Cntf(睫狀神經營養因子)受體激活物在治療肥胖症上的用途的製作方法

2023-07-01 23:54:01 2

專利名稱：Cntf(睫狀神經營養因子)受體激活物在治療肥胖症上的用途的製作方法
技術領域：
本發明的主題是激活CNTF(睫狀神經營養因子)受體的分子-例如hCNTF(人CNTF)或hCNTF的突變體-作為有效成分在製備適於治療肥胖症和與其相關的疾病之藥物組合物上的用途。術語hCNTF突變體意指理論上可以從hCNTF經一個或多個胺基酸取代衍生的胺基酸序列。
在工業國家中影響成年人口30％的肥胖症，是一個主要的公共衛生問題，因為它與II型糖尿病、高血壓、血脂過多和增加的死亡率有關。肥胖症是陽性能量平衡的結果，即熱量攝入與能量消耗提高的比例的結果。由於在故意的和非故意的改變後恢復脂肪群的機制的操作，治療一般是不成功的(1)。脂鬱積(lipostasis)理論提出體脂肪貯存的多少由反饋環調節，所說的反饋環由脂細胞來源的循環分子構成，這些分子作用於下丘腦降低食慾並增加能量消耗(2)。
最近鑑定的16-千道爾頓血漿蛋白質leptin滿足許多從這樣的脂鬱積激素預期的標準(3)。在嚙齒類和人類中，它在脂肪組織中表達，並且其血漿水平與體重指數密切相關(4)。在肥胖(ob/ob)突變小鼠中缺乏leptin導致體脂肪大量增加，這可以由全身施用重組蛋白質逆轉(5，6，7)。然而，人肥胖症似乎不是由於leptin缺損的表達，因為相對於瘦人而言，在胖人中顯示增加的leptin信使核糖核酸和血漿蛋白質水平(4)。這樣，胖人可能對leptin的脂鬱積作用不靈敏，有可能是因為在leptin轉運水平，leptin受體活性，或後-受體性信號機制上有缺陷(8)。
這樣，在這一特殊領域中需要一些在對leptin具有抵抗力的人群中能夠治療肥胖症的新藥劑。
Leptin抗性是糖尿病(db/db)小鼠突變體的特徵，該突變體表達缺乏大多數胞質內結構域的leptin受體的截短的形式(9)。更密切類似人肥胖症的動物模型是由飼餵高脂肪食物產生的小鼠(DIO小鼠)的模型。類似於人肥胖症患者，DIO小鼠具有提高的leptin的血漿水平(4)，說明它們對激素的體重減輕作用比較不靈敏。
本發明提供了生物活性的抗肥胖劑，其可以逆轉肥胖，以及與此相聯繫的血糖過多和血胰島素增多。
因此，本發明的主題是激活CNTF受體的物質在製備適於治療肥胖症和與其相關的疾病之藥物上的用途。這些物質可以是hCNTF(人睫狀神經營養因子；SEQ ID NO1)自身或者其突變體(參見例如SEQ IDNO2-28)。採用hCNTF突變體(Ser166Asp/Gln167His)，已經獲得了良好的結果，該突變體在159位到178位，具有下列胺基酸序列(如所附序列表中SEQ ID NO5所示)Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp His Trp Thr Val Arg Ser IleHis Asp Leu Arg Phe[為簡便起見，這一hCNTF突變體在下文也將稱為DH-CNTF]。為簡便起見，在所附序列表中，僅標明了突變體SEQID NO2-22的159-位到178位的部分。
本發明的另一個主題是編碼hCNTF或其突變體的DNA在製備用於治療肥胖症和與其相關的疾病的組合物上的用途。
本發明也具有作為其主題的用於治療肥胖症和減輕體重的藥物，該藥物含有作為至少一種有效成分的hCNTF或其突變體，並且含有藥學上可接受的載體。藥學上可接受的載體指對患者不危險，不降解或不使有效成分失活或者不幹擾有效成分的作用的載體。優選的載體是生理鹽溶液，但是也可以施用其它藥學上可接受的載體，並且易於由本領域技術人員所確定。在已顯示出好的結果的實施方案中，hCNTF或其突變體可以用於與leptin組合在這種情況下，野生型或突變型CNTF/leptin的比率可以在1∶500-1∶5，優選地在1∶100-1∶25的範圍內選擇。
hCNTF或hCNTF變體可以以約1-10,000μg/kg體重範圍內的劑量施用給需要治療的患者。優選的劑量在10和1000μg/kg體重之間。成年人典型的日劑量在1和100mg之間。按照本發明的有效成分的必需量可以以每日一次用藥或全天多次用藥來施用。治療方案可以需要延長期的施用。所施用的劑量大小須由醫生確定，並且取決於一些因素，如疾病的性質與特性，患者的年齡和健康狀況，患者對藥物自身的耐受性。
在特定的實施方案中，為了獲得快速體重的顯著的降低(5-10％)(使用適當的膳食和/或體育鍛鍊可以持續保持這種狀態)，可以藉助短期(1-2周)每日施用hCNTF或其突變體來治療肥胖患者。
活性蛋白質分子可以配製來供腸胃外，鼻，支氣管或眼施用。按照本發明的藥物組合物優選地是藉助注射腸胃外施用。在優選的實施方案中，腸胃外施用是皮下或肌內施用。其它施用的有效方法是施用靜脈內注射劑，緩釋腸胃外製劑，吸入霧劑，或栓劑。在緩釋製劑中，主要溶劑可以是含水或非水類型的。此外，載體可以含有保持或改變製劑的pH值，粘度，澄清度，顏色，無菌性，穩定性，分解速度或氣味的其它藥理學上可接受的賦形劑。同樣，載體也可以含有改變或保持有效成分的穩定性，分解速度，釋放，或吸收的其它藥理學上可接受的賦形劑。這些賦形劑是通常用來配製供腸胃外施用的藥劑(單劑形式和多劑形式)的物質。
如上所提及的，按照本發明的製劑的優選的腸胃外施用形式是皮下或肌內。最優選的腸胃外施用形式是皮下。為了獲得有效成分的所需日劑量，採取單次或重複皮下或肌內注射是可能的。在本發明的一個優選的實施方案中，有效成分的劑量在10和1000μg/kg/天之間。為了治療肥胖症，周期性地施用有效成分可能是合乎需要的。周期性地施用可以採取每月，每-兩周，每周，每日或每小時施用一次的形式。施用所需的頻率對基於標準的觀測技術治療患者的醫生而言是顯而易見的。
考慮按照本發明的藥物製劑的口服也是可能的。在這種情況下，所施用的有效成分優選地是膠囊化的。可以膠囊化的有效成分可以用或不用通常用於製備固體藥劑的載體配製。優選地，當生物利用度被最大化，同時前-系統降解被最小化時，膠囊以使得製劑的活性部分在胃腸道中釋放的方式製備。所說的製劑也可以包含以有利於有效成分的吸收為目的的其它賦形劑。使用稀釋劑，調味劑，低熔點蠟，植物油，潤滑劑，懸浮劑，膠囊分解劑和結合劑也是可能的。
特定的劑量按照患者的近似體重計算，而不依賴於施用方法。確定適當的治療劑量所需的計算的其它工作由本領域普通技術人員按常規進行，他們可以獲得這些結果而不需要過度的實驗，尤其是在本文所提供的試驗和用藥信息的教導下。
按照本發明，對肥胖患者施用治療有效量的有效成分。如上所提及的，所需的劑量可以由本領域技術人員確定而無須過度的實驗。″治療有效量″可以被定義為足以引起足夠的體重減輕並且導致代謝參數(如肥胖患者的血液葡萄糖水平)後續正常化的有效成分的量。
到現在為止，已經給出了本發明的一般性描述。藉助於下列實施例，參照特定的實施方案，以下給出更詳細的說明，目的是為了更好地理解本發明的目的，特徵，優點和操作方法。然而，無意於將本發明的範圍限定在此範圍內。附圖描述

圖1 hCNTF和leptin在遺傳性肥胖小鼠(ob/ob和db/db)和患飲食誘導的肥胖症(DIO)的小鼠中對體重(左邊組)和食物攝取(右邊組)的抗肥胖效果。在第0天開始，小鼠每日接受腹膜內注射的載體或蛋白質(數量以μg/只小鼠表示)。體重以在-2天的原始體重的百分數表示，並表示為平均值±s.e.m(對ob/ob和db/db n＝3，對DIO小鼠n＝5)。每一組載體處理的動物的基線重量(克)為ob/ob，49.3±0.3；db/db，39.1±2.5；DIO，42.6±0.8。由重複測量ANOVA確定統計學顯著性。對於所有組，處理的作用，時間以及時間×處理的P-值分別是P＜0.05，P＜0.0001和P＜0.01。
圖2在DIO小鼠中，單獨施用或組合施用hCNTF(2μg/只小鼠)和leptin(100μg/只小鼠)對體重減輕的作用。小鼠每日接受腹膜內注射的所示的藥劑。
圖3在肥胖對瘦小小鼠中，DH-CNTF對體重和食物攝取的作用的持續時間。以5隻一組圈養的C57BL/KS db/db小鼠(圓圈)或年齡和性別搭配的C57BL/KS+/+小鼠(方塊)，接受每日腹膜內注射載體(空心符號)或10μg DH-CNTF(實心符號)，共25天。從第26天起，所有小鼠用載體處理。食物攝取是每組所消耗的克數除以5。
圖4 DH-CNTF處理肥胖小鼠對屍體組成的影響。小鼠每日腹膜內注射載體或10μg DH-CNTF處理10天。結果為平均值±s.e.m.(n＝5)。*P＜0.05；**P＜0.01(對載體，由t-檢驗)。
圖5 leptin和hCNTF在神經元細胞系中對STAT因子活化的影響。人OB-Rb的表達載體轉染的GT-1-7和SN-56細胞在存在或不存在指示細胞因子(100ng/ml)下培養10分鐘。細胞STAT因子的活化由電遷移率變換測定法測定。箭頭指結合的STAT3同二聚體，STAT1STAT3雜二聚物，以及STATI同二聚體遷移的位置。
圖6由原位雜交測定的leptin(OB-Rb)和CNTF(CNTF受體-([CNTFRα和LIFR)的受體亞單位在小鼠下丘腦中的表達。A，弓狀核；P，副室核。(X100)圖7 leptin和hCNTF在小鼠下丘腦中對tis-11表達的影響。接受腹膜內注射載體，leptin(100μg)或DH-hCNTF(10μg)的三隻ob/ob小鼠組在1小時後經頸部脫位宰殺。採用對鼠tis-11特異性的35S-標記的cRNA探針，在載體或蛋白質處理的小鼠的冰凍冠腦切片上完成原位雜交。實施例1 hCNTF和其突變體DH-CNTF的抗肥胖作用方法蛋白質產生。如以前的描述(11)在大腸桿菌BL21中產生重組人類CNTF和DH-CNTF。按照Stemmer等的方法(12)利用合成寡脫氧核糖核酸經PCR裝配人leptin的DNA編碼序列，並且亞克隆進細菌表達質粒pRSET-5d(13)。利用與hCNTF相同的方案產生人leptin。為了除去細菌酯多糖，經反相HPLC(11)純化所有的蛋白質。當用鱟屬阿米巴樣細胞測定(西格瑪)時，純化的製劑含有不到5毫微克內毒素/mg蛋白質。
動物研究。採用雄性10-11周齡C57BL/6J ob/ob和C57BL/KSdb/db小鼠，以及19周齡AKR/J小鼠進行實驗，所說AKR/J小鼠通過從12周開始進食高脂肪食物(14)表現出肥胖。除了以其它方式註明的外，在12小時光照-黑暗循環(7:30時開始光照，19:30時停止)下，將動物在單個籠子中圈養，隨時可得到水和標準的或高脂肪的(AKR小鼠)齧齒動物食物。在開始用載體或細胞因子治療(0天)之前，對它們習慣性地每日(9:00)腹膜內注射載體(0.9％鹽水，0.2mg/ml無內毒素牛血清清蛋白)兩天。注射後稱量動物，通過記錄在食物盤子中餘下的食物的量確定食物攝取量。
結果人睫神經營養因子(hCNTF)，其突變體DH-CNTF(10)[(Ser166Asp/Gln167His)hCNTF]；對CNTFα-受體具有40-倍高的親和性的hCNTF的突變體)和人leptin在遺傳性肥胖小鼠以及飲食誘導的肥胖症的小鼠(DIO)中試驗生物學活性。這些肥胖症和糖尿病模型在本領域一般被接受為肥胖病態的指示。在這些模型中顯示抗肥胖作用的藥劑在其它哺乳動物(特別是人)中將顯示類似的作用。
如在以下將更清楚地看到的，本發明的化合物在以上所論及的所有生物學試驗中是活性的，並且也發現它們是抗肥胖劑。此外，它們在逆轉與肥胖症相聯繫的血糖過多與血胰島素增多中是活性的。因此認為這些化合物在人糖尿病的血糖過多的治療中也將有用。
依據以前的實驗和結果(6-8，15)，發現對不表達功能性leptin的突變ob/ob小鼠全身性施用leptin逆轉與leptin缺損有關的肥胖以及飲食過多。對ob/ob小鼠每日腹膜內施用hCNTF(在2和50μg/只小鼠之間；相對於40-1000μg/kg體重)也產生體重的逐步和劑量依賴性降低，並且產生食物攝取的迅速降低(圖1)。在實驗的最高劑量(50μg；1000μg/kg)時，hCNTF在7天之後引起體重降低16％(與載體處理的對照中5％增加相比)，並引起食物攝取的5-倍降低。這些作用在大小上與100μg(2000μg/kg)劑量的leptin的作用是可比較的(在體重和食物攝取上分別為13％和95％降低；t-檢驗P＜0.0001)。在劑量低於hCNTF的約5倍時，hCNTF變體DH-CNTF在體重和食物攝取上產生類似的降低。這一結果與具有降低的受體相互作用(數據未顯示出)的hCNTF變體的活性缺乏(11)一起表明，hCNTF的抗肥胖作用是由特異性CNTF受體的活化介導的。
db/db突變小鼠對leptin不產生反應(6-8，15)，這是因為編碼leptin受體OB-R的基因的突變，其導致產生具有截短的胞質內結構域的受體剪接變體(9，29)。相反以hCNTF治療db/db小鼠引起劑量和時間依賴性重量喪失和食物攝取抑制(圖1)。超激動劑DH-CNTF在約hCNTF 1/5劑量時，引發可比較的作用。在ob/ob和db/db小鼠中獲得的結果顯示不是通過刺激leptin釋放或通過直接激活leptin受體起作用。
經進食高脂肪食物患有肥胖症的AKR小鼠(DIO小鼠)以前已報導對leptin的重量和食慾降低作用不如ob/ob小鼠敏感(7)。這一發現以及在DIO小鼠中的leptin血漿水平高於瘦弱小鼠中的觀察結果，導致提出這樣一種觀點食物誘導的肥胖與leptin抗性相關(4，17)。如圖1所示，用人leptin(100μg，2500μg/kg)處理DIO小鼠5天引起體重(7±1％；p＜0.05，對載體)和食物攝取(27±2％；p＜0.05)中等程度的降低。相反，hCNTF(50μg，1250μg/kg)和DH-CNTF(10μg，250μg/kg)引起體重(分別為19±1％和24±1％；p＜0.0001)和食物攝取(分別為76±4％；和73±7％；p＜0.0005)上更強烈的降低。在db/db和DIO小鼠兩者中hCNTF可以逆轉肥胖的發現對治療人肥胖症具有重要意義，這種肥胖症已被認為與leptin的抗性相關(4，18，19)。
可以看到，肥胖小鼠每日接受腹膜內施用hCNTF或突變DH-CNTF，劑量從2到50μg，相當於50到1000μg/kg體重。在最高劑量時，在治療5天後，化合物引起體重10％以上的降低。因此，為誘導體重快速降低(5-10％)對患有肥胖症的患者施用在1000μg/kg以下的hCNTF或DH-CNTF，優選的劑量是約100μg/kg。此外，在優選的實施方案的這一形式中，每天施用hCNTF或DH-CNTF一次，連續處理幾天，直到獲得所需的體重減輕。
實施例2 在DIO小鼠中leptin與hCNTF協作增加抗肥胖作用對肥胖DIO小鼠每日腹膜內注射leptin(100μg；相當於2500μg/kg)以及小劑量的(2μg相當於50μg/kg)的hCNTF。兩種藥劑本身均不產生明顯的體重減輕。這一處理具有產生強的，協同的體重減輕的作用(圖2)。這一結果證明，小劑量的hCNTF可以用於在與leptin抗性相關的肥胖模型中給出明顯增加的leptin作用。
實施例3 DH-CNTF的抗肥胖作用的持續時間和特異性方法行為研究。通過記錄在3小時的黑暗的循環期間小鼠跨過其籠子中央的次數測定運動活性(21:00hr-24:00hr)。採用0到3級分類(0，沒有活性；1，弱；2，正常；3，超活)，通過在籠子中的集中觀察(在30分鐘光照循環期間各在1分鐘內觀察5次)估價Grooming行為。採用具有作為新味道的0.1％糖精的兩瓶樣品完成對調節的味道厭惡測定。
身體組成。將屠體勻漿，並將2-克等分試樣凍幹，然後在90℃下烘乾直到重量恆定。然後以乙醚/乙醇(20∶1，v/v)提取脂肪(21)。從脫水和脂肪提取後的重量差異分別計算水和脂肪質量，瘦肉質量定義為剩下的屠體量。
結果以前報導hCNTF在正常的小鼠中引起瞬時的體重減輕和食物攝取降低(22)，此後，還沒有研究其對肥胖動物的作用。因此確定它對肥胖小鼠的作用是否敏感是重要的。如圖3所示，DH-hCNTF產品在肥胖小鼠中產生延長的作用。以DH-CNTF 25-天處理db/db小鼠導致體重逐漸和穩步地減輕，至第8天達到相應於年齡和性別相對的野生型小鼠的水平。平行地，DH-CNTF引起食物攝取約50％的降低，在整個處理期間均保持。在用hCNTF處理17天的ob/ob小鼠中獲得了類似的結果(未顯示數據)。相反，在種系匹配的野生型小鼠中，DH-CNTF僅引起瞬時作用。這樣，在瘦弱小鼠中DH-CNTF迅速降低食物攝取和體重改變比率，但是這些作用在大約5和10天的處理後分別減弱(圖3)。
在肥胖和瘦弱動物之間所觀察到的區別的一種可能的解釋是hCNTF，類似於leptin(5，6)，有效地耗盡脂肪組織群體，以便其作用的程度和期限依賴於脂肪沉積的大小。事實上，與載體處理的對照相比，DH-CNTF在ob/ob和db/db小鼠中特異性地降低身體脂肪的百分比，而增加身體的水和瘦肉(圖4)。由DH-CNTF誘導的絕對重量損失可以通過體脂肪的有效損失(伴隨著水質量的小量減輕(參見圖4中的絕對重量))計量。在ob/ob小鼠中leptin產生類似的作用(5，6)。這樣，在肥胖小鼠中，hCNTF引起特異性抗脂肪作用。相反，已報導hCNTF在瘦弱小鼠中引起肌肉(23)和蛋白質(24)重量的減輕。對這一明顯差異的一種似是而非的解釋是hCNTF的有效的脂肪-消耗作用導致瘦弱動物中體脂肪幾乎全部損失(參見(23)和我們未出版的結果)，這引起作為次要事件的蛋白質損失。
hCNTF不產生毒性，不舒服或疾病。不可逆毒性由以下發現排除，在db/db(圖2G，H)和ob/ob小鼠(數據未顯示)兩者中，在中斷蛋白質施用後，體重和食物攝取迅速回到處理前的水平。與載體處理的對照比較，以DH-CNTF(10μg)處理db/db小鼠3天不明顯改變運動活性(活性得分分別為43±6和49±6；n＝5)。同樣地，DH-CNTF處理不改變grooming行為(活性得分對DH-CNTF和載體處理的分別為1.2±0.6和1.0±0.4)。此外，DH-CNTF不引起任何習慣性行為的形成。蛋白質引起對味道厭惡的可能性採用兩瓶具有作為新味道的0.1％糖精的樣品在DIO小鼠中檢查。類似於leptin(已報導其在ob/ob小鼠(5)中降低水攝取)，DH-CNTF(10μg)在調節2天後導致DIO小鼠水攝取的降低(1.8±0.1ml對在載體處理的對照中的2.8±0.2ml；n＝9；P＜0.001)。然而，DH-CNTF不引起對味道的討厭(糖精攝取為總液體的49±2％對對照的51±4％)。這些結果表明DH-CNTF的飽食作用不是因為細胞因子誘導的疾病行為。
實施例4 hCNTF和DH-CNTF肥胖相關代謝缺陷的逆轉方法小鼠接受每日腹膜內注射載體，leptin(100μg)，hCNTF(50μg)或DH-CNTF(10μg)。在配對飼餵實驗(2和4)中，在前面的24小時期間，載體處理的小鼠隨意飼餵或飼餵相同量的由DH-CNTF-處理的小鼠消耗的食物。在最後注射後的24小時(實驗1和3)，或在最後注射和移去食物後7小時(實驗2和4)取血樣。用葡糖氧化酶方法測定血清葡萄糖，並且利用大鼠胰島素作為標準，用放射免疫測定法(Amersham)測定血清胰島素。
結果除重量和食慾調節作用外，hCNTF和DH-CNTF能夠逆轉與ob和db突變相關的血糖過多與血胰島素增多。
攜帶有在C57BL/6背景上的ob突變的小鼠顯示出強的血胰島素增多(在2-3月齡時具有幾乎正常葡萄糖水平)(25)，這可以通過leptin處理予以糾正(5，6，15)。用hCNTF或DH-CNTF處理ob/ob小鼠也導致血清胰島素水平的大的降低(表1，實驗1和2)。在C57BL/KS背景上的db/db突變體以嚴重的血糖過多為特徵(在2-3月齡時具有幾乎正常的胰島素水平)(26)。如以前所報導的(5，6，15)，leptin不能在db/db小鼠中逆轉血糖過多。相反hCNTF和DH-hCNTF導致添加的和耐久的血清葡萄糖水平兩者上2-3-倍的降低，而不影響已經低水平的胰島素(表1，實驗3和4)。對細胞因子-處理的動物的食物攝取，DH-CNTF的體重減輕和抗糖尿病作用超過由配對飼餵ob/ob或db/db小鼠引起的那些(表1，實驗2和4)。這些結果顯示hCNTF的作用，類似於leptin(6，27，28)，不單獨因為降低的食物攝取。表1在肥胖小鼠中leptin，hCNTF和配對飼餵對體重改變和血清胰島素和葡萄糖的影響處理重量改變血清葡萄糖 胰島素- (g) (mM) (ng/ml)實驗1(ob/ob，7天)載體+1.6±0.1 nd 63.3±12.7Leptin -6.5±0.4** nd 8.1±9.1*hCNTF -8.2±0.1** nd 4.3±1.0*DH-CNTF -7.7±0.8** nd 3.2±2.9*實驗2(ob/ob，4天)載體+0.5±0.5nd 72.5±25.7DH-CNTF -8.4±0.5**§ nd 8.1±0.2*↑配對-7.0±0.5** nd 11.1±0.4*實驗3(db/db，7天)載體+0.2±0.4 23.3±0.8 9.1±4.2Leptin -0.8±0.5 28.7±0.8*9.7±2.6hCNTF -6.8±0.5**8.4±1.7**8.2±2.1實驗4(db/db，4天)載體0.0±0.3 30.1±2.0 ndDH-CNTF -6.8±0.4**§ 12.3±1.9**§nd配對-5.3±0.4**24.8±5.4 nd數據是每個處理組3到6隻動物的平均值±s.e.m.。nd，未測定。*P＜0.05對載體**P＜0.001對載體§P＜0.05對配對↑P＜0.001對配對(t-檢驗)實施例5 hCNTF和leptin激活重迭神經元信號系統方法STAT活化測定。將GT-1-7和SN-56細胞保持在完全培養基(Dulbecco’s改進的Eagle培養基，含有10％胎牛血清，青黴素，谷醯胺；和(對SN-55細胞)丙酮酸鈉)中。將細胞平板接種在100mm平皿上，當半匯合時，24小時後使用。如以前的描述(30)製備含有人OB-R(29)的整個編碼區(核苷酸141-3770)的表達載體，並且按照製造者的說明經Lipofectamine(Gibco BRL)將其轉染進細胞。24小時後，將細胞分布在60mm含有完全培養基的培養皿中，在另外的24小時後，如下詳細描述的用不同的效應物處理10分鐘前，除去血清4小時。然後用含有50mM NaF的冰冷的磷酸鹽緩衝鹽水洗滌細胞，由離心收集，並且在液氮中凍結。如以前的描述(31)製備整個細胞抽提物。利用10μg細胞抽提物，按照Sadowsky和Gilman的電遷移變換測定法(33)測定活化的STAT體內對高親和性SIE m67寡核苷酸(32)的結合。通過在[a-32P]dATP和[a-32P]dCTP(3000 Ci/mmol)存在下用克列諾酶填補5』突出端來標記寡核苷酸探針。將複合物在5％聚丙烯醯胺/2.5％甘油/0.5X TBE(45mM Tris-硼酸鹽)，0.5mM乙二胺四乙酸，pH 7.8)凝膠上分離，將其乾燥並進行放射自顯影。
原位雜交。在含有弓形和副室下丘腦核的區域製備系列冠腦段。利用35S-標記的cRNA探針按照以前的描述(34)進行原位雜交。通過利用合適的寡核苷酸引物，經RT-PCR擴增小鼠腦RNA獲得對小鼠OB-Rb，CNTFRa，LIFR和tis-11特異性的探針，相應於各自編碼序列的核苷酸2850-3407，246-856(按照人序列編號)，2620-3217和1-950。
結果部分具有hCNTF和leptin的生物活性說明這些蛋白質通過類似的信號機制起作用。hCNTF與leptin調節STAT轉錄因子DNA結合活性的能力在兩種神經元細胞系，SN-56(35)和GT-1-7(36)中檢測，所說的細胞系分別衍生自小鼠間隔以及下丘腦神經元。用人OB-Rb(OB-R的足夠產生信號的長形剪接變體(30，37，38))的表達載體轉染細胞。在兩種神經元細胞繫上，hCNTF和leptin觸發STAT因子的類似模式的活化，具有STAT3同二聚體和較低程度的STAT1同二聚體和STAT1/STAT3雜二聚物的的有效的DNA結合(圖5)。這一模式是gp130-信號細胞因子的特徵(39)，與序列相似性一致，包括存在JAK激酶的共有基元和STAT因子相互作用位點(在OB-Rb和gp130家族受體之間(9))。
leptin和hCNTF的重疊代謝作用的一種可能的解釋是這些蛋白質刺激人腦區域中的普通效應物途徑，其牽涉到能量攝取和消耗。長形OB-Rb剪接變體在這樣的區域有效地表達，包括弓形、腹內側和副室下丘腦核(40，41)。為了確定下丘腦飽食中心是否也可以是hCNTF的靶，採用對鼠OB-Rb，CNTFα和LIFR特異性的cRNA探針進行原位雜交。如圖6所示，小鼠下丘腦弓形和副室核表達leptin和CNTF受體亞單位的mRNA。初步的結果表明CNTFRα和LIFR在其它核(包括腹內側下丘腦)中表達。
與存在對中央飽食中心的細胞因子信號途徑相一致，全身性施用leptin在小鼠下丘腦中激活早期信號反應(42，43)。如果hCNTF的作用機理類似於leptin，則下丘腦反應的早期活化也應該在外周施用hCNTF後可檢測。tis-11原初應答基因(44)(其由hCNTF和其它Stat3-依賴性細胞因子(45)迅速誘導)被用作細胞活化的標記。在腹膜內注射leptin或DH-CNTF之後1小時，與載體處理的對照比較，ob/ob小鼠的下丘腦tis-11信使核糖核酸被發現明顯提高。原位雜交揭示弓形核是tis-11被兩種細胞因子誘導的主要的位點(圖7)。
這一結果說明，全身性施用hCNTF和leptin可以在已經被認為是leptin作用的重要的靶的腦區域中誘導早期信號反應(15，41)。不排除細胞因子間接地激活下丘腦細胞，例如通過外周介導物或經由傳入神經。目前，這一作用的迅速性，以及在弓形核中hCNTF和leptin的特異性受體的表達證明是細胞因子進入下丘腦的直接作用的結果。hCNTF(46)和leptin(47)兩者可以橫越血腦屏障。經由特異性轉運系統，細胞因子可以穿透人腦，如對leptin所報導的(47)。通過位於血腦屏障外部的周圍器官(例如鄰近弓形核的中央隆起)(48)，它們也可以接近下丘腦神經元。總之，現在結果與部分具有hCNTF和leptin的生物學活性牽涉作用的相關機制的概念是一致的。
實施例6 hCNTF和hCNTF變體的CNTFRα結合活性如以前的描述(10)，通過固相結合測定法測定對hCNTF和不同hCNTF變體的CNTF受體-α(CNTFRα)的相對結合親和性。如表2所示，一些hCNTF變體具有比野生型hCNTF對CNTFRα更大的親和性。這些變體，與DH-CNTF一樣，具有對治療肥胖症和與其相關的疾病，如糖尿病的增加的實用性。表2.hCNTF和hCNTF變體對CNTF受體α的結合SEQ ID NO名稱 縮寫/注 相對結合(hCNTF＝1)1hCNTF 野生型1.1±0.32(Gln167Thr)hCNTF 11.8±0.33(Lys160Gln/Gln167Thr)hCNTF 3.1±1.04(Gln167Tyr)hCNTF 9.6±2.65(Ser166Asp/Gln167His)hCNTF DH-CNTF 22.8±3.56(Gln163Ser/Gln167His)hCNTF 4.1±1.17(Gln167Ala)hCNTF 9.0±0.78(Ser166Ala/Gln167Ala)hCNTF 8.1±2.89(Ser166Gly/Gln167Ala)hCNTF 7.5±2.210 (Ser166Asn/Gln167Ala)hCNTF 12.4±1.211 (Ser166His/Gln167Ala)hCNTF 8.8±2.612 (Ser166Asp/Gln167Ala)hCNTF 13.5±1.713 (Val161Leu/Gln167Ala)hCNTF 8.8±0.414 (Lys160Gln/Gln167Ala)hCNTF 11.7±3.215 (Gln167Ala/His174Ala)hCNTF 3.6±0.816 (Gln167Ala/Arg177Leu)hCNTF 11.7±3.317 (Gln167Ala/Thr169Ser)hCNTF 6.9±1.318 (Gln167Ala/Thr169Leu)hCNTF 9.6±2.219 (Gln167Ala/Thr169Leu/Phe178Ile)hC8.4±0.420 (Ser166Asp/Gln167Ala/Thr169Leu)hC21.0±1.621 (Ser166Asp/Gln167Ala/Arg177Phe)hC13.1±2.022 (Val170Arg/His174Ala)hCNTF 3.3±0.423 (Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167His)hC32±1124 (Lys155Ala/Ser166Asp/Cln167His)hC51±1925 (Gln63Arg)hCNTF 2.0±0.326 (Gln63Arg/Ser166Asp/Gln167His)hCN66±1627 (Asp30Gln/Ser166Asp/Gln167His)hCN30±528 (Thr169Ile/His174ALa)hCNTF 0.07±0.01參考文獻1.Weigle，D.S.(1994)FASEB J.8，302-310。
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(ix)特徵(A)名稱(Gln167Ala)hCNTF(B)其它信息(Gln167Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO7Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(8)SEQ ID NO8的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Ser166Ala/Gln167Ala)hCNTF(B)其它信息(Ser166Ala/Gln167Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO8Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ala Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(9)SEQ ID NO9的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈
(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Ser166Gly/Gln167Ala)hCNTF(B)其它信息(Ser166Gly/Gln167Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO9Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Gly Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(10)SEQ ID NO10的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Ser166Asn/Gln167Ala)hCNTF(B)其它信息(Ser166Asn/Gln167Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQID NO10Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asn Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg phe20(11)SEQ ID NO11的信息(i)序列特徵
(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Ser166His/Gln167Ala)hCNTF(B)其它信息(Ser166His/Gln167Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO11Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu His Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(12)SEQ ID NO12的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Ser16 GAsp/Gln167Ala)hCNTF(B)其它信息(Ser166 Asp/Gln167Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO12Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(13)SEQ ID NO13的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Val161Leu/Gln167Ala)hCNTF(B)其它信息(Val161Leu/Gln167Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO13Leu Lys Leu Leu Gln Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(14)SEQ ID NO14的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Lys160Gln/Gln167Ala)hCNTF(B)其它信息(Lys160Gln/Gln167Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO14Leu Gln Val Leu Gln Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(15)SEQ ID NO15的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Gln167Ala/His174Ala)hCNTF(B)其它信息(Gln167Ala/His174Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO15Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15Ala Asp Leu Arg Phe20(16)SEQ ID NO16的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Gln167Ala/Arg177Leu)hCNTF
(B)其它信息(Gln167Ala/Arg177Leu)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO16Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Leu Phe20(17)SEQ ID NO17的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Gln167Ala/Thr169Ser)hCNTF(B)其它信息(Gln167Ala/Thr169Ser)hCNTF序列從159位到178(xi)序列描述SEQ ID NO17Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Ala Trp Ser Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(18)SEQ ID NO18的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知
(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Gln167Ala/Thr169Leu)hCNTF(B)其它信息(Gln167Ala/Thr169Leu)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO18Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(19)SEQ ID NO19的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Gln167Ala/Thr169Leu/Phe178Ile)hCNTF(B)其它信息(Gln167Ala/Thr169Leu/Phe178Ile)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO19Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Ala Trp Leu Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Ile20(20)SEQ ID NO20的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸
(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Ser166Asp/Gln167Ala/Thr169Leu)hCNTF(B)其它信息(Ser166Asp/Gln167AIa/Thr169Leu)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO20Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp Ala Trp Leu Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Arg Phe20(21)SEQ ID NO21的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Ser166Asp/Gln167Ala/Arg177Phe)hCNTF(B)其它信息(Ser166Asp/Gln167Ala/Arg177Phe)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO21Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp Ala Trp Thr Val Arg Ser Ile1 5 10 15His Asp Leu Phe Phe20(22)SEQ ID NO22的信息(i)序列特徵(A)長度20個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Val170Arg/His174Ala)hCNTF(B)其它信息(Val 170Arg/His174Ala)hCNTF序列從159位到178位(xi)序列描述SEQ ID NO22Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Arg Arg Ser Ile1 5 10 15Ala Asp Leu Arg Phe20(23)SEQ ID NO的信息23(i)序列特徵(A)長度200個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF(B)其它信息(Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF序列從1位到200(xi)序列描述SEQ ID NO23Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp1 5 10 15Leu Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp20 25 30Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn35 40 45Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser50 55 60Thr Asp Gln Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu65 70 75Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu80 85 90Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe95 100 105His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala110 115 120Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro125 130 135Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn Val Gly Asp Gly Gly140 145 150Leu Ala Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Gln Val Leu Gln Glu Leu155 160 165Asp His Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser170 175 180Ser His Thr Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr Ile Ala185 190 195Asn Asn Lys Lys Met200(24)SEQ ID NO24的信息(i)序列特徵(A)長度200個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質
(ix)特徵(A)名稱(Lys155Ala/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF(B)其它信息(Lys155Ala/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF序列從1位到200位(xi)序列描述SEQ ID NO24Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp1 5 10 15Leu Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp20 25 30Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn35 40 45Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser50 55 60Thr Asp Gln Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu65 70 75Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu80 85 90Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe95 100 105His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala110 115 120Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro125 130 135Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn Val Gly Asp Gly Gly140 145 150Leu Phe Glu Lys Ala Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu155 160 165Asp His Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser170 175 180Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr Ile Ala185 190 195Asn Asn Lys Lys Met200(25)SEQ ID NO25的信息(i)序列特徵
(A)長度200個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Q63R)hCNTF(B)其它信息(Q63R)hCNTF序列從1位到200位(xi)序列描述SEQ ID NO25Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp1 5 10 15Leu Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp20 25 30Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn35 40 45Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser50 55 60Thr Asp Arg Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu65 70 75Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu80 85 90Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe95 100 105His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala110 115 120Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro125 130 135Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn Val Gly Asp Gly Gly140 145 150Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu155 160 165Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser170 175 180Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr Ile Ala185 190 195Asn Asn Lys Lys Met200(26)SEQ ID NO26的信息(i)序列特徵(A)長度200個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Gln63Arg/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF(B)其它信息(Gln63Arg/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF序列從1位到200位(xi)序列描述SEQ ID NO26Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp1 5 10 15Leu Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp20 25 30Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn35 40 45Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser50 55 60Thr Asp Arg Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu65 70 75Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu80 85 90Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe95 100 105His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala110 115 120Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro125 130 135Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn Val Gly Asp GIy Gly140 145 150Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu155 160 165Asp His Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser170 175 180Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr Ile Alal85 190 195Asn Asn Lys Lys Met200(27)SEQ ID NO27的信息(i)序列特徵(A)長度200個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Asp30Gln/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF(B)其它信息(Asp30Gln/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF序列從1位到200位(xi)序列描述SEQ ID NO27Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp1 5 10 15Leu Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Gln20 25 30Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn35 40 45Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser50 55 60Thr Asp Gln Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu65 70 75Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu80 85 90Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe95 100 105His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala110 115 120Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro125 130 135Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro IIe Asn Val Gly Asp Gly Gly140 145 150Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu155 160 165Asp His Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu Arg Phe Ile Ser170 175 180Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr Ile Ala185 190 195Asn Asn Lys Lys Met200(28)SEQ ID NO28的信息(i)序列特徵(A)長度200個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈型單鏈(D)拓撲結構未知(ii)分子類型蛋白質(ix)特徵(A)名稱(Thr169Ile/His174Ala)hCNTF(B)其它信息(Thr169Ile/His174Ala)hCNTF序列從1位到200位(xi)序列描述SEQ ID NO28Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Arg Asp1 5 10 15Leu Cys Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp20 25 30Leu Thr Ala Leu Thr Glu Ser Tyr Val Lys His Gln Gly Leu Asn35 40 45Lys Asn Ile Asn Leu Asp Ser Ala Asp Gly Met Pro Val Ala Ser50 55 60Thr Asp Gln Trp Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Glu65 70 75Asn Leu Gln Ala Tyr Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu80 85 90Leu Glu Asp Gln Gln Val His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe95 100 105His Gln Ala Ile His Thr Leu Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala110 115 120Tyr Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile Leu Leu Glu Tyr Lys Ile Pro125 130 135Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile Asn Val Gly Asp Gly Gly140 145 150Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu155 160 165Ser Gln Trp Ile Val Arg Ser Ile Ala Asp Leu Arg Phe Ile Ser170 175 180Ser His Gln Thr Gly Ile Pro Ala Arg Gly Ser His Tyr Ile Ala185 190 195Asn Asn Lys Lys Met200
權利要求
1.激活CNTF(睫狀神經營養因子)受體的物質在製備用於治療肥胖症和與其相關的疾病(例如糖尿病)之藥物組合物上的用途。
2.按照權利要求1的激活CNTF受體的物質的用途，其中所說的激活CNTF受體的物質是hCNTF(人睫狀神經營養因子)或其突變體。
3.按照權利要求2的激活CNTF受體的物質的用途，其中所說的hCNTF的突變體選自包含SEQ ID NO2-SEQ ID NO28的組。
4.按照權利要求3的激活CNTF受體的物質的用途，其中所說的hCNTF的突變體是SEQ ID NO5。
5.編碼hCNTF或其突變體的DNA在製備用於基因治療肥胖症和與其相關的疾病之組合物上的用途。
6.用於治療肥胖症和與其相關的疾病的藥物組合物，該組合物含有藥學上可接受的載體，其特徵在於該組合物含有作為有效成分的至少一種hCNTF或至少一種其突變形式，該突變形式選自包含SEQ ID NO2-SEQ ID NO28的組。
7.按照權利要求6的藥物組合物，其中所說的有效成分是hCNTF或其突變形式之一，以及leptin，野生型或突變型CNTF/leptin的比率是1∶500-1∶5。
8.按照權利要求7的藥物組合物，其中所說的野生型或突變型CNTF/leptin的比率是1∶100-1∶25。
9.按照權利要求5到8的藥物組合物，其配製成供腸胃外，鼻，支氣管，眼或直腸施用的製劑。
10.按照權利要求5到9的藥物組合物的施用方法，其特徵在於以1和10,000μg/kg體重之間的日劑量施用有效成分。
11.按照權利要求10的施用方法，其中所說的日劑量優選地在10和1000μg/kg體重之間。
全文摘要
本發明涉及hCNTF(人睫狀神經營養因子),其突變體或激活CNTF受體的其它分子在製備用於治療肥胖症和與其相關的疾病(例如血糖過多)之藥物上的用途。圖1顯示hCNTF和leptin在遺傳性肥胖小鼠和患飲食誘導的肥胖症(DIO)的小鼠中對體重(左邊組)和食物攝取(右邊組)的抗肥胖效果。
文檔編號A61K38/18GK1240358SQ97180757
公開日2000年1月5日 申請日期1997年11月18日 優先權日1997年11月18日
發明者G·西裡伯特, P·科斯塔, G·帕恩薩, D·拉扎羅, I·格洛格恩, A·迪馬科, A·德馬提斯, R·勞弗, R·科特斯 申請人:布·安格萊荻公司分子生物學研究所