用於快速篩選和鑑定有效shRNA的載體及其篩選和鑑定方法

2023-06-09 05:05:11

專利名稱：用於快速篩選和鑑定有效shRNA的載體及其篩選和鑑定方法
技術領域：
本發明涉及一種快速篩選和鑑定有效shRNA的方法，包括用於篩選和鑑定有效 shRNA的真核表達載體的構建及其應用。
背景技術：
RNA幹擾(RNA interference)是一種由雙鏈RNA誘發的基因沉默(gene silencing)。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA (mRNA)被降解，從而抑制了該 基因的表達。RNA幹擾技術在探查基因功能和治療人類疾病方面有廣闊的應用前景。科學 界普遍認為，通過利用RNAi，操縱細胞的核糖核酸(遺傳信使)，幹擾或壓制目標基因，以防 止那些會導致疾病的蛋白質形成，有可能產生出前景不錯的治療藥物，用於治療包括癌症、 失明和愛滋病在內的疾病。目前，人們已經成功地使用髮夾狀RNA或以質粒DNA或病毒為載體在細胞內生成 小幹擾RNA樣轉錄物，來特異性地抑制外源性或內源性基因在哺乳類動物或人細胞內的表 達。用質粒DNA或病毒為載體可在細胞內長時間、穩定地生成小幹擾RNA。此類研究將有助 於把RNA幹擾技術用於治療人類疾病。RNA幹擾研究及應用的一個前提是篩選到有效的shRNA，然後將此有效shRNA構建 至真核表達載體或病毒表達載體，進行後續研究和應用。針對某一個靶基因，根據shRNA靶序列設計原則，一般來說會有多個候選的shRNA 序列。這些利用各種設計軟體設計出的shRNA序列，其僅僅在理論上可能對靶基因有幹擾 效果，但是其實際的幹擾有效性還需要進行實踐篩選和驗證。目前篩選和驗證有效shRNA，往往需要利用RT-PCR或狗8切111-1310丨的方法，費時、 費力，特別是待選shRNA數量較多時，會大大增加工作量和實驗成本。

發明內容
為克服上述篩選和驗證有效shRNA時的缺陷，實現快速、簡便地篩選和驗證有效 shRNA，本發明提供了一種技術方案為用於快速篩選和鑑定有效shRNA的真核表達載體， 將如下結構構建至同一個真核表達載體上1)由polIII型啟動子調控的shRNA表達框 結構，即polIII型啟動子+shRNA插入位點，用於插入待篩選和鑑定的shRNA ；2)由CMV啟 動子調控的螢光蛋白表達框，在螢光蛋白基因後面緊跟一個多克隆位點(MCS)，用於在其中 插入與待篩選和鑑定shRNA相對應的靶序列片段。幻由SV40啟動子調控的螢光蛋白表達 框，該螢光蛋白的螢光顏色與第2·)中的螢光蛋白的螢光顏色不同。所說的由CMV啟動子調控的螢光蛋白可為綠色螢光蛋白(EGFP)。上述載體結構中還可以包括由SV40啟動子調控的螢光蛋白表達框。所說的紅色 螢光蛋白可以為(RFP)。所述polIII型啟動子為hU6、mU6、hHl或h7SK啟動子；所述載體還包括Kan或者3Amp抗性篩選標記。根據上述技術方案，本發明還提供了一個真核表達載體，序列如SEQ NO 1所示。另外，本發明還提供了一種快速篩選和鑑定有效shRNA的技術方案，其特徵在於， 該方法為將待篩選和鑑定shRNA和與其對應的靶序列片段插入上述的真核表達載體，其 中，shRNA靶序列片段插入到螢光蛋白基因後的多克隆位點，再將得到的載體轉染至細胞 中，與轉染了未插入shRNA片段的空白載體的細胞相比，螢光明顯減弱，則待篩選shRNA為 有效shRNA。所述細胞為易轉染、易培養的細胞，優選四3細胞。其中shRNA的結構包括sense、loop、antisense和5T或6T終止信號。待篩選和鑑定shRNA相對應的靶序列片段，可以以該條shRNA所針對的欲幹擾基 因上的靶位點序列為中心，然後各向兩側延伸15 25個鹼基，以這樣一條片段(總長度大 約為49 69bp)作為與待篩選和鑑定shRNA相對應的靶序列片段。簡單舉例說明如果 shRNA針對的是CCCC，那麼它的結構差不多是CCCC-loop-GGGG-5T或6T終止信號，那麼相 對應的靶序列片段就是CCCC。即，所謂的靶序列片段，就是某個shRNA針對的那一段序列， 也就是整個shRNA結構中的sense序列。本領域普通技術人員能夠知道」靶序列片段」如 何確定。現有技術中，shRNA表達後，經Dicer酶切成siRNA，siRNA通過序列互補與具有同 源序列的mRNA結合，導致mRNA的降解。根據這一原理，本發明的技術方案將shRNA針對的 靶序列單獨合成出來，並將其加至螢光蛋白基因的後面，如果該shRNA有效，則整條包含熒 光蛋白基因的mRNA都會被降解掉，從而導致螢光強度減弱。通過觀察、比較對照組和shRNA 幹擾組細胞之間的螢光強度差異，就可判斷該shRNA的有效性，同時根據螢光強度對比還 可以判定大致的幹擾效率。載體中還包括一個由SV40啟動子調控的螢光蛋白表達框，可通過觀察螢光強度 來判斷質粒轉染效率。利用本發明提供的真核表達載體及相應方法篩選和鑑定有效shRNA，不需做 RT-PCR或ffestern-blot檢測，快速、簡單、方便、成本低廉，特別適合於從多個預先設計的 備選shRNA中篩選有效shRNA。


圖1是利用本發明技術方案提供的方法構建的篩選載體 pYrbio-shRNA-screening 的質粒圖譜；圖 2 是轉染了 pft~bio-shRNA-screening-GAPDH-l (A) >pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2 (B), pYrbio-shRNA-screening (C)的各組 293 細胞中紅色螢光照片；圖 3 是轉染了 pft~bio-shRNA-screening-GAPDH-l (A) >pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2 (B)、pYrbio-shRNA-screening (C)的各組四3細胞中綠色螢光照片；圖4是空白組、對照組、幹擾組四3細胞中GAPDH基因的表達情 況(Western-blot)，其中第1泳道為空白293細胞，第2泳道為轉染了 pYrbio-hU6-EGFP-shRNA 的對照組四3 細胞，第 3 泳道為轉染了 pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH_l 的幹擾組293細胞，第4泳道為轉染了 pft~bio-hU6-EGFP-GAPDH-2的幹擾組293細胞；
圖 5 是轉染了 pYrbio-shRNA-screening-3 (A)、pYrbio-shRNA_screening (B)的各 組293細胞中紅色螢光照片；圖 6 是轉染了 pYrbio-shRNA-screening-3 (A)、pYrbio-shRNA_screening (B)的各 組293細胞中綠色螢光照片；圖 商業化載體pYrbio-hU6-EGFP-shRNA的質粒圖譜。
具體實施例方式實施例1篩選載的構建方法以商業化載體pft~bi0-hTO-EGFP-shRNA(長沙贏潤生物技術有限公司生產， 如SEQ ID2所示)為骨架，通過一系列改構，構建篩選載體i^rbio-shRNA-screening。(1)從 pCDNA3. 1 (+)上 PCR 擴增 SV40promoter 片段，兩端加上 HindIII 和 BamHI酶切位點。以Hindi 11和BamHI為亞克隆位點，將SV40promoter片段亞克隆至 pYrbio-hU6-EGFP-shRNA 上。構建好的載體命名為 pft~bio-shRNA-screening-prel。(2)從pDsred2_Cl上PCR擴增RFP片段，兩端加上BamHI和EcoRI酶切位點。以 BamHI和EcoRI為亞克隆位點，將RFP片段亞克隆至pYrbio-shRNA_screening-prel上。構 建好的載體命名為 pft~bio-shRNA-screening-pre2。(3)從 pCDNA3. 1(+)上 PCR 擴增 BGH PolyA 片段，兩端加上 EcoRI 和 SalI酶切位點。以EcoRI和Mil為亞克隆位點，將BGH PolyA片段亞克隆至 pYrbio-shRNA_screening-pre2 上。構建好的載體艮口為 pYrbio-shRNA-screening。結果篩選載體pft~bio-shRNA-screening構建成功，圖一為 pYrbio-shRNA-screening質粒圖譜，序列表中為該載體完整序列。其中，shRNA Insertion Site前後各有一個BsaI酶切位點，用來插入待篩選的 shRNA >t 。 shRNA Target Fragment Insertion Site ^h* BglII、NotI、AscI、XhoI 切位點，用來插入與待篩選shRNA序列相對應的shRNA靶序列片段。結論按照此方法可成功構建pft~bio-shRNA-screening篩選載體。實施例2針對人GAPDH基因的有效shRNA的篩選方法按照本發明提供的方法構建兩個針對人GAPDH基因的shRNA真核表達載 體，分別命名為 pft~bio-shRNA-screening-GAPDH-l 和 pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2。 pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-1 的 shRNA 表達框中插入 GAPDH-shRNAl，EGFP 後面的 MCS 中插入相應的shRNAl靶序列片段；pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2的shRNA表達框中 插入GAPDH-shRNA2，EGFP後面的MCS中插入相應的shRNA2靶序列片段。以未插入任何 shRNA和shRNA靶序列片段的空白載體pft~bio-shRNA_screening作為對照。GAPDH-shRNAl CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTshRNAl靶序列片段GGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCTGACTTCAACAGCGACACCCAGAPDH-shRNA2 TCCGGGAAACTGTGGCGTGATshRNA2靶序列片段
ACTGTGGATGGCCCCTCCGGGAAACTGTGGCGTGATGGCCGCGGGGCTCTC將上述三種質粒載體分別轉染293細胞，48小時後於螢光顯微鏡下觀察螢光。結果三種質粒載體轉染至293細胞，48小時後於螢光顯微鏡下均可觀察到明顯 的紅色螢光，顯示轉染效率很高。圖2是各組細胞中的紅色螢光照片。比較三組細胞的綠色螢光強度，可以發現轉染了 pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-Ι 和 pYrbio-shRNA-screening-GAPDH-2 的兩組細胞的綠 色螢光強度均明顯弱於轉染了空白對照載體於計化-吐！？織-叱儀拙^^的細胞，顯示兩個 shRNA均為有效shRNA，且其幹擾效率較高。圖3是各組細胞中的綠色螢光照片。結論利用本發明提供的方法構建的針對人GAPDH基因的shRNA真核表達載體 能夠在293細胞中正常工作，表達出大量針對靶基因GAPDH的shRNA，並進而降解了帶有 shRNA靶序列片段的EGFP mRNA,從而有效的抑制了 EGFP基因的表達，導致觀察到的綠色熒 光變弱。說明本發明提供的快速篩選和鑑定有效shRNA的方法是可行的。實施例3篩選出的shRNA的幹擾有效性驗證方法以實施例1中篩選獲得的兩條針對人GAPDH基因的shRNA為基礎，以商業 化載體pft~bi0-hTO-EGFP-shRNA為骨架，構建兩個新的shRNA真核表達載體，分別命名為 ρYrb io-hU6-EGFP-GAPDH-1和 pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH_2。其中 pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH-l 中插入 GAPDH shRNAl , pYrbio-hU6-EGFP-GAPDH-2中插入GAPDH shRNA2。以未插入任何shRNA的空白載體 pYrbio-hU6-EGFP-shRNA 作為對照。GAPDH-shRNAl 靴序列CCAGGTGGTCTCCTCTGACTTGAPDH-shRNA2 靶序列TCCGGGAAACTGTGGCGTGAT將上述三個載體分別轉染入四3細胞中，編為對照組、shRNA幹擾組1、shRNA幹擾 組2，同時以未轉入任何質粒的293細胞作為空白組。48小時後收集各組細胞，提取蛋白質， 進行 Western-blot 檢測。結果jestern-blot檢測顯示，利用本發明提供的方法篩選出的針對人GAPDH的 兩條shRNA，確實對人GAPDH基因的表達具有很好的抑制作用。圖4是flfestern-blot檢測結果。結論利用本發明提供的方法篩選出的有效shRNA，其幹擾有效性被 Western-blot實驗進一步的確定，說明本發明提供的快速篩選和鑑定有效shRNA的方法是 行之有效的。實施例4快速篩選和鑑定有效shRNA的方法的特異性研究方法按照本發明提供的方法構建一個shRNA真核表達載體 pYrbio-shRNA-screening-3, shRNA 表達框中依然插入 GAPDH-shRNAl，而 EGFP 後面的 MCS 中插入以實施例1中的GAPDH shRNAl靶序列片段為基礎、但是其鹼基排列順序都被打亂、 與shRNAl序列不互補的一段序列。以未插入任何shRNA和shRNA靶序列片段的空白載體 pYrbio-shRNA-screening 作為對照。GAPDH-shRNAl CCAGGTGGTCTCCTCTGACTT6
序列被打亂的靶序列片段GGGCTACACTGAGCATCTTCCTTGACGTCGGTGCCACAACAGCGACACCCA將上述兩種質粒載體分別轉染293細胞，48小時後於螢光顯微鏡下觀察螢光。結果兩種質粒載體轉染至293細胞，48小時後於螢光顯微鏡下均可觀察到明顯 的紅色螢光，顯示轉染效率很高。圖5是各組細胞中的紅色螢光照片。比較兩組細胞的綠色螢光強度，可以發現shRNA幹擾組和對照組細胞基本一致， 顯示shRNA真核表達載體pYrbio-shRNA-screening-3表達出的shRNA沒有抑制EGFP基因 的表達。圖6是各組細胞中的綠色螢光照片。結論此實施例中構建的shRNA篩選載體pYrbio-shRNA-screening-3，shRNA表 達框中插入的shRNA和EGFP後面MCS中插入的靶序列片段並不互補，在此情況下，表達出 的shRNA沒有抑制EGFP基因的表達，shRNA幹擾組和對照組細胞中的綠色螢光強度基本一 致，說明本發明提供的快速篩選和鑑定有效shRNA的方法具有良好的特異性。序列表長沙贏潤生物技術有限公司用於快速篩選和鑑定有效shRNA的載體及其篩選和鑑定方法PLH098172PatentIn version 3. 116110DNA人工序列1tagttattagcgactagtgactttatttgtacaagttaacggttttttaatagatccggttctgagtccgcgaactccaggggtgctcaggctggtagtgtcaccttgattgtactccagcgatgcggttcgtcgtccttagaagtcgtggggtggtcac
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1.用於快速篩選和鑑定有效ShRNA的真核表達載體，其特徵在於，將如下結構構建至 同一個真核表達載體上1)由polIII型啟動子調控的shRNA表達框結構，即polIII型啟 動子+shRNA插入位點；2)由CMV啟動子調控的螢光蛋白表達框，並在螢光蛋白基因後面緊 跟一個多克隆位點(MCQ ；3)由SV40啟動子調控的螢光蛋白表達框，該螢光蛋白的螢光顏 色與第2)中的螢光蛋白的螢光顏色不同。
2.根據權利要求1所述的真核表達載體，其特徵在於，所述polIII型啟動子為hU6、 mU6、hHl或h7SK啟動子。
3.根據權利要求1或2所述的真核表達載體，其特徵在於，所述載體還包括Kan或者 Amp抗性篩選標記。
4.根據權利要求3所述的真核表達載體，其特徵在於，所述真核表達載體為SEQNO 1 所示。
5.一種快速篩選和鑑定有效shRNA的方法，其特徵在於，該方法為將待篩選和鑑定 shRNA和與其對應的靶序列片段插入權利要求1-4所述的真核表達載體，shRNA靶序列片 段插入到螢光蛋白基因後的多克隆位點，再將得到的載體轉染至細胞中，與轉染了未插入 shRNA片段的空白載體的細胞相比，螢光減弱，則待篩選shRNA為有效shRNA。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述細胞優選293細胞。
全文摘要
本發明提供了一種快速篩選和鑑定有效shRNA真核表達載體，將如下結構構建至同一個真核表達載體上1)由polIII型啟動子調控的shRNA表達框結構，即polIII型啟動子+shRNA插入位點；2)由CMV啟動子調控的螢光蛋白表達框，並在螢光蛋白基因後面緊跟一個多克隆位點(MCS)；3)由SV40啟動子調控的螢光蛋白表達框，該螢光蛋白的螢光顏色與第2)中的螢光蛋白的螢光顏色不同。本發明還提供了用上述載體篩選或驗證有效shRNA的方案，利用此載體和方法篩選和鑑定有效shRNA，不需做RT-PCR或Western-blot檢測，快速、簡單、方便、成本低廉，特別適合於從多個預先設計的備選shRNA中篩選有效shRNA。
文檔編號C12N15/79GK102051371SQ200910044738
公開日2011年5月11日 申請日期2009年11月11日 優先權日2009年11月11日
發明者呂媛, 孫永林, 易銀沙, 袁炳秋 申請人:湖南師範大學