便捷的乳製品病原體檢測方法
2023-06-09 02:30:56 1
專利名稱：便捷的乳製品病原體檢測方法
技術領域：
本發明屬於微生物檢測技術，尤其是涉及乳與乳製品中病原微生物的現場定性檢測技術，具體為一種乳製品病原體檢測方法。
背景技術：
民以食為天，食以安為先。充足、營養和安全的食品是人類生存的基本需要。儘管科技進步顯著降低了疾病對人類的危害，但食源性疾病仍是人類健康和生命的主要威脅之一。近年來狂牛症、禽流感、李斯特桿菌、豬鏈球菌等重大食品危害事件的頻頻爆發，也促使全球對食品安全的問題越來越重視。在美國，由於食品病原問題每年導致7，600萬人生病，32萬人住院，5，000人由於食品衛生而死亡，並為此每年支出65億美元。而國內，我國發生的幾起重大食物中毒事件都與微生物致病汙染有關。如河南鄭州市某高校發生雞腸球菌汙染食品引起367人集體食物中毒；山東省夏津縣一起鼠傷寒沙門菌汙染食物引起153人食物中毒事件；2005年四川的豬鏈球菌事件更是造成38人死亡，近200人中毒。諸多案例表明食源性病原菌常造成群發性的傷害，給人們的身體健康及生命財產造成相當的危害。2008年的『奶粉事件』，乳製品中的三聚氰胺超標，更是將食品安全檢測推向了高潮，由此引發了食品檢測的革命風暴。中國食品業在經歷了 2008年的牛奶之觴後，度過了較為平靜的一年，但年終歲尾的「問題奶粉」又死灰復燃，可口可樂「雪碧含汞」，「主食轉基因」安全問題引起全民激辯，春節期間，海南毒豇豆席捲全國……種種食品安全問題，使得人人自危。食品安全問題再次敲響了警鐘！ 2010年2月9日，食品安全委員會成立，三位副總理攜15部長共保食品安全。中共中央政治局常委、國務院總理溫家寶27日下午3時接受中國政府網、新華網聯合專訪，與廣大網友在線交流。在回答網友提出的「毒奶粉」等假冒偽劣產品時，溫家寶說，對於整個社會來講，道德問題十分重要，「我以為誠信和道德是現代社會應該解決的緊迫問題"，然而光有道德約束遠遠不夠，我們不僅要制訂詳細的法律來約束不法商家的違法行為，更要有快捷、經濟的檢測方法，用於隨時隨地檢測各種問題食品。目前用於檢測乳製品中的病原體檢測的國家標準有平板法、免疫法、real timePCR法，然而隨著人們生活水平的提高，對乳製品的檢測要求也不斷的提高。傳統的一些檢測方法，雖然一直作為國家標準，但其缺陷也日益顯現。首先，平板法需要很長時間，一般為六七天，而一些急於出售的乳製品，無法等待如此長的時間，待檢測完畢，拿到檢測報告後，該批次的乳製品就會由於旋轉時間過長而過保質期；對一些表型特徵變異的菌株，用傳統的形態學經驗很難辨別，受主觀的經驗影響較大。其次，目前一些養殖場為了逃避病原體檢測，往往會給奶牛餵養一些含抗生素的飼料，導致在原奶中有較高的抗生素含量，從而平板法就會由於有抗生素的幹擾，從而不能順利檢測到病原體的存在。再次，一個平板只能檢測一個樣本的一種病原體，一旦待測樣本數很多，平板法則根本沒辦法滿足，只能進行抽檢，這樣就會導致漏檢率大大升高。
免疫法依賴抗原抗體的特異性反應來檢測目的樣本中的病原體，因此，實驗的靈敏度很大程度上依賴於抗體的好壞一方面，製作抗體是一個耗時耗力的工作，而且即使抗體製作的再好，也會由於抗原表面決定簇類似的原因，使結果出現交叉反應；另一方面，有些病原變異極快，如病毒，或者一些菌屬，存在很多的亞型，並且經常變異，從而使抗體失效，不能檢測新的抗原。有些乳製品中加了一些色素，因此，由於免疫法是利用酶標儀的光吸收來判定結果的，因此，本底色過高，就很容易造成假陽性結果。Real time PCR是國家標準上唯一的一個基於核酸擴增的方法，不會受本底色和 抗生素的幹擾，結果也較為可靠，然而最大的缺點就是通量較低，一個反應只能檢測一種病原，一旦要檢測多個病原，就需要多臺PCR來完成，一旦有大量樣本，就不能及時完成所有檢測工作。同時該方法還需要昂貴的定量PCR儀，只能限定於實驗室檢測，不能走入尋常百姓家。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種便捷的乳製品病原體檢測方法，採用該方法無需複雜的儀器，並且用肉眼即可辨識檢測結果，從而準確判斷是否被病原體汙染。為了解決上述技術問題，本發明提供一種便捷的乳製品病原體檢測方法，包括以下步驟I)、設計引物設計大腸菌群、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、黴菌的對應引物組各一套；每套引物組中含有4條引物；2)、待測液態乳製品的前處理，依次進行以下步驟①、將待測液態乳製品於3 5°C下1000-2000rpm離心15 25min，棄上層懸浮物；②、在上述步驟的所得物中加入PBS，輕輕震蕩從而使沉澱重新懸浮，於3 5°C下1000 2000rpm離心15 25min,棄上層懸浮物；所述PBS與步驟I)中的待測液態乳製品的體積比為8 12 50 ；③、重複步驟②2次(目的是為了除去乳脂和乳蛋白)；4000 6000g離心8 12min,棄上清；得沉澱；④、按照TEN IN的NaOH溶液為22 2. 8 3. 2的體積比，在步驟③所得的沉澱中加入TEN和IN的NaOH溶液，直至沉澱完全懸浮；⑤、先將步驟④的所得物於90 100°C加熱7 9min，然後冷卻至彡室溫(放入冰盒中冷卻至不高於室溫)；⑥、將部分的步驟⑤所得物進行DNA濃度檢測，其餘的步驟⑤所得物於_20°C保存備用，作為DNA模板；3)、核酸的恆溫擴增利用步驟I)所得的每套引物組分別進行以下操作①、步驟I)所得的每套引物組中的引物用DEPC處理水進行溶解稀釋②、設置擴增反應體系2X 反應液(RM) *12. 5 μ I,Bst DNA 聚合酶 I μ I,4種引物各I μ 1，
DNA 模板 2 μ I，螢光染料I μ I，DEPC處理水4. 5 μ I ;總反應體系為25 μ I ;③、設置陰性對照以同體積量的DEPC處理水代替步驟②擴增反應體系中的DNA模板，作為陰性對昭.④、設置陽性對照以同體積量的所述引物組所對應菌的標準DNA代替步驟②擴增反應體系中的DNA模板，作為陽性對照；⑤、上述擴增反應體系、陰性對照和陽性對照分別進行以下操作先於60 65°C反應30 60分鐘；然後使酶失活；4)、結果的判讀步驟3)所得的擴增反應體系、陰性對照和陽性對照各自所得反應液分別按照以下任一方式進行操作方式一、①、將步驟3)所得的擴增反應體系、陰性對照和陽性對照各自所得反應液在可見光下直接用肉眼觀察，比較擴增反應體系反應液、陰性對照反應液和陽性對照反應液的混濁程度；當同時滿足陰性對照反應液為澄清透明、且陽性對照反應液為白色混濁時，進入步驟②，否則進入步驟③；②、進行樣品的判定當擴增反應體系反應液為澄清透明時，則待測液態乳製品的檢測結果為陰性；SP，待測液態乳製品中不含有所述引物組所對應的菌；當擴增反應體系反應液為白色混濁時，則待測液態乳製品的檢測結果為陽性；SP，待測液態乳製品中含有所述引物組所對應的菌；③、檢測失敗，需要重新進行檢測；方式二、①、將步驟3)所得的擴增反應體系、陰性對照和陽性對照各自所得反應液在紫外燈照射的狀態下用肉眼觀察，比較擴增反應體系反應液、陰性對照反應液和陽性對照反應液的混濁程度；當同時滿足陰性對照反應液為澄清透明、且陽性對照反應液出現強烈的藍色螢光時，進入步驟②，否則進入步驟③；②、進行樣品的判定、
當擴增反應體系反應液為澄清透明時，則待測液態乳製品的檢測結果為陰性；SP，待測液態乳製品中不含有所述引物組所對應的菌；當擴增反應體系反應液出現強烈的藍色螢光時，則待測液態乳製品的檢測結果為陽性；即，待測液態乳製品中含有所述引物組所對應的菌；③、檢測失敗，需要重新進行檢測。作為本發明便捷的乳製品病原體檢測方法的改進
大腸菌群引物組中的4條引物為Coli-BIP AACAAATGCCCTGCTTCCAGGA-CGGTTTGGGGTACGATTTCGColi-FIP CTCGTCATCACACCTCAGCGTT-TTGTCCCGGTTTAAGCATGTColi-F3 CTATGTTAGCCGGGCGACColi-B3 TCTACCTGACCACCTGTGT ；乳酸菌引物組中的4條引物為Lac-BIP CTGGGGAGTACGACCGCAAG-AAACCACATGCTCCACCGLac-FIP TGAAGGGCGGAAACCCTCCA-ATACCTGGTAGTCCATGCCGLac-F3 CATGGGTAGCGAACAGGATTLac-B3 TCTTCGCGTTGCTTCGAATT ；沙門氏菌引物組中的4條引物為Sal-BIP GCGGCCTGCGAAGCGATATC-TATCCACAGCGTGTCCCGSal-FIP GCGACATCACTTTCCTCCCGC-TCTCATGAGTCTGCCGTGGSal-F3 ATTGCTCAGAACGCACTACASal-B3 GGGTGAAGCGGTAAAACAGA志賀氏菌引物組中的4條引物為Shi-BIP CTGGGACATATCCCTCCGGCA-CAGGTTGCCAGATCATCGTShi-FIP CGTGGTGTGCCCATAGACTCCT-TATGGAGGGCCCATAGACAAShi-F3 GACCCCATAAAGCTGGACAGShi-B3 GCCCCGAGTTTCCTAGAGAA ；金黃色葡萄球菌引物組中的4條引物為SA-BIP AACGCATTAAGCACTCCGCCT-GGGTCCCCGTCAATTCCTSA-FIP CACTAAGGGGCGGAAACCCC-CTGGTAGTCCACGCCGTASA-F3 CGTGGGGATCAAACAGGATTSA-B3 CATGCTCCACCGCTTGTG黴菌引物組中的4條引物為mold-BIP ACTGATACGGGGCTCTTTTGGG-GCCCTCCAATTGTTCCTCGmoId-FIP ACCTCCCCGTATCGGGATTGG-TGAGAAACGGCTACCACATCmold-F3 AGGGTTCGATTCCGGAGAGmold-B3 GAATTACCGCGGCTGCTG。作為本發明便捷的乳製品病原體檢測方法的進一步改進步驟2)中TEN為每IOOml 的 TEN 中含有 O. 9 I. Iml 的 pH 7. 2 的濃度 IM 的 Tris,O. 18 O. 22mL的pH 8. O的濃度(λ 5M的EDTA，O. 58 O. 60g的NaCl ;其餘為水。作為本發明便捷的乳製品病原體檢測方法的進一步改進步驟3)的步驟①中以BIP為後綴的引物和以FIP為後綴的引物稀釋成18 22pmole/ μ I,以F3為後綴的引物和以Β3為後綴的引物稀釋成4. 5 5. 5pmole/ μ I。作為本發明便捷的乳製品病原體檢測方法的進一步改進步驟3)的步驟④的陽 性對照中引物組所對應菌的標準DNA的濃度為O. 8 I. 2ng/y I。鑑於目前食品安全領域對食品安全檢測技術和產品的迫切需求，本發明人基於核酸恆溫擴增技術，開發了一款可用於乳製品中病原體的快速、便捷的檢測方法，屬於基於核酸的食品安全檢測領域，不同於傳統的平板法，不會受抗生素幹擾，並且具有無須複雜儀器，肉眼即可辨識結果，可以適合在普通家庭就能使用的優點；該方法還具有很強的前瞻性，可以方便的增加所需要檢測的病原體。在本發明中，設計大腸菌群、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、黴菌的對應引物組可依照如下方法進行先從NCBI資料庫獲得待測菌的特異區核酸序列，網址如下http://www. ncbi.nlm. nih. gov/genomes/MICROBES/microbial taxtree. html ;然後利用軟體設計擴增弓I物，軟體地址為http: //primerexplorer. jp/elamp4. O. O/index, html。所有序歹丨J可委託英俊 公司製備，HPLC純化。本發明的步驟3)的步驟⑤中，反應可在PCR儀中進行，也可以直接在水浴鍋，甚至是保溫效果較好的保溫杯中進行，因此適合普通消費者家用。本發明的步驟3)的步驟②的設置擴增反應體系中2X反應液(RM)*、Bst DNA聚合酶、螢光染料均可通過市購的方式獲得，例如可從北京藍譜生物科技有限公司購得，貨號LMP221 (包括了 2 X反應液(RM)*和Bst DNA聚合酶)與LMP204(螢光染料)。在本發明的步驟4)的方式一中當陰性對照反應液不是澄清透明(即陰性對照有擴增產物)，或者陽性對照反應液不是白色混濁(即，陽性對照無擴增產物)時，說明檢測失敗，需要重新進行檢測。在本發明的步驟4)的方式二中當陰性對照反應液不是澄清透明(即陰性對照有擴增產物)，或者陽性對照的反應液沒有出現強烈的藍色螢光(即，陽性對照無擴增產物)時，說明檢測失敗，需要重新進行檢測。本發明的方法是一種基於核酸恆溫擴增的病原體檢測方法，該檢測方法具有步驟簡潔、無須複雜的儀器、易於操作、可利用肉眼辨識實驗結果的優點，非常具有開發成普通產品的潛力，能讓普通消費者定性檢測乳製品中是否含病原體。即，利用本發明的方法，普通家庭可以用來判斷家中乳製品，如純奶，是否被病原體汙染。綜上所述，本發明具有以下的優點I、檢測時間短，包括樣品前處理，1-2小時即可完成。2、可適合普通消費者在家庭中使用，無須複雜的儀器，只要一個恆溫的水杯，用肉眼即可辨識實驗結果。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖I是利用本方法檢測12種不同的牛奶中大腸桿菌，用肉眼直接觀察的示意圖；圖2是利用本方法檢測12種不同的牛奶中大腸桿菌，在紫外燈照射下再用肉眼觀察的示意圖。
具體實施例方式以下實施例中所用到的12份樣品，預先按照傳統的平板法進行檢測，具體檢測結果如表I所示。
表I、平板法檢測結果
權利要求
1.便捷的乳製品病原體檢測方法，其特徵是包括以下步驟 1)、設計引物 設計大腸菌群、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、黴菌的對應引物組各一套；每套引物組中含有4條引物； 2)、待測液態乳製品的前處理，依次進行以下步驟 ①、將待測液態乳製品於3 5°C下1000-2000rpm離心15 25min，棄上層懸浮物； ②、在上述步驟的所得物中加入PBS，輕輕震蕩從而使沉澱重新懸浮，於3 5°C下1000 2000rpm離心15 25min,棄上層懸浮物； 所述PBS與步驟I)中的待測液態乳製品的體積比為8 12 50 ； ③、重複步驟②2次；4000 6000g離心8 12min,棄上清；得沉澱； ④、按照TEN: IN的NaOH溶液為22 2. 8 3. 2的體積比，在步驟③所得的沉澱中加A TEN和IN的NaOH溶液，直至沉澱完全懸浮； ⑤、先將步驟④的所得物於90 100°C加熱7 9min，然後冷卻至<室溫； ⑥、將部分的步驟⑤所得物進行DNA濃度檢測，其餘的步驟⑤所得物於-20°C保存備用，作為DNA模板； 3)、核酸的恆溫擴增 利用步驟I)所得的每套引物組分別進行以下操作 ①、步驟I)所得的每套引物組中的引物用DEPC處理水進行溶解稀釋； ②、設置擴增反應體系2X 反應液(RM) *12. 5 u I,Bst DNA 聚合酶 Iii 1， 4種引物各I Ul，DNA 模板 2 u I, 螢光染料I U 1，DEPC處理水4. 5 ill ; 總反應體系為25ii I ; ③、設置陰性對照 以同體積量的DEPC處理水代替步驟②擴增反應體系中的DNA模板，作為陰性對照； ④、設置陽性對照 以同體積量的所述引物組所對應菌的標準DNA代替步驟②擴增反應體系中的DNA模板，作為陽性對照； ⑤、上述擴增反應體系、陰性對照和陽性對照分別進行以下操作 先於60 65°C反應30 60分鐘；然後使酶失活； 4)、結果的判讀 步驟3)所得的擴增反應體系、陰性對照和陽性對照各自所得反應液分別按照以下任一方式進行操作 方式一、 ①、將步驟3)所得的擴增反應體系、陰性對照和陽性對照各自所得反應液在可見光下直接用肉眼觀察，比較擴增反應體系反應液、陰性對照反應液和陽性對照反應液的混濁程度；當同時滿足陰性對照反應液為澄清透明、且陽性對照反應液為白色混濁時，進入步驟②，否則進入步驟③； ②、進行樣品的判定 當擴增反應體系反應液為澄清透明時，則待測液態乳製品的檢測結果為陰性；待測液態乳製品中不含有所述引物組所對應的菌； 當擴增反應體系反應液為白色混濁時，則待測液態乳製品的檢測結果為陽性；待測液態乳製品中含有所述引物組所對應的菌； ③、檢測失敗，需要重新進行檢測； 方式二、 ①、將步驟3)所得的擴增反應體系、陰性對照和陽性對照各自所得反應液在紫外燈照射的狀態下用肉眼觀察，比較擴增反應體系反應液、陰性對照反應液和陽性對照反應液的混濁程度； 當同時滿足陰性對照反應液為澄清透明、且陽性對照反應液出現強烈的藍色螢光時，進入步驟②，否則進入步驟③； ②、進行樣品的判定 當擴增反應體系反應液為澄清透明時，則待測液態乳製品的檢測結果為陰性；待測液態乳製品中不含有所述引物組所對應的菌； 當擴增反應體系反應液出現強烈的藍色螢光時，則待測液態乳製品的檢測結果為陽性；待測液態乳製品中含有所述引物組所對應的囷； ③、檢測失敗，需要重新進行檢測。
2.根據權利要求I所述的便捷的乳製品病原體檢測方法，其特徵是 大腸菌群引物組中的4條引物為 Coli-BIP AACAAATGCCCTGCTTCCAGGA-CGGTTTGGGGTACGATTTCGColi-FIP CTCGTCATCACACCTCAGCGTT-TTGTCCCGGTTTAAGCATGTCoIi-F3 CTATGTTAGCCGGGCGACCoIi-B3 TCTACCTGACCACCTGTGT ； 乳酸菌引物組中的4條引物為Lac-BIP CTGGGGAGTACGACCGCAAG-AAACCACATGCTCCACCGLac-FIP TGAAGGGCGGAAACCCTCCA-ATACCTGGTAGTCCATGCCGLac-F3 CATGGGTAGCGAACAGGATTLac-B3 TCTTCGCGTTGCTTCGAATT ； 沙門氏菌引物組中的4條引物為Sal-BIP GCGGCCTGCGAAGCGATATC-TATCCACAGCGTGTCCCGSal-FIP GCGACATCACTTTCCTCCCGC-TCTCATGAGTCTGCCGTGGSal-F3 ATTGCTCAGAACGCACTACASal-B3 GGGTGAAGCGGTAAAACAGA志賀氏菌引物組中的4條引物為Shi-BIP CTGGGACATATCCCTCCGGCA-CAGGTTGCCAGATCATCGTShi-FIP CGTGGTGTGCCCATAGACTCCT-TATGGAGGGCCCATAGACAAShi-F3 GACCCCATAAAGCTGGACAG Shi-B3 GCCCCGAGTTTCCTAGAGAA ； 金黃色葡萄球菌引物組中的4條引物為SA-BIP AACGCATTAAGCACTCCGCCT-GGGTCCCCGTCAATTCCTSA-FIP CACTAAGGGGCGGAAACCCC-CTGGTAGTCCACGCCGTASA-F3 CGTGGGGATCAAACAGGATTSA-B3 CATGCTCCACCGCTTGTG黴菌引物組中的4條引物為mold-BIP ACTGATACGGGGCTCTTTTGGG-GCCCTCCAATTGTTCCTCGmoId-FIP ACCTCCCCGTATCGGGATTGG-TGAGAAACGGCTACCACATCmold-F3 AGGGTTCGATTCCGGAGAGmold-B3 GAATTACCGCGGCTGCTG。
3.根據權利要求2所述的便捷的乳製品病原體檢測方法，其特徵是所述步驟2)中TEN 為 每IOOml的TEN中含有0. 9 I. Iml的pH 7. 2的濃度IM的Tris、0. 18 0. 22mL的pH 8. 0的濃度0. 5M的EDTA, 0. 58 0. 60g的NaCl ;其餘為水。
4.根據權利要求3所述的便捷的乳製品病原體檢測方法，其特徵是所述步驟3)的步驟①中以BIP為後綴的引物和以FIP為後綴的引物稀釋成18 22pmole/ y I,以F3為後綴的引物和以B3為後綴的引物稀釋成4. 5 5. 5pmole/u I0
5.根據權利要求3或4所述的便捷的乳製品病原體檢測方法，其特徵是所述步驟3)的步驟④的陽性對照中引物組所對應菌的標準DNA的濃度為0. 8 I. 2ng/u I0
全文摘要
本發明公開了一種便捷的乳製品病原體檢測方法，包括以下步驟1)設計大腸菌群、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、黴菌的對應引物組各一套；2)待測液態乳製品進行前處理，作為DNA模板；3)核酸的恆溫擴增包括設置擴增反應體系、設置陰性對照、設置陽性對照；對上述擴增反應體系、陰性對照和陽性對照分別進行以下操作先於60～65℃反應30～60分鐘；然後使酶失活；4)結果的判讀將步驟3)所得的擴增反應體系、陰性對照和陽性對照各自所得反應液在可見光下直接用肉眼觀察，或者在紫外燈照射的狀態下用肉眼觀察；從而判定待測液態乳製品的檢測結果為陰性還是陽性。
文檔編號C12Q1/68GK102634573SQ201210035928
公開日2012年8月15日 申請日期2012年2月17日 優先權日2012年2月17日
發明者餘文菁, 宓婭娜, 洪旭濤, 程小璇, 邵暉 申請人:杭州銳創生物技術有限公司