抗狂犬病病毒單克隆抗體及其製備方法、應用的製作方法

2023-06-02 14:02:26 1

專利名稱：：抗狂犬病病毒單克隆抗體及其製備方法、應用的製作方法
技術領域：
：本發明抗狂犬病病毒單克隆抗體及其製備方法、應用涉及的是生物醫學領域，具體涉及一種能識別狂犬病病毒的單克隆抗體的製備及其應用。
背景技術：
：狂犬病是由狂犬病病毒(Rabiesvirus)引起的世界性人獸共患傳染病。人和動物一旦發病死亡率高達100%。全球每年約有55，000人死於狂犬病，主要集中在亞非拉發展中國家。人類患者多因病畜咬傷而感染，出現以恐水、畏光、吞咽困難、狂躁等為主要特徵的中樞神經系統感染疾病。該病流行廣、宿主多，幾乎所有溫血動物都能被感染，以各種哺乳動物為主要宿主，是一種危害非常嚴重的人畜共患急性傳染病，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病，也是人類尚未能有效控制的疫病之一。狂犬病毒屬於彈狀病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病病毒屬。病毒顆粒由外殼和核心兩部分組成。外殼為一緊密完整的脂蛋白雙層包膜，表面嵌有數量眾多的由病毒糖蛋白構成的槌狀包膜突起，它覆蓋了除平端外的整個病毒表面，是病毒主要的表面抗原，也是病毒惟一的糖基化蛋白。病毒包膜內側主要是膜蛋白，亦稱基質蛋白。膜蛋白內側為病毒核心，即一個直徑為40nm,的核衣殼，由核酸和緊密8包在它外面的核蛋白所構成，呈緊密的連續性螺旋形式，有3035個巻曲，另外2種核衣殼核心的蛋白為大轉錄酶蛋白或稱RNA多聚酶和磷酸化蛋白。目前，對於狂犬病病毒檢測的方法主要有病毒形態學觀察、組織病理學檢測、小鼠顱內接種分離狂犬病病毒法等，但操作較為繁瑣，或需要使用電鏡等設備。近年來從動物和人類唾液中檢測狂犬病毒抗原的方法也有較大發展，如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和間接免疫螢光技術(IFA)，具有快速、特異敏感、不受標本量限制、節約試劑和試驗成本費用較低等優點。Kohler和Milstein於1975年創立的B淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體(monoclonalantibodies,McAb)技術，作為一類用於基礎研究，實驗室診斷，臨床治療和預防的新型產物，其應用價值和開發前景已獲得普遍的肯定。而目前在我國流行的狂犬病病毒株主要有CNX、CGX、CVS、PG、CTN株等。明平剛(2006)等從系統進化樹上分析表明，CTN株與我國街毒株的抗原關係比其它毒株近。
發明內容本發明的目的是針對上述檢測方法操作較為繁瑣，或需要使用電鏡等設備不足之處，提供一種抗狂犬病病毒單克隆抗體及其製備方法、應用，是一種能識別狂犬病病毒的鼠源性單克隆抗體，該抗體對狂犬病病毒的選擇性強。本發明公開的能識別狂犬病病毒的鼠源單克隆抗體是一種以與我國街毒株的抗原關係比其它毒株近的CTN株滅活病毒為抗原，同時用該病毒包被ELISA板，對得到的抗體進行篩選而獲得的抗狂犬病病毒的單克隆抗體。本發明抗狂犬病病毒的單克隆抗體，是由保藏號為CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株2C5所分泌的。抗狂犬病病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株2C5己於2009年04月09日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號為CGMCCNo.3014。該鼠源雜交瘤細胞株2C5也屬於本發明的保護範圍。抗狂犬病病毒的單克隆抗體的製備方法1、免疫原準備與免疫免疫原的製備採用滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒(純度99%以上，武漢病毒所張愛華惠贈)。動物免疫將上述滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒經測定蛋白濃度為0.67mg/mL，按1:1加入弗氏完全佐劑混合，振蕩乳化半小時，皮下按lOOug(O.3mL/只)免疫BALB/c小鼠；2周後，改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，以同樣方法進行再次免疫；二免後2周，腹腔注射200yg純化抗原加強免疫，三天後融合。2、雜交瘤細胞的融合按常規方法進行雜交瘤細胞的融合。在融合前摘眼球法取陽性血備用。取脾細胞與處於對數生長期的SP2/0細胞用PEG-2000融合。同時，分別從BALB/c免疫小鼠、提供飼養細胞的ICR小鼠採血，作為篩選單抗時對照用的陽性、陰性血清。融合後的細胞用HAT培養基懸浮，分裝96孔板，置37r，5%C02培養箱內培養，5-7d換加新鮮HAT，經常觀察，適時換液和檢測。3、雜交瘤細胞的檢測酶標板的包被在酶標板上，做方陣試驗，即以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原，橫向用PBS倍比稀釋包被ELISA板，以陽性血清為一抗，縱向以100倍、200倍、400倍、800倍稀釋，根據反應結果選擇包被濃度。酶標板的包被簡述如下取純化的抗原蛋白，以碳酸鹽緩衝液，即0.2mol/LNa2C038mL，0.2mol/LNaHC0317mL，加去離子水至100mL，pH9.6，稀釋至包被濃度，同時設陰性對照；以100uL/孔加入ELISA板中，37°C，3小時;PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5%Tween-20，洗滌3次，5分鐘/次;加PBS/FCS，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+10%FCS或1%BSA，200uL/孔，37。C封閉3小時或4。C過夜；PBST洗3次，5分鐘/次，晾乾，一20。C或4。C存放備用。雜交瘤細胞的檢測用上述包被的ELISA板，常規間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養上清，以待檢雜交瘤細胞上清和滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒反應的值，以SP2/0細胞培養上清為陰性對照，P/N>2.l為陽性判定標準。經常規ELISA檢測，根據所設的判定標準，得到七個陽性反應的細胞株，分別經過三次亞克隆後發現其中三株陽性反應丟失，棄去；其餘四株雜交瘤細胞株仍保持了分泌抗狂犬病病毒抗體的能力，其中一株命名為2C5。4、細胞株的建立與腹水製備、純化細胞株的建立按上述判定標準，將篩選得到的陽性雜交瘤細胞進行亞克隆，取分泌抗體穩定的和四次亞克隆後細胞形態良好，生長旺盛的強陽性單克隆細胞，命名建株並擴大培養，一部分液氮凍存，一部分用於單抗腹水製備。腹水製備每隻BALB/c小鼠注射0.5mL降植垸與弗氏不完全佐劑的等體積混合物，7天後腹腔分別注射2C5、2G4、3C7和5E11株的雜交瘤細胞，接種量為5倍105個細胞，約經過一周，待小鼠腹部膨大後抽取腹水，5000轉/分鐘離心15分鐘，取上清，等量加入PH7.2巴比妥緩衝鹽水，即VBS:0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCl，0.8聽1/LMg2+，0.3麵1/LC^+稀釋;然後以每10ml腹水中加150mg二氧化矽粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時搖動；2000g離心20分鐘，脂質等通過該法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22um微孔濾膜過濾，備用。抗體純化用結合緩衝液，即20mM磷酸鹽緩衝液，pH7.0，平衡HiTrapProteinGHP層析柱。用結合緩衝液稀釋樣品後通過層析株。待蛋白峰下降後，用0.1M甘氨酸緩衝液，pH2.7，洗脫層析柱，收集洗脫液。用lMTris，pH9.0調節pH至7，PBS透析，純化的抗體進行SDS-PAGE電泳，用ELISA檢測抗體效價。結果表明，獲得純化抗體10mg。SDS-PAGE電泳結果表明，在還12原劑的作用下，抗體分解為兩個片段，分別為約50KD的重鏈和約25KD的輕鏈，結果附圖l。5、單克隆抗體的鑑定單克隆抗體亞類鑑定使用捕獲ELISA試劑盒檢測單克隆抗體的亞類..1)將表位特徵性抗體IgA，IgGl，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分別用PBS進行l:1000稀釋，100ul/孔包被，每種特徵性抗體包被兩孔，37"C孵育1小時。2)用洗滌液PBST洗滌3次，5分鐘/次。3)每孔加入100ul待檢測的單抗上清，37。C孵育1小時。4)用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次。5)用PBST將辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊IgG抗體進行1:1000稀釋，每孔lOOul,37"C孵育30分鐘。6)用洗滌液洗滌三次，5分鐘/次。7)每孔加入新鮮配置的底物溶液100u1，37。C避光孵育20分鐘。8)每孔加入50ul2MH2S04終止反應。在酶標儀上讀取OD柳的值，以OD值明顯高於其他各個孔的表位特徵性抗體判為其單抗亞類。間接ELISA滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5ug/mL的濃度100u1/孔包被ELISA板，37。C溼盒作用2.5小時，PBST洗3次，5分鐘/次；拍幹後用含5%小牛血清的PBS封閉，37。C溼盒作用2.5小時，PBST洗3次，5分鐘/次，拍幹後加入100倍、200倍、400倍、800倍稀釋、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600、51200稀釋的本研究製備的單抗腹水，37"C溼盒作用90分鐘，PBST洗3次，5分鐘/次，拍幹後加入1:1000稀釋的過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，37'C溼盒作用90分鐘，以TMB顯色，設正常ICR小鼠的血清為陰性對照。結果顯示，本研究製備的單抗腹水與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒的反應為陽性，與正常ICR小鼠的陰性血清的反應為陰性，表l和附圖2。斑點ELISA(Dot-ELISA)將滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，稀釋至濃度為5yg/mL，分別滴加於硝酸纖維素膜上，2化/點，37。C溫箱烘乾，用含1%BSA的PBS溶液37。C封閉2小時，PBS洗三次，5分鐘/次，然後將其浸入1:1000稀釋的2C5、2G4、3C7和5E11株雜交瘤細胞的單抗腹水，37。C作用60分鐘，漂洗後浸入1:1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，37'C作用60分鐘，PBS洗三次，5分鐘/次，以DAB顯色，蒸餾水終止反應。以SP2/0培養上清為陰性對照。四株單克隆抗體的腹水、陽性血清均能與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原的點顯色為陽性；而以SP2/0細胞培養上清與之顯色為陰性，結果見附圖3。免疫印跡(Western-blot)檢測單克隆抗體的特異性分別以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒、GST融合表達的狂犬病糖蛋白的IPTG誘導表達的GST-RVG蛋白和pGEX-6p-1的誘導裂解物為電泳樣品進行SDS-PAGE，按常規方法將蛋白轉印於NC膜上。轉印結束後，取出硝酸纖維素膜，作好標記，放入平皿中，用PBST(含5%脫脂奶粉)室溫封閉過夜，將硝酸纖維素膜轉移到封閉液稀釋的雜交瘤上清中，室溫作用2小時之後，用PBS洗膜3次，每次10分鐘。再分別將膜轉移入用封閉液1:100倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG抗體中，室溫作用2小時後，再用PBS洗3遍，每次10分鐘，DAB進行顯色。免疫印跡結果表明此四株單克隆抗體均能與狂犬病CTN株病毒反應，其中2C5株還能與融合表達的狂犬病糖蛋白GST-RVG(另文報導)反應，而與GST載體菌蛋白不反應，表明此單克隆抗體針對的是狂犬病糖蛋白的，見圖4。單克隆抗體腹水的ELISA效價測定滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5yg/mL的濃度包被ELISA板，100uL/孔，腹水以PBS倍比稀釋，做間接ELISA反應，以P/N》2.1為陽性判定標準。目前，檢測狂犬病毒中和抗體的方法主要有小鼠中和試驗(MNT)、快速螢光灶抑制試驗(RFFIT)等。MNT法實驗費用高，操作繁瑣且周期長，同時由於影響動物試驗的因素較多，使得實驗結果誤差較大，重複性較低。RFFIT法周期短，準確率較高，但操作較為複雜，成本相對較高，且對基礎設施有較高的要求，不利於推廣。ELISA法操作簡單、快速、靈敏、經濟並且適用於批量處理，是蛋白多肽藥代動力學研究的常用方法。本發明利用單克隆抗體技術，製備了抗狂犬病病毒的抗體，並製備了單抗腹水，對其生物學活性進行鑑定，並建立了Dot-ELISA、間接ELISA等狂犬病病毒檢測方法，從檢測方法的結果看，Dot-ELISA和間接ELISA法操作簡單，結果易於判斷且比較準確。目前在我國流行的狂犬病病毒株主要有CNX、CGX、CVS、PG、CTN株等。明平剛(2006)等從系統進化樹上分析表明，CTN株與我國街毒株的抗原關係比其它毒株近。本發明在製備抗狂犬病病毒單克隆抗體時，選擇了與我國街毒株的抗原關係比其它毒株近的CTN株滅活病毒為抗原，同時用該病毒包被ELISA板，對得到的抗體進行篩選而獲得的抗狂犬病病毒的單克隆抗體。以下將結合附圖對本發明作進一步說明。圖1為單克隆抗體的純化的SDS-PAGE。圖2為用間接ELISA方法檢測製備的四株單抗腹水與病毒的結合。圖3為用Dot-ELISA方法檢測製備的四株單抗腹水與病毒的結合。圖4為2C5株單抗與病毒的免疫印跡。具體實施例方式抗狂犬病病毒單克隆抗體其製備方法、應用實施例1免疫原準備與免疫免疫原的製備採用滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒(純度99y。以上，武漢病毒所張愛華惠贈)。動物免疫將上述滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，測定蛋白濃度為0.67mg/mL，按1:1加入弗氏完全佐劑混合，振蕩乳化半小時，皮下按100ug免疫BALB/c小鼠；2周後，改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，以同樣方法進行再次免疫；二免後2周，腹腔注射200ug純化抗原加強免疫，三天後融合。實施例2雜交瘤細胞的融合按常規方法進行雜交瘤細胞的融合。在融合前摘眼球法取陽性血備用。取脾細胞與處於對數生長期的SP2/0細胞用PEG-2000融合。同時，分別從BALB/c免疫小鼠、提供飼養細胞的ICR小鼠採血，作為篩選單抗時對照用的陽性、陰性血清。融合後的細胞用HAT培養基懸浮，分裝96孔板，置37。C，5%C02培養箱內培養，5-7d換加新鮮HAT，經常觀察，適時換液和檢測。實施例3雜交瘤細胞的檢測酶標板的包被在酶標板上，做方陣試驗，即以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原，橫向用PBS倍比稀釋包被ELISA板，以陽性血清為一抗，縱向以100倍、200倍、400倍、800倍稀釋，根據反應結果選擇最佳包被濃度(5ug/mL)。酶標板的包被簡述如下取純化的抗原蛋白，以碳酸鹽緩衝液，即0.2mol/LNa2C038mL，0.2mol/LNa跳17mL，加去離子水至100mL，pH9.6，稀釋至包被濃度，同時設陰性對照；以100uL/孔加入ELISA板中，37°C，3小時；PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5%Tween—20，洗滌3次，5分鐘/次；加PBS/FCS，即O.01mol/L，pH7.3，PBS+10%FCS或淺BSA，200uL/孔，37"C封閉3小時或4'C過夜;PBST洗3次，5分鐘/次，晾乾，一20。C或4。C存放備用。雜交瘤細胞的檢測用上述包被的ELISA板，常規間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養上清，以待檢雜交瘤細胞上清和滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒反應的值，以SP2/0細胞培養上清為陰性對照，P/N》2.l為陽性判定標準。經常規ELISA檢測，根據所設的判定標準，得到七個陽性反應的細胞株，分別經過三次亞克隆後發現其中三株陽性反應丟失，棄去；其餘四株雜交瘤細胞株仍保持了分泌抗狂犬病病毒抗體的能力，其中一株命名為2C5。實施例4細胞株的建立與腹水製備、純化細胞株的建立按上述判定標準，將篩選得到的陽性雜交瘤細胞進行亞克隆，取分泌抗體穩定的和四次亞克隆後細胞形態良好，生長旺盛的強陽性單克隆細胞，命名建株並擴大培養，一部分液氮凍存，一部分用於單抗腹水製備。腹水製備每隻BALB/c小鼠注射0.5mL降植烷與弗氏不完全佐劑的等體積混合物，7天後腹腔分別注射2C5、2G4、3C7和5E11株的雜交瘤細胞，接種量為5X105個細胞，約經過一周，待小鼠腹部膨大後抽取腹水，5000轉/分鐘離心15分鐘，取上清，等量加入^7.2巴比妥緩衝鹽水，即..VBS;0.004mol/L巴比妥,0.15mol/LNaCl，0.8mmol/LMg2+，0.3mmol/LCa1希釋;然後以每10ml腹水中力口150mg二氧化矽粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時搖動；2000g離心20分鐘，脂質等通過該法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22ym微孔濾膜過濾，備用。抗體純化用結合緩衝液，即20mM磷酸鹽緩衝液，pH7.0，平衡HiTmpProteinGHP層析住。用結合緩衝液稀釋樣品後通過層析株。待蛋白峰下降後，用0.1M甘氨酸緩衝液pH2.7，洗(脫層析柱，收集洗脫液。用lMTris，pH9.0,調節pH至7，PBS透析，純化的抗體進行SDS-PAGE電泳，用ELISA檢測抗體效價。實驗結果表明，獲得純化抗體10mg。SDS-PAGE電泳結果表明，在還原劑的作用下，抗體分解為兩個片段，分別為約50KD的重鏈和約25KD的輕鏈，結果附圖l。實施例5單克隆抗體的鑑定單克隆抗體亞類鑑定使用捕獲ELISA試劑盒檢測單克隆抗體的亞類(1)將表位特徵性抗體IgA，IgGl，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分別用PBS進行l:1000稀釋，100ul/孔包被，每種特徵性抗體包被兩孔，37。C孵育1小時。(2)用洗滌液PBST洗滌3次，5分鐘/次。(3)每孔加入100ul待檢測的單抗上清，37。C孵育l小時。(4)用洗滌液洗漆3次，5分鐘/次。(5)用PBST將辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG抗體(Fab片段)進行l:1000稀釋，每孔100ul，37。C孵育30分鐘。(6)用洗滌液洗滌三次，5分鐘/次。(7)每孔加入新鮮配置的底物溶液100ul，37。C避光孵育20分鐘。(8)每孔加入50ul2MH2S04終止反應。在酶標儀上讀取0D490的值，以OD值明顯高於其他各個孔的表位特徵性抗體判為其單抗亞類。鑑定結果表明，本發明製備的抗狂犬病病毒單克隆抗體2C5株產生的抗體亞類為IgG2a。間接ELISA滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5pg/mL的濃度100u1/孔包被ELISA板，37'C溼盒作用2.5小時，PBST洗3次，5分鐘/次；拍幹後用含5%小牛血清的PBS封閉，37。C溼盒作用2.5小時，PBST洗3次，5分鐘/次，拍幹後加入100、200倍、400倍、800倍稀釋、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600、51200稀釋的本研究製備的單抗腹水，37"C溼盒作用90分鐘，PBST洗3次，5分鐘/次，拍幹後加入1:1000稀釋的過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，37'C溼盒作用90分鐘，以TMB顯色，設正常ICR小鼠的血清為陰性對照。結果顯示，本研究製備的單抗腹水與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒的反應為陽性，與正常ICR小鼠的陰性血清的反應為陰性，表1和附圖2。表l間接ELISA結果tableseeoriginaldocumentpage20斑點ELISA(Dot-ELISA)將滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，稀釋至濃度為5Pg/mL，分別滴加於硝酸纖維素膜上，2化/點，37。C溫箱烘乾，用含1%BSA的PBS溶液37。C封閉2小時，PBS洗三次，5分鐘/次，然後將其浸入1:1000稀釋的2C5、2G4、3C7和5E11株雜交瘤細胞的單抗腹水，37。C作用60分鐘，漂洗後浸入1:1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，37"C作用60分鐘，PBS洗三次，5分鐘/次，以DAB顯色，蒸餾水終止反應。以SP2/0培養上清為陰性對照。四株單克隆抗體的腹水、陽性血清均能與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原的點顯色為陽性；而以SP2/0細胞培養上清與之顯色為陰性，結果見附圖3。免疫印跡(Western-blot)檢測單克隆抗體的特異性分別以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒、GST融合表達的狂犬病糖蛋白的IPTG誘導表達的GST-RVG蛋白和pGEX-6p-l的誘導裂解物為電泳樣品進行SDS-PAGE，按常規方法將蛋白轉印於NC膜上。轉印結束後，取出硝酸纖維素膜，作好標記，放入平皿中，用PBST(含5%脫脂奶粉)室溫封閉過夜，將硝酸纖維素膜轉移到封閉液稀釋的雜交瘤上清中，室溫作用2小時之後，用PBS洗膜3次，每次10分鐘。再分別將膜轉移入用封閉液1:100倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG抗體中，室溫作用2小時後，再用PBS洗3遍，每次10分鐘，DAB進行顯色。免疫印跡結果表明此四株單克隆抗體均能與狂犬病CTN株病毒反應，其中2C5株還能與融合表達的狂犬病糖蛋白GST-RVG(另文報導)反應，而與GST載體菌蛋白不反應，表明此單克隆抗體針對的是狂犬病糖蛋白的，見圖4。四株單克隆抗體腹水的ELISA效價測定滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5lig/mL的濃度包被ELISA板，100uL/孔，腹水以PBS倍比稀釋，做間接ELISA反應，以P/N>2.1為陽性判定標準。實驗結果表明，本研究製備的2C5單抗腹水效價分別為1:25600。權利要求1、一種抗狂犬病病毒的單克隆抗體，是由保藏號為CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株2C5所分泌。2、權利要求1所述的抗狂犬病病毒的單克隆抗體的製備方法，其特徵在於(1)免疫原準備與免疫免疫原的製備採用滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒動物免疫將上述滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，測定蛋白濃度為0.67mg/mL，按1:1加入弗氏完全佐劑混合，振蕩乳化半小時，皮下按100"g/只的劑量免疫BALB/c小鼠；2周後，改用弗氏不完全佐劑乳化抗原，以同樣方法進行再次免疫；二免後2周，腹腔注射200ug純化抗原加強免疫，三天後融合；(2)雜交瘤細胞的融合在融合前摘眼球法取陽性血備用；取脾細胞與處於對數生長期的SP2/0細胞用PEG-2000融合，同時，分別從BALB/c免疫小鼠、提供詞養細胞的ICR小鼠採血，作為篩選單抗時對照用的陽性、陰性血清，融合後的細胞用HAT培養基懸浮，分裝96孔板，置37°C，5%C02培養箱內培養，5-7d換加新鮮HAT，經常觀察，適時換液和檢測；(3)雜交瘤細胞的檢測酶標板的包被在酶標板上，做方陣試驗，即以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原，橫向用PBS倍比稀釋包被ELISA板，以陽性血清為一抗縱向以100倍、200倍、400倍、800倍稀釋，根據反應結果選擇包被濃度，酶標板的包被簡述如下取純化的抗原蛋白，以碳酸鹽緩衝液，即0.2mol/LNa2C038mL，0.2mol/LNaHC0317mL，加去離子水至100mL，pH9.6，稀釋至包被濃度，同時設陰性對照；以100uL/孔加入ELISA板中，37°C，3小時;PBST，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+0.5%Tween-20洗滌3次，5分鐘/次；加PBS/FCS，即0.01mol/L，pH7.3，PBS+10%FCS或1%BSA，200yL/孔，37。C封閉3小時或4。C過夜；PBST洗3次，5分鐘/次，晾乾，一2(TC或4。C存放備用；雜交瘤細胞的檢測用上述包被的ELISA板，常規間接ELISA法檢測雜交瘤細胞培養上清，檢測雜交瘤細胞上清和滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒反應的值，以SP2/0細胞培養上清為陰性對照，P/N>2.l為陽性判定標準；經常規ELISA檢測，根據所設的判定標準，得到七個陽性反應的細胞株，分別經過三次亞克隆後發現其中三株陽性反應丟失，棄去；其餘四株雜交瘤細胞株仍保持了分泌抗狂犬病病毒抗體的能力，其中一株命名為2C5;(4)細胞株的建立與腹水製備、純化細胞株的建立按上述判定標準，將篩選得到的陽性雜交瘤細胞2C5進行亞克隆，取分泌抗體穩定的和四次亞克隆後細胞形態良好，生長旺盛的強陽性單克隆細胞，命名建株並擴大培養，一部分液氮凍存，一部分用於單抗腹水製備；腹水製備每隻BALB/c小鼠注射0.5mL降植烷與弗氏不完全佐劑的等體積混合物，7天後腹腔分別注射2C5株的雜交瘤細胞，接種量為5倍105個細胞，約經過一周，待小鼠腹部膨大後抽取腹水，5000轉/分鐘離心15分鐘，取上清，等量加入ra7.2巴比妥緩衝鹽水，即VBS;0.004mol/L巴比妥，0.15mol/LNaCl，0.8mmol/LMg2+，0.3mmol/LCa1希釋；然後以每10ml腹水中加150mg二氧化矽粉末，混勻，懸液在室溫孵育30分鐘，不時搖動；2000g離心20分鐘，脂質等通過該法除去，即可得澄清得腹水。腹水0.22um微孔濾膜過濾，備用；抗體純化用結合緩衝液，即20mM磷酸鹽緩衝液，pH7.0，平衡HiTrapProteinGHP層析柱，用結合緩衝液稀釋樣品後通過層析柱待蛋白峰下降後，用O.1M甘氨酸緩衝液，pH2.7，洗脫層析柱，收集洗脫液。用1MTris，pH9.0，調節pH至7，PBS透析，純化的抗體進行SDS-PAGE電泳，用EL工SA檢測抗體效價；(5)單克隆抗體的鑑定單克隆抗體亞類鑑定使用捕獲ELISA試劑盒檢測單克隆抗體的亞類1)將表位特徵性抗體IgA，IgGl，IgG2b，IgG2a，IgG3，IgM分別用PBS進行l:1000稀釋，100ul/孔包被，每種特徵性抗體包被兩孔，37'C孵育1小時。2)用洗滌液PBST洗滌3次，5分鐘/次。3)每孔加入100ul待檢測的單抗上清，37。C孵育1小時。4)用洗滌液洗滌3次，5分鐘/次。5)用PBST將辣根過氧化物酶標記的兔抗山羊工gG抗體進行1:1000稀釋，每孔100ul，37。C孵育30分鐘。6)用洗滌液洗滌三次，5分鐘/次。7)每孔加入新鮮配置的底物溶液100u1，37t:避光孵育20分鐘。8)每孔加入50ul2MH2S04終止反應。在酶標儀上讀取OD，的值，以0D值明顯高於其他各個孔的表位特徵性抗體判為其單抗亞類。間接ELISA滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5wg/mL的濃度100u1/孔包被ELISA板，37'C溼盒作用2.5小時，PBST洗3次，5分鐘/次；拍幹後用含5%小牛血清的PBS封閉，37"C溼盒作用2.5小時，PBST洗3次，5分鐘/次，拍幹後加入100倍、200倍、400倍、800倍稀釋、1600倍、3200倍、6400倍、12800倍、25600倍、51200倍稀釋的本研究製備的單抗腹水，37"C溼盒作用90分鐘，PBST洗3次，5分鐘/次，拍幹後加入1:1000稀釋的過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，37。C溼盒作用90分鐘，以TMB顯色，設正常ICR小鼠的血清為陰性對照。結果顯示，本發明製備的單抗腹水與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒的反應為陽性，與正常ICR小鼠的陰性血清的反應為陰性；斑點ELISA將滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒，稀釋至濃度為5ug/mL，分別滴加於硝酸纖維素膜上，2!4V點，37。C溫箱烘乾，用含1%BSA的PBS溶液37。C封閉2小時，PBS洗三次，5分鐘/次，然後將其浸入1:1000稀釋的2C5、2G4、3C7和5E11株雜交瘤細胞的單抗腹水，37。C作用60分鐘，漂洗後浸入1:1000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠抗體，37。C作用60分鐘，PBS洗三次，5分鐘/次，以DAB顯色，蒸餾水終止反應。以SP2/0培養上清為陰性對照；本單克隆抗體的腹水、陽性血清均能與滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒為抗原的點顯色為陽性；而以SP2/0細胞培養上清與之顯色為陰性；免疫印跡檢測單克隆抗體的特異性分別以滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒、GST融合表達的狂犬病糖蛋白的IPTG誘導表達的GST-RVG蛋白和pGEX-6p-l的誘導裂解物為電泳樣品迸行SDS-PAGE，按常規方法將蛋白轉印於硝酸纖維素膜上，轉印結束後，取出硝酸纖維素膜，作好標記，放入平皿中，用PBST，含5%脫脂奶粉，室溫封閉過夜，將硝酸纖維素膜轉移到封閉液稀釋的雜交瘤上清中，室溫作用2小時之後，用PBS洗膜3次，每次10分鐘。再分別將膜轉移入用封閉液1:100倍稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗鼠IgG抗體中，室溫作用2小時後，再用PBS洗3遍，每次10分鐘，DAB進行顯色；免疫印跡結果表明此株單克隆抗體均能與狂犬病CTN株病毒反應，其中2C5株還能與融合表達的狂犬病糖蛋白GST-RVG反應，而與GST載體菌蛋白不反應，表明此單克隆抗體針對的是狂犬病糖蛋白的。單克隆抗體腹水的ELISA效價測定滅活的狂犬病病毒CTN株純化病毒以5iig/mL的濃度包被ELISA板，100uL/孔，腹水以PBS倍比稀釋，做間接ELISA反應，以P/N》2.1為陽性判定標準。3、權利要求1所述的單克隆抗體在檢測狂犬病病毒抗原中的應用。4、根據權利要求3所述的應用，其特徵在於所述檢測狂犬病病毒抗原方法包括間接酶聯免疫吸附檢測法、Dot-ELISA、免疫組織化學檢測法或試紙條檢測法。5、權利要求1所述的單克隆抗體在製備狂犬病病毒檢測試劑盒中的應用。6、含有權利要求1所述的單克隆抗體的檢測狂犬病病毒的試劑盒。7、分泌權利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞，是保藏號為CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒單克隆抗體的雜交瘤細胞株2C5。全文摘要本發明抗狂犬病病毒單克隆抗體及其製備方法、應用涉及的是生物醫學領域，具體涉及一種能識別狂犬病病毒的單克隆抗體的製備及其應用。本發明單克隆抗體經間接酶聯免疫法篩選，並用聚丙烯醯胺凝膠電泳分析、斑點ELISA、免疫印跡分析等方法鑑定了其與抗原結合的特異性和親和力等特性。本發明的抗狂犬病毒單克隆抗體可應用於狂犬病病毒的抗原的多種檢測方法中，也可應用於製備狂犬病病毒檢測試劑盒。一種抗狂犬病病毒的單克隆抗體，是由保藏號為CGMCCNo.3014的抗狂犬病病毒單克隆抗體雜交瘤細胞株2C5所分泌。文檔編號C07K16/10GK101560255SQ200910026398公開日2009年10月21日申請日期2009年4月22日優先權日2009年4月22日發明者馮振卿,劉新建,奇唐,進朱,琛李,管曉虹,黃劍飛申請人:南京醫科大學;中國人民解放軍南京軍區軍事醫學研究所