PEG化脂質體包封的糖肽抗生素的新製劑的製作方法

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本申請是申請號為201180035419.5的中國專利申請的分案申請，原申請是2011年6月20日提交的pct國際申請pct/us2011/041053於2013年1月18日進入中國國家階段的申請。相關申請的交叉引用本申請要求2010年6月19日提交的美國臨時專利申請序列號61/356,601的優先權，其全部公開內容通過引用併入本文。本發明涉及脂質體介導的藥劑遞送。
背景技術：
：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)是造成超過一半的醫院獲得性肺炎病例的細菌(1-3)。它也被稱為多藥耐藥和耐苯唑西林金黃色葡萄球菌(oxacillin-resistants.aureus，orsa)。更特別地，mrsa對一大類稱為β-內醯胺的抗生素(包括青黴素類，頭孢菌素類和碳青黴烯類)有抗性。許多菌株還對氟喹諾酮有抗性。萬古黴素仍是美國食品和藥品監督管理局(fda)批准用於治療mrsa肺炎的僅有的兩種抗微生物劑之一，但其臨床失敗率超過30％(4)。療效不佳的原因包括緩慢、時間依賴性的殺菌活性；劑量不足；對肺組織和肺泡巨噬細胞的滲透弱(5-11)；以及敏感性降低(4，12，13)。金黃色葡萄球菌是細胞內和細胞外病原體(14，15)，其可以經受住吞噬細胞而存活並且可以逃避免疫系統(16，17)。相比於標準製劑，脂質體包封的抗微生物劑可提供更強的藥代動力學，藥效學，以及更低的毒性(18，19)。感染組織中更高濃度抗微生物劑的積累可使活化的組織巨噬細胞對其的攝取增加(20，21)，從而可能提高治療效果。基於此觀點，已證明將聚乙二醇(peg)分子與脂質體表面連接有效地將化學治療藥物吉西他濱遞送至胰腺癌腫瘤細胞(coscod等，cancerchemotherapyandpharmacology，64：(5)1009-1020(2009))。然而對於在治療或預防細菌感染的製劑中使用被peg化脂質體包封的抗微生物劑還未有描述。的確，萬古黴素這樣的強效抗生素通常是對抗耐受常用抗生素之細菌(如mrsa)的最後手段。但是，萬古黴素的療效由於對肺組織的滲透不佳而減弱。該問題在治療mrsa肺感染時經常遇到。因此，本發明採用表面peg化的脂質體包封，其相比於標準的萬古黴素製劑，通過將更高濃度的萬古黴素沉積至肺組織來更有效地實現針對性藥物遞送(「drug-to-bug」)。技術實現要素：本發明涉及治療個體的細菌感染(例如個體的多種組織或器官的細菌感染)的新方法。一般而言，所述治療方法涉及對個體施用藥物製劑，其包含脂質體包封的抗微生物劑，其中聚乙二醇(peg)分子共價連接到脂質體的表面。因此，本發明涉及包封殺菌或抑菌的藥物或藥物組合的peg化脂質體。一般地，本發明的治療方法針對革蘭氏陽性菌。因此，本發明的peg化脂質體可以例如包含殺菌或抑菌的抗微生物劑，它們針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)、mrsa亞株以及一般地耐受β-內醯胺抗生素(例如青黴素類(雙氯青黴素，乙氧萘青黴素，苯唑西林等)和頭孢菌素類)的其他細菌。糖肽類抗生素尤其以在治療上有效對抗mrsa而在本領域公知。因此，本發明的一些具體實施方案涉及peg化脂質體包封的糖肽抗生素、糖肽抗生素的組合，或其衍生物。常被臨床醫生用於治療mrsa感染的糖肽抗生素是萬古黴素。因此，本發明的一個實施方案涉及peg化脂質體包封的萬古黴素或萬古黴素衍生物。本發明的另一個一般目的是提供可以逃避吞噬細胞(如巨噬細胞)的攝取的藥物製劑。因此，本發明還涉及通過將抗微生物劑包封在peg化脂質體中來將抗生素遞送至感染組織或器官的新方法，其因至少部分地逃避細胞清除機制的能力而具有偷襲(stealth)特性。表的簡述表1包含靜脈內施用5-mg/kg劑量的標準、常規和peg化脂質體萬古黴素製劑後，血漿中萬古黴素的主要藥代動力學參數。表2包含靜脈內施用5mg/kg劑量的標準、常規和peg化脂質體萬古黴素製劑後，萬古黴素在肝、腎、肺和脾的生物分布數據。附圖說明圖1.對小鼠靜脈內施用5-mg/kg劑量的標準萬古黴素溶液(sv)，常規脂質體萬古黴素(clv)和peg化脂質體萬古黴素(plv)後，萬古黴素的藥代動力學。所有值都顯示為平均值±標準差。圖2.靜脈內施用5mg/kg劑量的標準萬古黴素溶液(sv)，常規脂質體萬古黴素(clv)和peg化脂質體萬古黴素(plv)後，總萬古黴素在cf-1小鼠脾中的組織分布。＊＊p＜0.0015分鐘時常規脂質體相比於標準萬古黴素。++p＜0.0015分鐘時peg化脂質體相比於標準萬古黴素。＊p＜0.011小時時常規脂質體相比於標準萬古黴素。+p＜0.011小時時peg化脂質體相比於標準萬古黴素。圖3.靜脈內施用5-mg/kg劑量的標準萬古黴素溶液(sv)，常規脂質體萬古黴素(clv)和peg化脂質體萬古黴素(plv)後，萬古黴素在雄性cf-1小鼠肝中的組織分布。＊＊p＜0.0015分鐘時常規脂質體相比於標準萬古黴素。++p＜0.0015分鐘時peg化脂質體相比於標準萬古黴素。＊p＜0.011小時時常規脂質體相比於標準萬古黴素。+p＜0.011小時時peg化脂質體相比於標準萬古黴素。圖4.靜脈內施用5-mg/kg劑量的標準萬古黴素溶液(sv)，常規脂質體萬古黴素(clv)和peg化脂質體萬古黴素(plv)後，萬古黴素在cf-1小鼠肺部的組織分布。＊＊p＜0.0015分鐘時常規脂質體相比於標準萬古黴素。++p＜0.0015分鐘時peg化脂質體相比於標準萬古黴素。＊p＜0.011小時時常規脂質體相比於標準萬古黴素。+p＜0.011小時時peg化脂質體相比於標準萬古黴素。圖5.靜脈內施用5-mg/kg劑量的標準萬古黴素溶液(sv)，常規脂質體萬古黴素(clv)和peg化脂質體萬古黴素(plv)後，萬古黴素在cf-1小鼠腎中的組織分布。＊＊p＜0.0015分鐘時常規脂質體相比於標準萬古黴素。++p＜0.0015分鐘時peg化脂質體相比於標準萬古黴素。＊p＜0.011小時時常規脂質體相比於標準萬古黴素。+p＜0.011小時時peg化脂質體相比於標準萬古黴素。具體實施方式如上所述，本發明涉及包含抗微生物劑的藥物製劑，其中抗微生物劑由脂質體包封，並且其中至少一個聚乙二醇(peg)分子與脂質體的脂質分子共價連接。關於本發明中抗微生物劑成分，它可發揮殺菌或抑菌活性。在本發明的多個實施方案中，所述藥物製劑可包含多於一種抗微生物劑，例如，所述製劑可包含抑菌抗微生物劑和殺菌抗微生物劑的組合。一般而言，發揮針對細菌的殺菌活性是指抗微生物劑的組合物具有殺死或不可逆轉地破壞對組合物的抗生素敏感的一種或更多種細菌的能力。然而，具有抑菌活性的抗微生物劑具有抑制對組合物的抗生素敏感的一種或更多種靶細菌物種的生長而不將其殺死的能力。在本發明的一些優選實施方案中，所述藥物製劑的抗微生物劑針對革蘭氏陽性菌(包括但不限於耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa))為殺菌或抑菌的。在本發明的多個實施方案中，本發明藥物製劑的抗微生物劑是糖肽抗生素。如本領域技術人員已知的，本發明上下文中使用的術語「糖肽抗生素」是一種抗生素，其作用機制包括抑制細菌細胞壁生長。這類糖肽抗生素中的抗生素包括但不限於萬古黴素(vancomycin)、阿伏帕星(avoparcin)、瑞斯託菌素(ristocetin)、替考拉寧(teicoplanin)及其衍生物。例如，萬古黴素的衍生物包括但不限於多價萬古黴素、peg化萬古黴素綴合物、去甲萬古黴素、萬古黴素二硫化物、synmonicin、單或二去氯萬古黴素、萬古黴素的穀氨醯胺類似物(如a51568b和m43g)、萬古黴素的天冬氨酸類似物(如m43f和m43b)、萬古黴素的去萬古胺衍生物(desvancosaminederivativesofvancomycin)(如a51568a和m43a，以及相應配基)、萬古黴素的氯衍生物(如a82846b、a82846a(伊瑞黴素)、orienticina，a82846c)、萬古黴素的苄氨基糖衍生物(如a82846b)、n-醯基萬古黴素、n-芳基醯基萬古黴素(n-aracylvancomycins)、n-烷基萬古黴素(包括但不限於辛基苄基、辛氧基苄基、丁基苄基、丁氧基苄基和丁基衍生物)，或其混合物。在本發明的多個優選實施方案中，所述藥物製劑包含萬古黴素，或萬古黴素的衍生物或萬古黴素衍生物的組合。關於本發明藥物製劑的脂質體成分，術語「脂質體」是指可用來遞送化合物的任何脂質成分，其中水性體積被兩性脂質雙層包封，或者其中脂質包被包含抗微生物劑或抗微生物劑的組合的內部。脂質體可以是單層的，由單個雙層構成，或者它們可以是多層的，由兩個或更多個同心雙層構成。磷脂雙層由兩層磷脂分子形成。磷脂是具有兩個主要區域的分子，所述兩個區域為含有機分子的磷酸酯的親水性頭部區域和一個或更多個疏水性脂肪酸尾部。尤其地，天然磷脂具有由膽鹼、甘油和磷酸構成的親水性區域和由脂肪酸構成的兩個疏水性區域。當磷脂處於水性環境時，親水性頭部聚集成線性構型，而它們的疏水性尾部基本彼此平行地排列。由於疏水性尾部試圖避開水性環境，第二列分子與第一列尾對尾排列。為了最大程度地避免與水性環境接觸(即在雙層邊緣)，同時使表面積與體積之比最小從而達到最小能量構型，兩列磷脂(稱為磷脂雙層或層(lamella))聚集成球，從而包封一些水性基質和溶解或懸浮於其中的任何物質，如本發明藥物製劑中包含的抗微生物劑。例如，在本發明的多個實施方案中，本發明的藥物製劑包含包封了萬古黴素溶液的peg化脂質體。可用於製作peg化脂質體的磷脂為(但不限於)1，2-二肉豆蔻醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1，2-dimyristroyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1，2-二月桂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1，2-dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1，2-二硬脂醯-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)、1，2-二肉豆蔻醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1，2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1，2-二棕櫚醯-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)、1，2-二油醯-sn-甘油-3-磷酸單鈉鹽(1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphatemonosodiumsalt)、1，2-二棕櫚醯-sn-甘油-3-[磷-外消旋-(1-甘油)]鈉鹽(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-[phosphor-rac-(l-glycerol)]sodiumsalt)、1，2-二肉豆蔻醯-sn-甘油-3-[磷酸-l-絲氨酸]鈉鹽(1，2-dimyristoyl-sn-glycero-3-[phospho-l-serine]sodiumsalt)、1，2-二油醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-戊二醯鈉鹽(1，2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-n-glutarylsodiumsalt)和1，1』，2，2』-四肉豆蔻醯心磷脂銨鹽(1，1′，2，2′-tetramyristoylcardiolipinammoniumsalt)或其混合物。如上所述，所述藥物製劑中包封抗微生物劑的脂質體具有附在其表面上的peg分子。一般而言，peg指聚乙二醇，具有兩個羥基末端的乙烯peg重複單元的線性水溶性聚合物。peg按照其分子量進行分類，例如，peg2000的平均分子量為約2000道爾頓，peg5000的平均分子量為約5000道爾頓。peg可購自sigmachemicalco.、genzymepharmaceuticals和其他公司，並且包括例如以下：甲基聚乙二醇-1，2-二硬脂醯-磷脂醯乙醇胺綴合物(mpeg-2000-dspe)、單甲氧基聚乙二醇(mpeg-oh)、單甲氧基聚乙二醇琥珀酸鹽/酯(mpeg-s)、單甲氧基聚乙二醇琥珀醯亞胺琥珀酸酯(mpeg-s-nhs)、單甲氧基聚乙二醇胺(mpeg-nh2)、單甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯(mpeg-tres)和單甲氧基聚乙二醇咪唑基羰基(mpeg-im)或其混合物。在多個實施方案中，peg是平均分子量為約550至約10000道爾頓的聚乙二醇，並且任選地被烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在一個實施方案中，peg末端的羥基位被甲基取代。在另一實施方案中，peg平均分子量為約750至約5000道爾頓，更優選約1000至約5000道爾頓，更優選約1500至約3000道爾頓，甚至更優選約2000至約750道爾頓。peg可任選地被烷基、烷氧基、醯基或芳基取代。在一個優選的實施方案中，末端羥基被甲氧基或甲基取代。本發明的peg化脂質體還可包含膽固醇、膽固醇衍生物，或者衍生物或膽固醇的組合。一般而言，peg化脂質體的膽固醇組分為脂質體結構提供增加的穩定性(22)。在本發明的上下文中，磷脂與膽固醇或膽固醇衍生物與peg的摩爾比可以為0.1∶0.1∶0至30∶10∶2。例如，在本發明的一些實施方案中，peg化脂質體包含各自為3∶1∶0.02的dspc、膽固醇和mpeg-2000-dspe。如上所述，脂質體可以是單層的，由單個雙層構成；多層的，由兩個或更多個同心雙層構成。脂質體直徑對於小的單層囊泡(suv)來說為約20nm-100nm，對於大的多層囊泡來說為約100nm-5000nm，對於巨大的多層囊泡(gmv)來說最終多至約100微米。伴隨攪拌水化幹的脂質膜/餅時自發形成lmv，幹的脂質膜/餅一般這樣形成：將脂質溶解在有機溶劑中，用溶液塗布容器壁，並且蒸發溶劑。然後施加能量將lmv轉化成suv和luv等。能量的形式可以是但不限於超聲、高壓、升高的溫度和擠壓，以獲得更小的單層或多層囊泡。在該過程中，一些水性基質被包封在囊泡中。脂質體可由本領域普通技術人員公知的任何方法製備。可用於製備本發明脂質體的脂質體製備常用方法的實例包括但不限於脫水-再水化，硫酸銨梯度和薄膜水化法。在本發明的多個實施方案中，改進了用於製備脂質體的脫水-再水化方法。如上所述，本發明的藥物製劑可用於治療細菌感染。類似地，本發明的藥物製劑可用於預防性治療細菌感染。因此，本發明的範圍內包括藥物組合物，其包含至少一種peg化脂質體包封的抗微生物劑，配製其用於人或獸藥。因此，該組合物可與生理上可接受的載體或賦形劑一起使用，任選地與補充藥劑一起使用。常規載體也可與本發明的製劑一起使用。治療細菌感染的上下文中的術語「治療」是指對含有至少一種不是哺乳動物正常菌群和動物群之一部分的細菌的任何哺乳動物組織進行的任何治療，或者在哺乳動物中治療具有細菌感染的哺乳動物組織。本發明的peg化脂質體包封的抗微生物劑可經腸胃外或經口施用給患者。腸胃外施用包括靜脈內施用、肌內施用、皮下施用、直腸施用或透皮施用。而且，本發明的peg化脂質體包封的抗微生物劑可以根據施用途徑製成合適的劑型。這種劑型的實例包括，例如，主要例如用於靜脈內施用和肌內施用的注射劑；用於替代腸胃外施用的外用製劑，例如，滴眼劑，滴耳劑，滴鼻劑，眼用軟膏，皮膚黏膜吸收劑，皮膚科製劑，吸入劑或栓劑；以及口服施用製劑，例如，膠囊劑，片劑，丸劑，細粒劑，顆粒劑，粉末劑，糖漿劑，或錠劑。本文所用短語「治療有效量」是指對需要該治療的顯著量的對象施用藥物後提供特定藥理學應答的藥物劑量。化合物或藥物的實際有效量可以根據使用的具體組成、施用模式以及患者的年齡、體重和狀況而異。例如，本文所用的藥物有效量是刺激抗菌肽產生的量。特定個體患者的劑量可以由本領域普通技術人員通過常規考慮而確定(如，通過合適的常規藥理方案)。實施例實施例1：脂質體萬古黴素製劑的製備通過三種方法之一製備脂質體：1)薄膜水化法(23)；2)硫酸銨梯度法(24)；3)改進的脫水-再水化法(25)。為了通過薄膜法製備脂質體，將287mg1，2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(dspc)(genzymepharmaceutical，cambridge，ma)和52mg膽固醇(sigmachemicals，st.louis，mo)溶解於7mlhplc級氯仿(emdchemicals，gibbstwon，nj)中，在旋轉蒸發器(buchirotavaporr-200，switzerland)中蒸發至膜。該膜在真空乾燥器中在室溫下放置過夜，從而形成脂質膜的薄層。通過將溶解於10ml磷酸鹽緩衝鹽水(pbs)ph7.4(sigmachemicals，st.louis，mo)的萬古黴素溶液(100mg萬古黴素鹽酸鹽(sigmachemicals，st.louis，mo)加入裝有脂質薄膜的燒瓶中，使薄脂質膜水化，混合物通過旋轉蒸發器混合15分鐘生成脂質體。脂質體用探頭超聲儀超聲10分鐘(5輪，每輪2分鐘)。隨後脂質體在高壓下用0.8μm聚碳酸酯濾器，然後用0.4μm和0.2μm的濾器進行擠壓。將脂質體凍幹48小時，使用適量的蔗糖作為凍幹保護劑。除了在dspc和膽固醇的初始混合物中使用281mgdspc和6mgmpeg-2000-dspe外，通過根據以上方法的薄膜法製備peg化脂質體。脂質體和peg化脂質體的顆粒大小使用動態光散射技術(nicompmodel370亞微米粒度儀，santabarbara，ca)測量。將脂質體懸液適度稀釋，記錄顆粒大小。常規脂質體的平均顆粒大小為254±147nm，peg化脂質體的平均顆粒大小為245±139nm。常規脂質體的包封率為9±2％，peg化脂質體的為13±3％。為了從脂質體和peg化脂質體中分離未包封的藥物，使用了超濾技術。簡言之，將0.4ml脂質體加入管中，用beckman超速離心機以6000rpm在25℃下離心15分鐘。適度稀釋後，用分光光度法在280nm處分析濾液。常規和peg化脂質體萬古黴素製劑都分別使用摩爾比為3∶1∶0和3∶1∶0.02的dspc、膽固醇和peg製備。脂質體萬古黴素製劑製備的具體步驟已於最近發表。為了通過硫酸銨ph梯度法製備脂質體，將143.5mgdspc和26mg膽固醇溶解於5ml氯仿中，通過旋轉蒸發器將溶液蒸發至膜。該膜在真空乾燥器中在室溫下放置過夜，從而形成脂質膜的薄層。將該膜懸浮於10ml250mm硫酸銨溶液中30分鐘，隨後進行冷凍(-80℃10分鐘)和解凍(40℃水浴)的10個循環。所得的多層囊泡用具有高壓擠壓器(northernlipidsinc.，usa)的聚碳酸酯濾器(孔徑：200，100和80nm，whatman，usa)擠壓5次。顆粒大小用前面描述的動態光散射技術測量。未包封的硫酸銨通過4000rpm離心15分鐘去除。為了用萬古黴素裝載脂質體，將離心後得到的小單層囊泡懸浮於5ml的萬古黴素溶液(50mg萬古黴素溶解於5mlpbsph7.4)中，將所得溶液在室溫中放置3小時。為了分離脂質體和未包封的萬古黴素，之後使脂質體通過100ml的sepharose-4b柱，收集不同級分，合併脂質體級分。適當稀釋後，通過分光光度法在280nm處分析級分以測量萬古黴素的包封率。在加入適量(130mg)的蔗糖作為冷凍保護劑後對合併的脂質體級分進行冷凍乾燥。除了在dspc和膽固醇的初始混合物中使用3mgmpeg-2000-dspe，以及萬古黴素溶液通過添加50mg萬古黴素至2mlpbs(而非5ml)而製備外，根據前面描述的硫酸銨ph梯度法製備peg化脂質體。為了通過改進的脫水-再水化法製備脂質體，將287mgdspc和52mg膽固醇溶解於7ml氯仿中，通過旋轉蒸發器蒸發至膜。該膜在真空乾燥器中在室溫下放置過夜，從而形成脂質膜的薄層。該薄脂質膜通過加入5ml高純度、去離子水孵育30分鐘進行水化，使用探頭超聲儀超聲2分鐘。將脂質體凍幹48小時，使用140mg蔗糖作為冷凍保護劑。通過以下用萬古黴素裝載脂質體：將1ml萬古黴素溶液(50mg萬古黴素在5mlpbs，ph7.0中)加至凍幹的空脂質體，渦旋，室溫放置30分鐘。然後將生成的凝膠用4mlpbs稀釋。將形成的囊泡使用0.8，0.4和0.2μm濾器進行擠壓。除了在dspc和膽固醇的初始混合物中使用281mgdspc和6mgmpeg-2000-dspe外，通過根據前面描述方法的脫水-再水化法製備peg化脂質體。常規和peg化脂質體萬古黴素製劑分別使用摩爾比為3∶1∶0和3∶1∶0.02的dspc、膽固醇和peg製備，。裝載有萬古黴素的脂質體在4℃存放備用。脂質體中萬古黴素的濃度通過uv-vis分光光度計(uv-mini，shimadzu，japan)在497nm處測量，裝載率根據下列方程計算：裝載率(％)＝ft/fi×100，其中ft是脂質體中萬古黴素溶解於由氯仿∶甲醇∶蒸餾水(2∶1∶0.05，體積/體積)組成的有機溶劑混合物後的濃度，fi是萬古黴素的起始濃度。實施例2：藥代動力學使至少52隻小鼠(雄性cf-1小鼠來自於charlesriverlab，wilmington，ma)的組各接受單次劑量的5mg/kg萬古黴素尾靜脈注射，萬古黴素分別製備為標準萬古黴素溶液，脂質體包封的萬古黴素的常規製劑或peg化脂質體包封的萬古黴素製劑。施用藥物後，各來自於不同萬古黴素製劑(萬古黴素溶液，常規脂質體和peg化脂質體)的三隻小鼠在預先設計的時間點(5、15、30和45分鐘，1、2、3、4、5、6、8、12、24和48小時)吸入異氟烷(piramalhealthcare，ltd.，ap，india)而處死。收集每個時間點處死的小鼠血液。在1、4和24小時收集肝，腎，脾，肺和肌肉組織。將血液樣品置於肝素化的微型離心管中，通過離心分離血漿。通過簡單的蛋白沉澱步驟將萬古黴素從每個血漿樣品中提取出來。更具體地，將200μl血漿，250μl乙腈和250μl甲醇添加在一起。混合物渦旋1分鐘，14000rpm離心10分鐘。取400μl上清液轉移至新管，用經過濾空氣的流處理1-2小時蒸發至幹。蒸發步驟中管內形成的殘餘物用200μl高純度去離子水重構。開發和驗證了敏感、快速和精準的hplc方法，以測量每個上述重構的組織蛋白質製備物溶液的20μl樣品中萬古黴素濃度。簡言之，用c18柱(4.6×50mm，3μm)進行檢測波長為214nm的色譜分離。將去甲萬古黴素(10μl，100μg/μl的去甲萬古黴素(northernchinapharmaceuticalcorp.shijiazhuang，hebei，china)加至200μl血漿中，以如樣品一樣的方式進行製備和分析)。流動相的構成如下：由0.1％(v/v)tfa作為流動相a和95∶5(v/v)乙腈/0.1％tfa作為流動相b，梯度洗脫15分鐘，其中流動相b在15％保持8分鐘，然後經之後的7分鐘線性增加至100％，總流速為1ml/分鐘。該方法在0.1-20μg/ml範圍內有良好的線性。根據在精密，準確和線性方面評價分析方法的統一準則的國際會議(internationalconferenceonharmonizationguidelinesforvalidationofanalyticalprocedureswithrespecttoprecision，accuracyandlinearity)驗證該方法。使用經驗證的hplc測定進行來自組織的樣品中萬古黴素濃度的hplc分析以測定萬古黴素水平。標準校準曲線在0.1-20μg/ml的濃度範圍內呈線性，相關係數(r2)大於0.995。萬古黴素的檢測下限(llod，s/n5)為0.05μg/ml，定量的下限(lloq，s/n10)為0.1μg/ml。變異係數一日內精密度時為1.7至9.5％，日間為6.3至9.4％。所有三種製劑的藥代動力學譜如圖1所示。萬古黴素血漿濃度在注射標準萬古黴素製劑(t1/2-22分鐘)的開始2小時內迅速下降，2小時後已沒有可檢測量。但是，常規和peg化脂質體製劑注射後，萬古黴素血漿濃度分別在4小時和12小時時保持為大於1μg/ml。48小時後，血漿中仍能檢測到萬古黴素。使用非房室方法計算的藥代動力學譜如表1所示。表1顯示，對於標準和常規脂質體製劑，5分鐘時萬古黴素血漿濃度峰值(cmax)分別為6.76±0.42μg/ml和9.80±1.07μg/ml；15分鐘時peg化脂質體製劑的為15.48±1.71μg/ml。萬古黴素血漿濃度-時間曲線下面積(auc)用線性梯形法計算。常規脂質體的auc是標準萬古黴素的4倍，peg化脂質體的auc是常規脂質體的1.7倍。相對於標準萬古黴素，施用脂質體製劑時萬古黴素的血漿半衰期延長。機體總清除(cl)以劑量/auc計算。脂質體包封的萬古黴素使血漿中的清除降低。因為血漿濃度是測量來自於包含釋放的和仍包封的脂質體萬古黴素的樣品，因此很難將數據擬合至具體的房室模型，也不能準確地測量所有藥代動力學參數。數據顯示為平均值±標準差。用prism軟體(lajolla，ca，usa)進行兩因素anova隨後進行bonferroni事後分析，以確定統計學顯著性。p值≤0.05被認為有顯著性。表1萬古黴素製劑cmax(μg/ml)auc0.48(μg·h/ml)cl(ml/h)標準溶液6.76±0.426.82±0.181.83±0.25常規脂質體9.79±1.0725.91±2.820.48±0.26peg化脂質體15.48±1.7147.19±0.720.26±0.23實施例3：生物分布測定單劑量靜脈內給予5-mg/kg標準、常規和peg化脂質體萬古黴素製劑後萬古黴素在肝、腎、肺、脾和肌肉的生物分布。上述製劑向各組小鼠的施用以及給藥後處死步驟如實施例2所述進行。組織的製備及分析根據如下方案。如前所述，分析了多個主要器官(肝、腎、肺、脾和肌肉)以確定靜脈內注射後1，4和24小時萬古黴素在這些組織中的分布，萬古黴素分別製備為標準萬古黴素溶液、脂質體包封萬古黴素的常規製劑或peg化脂質體包封的萬古黴素製劑。將組織樣品稱重、在pbs中勻漿(肝、腎、肺和肌肉0.5mg/ml，脾0.2mg/ml)。勻漿後，轉移300μl勻漿液至1.5mleppendorf微型離心管中，向其中加入250μl乙腈和250μl甲醇。然後將混合物渦旋1分鐘，14000rpm離心10分鐘。取上清液500μl轉移至試管中，用經過濾空氣的流處理1-2小時蒸發至幹。蒸發步驟中管內形成的殘餘物用200μl高純度去離子水重構。作為內部對照標準，向每管中加入10μl100μg/ml去甲萬古黴素溶液，將混合物渦旋1分鐘，以與對樣品完全相同的方式進行製備及分析。通過使用與以上所述相似的方法進行來自組織的樣品的萬古黴素濃度的hplc分析。hplc結果如下。如脾和肝組織中萬古黴素水平的提高所證實的，脂質體包封增強網狀內皮系統攝取(見圖2和圖3)。4小時和24小時時脾從peg化脂質體中攝取的萬古黴素較從常規脂質體中攝取的顯著更少(p＜0.001，圖2)，1，4和24小時時肝從常規和peg化脂質體製劑中攝取入肝組織的萬古黴素較從標準萬古黴素攝取的顯著更多(p＜0.001，圖3)。不論施用哪種萬古黴素製劑，給藥後4小時肝中萬古黴素濃度達最高。auc，aumc和mrt值如表2所示。關於萬古黴素在肺部的分布，與標準萬古黴素溶液相比，常規或peg化脂質體包封的萬古黴素在肺組織有更大的分布(圖4)。而且，施用後5分鐘，1小時，4小時和24小時時，peg化脂質體包封的萬古黴素的分布較常規脂質體包封的萬古黴素的分布大。24小時時的差異具有統計顯著性(p＜0.001，圖4)。auc，aumc和mrt值如表2所示。關於萬古黴素在腎的分布，與標準萬古黴素溶液相比，脂質體包封的萬古黴素通常與較小的分布相關(圖5)。在5分鐘(p＜0.001)和1小時(p＜0.01)時，兩種脂質體製劑和標準萬古黴素製劑相比，萬古黴素在腎的分布有顯著性差異。auc，aumc和mrt值如表2所示。關於萬古黴素在肌肉的分布，不論施用哪種製劑，在任何時間點均未肌肉組織中檢測到顯著水平的萬古黴素。表2參考文獻1.rubinsteine，kollefmh，nathwanid.pneumoniacausedbymethicillin-resistantstaphylococcusaureus.clininfectdis.[article].2008jun；46：s378-s85.2.guidelinesforthemanagement，ofadultswithhospital-acquired，ventilator-associated，andhealthcare-associatedpneumonia.amjrespircritcaremed.[review].2005feb；171(4)：388-416.3.kuehnertmj，hillha，kupronisba，tokarsji，solomonsl，jernigandb.methicillinresistant-staphylococcusaureushospitalizations，unitedstates.emerginfectdis.[article].2005jun；11(6)：868-72.4.choiey，huhjw，limcm，kohy，kimsh，choish，etal.relationshipbetweenthemicofvancomycinandclinicaloutcomeinpatientswithmrsanosocomialpneumonia.intensivecaremed.2011apr；37(4)：639-47.5.shulmanlm，pretzer-aboffi，andersonke，stevensonr，vaughancg，gruber-baldinial，etal.subjectivereportversusobjectivemeasurementofactivitiesofdailylivinginparkinson′sdisease.movdisord.2006jun；21(6)：794-9.6.kollefmh.limitationsofvancomycininthemanagementofresistantstaphylococcalinfections.clininfectdis.[article].2007sep；45：s191-s5.7.stevensdl.theroleofvancomycininthetreatmentparadigm.clininfectdis.2006jan1；42suppl1：s51-7.8.crucianim，gattig，lazzarinil，furlang，broccalig，malenam，etal.penetrationofvancomycinintohumanlungtissue.jantimicrobchemother.1996november1，1996；38(5)：865-9.9.moise-broderpa，forresta，birminghammc278，schentagjj.pharmacodynamicsofvancomycinandotherantimicrobialsinpatientswithstaphylococcusaureuslowerrespiratorytractinfections.clinpharmacokinet.[review].2004；43(13)：925-42.10.onyejico，nightingalech，marangosmn.enhancedkillingofmethicillinresistantstaphylococcusaureusinhumanmacrophagesbyliposome-entrappedvancomycinandteicoplanin.infection.1994；22(5)：338-42.11.pumerantza，muppidik，agnihotris，guerrac，venketaramanv，wangj，etal.preparationofliposomalvancomycinandintracellularkillingofmeticillin-resistantstaphylococcusaureus(mrsa).injantimicrobagents.2011feb；37(2)：140-4.12.gouldim.clinicalrelevanceofincreasingglycopeptidemicsagainststaphylococcusaureus.intjantimicrobagents.2008apr；31suppl2：1-9.13.steinkrausg，whiter，friedrichl.vancomycinmiccreepinnon-vancomycinintermediatestaphylococcusaureus(visa)，vancomycin-susceptibleclinicalmethicillinresistants.aureus(mrsa)bloodisolatesfrom2001-05.jantimicrobchemother.2007oct；60(4)：788-94.14.lowyfd.isstaphylococcusaureusanintracellularpathogen？trendsmicrobiol.[editorialmaterial].2000aug；8(8)：341-3.15.sinhab，fraunholzm.staphylococcusaureushostcellinvasionandpost-invasionevents.ihtjmedmicrobiol.[review].2010feb；300(2-3)：170-5.16.garzonic，kelleywl.staphylococcusaureus：newevidenceforintracellularpersistence.trendsmicrobiol.[review].2009feb；17(2)：59-65.17.fostertj.immuneevasionbystaphylococci.natrevmicrobiol.[review].2005dec；3(12)：948-58.18.allentm.liposomaldrugformulations.rationalefordevelopmentandwhatwecanexpectforthefuture.drugs.1998nov；56(5)：747-56.19.drulis-kawaz，dorotkiewicz-jacha.liposomesasdeliverysystemsforantibiotics.internationaljournalofpharmaceutics.387(1-2)：187-98.20.bakker-woudenbergi，schiffelersrm，stormg，beckermj，guol.long-circulatingstericallystabilizedliposomesinthetreatmentofinfections.liposomes，pte.sandiego：elsevieracademicpressinc；2005.p.228-60.21.bakker-woudenbergi.long-circulatingstericallystabilizedliposomesascarriersofagentsfortreatmentofinfectionorforimaginginfectiousfoci.intjantimicrobagents.[proceedingspaper].2002apr；19(4)：299-311.22.kirbyc，clarkej，gregoriadisg.effectofthecholesterolcontentofsmallunilamellarliposomesontheirstabilityinvivoandinvitro.biochemj.1980186：591-98.23.bangha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