藻體內葉黃素的保存方法
2023-06-02 15:31:21
專利名稱：藻體內葉黃素的保存方法
技術領域：
本發明涉及一種葉黃素、特別是含有蝦青素的藻體內葉黃素的保存方法。另外，本發明涉及一種提高葉黃素在含葉黃素的乾燥藻體內的保存穩定性的方法。
背景技術：
葉黃素(如蝦青素、角黃素、玉米黃質、阿多尼如賓(adonirubin)、金盞花黃質、隱黃質等)是一種類胡蘿蔔素，具有多種用途。例如，已知蝦青素是紅色的類胡蘿蔔素一種，具有極強的抗氧化作用。因此被用作魚類等的重染用飼料、食用色素、化妝品、保健食品等。作為含有蝦青素的飼料，例如將法夫酵母經過氫氧化鈉處理而生產出的飼料(專利文獻1)；將藻體粉碎後，經過冷凍乾燥再研成粉末而生產出的飼料(專利文獻2)。
蝦青素或通過化學合成得到，或從磷蝦、甜蝦等蝦類以及法夫酵母、藻類等天然物質提取。在提取蝦青素的情況下，由於磷蝦、甜蝦、螃蟹等甲殼類，法夫酵母等蝦青素的產量少，所以收率非常低。因此，一般地是從蝦青素含量高的藻類，如從紅球藻屬的綠藻內提取蝦青素。
蝦青素相對熱、氧、光等不穩定，因而，不能直接保存藻體的培養液。為此，多數情況下是在藻體培養後立即進行蝦青素的提取(例如，參照專利文獻3和4)。這種情況下，必須將培養設備和提取設備安置在同一場所。在一次培養了大量藻體的情況下，需要暫時保存培養液或者提取液，為了防止蝦青素的氧化及分解，必須將其在氮氣環境下遮光、低溫保存。再則，還要防止因細菌繁殖等而產生的腐爛。這樣，還必須增添保存設備，涉及到提取工序的成本增加。
為了解決上述問題，行之有效的辦法是，使含有蝦青素的藻體乾燥。專利文獻5刊載的方法是，將含有類胡蘿蔔素的藻體乾燥，將其在食用植物油中粉碎。專利文獻6也刊載了使含有蝦青素的藻體乾燥的方法。但是，在專利文獻5及專利文獻6中，並沒有對蝦青素自身相對乾燥時的熱、氧、光等條件的穩定性進行討論。例如，通過本發明者的研究證明，使用專利文獻6記載的乾燥方法單單對藻體進行乾燥的情況下，藻體內的蝦青素分解，蝦青素含量降低。
另外，也曾有人開發了一種方法，就是把藻體破碎物與各種添加物混合在一起，製作成粉狀混合物，由此來提高蝦青素的長期保存性(專利文獻7)。但是，就這種方法而言，由於必需表面活性劑、抗氧化劑等添加物，所以提高了成本，或者由於含有表面活性劑，在提取物中混入這些添加物，必須將其去掉，因而不理想。
如上所述，在本發明之前，還沒有一種保存方法，通過簡單的手段使得葉黃素類在藻體內長期且穩定地得以保存。
特開平6-105657號公報[專利文獻2]特開平3-83577號公報[專利文獻3]特開平9-111139號公報[專利文獻4]特開昭53-38653號公報[專利文獻5]特開平7-8212號公報[專利文獻6]特開2004-129504號公報[專利文獻7]國際公開第2002/077105號小冊子[非專利文獻1]佐藤恭子等，日本食品衛生雜誌，39卷，6號，368～374頁，1998年發明內容本發明的目的在於，提供一種含葉黃素藻體內葉黃素的保存方法，由此提供提高含葉黃素的乾燥藻體內的葉黃素，特別是蝦青素的保存穩定性的方法。
本發明提供一種藻體內葉黃素的保存方法，該方法包含培養含葉黃素的藻體後、回收的工序，和對該回收的藻體進行乾燥使水分含量為3質量％以下的工序。
本發明還提供一種提高含葉黃素乾燥藻體內的葉黃素的保存穩定性的方法，該方法包含使該藻體乾燥，使藻體中的水分含量為3質量％以下的工序。
在某實施方式中，無論對上述哪種方法，上述葉黃素是蝦青素。
在另一實施方式中，無論對上述哪種方法，上述藻體是屬於紅球藻屬的綠藻。
在進一步的實施方式中，無論對上述哪種方法，上述綠藻指的是雨生紅球藻。
在另外的實施方式中，無論對上述哪種方法，上述乾燥是通過噴霧乾燥法來進行的。
在進一步的實施方式中，無論對上述哪種方法，上述噴霧乾燥法是使用噴霧乾燥裝置來進行的，該噴霧乾燥裝置中，排風溫度調整為125℃以上。
本發明還提供一種葉黃素的製造方法，該方法包含上述任一種提高葉黃素的保存穩定性的方法。
發明效果通過使用本發明的方法，能夠在室溫條件下(即無須冷凍或冷卻保存)持久而穩定地保存含有葉黃素的乾燥藻體內的葉黃素。用本發明的方法生產出來的含有葉黃素的乾燥藻體，能夠在室溫下長期保存，適合用於葉黃素特別是蝦青素的提取和精製加工。因此比如，能夠將含蝦青素藻體的培養工序和蝦青素的提取、精製工序分開，能夠有效且低成本地製造蝦青素。再則，通過使用本發明的方法，可以使得高濃度蝦青素的保存變得簡單易行，因而提高了蝦青素提取、回收的效率。特別是使用本發明的方法製造出的含有蝦青素的乾燥藻體，當被用作魚類飼料時，由於飼料中的蝦青素得以長期穩定地保存，因而提高了魚類的重染效果。
圖1是可用於本發明的方法的噴霧乾燥裝置模式2是表示各乾燥藻體內的蝦青素含量時效變化的圖具體實施方式
(藻體)本發明所採用的藻體，只要是產生葉黃素的藻體則不特別限定。代表性地優選使用綠藻類，例如，屬於紅球藻屬的單細胞藻類。紅球藻屬例如有雨生紅球藻(H.pluvialis)、湖生紅球藻(H.lacustris)、H.capensis、H.droebakensi、H.zimbabwiensis等等。
雨生紅球藻(H.pluvialis)例如，NISE144株被保藏在獨立行政法人國立環境研究所，UTEX2505株被保藏在美國德克薩斯大學的藻類保存設施，K0084株被保藏在丹麥哥本哈根大學的Scandinavian CultureCenter for Algae and Prtozoa，Botanical Institute等。
湖生紅球藻(H.lacustris)例如有，保藏在ATCC的ATCC30402株以及30453株，保藏在東京大學分子細胞生物研究所的IAM C-392株、IAM C-393株、IAM C-394株以及IAM C-339株，或者還有UTEX 16株和UTEX 294株等。
H.capnsis例如有UTEX LB1023株等。
H.droebakensi例如有UTEX 55株等。
H.zimbabwiensis例如有UTEX LB1758株等。
在這些藻類中，優選使用雨生紅球藻。
(含有葉黃素的藻體的培養)含有葉黃素的藻體，能夠在產生葉黃素的條件下，通過培養上述藻體生產出來。對於產生葉黃素的條件並無特別限制。例如有如下方法，例如，在明亮的條件下，一邊通入二氧化碳氣體，一邊使藻體的營養細胞在氮源及含有微量金屬的培養基中繁殖，然後對繁殖後的藻體，通過單獨或組合施於光照射等物理性應激、營養飢餓等生物學應激、過氧化氫和/或鐵化合物等添加劑方面的化學物質應激等應激，促使營養細胞包囊化。另外，也可以添加醋酸等作為碳源進行暗培養，促使其營養繁殖，然後使其包囊化(例如可參照專利文獻2和6)。
得到的藻體通過離心分離而回收，根據需要，經水洗過後，調整藻體濃度使其固態成分的濃度約為5～40％，優選濃度10～30％，附加以下詳述的乾燥工序。
在本發明中，所謂的葉黃素是指具有含氧官能團的類胡蘿蔔素的總稱，非指特定的化合物。在本發明中，主要是指由藻體生產的葉黃素，這種葉黃素具代表性的有蝦青素、角黃素、玉米黃質、阿多尼如賓、金盞花黃質、隱黃質等、這些物質的脂肪酸酯等。
(藻體的乾燥)
含葉黃素藻體的乾燥，以使乾燥藻體內的水分含量為3質量％以下。如果幹燥藻體內的水分含量超過3質量％，就會導致乾燥藻體內的葉黃素在保存時分解，降低葉黃素的保存穩定性。
對於乾燥方法無特殊限制。比如有下述乾燥方法滾筒乾燥(實例可參照國際公開第2000/057724號小冊子)、熱風乾燥法(實例可參照特開2002-119252號)、冷凍乾燥法(實例可參照美國專利第6163979號說明書)以及噴霧乾燥法等。從防止葉黃素熱分解的角度來分析，優選冷凍乾燥法等低溫乾燥，但其不足之處是，乾燥過程需要較長時間，乾燥設備需要高成本投入等。在使用滾筒乾燥法、熱風乾燥法或者噴霧乾燥法的情況下，由於擔心由於加熱而葉黃素分解，所以要注意加熱的溫度和加熱的時間。
藻體乾燥時，為了防止藻體內的葉黃素(特別是脂肪酸酯)分解，優選儘可能低的溫度條件，優選使藻體內的溫度不超過100℃。在滾筒乾燥法以及熱風乾燥法中，其加熱溫度一旦超過100℃，藻體內的溫度有時會超過100℃。而且，由於被乾燥的藻體顆粒一個個粒徑都比較大，乾燥時就需要一定的時間。鑑於此，在本發明中，優選採用噴霧乾燥法。
噴霧乾燥法，可以通過任意的噴霧乾燥裝置來實施。如圖1模式性地顯示典型的噴霧乾燥裝置。根據圖1，下面對藉助該噴霧乾燥裝置的對藻體的乾燥工序加以說明。
含藻體的生料通過生料槽2送入噴霧乾燥裝置的主體1內。生料與壓氣機3噴出的壓縮空氣一起從噴霧器4的前端噴向主體1內。通過加熱室5內的加熱器6，向主體1內輸送暖空氣，以乾燥被噴霧的藻體。向主體1內邊噴霧乾燥，邊下落的藻體堆積在主體1內的斜面部7。在斜面部7設有衝擊錘8，其作用在於提供衝擊以使該堆積物落下。在流路9的末端設有風扇10，藉助風扇10的運轉，將加熱器6產生的暖空氣從加熱室5導入主體1內，將已乾燥的藻體送入旋風收塵器(回收器)11內。此外在流路9內設有溫度計12，其作用在於，準確指示送入旋風收塵器(回收器)11的含乾燥藻體的空氣的溫度。在旋風收塵器11內，因為乾燥藻體堆積在下部，所以通過閥門13的開啟，就能把藻體回收到容器14內。
在這種噴霧乾燥裝置中，由加熱室6向主體1輸送的熱風溫度優選200～400℃，更優選250～350℃，特別優選300℃左右。在這種噴霧乾燥裝置中，在流路9內的排風溫度優選高於120℃，更優選125℃以上，特別優選130℃以上。但是，如果排風溫度超過150℃，就會導致藻體內的溫度過高，有可能引起葉黃素的熱分解，因此，排風溫度優選不超過150℃，更優選140℃以下。通過使用這種噴霧乾燥法來進行乾燥，在比較短的時間內使乾燥藻體內的水分含量為3質量％以下。特別是當葉黃素為蝦青素的情況，優選按照這樣的條件進行。尤其是噴霧乾燥法，通過調整排風溫度，可以幾乎不依賴乾燥的藻體濃度，調整乾燥藻體內的水分含量，故優選使用。
經過這些工序，使其水分含量降到3％以下，優選採用噴霧乾燥法，將排風溫度調整到125℃以上來對藻體進行乾燥，使乾燥藻體內的水分濃度為3％以下。將得到的乾燥藻體，在空氣溼度為30～40％的條件下，放入玻璃瓶等容器中密封遮光，即使在常溫條件下保存，也幾乎不會引起葉黃素的分解。在第一實施方式中，曾把含有蝦青素且水分含量在3％以下的藻體，在室溫條件下放置在溼度為30～40％的空氣中，保存50天後，蝦青素的分解率不到10％。另外，使乾燥體內的水分含量超過3％時，在同等條件下保存50天後，蝦青素的分解率竟達40％。從如上效果來看，使用本發明的方法，藻體內的蝦青素其保存穩定性提高了，因此能夠使得藻體內的蝦青素得以長期保存。對於乾燥後的乾燥藻體，為進一步防止其葉黃素分解，優選保持在低溼度、且低氧環境中，比如，將其裝入真空鋁罐中保存，以使其不吸收水分。
需要說明的是，乾燥藻體內的水分含量通過下述方法求得。把玻璃皿放入預置好溫度的低溫乾燥機內，加熱一個小時後移到乾燥器。放置冷卻到室溫溫度，立刻測其質量，測量單位為0.1mg。然後重複上述加熱、放置冷卻和測重這些操作，求得衡重(W0g)。其次，快速取1～2g試樣均勻攤放在玻璃皿中，蓋上蓋，正確測量(W1g)。把蓋和玻璃皿錯開放入低溫乾燥機內，低溫乾燥機的溫度達到105℃後，經過3個小時的乾燥，然後，快速在乾燥機內把蓋蓋上，移動到乾燥器內放置冷卻。等冷卻到室溫後，立刻稱量(W2g)。樣品中的水分濃度由下述公式求得。
樣品內水分含量(％)＝(W1-W2)/(W1-W0)×100(葉黃素的提取、回收、精製)本發明能夠從水分含量在3質量％以下的乾燥藻體中，提取、回收葉黃素。提取、回收葉黃素的方法無特別限制，通常使用同行業常用的方法。例如有使用三氯甲烷、己烷、丙酮、甲醇、乙醇等有機溶劑、食用油脂等進行化學提取的方法；或者採用壓榨等的物理提取的辦法。或者可以用超臨界提取法來進行提取、回收。提取後，可以經濃縮、晶析、以及藉助合成樹脂(例如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物等)進行分離等方法進行精製。
根據本發明，因為使藻體內水分含量降到3質量％以下時，藻體內的葉黃素保持在較高的濃度，所以從該藻體內提取回收的葉黃素數量不會減少。因此，通過使用本發明的保存方法或提高保存穩定性的方法，能夠高效益地從大批量培養的藻類中回收和製造葉黃素。
實施例下面，通過使用紅球藻屬藻體的實施例，對本發明進行詳細說明。毋庸置疑，本發明絕不僅僅局限於該實施例。
首先，對葉黃素的測定方法、蝦青素同分異構體的測定方法、以及藻體乾燥質量的測定方法，加以說明。
(葉黃素的測定方法)取一定量的樣品放入顆粒攪拌器專用的微管中。在相同管中加入氧化鋯顆粒，之後加入丙酮，用顆粒攪拌器把樣品打碎。破碎後，經離心器分離使試樣分為上清和下沉澱，回收上清部分(即丙酮部分)。在沉澱物中再加入丙酮，重複上述同樣的操作，直至沉澱物幾乎完全發白為止。把回收的丙酮組分裝到一起，用二甲基亞碸(DMSO)稀釋到10倍，測定492nm對應的吸光度(A492)以及750nm對應的吸光度(A750)。回收丙酮組分(樣品)中葉黃素的濃度(按游離體換算)，由下述公式求得。
樣品中葉黃素的濃度(μg/mL)＝4.5×100×(A492-A750)另外，在下述實施例中使用雨生紅球藻生產的葉黃素，絕大多數是蝦青素。上述葉黃素的測定方法也同樣適用於蝦青素的測定。
(蝦青素同分異構體的測定方法)將上述測定葉黃素而配製的樣品(回收丙酮組分)，溶解於0.15M磷酸緩衝液(pH值7.0)中，再添加甾醇酯酶，使蝦青素水解。通過使用ODS柱的高效液相色譜，來分析這種水解物。這裡使用的檢測器是紫外線檢測器或光電二極體陣檢測器。高效液相色譜的分析條件跟非專利文獻1上記載的條件相同。在這一條件下，按照反式-蝦青素(保持時間約7.9分鐘)、9-順式-蝦青素(保持時間約8.9分鐘)、以及13-順式-蝦青素(保持時間約9.3分鐘)順序依次溶解析出。假定這些化合物的摩爾吸光係數是相同的，通過比較面積值就能求得各種化合物的比例。
(藻體濃度的測定方法)
藻體濃度通過下述方法求得。取一定量的培養液，用GC50玻璃纖維濾紙(TOYO ADVANTEC制)進行吸引過濾。為了溶解無機鹽類，用5毫升pH4的鹽酸溶液將濾紙清洗2次。然後，將濾紙用105℃的恆溫乾燥機進行3個小時的乾燥，再在真空乾燥器中冷卻1個小時至室溫，測定濾紙的乾燥質量。再者，預先將GC50玻璃纖維濾紙，用上述恆溫乾燥機在105℃、乾燥1小時，測定濾紙的質量。從吸附藻體的乾燥濾紙質量中，扣除預先測定的濾紙乾燥質量，來求得藻體的乾燥質量，由此測定每單位容積或每單位質量的藻體濃度。另外，對於乾燥藻體在分散液中的藻體濃度的測定，除了不用鹽酸溶液清洗之外，其它同上述方法一樣。
(配製實例含蝦青素藻體的培養)採用產生蝦青素的雨生紅球藻K0084株(以下簡單地稱作K0084株)。在容積為1.5L、光程25mm的密封扁平培養瓶中，加入1L如下表1所示的MBG-11培養基，接種K0084株，使起始濃度為0.6g/L。
表1
以600mL/分鐘的速度(即0.6vvm)通入含有3體積％二氧化碳的空氣，同時將培養溫度調整到25℃、pH值調整到6～8之間，在下述光照條件下培養5天。
光照射採用的光源為白色螢光燈(松下電器產業株式會社制、FL40SSW/37)。調整光照射強度，使其用L1COR-190SA平面光量子傳感器測量，培養槽受光方向的PPFD為100μmol-p/m2s。
培養後的K0084株，顏色由綠色逐漸向茶色～茶褐色改變，已確定被包囊化。
接著，向與上述相同的扁平培養瓶中裝入相同的培養基(MBG-11)，接種起始濃度為0.6g/L、已經包囊化了的K0084株。在與上述相同的培養條件，培養200個小時。通過這種培養，可得到含4.2質量％的蝦青素的藻體。
實施例把通過上述配製例得到的藻體，經過離心分離回收、水洗，使藻體含量大致調整到18質量％左右，以便通過噴霧乾燥法乾燥。使用噴霧乾燥裝置(Anhydro APV PSD52)，將入口處的熱風溫度設定為300℃，出口處排風溫度分別設定在105℃、120℃、1 30℃或140℃，得到各個乾燥藻體A～D。對乾燥藻體A～D分別測定其水分含量、蝦青素濃度以及蝦青素同分異構體的濃度。結果如表2所示。
表2
從該張表可知乾燥藻體內的水分含量隨排風溫度的增高而減少，當排風溫度為140℃時，藻體內的水分含量為1.87％。而藻體內的蝦青素，其絕大部分9位和13位的雙鍵都是反(trans)體。但是，隨著排風溫度的增高，其同分異構體9-順(9-cis)體和13-順(13-cis)體有增加的趨勢。其顯示加熱促進蝦青素的同分異構化。
然後，將得到的乾燥藻體樣品A～D，裝到玻璃瓶中使其為30體積％密封，在室溫溫度、30～40％的溼度條件下保存。定時測定各種蝦青素的濃度，作為評價其保存穩定性的指標。結果如圖2所示。
從圖2可知，水分含量在3質量％以下的乾燥藻體C和D，儘管其保存於室溫下空氣環境中的玻璃瓶中，但蝦青素的分解極其緩慢。特別是水分濃度在2％以下的乾燥藻體D，即使保存時間超過80天，蝦青素也幾乎沒有發生分解。而乾燥藻體C，在第50天，其分解率在10％以下。另一方面，水分含量在3％質量以上的乾燥藻體A和B，都發生了蝦青素的分解，在第50天，30～40％的蝦青素發生了分解。分析上述結果可知，對於蝦青素的分解，與藻體乾燥時的熱相比，乾燥藻體中的殘存水分影響較大。從這些結果來看，通過將乾燥藻體中的水分濃度控制在3質量％以下，蝦青素將會穩定地保存。另外，將依照本發明的方法生產的乾燥藻體C和D，與相當於比較例的乾燥藻體A和B進行對比，不難看出，從保存開始到第20天之後，殘存蝦青素量出現很大的差異。因此，本發明的方法在保存20天以上的情況下特別有用。
由以上可知在使用噴霧乾燥法的情況下，即使容許部分蝦青素進行熱分解，但將藻體內水分含量降到3質量％以下這一方法，最終對於蝦青素穩定地保存是有效的。
根據本發明的方法，能夠使葉黃素，特別是含有遇到熱、氧、光易於分解的蝦青素的乾燥藻體內的葉黃素(蝦青素)，在室溫、空氣條件下長期而穩定地保存。因此，對於葉黃素，特別是蝦青素的穩定化及製造有用。另外，根據本發明的方法，當把含有蝦青素的乾燥藻體用作魚類飼料時，因為飼料中的蝦青素能夠長期而穩定地保存，所以提高了魚的重染效果。
權利要求
1.一種藻體內葉黃素的保存方法，其包括培養含葉黃素的藻體後，將其回收的工序；以及對該回收的藻體進行乾燥以使藻體內的水分為3質量％以下的工序。
2.如權利要求1記載的方法，所述葉黃素是蝦青素。
3.如權利要求1或2記載的方法，所述藻體是屬於紅球藻屬的綠藻。
4.如權利要求3記載的方法，所述綠藻是雨生紅球藻。
5.如權利要求1～4中任一項記載的方法，所述乾燥是通過噴霧乾燥法進行的。
6.如權利要求5記載的方法，所述噴霧乾燥法是使用噴霧乾燥裝置來進行，該噴霧乾燥裝置中，排風溫度調整在125℃以上。
7.一種提高含葉黃素的乾燥藻體中的葉黃素保存穩定性的方法，其包括使藻體乾燥成而使藻體中水分含量為3質量％以下的工序。
8.如權利要求7記載的方法，所述葉黃素是蝦青素。
9.如權利要求7或8記載的方法，所述乾燥是通過噴霧乾燥法進行的。
10.如權利要求9記載的方法，所述噴霧乾燥法是使用噴霧乾燥裝置來進行，該噴霧乾燥裝置中，排風溫度調整在125℃以上。
11.如權利要求7～10中任一項記載的方法，所述藻體是屬於紅球藻屬的綠藻。
12.如權利要求11記載的方法，所述綠藻是雨生紅球藻。
13.一種葉黃素的製造方法，包括權利要求7～12中任一項記載的方法。
全文摘要
本發明提供一種含葉黃素的藻體內的葉黃素的保存方法。本發明的藻體內葉黃素的保存方法，包含回收工序和乾燥工序。回收工序是培養含葉黃素的藻體之後，進行回收；乾燥工序是對該回收的藻體進行乾燥使其水分含量降到3質量％以下。乾燥優選採用噴霧乾燥法，在噴霧乾燥裝置的排風溫度為125℃以上的乾燥條件下進行。在這樣的乾燥藻體中，即使放置在室溫空氣中保存，葉黃素也能得以長期而穩定地保存。
文檔編號C07C403/00GK1869194SQ20061008478
公開日2006年11月29日 申請日期2006年5月17日 優先權日2005年5月17日
發明者石倉正治 申請人:山葉發動機株式會社