提高人幹細胞活性的方法

2023-06-02 07:32:26 2

專利名稱：提高人幹細胞活性的方法
技術領域：
本發明涉及製備高活性人間充質幹細胞團塊的方法，由該方法獲得的高活性幹細胞團塊，以及含有該幹細胞團塊的細胞治療劑。
背景技術：
幹細胞能夠分化成構成生物體組織的各種細胞，且一般是指從胚胎、胎兒和成人各種組織中獲得的未分化細胞。幹細胞通過分化刺激(環境)分化成專門的細胞；與細胞分裂已停止的分化細胞不同，它通過細胞分裂(自我更新)產生相同的細胞從而增殖(擴增);其特點在於其分化的可塑性，它可以在不同的環境下或通過分化刺激，分化成另一種細胞。根據它們的分化能力，可將幹細胞分為萬能(pluripotent)幹細胞、多能 (multipotent)幹細胞和單能(unipotent)幹細胞。萬能幹細胞能夠分化成所有類型的細胞，如胚胎幹細胞(ES細胞)，以及誘導的萬能幹細胞(iPS)。多能幹細胞和/或單能幹細胞的實例包括成人幹細胞。胚胎幹細胞源自囊胚期囊胚細胞的內細胞團。這類細胞的特點在於，由於它們具有分化成任何類型細胞的萬能性，它們可以分化成任何類型組織的細胞，與通過生殖細胞產生的成體幹細胞不同，它可以在永生和未分化狀態中培養，並可以傳給下一代(Thomson 等人，科學(Science), 282 :1145-1147 (1998) ; Reubinoff 等人，Nat.Biotechnol.，18:399-404(2000))。製備人胚胎幹細胞只能通過從人類囊胚中分離內細胞團並進行培養。目前，世界各地製備的所有的人胚胎幹細胞均來自無菌處理後的冷凍胚胎。由於如癌症發展和免疫排斥反應的可能性的問題，各種將萬能人胚胎幹細胞作為細胞治療劑使用的方法尚未獲得完全成功。作為替代方法，誘導的萬能幹細胞(iPS)引起研究人員的關注。誘導的萬能幹細胞來自分化的成體細胞，通過使用不同的方法，有目的的將其去分化成胚胎狀態。據報導，在許多方面，iPS細胞具有與天然的ES細胞幾乎相同的性能，包括基因表達和分化能力。在iPS細胞的情況下，可通過使用源自病人的細胞作為來源，可避免免疫排斥反應的可能性，但仍然要面對癌症發展的風險。近來，有人提議將間充質幹細胞作為替代物，以解決與癌症發展和免疫排斥有關的風險。間充質幹細胞為多能(multipotent)細胞，能夠分化成脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞、心肌細胞、肝細胞、胰島β細胞、血管細胞等，且已報導具有調節免疫應答的活性。間充質幹細胞可從各種組織例如骨髓、臍帶血、脂肪組織中分離得到，且可進行培養。然而，根據它們的起源，其細胞表面標誌物彼此不同，因此難以清楚地定義間充質幹細胞。在這方面，間充質幹細胞通常被定義為具有分化為成骨細胞、軟骨細胞和心肌細胞的能力，其特徵在於，其呈旋渦狀，且表達標準的細胞表面標誌物⑶73 (+)、⑶105 (+)、⑶34 (-)和CD45(_)。在這方面，基於上述間充質幹細胞的定義，這些具有不同的遺傳起源和/或背景的間充質幹細胞未顯示出彼此顯著的不同。然而，它們的體內活性通常顯示出顯著差異。另外，在間充質幹細胞作為同種異體細胞治療劑的情況下，可獲得的幹細胞池是有限的。因此，當選定的間充質幹細胞在體內顯示出低活性時，在某些情況下，這類細胞不能被替換，且沒有許多可替代的選擇。此外，為了用作細胞治療劑，間充質幹細胞通常必須滿足細胞治療和/或再生醫學領域中所需的最小細胞數(約I X IO9個細胞)。考慮到條件設置和建立標準，實驗所需的細胞數目會變得甚至更大。在來自各種起源的常規間充質幹細胞的情況下，至少要進行10次體外實驗傳代才能夠獲得該數目的細胞。在這種情況下，細胞會老化並發生變化，這將使它們不能夠滿足在治療中使用。因此，為了有效地將間充質幹細胞作為細胞治療劑使用，需要開發一種新的方法，即使在僅有少量幹細胞的情況下，該方法也能夠通過誘導出高活性間充質幹細胞，最大限度地提高間充質幹細胞的治療效果。發明概述 本發明目的是提供一種從老化的或體內活性相對低的間充質幹細胞製備高活性幹細胞團塊的方法。本發明另一目的是提供由上述方法製備的高活性間充質幹細胞團塊以及包含其的細胞治療劑。根據本發明的一個方面，提供一種製備高活性人間充質幹細胞團塊的方法，包括克服重力培養人間充質幹細胞以形成球狀細胞團塊(spherical cell aggregate)。根據本發明的另一個方面，提供一種通過上述方法製備的高活性間充質幹細胞團塊及包含該幹細胞團塊的細胞治療劑。根據本發明的又一個方面，提供一種製備高活性人間充質幹細胞團塊的方法，包括培養人間充質幹細胞以形成球狀細胞團塊，其中在培養過程中，間充質幹細胞中上皮鈣粘附蛋白(E-cadherin)的量增加。


結合附圖並通過以下描述，本發明的上述及其它目的和特徵將更加明顯，附圖所示分別為圖I :在無bFGF的胚胎幹細胞培養基中培養的人間充質幹細胞的非貼壁狀態。圖2 :在低吸附培養皿中人間充質幹細胞通過非貼壁而形成的球狀體。圖3 :在培養皿的皿蓋上克服重力培養的人間充質幹細胞通過非貼壁而形成的球狀體。圖4 :顯示評價缺血性心臟病結局的左室舒張末期內徑(LVEDD)和左室收縮末期內徑(LVESD)的結果。圖5 :顯示評價缺血性心臟病結局的左室末期射血分數(LVEF)和左室末期縮短分數(LVFS)的結果。圖6 :顯示評價缺血性心臟病結局的梗塞壁厚度和梗塞區的結果。圖7 :與空白對照組(注射非球狀體形成細胞)相比，球狀體組(注射球狀細胞團塊)中缺血性心臟附近殘留的細胞數量明顯更高。
圖8 :在球狀體組觀察的肌節輔肌動蛋白(sacomeric actinin)(圖8a)和連接蛋白43 (圖8b)的表達。圖9 :作為血管特異性標記物的同工凝集素B4的表達及其定量水平，用於觀察對血管生成的效果。圖10 :同工凝集素B4的表達，用於觀察注射的間充質幹細胞是否已分化為血管細胞(angiocytes)。圖11 :顯示加入EDTA後無球狀體形成的結果。圖12 :球狀體形成期間，檢測Ca2+依賴性細胞粘附分子，如神經性鈣粘附蛋白(N-cadherin)和上皮I丐粘附蛋白(E-cadherin)的蛋白質印跡法(Western blot)分析結
果O圖13 :當上皮鈣粘附蛋白的功能被抑制時，間充質幹細胞的球狀體形成結果。圖14 :用上皮鈣粘附蛋白腺病毒載體過表達上皮鈣粘附蛋白時，對球狀體形成的影響。圖15 :在球狀體形成中，細胞外信號調節激酶(ERK)和V-AKT小鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物(AKT)活性的結果。圖16 :上皮鈣粘附蛋白對ERK和AKT活性的影響。圖17 :用上皮鈣粘附蛋白腺病毒載體過表達上皮鈣粘附蛋白時，ERK和AKT活性的結果。圖18 :上皮鈣粘附蛋白對間充質幹細胞生長的影響。圖19 :上皮鈣粘附蛋白對間充質幹細胞的細胞死亡的影響。圖20 :上皮鈣粘附蛋白對間充質幹細胞釋放血管內皮生長因子(VEGF)的影響。圖21 :用不同起源的兩種類型臍帶血來源的間充質幹細胞(UCB-MSCs)檢測離體免疫細胞應答程度的混合淋巴細胞反應(MLR)結果。圖22 :用從每個MLR細胞培養物獲得的上清液測定PGE2濃度的ELISA分析結果。圖23 :用免疫細胞標記物F4/80觀察球狀體形成對免疫系統的影響。圖24A和24B :軟骨細胞(活/死細胞)染色分析結果，測定對間充質幹細胞的球狀體形成誘導的細胞死亡的抑制作用，以及由此計算的細胞活力圖。圖25 :軟骨缺陷兔模型(10周後)的受損軟骨位點的肉眼分析和組織染色分析結果，檢測對間充質幹細胞的球狀體形成誘導的軟骨細胞再生的影響。圖26 :懸滴法與生物反應器法製備的球狀體相比，在誘導分化為肺泡過程中，分化激活劑的表達結果。發明詳述本發明提供一種製備高活性人間充質幹細胞團塊的方法。具體地，本發明提供一種製備高活性人間充質幹細胞團塊的方法，包括克服重力培養人間充質幹細胞以形成球狀細胞團塊。本文所用術語「幹細胞團塊」(stem cell aggregate)、「團塊」，或「球狀體」(spheiOid)，可相互交換使用，指由培養幹細胞形成的球狀幹細胞團塊。本發明所用人間充質幹細胞對遺傳背景和/或其來源沒有限制。例如，這樣的人間充質幹細胞可包括臍帶血來源的間充質幹細胞(UCB-MSCs)、脂肪來源的間充質幹細胞(AD-MSCs)、骨髓來源的間充質幹細胞(BM-MSCs)等，優選UCB-MSCs ο本發明中，將人間充質幹細胞培養形成球狀細胞團塊可在克服重力的培養液滴(culture drop)中實施。由此,每個液滴中300-30，000個細胞形成球狀細胞團塊,優選地，每個液滴1，000-30，000個細胞，從而得到具有高治療效果的球狀細胞團塊。克服重力的幹細胞培養方法可形成大量具有均勻大小的幹細胞團塊，可提高治療效果。本發明方法中，培養基可為含有血清替代品(SR)的無血清培養基。任何可商購的SR均可用於本發明，培養基中SR濃度可根據需要調節，優選20% (v/v)0無血清培養基可為不含血清和鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的人胚胎幹細胞 培養基。本發明還提供一種製備球狀細胞團塊的方法，包括培養人間充質幹細胞，其中在培養期間間充質幹細胞中上皮鈣粘附蛋白(E-cadherin)的量增加。可通過將上皮鈣粘附蛋白表達載體引入間充質幹細胞，來增加間充質幹細胞中上皮鈣粘附蛋白的量。例如，表達載體可為包括上皮鈣粘附蛋白基因的腺病毒載體。進一步地，可通過使用上述培養基在克服重力下培養幹細胞，或使用低吸附培養皿進行非貼壁培養，來培養所述人間充質幹細胞以形成球狀細胞團塊。在非貼壁條件下，可進一步包括將生成的球狀細胞團塊與不包含在球狀細胞團塊中的其它細胞分離的步驟。在此分離步驟中，可使用任何根據大小將球狀細胞團塊與單細胞分離的工具，優選可使用濾器。同樣，可使用三維生物器(或旋轉器)在上述培養基中培養間充質幹細胞；通過攪拌來減少幹細胞接觸容器底部的機會，將間充質幹細胞在傳統吸附容器中培養；將單細胞在應激誘導條件下培養，例如，低氧或低於室溫的低溫。也可通過在培養板如底部具有微孔結構的AggreWeir中培養一定數量的幹細胞，或將單細胞置於非吸附容器中或用於幹細胞治療劑的注射器中，從而形成球狀細胞團塊。進一步地，本發明提供用上述方法製備的高活性人間充質幹細胞團塊。本發明的幹細胞團塊表現出良好的體內組織再生和治療效果，體內活力高，分化為組織細胞的效果好。進一步地，本發明提供包括高活性人間充質幹細胞團塊的細胞治療劑。本發明的細胞治療劑可用於產生脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞、心肌細胞、肝細胞、胰島β細胞、血管細胞(angiocytes)或肺泡細胞。進一步地，本發明的細胞治療劑可用於下組任何之一的應用肺疾病的治療、由肺疾病引起的炎症的治療或抑制、肺組織再生和肺組織纖維化的抑制。優選地，可抑制或減輕由肺疾病引起的炎症和纖維化。本發明的細胞治療劑可用於心血管疾病的治療或軟骨形成。更進一步地，本發明的細胞治療劑可增加免疫調節功能，並減少下述任何之一弓丨起免疫的活性、免疫細胞滲透和免疫原性。也可抑制炎症反應。進一步地，本發明提供使用生物反應器大規模生產大量高活性人間充質幹細胞的方法。
生物反應器是維持和提供生物活性環境的系統或裝置。人間充質幹細胞可在生物反應器中誘導形成球狀細胞團塊，通過持續培養在生物反應器中形成的球狀細胞團塊，在無生長接觸抑制下，可大規模生產高活性人間充質幹細胞團塊。換句話說，在生物反應器中通過攪拌產生離心力，間充質幹細胞可在上述提到的培養基中形成球狀細胞團塊，得到的球狀細胞團塊可在相同培養基中進一步培養，以大規模生產高活性人間充質細胞。本發明方法可提高老化的或體內活性 相對低的間充質幹細胞的活性，其可使間充質幹細胞作為細胞治療劑的實用性和治療效果最大化。並且，它為所有不同遺傳背景和/或來源的間充質幹細胞提供標準方法，對於同種異體的細胞治療劑的發展和選擇非常有用。另外，本發明可使人間充質幹細胞的效果最大化，其可使研究者在細胞治療和再生藥物領域應用適量的高功能性人間充質幹細胞。此外，本發明能夠生產大量的高活性人間充質幹細胞。最後，本發明可增大人間充質幹細胞的效果，其可提高細胞治療劑的實用性，並促進用於治療心血管疾病、神經系統紊亂等的治療藥物的開發。本發明進一步公開以下實施例。應當理解，這些實施例表明本發明優選的實施方式，僅用於解釋，並不限制本發明的保護範圍，
實施例本發明中，所用的人臍帶血間充質幹細胞購自MEDIP0ST有限公司(韓國)。在人間充質幹細胞鑑定試驗後，幹細胞被鑑定和分類為「人臍帶血來源的間充質幹細胞(UCB-MSCs)」，該試驗包括至少95%的陽性細胞標記物(如CD29，CD44，CD73，CD105，CD166，和HLA-ABC)表達和少於5%的陰性細胞標記物(如⑶34，⑶45和HLA-DR)表達，以及間充質幹細胞的多能性確認。實施例I誘導人間充質幹細胞的球體形成(I)誘導球狀體形成的培養基使用低吸附培養皿進行非貼壁培養，將上述間充質幹細胞培養於間充質幹細胞的傳統培養基，即添加血清替代品(SR)的a -MEM培養基(Invitrogen)。然而，誘導非貼壁不成功(見圖1A)。下一步，使用低吸附培養皿進行非貼壁培養，將間充質幹細胞培養於除去鹼性纖維細胞生長因子(bFGF)的胚胎幹細胞培養基(ESM)中(以下稱為，無bFGF的ESM)。成功誘導了非貼壁(見圖1B)。培養基不含有任何胎牛血清(FBS)，但含有DMEM/F-12 (Invitrogen),20%Knock0ut SR (Invitrogen),O. lmmol/L β -疏基乙醇(Sigma), 1% 非必需胺基酸(Invitrogen), 50IU/mL 青黴素和 50mg/mL 鏈黴素(Invitrogen)。(2)球狀體形成的方法本發明人使用了兩種不同的用於人間充質幹細胞球狀體形成的方法。下述兩種方法均可成功地實現球狀體形成。首先，使用低吸附培養皿將人間充質幹細胞在步驟(I)中製備的無bFGF的ESM中培養，以誘導球狀體形成，結果如圖2所示。製備成球狀細胞團塊，然後使用濾器將它們與其它非球狀體形成細胞分離。
另一種方法，在相同的培養基中，將間充質幹細胞以300-3，000個細胞/20 μ I培養基的濃度接種於培養皿的皿蓋上。然後把皿蓋倒置，克服重力培養以誘導球狀體形成。結果如圖3所示。該方法的優點是可控制細胞數量，形成的球狀體大小均一，使幹細胞團塊具有高的治療效果。因此，除非另有說明，本發明所用的幹細胞團塊用該方法製備。實施例2球狀體形成的效果-體內活性用患有缺血性心臟病的大鼠模型評價間充質幹細胞的體內活性。通過冠狀動脈結紮誘導缺血製備缺血性心臟病大鼠模型。將缺血性心臟病的大鼠模型分為三組評價一組注射實施例I中(2)製備的球狀細胞團塊(球狀體)；一組注射由球狀細胞團塊製備的單細胞(離散組)(Dissociate);—組注射未誘導形成任何球狀細胞團塊的細胞(空白對照組)(NaiVe)0每組至少7隻大鼠。
(I)心電圖測丨量製備大鼠模型4天後進行基線心電圖測量，大鼠模型製備7天後給大鼠注射幹細胞。具體地，使用無摩擦玻璃製造的漢密爾頓注射器將幹細胞或細胞團塊注射到誘發缺血性心臟病的心肌膜周圍位點。注射用間充質幹細胞的數量調整為IX IO5/大鼠。注射後4周和8周進行心電圖測量。左室舒張末期內徑(LVEDD)，左室收縮末期內徑(LVESD)，左室末期縮短分數(LVFS)，左室末期射血分數(LVEF)，其結果用圖表示，並評價疾病的進展。LVFS定義為 LVEDD-LVESD/LVEDD，LVEF 定義為 LVEDD2 - LVESD2/LVEDD2。更低的 LVEDD 和 LVESD值，及更高的LVFS和LVEF值代表缺血性心臟病進展良好。如圖4所示，與空白對照組相比，球狀體組和離散組導致更低的LVEDD和LVESD值。具體地，與空白對照組相比，球狀體組導致明顯更低的LVEDD和LVESD值。球狀體組的值仍低於離散組的值。而且，如圖5所示，與空白對照組相比，球狀體組和離散組導致更高的LVFS和LVEF值。具體地，與空白對照組相比，球狀體組導致明顯更高的LVFS和LVEF值。球狀體組的值仍高於離散組的值。由以上結果可知，注射球狀細胞團塊表現出疾病的高好轉率。(2)心臟大小和纖維化的比較除了心電圖測量，還研究了球狀細胞團塊的注射對心臟壁整個厚度和纖維化的影響。圖6顯示了梗塞的心肌壁厚度和梗塞區的損害結果。一般地，心臟發生缺血時，由於心臟壁纖維化、活動度喪失以及隨後體積擴大，心臟壁厚度降低。如圖6所示，與空白對照組相比，球狀體組明顯減少了缺血的常規症狀，如心臟壁變薄和纖維化進展。並且，與離散組相比，球狀體組降低了心臟壁變薄和纖維化進展。(3)心臟的組織學分析為了找出缺血性心臟病大鼠模型中關於體內活性(改善)結果的原因，對心臟進行了組織學分析。為了方便示蹤注射後殘留的間充質幹細胞，幹細胞用DiI染色，然後注入大鼠模型。DiI (1，I』 -雙十八烷基-3，3，3』，3』 -四甲基吲哚羰花青高氯酸鹽)是一種疏水性和親脂性染料，通過結合細胞的雙分子層脂膜，將整個細胞染成紅色。為了觀察器官中注射的細胞，取心臟組織樣本，DAPI染色之後用螢光顯微鏡觀察。DAPI (4』，6- 二脒基-2-苯基吲哚)是藍色螢光材料，其可有力結合DNA雙螺旋的A-T簇的小溝。如圖7所示，可觀察到在球狀體組中，缺血心臟周圍殘留的間充質幹細胞明顯大於空白對照組。換句話說，大量的DiI染色細胞(紅色)表明球狀細胞團塊對於注射細胞的存活率具有顯著效果。此外，為了研究缺血性心臟周圍殘留的間充質幹細胞是否分化成缺血損失的心肌細胞，觀察作為心肌細胞特異性標記物 的輔肌動蛋白(S-actinin)。另外，還觀察了連接蛋白43 (CX43)的表達，其在連接剩餘心肌細胞中起著重要作用。如圖8所示，在球狀體組觀察到輔肌動蛋白(染成綠色的部分)的表達(見圖8a)。這表明在缺血性心臟周圍殘留的間充質幹細胞分化成了缺血損失的心肌細胞。並且，在球狀體組(見圖8b)，觀察到(染成綠色的部分)在心肌細胞功能起重要作用的連接蛋白43的表達。另外，研究了血管生成的效果，其為改善缺血性心臟病最重要的因素。具體地，觀察到血管特異性標記物同工凝集素B4 (isolectin B4)的表達,將結果量化並如圖9所示。如圖9所示，與空白對照組的相比，注射球狀細胞團塊的球狀體組導致同工凝集素B4顯著表達(染成綠色的部分)。這表明球狀體組的血管生成是空白對照組的兩倍，如量化圖所示(細胞數/mm2)。並且，進行試驗以證實血管生成是通過殘留在缺血性心臟周圍的間充質幹細胞分化成的血管細胞誘導的。具體地，細胞用DiI和同工凝集素B4染色，並分析結果。如圖10所示，與空白對照組相比，注射球狀細胞團塊的球狀體組導致同工凝集素B4顯著表達(染成綠色的部分)。這表明球狀體形成會導致間充質幹細胞分化為血管細胞。由以上結果可知，與不形成球狀體的細胞或球狀細胞團塊重新分散後的單細胞相t匕，通過非貼壁培養人間充質幹細胞製備的球狀幹細胞團塊注射進大鼠缺血性心臟病模型，顯示治療效果明顯改善。還證實，球狀體組缺血性心臟病治療效果的改善歸因於間充質幹細胞球狀體的形成所誘導的間充質幹細胞存活率、分化為心肌細胞效率和血管生成的能力明顯改善。總之，在間充質幹細胞中誘導球狀體的形成激活了間充質幹細胞。而且很清楚的是，間充質幹細胞活性的增加是通過維持已形成的球狀體，而不是通過利用從球狀細胞團塊中再次分離的單個細胞。實施例3 :球狀體形成機制分析(體內活性)通過試驗來分析球狀體形成的機制，其可引起如實施例2所示的不同的體內活性。首先，將EDTA加入至幹細胞中，所述幹細胞通過使用低吸附培養皿在無bFGF的ESM中誘導球狀體形成，螯合作為細胞粘附因子起著重要作用的鈣離子。如圖11所示，在EDTA存在下，沒有形成球狀體。換句話說，由於作為Ca2+螯合劑的EDTA的加入，間充質幹細胞的球狀體形成被阻斷，由此認為球狀體形成是通過Ca2+依賴性細胞粘附分子實現的。由此，用蛋白質印跡分析檢測球狀體形成中兩個不同的Ca2+依賴性細胞粘附分子即神經性鈣粘附蛋白和上皮鈣粘附蛋白的表達。如圖12所示，通過非貼壁誘導球狀體形成時，神經性 丐粘附蛋白(abeam, abl8203)的表達減少，而在誘導球狀體形成時，上皮鈣粘附蛋白(神經性鈣粘附蛋白的對應物)的表達(abcam，abl416)增加。α-微管蛋白(a -tubulin)作為對照。在蛋白質印跡分析中，將幹細胞溶於還原劑(細胞溶解預混合物(Lysis PreMix)(4°〇儲藏))+似？(1(^ XlOO)+正釩酸鹽(200mM，X200) +蛋白酶抑制劑混合物(I片/10mL))，進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳，再轉到PVDF轉移膜(Millipore)，並用抗兔IgG和抗鼠IgG進行第一抗原-抗體反應和第二抗原-抗原反應，以檢測蛋白表達。結果證實，上皮鈣粘附蛋白在人間充質幹細胞的球狀體形成中起關鍵作用。因此，本發明人進一步通過以下試驗研究上皮鈣粘附蛋白對間充質幹細胞的球狀體形成和球狀體活性的作用。實施例4上皮鈣粘附蛋白的活性-對球狀體的形成和球狀細胞團塊高活性的作用(I)對球狀體形成的作用首先，上皮鈣粘附蛋白的功能被阻礙時，研究者對間充質幹細胞球狀體形成的效 果進行了研究。具體而言，上皮鈣粘附蛋白的細胞間粘附功能受到一種抗體(克隆，DECMA-1)的抑制，這種抗體通過識別細胞膜上的鈣粘附蛋白位點中和鈣粘附蛋白。這個過程是通過使用低吸附培養皿在無bFGF的ESM中誘導幹細胞球狀體形成時，添加2-10 μ g/mL的上皮鈣粘附蛋白中和抗體或或IgG來實現的。如圖13所示，IgG處理組(IgG)和未處理的對照組(空白對照組)形成了球狀體，而抑制上皮鈣粘附蛋白功能的組(Neu E-cad)沒有形成球狀體。空白對照組用作對照來驗證該抗體處理組不是在特殊條件如細胞凋亡或激活下實施的，因此其與IgG處理組相比具有相同的結果。此外，通過使用上皮鈣粘附蛋白過表達腺病毒載體重新評價了該上皮鈣粘附蛋白對球狀體形成的作用。將用LacZ基因代替上皮鈣粘附蛋白的同樣的過表達腺病毒載體作為對照組。在293個細胞經過病毒包裝的誘導之後，使用了 CMV啟動子並且定量了腺病毒載體。以與常規病毒載體轉導同樣的方式，將病毒上清液加入至貼壁培養具有70%匯合的間充質幹細胞中來誘導表達上皮鈣粘附蛋白。轉導24小時後，使細胞穩定24小時再分離成單個細胞。使用低吸附培養皿在無bFGF的ESM中誘導分離的單個細胞以形成球狀體，收集樣品。將未處理的腺病毒載體組(空白對照組)作為對照組與處理的腺病毒載體組(上皮鈣粘附蛋白或LacZ組)比較。各組腺病毒載體處理細胞4小時後分別誘導形成球狀體，5小時和24小時後分別觀察各組誘導形成球狀體的效率。空白對照組用作對照來驗證該處理的腺病毒載體不是在特殊條件如細胞凋亡或激活下實施的，因此其與LacZ組相比具有相同的結果。如圖14所示，與上皮鈣粘附蛋白抑制試驗的結果不同，當上皮鈣粘附蛋白在間質幹細胞(E-cad)中過表達時，球狀體的形成很迅速並顯示出提高的誘導效率。因此，很明顯，上皮鈣粘附蛋白對間充質幹細胞的球狀體的形成起著關鍵作用。(2)對ERK和/或AKT的作用在細胞生理機制的領域中，細胞外信號調節激酶(ERK)和V-akt小鼠胸腺瘤病毒致癌基因同源物(AKT)的磷酸化在激活細胞的過程中起著關鍵作用。因此，我們測定ERK和AKT的活性。重複實施例I中步驟⑵的過程以誘導形成球狀體，誘導後30分鐘、I小時、3小時後處理取樣。通常各種處理之後3小時內完成ERK和AKT的磷酸化，因此，在上述指定的時間間隔取樣檢測ERK和AKT的磷酸化作用。如圖15所示，通過非貼壁而形成球狀細胞團塊，在總AKT(tAKT)和ERK(tERK)水平上激活的AKT(pAKT)和ERK(pERK)水平增加。從以上結果可以得出通過間充質幹細胞非貼壁而形成的球狀細胞團塊能夠激活AKT和ERK，這也意味著AKT和ERK的激活途徑可能是隨著人間充質幹細胞的球狀體形成而後續發生的激活途徑。接下來，檢測上皮鈣粘附蛋白對這些活性因子的作用。具體地，將單個細胞用具有上皮鈣粘附蛋白中和功能的抗體(克隆DECMA-1，sigma)處理，然後誘導形成球狀體，接下來進行蛋白質印跡分析。在蛋白質印跡分析中，將細胞溶解於還原劑[Lysis PreMix(4°C 儲藏)+NaF (10M，X 100) +原釩酸鹽(200mM, X 200) +蛋白酶抑制劑(I片/IOmL)]，進行sds聚丙烯醯胺凝膠電泳。然後，將這些細胞轉到PVDF轉移膜(Millipore)，並用抗兔IgG和抗鼠IgG進行第一抗原-抗體反應和第二抗原-抗原反應，以檢測蛋白表達。具體地，識別細胞膜的上皮鈣粘附蛋白位點並粘附其上的抗體被用來抑制上皮鈣粘附蛋白的細胞間粘附功能，然後取樣進行AKT和ERK的磷酸化檢測。結果如圖16所示。空白對照組用作對照來驗證該抗體處理組不是在特殊條件如細胞凋亡或激活下進行的，因此其與IgG組相比具有相同的結果。如圖16所示，IgG處理組(對照)和空白對照組在pAKT和pERK水平上並沒有顯著的變化，然而，在上皮鈣粘附蛋白功能抑制組(neu E-cad)檢測到AKT和ERK的活性即pAKT和pERK水平降低了。此外，上述結果通過使用上皮鈣粘附蛋白過度表達腺病毒載體(上皮鈣粘附蛋白病毒載體)再次被證實。以與常規病毒載體轉導同樣的方式，將病毒上清液加入至貼壁培養具有70%匯合的間充質幹細胞中來誘導表達上皮鈣粘附蛋白。轉導24小時後，使細胞穩定24小時再分離成單個細胞。使用低吸附培養皿在無bFGF的ESM中誘導分離的單個細胞形成球狀體，收集樣品。對照組(LacZ組)除了用LacZ基因代替上皮鈣粘附蛋白以外使用同樣的腺病毒載體。未處理的腺病毒載體組(空白對照組)作為處理的腺病毒載體組(E-cad和LacZ組)的對照組。空白對照組用作對照來驗證處理的腺病毒載體組不是在特殊條件如細胞凋亡或激活下進行的，因此其與LacZ組相比具有相同的結果。如圖17所示，觀察到與空白對照組和LacZ組相比，上皮鈣粘附蛋白過表達組(E-cad組)ERK和AKT明顯被激活並表現出pAKT和pERK水平的提聞。(3)對細胞牛長和死亡的作用對上皮鈣粘附蛋白在間充質幹細胞的細胞生長和死亡方面的作用進行了檢測。具體地，使用流式細胞技術檢測了上皮鈣粘附蛋白過表達組(e-cad組)、空白對照組和LacZ組的細胞生長情況。將按實施例I步驟(I)中相同的方式製備的間充質幹細胞，按實施例4步驟(I)中的方法用上皮鈣粘附蛋白過表達腺病毒載體進行處理，培養24小時以誘導形成球狀體。將所得球狀體分離為單個細胞，並將這些單個細胞的細胞核染色。隨後，染色的細胞通過流式細胞技術來分析細胞周期情況。在細胞生長活躍的細胞周期S期(合成期)評價每組的細胞增長(%)。如圖18所示，S期是間充質幹細胞的重要細胞生長期，與空白對照組和LacZ組相t匕，上皮鈣粘附蛋白過表達組(e-cad)在S期顯示出細胞生長增加。此外，如圖19所示，當上皮鈣粘附蛋白過量表達時，細胞發生凋亡的Ml期的百分比降低了，這也證明了細胞死亡的降低。(4)對VEGF分泌的作用檢測了上皮鈣粘附蛋白對間充質幹細胞的血管內皮生長因子(VEGF)分泌的作用。VEGF是治療缺血性心臟病的關鍵因子。具體地，對過表達上皮鈣粘附蛋白組、空白對照組和LacZ組進行實時定量PCR和 使用抗原抗體反應的ELISA分析，對每組的mRNA和蛋白質表達水平進行比較，結果如圖20所示。將幹細胞用腺病毒載體轉化，然後培養。48小時後，提取RNA以合成cDNA，接著用VEGF特異性引物組(定製的，Bioneer，韓國)(VEGF-實時PCR)定量分析RNA水平。同樣，將幹細胞用腺病毒載體轉化並培養。48小時後，所得培養溶液進行VEGF抗原-抗體反應，接著在蛋白表達的水平上進行定量分析VEGF(VEGF-ELISA)。如圖20所示,上皮I丐粘附蛋白過量表達組在mRNA和蛋白表達分析中都顯示出相對增加的VEGF水平。從以上結果可以得出結論在人間充質幹細胞球狀體形成中，上皮鈣粘附蛋白不僅僅是作為誘導因素，而且也是多種體內活動的調控者。總之，上皮鈣粘附蛋白促進了人間充質幹細胞球狀體的形成，並誘導了高活性的球狀細胞團塊。實施例5UCB-MSC形成細胞團塊後的免疫調節活性分析(I)混合淋巴細胞反應(MLR )為了評價臍帶血來源的間充質幹細胞(UCB-MSC)形成細胞團塊後的免疫調節活性，在試管中對來自不同供體的兩個UCB-MSC樣品進行了混合淋巴細胞反應(MLR)試驗。具體地說，將來自兩個不同供體的同種異體人外周血細胞共同培養以誘導同種免疫反應。每個樣品的細胞生長都受到抑制，將產生的細胞與平板附著培養(單層幹細胞)的UCB-MSC或團塊的(幹細胞團塊)UCB-MSC共同培養。對MLR試驗的數值進行評價以比較這兩種幹細胞的免疫調控活性。在該實驗中所用的UCB-MSC為以5 X IO5個細胞/cm2的比率在175T培養皿內的添加10%FBS的MEM- α培養基中單層培養UCB-MSC至具有80-90%匯合後的UCB-MSC。將所得的UCB-MSC在非貼壁狀態下用絲裂黴素C(10y g/mL)處理I小時，然後分別進行平板附著培養和細胞團塊形成培養。為了形成幹細胞團塊，將用絲裂黴素C處理的UCB-MSC通過懸滴法在DMEM/F12培養基(含20%Knock0ut SR, O. ImM β -巰基乙醇，1%非必需胺基酸，50IU/mL青黴素和50mg/mL鏈黴素)中培養24小時，培養密度為2X IO3個細胞/20 μ I。將單層幹細胞(2Χ104個細胞)和幹細胞團塊(2Χ103個細胞)分別轉移到96孔板的每個孔中作為陰性對照。作為陽性對照，將2Χ IO5個來自兩個不同供體的人外周血細胞共同培養以誘導同種免疫反應。作為實驗組，將2Χ IO5個來自兩個不同供體的人外周血細胞分別轉移到每個含有2 X IO4個單層幹細胞和2 X IO3個幹細胞團塊的孔中，並共同培養以檢測對同種免疫反應的抑制活性。培養5天後，用顯微鏡觀察細胞生長和球狀體的形成。接下來，在培養5天後將樣品用BrdU處理，觀察24小時內新合成細胞中的DNA。結果如圖21所示，幹細胞團塊⑶對同種免疫應答的抑制比單層幹細胞(M)至少多37%，這表明幹細胞團塊有很強的抑制免疫反應活性。(2)前列腺素EJPGEJ分泌已知前列腺素PGE2是免疫調控因子，在(I)中得到的MLR培養基中通過ELISA反應(Cayman Chemical Company,前列腺素E^ELISA試劑盒,分類號No. 514010)來測量前列腺素PGE2的分泌水平。培養基與捕獲抗體在4°C下反應18小時，在室溫下進行顏色反應90分鐘，然後進行分析。ELISA反應結果如圖22所示，前列腺素PGE2的分泌水平在同種免疫反應誘導條件下形成細胞團塊後明顯增加(N:單層幹細胞，A :幹細胞團塊)。結果表明，與平板附著培養獲得的UCB-MSC相比，通過形成細胞團塊UCB-MSC的免疫調節功能增強了。
(3)免瘡原件為了檢測細胞團塊形成對UCB-MSC免疫原性的影響，進行了組織分析。具體地，將平板附著培養的UCB-MSC和以細胞團塊形式的UCB-MSC分別注射至患有缺血性心臟病大鼠模型的心肌。採集心臟組織的樣本，並用免疫細胞標記物F4/80染色以分析在缺血組織周圍的免疫細胞滲透，一種綠色標記物用作二抗。注射前將注入的細胞用DiI染色以便於跟
足示O如圖23所示，與平板附著培養的UCB-MSC相比，注射細胞團塊(球狀體)形式UCB-MSC的組織顯示了更少數量的免疫細胞。結果表明細胞團塊的形成降低了 UCB-MSC的免疫原性。實施例7UCB-MSC細胞團塊形成對抑制軟骨細胞死亡和促進軟骨生成效果的增強(I)軟骨細胞死亡的抑制效果眾所周知，UCB-MSC能夠分化成軟骨細胞，抑制由各種分泌因子引起的細胞死亡，並具有抗炎效果，因此一直試圖將它們應用於軟骨損傷疾病的治療。因而，對UCB-MSC的細胞團塊形成是否能夠增強或提高UCB-MSC對軟骨形成的效果並抑制由軟骨損傷和關節炎弓I起的軟骨細胞死亡進行了驗證。將兔子軟骨細胞在IOcm2的培養皿中以5X IO4細胞/cm2的比率培養於3mL的DMEM培養基(10%FBS和50 μ g/mL慶大黴素)中。在共培養的前一天，將平板附著培養的UCB-MSC(空白對照的hUCB-MSC)以5X IO5個細胞/3mL的密度培養於Trans-Well板的上偵U。在共培養的前一天，將UCB-MSC用懸滴法在培養皿蓋上(I X IO4個細胞/20 μ L)培養於DMEM/F12培養基(20%Knock0ut SR, O. ImM β -巰基乙醇，1%非必需胺基酸，50IU/mL青黴素和50mg/mL鏈黴素)中，以製備UCB-MSC細胞團塊(球狀體的hUCB-MSC)。兔子軟骨細胞培養六天後，用Trans-Well板共培養分離的細胞。共培養是通過將含有空白對照hUCB-MSC培養物的Trans-Well板置於兔軟骨細胞培養皿上實施的。對於球狀體hUCB-MSC，將上述形成的50個球狀體hUCB-MSC轉移到3mL的DMEM培養基(10%的FBS和50 μ g/mL慶大黴素)，放到Trans-Well板上與兔子軟骨細胞共培養。此時，向培養基中加500 μ M硝普鈉來誘導軟骨細胞死亡。如圖24Α所示，活/死細胞的染色結果表明，軟骨細胞的死亡明顯減少；如圖24Β所示，hUCB-MSC (I)和hUCB-MSC⑵中軟骨細胞死亡抑制的程度分別為90. 6±4. 4%和95. 7 + 1. 2%，由於球狀體的形成其比對照組(66. 2±13. 0%)顯著增加。(2)對軟骨生成的效果將10周左右的紐西蘭白兔的膝關節的側皮膚、皮下組織和膝關節囊下切暴露膝關節。使用5mm直徑的活檢穿孔對滑車溝中心的關節軟骨進行破損，建立關節軟骨缺損模型，接著用無菌紗布對傷口止血20秒。隨後，將兩個細胞組的每5X IO6個細胞(高細胞組和低細胞組)根據UCB-MSC的軟骨形成分化和再生能力分類；對照組(正常的人肺成纖維細胞)；以及由低細胞製備的細胞團塊組與4%透明質酸混合，並注入到上述缺陷位點處。將這些缺陷位點(膝蓋節囊、皮下組織和膝關節的側皮膚)縫合，養育這些兔子10周。此後，對細胞團塊形成所誘導的UCB-MSC軟骨生成能力增強進行了分析。如圖25 所不，按照 Pineda 等人(1992，Acta Anat (Basel))和 Wakitani 等人(1994，J Bone Joint Surg Am)描述的方法對軟骨損傷程度(注入後10周進行宏觀和組織學(組織染色)分析獲得)進行評價。其中，較低程度的損傷軟骨顯示其通過軟骨形 成的更高程度恢復。結果正如所料，高細胞組(5.00±2. 24)和細胞團塊形式的低細胞組(6. 00±1.22)比低細胞組(7. 40±1.52)和對照組(7. 20±1.48)的值更高。結果表明，細胞團塊的形成抑制了軟骨細胞死亡，增強了軟骨形成。實施例8肺損傷模型中UCB-MSC細胞團塊的形成提高了肺再生功能(I)與幹細胞再生肺細胞活性相關的VEGF表達據報導，UCB-MSC的作用如抑制細胞死亡和抗炎活性是由各種分泌因子產生的。具體地，已知VEGF與肺疾病中肺復甦時的肺毛細血管再生、肺細胞增殖和肺細胞死亡的抑制相關[Varet J.等人，Am JPhysiol Lung Cell Mol Physiol, 298, L768-L774 (2010);以及Kuhn H等人，呼吸病學(Respirology) 15，343-348 (2010)]。在這方面，預期UCB-MSC的細胞團塊形成能夠增加VEGF分泌的水平，從而有助於肺損傷模型中的肺再生。因此，用抗VEGF抗體(R & D systems公司，ELISA kit cat#DY293B)通過ELISA檢測對在細胞團塊形成之前和之後UCB-MSC的VEGF分泌水平進行分析。結果，細胞團塊形成後UCB-MSCs的VEGF分泌水平比細胞團塊形成之前UCB-MSCs的VEGF分泌水平增加了三倍。這意味著細胞團塊的形成增強了 VEGF (VEGF是主要的肺疾病治療劑)的分泌水平，從而提高了肺恢復能力。(2) UCB-MSC的細胞團塊形成增強了肺細胞的分化眾所周知，UCB-MSC能夠分化成肺細胞，其通過連接到肺組織中、抑制肺纖維化和抗炎活性能夠實現肺細胞的形成或再生，因此，本發明人試圖開發一種使用UCB-MSC治療肺部疾病的治療劑。具體地，肺細胞釋放的用於肺細胞再生的sp-C(表面活性劑蛋白C)是肺疾病治療中的一個重要因子。因此，本發明人研究了通過細胞團塊的形成能否改善或增強UCB-MSC的治療功效。為了驗證在細胞團塊形成後UCB-MSC對肺細胞分化的影響，使用由兩個不同的供體提供的UCB-MSC評價了體外SP-C基因表達。在該實驗中所用的UCB-MSC為以5X IO3個細胞/cm2的比率在175T培養皿內的添加10%FBS的MEM-α培養基中單層培養UCB-MSC至具有50-60%匯合後的UCB-MSC。對於單層培養，由此獲得的UCB-MSC在75Τ培養皿上培養。細胞團塊形成是通過兩種不同的方法即懸滴法和生物反應器實現的。在懸滴法中，通過使用培養皿蓋以2X IO3個細胞/20 μ I的培養密度，將UCB-MSC在DMEM/F12培養基(含20%Knock0ut SR，(λ ImM β -巰基乙醇，1%非必需胺基酸，50IU/mL青黴素和50mg/mL鏈黴素)中培養24小時。在顯微鏡下觀察細胞增殖和球狀體形成，然後將球狀體轉移到35 Ji培養皿中進一步培養。在生物反應器法中，UCB-MSC以5X IO5個細胞/mL的濃度，並以恆定速率70rpm培養於旋轉瓶中。單層培養組和兩個細胞團塊組培養5天，然後提取RNA，再合成cDNA，接下來應用實時定量PCR分析SP-C的表達水平。如圖26所示，與單層培養和用反應器培養的UCB-MSC細胞團塊相比，使用懸滴法得到的UCB-MSC細胞團塊的SP-C表達水平表現出明顯的提高，這表明，懸滴法得到的細胞團塊的治療效果要優於生物反應器法得到的細胞團塊。在這一結果中，懸滴法得到的細胞團塊的肺細胞分化因子SP-C的表達水平比與生物反應器法得到的細胞團塊高15-80倍，比單層培養組得到的團塊高2-8倍。這意味著懸滴法形成的細胞團塊增加了 SP-C (SP-C是主要的肺疾病治療劑)的表達從而改善了肺恢復的能力。
如上述實施例所示，預期UCB-MSC的細胞團塊形成增強了各種功能性分泌因子的水平，降低了細胞的免疫原性，因此，作為細胞治療劑治療軟骨病、肺疾病和炎症性疾病，增強了細胞的治療效果。實施例9使用搖杆形成UCB-MSC球狀體的方法為了形成MSC細胞團塊，通過使用搖床搖動來誘導MSC形成細胞團塊。以10，000-20, 000個細胞/cm2的密度將MSC細胞培養於添加了 10%FBS的a -DMEM培養基中。將緊湊型搖床CR95 (FinePCR有限公司)置於37°C的CO2培養箱中，以8_12rpm的搖擺速度培養MSC細胞24小時。為了防止MSC粘附到培養皿的表面，使用了未處理的細菌培養皿。結果表明，MSC細胞團塊的形成隨搖擺速度的增加而下降。同樣，觀察到形成的細胞團塊大小範圍隨搖擺速度而改變，而且即使搖擺的速度保持不變細胞團塊的大小也會發生改變。儘管已經針對上述具體實施方案描述了本發明，應當理解，本領域技術人員可能做出的各種修改和改變也將落入所附權利要求所限定的保護範圍內。
權利要求
1.一種製備高活性人間充質幹細胞團塊的方法，包括在克服重力的條件下培養人間充質幹細胞以形成球狀細胞團塊。
2.根據權利要求I所述的方法，其中所述人間充質幹細胞培養於克服重力條件下的培養液滴中。
3.根據權利要求I所述的方法，其中所述人間充質幹細胞培養於含有血清替代品(SR)但不含血清的培養基中。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述不含血清的培養基為不含鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)的人胚胎幹細胞培養基。
5.根據權利要求I所述的方法，其中所述間充質幹細胞源自人臍帶血。
6.一種製備高活性人間充質幹細胞團塊的方法，包括培養人間充質幹細胞以形成球狀細胞團塊，其中所述間充質幹細胞中上皮鈣粘附蛋白的量在培養過程中増加。
7.根據權利要求6所述的方法，其中通過向所述間充質幹細胞中引入上皮鈣粘附蛋白的表達載體，提高上皮鈣粘附蛋白的量。
8.根據權利要求1-7任一項所述方法製備的高活性人間充質幹細胞團塊。
9.一種細胞治療劑,其含有權利要求8所述的高活性人間充質幹細胞團塊。
10.根據權利要求9所述的細胞治療劑，其用於產生脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞、心肌細胞、肝細胞、胰島P細胞、血管細胞或肺泡細胞。
11.根據權利要求9所述的細胞治療劑，其用於選自下組任何之一的應用肺疾病的治療、由肺疾病引起的炎症的抑制或治療、肺組織的再生和肺組織纖維化的抑制。
12.根據權利要求9所述的細胞治療劑，其用於心血管疾病的治療。
13.根據權利要求9所述的細胞治療劑，其用於血管生成的治療。
14.根據權利要求9所述的細胞治療劑，其用於免疫調節活性的增強。
15.根據權利要求9所述的細胞治療劑，其中所述細胞治療劑降低下組任何之一引起免疫的活性、免疫細胞滲透和免疫原性。
16.根據權利要求9所述的細胞治療劑，其用於軟骨形成。
17.根據權利要求9所述的細胞治療劑，其用於抑制炎症反應。
18.ー種細胞治療方法，包括對需要進行細胞治療的個體施用權利要求8所述的高活性人間充質幹細胞團塊。
19.根據權利要求17所述的細胞治療方法，其用於產生脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞、神經細胞、心肌細胞、肝細胞、胰島P細胞、血管細胞或肺泡細胞；肺疾病的治療；由肺疾病引起的炎症的抑制或治療；肺組織的再生和肺組織纖維化的抑制；心血管疾病的治療；免疫調節活性的增強；引起免疫的活性的降低，免疫細胞滲透的降低或免疫原性的降低；軟骨形成；或炎症反應的抑制。
全文摘要
本發明提供一種製備高活性人間充質幹細胞的方法，其包括通過在克服重力的條件下培養人間充質幹細胞以形成球狀細胞團塊；由此方法製備的高活性幹細胞團塊；含有所述幹細胞團塊的細胞治療劑；以及通過培養人間充質幹細胞以形成球狀細胞團塊的方法，其中所述間充質幹細胞中上皮鈣粘附蛋白的量在培養過程中增加。
文檔編號C12N5/02GK102822331SQ201180018007
公開日2012年12月12日 申請日期2011年4月5日 優先權日2010年4月5日
發明者金孝洙, 姜炫在, 李銀珠 申請人:首爾大學醫院