，230681-683(1985)；Kass et al.，Exp.Neurol.，103116-122(1989)；Weiss et al.，Brain Res.，380186-190(1986)]。也有報導稱ROS和鋅是中風後神經元死亡的主要機制。抗氧化劑或鋅毒性抑制劑保護中風的動物模型的缺血性損傷[Flamm，E.S.et al.，Stroke，9(5)445-447(1978)；Kogure，K.et al.，Prog.Brain Res.，63237-259(1985)；Chan，P.H.，J.Neurotrauma.，9 Suppl2S417-423(1992)]。因此，顯示抗興奮毒性、抗氧化應激和抗鋅毒性的多重保護作用的本發明化合物可以用作治療中風的藥物。
應用實施例2外傷外傷性腦損傷(TBI)和外傷性脊髓損傷(TSCI)後的神經元細胞變性與興奮毒素密切相關。在TBI患者體內喹啉酸(一種存在於人體內的NMDA受體激動劑)上升50-500倍[Sinz et al.，J.Cereb.Blood Flow Metab.，18610-615(1988)]。有報導稱NMDA受體拮抗劑可減少TBI和TSCI後的神經元死亡[Faden et al.，J Neurotrauma，533-45(1988)；Okiyama et al.，JNeurotrauma，14211-222(1997)]。抗氧化劑還可抑制TBI或TSCI後的組織損傷[FadenSalzman，Trends Pharmacol.Sci.，1329-35(1992)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應激的多重保護作用的本發明化合物可以用作TBI和TSCI的治療藥物。
應用實施例3癲癇症給予海人藻酸(一種AMPA激動劑和海人藻酸穀氨酸鹽受體)誘導包括海馬結構的若干大腦區域的癲癇發作和神經元細胞死亡。NMDA受體拮抗劑在許多引起癲癇的動物模型中表現出抑制驚厥和癲癇發作的作用。[Anderson et al.，J.Neurophysiol，571-21(1987)；Wong et al.，NeurosciLett.，85261-266(1988)；Mc Namara et al.，Neuropharmacology，27563-568(1988)]。抗氧化劑抑制癲癇發作和癲癇發作誘導的神經元死亡[He et al.，Free Radic.Biol.Med.22917-922(1997)；Kabuto et al.，Epilepsia，39237-243(1998)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應激的多重保護作用的本發明化合物可以用作癲癇和由癲癇誘導的神經元死亡的治療藥物。
應用實施例4肌萎縮性骨髓側索硬化ALS患者表現出細胞外穀氨酸鹽水平增加和星形膠質細胞中穀氨酸鹽的運輸缺陷。向脊髓中給予穀氨酸鹽受體拮抗劑模擬ALS患者脊髓中的病理變化[Rothstein et al.，Clin Neurosci.，3348-359(1995)；Ikonomidouet al.，JNeuropathol Exp Neurol，55211-224(1996)]。除了興奮毒性，許多證據表明氧化應激參與ALS中神經元的死亡[CooksonShaw，BrainPathol.，9165-186(1999)]。事實上，利魯唑(riluzole，一種FDA許可的用於ALS患者的新型藥物)的主要藥理學作用包括預防興奮毒性和氧化應激[Obrenovitch，Trends.Pharmacol.Sci.199-11(1998)；Noh et al.，Neurobiol.Dis.，7375-383(2000)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應激的多重保護作用的本發明化合物可以用作ALS的治療藥物。
應用實施例5帕金森症(PD)PD是一種神經變性疾病，通過塞梅林氏神經節中多巴胺能神經元的選擇性死亡表現為運動功能紊亂。許多NMDA受體拮抗劑保護多巴胺能神經元抵禦多巴胺能神經毒素MPTP(1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶)[Lange et al.，Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol.348586-592(1993)；Brouillet and Beal.Neuroreport.4387-390(1993)]。NMDA受體拮抗劑也能改善左旋多巴(levodopa)誘導的運動障礙，因此可改善左旋多巴的治療效果[Papa and Chase，Ann.Neurol.39574-578(1996)；Marin et al.，BrainRes.736202-205(1996)]。氧化應激及興奮毒性被證明是PD患者體內神經元細胞死亡的主要機制[Schapira et al.，biochem.Soc.Trans.，21367-370(1993)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應激的多重保護作用的本發明化合物可以用作PD的治療藥物。
應用實施例6亨廷頓症(HD)HD是一種進行性的神經變性疾病，主要影響紋狀體(striata)中較小或中等尺寸的中間神經元。給予NMDA受體激動劑後可在體內和體外觀察到HD的這些病理特徵，這些特徵提高了NMDA受體介導的神經毒性造成HD中選擇性神經元死亡的可能性[Koh et al.，Science 23473-76(1986)；Beal et al.，Nature 321168-171(1986)；Beal et al.，J.Neurosci.111649-1659(1991)]。由於積累的證據顯示氧化應激(例如線粒體功能紊亂和產生ROS)導致HD中觀察到的神經元死亡，因此抑制ROS的藥物有可能用於治療HD。[Jenner，Pathol.Biol.4457-64(1996)；AlbersBeal，J.Neural.Transm.Suppl.，59133-154(2000)]。因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應激的多重保護作用的本發明化合物可以用作HD的治療藥物。
應用實施例7阿耳茨海默氏症(AD)大腦皮質及海馬結構中穀氨酸能性神經元以及基底(basal)前腦中膽鹼能神經元的變性、澱粉斑塊的細胞外沉積、及細胞內神經原纖維纏結是AD的病理學特徵。已報導，在AD中自由基的過度生成產生脂質過氧化反應、8-羥基脫氧鳥嘌呤核苷、蛋白羰基、硝化作用或蛋白的氧化交聯，這表明氧化應激是AD中神經元死亡的主要成因[Vitek et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，914766-4770(1994)；Smith et al.，Trends.Neurosci.，18172-176(1995)，Mol.Chem.Neuropathol.，2841-48(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，949866-9868(1997)；Montine et al.，J.Neuropathol.Exp.Neurol.，55202-210(1996)]。事實上，已經在AD患者體內對抗氧化劑的療效進行了廣泛研究。Zn2+在AD患者的大腦中(扁桃體(amygdala)、海馬體、頂下小葉(inferior parietal lobule)、頂部和中部顳顬腦回(superior andmiddle temporal gyri))累積，主要在澱粉斑塊的中央和周圍，並引起β澱粉質的聚集[Bush et al.，Science 2651464-1467(1994)；Lovell et al.，J.Neurol.Sci.，15847-52(1998)]。因此，顯示抗氧化應激和抗ZN2+毒性的保護作用的本發明化合物可以用作AD的治療藥物。
應用實施例8眼科疾病和白內障在青光眼中，眼內壓力上升阻礙了血液流入視網膜中，造成視網膜缺血，並誘導穀氨酸鹽過度釋放入突觸間隙中。一旦釋放，穀氨酸鹽通過在後突觸(post-synaptic)神經元中打開鈣通道並提高細胞內Ca2+的濃度來誘導NMDA受體介導的興奮毒性。也可以通過在再灌注過程中增加活性氧類物質的產生來造成視網膜細胞的變性。[Osborne N.N.et al.，Surv.Opththalmol.，43 suppl.，1S102-28(1999)；Hartwick A.T.，Optom.Vis.Sci.，7885-94(2001)]。給予NMDA受體拮抗劑或抗氧化劑來抑制青光眼動物模型中視網膜的變性[Gu.Z.et al.，Nippon Ganka Gakkai Zasshi，10411-6(2000)；Vorwerk C.K.et al.，Surv Ophthalmol.，43 suppl.，1S142-50(1999)；Schwartz M.et al.，Eur.J.Ophthalmol.，9 Suppl.，1S9-11(1999)]。
在視網膜病和斑點變性(macular degeneration)中，神經元變性可以通過抑制興奮毒性和氧化應激(此類疾病的主要成因)來阻斷[Lieth E.et al.，Clin.Experiment Ophthalmol.，28(1)3-8(2000)；Moor P.et al.，Exp.EyeRes.，7345-57(2001)；Winkler B.S.et al.，Mol.Vis.，532(1999)；Simonelli F.et al.，Clin.Chim.Acta.，320111-5(2002)]。
白內障是一種伴隨晶狀體不透明的老年疾病。氧化應激被認為是白內障的主要媒介。實際中已經使用抗氧化劑來治療白內障[Varma et al.，Curr.Eye Res.335-57(1984)；Anderson et al.，Adv.Exp.Med.Biol.，36673-86(1994)]。
因此，顯示抗興奮毒性和抗氧化應激的多重保護作用的本發明化合物可以用作眼科疾病的治療藥物。
應用實施例9藥物成癮在凸出至伏隔核的中腦腹側被蓋區內的中腦邊緣(mesolimbic)多巴胺能神經元的活化是需要神經元興奮性的藥物成癮過程所必需的。[Self D.W.and Nestler E.J.，Annu.Rev.Neurosci.，18463-95(1995)]。多方面的證據支持可以使用NMDA受體拮抗劑來減少神經元對濫用藥物的適應性，並已經被建議作為藥物成癮的新型治療藥劑[Boening et al.，Alcohol Clin.Exp.Res.，25127S-131S(2001)；Vorel et al.，Science，2921175-8(2001)]。
應用實施例10抑鬱症三環抗抑鬱劑和MAO(單胺氧化酶)抑制劑(抗抑鬱劑)可增強去甲腎上腺素和5-羥色胺的神經傳遞。現有的治療藥物通過與其它神經系統相互作用誘導許多副作用，並且對30％的抑鬱症患者沒有治療效[Pacher etal.，Curr.Med.Chem.，Feb.8(2)89-100(2001)]，近來發現NMDA受體拮抗劑可用作抑鬱症的新型治療藥物[Le D.A.and Lipton S.A.，DrugsAging，18717-724(2001)；Petrie et al.，Pharmacol.Ther.，8711-25(2000)]。
應用實施例11疼痛與外科手術、癌症患者和外傷等相關的外周損傷和神經組織損傷後神經傳遞的增強造成神經性疼痛[Hempenstall K.and Rice A.S.，Curr.Opin.Investig.Drugs.，Mar；3(3)441-8(2002)；McDonnell et al.，Curr.Oncol.Rep.，2351-7(2000)]。由於NMDA受體的活化作用是神經性疼痛過程必需的，有報導稱NMDA受體拮抗劑可用作治療神經性疼痛的治療藥物[Parson C.G.，Eur.J.Pharmacol.，42971-8(2001)；Hewitt，Clin.J.Pain.，16S73-9(2000)]。
應用實施例12多發性硬化、腦膜炎、腦炎或腦積水氧化應激在多發性硬化、腦膜炎、腦炎或腦積水的發病機理中起作用。在多發性硬化患者的體內抗氧化劑(如視黃醛、a-維生素E、b-胡蘿蔔素和抗壞血酸)的水平降低[Calabrese，V et al.，Int.J.Clin.Pharmacol.Res，14(4)119-123(1994)；Besler H.T.et al.，Nutr.Neurosci.5(3)215-220(2002)；Nutr.Neurosci.6(3)189-196(2002)]。在腦膜炎患者及其動物模型[Maurizi C.P.，Med.Hypotheses，52(1)85-87(1999)；Christen S.et al.，Free Radic.Biol.Med，31(6)754-762(2001)；Kastenbauer S.et al.，Neurology，58(2)186-191(2002)]、腦炎病毒感染模型[Fujii，S.et al.，Virology，256(2)203-212(1999)；Raung S.et al.，Neurosci.Lett.，315(1-2)9-12(2001)]、及腦積水患者[Nuss J.I.et al.Am.J.Vet Res.，28(127)1909-1913(1967)；Vannucci R.C.et al.，Dev.Med.Child.Neurol.，22(3)308-316(1980)；Radwanska-Wala B.et al.，Pathol.Res.Pract.，198(6)421-423(2002)]中發現ROS產生和神經元細胞死亡的增加。因此，顯示抗氧化應激保護作用的本發明化合物可以用作治療由多發性硬化、腦膜炎、腦炎或腦積水引起的神經元死亡的藥物。
本發明是以說明的方式進行描述的，且應該理解，所用術語具有描述性質而不具有限定作用。依照上述教導可以對本發明進行各種修改和變化。因此，可以理解，在所附權利要求範圍內可以不同於以上具體描述的方式實施本發明。
工業實用性如上文中所述，四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽，以及含有上述物質作為有效成分的藥物組合物可預防和治療如上所述的神經變性疾病(例如肌萎縮性脊髓側索神經硬化、帕金森症、亨廷頓症或阿耳茨海默氏症)，神經元痙攣性疾病(如癲癇症等)，以及由中風、外傷或腦積水造成的腦損傷，由青光眼和視網膜疾病引起的眼科疾病，由藥物成癮和抑鬱症引起的精神疾病，神經性疼痛，由腦膜炎和腦炎引起的炎症。
權利要求
1.一種以如下化學式1表示的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽[化學式1] 其中，R1、R2和R3為氫或滷素，R4為羥基、烷基、烷氧基、滷素、滷代烷氧基、烷醯氧基或硝基，及R5為羧酸、C1-C4烷基取代的羧酸酯、醯胺、磺酸、滷素或硝基。
2.如權利要求1所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟苄基衍生物為2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-硝基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-氯-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-溴-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-甲基苄氨基)苯甲酸，2-甲基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-甲氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基-苄氨基)苯甲酸，5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)-2-三氟甲氧基苯甲酸，2-硝基-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚，2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-甲基苄氨基)苯酚，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲醯胺，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯磺酸，2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸甲酯，2-乙醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，2-丙醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸，或2-環己胺碳醯氧基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸。
3.如權利要求2所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟苄基衍生物為2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲酸。
4.如權利要求2所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟苄基衍生物為2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯磺酸。
5.如權利要求2所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟苄基衍生物為2-羥基-5-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯甲醯胺。
6.如權利要求2所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽，其中所述的四氟苄基衍生物為2-氯-4-(2，3，5，6-四氟-4-三氟甲基苄氨基)苯酚。
7.一種用於治療和預防神經變性疾病的藥物組合物，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分，其中所述的神經變性疾病選自肌萎縮性骨髓側索硬化、帕金森症、亨廷頓症、阿耳茨海默氏症及其組合。
8.一種用於治療和預防癲癇症的藥物組合物，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
9.一種用於治療和預防中風的藥物組合物，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
10.一種用於治療和預防外傷性腦損傷、外傷性脊髓損傷或腦積水的藥物組合物，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
11.一種用於治療和預防青光眼、視網膜病或黃斑變性(視網膜)的藥物組合物，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
12.一種用於治療和預防藥物成癮的藥物組合物，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
13.一種用於治療和預防抑鬱症的藥物組合物，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
14.一種用於治療和預防疼痛的藥物組合物，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
15.一種用於治療和預防腦炎、腦膜炎和/或多發性硬化的藥物組合物，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
16.一種N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體拮抗劑，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
17.一種抗氧化劑，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
18.一種鋅毒性抑制劑，包括如權利要求1-6中任一權利要求所述的四氟苄基衍生物或其藥物可接受的鹽作為有效成分。
全文摘要
本發明涉及四氟苄基衍生物及含有其成分的用於治療和預防中樞神經系統的急慢性神經變性疾病和眼科疾病的藥物組合物。本發明的四氟苄基衍生物可有效地用於預防和治療諸如帕金森症、亨廷頓症及阿耳茨海默氏症的慢性神經變性疾病，諸如癲癇的腦變性疾病和諸如中風的缺血性腦病。
文檔編號A61P43/00GK1668576SQ03816752
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月19日 優先權日2002年6月19日
發明者郭秉周, 尹性和, 文鎬相, 樸恩贊, 元碩駿, 李英愛, 李海彥 申請人:紐若泰克有限公司