用於自含木素纖維素材料產生發酵產物的方法與流程

2023-05-28 06:16:47 2

本申請是基於申請日為2010年12月21日，優先權日為2009年12月21日，申請號為201080058461.4，發明名稱為「用於自含木素纖維素材料產生發酵產物的方法」的專利申請的分案申請。

公開了用於自含木素纖維素材料產生發酵產物的方法，並且更具體而言，通過兩階段預處理來增強含木素纖維素材料的酶促水解的方法。

對於序列表的提及

本申請含有計算機可讀形式的序列表。所述計算機可讀形式通過提述引入本文。

背景技術：

含木素纖維素材料或生物質可以用於產生可發酵糖，其繼而可以用於產生發酵產物例如可再生燃料和化學品。含木素纖維素材料是包裹在木質素和半纖維素鞘中的纖維素纖維的複雜結構。自含木素纖維素材料產生發酵產物包括預處理、水解和發酵含木素纖維素材料。

木素纖維素的結構不是酶促水解能夠直接接近的。因此，對木素纖維素進行預處理，以便破裂木質素密封且破壞纖維素的晶狀結構。這可能引起半纖維素級分的增溶和糖化。隨後可以將纖維素級分酶促水解，例如通過纖維素分解酶，所述纖維素分解酶將碳水化合物聚合物降解成可發酵糖。這些可發酵糖隨後通過發酵生物轉化成所需發酵產物，所述產物可以任選地例如通過蒸餾進行回收。

自含木素纖維素材料產生發酵產物目前是非常昂貴的。因此，需要提供用於自含木素纖維素材料產生發酵產物的進一步的工藝。

發明概述

本發明涉及用於自含木素纖維素材料產生水解產物的方法，其包括在相對低的溫度預處理含木素纖維素材料，隨後用包含高比例木聚糖酶的酶組合物水解。

相應地，在一個方面，本發明涉及用於產生木素纖維素材料的水解產物的工藝，其包括(a)對所述木素纖維素材料實施在165℃–175℃之間的溫度的預處理，(b)對經預處理的木素纖維素材料實施水解酶的作用以產生水解產物，其中所述水解酶包含纖維素分解酶(cellulyticenzyme)和木聚糖酶，所述木聚糖酶以總量水解酶蛋白的至少10％的量存在。

本發明的一個優點包括含木素纖維素材料的可消化性得到顯著改善，因此降低用於自含木素纖維素材料產生發酵產物的成本。

附圖簡述

圖1顯示使用表2中所示的水解酶的12種不同組合物在2個不同溫度預處理的玉米秸稈的水解結果。

發明詳述

含木素纖維素材料

「木素纖維素」或「含木素纖維素材料」意指主要由纖維素、半纖維素和木質素組成的材料。此類材料通常稱為「生物質」。

生物質是包裹在木質素和半纖維素鞘中的纖維素纖維的複雜結構。生物質的結構使得它對於酶促水解並不易感。為了增強酶促水解，生物質必須進行預處理，以便破裂木質素密封，且溶解半纖維素，且破壞纖維素的晶狀結構。纖維素隨後可以進行酶促水解，例如通過纖維素分解酶處理，以將碳水化合物聚合物轉化成可發酵糖，其可以發酵成所需發酵產物，例如乙醇。半纖維素分解酶處理也可以用於水解預處理的生物質中的任何剩餘的半纖維素。

生物質可以是含有木素纖維素的任何材料。在一個優選實施方案中，生物質含有至少約30重量％、優選至少約50重量％、更優選至少約70重量％、甚至更優選至少約90重量％木素纖維素。

生物質一般例如在植物的莖、葉、皮、殼(hull,husk)和穗軸或樹的葉、枝和木材中發現。生物質包括但不限於草本材料、農業殘餘物、林業殘餘物、市政固體廢物、廢紙以及漿和造紙廠殘餘物。應當理解生物質可以是在混合基質中含有木質素、纖維素和半纖維素的植物細胞壁材料的形式。生物質可以進一步含有組成成分，例如蛋白質性材料、澱粉、和糖例如可發酵糖或不可發酵糖、或它們的混合物。

合適生物質的其他例子包括玉米纖維、稻草、松材、木屑(woodchip)、甘蔗渣、紙和漿加工廢物、玉米秸稈、玉米穗軸、硬木材例如白楊木(poplar)和樺木(birch)、軟木材、穀類稻草(cerealstraw)例如麥秸、稻草(ricestraw)、柳枝稷、芒屬(miscanthus)、稻殼、市政固體廢物(msw)、工業有機廢物、辦公室用紙、或它們的混合物。

在一個優選實施方案中，生物質選自玉米秸稈、玉米穗軸、玉米纖維、柳枝稷、麥秸、稻草(ricestraw)和甘蔗渣及其組合。

預處理

根據本發明，生物質在水解前進行化學、機械、生物學或其任何組合的預處理。此外，化學、機械或生物學處理可以與水解同時進行，例如與一種或多種纖維素分解酶的添加或其他酶活性同時，以釋放例如可發酵糖例如葡萄糖或麥芽糖。

預處理的目的是分離或釋放纖維素、半纖維素和木質素，並且因此改善水解和/或發酵的速率或效率。生物質可以在預處理過程中以約10-80之間的幹固體重量％、優選約20-70之間的幹固體重量％、尤其是約30-60之間的幹固體重量％例如在約幹固體50重量％左右的量存在。

根據本發明，預處理在相對低的溫度進行，優選在165℃-175℃之間，特別是從165℃、166℃、167℃、168℃、169℃、170℃、171℃、172℃、173℃或174℃一直到166℃、167℃、168℃、169℃、170℃、171℃、172℃、173℃、174℃或175℃。

在其中溫度通常是約180°的常規生物質預處理過程中，出現半纖維素組分的廣泛降解。從含木素纖維素材料中釋放的木聚糖降解為木糖，並且木糖可以進一步降解為化合物，其可以是酶促水解和/或發酵的抑制劑。木糖的降解產物包括但不限於糠醛、羥甲基糠醛(hmf)、甲醛、甲酸、乙醛、巴豆醛、乳酸、二羥基丙酮、甘油醛、丙酮醛、丙酮醇和羥乙醛。不受任何具體理論束縛，認為在用本發明相對低的溫度的預處理下，含木素纖維素材料的結構被打開，但木聚糖僅部分降解。因為較少的木聚糖被降解，所以抑制劑較少程度地產生，並且可以省略洗滌步驟。

化學預處理

術語「化學預處理」指促進纖維素、半纖維素或木質素的分離或釋放的任何化學預處理。合適的化學預處理方法的例子包括用例如稀酸、石灰、有機溶劑、二氧化硫或二氧化碳處理。進一步地，溼氧化和ph控制的水熱解也是考慮的化學預處理。

在一個優選實施方案中，化學預處理是酸處理，更優選地連續稀酸和/或弱酸處理，例如用硫酸或另一種有機酸和/或無機酸處理，所述酸例如乙酸、檸檬酸、酒石酸、琥珀酸、氯化氫或其混合物。還可以使用其他酸。弱酸處理意指處理ph處於約ph1-5的範圍中，優選約ph1-3。

在一個優選實施方案中，預處理是用0.1-2.5重量％酸、優選0.5-2.0重量％酸、優選0.8-1.5重量％酸的酸預處理。用於第二次預處理的酸可以是鹽酸、磷酸、硫酸、亞硫酸、碳酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、酒石酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、琥珀酸和/或其混合物；尤其是硫酸。酸可以與生物質和混合物接觸範圍為數分鐘到數秒的時期。在本發明的一個優選實施方案中，預處理進行1分鐘-60分鐘的時期。

根據本發明還考慮了其他化學預處理技術。還已顯示當木素纖維素結構被破壞時，酶促水解可以得到極大增強。臭氧、有機溶劑(organosolv)(使用在含水醇中的(al)2so4、fecl3、路易斯酸)、甘油、二噁烷、苯酚或乙二醇屬於已知的破壞纖維素結構且促進水解的溶劑(mosier等人，2005，bioresourcetechnology96：673-686)。

合適預處理方法的其他例子由下述描述：schell等人，2003，appl.biochemandbiotechn.第105-108卷，第69-85頁，和mosier等人，2005，bioresourcetechnology96：673-686，和美國申請公開號2002/0164730，將所述各篇參考文獻在此通過提述併入。

機械預處理

術語「機械預處理」指促進自生物質分離或釋放纖維素、半纖維素或木質素的任何機械或物理預處理。例如，機械預處理包括多個類型的研磨、照射、汽蒸/蒸汽爆炸、和水熱解(hydrothermolysis)。

機械預處理包括粉碎，即大小的機械減少。粉碎包括幹磨、溼磨和振動球磨。機械預處理可以涉及高壓和/或升高的溫度(蒸汽爆炸)。「高壓」意指在約300-600psi範圍中、優選400-500psi，例如約450psi的壓力。升高的溫度意指在從約165℃一直到175℃範圍中、優選約170℃的溫度。在一個優選實施方案中，本發明的預處理作為在170℃的溫度的蒸汽爆炸進行。在一個優選實施方案中，機械預處理是用蒸汽槍水解儀系統的分批工藝，其使用如上定義的壓力和溫度。sundshydrolyzer(可從sundsdefibratorab(瑞典)獲得)可以用於此。

生物學預處理

術語「生物學預處理」指任何促進自生物質分離或釋放纖維素、半纖維素或木質素的生物學預處理。生物學預處理技術可以涉及應用木質素溶解微生物。參見例如，hsu，t.-a.，1996，pre-treatmentofbiomass，於handbookonbioethanol：productionandutilization，wyman，c.e.，編輯，taylor&francis，washington，dc，179-212；ghosh，p.和singh，a.，1993，physicochemicalandbiologicaltreatmentsforenzymatic/microbialconversionoflignocellulosicbiomass，adv.appl.microbiol.39：295-333；mcmillan，j.d.，1994，pre-treatinglignocellulosicbiomass：areview，於enzymaticconversionofbiomassforfuelsproduction，himmel，m.e.，baker，j.o.和overend，r.p.，編輯，acssymposiumseries566，americanchemicalsociety，washington，dc，第15章；gong，c.s.，cao，n.j.，du，j.和tsao，g.t.，1999，ethanolproductionfromrenewableresources，於advancesinbiochemicalengineering/biotechnology，scheper，t.，編輯，springer-verlagberlinheidelberg，germany，65：207-241；olsson，l.和hahn-hagerdal，b.，1996，fermentationoflignocellulosichydrolyzatesforethanolproduction，enz.microb.tech.18：312-331；以及vallander，l.和eriksson，k.-e.l.，1990，productionofethanolfromlignocellulosicmaterials：stateoftheart，adv.biochem.eng./biotechnol.42：63-95。

水解

在水解過程中，將經預處理的生物質(優選以生物質漿料的形式)酶促水解且降解成可發酵糖或其他有用的化合物。如本文使用的，術語「生物質漿料」指經歷酶促水解的水性生物質材料。生物質漿料通過混合生物質，例如玉米秸稈、甘蔗渣等與水、緩衝液和其他預處理材料產生。生物質漿料可以在水解前進行預處理，或所述漿料可以由經預處理的生物質形成。

在水解過程中幹固體含量可以在約5-50重量％、優選約10-40重量％、優選約20-30重量％的範圍中。在一個優選實施方案中，水解可以作為分批補料工藝進行，其中將經預處理的生物質(即底物)逐步補料給例如含酶水解溶液。

根據本發明，水解和/或發酵使用纖維素分解酶和木聚糖酶進行。

在一個優選實施方案中，水解使用包含具有纖維素分解增強活性的一種或多種多肽的纖維素分解酶製備物進行。在一個優選實施方案中，具有纖維素分解增強活性的一種或多種多肽是家族gh61a來源的。合適和優選的纖維素分解酶製備物和具有纖維素分解增強活性的多肽的例子在下文進一步描述。

因為生物質可能含有除木質素、纖維素和半纖維素外的組成成分，所以水解和/或發酵可以在另外的酶活性的存在下進行，所述另外的酶活性選自蛋白酶、澱粉酶、酯酶、脂肪酶、纖維素酶、半纖維素酶、澱粉酶、蛋白酶、酯酶、內切葡聚糖酶、β-葡糖苷酶、纖維二糖水解酶、纖維二糖酶、木聚糖酶、木糖異構酶、α-澱粉酶、α-葡糖苷酶、葡糖澱粉酶及其混合物。

酶促水解優選在可以由本領域技術人員容易地確定的條件下在合適的含水環境中進行。在一個優選實施方案中，水解在用於所討論的一種或多種酶的合適的、優選最佳的條件下進行。

優選地，水解在25℃-70℃之間、優選在40℃-60℃之間、尤其是約50℃的溫度進行。水解優選在ph3-8範圍中的ph、優選ph4-6、尤其是約ph5進行。此外，水解一般進行12–96小時之間、優選16–72小時、更優選24-48小時之間。

合適的工藝時間、溫度和ph條件可以由本領域技術人員容易地確定。

發酵

通過能夠將糖例如葡萄糖、木糖、甘露糖和半乳糖直接或間接發酵成所需發酵產物的一種或多種發酵生物，可以發酵來自經預處理的和/或水解的生物質的可發酵糖。發酵條件取決於所需發酵產物和發酵生物，並且可以由本領域普通技術人員容易地確定。

尤其是在乙醇發酵的情況下，發酵可以進行1-72小時之間。在一個實施方案中，發酵在約20℃–40℃之間、優選25℃–40℃、更優選約30℃-約38℃、特別是約32℃的溫度進行。在一個實施方案中，ph是5以上。在另一個實施方案中，ph是約ph3-7、優選約ph4–6、尤其是4–5之間。

發酵可以在分批、分批補料或連續反應器進行。分批補料發酵可以是固定體積或可變體積分批補料。在一個實施方案中，採用分批補料發酵。分批補料發酵的體積和速率取決於例如發酵生物、可發酵糖的特性和濃度、和所需發酵產物。此類發酵的速率和體積可以由本領域普通技術人員容易地確定。

發酵生物

術語「發酵生物」指適合於產生所需發酵產物的任何生物，包括細菌和真菌生物。尤其合適的發酵生物能夠將糖例如葡萄糖直接或間接發酵，即轉化成所需發酵產物。發酵生物的例子包括真菌生物，尤其是酵母。優選的酵母包括酵母屬菌種(saccharomycesspp.)菌株，特別是釀酒酵母或葡萄汁酵母(saccharomycesuvarum)菌株；畢赤酵母屬(pichia)菌株，優選樹幹畢赤酵母(pichiastipitis)，例如樹幹畢赤酵母cbs5773；假絲酵母屬(candida)菌株，特別是產朊假絲酵母(candidautilis)、迪丹斯假絲酵母(candidadiddensii)或博伊丁假絲酵母(candidaboidinii)菌株。其他發酵生物包括發酵單胞菌屬(zymomonas)；漢遜酵母屬(hansenula)，特別是異常漢遜酵母(h.anomala)；克魯維酵母屬(klyveromyces)，特別是脆壁克魯維酵母(k.fragilis)；和裂殖酵母屬(schizosaccharomyces)，特別是粟酒裂殖酵母(s.pombe)菌株。

商購可得的酵母包括，例如，ethanolredtm酵母(可從fermentis/lesaffre，usa獲得)，falitm(可從fleischmann’syeast，usa獲得)，superstart和thermosacctm新鮮酵母(可從ethanoltechnology，wi，usa獲得)，biofermaft和xr(可從nabc-northamericanbioproductscorporation，ga，usa獲得)，gertstrand(可從gertstrandab，瑞典獲得)，和fermiol(可從dsmspecialties獲得)。

根據本發明，優選的發酵生物能夠將c5糖例如木糖轉化為所需發酵生物。

發酵產物

本發明可以用於產生任何發酵產物。優選的發酵產物包括醇(例如乙醇、甲醇、丁醇)；有機酸(例如檸檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸)；酮(例如丙酮)；胺基酸(例如穀氨酸)；氣體(例如h2和co2)；抗生素(例如青黴素和四環素)；酶；維生素(例如核黃素、b12、β-胡蘿蔔素)；和激素。

其他產物包括可消耗的醇工業產品，例如啤酒和葡萄酒；乳品工業產品，例如發酵乳製品；皮革工業產品和菸草工業產品。在一個優選實施方案中，發酵產物是醇，尤其是乙醇。根據本發明獲得的發酵產物例如乙醇可以優選用作燃料酒精/乙醇。然而，在乙醇的情況下，它還可以用作飲用乙醇。

ssf、hhf和shf

根據本發明，水解和發酵可以同時(shhf工藝)或連續(shf工藝)進行。

水解和發酵可以作為同時水解和發酵步驟、或同時糖化作用和發酵(ssf)進行。一般而言，這意指組合/同時水解和發酵在對於所討論的一種或多種發酵生物合適的、優選最佳的條件(例如溫度和/或ph)下進行。

水解步驟和發酵步驟可以作為混合(hybrid)水解和發酵(hhf)進行。hhf一般以分開的部分水解步驟開始且以同時水解和發酵步驟結束。分開的部分水解步驟是通常在對於所討論的一種或多種水解酶合適的、優選最佳的條件(例如在更高溫度)下進行的酶促纖維素糖化步驟。後續同時水解和發酵步驟通常在對於一種或多種發酵生物合適的條件下(通常在比分開的水解步驟更低的溫度)進行。

水解和發酵步驟還可以作為分開的水解和發酵進行，其中使水解在發酵起始前完成。這通常稱為「shf」。

回收

在發酵後，發酵產物可以任選以任何合適方式與發酵培養基分離。例如，培養基可以進行蒸餾以提取發酵產物，或發酵產物可以通過微濾或膜過濾技術從發酵培養基中提取。可替代地，發酵產物可以通過汽提(stripping)進行回收。回收方法是本領域眾所周知的。

組合物

本發明涉及包含纖維素分解酶和木聚糖酶的水解酶的組合物，其中所述木聚糖酶以總量水解酶蛋白質的至少10％的量存在。纖維素分解酶可以包含衍生自裡氏木黴(trichodermareesei)的纖維素酶系統。

木聚糖酶優選是gh10木聚糖酶。木聚糖酶可以以水解酶蛋白總量的至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少20％或甚至至少25％的量存在。

優選地，水解酶包含以水解酶蛋白總量的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％或甚至至少5％、例如至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％或甚至至少25％的量的β-葡糖苷酶。

組合物可以進一步包含家族61糖苷水解酶，且優選以水解酶蛋白總量的至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％或甚至至少25％的量存在。

組合物可以依照本領域已知的方法進行製備，並且可以以液體或幹組合物的形式。例如，多肽組合物可以以顆粒或微粒的形式。待包括在組合物中的多肽可以依照本領域已知的方法進行穩定。

下文給出本發明的組合物的優選用途的例子。本發明的多肽組合物的劑量和在其下使用組合物的其他條件可以基於本領域已知的方法進行測定。

用途

本發明還涉及用於降解或轉化纖維素材料的方法，包括：用本發明包含有效量的具有內切葡聚糖酶活性的多肽的組合物處理纖維素材料。在一個優選方面，該方法進一步包括回收降解或轉化的纖維素材料。

本發明的多肽和宿主細胞可以在單糖、二糖和多糖的產生中用作來自纖維素生物質的化學或發酵原料用於產生乙醇、塑料或其他產物或中間產物。包含具有內切葡聚糖酶活性的多肽的組合物可以以去除或不去除細胞的粗發酵液的形式或以半純化或純化的酶製備物的形式。可替代地，組合物可以包含本發明的宿主細胞作為在用生物質的發酵工藝中具有內切葡聚糖酶活性的多肽來源。宿主細胞還可以含有在生物質的加工中有用的上文提及的編碼其他蛋白質和酶的天然或異源基因。特別地，本發明的多肽和宿主細胞可以通過纖維素或半纖維素的部分或完全降解用於增加加工殘餘物(幹酒糟、來自釀造的酒糟、甘蔗蔗渣等)的價值。

酶

即使在本發明的方法或工藝的背景中未具體提及，但應當理解一種或多種酶以及其他化合物以有效量使用。可以使用一種或多種酶。

纖維素分解酶

如本文使用的，術語「纖維素分解酶」或術語「纖維素分解酶製備物」或術語「具有纖維素分解活性的酶」應理解為包含具有纖維二糖水解酶活性(ec3.2.1.91)，例如纖維二糖水解酶i和纖維二糖水解酶ii，以及內切葡聚糖酶活性(ec3.2.1.4)和β-葡糖苷酶活性(ec3.2.1.21)的酶。在一個優選實施方案中，纖維素分解酶可以包含真菌來源的酶製備物，例如木黴屬(trichoderma)菌株，優選裡氏木黴菌株；腐質黴屬(humicola)菌株，例如特異腐質黴(humicolainsolens)菌株；或金孢子屬(chrysosporium)菌株，優選chrysosporiumlucknowense菌株。

纖維素分解酶製備物可以包含可從novozymesa/s，丹麥或accelerasetm1000(來自genencorinc.，usa)獲得的商購可得的產物1.5l或celluzymetm。

纖維素分解酶可以以0.1-100fpu/克總固體(ts)、優選0.5-50fpu/克ts、尤其是1-20fpu/克ts的範圍投入。在另一個實施方案中，將至少0.1mg纖維素分解酶/克總固體(ts)、優選至少3mg纖維素分解酶/克ts、例如5–10mg一種或多種纖維素分解酶/克ts用於水解。

內切葡聚糖酶(eg)

一種或多種內切葡聚糖酶可以存在於水解過程中。術語「內切葡聚糖酶」意指內切-1,4-(1,3；1,4)-β-d-葡聚糖4-葡聚糖水解酶(ec編號3.2.1.4)，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如羧甲基纖維素和羥乙基纖維素)、地衣澱粉中的1,4-β-d-糖苷鍵、在混合的β-1,3葡聚糖例如穀類β-d-葡聚糖或木葡聚糖和含有纖維質組分的其他植物材料中的β-1,4鍵的內水解。根據ghose，1987，pureandappl.chem.59：257-268的程序，內切葡聚糖酶活性可以使用羧甲基纖維素(cmc)水解進行測定。

內切葡聚糖酶可以衍生自木黴屬菌株，優選裡氏木黴菌株；腐質黴屬菌株，例如特異腐質黴菌株；或金孢子屬菌株，優選chrysosporiumlucknowense菌株。

β-葡糖苷酶

一種或多種β-葡糖苷酶可以存在於水解過程中。術語「β-葡糖苷酶」意指β-d-葡糖苷葡糖水解酶(ec3.2.1.21)，其催化末端非還原β-d-葡萄糖殘基的水解，伴隨β-d-葡萄糖的釋放。為了本發明的目的，β-葡糖苷酶活性根據由venturi等人，2002，j.basicmicrobiol.42：55-66描述的基本程序進行測定，除如本文描述的採用不同條件外。β-葡糖苷酶活性的1個單位定義為由在100mm檸檬酸鈉、20中作為底物的4mm對硝基苯基-β-d-吡喃葡糖苷在50℃、ph5每分鐘產生的1.0微摩爾對硝基苯酚

β-葡糖苷酶可以是真菌來源的，例如木黴屬、麴黴屬(aspergillus)或青黴屬(penicillium)菌株。β-葡糖苷酶可以衍生自裡氏木黴，例如由bgl1基因編碼的β-葡糖苷酶(參見ep562003的圖1)。β-葡糖苷酶可以衍生自米麴黴(aspergillusoryzae)(根據wo2002/095014在米麴黴中重組產生的)、煙麴黴(aspergillusfumigatus)(根據wo2002/095014的實施例22在米麴黴中重組產生的)或黑麴黴(aspergillusniger)(1981，j.appl.第3卷，第157-163頁)。

β-葡糖苷酶可以衍生自巴西青黴(penicilliumbrasilianum)，例如在wo2009/111706中顯示為seqidno:2的β-葡糖苷酶。

纖維二糖水解酶(cbh)

一種或多種纖維二糖水解酶可以存在於水解過程中。術語「纖維二糖水解酶」意指1,4-β-d-葡聚糖纖維二糖水解酶(e.c.3.2.1.91)，其催化纖維素、纖維寡糖或任何含β-1,4-連接的葡萄糖的聚合物中1,4-β-d-葡糖苷鍵的水解，從鏈的還原或非還原末端釋放纖維二糖。

纖維二糖水解酶的例子在上文提及，包括來自裡氏木黴；特異腐質黴的cbhi和cbhii和來自土生梭孢殼(thielaviaterrestris)纖維二糖水解酶(cell6a)的cbhii。

纖維二糖水解酶活性可以根據由lever等人，1972，anal.biochem.47：273-279和tilbeurgh等人，1982，febsletters149：152-156；vantilbeurgh和claeyssens，1985，febsletters187：283-288描述的程序進行測定。lever等人的方法適合於評估玉米秸稈中纖維素的水解，並且vantilbeurgh等人的方法適合於測定對螢光二糖衍生物的纖維二糖水解酶活性。

家族61糖苷水解酶

家族61糖苷水解酶：根據henrissatb.，1991，aclassificationofglycosylhydrolasesbasedonamino-acidsequencesimilarities，biochem.j.280：309-316，以及henrissatb.和bairocha.，1996，updatingthesequence-basedclassificationofglycosylhydrolases，biochem.j.316：695-696以及www.cazy.org，術語「家族61糖苷水解酶」或「家族gh61」在本文中定義為屬於糖苷水解酶家族61的多肽。目前，henrissat將gh61家族列為未分類的，指出對於屬於這個家族的多肽未知的性質，例如機制、催化親核基團/鹼基、催化質子供體和3-d結構。在本發明的背景中，家族61糖苷水解酶具有「纖維素分解增強活性」。

術語「纖維素分解增強活性」在本文中定義為增強纖維素材料通過具有纖維素分解活性的蛋白質的水解的生物學活性。為了本發明的目的，通過在下述條件下測量來自纖維素材料通過纖維素酶蛋白的水解的還原糖的增加或纖維二糖和葡萄糖總共的增加來測定纖維素分解增強活性：在pcs中的1-50mg總蛋白質/g纖維素，其中總蛋白質包含在pcs中的80-99.5％w/w纖維素酶蛋白/g纖維素和0.5-20％w/w具有纖維素分解增強活性的蛋白質在50℃進行1-7天，與具有不含纖維素分解增強活性的相等總蛋白質載量的對照水解比較(在pcs中的1-50mg纖維素分解蛋白質/g纖維素)。在一個優選方面，將在纖維素酶蛋白質載量的3％總蛋白質重量米麴黴β-葡糖苷酶(根據wo2002/095014在米麴黴中重組產生的)或3％總蛋白質重量煙麴黴β-葡糖苷酶(根據wo2002/095014的實施例22在米麴黴中重組產生的)存在下的1.5l(novozymesa/s，bagsvaerd，丹麥)的混合物用作纖維素分解活性的來源。

半纖維素酶

半纖維素可以通過半纖維素酶和/或酸水解進行分解，以釋放其五和六碳糖組分。根據本發明，預處理的木素纖維素材料用一種或多種半纖維素酶包括至少一種木聚糖酶(ec3.2.1.8)進行處理。

用於在本發明中使用的木聚糖酶是內切-1,4-β-木聚糖酶，並且可以是糖苷水解酶家族10或11(gh10或gh11)。gh10或gh11在cantarel等人(2008)的nucl.acidsres.200937：d233-d238中和在www.cazy.org上定義。

木聚糖酶可以是任何來源的，包括哺乳動物、植物或動物來源；然而，優選木聚糖酶是微生物來源的。特別地，木聚糖酶可以是可衍生自絲狀真菌或酵母的那種。優選地，木聚糖酶衍生自絲狀真菌例如麴黴屬菌種(aspergillussp.)、芽孢桿菌屬菌種(bacillussp.)、腐質黴屬菌種(humicolasp.)、毀絲黴屬菌種(myceliophotorasp.)、poitrasiasp.、根毛黴屬菌種(rhizomucorsp.)或木黴屬。

優選的是木聚糖酶gh10木聚糖酶。合適的gh10木聚糖酶可以衍生自棘孢麴黴(aspergillusaculeatus)，例如作為木聚糖酶ii公開於wo1994/021785的seqidno:2中的酶。還優選的是與wo1994/021785的seqidno:2中和/或在本文中作為seqidno:1顯示的胺基酸序列具有至少50％同一性、至少60％同一性、至少70％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、或甚至至少99％同一性的木聚糖酶。

商業木聚糖酶的例子包括來自novozymesa/s，丹麥的shearzymetm和biofeedwheattm。

根據本發明，木聚糖酶以水解酶蛋白總量的至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％或甚至至少25％的量加入和/或存在於本發明的水解步驟中。

木聚糖酶以0.001-1.0g/kgds底物的量、優選以0.005-0.5g/kgds底物的量、且最優選以0.05-0.10g/kgds底物的量加入和/或存在於本發明的水解步驟中。

半纖維素酶必須以有效水解半纖維素的量加入，例如以約0.001-0.5重量％總固體(ts)、更優選地約0.05-0.5重量％ts的量。

木聚糖酶可以以0.001-1.0g/kgdm(乾物質)底物的量、優選以0.005-0.5g/kgdm底物的量、且最優選0.05-0.10g/kgdm底物加入。

其他優選的半纖維素酶包括阿拉伯呋喃糖苷酶、乙醯木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、葡糖醛酸糖苷酶、內切半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、內切或外切阿拉伯糖酶、外切半乳聚糖酶、及它們中兩種或更多種的混合物。優選地，用於在本發明中使用的半纖維素酶是外切作用的半纖維素酶，並且更優選地，半纖維素酶是這樣的外切作用的半纖維素酶，其具有在低於ph7、優選ph3-7的酸性條件下水解半纖維素的能力。適合於在本發明中使用的半纖維素酶的例子包括viscozymetm(可從novozymesa/s，丹麥獲得)。

木糖異構酶

木糖異構酶(d-木糖酮異構酶)(e.c.5.3.1.5.)是催化d-木糖至d-木酮糖的可逆異構化反應的酶。

木糖異構酶可以用於該方法或工藝中，並且可以是具有木糖異構酶活性的任何酶，並且可以衍生自任何來源，優選細菌或真菌來源，例如絲狀真菌或酵母。細菌木糖異構酶的例子包括屬於鏈黴菌屬(streptomyces)、遊動放線菌屬(actinoplanes)、芽孢桿菌屬和黃桿菌屬(flavobacterium)和棲熱袍菌屬(thermotoga)的那種，包括新阿波羅棲熱袍菌(t.neapolitana)(vieille等人，1995，appl.environ.microbiol.61(5)，1867-1875)和海棲熱袍菌(t.maritime)。真菌木糖異構酶的例子是擔子菌綱(basidiomycetes)的衍生菌種。

優選木糖異構酶衍生自酵母屬假絲酵母屬(candida)菌株，優選博伊丁假絲酵母(candidaboidinii)菌株，尤其是由例如vongsuvanlert等人，1988，agric.biol.chem.，52(7)：1817-1824公開的博伊丁假絲酵母木糖異構酶。木糖異構酶可以優選衍生自博伊丁假絲酵母菌株(kloeckera2201)，作為dsm70034和atcc48180保藏，公開於ogata等人，agric.biol.chem，第33卷，第1519-1520頁或vongsuvanlert等人，1988，agric.biol.chem，52(2)，第1519-1520頁中。

在一個實施方案中，木糖異構酶衍生自鏈黴菌屬菌株，例如衍生自鼠灰鏈黴菌(streptomycesmurinus)(美國專利號4,687,742)；黃微綠鏈黴菌(s.flavovirens)、白色鏈黴菌(s.albus)、不產色鏈黴菌(s.achromogenus)、s.echinatus、威德摩爾鏈黴菌(s.wedmorensis)菌株，都公開於美國專利號3,616,221中。其他木糖異構酶公開於美國專利號3,622,463、美國專利號4,351,903、美國專利號4,137,126、美國專利號3,625,828、hu專利號12,415、de專利2,417,642、jp專利號9,28,473和wo2004/044129中，其各自通過提述併入本文。木糖異構酶可以以固定化的或液體的形式。液體形式是優選的。商購可得的木糖異構酶的例子包括來自novozymesa/s，丹麥的sweetzymetmt。木糖異構酶以提供在0.01-100igiu/克總固體範圍中活性水平的量加入。

α-澱粉酶

可以使用一種或多種α-澱粉酶。優選的α-澱粉酶是微生物例如細菌或真菌來源的。最合適的α-澱粉酶基於工藝條件進行測定，但可以通過本領域技術人員容易地完成。

優選的α-澱粉酶可以是酸性α-澱粉酶，例如真菌酸性α-澱粉酶或細菌酸性α-澱粉酶。術語「酸性α-澱粉酶」意指以有效量加入的α-澱粉酶(e.c.3.2.1.1)具有在3–7、優選3.5–6或更優選4-5範圍中的ph下的最適活性。

根據本發明，酸性α-澱粉酶可以以0.1-10afau/gds、優選0.10-5afau/gds、尤其是0.3-2afau/gds的量加入。

包含α-澱粉酶的優選商業組合物包括mycolase(來自dsm)、bantm、termamyltmsc、fungamyltm、liquozymetmx和santmsuper、santmextral(novozymesa/s)和clarasetml-40,000、dex-lotm、spezymetmfred、spezymetmaa和spezymetmdeltaaa(genencorint.)，和以商品名sp288(可從novozymesa/s、丹麥獲得)銷售的酸性真菌α-澱粉酶。

蛋白酶

蛋白酶可以在水解、發酵或同時水解和發酵過程中加入。蛋白酶可以在發酵過程中加入，以反絮凝發酵生物尤其是酵母。蛋白酶可以是任何蛋白酶。在一個優選實施方案中，蛋白酶是微生物來源的，優選真菌或細菌來源的酸性蛋白酶。酸性真菌蛋白酶是優選的，但還可以使用其他蛋白酶。

合適的蛋白酶包括微生物蛋白酶，例如真菌和細菌蛋白酶。優選的蛋白酶是酸性蛋白酶，即，特徵在於在低於ph7的酸性條件下水解蛋白質的能力的蛋白酶。

考慮的酸性真菌蛋白酶包括衍生自麴黴菌屬、毛黴屬(mucor)、根黴菌屬(rhizopus)、假絲酵母屬、革蓋菌屬(coriolus)、內座殼屬(endothia)、蟲黴屬(enthomophtra)、耙齒菌屬(irpex)、青黴屬、小核菌屬(sclerotium)和球擬酵母屬(torulopsis)的真菌蛋白酶。尤其考慮的是衍生自黑麴黴(參見例如，koaze等人，1964，agr.biol.chem.japan，28，216)、佐氏麴黴(aspergillussaitoi)(參見例如，yoshida，1954，j.agr.chem.soc.japan，28，66)、泡盛麴黴(aspergillusawamori)(hayashida等人，1977，agric.biol.chem.，42(5)，927-933、棘孢麴黴(wo1995/02044)、或米麴黴的蛋白酶，例如pepa蛋白酶；和來自微小毛黴(mucorpusillus)或米赫毛黴(mucormiehei)的酸性蛋白酶。

還考慮的是中性或鹼性蛋白酶，例如衍生自芽孢桿菌屬菌株的蛋白酶。例如，考慮用於本發明的蛋白酶衍生自解澱粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)，並且具有在swissprot作為登記號p06832可獲得的序列。還考慮的是與在swissprot作為登記號p06832可獲得的胺基酸序列具有至少90％同一性的蛋白酶，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特別是至少99％同一性。

進一步考慮的是與在wo2003/048353中作為seqidno:1公開的金黃色嗜熱子囊菌(thermoascusaurantiacus)蛋白酶具有至少90％同一性，例如至少92％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或特別是至少99％同一性。

還考慮的是木瓜蛋白酶樣蛋白酶，例如在e.c.3.4.22.*(半胱氨酸蛋白酶)內的蛋白酶，例如ec3.4.22.2(木瓜蛋白酶)、ec3.4.22.6(木瓜凝乳蛋白酶)、ec3.4.22.7(蘿藦蛋白酶)、ec3.4.22.14(獼猴桃蛋白酶)、ec3.4.22.15(組織蛋白酶l)、ec3.4.22.25(甘氨醯內肽酶)和ec3.4.22.30(caricain)。

在一個實施方案中，蛋白酶可以是衍生自麴黴菌屬菌株例如米麴黴的蛋白酶製備物。在另一個實施方案中，蛋白酶可以衍生自根毛黴屬菌株，優選曼赫根毛黴(rhizomucormeihei)。在另一個相關實施方案中，蛋白酶可以是蛋白酶製備物，優選衍生自麴黴屬菌株例如米麴黴的蛋白水解製備物、和衍生自根毛黴屬菌株優選曼赫根毛黴的蛋白酶的混合物。

天冬氨酸蛋白酶例如在hand-bookofproteolyticenzymes，由a.j.barrett，n.d.rawlings和j.f.woessner編輯，aca-demicpress，sandiego，1998，第270章)中描述。天冬氨酸蛋白酶的合適例子包括例如公開於r.m.berka等人，gene，96，313(1990))；(r.m.berka等人，gene，125，195-198(1993))；和gomi等人，biosci.biotech.biochem.57，1095-1100(1993)中的那些，所述參考文獻通過提述併入本文。

商購可得的產品包括esperasetm、flavourzymetm、promixtm、novozymtmfm2.0l和novozymtm50006(可從novozymesa/s、丹麥獲得)以及來自genencorint.、inc.、usa的gc106tm和spezymetmfan。

蛋白酶可以以0.0001-1mg酶蛋白質/gds、優選0.001-0.1mg酶蛋白質/gds的量存在。可替代地，蛋白酶可以以0.0001-1lapu/gds、優選0.001-0.1lapu/gds和/或0.0001-1mau-rh/gds、優選0.001-0.1mau-rh/gds的量存在。

脂肪分解酶

脂肪分解酶是能夠水解羧酸酯鍵的酶，以釋放羧酸或羧酸鹽(ec3.1.1)。所述脂肪分解酶主要包含下述3個亞型：半乳糖脂酶(ec3.1.1.26)、磷脂酶(a1或a2，ec3.1.1.32或3.1.1.4)和三醯基甘油脂酶(ec3.1.1.3)，佔優勢地分別具有對於半乳糖脂、磷脂和甘油三酯的活性。活性可以通過任何合適方法進行測定，例如通過本領域已知的或本說明書中隨後描述的測定。

脂肪分解酶可以具有窄的特異性，對於3種底物之一具有活性而對於其他2種具有很少活性或無活性，或它可以具有更廣泛的特異性，對於一種底物具有佔優勢活性而對於其他2種底物具有較少活性。可以使用2種或更多種脂肪分解酶的組合。

脂肪分解酶可以是原核的，特別是細菌的，或真核的，例如來自真菌或動物來源。脂肪分解酶可以衍生自例如下述屬或種：嗜熱絲孢菌屬(thermomyces)，疏棉狀嗜熱絲孢菌(t.lanuginosus)(也稱為柔毛腐質黴(humicolalanuginosa))；腐質黴屬，特異腐質黴；鐮孢屬(fusarium)，尖鐮孢(f.oxysporum)、茄病鐮孢(f.solani)、異孢鐮孢(f.heterosporum)；麴黴屬，塔賓麴黴(a.tubigensis)、黑麴黴、米麴黴；根毛黴屬；假絲酵母屬，南極假絲酵母(c.antarctica)、皺褶假絲酵母(c.rugosa)，青黴屬，卡門柏青黴(p.camembertii)；根黴屬，米根黴(rhizopusoryzae)；犁頭黴屬(absidia)，網柄菌屬(dictyostelium)，毛黴屬，脈孢菌屬(neurospora)，根黴屬，少根根黴(r.arrhizus)、日本根黴(r.japonicus)，核盤菌屬(sclerotinia)，髮癬菌屬(trichophyton)，維氏核盤菌屬(whetzelinia)，芽孢桿菌屬，檸檬酸桿菌屬(citrobacter)，腸桿菌屬(enterobacter)，愛德華氏菌屬(edwardsiella)，歐文氏菌屬(erwinia)，埃希氏菌屬(escherichia)，大腸桿菌(e.coli)，克雷伯氏菌屬(klebsiella)，變形桿菌屬(proteus)，普羅菲登斯菌屬(providencia)，沙門氏菌屬(salmonella)，沙雷氏菌屬(serratia)，志賀氏菌屬(shigella)，鏈黴菌屬，耶爾森氏菌屬(yersinia)，假單胞菌屬(pseudomonas)、洋蔥假單胞菌(p.cepacia)。

本文描述且請求保護的本發明並不限於本文公開的具體實施方案的範圍中，因為這些實施方案預期作為本發明的幾個方面的舉例說明。任何等價實施方案以及一個或多個實施方案的組合預期在本發明的範圍內。本發明的多種修飾加上本文顯示且描述的那些根據前述說明書對於本領域技術人員將變得顯而易見的。此類修飾也預期屬於所附權利要求書的範圍。

本文引用了多個參考文獻，將其公開內容通過提述整體引入。本發明通過下述實施例進一步描述，所述實施例不應解釋為限制本發明的範圍。

材料與方法

同一性的測定

在2個胺基酸序列之間或在2個核苷酸序列之間的關聯性由參數「同一性」描述。

為了本發明的目的，使用needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，j.mol.biol.48：443-453)測定在2個胺基酸序列之間的序列同一性程度，如在emboss包(emboss：theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite，rice等人，2000，trendsgenet.16：276-277)的needle程序中所執行的，優選版本3.0.0或更新的版本。使用的可選參數是缺口開放罰分10、缺口延伸罰分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。標記為「最長同一性」(使用–nobrief選項獲得的)的needle的輸出用作同一性百分比，並且如下計算：

(相同殘基x100)/(比對長度–比對中的缺口總數)

為了本發明的目的，在2個脫氧核糖核苷酸序列之間的序列同一性程度使用needleman-wunsch算法(needleman和wunsch，1970，同上)進行測定，如emboss包(emboss：theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite，rice等人，2000，同上)中的needle程序所執行的，優選版本3.0.0或更新的版本。使用的任選參數是缺口開放罰分10、缺口延伸罰分0.5和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)取代矩陣。標記為「最長同一性」(使用–nobrief選項獲得的)的needle的輸出用作同一性百分比，並且如下計算：

(相同脫氧核糖核苷酸x100)/(比對長度–比對中的缺口總數)

酶

包含衍生自裡氏木黴的纖維素分解酶複合物，在wo2005074656中作為seqidno：2的胺基酸23–250顯示的具有纖維素分解增強活性(gh61a)的金黃色嗜熱子囊菌多肽，和在wo05047499中作為seqidno：2的胺基酸1-863顯示的煙麴黴β-葡糖苷酶的纖維素酶製備物c。

包含在wo9421785的seqidno:2中作為xylii和在本文中作為seqidno:1公開的棘孢麴黴木聚糖酶的製備物。

包含在wo2005074656中作為seqidno：2的胺基酸23–250顯示的具有纖維素分解增強活性(gh61a)的金黃色嗜熱子囊菌多肽的製備物。

包含在wo2009/111706作為seqidno：2顯示的巴西青黴β-葡糖苷酶的製備物。

實施例

實施例1

預處理：將玉米秸稈在1.13wt.％h2so4溶液中在環境溫度浸泡4小時。對玉米秸稈實施分別在170℃和180℃的蒸汽爆炸5.5分鐘。分析經預處理的玉米秸稈(pcs)的組成，並且結果顯示於表1中。

對2批pcs測試了酶組合物1-12(表2)。在具有12.6％起始ts、20g總重量的系統中評價了所述pcs的水解。酶劑量是5mg酶蛋白質/g纖維素。水解時間是72小時，伴隨在50℃和ph5.0的130rpm。通過hplc分析水解產物中的葡萄糖含量。纖維素轉化按照從pcs中的總葡萄糖潛能(potential)中產生的葡萄糖的百分比計算。所有處理以3次重複進行。結果顯示於圖1中。

用高木聚糖酶劑量處理顯示出對於在低溫預處理的生物質的改善的水解。未見到高木聚糖酶劑量對於在高溫預處理的生物質的效應。

序列表

中國石油化工股份有限公司

中糧集團有限公司

諾維信公司

用於自含木素纖維素材料產生發酵產物的方法

11649-wo-pct

1

patentinversion3.5

1

406

prt

棘孢麴黴(aspergillusaculeatus)

1

metvalglyleuleuserilethralaalaleualaalathrvalleu

151015

proasnilevalseralavalglyleuaspglnalaalavalalalys

202530

glyleuglntyrpheglythralathraspasnprogluleuthrasp

354045

ileprotyrvalthrglnleuasnasnthralaasppheglyglnile

505560

thrproglyasnsermetlystrpaspalathrgluproserglngly

65707580

thrphethrphethrlysglyaspvalilealaaspleualaglugly

859095

asnglyglntyrleuargcyshisthrleuvaltrptyrasnglnleu

100105110

prosertrpvalthrserglythrtrpthrasnalathrleuthrala

115120125

alaleulysasnhisilethrasnvalvalserhistyrlysglylys

130135140

cysleuhistrpaspvalvalasnglualaleuasnaspaspglythr

145150155160

tyrargthrasnilephetyrthrthrileglyglualatyrilepro

165170175

ilealaphealaalaalaalaalaalaaspproaspalalysleuphe

180185190

tyrasnasptyrasnleuglutyrglyglyalalysalaalaserala

195200205

argalailevalglnleuvallysasnalaglyalalysileaspgly

210215220

valglyleuglnalahispheservalglythrvalproserthrser

225230235240

serleuvalservalleuglnserphethralaleuglyvalgluval

245250255

alatyrthrglualaaspvalargileleuleuprothrthralathr

260265270

thrleualaglnglnserserasppheglnalaleuvalglnsercys

275280285

valglnthrthrglycysvalglyphethriletrpasptrpthrasp

290295300

lystyrsertrpvalproserthrpheserglytyrglyalaalaleu

305310315320

protrpaspgluasnleuvallyslysproalatyrasnglyleuleu

325330335

alaglymetglyvalthrvalthrthrthrthrthrthrthrthrala

340345350

thralathrglylysthrthrthrthrthrthrglyalathrserthr

355360365

glythrthralaalahistrpglyglncysglyglyleuasntrpser

370375380

glyprothralacysalathrglytyrthrcysthrtyrvalasnasp

385390395400

tyrtyrserglncysleu

405