減少蛋白質糖基化的方法和過程及其蛋白質的製作方法

2023-05-27 22:12:06 1

專利名稱：減少蛋白質糖基化的方法和過程及其蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及破壞巴斯德畢赤酵母的蛋白甘露糖基轉移酶(PMT)基因，從而減少由畢赤酵母生產的胰島素前體分子的O-糖基化水平。本發明提供了甲醇營養型酵母的基因工程敲除菌株，包括畢赤酵母尤其是巴斯德畢赤酵母，能夠生產糖基化減少的異源性蛋白質。本發明考慮了用於轉化甲醇營養型酵母的載體，這些載體包括PMTl、PMT2、PMT4、PMT5、 和PMT6基因的編碼序列。
背景技術：
已經在多種微生物表達系統中生產了胰島素、胰島素類似物和/或衍生物的重組形式。目前生物體，例如大腸桿菌，釀酒酵母，已經用於商業化生產重組人胰島素及其衍生物。由於這些系統的某些缺點，例如低表達水平，在下遊純化中的困難等，甲醇營養型酵母巴斯德畢赤酵母已經有利地用作蛋白質表達系統。該表達系統提供了若干優點例如高表達，處理簡單，生產成本低，高密度培養(US6800606)。
因為酵母表達系統易於生長，快速並且可按比例放大，它們是廣泛使用的；然而， 一些酵母表達系統產生了不一致的結果，並且有時難以實現高產率。顯示較大前途的一種酵母表達系統是甲醇營養型酵母，巴斯德畢赤酵母。與其他真核生物表達系統相比較，因為畢赤酵母不存在與動物細胞培養中生產蛋白質的細菌或病毒汙染問題相關的內毒素問題， 它有許多優點(Cino, Am Biotech Lab, May 1999)。
雖然多個優點歸因於基於酵母的表達系統，例如巴斯德畢赤酵母，這個系統主要的一個缺點是得到蛋白質的翻譯後修飾，其隨後在終產物中以雜質形式存在，該終產物難以純化。雖然存在許多已知的蛋白質翻譯後修飾，翻譯後修飾的最常用形式還是糖基化(Hart G. ff, Glycosylation, Curr. Opin. Cell. Biol 1992;4:1017)。根據表達系統糖基化可以是 N-連接的或 O-連接的(Gemmill TR et al. , Overview of N-and 0-linked oligosaccharide structures found in various yeast species, Biochemica et Biophysica Acta, 1999; 1426:227)。糖基化影響蛋白質構象的穩定性、免疫原性、清除率、 保護避免蛋白質水解以及改善蛋白質溶解度(Walsh G, Biopharmaceutical benchmarks 2006, Nature Biotechnology, 2006;24:769)。
在酵母中，在高爾基體中糖支鏈的修飾涉及通過不同的甘露糖酶轉移酶進行甘露糖殘基的一系列添加(「外部鏈」糖基化)。所述外部鏈糖基化的結構是生物體特異性的。這類糖基化通常是不期望的，因為在碳水化合物組成以及分子量兩個方面，均會導致重組蛋白質產物的異質性，這可能使蛋白質純化複雜化。它還可以使蛋白質變成高度免疫原性或可以引起不期望的變應性反應。
雖然在改善生物技術製造方面有很大進步，對於每種蛋白質沒有統一的解決方案。用於特異性治療蛋白質的製造方法需要新穎的以及創造性的對問題的解決方案，它們對於該蛋白質或蛋白質家族可以是特異性的。
因此，期待以下的基因工程甲醇營養型酵母菌 株，例如巴斯德畢赤酵母，其中可以操縱蛋白質的糖基化，基本上是減少，並且可以從中生產具有哺乳動物樣翻譯後模式的重組糖蛋白質，而不影響期望的終產物的產率。發明內容
因此，本發明涉及減少從甲醇營養型酵母生產的蛋白質的糖基化的方法，所述方法通過失活選自包括PMTl、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的組中的至少一個或多個基因能夠實現，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述序列編碼蛋白甘露糖基轉移酶或其功能性部分；一種包含選自下組的蛋白甘露糖基轉移酶基因或其功能性部分的載體，所述組包括 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5 和 PMT6 基因，所述 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5 和 PMT6 基因分別具有與 SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述載體整合到同源基因座中抑制了功能性蛋白甘露糖基轉移酶在宿主中，優選在甲醇營養型酵母中的表達；用於生產甲醇營養型酵母的敲除菌株的方法，其中(a) —種載體併入了能夠同源重組的核酸序列，所述同源重組的核酸序列包含編碼選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6 的組中的基因的至少一個的目標核酸序列和編碼選擇標記的核酸序列，所述PMT1、PMT2、 PMT4、PMT5和PMT6分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，(b)在允許在所述載體中編碼目標基因的DNA與在宿主細胞中編碼目標·基因的DNA之間發生同源重組的條件下培養細胞，從而導致破壞宿主細胞中的目標基因，(c) 用失活的目標基因來選擇宿主細胞；從上述方法生產的蛋白質；一種甲醇營養型酵母敲除菌株，具有選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6的組中至少一個失活基因，所述PMTl、 PMT2、PMT4、PMT5和PMT6分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80% 同源性的核苷酸序列；如上所述的PMTl基因失活菌株；如上所述的PMT4基因失活菌株；如上所述的PMT5基因失活菌株；如上所述的PMT6基因失活菌株；從如上所述敲除菌株生產的蛋白質；從根據權利要求23所述的敲除菌株生產的蛋白質，其中該敲除菌株是MTCC5515 (保藏日期2010年I月18日)、MTCC5516 (保藏日期2010年I月18日)、MTCC5517 (保藏日期2010年I月18日)、MTCC5518 (保藏日期2010年I月18日)或其任何修飾菌株中的一種；以及根據上面說明中任一項所述的蛋白質，其中所述蛋白質顯示改變的糖基化。
本發明涉及生產糖基化減少的蛋白質的方法，所述方法涉及對甲醇營養型酵母菌株進行基因修飾並且使它們能夠生產糖基化減少的蛋白質的載體用途。
在一個優選實施方式中，本發明的失活載體包括編碼蛋白甘露糖基轉移酶(PMT， 長萜基磷酸甘露糖蛋白甘露糖基轉移酶蛋白質，E. C. 2. 4.1. 109)的核苷酸序列或其功能性部分，並且能夠破壞或失活甲醇營養型酵母菌株中的蛋白甘露糖基轉移酶或功能性部分。 優選的核苷酸序列是在SEQ ID USEQ ID 2, SEQ ID 3, SEQ ID 4, SEQ ID 5中表示的編碼 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、PMT6基因的核苷酸序列以及它的功能性部分，其被選擇用於破壞在 SEQ ID 6、SEQ ID 7、SEQ ID 8、SEQ ID 9、SEQ ID 10 中分別表示的基因。
根據在本發明中提出的方法，可以將能夠表達異源性蛋白質的核苷酸序列引入到甲醇營養型酵母菌株中，該菌株在前面已經以逐步方式用本發明的一種或多種載體進行轉化。這種酵母菌株可以連續地或同時地用本發明的一種或多種載體進行轉化。另外，可以用一種或多種本發明的失活載體來轉化甲醇營養型酵母菌株，這些載體包括如在序列表中表示的編碼蛋白甘露糖基轉移酶的核苷酸序列。
還提供了使用本方法和載體產生的甲醇營養型酵母菌株，以及從這類基因修飾菌株產生的蛋白質。
使用本發明方法生產的異源性蛋白質產物，即具有降低O-糖基化的蛋白質，也是本發明的一部分。
根據本發明最顯著的方面，所期望的終產物的產率保持不受影響。
本發明另外的目的和優點將在隨後的說明書中部分地提出，並且部分地從該說明書明顯看出或可以從本發明的實踐中得知。可以通過在所附權利要求書中具體指出的手段以及組合來實現並達到這些目標和優點。
結合在本文中並且構成本申請一部分的


了在本發明中有用的多種屬性， 並且與說明書一起用於說明形成本發明關鍵點的多種顯著屬性。

圖1 :當將PMT基因亞克隆到pPICZa中時得到的克隆。
道I =在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL184質粒(1775+576bp片段)，
道2=在BstEII限制性酶作用下消化的PMBL184質粒(線性2351bp片段)，
道3=在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL185質粒(1930+431bp片段)，
道4=在KpnI限制性酶作用下消化的PMBL185質粒(線性2361bp片段)，道5=標記，λ DNAEcoRI 和 HindIII 消化，
道6=在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL186質粒(1923+428bp片段)，
道7=在XmnI限制性酶作用下消化的PMBL186質粒(線性2351bp片段)，
道8=在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL187質粒(1929+437bp片段)，
道9=在BstEII限制性酶作用下消化的PMBL187質粒(線性2366bp片段)，
道10=在BamHI以及SmaI限制性酶作用下消化的PMBL188質粒(1929+497bp片段)，並且
道11=在NdeI限制性酶作用下消化的PMBL188質粒(線性2426bp片段)。
圖2a pMBL184描述了在pPICZa中克隆的PMTl破壞基因。BstEII限制性位點用於將該質粒線性化。
圖2b :敲除型BICC#9104，其中PMTl基因被破壞，道I和13= λ標記，道 18=BICC#9104o
圖2 (c):通過用Hind III限制性酶消化基因組DNA以及使用PMTl破壞片段作為探針得到的DNA印跡。
道M==Ikb DNA 標記,
道1==生產胰島素前體的親代克隆#11』
道2==生產PMTl敲除型胰島素前體的克隆#11，
道3==生產胰島素前體的親代克隆#8』
道4==生產PMTl敲除型胰島素前體的克隆#8,
道5==生產胰島素類似物前體的親代克隆，
道6=生產PMTl敲除型胰島素類似物前體的克隆以及質粒對照。
圖3a pMBL188描述了在pPICZa質粒中克隆的PMT6破壞基因。NdeI限制性位點用於將該質粒線性化。
圖3b PMT6基因敲除的PCR證實結果。
道I=DNA 標記，Ikb 梯子，
道2=使用InsteZRP和PMT6DSCHK的親代克隆PCR (無產物)，
道3=使用 InsteZRP 和 PMT6DSCHK 的 BICC#9107PCR (895bp 產物)，
道4=使用TEFDSRP和SPMT6DCFP的親代克隆PCR (無產物)，
道5=使用 TEFDSRP 和 SPMT6DCFP 的 BICC#9107PCR (639bp 產物)，
道6=使用 ISCHKFP 和 PMT6DSCHK 的 BICC#9107PCR (835bp 產物)。
圖4a pMBL186描述了在pPICZ α質粒中克隆的ΡΜΤ4破壞基因。XcmI限制性位點用於將該質粒線性化。圖4b :破壞的PMT4基因的PCR證實結果。道1=使用InsteZRP和PMT4DSCHK的親代克隆PCR (無產物，-ve對照)，道 2=使用 InsteZRP 和 PMT6DSCHK 的陽性對照 PMT6#79 (895bp 產物)，道 3=使用 InsteZRP 和 PMT4DSCHK 的 BICC#9105PCR (981bp 產物)(第 4 次傳代道 4=使用 TEFDSRP 和 SPMT4DCFP 的 BICC#9105PCR (649bp 產物)(第 4 次傳代培 道5=lkb梯狀DNA標記，道 6=使用 InsteZRP 和 PMT4DSCHK 的 BICC#9105PCR (981bp 產物)(第一次傳代道 7=使用 TEFDSRP 和 SPMT4DRP 的 BICC#9105PCR (649bp 產物)(第一次傳代培
培養)，
養)，
培養)，
養)。
圖5a :pMBL187描述了在pPICZa質粒中克隆的PMT5破壞基因。BstEII限制性位點用於將該質粒線性化。
圖5b PMT5破壞克隆的PCR篩選
道I和13=DNA分子量標記
道2-12和14-21是篩選的不同的PMT5破壞基因。
圖6a pMBL185描述了在pPICZa質粒中克隆的PMT2破壞基因。KpnI限制性位點用於將該質粒線性化。
圖6b PMT2基因敲除陽性篩選。
圖7 :色譜圖的重疊，表明PMTl/胰島素克隆的糖基化減少。
圖8 =RPHPLC譜圖，表明在PMTl基因失活之前和之後胰島素類似物I的糖基化譜圖。
圖9 =RPHPLC譜圖，表明在PMTl基因失活之前和之後胰島素類似物2的糖基化譜圖。
隨附序列表的說明
SEQ ID I =PMTl的核苷酸編碼序列
SEQID2PMT2的核苷酸編碼序列
SEQID3PMT4的核苷酸編碼序列
SEQID4PMT5的核苷酸編碼序列
SEQID5PMT6的核苷酸編碼序列
SEQID6PMT1的破壞序列
SEQID7PMT2的破壞序列
SEQID8PMT4的破壞序列
SEQID9PMT5的破壞序列
SEQID10 PMT6的破壞序列具體實施方式
本發明涉及通過失活選自下組的至少一種或多種基因能夠降低從甲醇營養型酵母生產的蛋白質糖基化的方法，所述組包括分別與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列具有至少80%同源性的核苷酸序列的PMTl、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因，所述序列編碼蛋白甘露糖基轉移酶或其功能性部分。
在本發明的一個實施方式中，該甲醇營養型酵母屬於畢赤酵母。
在本發明的另一個實施方式中，該甲醇營養型酵母是巴斯德畢赤酵母。
在本發明的一個另外實施方式中，該蛋白質是通過式I表示的
X-B-Y-A
其中，
X是包括至少一個胺基酸的前導肽序列，
B是胰島素分子B鏈的胺基酸序列，它的衍生物或類似物，
Y是包括至少一個胺基酸的連接肽，
A是胰島素分子A鏈的胺基酸序列，它的衍生物或類似物，
並且該A和B鏈可以通過胺基酸取代、缺失和/或添加進行修飾。
在本發明的另一個實施方式中，該糖基化模式是O-糖基化。
在本發明的另一個實施方式中，該糖基化降低至少10%至約99%。
在本發明的另一個實施方式中，該糖基化降低25%。
在本發明的另一個實施方式中，該糖基化降低65%。
本發明涉及包含選自下組的蛋白甘露糖基轉移酶基因或其功能性部分的載體，所述組包括分別與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列具有至少80%同源性的核苷酸序列的PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因，將所述載體整合到同源性基因座中抑制了功能性蛋白甘露糖基轉移酶在宿主中，優選在甲醇營養型酵母中的表達。
在本發明的一個實施方式中，減少或改變甲醇營養型酵母生產的蛋白質上糖基化的方法包括用上述載體轉化所述酵母。
在本發明的另一個實施方式中，該甲醇營養型酵母屬於畢赤酵母。
在本發明的另一個實施方式中，該甲醇營養型酵母是巴斯德畢赤酵母。
本發明涉及用於生產甲醇營養型酵母敲除菌株的方法，其中(a) —種載體併入了能夠同源重組的核酸序列，所述同源重組的核酸序列包含編碼選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6的組中的基因的至少一個的目標核酸序列和編碼選擇標記的核酸序列，所述 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，(b)在允許在所述載體中編碼目標基因的DNA與在宿主細胞中編碼目標基因的DNA之間發生同源重組的條件下培養細胞，從而導致破壞宿主細胞中的目標基因，(c)用失活的目標基因來選擇宿主細胞。
本發明進一步涉及從根據前述權利要求中任一項所述的方法生產的蛋白質。
本發明進一步涉及甲醇營養型酵母的敲除菌株，所述菌株具有選自下組的至少一種失活基因，該組包括分別與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列具有至少80%同源性的核苷酸序列的PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6。
本發明涉及如上所述的PMTl基因失活菌株，具有登錄號MTCC5515。
本發明進一步涉及如上所述的PMT4基因失活菌株，具有登錄號MTCC5516。
本發明涉及如上所述的PMT5基因失活菌株，具有登錄號MTCC5517。
本發明進一步涉及如上所述的PMT6基因失活菌株，具有登錄號MTCC5518。
在本發明的一個實施方式中，與在未改變的宿主菌株中表達的蛋白質產物相比， 所述宿主菌株產生糖基化水平減少的蛋白質。
在本發明的另一個實施方式中，該糖基化減少至少25%。
在本發明的另一個實施方式中，該糖基化減少至少65%。
本發明涉及從如上所述的敲除菌株生產的蛋白質。
本發明涉及從根據權利要求23所述的敲除菌株生產的蛋白質，其中該敲除菌株是MTCC 5515,MTCC 5516,MTCC 5517,MTCC 5518或它們任何修飾菌株中的一種。
在本發明的一個實施方式中，該選擇性標記是博萊黴素抗性標記。
在本發明的另一個實施方式中，該蛋白質是胰島素/胰島素類似物/胰島素前體分子。
在本發明的另一個實施方式中，所生產的蛋白質是異源性蛋白質產物。
在本發明的另一個實施方式中，該蛋白質顯示改變的糖基化。
在本發明的另一個實施方式中，所期望的蛋白質終產物的產率保持不受影響。
現在將詳細地參考本發明目前優選的實施方式，它們與下面實施例一起用於說明本發明的原理。
列出下面的實施例以幫助理解本發明，而不旨在，並且不應理解成以任何方式限制其範圍。這些實施例不包括對構建載體、將編碼多肽的基因插入這類載體中或將得到的質粒引入到宿主內中所使用的常規方法的詳細說明。這些實施例還不包括對用於分析由這類宿主載體系統生產的多肽所使用的常規方法的詳細說明。這類方法是本領域普通技術人員熟知的並且在許多出版物中進行了描述，包括通過舉例方式。
標準技術用於不同的重組DNA技術、轉化(例如，電穿孔、脂質體轉染)以及測定。 這些重組技術和步驟通常是根據本領域熟知的常規方法以及如在貫穿本說明書所引用和討論的各種一般性以及更具體的參考文獻中所描述的進行的。參見例如SambiOOk et al. Molecular Cloning:A Laboratory Manual(3rd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001),它通過引用結合在此。
在說明本發明以及提出權利要求中，可以根據在此列出的定義來使用下面術語。
除非在此另外定義，否則在本發明中使用的科學和技術術語將具有本領域普通技術人員所通常理解的含義。另外地，除非上下文另外要求，否則單數術語包括複數並且複數術語包括單數。本發明的方法和技術通常是根據本領域熟知的常規方法來完成的。總體上，結合使用的命名法以及在本文所述的分子和細胞生物學、生物化學、蛋白質和核酸化學以及雜交技術是熟知的並且是本領域中常用的。本發明的方法和技術通常是根據本領域熟知的常規方法來完成的。
如在本文中使用的「胺基酸」是指肽或蛋白質序列或它們的部分。術語「蛋白質」、 「肽」以及「多肽」可互換地使用。
根據本發明優選實施方式的異源性蛋白質是胰島素或胰島素類似物前體分子。
編碼異源性蛋白質的DNA是通過式I表示的
X-B-Y-A
其中，
X是包括至少一個胺基酸的前導肽序列，
B是胰島素分子B鏈的胺基酸序列，它的衍生物或類似物，
Y是包括至少一個胺基酸的連接肽，
A是胰島素分子A鏈的胺基酸序列，它的衍生物或類似物，
並且所述A和B鏈可以通過胺基酸取代、缺失和/或添加進行修飾。
如在本文中使用的術語「C-肽」或「連接肽」包括胰島素C-肽的所有形式，包括天然或合成的肽。這類胰島素C -肽可以是人類肽，或可以是來自其他動物種以及屬，優選哺乳動物。因此包括天然胰島素C-肽的變異體以及修飾，只要它們保存胰島素C-肽的活性即可。修飾蛋白質或肽的序列，同時保持它們有用的活性是本領域已知的，並且可以使用本領域中標準的並且在文獻中廣泛說明的技術(例如，隨機或定點誘變，切割以及連接核酸等)來實現這一點。因此，天然胰島素C-肽序列的功能等效變異體或衍生物可以根據本領域熟知的技術容易地製備，並且包括具有天然胰島素C-肽功能性(例如生物學)活性的肽序列。所有這類胰島素C-肽的類似物、變異體、衍生物或片段特別地包括在本發明的範圍內， 並且包含在術語「胰島素C-肽」下。
連接序列可以是具有至少兩個胺基酸的任何序列。連接區域可以包括從2至25、 2至15、2至12或2至10個胺基酸殘基，雖然長度不是關鍵性的並且可以方便地或根據選項進行選擇，或可以無連接物。
該連接肽可以是在前兩個胺基酸代表「RR」的條件下包括至少兩個胺基酸的任何序列。
根據本發明其他實施方式的多肽在本文中稱為具有甘精胰島素(insulin glargine)活性，例如甘精胰島素被認為具有人類胰島素結構兩個改變的胺基酸序列通過重組DNA技術產生的將人類胰島素A鏈位置A21處的天然天冬氨酸取代為胺基酸甘氨酸， 以及將兩個精氨酸分子添加到人類胰島素B鏈的COOH末端。任何胰島素(包括甘精胰島素) 的主要作用是調節葡萄糖代謝。胰島素和它的類似物通過刺激周邊葡萄糖吸收(尤其是在骨骼肌以及脂肪內)以及通過抑制肝臟葡萄糖生產降低了血糖水平。
術語「插入失活」是指通過插入外源DNA來破壞基因的編碼區，導致基因功能的喪失。這廣泛地用於基因技術中以允許在轉化後容易地選擇重組體。
術語「敲除」是指破壞基因，其中該破壞導致天然基因的功能性失活；天然基因或其一部分的缺失，或天然基因中的突變。具體地關於本發明，「敲除」是指破壞PMT1、PMT2、 PMT4、PMT5、PMT6 基因。
可以根據本領域已知有效的多種方法中的任何一種來製備敲除菌株。例如，可以將包含期望的核酸缺失序列的同源目標基因序列5'和3'的同源重組載體轉化到宿主細胞中。理想地，當同源重組時，可以產生期望的目標酶基因敲除。
「同源重組」是指在兩個DNA分子配對染色體之間在相同或基本上相同核苷酸序列的位點處交換DNA片段。在同源重組中，進入的DNA與包含基本上同源的DNA序列的基因組中的位點相互作用並且整合到其中。在非同源(「隨機」或「非法」)整合中，進入的DNA不整合在基因組中同源序列處而是在別處，在許多潛在位置中的一處。
例如，使用或不使用可選擇標記和/或陰性可選擇標記，可以使用突變體、功能性或非功能性基因、側接與內源性目標基因同源的DNA (例如，編碼區側接目標基因)、體內轉化編碼目標基因不期望的形式的細胞。通過靶向同源重組插入DNA構建體導致內源性基因失活。
如在本文中使用的，術語「同源性」是指i)具有與給定的原始蛋白質或肽的序列基本上類似的(即，至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、或98%)胺基酸序列以及保持原始蛋白質或肽的期 望功能的蛋白質或肽，或ii)具有與給定核酸的序列基本上類似(即，至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、或98%)的序列以及保持原始核酸序列的期望功能的核酸。在本發明以及公開的所有實施方式中，任何公開的蛋白質、肽或核酸可以用保持期望功能的同源或基本上同源的蛋白質、肽、或核酸來取代。在本發明以及公開的所有實施方式中，當公開任何核酸時，應當假設本發明還包括雜交到公開的核酸上的所有核酸。
「功能性部分」是指基本上保持全長蛋白質酶活性的PMT基因片段。「基本上」是指保留了全長PMT的至少約40%，或優選地至少50%或更高的酶活性。
當將它放在與另一種核酸序列功能性關係中時，核酸是「可操作地連接」的。因此， 編碼序列「可操作地連接」到控制序列是指一種結構，其中編碼序列可以在這些序列的控制下表達並且其中所連接的DNA序列是連續的。
如在本文中使用的術語「表達」是指一種過程，通過該過程基於基因的核酸序列生產了多肽。該過程包括轉錄和翻譯二者。
一方面，分離的核酸分子包括與編碼PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、PMT6基因的DNA分子具有至少約80%核酸序列一致性，可替代地至少約81%核酸序列一致性，可替代地至少約 82%核酸序列一致性、可替代地至少約83%核酸序列一致性、可替代地至少約84%核酸序列一致性、可替代地至少約85%核酸序列一致性、可替代地至少約86%核酸序列一致性、可替代地至少約87%核酸序列一致性、可替代地至少約88%核酸序列一致性、可替代地至少約 89%核酸序列一致性、可替代地至少約90%核酸序列一致性、可替代地至少約91%核酸序列一致性、可替代地至少約92%核酸序列一致性、可替代地至少約93%核酸序列一致性、可替代地至少約94%核酸序列一致性、可替代地至少約95%核酸序列一致性、可替代地至少約 96%核酸序列一致性、可替代地至少約97%核酸序列一致性、可替代地至少約98%核酸序列一致性以及可替代地至少約99%核酸序列一致性的核苷酸序列。
可替代地,可以通過Smith 和 Waterman (1981)Add. APL. Math 2:482 的局部識別算法，通過Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443 的識別比對算法,通過Pearson 和Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 85:2444是尋找相似性方法，通過計算機實現這些算法(在 Wisconsin Genetics Software Package 中的 BLAST、FASTA、GAP、BESTFIT 以及 TFASTA, Genetics Computer Group (GCG), 575Science Dr.，Madison, Wis.),或通過檢查進行用於比較的序列優化比對。適合確定百分比序列一致性以及序列相似性的算法的一個實例是BLAST 以及BLAST 2. O算法，在Altschul et al. (1977)Nucl. Acids Res. 25:3389 3402 以及 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403410 中對它們進行說明。
更具體地，本發明是針對核酸序列，適當地分離的核酸序列，它包括或包含至少 SEQ ID USEQ ID 2,SEQ ID 3,SEQ ID 4,SEQ ID 5、它們的變異體或它們的部分，或 PMT1、 PMT2、PMT4、PMT5、PMT6基因(包括變異體或部分)中的至少一種。本發明還針對在嚴格條件下能夠與這些核酸序列雜交的分離核酸序列。
本發明提供了包括編碼在本文中所述基因中任一項的DNA載體。還提供了包含任何這類載體的宿主細胞。作為舉例，宿主細胞可以是細菌的、真菌的，或哺乳動物的。·
本發明還針對重組宿主細胞，其中如上定義核酸序列的至少一部分被破壞從而導致重組宿主細胞，與相應的親代重組宿主細胞相比，該重組宿主細胞生產降低水平糖基化的胰島素前體。重組表達細胞選自原核以及真核宿主。真核宿主包括酵母細胞(例如， 釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母)、哺乳動物細胞或植物細胞。對於本領域普通技術人員而言，細菌以及真核細胞可從許多不同來源得到包括商業來源，例如美國典型培養物保藏所 (American Type Culture Collection) (ATCC; Rockville, Md.)。用於重組蛋白質表達的細胞商業來源還提供了使用這些細胞的說明書。表達系統的選擇取決於針對表達的多肽所期望的特徵。
最優選地涉及本發明的多個方面，最優選的宿主細胞是甲醇營養型酵母。可以使用本發明修飾的甲醇營養型酵母的菌株包括但不限於能夠在甲醇上生長的酵母菌株，例如畢赤酵母屬、念珠菌屬、漢遜酵母屬、或球擬酵母屬的酵母。優選的甲醇營養型酵母是畢赤酵母屬。可以用本方法修飾的甲醇營養型酵母菌株還包括已經改造用來表達感興趣的一種或多種異源性蛋白質的那些甲醇營養型酵母菌株。可以通過用本發明的一種或多種載體轉化這類菌株來降低從之前這些基因工程菌株表達的異源性蛋白質上的糖基化。
可以使用標準技術將宿主細胞或生物體工程化用來表達重組蛋白質或肽。例如， 可以從質粒或從插入到宿主基因組中的異源基因來表達重組蛋白質。
可以用於表達外源性蛋白質的載體是本領域熟知的並且在下面進行說明。還可以使用如在本發明中說明的多種技術(例如同源或異源重組)，將用於表達重組蛋白質或肽的基因插入到基因組中。攜帶蛋白甘露糖基轉移酶基因的本發明優選的載體包括但不限於 pPICZa 以及 pTZ57R。
另一方面，本發明提供了失活載體，當引入到甲醇營養型酵母菌株中時該失活載體失活或破壞基因，由此有助於降低在甲醇營養型酵母菌株中生產的期望蛋白質終產物的糖基化而不影響終產物的產率。
在用化合物誘導之後或當表達內源性基因或基因產物後可以表達重組蛋白質或肽。當將宿主細胞置於具體環境中時也可以表達重組蛋白質。下面對特異性啟動子元件進行說明。
如在本文中使用的，術語「轉化的」以及「穩定轉化的」是指已經被用來結合整合到維持至少兩代的游離型質粒中的非天然(異源)多核苷酸序列的細胞。
如在本文中使用的，「重組體」包括細胞或載體，它已經通過引入異源性核酸序列進行修飾或該細胞是從這樣修飾的細胞衍生的。
可以通過多種方式將載體轉化到宿主細胞中，包括但不限於電穿孔、病毒感染、磷酸鈣沉澱、DEAE-葡聚糖、直接顯微注射、加載DNA的脂質體以及陽離子脂質體-DNA複合物、 細胞超聲、使用高速微粒的基因轟擊或在此所述或本領域已知的任何其他方式。
本發明還針對生產期望蛋白質的方法，包括在多種條件下以及在適合生產這種蛋白質化合物或其類似物的培養基中，在生物體中(例如畢赤酵母)進行發酵，其中已經結合了足以指導所期望終產物生產的編碼多肽的基因。
已經發現的是在內質網中蛋白甘露糖基轉移酶基因(PMT)催化蛋白質的絲氨酸和蘇氨酸殘基的O-糖基化。在本發明中已經證明的是PMT基因的破壞顯著地降低了所產生的胰島素前體分子的O-糖基化水平。PMTl基因的破壞導致胰島素前體顯示甘露糖基化降低約65%。分別破壞PMT5和PMT6基因導致胰島素前體糖基化水平分別降低31%以及28%。 PMT2以及PMT4的破壞不影響甘露糖基化。
如在本文中使用的，術語「減少表達」廣義地解釋為包括感興趣蛋白質的降低生產。減少表達是指表達低於在未用本文中傳授的內容改變但是在基本上相同的生長條件下生長的相應宿主菌株中正常表達的水平。在本發明的上下文中，感興趣的酶或蛋白質是甘露糖基轉移酶類，這些酶在胰島素/胰島素類似物前體分子的甘露糖殘基的糖基化方面具有顯著作用。
根據本發明的一個方面，糖基化的減少可以是至少20%、優選地至少25%、優選地至少30%、優選地至少35%、更優選地至少40%、更優選地至少45%、更優選地至少50%、更優選地至少55%、最優選地至少60%、最優選地至少65%並且最優選地至少70%。根據本發明的另一個方面，可得到的糖基化的降低是約100%。
如在本文中使用的，術語「引物」是指寡核苷酸，無論天然存在的(如在純化的限制性消化物中)或合成生產的，當在誘導合成與一個核酸鏈互補的引物延伸產物的條件下 (即，在核苷酸以及誘導劑例如DNA聚合酶存在下以及在適當的溫度和pH下)時它能夠作為合成的起始點。
在許多出版物中對PCR技術進行了說明，包括PCR:A Practical Approach,M.J.McPherson et al. , IRL Press (1991), PCR ProtocoIs: A Guide to Methods and Applications, by Innis et al., Academic Press(1990),以及 PCR Technology: Principals and Applications of DNA Amplification, H. A.Erlich, Stockton Press (1989)。
在許多美國專利中也對PCR進行了說明，包括美國專利號4，683，195,4, 683，202、 4，800，159、4，965，188、4，889，818、5，075，216、5，079，352、5，104，792、5，023，171、 5，091，310、以及5，066，584，它們通過引用結合在此。
根據本發明最顯著的方面，提供了用於生產甲醇營養型酵母「敲除」菌株的方法， 其中(a)—種載體結合了編碼選自下組的至少一種基因的核酸序列以及編碼可選擇標記的核酸序列，該組由分別通過SEQ ID 1、2、3、4和5表示的PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6組.成，(b)在發生同源重組的條件下培養細胞，由此破壞宿主細胞中的目標核酸序列，(C)對其中發生同源重組的細胞進行選擇，以及(d)對改變的菌株中糖基化的降低水平進行評估。
用電穿孔實施巴斯德畢赤酵母的所有轉化。在包含100 μ g/ml博萊黴素的YPD平板上選擇攜帶博萊黴素抗性基因的載體轉化體。
因此，本發明的方法導致能夠生產感興趣蛋白質的改變的酵母菌株，其中所述菌株具有選自下組的至少一種失活基因，該組包括如分別通過SEQ ID 1、2、3、4和5表示的 PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6，以及(b )在例如與未改變的宿主菌株中生產的蛋白質產物相比糖基化終產物的水平降低的條件下，生長所述改變的菌株。
應當理解的是本發明不限於具體的方法、實驗方案、細胞系、載體、種或屬、以及所述培養基組分，因為這些可以改變。還應當理解的是在本文中使用的術語僅是用於說明具體實施方式
的目的，並非旨在限制本發明的範圍，本發明的範圍將僅受所附權利要求書的限制。上面的說明是用於傳授本領域普通技術人員如何實踐本發明的目的，並不旨在對其所有顯而易見的改變以及變更進行詳細說明，當閱讀本說明書時這些對於本領域的技術人員而言應當是清楚的。
PMT基因失活菌株的保藏
按照充分公開的要求,本發明的菌株已經保藏在IMTEC Institute of Microbial Technology, Sector 39-A, Chandigarh 160036, India (根據基於布達佩斯條約的國際保藏)。這些菌株是(登錄號示於括號中)
菌株名稱MTCCΔΡΜΤ1 /GSl 15MTCC 5515APMT4/GS115MTCC 5516ΔΡΜΤ5 /GSl I5MTCC 5517APMT6/GS115MTCC 5518
通過參考下面的實施例，可以更全面地說明並理解本發明，這些實施例是以舉例說明的方式給出的並非旨在以任何形式限制本發明的範圍。
實施例1
PMTl 的破壞
使用下面PMTl引物對涉及巴斯德畢赤酵母PMTl編碼區的部分的約477bp的編碼序列進行擴增
PMT1FP=5/ GGA TCC TAA TAG CCC ACT CTG ATC TAC CTC ACT 3'
PMT1RP=5/ GGA TCC AAA GCC CTC ATG TCC ATA AGC AGA 3'。
在框內在正向引物中包括兩個終止密碼子以避免從載體中潛在的早期翻譯起始位點的任何通讀(read-through)。將PCR產物克隆到pTZ57R載體中，並且使用M13FP以及 M13RP進行測序用來證實該克隆。使用BamHI對PMTl片段進行切除並且克隆到pPICZa中 BamHI和Bgl II位點中。選擇給出1775bp和576bp片段的克隆。
將PMTl破壞盒(disruption cassette)轉化到巴斯德畢赤酵母GS115中。使用 BstEII位點將質粒線性化，該位點幾乎在通過電穿孔轉化到畢赤酵母菌株中的PMTl破壞片段(disruption fragment)的中部。使用100 μ g/ml博萊黴素選擇轉化的克隆。得到幾百個克隆並且將各克隆劃線到YPD平板上。從每個克隆中分離基因組DNA並且進行PCR以檢查正確破壞的克隆。通過PCR (參見圖2b)和DNA印跡(參見圖2c)來證實PMTl敲除。 將選擇的克隆保藏為MTCC5515。
引物序列
InSTEzRP:5』 TAG CAG AGC GAG GTA TGT AGG CGG TGC 3』
TEFDSRP:GAG TCC GAG AAA ATC TGG AAG AGT 3』
ISCHKFP:5』 GCT ACA CTA GAA GGA CAG TAT TTG GTA 3』
SPMT1DCFP:5』 GGA CTT ATG GTT CAT CAT TGG TGA 3』
實施例2
PMT6 的破壞
使用下面引物對涉及PMT6編碼區的部分的約515bp的編碼序列進行擴增
PMT6FP=5' GGA TCC TAA TAG CTT GCC GTT AAG AGA TAC GAT GA 3』
PMT6RP=5』 GGA TCC TGA GAA TGC AAG TTT GCA CCA GTA 3'
在框內在正向引物中包括兩個終止密碼子以避免從載體中潛在的早期翻譯起始位點的任何通讀。將PCR產物克隆到pTZ57R載體中，使用M13FP和M13RP進行測序以證實該克隆。
將PMT6破壞盒轉化到巴斯德畢赤酵母GSl 15中。使用唯一的NdeI位點將質粒線性化，該位點幾乎位於通過電穿孔轉化到畢赤酵母菌株中的PMT6破壞片段的中部。使用 100 μ g/ml博萊黴素選擇轉化的克隆。得到幾百個克隆並且將各克隆劃線到YH)平板上。 從每個克隆中分離基因組DNA並且進行PCR用來篩選正確破壞的克隆(參見圖3b)。將選擇的克隆保藏為MTCC5518。
實施例3:
PMT4 的破壞
使用下面引物對涉及PMT4編碼區的部分的約516bp的編碼序列進行擴增。
PMT4FP=5' GGA TCC TAA TAG GTT CAT TTC GCT ATT CTA AGC A 3』
PMT4RP=5』 GGA TCC TTT CGA CTT CAA AGG ACG GGT T 3'
在框內在正向引物中包括兩個終止密碼子以避免從載體中潛在的早期翻譯起始位點的任何通讀。將PCR產物克隆到pTZ57R載體中，使用M13FP和M13RP進行測序以證實該克隆。
將PMT4破壞盒轉化到巴斯德畢赤酵母GSl 15中。用唯一的XcmI位點將質粒線性化，該位點幾乎位於通過電穿 孔轉化到畢赤酵母菌株中的PMT4破壞片段的中部。使用 100 μ g/ml博萊黴素選擇轉化的克隆。得到數百個克隆並且將各克隆劃線到YPD平板上。 從每個克隆中分離基因組DNA並且進行PCR以篩選正確破壞的克隆(參見圖4b)。將選擇的克隆保藏為MTCC5516。
實例4:
PMT5 的破壞
使用引物對涉及PMT5編碼區的部分的約455bp的編碼序列進行擴增
PMT5FP=5' AGA TCT TAA TAG ATC CTA CCA GTG ATC ATT TAC CT 3』
PMT5RP=5』 AGA TCT TCA CTA ATT GGA AGG TCT AGA ATC 3'
在框內在正向引物中包括兩個終止密碼子以避免從載體中潛在的早期翻譯起始位點的任何通讀。將PCR產物克隆到pTZ57R載體中，使用M13FP和M13RP進行測序以證實該克隆。
將PMT5破壞盒轉化到巴斯德畢赤酵母GS115中。使用唯一的BstEII位點將質粒線性化，該位點幾乎位於通過電穿孔轉化到畢赤酵母菌株中的PMT5破壞片段的中部。使用 100 μ g/ml博萊黴素選擇轉化的克隆。得到幾百個克隆並且將各克隆劃線到YPD平板上。 從每個克隆中分離基因組DNA並且進行PCR以篩選正確破壞的克隆並且通過PCR證實該克隆(參見圖5b)。將選擇的克隆保藏為MTCC5517。
實施例5:
PMT2 的破壞
使用下面的引物組對涉及PMT2編碼區的部分的約439bp的編碼序列進行擴增
PMT2FP=5』 GGA TCC TAA TAG GTG GGT TTA TTT GTC ACA GTA 3』
Pmt2RP=5』 GGA TCC GAA ACA CCC AAT CAT TGT TGG CA 3'
在框內在正向引物中包括兩個終止密碼子以避免從載體中潛在的早期翻譯起始位點的任何通讀。將PCR產物克隆到pTZ57R載體中，使用M13FP和M13RP進行測序以證實該克隆。
將PMT2破壞盒轉化到巴斯德畢赤酵母GSl 15中。使用唯一的KpnI位點將質粒線性化，該位點幾乎位於通過電穿孔轉化到畢赤酵母菌株中的PMT2破壞片段的中部。使用 100 μ g/ml博萊黴素選擇轉化菌株。得到幾百個克隆並且將各克隆劃線到YH)平板上。從每個克隆分離基因組DNA並且進行PCR以篩選正確破壞的克隆(圖6)。
實施例6
通過PMT敲除減少胰島素的糖基化
用胰島素表達構建體來轉化巴斯德畢赤酵母GS115從而得到克隆BICC#7743，作為糖基化水平的對照；分泌的胰島素具有1. 90-2. O的糖基化水平(視為100%)。也用胰島素表達構建體克隆PMT敲除菌株MTCC5515、MTCC 5517和MTCC 5518以對比分泌的胰島素的糖基化水平與對照。當與對照BICC#7743生產的胰島素比較時，在糖基化方面存在顯著減少(參見圖7)，分別為61%、31%以及28%。
克隆名稱菌株名稱糖基化水平糖基化減少％BICC#7743GS1151.90-2.20OBICC#9104MTCC5515O. 8661BICC#9106MTCC55171. 531BICC#9107MTCC55181. 5928
實施例7:
通過PMT敲除減少胰島素類似物I的糖基化
用胰島素表達構建體轉化巴斯德畢赤酵母GS115從而得到克隆BICC#7744，作為糖基化水平的對照；分泌的胰島素具有1. 66的糖基化水平(視為100%)。也用胰島素表達構建體克隆PMT敲除菌株MTCC 5515以比較分泌的胰島素的糖基化水平與對照。當與由對照BICC#7744生產的胰島素類似物I比較時，在糖基化方面顯著減少(圖8) 46%。
權利要求
1.一種減少由甲醇營養型酵母生產的蛋白質的糖基化的方法，所述方法通過失活選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的組中的至少一個或多個基因能夠實現，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述序列編碼蛋白甘露糖基轉移酶或其功能性部分。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述甲醇營養型酵母屬於畢赤酵母。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述甲醇營養型酵母是巴斯德畢赤酵母。
4.根據權利要求1所述的方法，其中所述蛋白質是通過式I表示的 X-B-Y-A 其中， X是包括至少一個胺基酸的前導肽序列， B是胰島素分子B鏈的胺基酸序列、它的衍生物或類似物， Y是包括至少一個胺基酸的連接肽， A是胰島素分子A鏈的胺基酸序列，它的衍生物或類似物， 並且所述A和B鏈可以通過胺基酸取代、缺失和/或添加來修飾。
5.根據權利要求1所述的方法，其中所述糖基化的方式是O-糖基化。
6.根據權利要求1所述的方法，其中糖基化減少至少10%至約99%。
7.根據權利要求6所述的方法，其中糖基化減少25%。
8.根據權利要求6所述的方法，其中糖基化減少65%。
9.一種包含蛋白甘露糖基轉移酶基因或其功能性部分的載體，所述蛋白甘露糖基轉移酶基因或其功能性部分選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因的組，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6基因分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，所述載體整合到同源基因座中抑制了功能性蛋白甘露糖基轉移酶在宿主中，優選在甲醇營養型酵母中的表達。
10.一種減少或改變甲醇營養型酵母生產的蛋白質上的糖基化的方法，包括用權利要求9所述的載體轉化所述酵母。
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述甲醇營養型酵母屬於畢赤酵母。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述甲醇營養型酵母是巴斯德畢赤酵母。
13.一種用於生產甲醇營養型酵母的敲除菌株的方法，其中(a)—種載體併入了能夠同源重組的核酸序列，所述同源重組的核酸序列包含編碼選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6的組中的基因的至少一個的目標核酸序列和編碼用於選擇標記的核酸序列，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6分別具有與SEQ ID No. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列，(b)在允許在所述載體中編碼所述目標基因的DNA與在宿主細胞中編碼所述目標基因的DNA之間發生同源重組的條件下培養細胞，從而導致破壞宿主細胞中的目標基因，(c)用失活的目標基因來選擇宿主細胞。
14.一種由根據前述權利要求中任一項所述的方法生產的蛋白質。
15.一種甲醇營養型酵母的敲除菌株，所述菌株具有選自包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6的組中至少一個失活基因，所述PMT1、PMT2、PMT4、PMT5和PMT6分別具有與SEQ IDNo. 1、2、3、4和5表示的核苷酸序列至少80%同源性的核苷酸序列。
16.權利要求15中所述的PMTl基因失活菌株，登錄號是MTCC5515。
17.權利要求15中所述的PMT4基因失活菌株，登錄號是MTCC5516。
18.權利要求15中所述的PMT5基因失活菌株，登錄號是MTCC5517。
19.權利要求15中所述的PMT6基因失活菌株，登錄號是MTCC5518。
20.根據權利要求15所述的敲除菌株，其中與在未改變的宿主菌株中表達的蛋白質產物相比，所述宿主菌株產生糖基化水平減少的蛋白質。
21.根據權利要求15所述的敲除菌株，表達糖基化減少至少25%的蛋白質。
22.根據權利要求15所述的敲除菌株，表達糖基化減少至少65%的蛋白質。
23.一種由根據權利要求15所述的敲除菌株生產的蛋白質。
24.根據權利要求23所述的由敲除菌株生產的蛋白質，其中所述敲除菌株是MTCC5515, MTCC 5516, MTCC 5517, MTCC 5518或它們任何修飾菌株中的一種。
25.根據權利要求14和23所述的蛋白質，其中選擇標記是博萊黴素抗性標記。
26.根據權利要求23所述的蛋白質，其中所述蛋白質是胰島素/胰島素類似物/胰島素前體分子。
27.通過根據權利要求1所述的方法生產的蛋白質是異源性蛋白質產物。
28.根據前述權利要求中任一項所述的蛋白質，其中所述蛋白質顯示改變的糖基化。
29.根據前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述期望的蛋白質終產物的產率保持不受影響。
全文摘要
本發明涉及降低由畢赤酵母生產的胰島素或胰島素類似物前體分子的O-糖基化水平的方法。本發明通過破壞蛋白甘露糖基轉移酶(PMT)基因提供了包括畢赤酵母尤其是巴斯德畢赤酵母的甲醇營養型酵母的基因工程敲除菌株，且使它們能夠生產糖基化減少的異源性蛋白質。本發明考慮了用於轉化甲醇營養型酵母的載體，這些載體包括PMT1、PMT2、PMT4、PMT5、和PMT6基因的編碼序列。本發明的PMT失活菌株已經保藏在MTCC，Chandigarh。這些菌株是PMT1/GS115(MTCC 5515)、PMT4/GS115(MTCC 5516)、PMT5/GS115(MTCC 5517)以及PMT6/GS115(MTCC5518)。
文檔編號C12N15/81GK103003438SQ201080063624
公開日2013年3月27日 申請日期2010年3月29日 優先權日2010年2月10日
發明者納加拉傑·戈文達帕, 科瑪爾·卡諾賈, 克裡希納穆爾蒂·文卡特森, 尼特斯·戴夫, 穆克什·巴布阿帕·帕塔勒, 桑賈伊·蒂瓦裡, 克達納斯·N·薩斯特裡, 哈裡什·耶爾 申請人:拜康有限公司