一種茶葉下腳料培養金花菌粉的方法

2023-06-02 07:31:31 3

一種茶葉下腳料培養金花菌粉的方法
【專利摘要】一種茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其步驟如下：（1）從茯磚茶中篩選金花菌菌種；（2）製備改良PDA發酵液，無菌操作接種金花菌，培養；（3）製備成金花菌孢子接種液；（4）將茶葉下腳料粉碎，製成培養基質；（5）將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內；（6）完成營養生長，促進閉囊殼產生；（7）發酵；（8）基質乾燥，篩分，獲得純度較高的金花菌粉。本發明發酵步驟一次性完成；對設備要求較低，同時減少了雜菌的汙染；降低了雜菌汙染概率；成本較低，提高了生長面積，菌粉產率較高。
【專利說明】一種茶葉下腳料培養金花菌粉的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及菌種培養【技術領域】，具體涉及一種茶葉下腳料培養金花菌粉的方法。【背景技術】
[0002]金花菌學名為冠突散囊菌crisiar應)，主要存在於黑茶中的獲磚茶內，是我國制茶行業唯一二級機密保護菌種，其在茶葉上生長產生的閉囊殼堆積成肉眼可見的金黃色顆粒，人工將其篩分出來即為金花菌粉，簡稱為金花。近年來大量研究資料表明金花菌粉對高血壓、高血脂、糖尿病等疾病具備良好的保健效果，並有提高機體免疫力的作用。
[0003]隨著金花菌保健功效的發掘，對其產品的開發成為了時下研究的熱點，這就需要大量的金花菌粉作為研究材料。金花菌生長條件較為苛刻，對氧氣、溼度、培養基質均有嚴格的要求，往往只在發酵良好的茯磚茶內部有少量存在，因此從茯磚茶中大量收集金花菌粉的方案是不現實的。而通過常規培養基(如PDA、CZG)培養的金花菌粉，卻不具備茶葉內所篩分金花菌粉的品質(菌花香較低、顏色較暗淡)。
[0004]中國專利(申請號:201210470477.7)提供了一種茯磚茶金花菌孢子粉的製備方法，但該專利申請存在下述不足:
(1)使用250mL/500mL錐形瓶作為培養容器、麩皮平鋪厚度為1.0~1.3cm，一次培養獲得的曲種較少；
(2)首先需發酵培養獲得曲種，再以發酵完成的曲種擴大培養，所有操作均需在無菌條件下進行，發酵容器外需包裹8層紗布，且(T36h時還需加蓋透氣封口膜，其操作較為繁瑣，不適宜大批量生產。`
【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是:解決現有茯磚茶金花菌粉產率低的問題，而提供一種茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，產率可達到等重量茯磚茶的6倍以上，對金花保健產品的研發具有重要意義。
[0006]本發明採用的技術方案是:
一種茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其步驟如下:
Cl)從茯磚茶中篩選金花菌菌種；
(2)製備改良PDA發酵液，無菌操作接種金花菌，28°C培養6d；
(3)將發酵液瓶180rpm振蕩20min，使金花菌孢子與菌絲分離，之後用雙層無菌紗布過濾除去菌絲，製成金花菌孢子接種液；
(4)將茶葉下腳料粉碎，加入茶葉下腳料重量30%左右自來水充分混勻成培養基質，將基質平鋪在不鏽鋼方盤發酵容器內，調節厚度為2.5cm~3.5 cm，蓋上玻璃蓋，100°C烘lh，冷卻24h後重複烘Ih ；
(5)將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內，均勻噴灑到冷卻的培養基質表面，Ikg基質用接種液15~20mL，蓋上玻璃蓋，67°C預烘Ih ；
(6)將容器取出置於28°C環境下持續發酵3d，待白色菌絲遍布基質表面並開始轉黃時，即完成營養生長，此時提高室溫為3(T32°C並加強室內空氣流通，以促進閉囊殼產生；
(7)發酵6d時取下玻璃蓋，拌勻發酵底物，控溫為38~42°C乾燥；
(8)待基質充分乾燥後，100目電動篩重複篩分兩次，獲得純度較高的金花菌粉。
[0007]上述技術方案中，所述步驟(1)從茯磚茶中篩選金花菌菌種，金花菌菌種從湖南益陽茶廠有限公司08年產金湘益牌茯磚茶中分離純化獲得，經廣東微生物研究所鑑定為冠關散囊囷。
[0008]上述技術方案中，所述步驟(2)製備改良PDA發酵液，每升培養基使用200g馬鈴薯、50g蔗糖，方法為將去皮切碎的馬鈴薯置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入蔗糖並攪拌溶解，定容至1000mL,分裝三角瓶滅菌。
[0009]上述技術方案中，所述步驟(3)中金花菌孢子接種液，其具體製備方法為，待改良PDA發酵液滅菌冷卻後，無菌操作接入金花菌，28°C靜置培養6d至產生大量的金花菌菌體，將三角瓶置搖瓶機上180rpm振蕩20min使金花菌孢子與菌絲分離，之後用雙層紗布過濾去除菌絲，即獲得金花菌孢子接種液；所述的金花菌孢子接種液，通過塗布平板法測定孢子含量> IO8 個 /mL。
[0010]上述技術方案中，所述步驟(4)中所述的發酵容器為不鏽鋼方盤(500cmX350cmX4.5cm),容器蓋為面積略大於方盤的玻璃，以便於在發酵過程中觀察，玻璃蓋上後應無明顯空隙。使用時將培養基質放在方盤內攤平，厚度不超過3.5cm，每盤約可容納基質500g。該容器蓋上玻璃後為半封閉狀態，可有效控制培養基質內的水分緩慢散發，培養基質前期溼度較大利於菌`絲生長，後期溼度降低則可促使耐乾燥的閉囊殼產生。玻璃蓋與方盤之間的縫隙有利於空氣交換，滿足了金花菌對氧氣的需求，同時外界黴菌孢子也不易透過縫隙對基質造成汙染，正確操作下每盤培養基質雜菌汙染面積< 2cm2。
[0011]上述技術方案中，所述步驟(5)中67°C預烘Ih是金花菌發酵前的關鍵步驟，通過實驗可知，金花菌孢子在67°C條件下可存活2~3h，67°C預烘Ih即可有效殺死接種過程中所汙染的雜菌，並且不對金花菌孢子的活性造成影響，使本工藝對環境要求較低，無需使用無菌操作間等設施。
[0012]上述技術方案中，所述步驟(6)菌絲開始轉黃並產生少量閉囊殼時，應及時升溫以促進閉囊殼產生。
[0013]上述技術方案中，所述步驟(7)所述的發酵6d時基質應布滿金花菌閉囊殼且顆粒飽滿豐富，乾燥過程中溫度不應超過42°C，此過程可進一步促使金花菌閉囊殼產生。
[0014]上述技術方案中，所述步驟(8)產品金花菌粉為金黃色粉末狀，輕嗅有菌花香，在潮溼處易結塊且顏色加深，置於密封清潔容器乾燥處保存。
[0015]本發明和現有的專利與文獻相比，具備以下顯著優點:
(O由孢子懸液直接接種至培養基質，發酵步驟一次性完成；
(2)對設備要求較低，全過程中除接種液製備外均不需要無菌環境；
(3)利用改良發酵容器，發酵量較大，半封閉式發酵滿足了金花菌生長所需的氧氣與溼度，同時減少了雜菌的汙染；
(4 )接種之後控溫預烘，殺死雜菌而保存了金花菌孢子活力，進一步降低了雜菌汙染概率；
(5)利用茶葉下腳料作為培養基質，成本較低，所產金花菌粉與茯茶內金花菌粉品質一致(培養基質化學成分相似);
(6)培養基質經粉碎，提高了生長面積，菌粉產率較高，每公斤茶葉渣可收穫純金花菌粉50g以上(傳統工藝從粉碎茯磚茶內提取金花菌粉的產率為0.6%~0.8%)0
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1為金花菌菌種CZG培養基生長7d照片；
圖2為金花菌孢子接種液照片；
圖3為黑茶下腳料培養金花6d照片；
圖4為二次過篩的金花照片；
圖5為不同預烘溫度與發酵狀況之間的關係表；
圖6為本發明工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0017]從茯磚茶中篩選金花菌菌種，金花菌的分離純化:金花菌來源為湖南省益陽茶廠有限公司08年產金湘益牌茯磚茶。具體分離純化步驟為:用鑷子取茯磚茶磚心處長有金花的茶葉IOg,加入到裝有90mL 無菌水的三角瓶內，蓋上無菌封口膜,置搖床上180rpm振搖20min,製成10-2倍樣品稀釋液，梯度稀釋至10_6，取ImL稀釋液塗布於CZG平板上，28°C培養5飛d，用接種針挑取長勢較好的金花菌菌落進行劃線分離，重複劃線2~3次後獲得純培養金花菌菌種。
[0018]純培養的金花菌菌種見附圖1。
[0019]金花菌孢子接種液的製作:馬鈴薯200g洗淨去皮，加1000mL水煮沸20min後過濾，濾液加入50g鹿糖,攪拌至溶解後,分裝滅菌。接種金花菌，28°C培養6d後,置於搖瓶機上180rpm振搖20min,雙層無菌紗布過濾即為金花菌孢子接種液。
[0020]金花菌孢子接種液見附圖2。
[0021]培養基質製備:將茶葉下腳料用植物粉碎機粉碎，稱量1000g加入300g自來水，攪拌均勻後平鋪到不鏽鋼方盤內，厚度調節為2.5cm左右，最厚處不超過3.5cm,基質無需壓緊，蓋上玻璃蓋並確認四周無孔隙。將準備好的方盤放入烘箱，調節溫度為100°C維持lh，冷卻24h後，重複升溫至100 C維持lh，取出冷卻備用。
[0022]接種與培養:將金花菌孢子接種液倒入用70%酒精消過毒的噴壺內，揭開玻璃蓋，將接種液均勻噴灑到冷卻的培養基質上。蓋上玻璃蓋，將方盤置烘箱67°C烘lh，取出置於28°C環境下發酵3d，待白色的營養菌絲長滿基質表明並開始轉黃時，將室溫升高至3(T32°C，並每日打開門窗透氣半小時，以促進子囊果大量產生。
[0023]不同預烘溫度與發酵狀況之間的關係見附表圖5。
[0024]乾燥與金花收集:發酵6d左右，此時金花布滿了培養基質，將玻璃蓋揭去，拌勻基質，提高室溫為38°C~42°C，48h 左右即可乾燥充分，將乾燥基質置於100目電動振搖篩中振搖3min，便將大部分金花篩下，再次過100目篩即獲得純度較高的金花，用自封袋將金花包裝好放置在陰涼乾燥處儲存。[0025]發酵6d的培養基質見附圖3。 [0026]二次過篩的金花見附圖。
【權利要求】
1.一種茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其特徵在於，其步驟如下: (1)從茯磚茶中篩選金花菌菌種； (2)製備改良PDA發酵液，無菌操作接種金花菌，28°C培養6d； (3)將發酵液瓶180rpm振蕩20min，使金花菌孢子與菌絲分離，之後用雙層無菌紗布過濾除去菌絲，製成金花菌孢子接種液； (4)將茶葉下腳料粉碎，加入茶葉下腳料重量30%左右自來水充分混勻成培養基質，將基質平鋪在不鏽鋼方盤發酵容器內，調節厚度為2.5cm~3.5 cm，蓋上玻璃蓋，100°C烘lh，冷卻24h後重複烘Ih ； (5)將金花菌孢子接種液置消毒噴壺內，均勻噴灑到冷卻的培養基質表面，Ikg基質用接種液15~20mL，蓋上玻璃蓋，67°C預烘Ih ； (6)將容器取出置於28°C環境下持續發酵3d，待白色菌絲遍布基質表面並開始轉黃時，即完成營養生長，此時提高室溫為30~32°C並加強室內空氣流通，以促進閉囊殼產生； (7)發酵6d時取下玻璃蓋，拌勻發酵底物，控溫為38~42°C乾燥； (8)待基質充分乾燥後，100目電動篩重複篩分兩次，獲得純度較高的金花菌粉。
2.根據權利要求1所述茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其特徵在於，所述步驟(1)從茯磚茶中篩選金花菌菌種，金花 菌菌種從湖南益陽茶廠有限公司08年產金湘益牌茯磚茶中分離純化獲得，經廣東微生物研究所鑑定為冠突散囊菌。
3.根據權利要求1所述茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其特徵在於，所述步驟(2)製備改良PDA發酵液，每升培養基使用200g馬鈴薯、50g蔗糖，方法為將去皮切碎的馬鈴薯置適量水中煮爛，雙層紗布濾去馬鈴薯渣，濾液加入蔗糖並攪拌溶解，定容至1000mL,分裝三角瓶滅菌。
4.根據權利要求1所述茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其特徵在於，所述步驟(3)中金花菌孢子接種液，其具體製備方法為，待改良PDA發酵液滅菌冷卻後，無菌操作接入金花菌，28°C靜置培養6d至產生大量的金花菌菌體，將三角瓶置搖瓶機上180rpm振蕩20min使金花菌孢子與菌絲分離，之後用雙層紗布過濾去除菌絲，即獲得金花菌孢子接種液；所述的金花菌孢子接種液，通過塗布平板法測定孢子含量> IO8個/mL。
5.根據權利要求1所述茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其特徵在於，所述步驟(4)中所述的發酵容器為不鏽鋼方盤(500cmX 350cmX 4.5cm),容器蓋為面積略大於方盤的玻璃，以便於在發酵過程中觀察，玻璃蓋上後應無明顯空隙；使用時將培養基質放在方盤內攤平，厚度不超過3.5cm,每盤約可容納基質500g ;該容器蓋上玻璃後為半封閉狀態,可有效控制培養基質內的水分緩慢散發，培養基質前期溼度較大利於菌絲生長，後期溼度降低則可促使耐乾燥的閉囊殼產生；玻璃蓋與方盤之間的縫隙有利於空氣交換，滿足了金花菌對氧氣的需求，同時外界黴菌孢子也不易透過縫隙對基質造成汙染，正確操作下每盤培養基質雜菌汙染面積< 2cm2。
6.根據權利要求1所述茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其特徵在於，所述步驟(5)中67°C預烘Ih是金花菌發酵前的關鍵步驟，通過實驗可知，金花菌孢子在67°C條件下可存活2~3h，67°C預烘Ih即可有效殺死接種過程中所汙染的雜菌，並且不對金花菌孢子的活性造成影響，使本工藝對環境要求較低，無需使用無菌操作間等設施。
7.根據權利要求1所述茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其特徵在於，所述步驟(6)菌絲開始轉黃並產生少量閉囊殼時，應及時升溫以促進閉囊殼產生。
8.根據權利要求1所述茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其特徵在於，所述步驟(7)所述的發酵6d時基質應布滿金花菌閉囊殼且顆粒飽滿豐富，乾燥過程中溫度不應超過42°C，此過程可進一步促使金花菌閉囊殼產生。
9.根據權利要求1所述茶葉下腳料培養金花菌粉的方法，其特徵在於，所述步驟(8)產品金花菌粉為金黃色粉末狀，輕嗅有菌花香，在潮溼處易結塊且顏色加深，置於密封清潔容器乾燥 處保存。
【文檔編號】C12N1/14GK103865810SQ201410114977
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月26日 優先權日:2014年3月26日
【發明者】趙運林, 胡治遠, 劉石泉, 龍立平, 彭雨軒 申請人:湖南城市學院