具有削弱的3′-5′核酸外切酶活性的熱穩定性的或熱激活性的dna聚合酶分子的製作方法

2023-06-10 20:23:56

專利名稱：具有削弱的3′-5′核酸外切酶活性的熱穩定性的或熱激活性的dna聚合酶分子的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有削弱的3』-5』核酸外切酶(「校正」)活性的熱穩定性的或熱激活性的DNA聚合酶，它們的合成方法，它們的應用方法，和包含它們的試劑盒。其是在許多重組DNA技術，特別是通過聚合酶鏈式反應(PCR)的核酸擴增中應用的酶。
背景技術：
DNA聚合酶以從5』到3』的方向用互補模板DNA鏈和引物從三磷酸脫氧核苷(核苷酸)在延長鏈的3』-羥基自由端順序地增加核苷酸而合成DNA分子。模板鏈通過Watson-Crick鹼基對確定核苷酸增加的順序。在細胞中，在DNA修補合成和複製中涉及DNA聚合酶。參見，例如Komberg等.，1992，DNA合成，W.H.Freeman，紐約；Alberts等，1994，細胞分子生物學，第三版，Garland出版社，紐約。
許多分子克隆技術和方案都包括由DNA聚合酶在體外反應催化而合成DNA。例如，DNA聚合酶被用於DNA標記和DNA測序反應，使用35S-，32P-，33P-或螢光標記核苷酸。聚合酶鏈式反應(PCR)技術是一種最通用的廣泛使用的DNA合成技術，由美國專利No.4,683,202；4,683,195；4,800,159；和14,965,188公開，PCR策略，1995 Innis等(編著)，學院出版社，中有所討論，它們全文在此引作參考。
最有特點的DNA聚合酶是大腸桿菌(Escherichia coli)DNA聚合酶I(Eco PolI)。Eco Pol I和一些與其同源的DNA聚合酶具有三種酶的功能i) 5』-3』核酸外切酶活性，ii)3』-5』核酸外切酶活性，iii)DNA合成活性。後兩種功能的克列諾片段(EcoPolIK)位於蛋白的羧基末端。可以用枯草桿菌蛋白酶處理EcoPolI的酶製劑，產生缺少5』-3』核酸外切酶活性的EcoPol IK。參見Brown等1982，生物化學雜誌(JBiol.Chem.)，2571965-72；Joyce等，1982，生物化學雜誌，2571958-64；Joyce等，1983，美國國家科學院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)801830-34；Klenow等，1970，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 65168-75；Komberg，1974；Setlow，P.等，1972，生物化學雜誌，247224-31；Setlow等，1972，生物化學雜誌，247232-40；Steitz等，1987，蛋白質工程，第20章，pp.227-35，Oxender等(編著).Alan R.Liss，紐約。
Eco Pol I K的晶體結構分析顯示為其肽鏈被摺疊成完全不同的兩個結構域，較小的區域有200個胺基酸殘基，是3』-5』核酸外切酶區域，另一個區域有400個胺基酸殘基，是DNA合成區域。參見Ollis等，1985，自然雜誌(Nature)313762-66。3』-5』核酸外切酶活性位點和DNA合成的活性位點大約由30埃分開。參考上述文獻。DNA合成活性位點與包含單鏈5』延申端的雙鏈DNA和三磷酸脫氧核苷(dNTP)連接，而3』-5』核酸外切酶活性位點與單鏈DNA和單磷酸脫氧核苷(dNMP)連接。參見上述文獻。由Bemat等預測大量DNA聚合酶中存在保守的3』-5』核酸外切酶活性位點，1989，細胞(Cell)59219-28；Blanco等，1992，基因(cell)112139-44；Reha-Krantz，1992，基因(Gene)112133-37。
Eco Pol I的DNA合成區域被克隆，表達，並分別表徵3』-5』和5』-3』核酸外切酶區域。如上述討論一樣，DNA合成區域包括大約400個胺基酸。在DNA合成區域聚合酶活性比Eco Pol I K中的小50倍。參見Derbyshire等，1993，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，215439-48。
來自各種生物體的熱穩定性的或熱激活性DNA聚合酶已經在文獻中被廣泛公開了。詳細的例子包括來自真菌Thermus的不同種的DNA聚合酶，參見美國專利No.5,466,591，特別是在美國專利No.4,889,818，5,352,600和5,079,352中描述的來自水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq DNA聚合酶)，來自真菌Thermatoga maritima(Tma DNA聚合酶)的DNA聚合酶在美國專利No.5,374,553和5,420,029中公開。
嗜溫的大腸桿菌和嗜熱的T.maritima都是真菌。如大腸桿菌的DNA聚合酶I一樣，Tma DNA聚合酶具有5』-3』的核酸外切酶活性和3』-5』的核酸外切酶活性。相反，來自Thermus的DNA聚合酶也是嗜熱的真菌，但僅具有5』-3』核酸外切酶活性。熱穩定和熱活性DNA聚合酶和它們的相關活性的綜述參見Abramson，1995，PCR策略(PCR Strategies)，Innis等(編著)，學院出版社，Inc。缺少3』-5』核酸外切酶活性的大量的原始的突變體形式，真菌熱穩定或熱活性DNA聚合酶在美國專利No.6,015,668，5,39,301，5,988,614，5,882,904，5,489,523中公開。
雖然Eco Pol I和Tma DNA聚合酶具有同樣的三種酶的活性，和相同的普通域的結構，但它們是非常不同的酶。例如，Eco Pol I和Tma DNA聚合酶具有完全不同的胺基酸序列。特別地，即使當間隙插入到它們的序列中使它們的排列最優化，這兩種蛋白的3』-5』核酸外切酶功能域也僅有大約33％相同。而且，這兩種酶表現出不同的特異活性和對化學變性條件的抗性不同。從它們的自然體內環境分離的純化的酶中觀察到這些區別，它們一定是酶本身的胺基酸序列的不同而導致的。
初生態DNA鏈由3』-5』核酸外切酶活性「校正」合成，首先從中除去模板鏈中錯配的核苷酸，從而增加了DNA合成的重現精度。然而，強3』-5』核酸外切酶活性的存在對體外的聚合反應特別是PCR是存在問題的，其中3』-5』核酸外切酶活性的存在降低擴增的效率。參見Bames，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA912216-20。
為了避免3』-5』核酸外切酶活性的有害效應，有人曾嘗試應用缺少3』-5』核酸外切酶活性的DNA聚合酶。Taq聚合酶天然缺少這種活性。其它的DNA聚合酶已經通過基因工程將其消除。參見，如，美國專利No.6,015,668，5,939,301，5,988,614，5,882,904和5,489,523。在這些申請中的酶工作的高複製重現精度是不必須的，例如，在PCR中用於擴增DNA測序反應的模板，大小分析，限制性酶分析和以探針為基礎的分析。
然而，其它聚合反應，如，擴增用於克隆的一個DNA片段的PCR，需要較高的保真度水平。在保留3』-5』核酸外切酶活性的優點時又降低與其相關的問題的努力中，使用兩種不同的DNA聚合酶的混合物。在混合物中的一種聚合酶具有野生型水平的3』-5』核酸外切酶活性。另一種缺少此活性。這兩種聚合酶的比率可以調整為產生所期望的3』-5』核酸外切酶與DNA聚合酶活性的比率。參見Cheng等，1994，Proc.NatlAcad.Sci.USA915695-99；Barnes，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA912216-20；Cheng，1995，「更長的PCR擴增」，PCR策略(Innis等，編著)，學院出版社，San Diego 313-24；Cheng等，1995，適用的PCR方法(PCRMeth.Applic.)4294-98；美國專利No.5,512,462，5,436,149和5,556,772和PCT專利申請公開WO94/26766。這個聯合技術可以用來完成3』-5』核酸外切酶活性的期望量的要求，但價格昂貴，必須一步一步地優化組合，從而消耗時間。其要求DNA聚合酶活性和每個酶製劑的3』-5』核酸外切酶活性被仔細地校準，這樣才能在正確的劑量下混合這兩種聚合酶以產生3』-5』核酸外切酶活性與DNA聚合酶活性的期望比率。故，本領域需要一種快速和經濟的方法來產生具有預期的3』-5』核酸外切酶活性水平的，並具有期望的3』-5』核酸外切酶與DNA聚合酶活性的比率的DNA聚合酶試劑。

發明內容
本發明描述了令人驚訝地產生了一種削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性的DNA聚合酶。這種削弱了3』-5』核酸外切酶活性的酶可以廣泛應用於聚合酶反應。
一方面，本發明提供了一種表現為削弱了3』-5』核酸外切酶活性的分離的熱穩定性或熱激活性的DNA聚合酶。在一個實施方案中，其熱穩定性或熱激活性聚合酶是一種修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在另一個實施方案中，這種修飾的熱穩定性DNA聚合酶是一種突變的熱穩定性DNA聚合酶。在另一個實施方案中，這種修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶所具有的3』-5』核酸外切酶活性是相應的沒有修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的活性的大約0.1％到大約65％之間，其中核酸外切酶的活性是由實施例3中的所述的標準試驗測定的。在另一個實施方案中，修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有的3』-5』核酸外切酶活性是相應的沒有修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的活性的大約1％到大約30％之間。在另一實施方案中，修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有的3』-5』核酸外切酶活性是相應的沒有修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的活性的大約3％到大約20％之間。在另一實施方案中，修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有的3』-5』核酸外切酶活性是相應的沒有修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的活性的大約3％到大約10％之間。在另一實施方案中，修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有的3』-5』核酸外切酶活性是相應的沒有修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的活性的大約3％到大約5％之間。
在另一方面，本發明提供了一種分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其具有6.5個或更少的單位，但大於0，單位(U)/pmol3』-5』核酸外切酶活性，其活性用下述實施例3中的標準試驗測定。在一個實施方案中，修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有3』-5』核酸外切酶活性為大約0.4到3.0U/pmol之間。在另一實施方案中，修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有3』-5』核酸外切酶活性為大約0.4到1.6U/pmol之間。
在另一方面，本發明提供了一種分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有5』-3』DNA聚合酶活性和3』-5』核酸外切酶活性，其聚合酶活性和核酸外切酶活性的比率大於1。在一個實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的5』-3』DNA聚合酶活性與3』-5』核酸外切酶活性的比率大約為3.0到50之間。在另一實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的5』-3』DNA聚合酶活性與3』-5』核酸外切酶活性的比率大約為6.0到25.0之間。
在另一方面，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性。在一個實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶是一種修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在另一實施方案中，這種修飾的熱穩定性DNA聚合酶是一種熱穩定性型DNA聚合酶的突變體。
在另一方面，本發明提供一種修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中無論是單鏈DNA還是雙鏈DNA3』-5』核酸外切酶活性均被優先削弱。在一個實施方案中，修飾的熱穩定性型DNA聚合酶是一種熱穩定性型DNA聚合酶的突變體。
在另一方面，具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶是從嗜熱真菌Thermotoga中分離出來的。然而在另一方面，其嗜熱真菌是Thermotoga maritima(Tma)。在另一方面，嗜熱真菌是Thermotoganeapolitana。
一方面，具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶是從嗜熱真菌Thermosipho中分離出來的。在一個實施方案中，嗜熱真菌是Thermosipho africanus。
另一方面，具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶是從嗜熱真菌Aquifex中分離出來的。在一個實施方案中，其嗜熱真菌是Aquifex pyrophilus。在另一實施方案中，其嗜熱真菌是Aquifex aeolieus。
另一方面，具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶是從原始嗜熱菌Thermococcus中分離出來的。在一個實施方案中，所述原始嗜熱菌是Thermococcus barossi。在另一實施方案中，所述原始嗜熱菌是Thermococcus litoralis。在另一實施方案中，所述原始嗜熱菌是Thermococcusgorgonarius(「Tgo」)。
另一方面，具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶是從原始嗜熱菌Pyrococcus中分離出來的。在一個實施方案中，所述原始嗜熱菌是Pyrococcus furiosus。在另一實施方案中，所述原始嗜熱菌是Pyrococcus sp.GB-D。在另一實施方案中，所述原始嗜熱菌是Pyrococcus woesei。在另一實施方案中，所述原始嗜熱菌是Pyrococcus abyssi。
另一方面，具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶是從原始嗜熱菌Pyrodictium中分離出來的。在一個實施方案中，所述原始嗜熱菌是Pyrodictium abyssi。在另一實施方案中，所述原始嗜熱菌是Pyrodictium occultum。
另一方面，本方面提供一種分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其包括3』-5』核酸外切酶功能域並具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性大約為6.5或更少，但大於0，U/pmol，由實施例3所述的標準試驗測定而得，其中所述3』-5』核酸外切酶功能域包括基元序列a)一個通式為DX1EX2X3SX4的EXO I基元，其中D為天冬氨酸殘基，X1為任何胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為任何胺基酸殘基，X3為任何胺基酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為任何胺基酸殘基，或b)一個通式為X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO1)的EXO II基元，其中X5為任何胺基酸殘基，X6為任何胺基酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為任何胺基酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，
X10為任何胺基酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基，或c)一個通式為DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23(SEQ ID NO2)的EXO IIa基元，其中D為天冬氨酸殘基，X15為脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸或蘇氨酸殘基，X16為亮氨酸或甲硫氨酸殘基，X17為亮氨酸或異亮氨酸殘基，X18為任何胺基酸殘基，X19為丙氨酸或絲氨酸殘基，Y為酪氨酸殘基，X20為亮氨酸，異亮氨酸或纈氨酸殘基，X21為亮氨酸或色氨酸殘基，X22為天冬氨酸殘基，天冬醯胺殘基，穀氨酸殘基或穀氨醯胺殘基，和X23為脯氨酸或絲氨酸殘基，或d)一個通式為X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36(SEQ ID NO3)的EXO III基元，其中X24為脯氨酸或丙氨酸殘基，X25為任何胺基酸殘基，X26為穀氨酸，天冬氨酸或脯氨酸殘基，X27為賴氨酸，精氨酸或穀氨酸殘基，X28為任何胺基酸殘基，X29為任何胺基酸殘基，X30為穀氨酸，精氨酸或天冬醯胺殘基，X31為任何胺基酸殘基，X32為絲氨酸，丙氨酸或半胱氨酸殘基，X33為任何胺基酸殘基，
X34為穀氨酸或蘇氨酸殘基，X35為任何胺基酸殘基，和X36為丙氨酸殘基。
另一方面，本發明提供一種分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其包括3』-5』核酸外切酶功能域並且具有5』-3』聚合酶活性和削弱的3』-5』核酸外切酶活性，其中用實施例3中的聚合酶試驗測定的5』-3』聚合酶活性的U/pmol，與由實施例3所述的標準試驗測定的3』-5』核酸外切酶活性的U/pmol之比，大約在1到100之間，所述的3』-5』核酸外切酶的功能域包括序列基元a)一個通式為DX1EX2X3SX4的EXOI基元，其中D為天冬氨酸殘基，X1為任何胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為任何胺基酸殘基，X3為任何胺基酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為任何胺基酸殘基，或b)一個通式為X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO1)的EXOII基元，其中X5為任何胺基酸殘基，X6為任何胺基酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為任何胺基酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為任何胺基酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基，或c)一個通式為DX15X17X18X19YX20X21X22X23(SEQ ID NO2)的EXO IIa基元，其中
D為天冬氨酸殘基，X15為脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸或蘇氨酸殘基，X16為亮氨酸或甲硫氨酸殘基，X17為亮氨酸或異亮氨酸殘基，X18為任何胺基酸殘基，X19為丙氨酸或絲氨酸殘基，Y為酪氨酸殘基，X20為亮氨酸，異亮氨酸或纈氨酸殘基，X21為亮氨酸或色氨酸殘基，X22為天冬氨酸殘基，天冬醯胺殘基，穀氨酸殘基或穀氨醯胺殘基，和X23為脯氨酸或絲氨酸殘基，或d)一個通式為X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36(SEQ ID NO3)的EXO III基元，其中X24為脯氨酸或丙氨酸殘基，X25為任何胺基酸殘基，X26為穀氨酸，天冬氨酸或脯氨酸殘基，X27為賴氨酸，精氨酸或穀氨酸殘基，X28為任何胺基酸殘基，X29為任何胺基酸殘基，X30為穀氨酸，精氨酸或天冬醯胺殘基，X31為任何胺基酸殘基，X32為絲氨酸，丙氨酸或半胱氨酸殘基，X33為任何胺基酸殘基，X34為穀氨酸或蘇氨酸殘基，X35為任何胺基酸殘基，和X36為丙氨酸殘基。
另一方面，本發明提供了一種修飾的熱穩定性和熱激活性DNA聚合酶，其中所述修飾的聚合酶包括3』-5』核酸外切酶功能域，熱穩定性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性是修飾前的大約0.1％到65％，所述的3』-5』核酸外切酶功能域包括序列基元
a)一個通式為DX1EX2X3SX4的EXOI基元，其中D為天冬氨酸殘基，X1為任何胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為任何胺基酸殘基，X3為任何胺基酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為任何胺基酸殘基，或b)一個通式為X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(SEQ ID NO1)的EXO II基元，其中X5為任何胺基酸殘基，X6為任何胺基酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為任何胺基酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為任何胺基酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基，或c)一個通式為DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23(SEQ ID NO2)的EXO IIa基元，其中D為天冬氨酸殘基，X15為脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸或蘇氨酸殘基，X16為亮氨酸或甲硫氨酸殘基，X17為亮氨酸或異亮氨酸殘基，X18為任何胺基酸殘基，X19為丙氨酸或絲氨酸殘基，Y為酪氨酸殘基，X20為亮氨酸，異亮氨酸或纈氨酸殘基，
X21為亮氨酸或色氨酸殘基，X22為天冬氨酸殘基，天冬醯胺殘基，穀氨酸殘基或穀氨醯胺殘基，和X23為脯氨酸或絲氨酸殘基，或d)一個通式為X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36(SEQ ID NO3)的EXO III基元，其中X24為脯氨酸或丙氨酸殘基，X25為任何胺基酸殘基，X26為穀氨酸，天冬氨酸或脯氨酸殘基，X27為賴氨酸，精氨酸或穀氨酸殘基，X28為任何胺基酸殘基，X29為任何胺基酸殘基，X30為穀氨酸，精氨酸或天冬醯胺殘基，X31為任何胺基酸殘基，X32為絲氨酸，丙氨酸或半胱氨酸殘基，X33為任何胺基酸殘基，X34為穀氨酸或蘇氨酸殘基，X35為任何胺基酸殘基，和X36為丙氨酸殘基。
一方面，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括符合上述通式的特定胺基酸殘基任意重組的EXO I，EXO II，EXO IIa，或EXO III功能域。
另一方面，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括在氨基末端到羧基末端的順序為至少兩組，三組或一組所述的序列基元(a)，(b)，(c)和(d)。
另一方面，本發明修飾的熱穩定性和熱激活性DNA聚合酶包括3』-5』核酸外切酶功能域並且具有用下面的實施例3的標準試驗測定的大約6.5或更少，但大於0，U/pmol的削弱的3』-5』核酸外切酶活性，其中所述的3』-5』核酸外切酶功能域與

圖1A強調的3』-5』核酸外切酶功能域(SEQ ID NO85)序列同一性大於約80％但小於100％。
另一方面，本發明修飾的熱穩定性和熱激活性DNA聚合酶包括3』-5』核酸外切酶功能域並且具有用下面的實施例3的標準試驗測定的大約6.5或更少，但大於0 U/pmol的削弱的3』-5』核酸外切酶活性，其中所述的修飾的DNA聚合酶與圖1A(SEQ ID NO85)的序列的序列同一性大於約80％但小於100％。
另一方面，本發明修飾的熱穩定性和熱激活性DNA聚合酶包括3』-5』核酸外切酶功能域並且具有用下面的實施例3的標準試驗測定的大約6.5或更少，但大於0，U/pmol的削弱的3』-5』核酸外切酶活性，其中所述的3』-5』核酸外切酶功能域與未被修飾的The DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶的功能域的序列同一性大於約80％但小於100％。在一個實施方案中，未被修飾的Tne DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶的功能域包括圖2所顯示的序列(SEQ ID NO88)。
另一方面，本發明修飾的熱穩定性和熱激活性DNA聚合酶包括3』-5』核酸外切酶功能域並且具有下面實施例3的標準試驗測定的大約6.5或更少，但大於0，U/pmol的削弱的3』-5』核酸外切酶活性，其中所述的DNA聚合酶與未被修飾的Tne DNA聚合酶的胺基酸序列的序列同一性大於約80％但小於100％。未被修飾的Tne DNA聚合酶的胺基酸序列可以，例如，包括美國專利No.5,948,614提供的Tne聚合酶的胺基酸序列。
另一方面，本發明修飾的熱穩定性和熱激活性DNA聚合酶包括3』-5』核酸外切酶功能域並且具有用下面的實施例3的標準試驗測定的大約6.5或更少，但大於0，U/pmol的削弱的3』-5』核酸外切酶活性，其中所述的3』-5』核酸外切酶功能域與未被修飾的Taf DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域的序列同一性大於約80％但小於100％。在一個實施方案中，未被修飾的Taf DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶的功能域包括圖3所顯示的序列(SEQ ID NO89)。
另一方面，本發明修飾的熱穩定性和熱激活性DNA聚合酶包括3』-5』核酸外切酶功能域並且具有用下面的實施例3的標準試驗測定的大約6.5或更少，但大於0，U/pmol的削弱的3』-5』核酸外切酶活性，其中所述的DNA聚合酶與未被修飾的Taf DNA聚合酶的胺基酸序列的序列同一性大於約80％但小於100％。未被修飾的Taf DNA聚合酶的胺基酸序列可以，例如，包括美國專利No.5,968,799提供的TafDNA聚合酶的胺基酸序列。
另一方面，本發明熱穩定性和熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO I基元，其中DX1EX2X3SX4，其中
D為天冬氨酸殘基，X1為任何胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為蘇氨酸殘基，X3為任何胺基酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為任何胺基酸殘基(SEQ ID NO4)；或其中D為天冬氨酸殘基，X1為任何胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為蘇氨酸殘基，X3為蘇氨酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為亮氨酸殘基(SEQ ID NO5)；或其中D為天冬氨酸殘基，X1為任何胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為蘇氨酸殘基，X3為任何胺基酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為亮氨酸殘基(SEQ ID NO6)；或其中D為天冬氨酸殘基，X1為任何胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為任何胺基酸殘基，X3為任何胺基酸殘基，S為絲氨酸殘基，和
X4為亮氨酸殘基(SEQ ID NO7)；或其中D為天冬氨酸殘基，X1為任何胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為任何胺基酸殘基，X3為蘇氨酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為亮氨酸殘基(SEQ ID NO8)；或其中D為天冬氨酸殘基，X1為亮氨酸殘基，E為穀氨酸殘基，X2為蘇氨酸殘基，X3為絲氨酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為亮氨酸殘基(SEQ ID NO9)；另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X5為任何胺基酸殘基，X6為任何胺基酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為任何胺基酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO10)；或其中
X5為無電荷的極性殘基，X6為任何胺基酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為任何胺基酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO11)；或其中X5為無電荷的極性殘基，X6為無電荷的極性殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為任何胺基酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO12)；或其中X5為無電荷的極性殘基，X6為無電荷的極性殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為酸性殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，
X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ D NO13)；或其中X5為無電荷的極性殘基，X6為無電荷的極性殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為酸性殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO14)；或其中X5為穀氨醯胺殘基，X6為天冬醯胺殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為天冬氨酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO15)；或其中X5為穀氨醯胺殘基，X6為天冬醯胺殘基，X7為亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸殘基，
X10為天冬氨酸殘基，X11為酪氨酸殘基，X12為賴氨酸殘基，X13為纈氨酸殘基和，X14為亮氨酸殘基(SEQ ID NO16)；另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X5是一種無極性的殘基，如丙氨酸殘基。在一個實施方案中，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X8是賴氨酸殘基。在另一實施方案中，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X5是一個無極性的殘基並且X8是賴氨酸殘基。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X5為無極性的殘基，X6為不帶電荷的極性殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為酸性殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO17)；或其中X5為丙氨酸殘基，X6為不帶電荷的極性殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為酸性殘基，
X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO18)；或其中X5為丙氨酸殘基，X6為天冬醯胺殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為天冬氨酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO19)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性的DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X5為丙氨酸殘基，X6為天冬醯胺殘基，X7為亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸殘基，X10為天冬氨酸殘基，X11為酪氨酸殘基，X12為賴氨酸殘基，X13為纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸殘基(SEQ ID NO20)。
在一個實施方案中，這樣一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包括由Q384A突變株修飾的圖4A所描述的3』-5』核酸外切酶功能域的胺基酸序列(SEQID NO96)。在另一實施方案中，這樣一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包括由Q384A突變株修飾的圖4A所描述的胺基酸序列(SEQ ID NO97)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X6是非極性的胺基酸殘基。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X5為無電荷的極性殘基，X6為非極性殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為酸性殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO21)；或其中X5為穀氨醯胺殘基，X6為丙氨酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為天冬氨酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO22)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X5為穀氨醯胺殘基，X6為丙氨酸殘基，
X7為亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸殘基，X10為天冬氨酸殘基，X11為酪氨酸殘基，X12為賴氨酸殘基，X13為纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸殘基(SEQ ID NO23)。
在一個實施方案中，這樣一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包括由N385A突變株修飾的圖4A所描述的3』-5』核酸外切酶功能域的胺基酸序列(SEQID NO98)。在另一實施方案中，這樣一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包括由N385A突變株修飾的圖4A所描述的胺基酸序列(SEQ ID NO99)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X10是穀氨酸殘基。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOII基元，其中X5為無電荷的極性殘基，X6為無電荷的極性殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為穀氨酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO24)；或其中X5為穀氨醯胺殘基，X6為天冬醯胺殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，
X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為穀氨酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO25)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOII基元，其中X5為穀氨醯胺殘基，X6為天冬醯胺殘基，X7為亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸殘基，X10為穀氨酸殘基，X11為酪氨酸殘基，X12為賴氨酸殘基，X13為纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸殘基(SEQ ID NO26)。
在一個實施方案中，這樣一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包括由D389E突變株修飾的圖4A所描述的3』-5』核酸外切酶功能域的胺基酸序列(SEQ IDNO159)。在另一實施方案中，這樣一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包括由D389E突變株修飾的圖4A所描述的胺基酸序列(SEQ ID NO175)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOII基元，其中X10是穀氨酸殘基。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOII基元，其中X5是一種非極性殘基，X6是一種非極性殘基。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOII基元，其中
X5為非極性殘基，X6為非極性殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為酸性殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO27)；或其中X5為丙氨酸殘基，X6為丙氨酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為天冬氨酸殘基，X11為任何胺基酸殘基，X12為任何胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基(SEQ ID NO28)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO II基元，其中X5為丙氨酸殘基，X6為丙氨酸殘基，X7為亮氨酸殘基，X8為賴氨酸殘基，X9為苯丙氨酸殘基，X10為天冬氨酸殘基，X11為酪氨酸殘基，
X12為賴氨酸殘基，X13為纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸殘基(SEQ ID NO29)。
在一個實施方案中，這樣一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包括由Q384AN385A雙突變株修飾的圖4A所描述的3』-5』核酸外切酶功能域的胺基酸序列(SEQ ID NO100)。在另一實施方案中，這樣一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包括由Q3 84AN385A雙突變株修飾的圖4A所描述的胺基酸序列(SEQID NO101)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO IIA基元，其中D為天冬氨酸殘基，X15為蘇氨酸殘基，X16為甲硫氨酸殘基，X17為異亮氨酸殘基，X18為丙氨酸殘基，X19為丙氨酸殘基，Y為酪氨酸殘基，X20為亮氨酸殘基，X21為亮氨酸殘基，X22為穀氨酸殘基，和X23為脯氨酸殘基(SEQ ID NO30)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOIII基元，如上所述，其中X35是酸性胺基酸殘基。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOIII基元，其中X24為脯氨酸殘基，X25為纈氨酸，亮氨酸或異亮氨酸殘基，X26為穀氨酸，天冬氨酸或脯氨酸殘基，X27為賴氨酸，精氨酸殘基，X28為丙氨酸或纈氨酸殘基，
X29為丙氨酸或纈氨酸殘基，X30為穀氨酸，或天冬醯胺殘基，X31為無電荷的極性胺基酸殘基，X32為絲氨酸或半胱氨酸殘基，X33為半胱氨酸或氨基乙酸殘基，X34為穀氨酸或蘇氨酸殘基，X35為天冬氨酸殘基，和X36為丙氨酸殘基(SEQ ID NO31)，或其中X24為脯氨酸殘基，X25為纈氨酸殘基，X26為穀氨酸殘基，X27為賴氨酸殘基，X28為丙氨酸殘基，X29為丙氨酸殘基，X30為天冬醯胺殘基，X31為酪氨酸殘基，X32為絲氨酸殘基，X33為半胱氨酸殘基，X34為穀氨酸殘基，X35為天冬氨酸殘基，和X36為丙氨酸殘基(SEQ ID NO32)。
另一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXO III基元，其中X31是非極性的殘基。在一個實施方案中，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOIII基元，其中X31是非極性的殘基，X35是酸性殘基。
一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOIII基元，其中X24為脯氨酸殘基，X25為纈氨酸，亮氨酸或異亮氨酸殘基，
X26為穀氨酸，天冬氨酸或脯氨酸殘基，X27為賴氨酸，或精氨酸殘基，X28為丙氨酸或纈氨酸殘基，X29為丙氨酸或纈氨酸殘基，X30為穀氨酸或天冬醯胺殘基，X31為非極性殘基，X32為絲氨酸或半胱氨酸殘基，X33為半胱氨酸或氨基乙酸殘基，X34為穀氨酸或蘇氨酸殘基，X35為天冬氨酸殘基，和X36為丙氨酸殘基(SEQ ID NO33)。
一方面，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能域包括一個EXOIII基元，其中X24為脯氨酸殘基，X25為纈氨酸殘基，X26為穀氨酸殘基，X27為賴氨酸殘基，X28為丙氨酸殘基，X29為丙氨酸殘基，X30為天冬醯胺殘基，X31為丙氨酸殘基，X32為絲氨酸殘基，X33為半胱氨酸殘基，X34為穀氨酸殘基，X35為天冬氨酸殘基，和X36為丙氨酸殘基(SEQ ID NO34)。
另一方面，本發明提供了一種具有削弱的3』-5』核酸外切酶的嵌合熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，所述的聚合酶包括氨基末端部分和羧基末端部分，氨基末端部分從第一DNA聚合酶的氨基末端部分衍生，羧基末端部分從第二DNA聚合酶衍生。在一個實施方案中，所述的帶有減弱的3`-5`核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶含有衍生自第一個熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的氨基末端部分的氨基末端部分以及衍生自第二個熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的羧基端部分的羧基末端部分，所述第二聚合酶優選的是顯示3`-5`核酸外切酶活性的。在另外一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，上述的氨基端和/或羧基端部分衍生於棲熱菌屬(Thermus)種的一種DNA聚合酶。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，上述的氨基端和/或羧基端部分衍生於棲熱袍菌屬(Thermotoga)種的一種DNA聚合酶。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，上述的氨基端和/或羧基端部分或另一部分衍生於棲熱菌屬種的一種DNA聚合酶，並且,其它的末端部分或另一部分衍生於棲熱袍菌屬種的一種DNA聚合酶；例如，在一個實施方案中，氨基端部分衍生於棲熱菌屬種的一種DNA聚合酶，羧基端部分衍生於棲熱袍菌屬種的一種DNA聚合酶。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端部分來源於棲熱菌屬種並含有一個5』-3』核酸外切酶結構域，羧基端部分來源於棲熱袍菌屬種並含有一個3』-5』核酸外切酶結構域和一個聚合酶結構域。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端部分來源於棲熱菌屬種並含有一個5』-3』核酸外切酶結構域而且與來源於棲熱菌屬種的DNA聚合酶的相應氨基端部分有高於約80％的序列同一性，上述的羧基端部分與來源於棲熱袍菌屬種的DNA聚合酶的相應羧基端部分有高於約80％低於100％的序列同一性。在另一個實施方案中，上述的棲熱菌屬種為Thermus sp.Z05，上述的棲熱袍菌屬種為海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)。在另一個實施方案中，嵌合熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包含如圖所示被一個或多個突變所修飾的圖4的胺基酸序列(SEQ ID NO90)。在另一個實施方案中，嵌合熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包含如圖所示被一個或多個突變所修飾的圖5的胺基酸序列(SEQID NO107)。在另一個實施方案中，嵌合熱穩定性或熱激活性的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的DNA聚合酶包含一個氨基端部分，一個中間部分，和一個羧基端部分。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端部分含有一個5』-3』核酸外切酶結構域。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，中間部分含有一個3』-5』核酸外切酶結構域。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，羧基端部分包含了一個聚合酶結構域。在另外一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端和羧基端部分衍生自來源於棲熱菌屬種的一種聚合酶。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端和/或羧基端與來源於棲熱菌屬種的聚合酶的相應氨基端和/或羧基端部分有高於80％的序列同一性。在另外一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，中間部分衍生自來源於棲熱袍菌屬種的一種聚合酶。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，中間部分與來源於棲熱袍菌屬種的相應聚合酶有高於80％低於100％的序列同一性。在另外一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，氨基端和羧基端部分衍生自來源於棲熱菌屬種的一種聚合酶，並且中間部分來源於棲熱袍菌屬種。在另一個實施方案中，上述的被削弱了3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶中，棲熱菌屬種為Thermussp.Z05，棲熱袍菌屬種為海棲熱袍菌。在另一個實施方案中，嵌合熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包含如圖所示被一個或多個突變所修飾的圖6的胺基酸序列(SEQ DNO130)。在另一個實施方案中，嵌合熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包含如圖所示被一個或多個突變所修飾的圖7的胺基酸序列(SEQ IDNO148)。
在其它方面，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶用如下實施例3所述的標準試驗測得其表現出大約6.5或更少但大於0，U/pmol的削弱的3』-5』核酸外切酶活性，其與未修飾的Tma DNA聚合酶的3』-5核酸外切酶結構域有高於約80％低於100％的序列同一性。在一個實施方案中，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶用如下實施例3所述的標準試驗測得其表現出大約6.5或更少但大於0U/pmol的削弱的3』-5』核酸外切酶活性，其與未修飾的Tma DNA聚合酶有高於約80％低於100％的序列同一性。未修飾的Tma DNA聚合酶的胺基酸序列比如可以包含圖1A的胺基酸序列(SEQ ID NO85)。
在其它方面，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶用如下實施例3所述的標準試驗測得其表現出大約6.5或更少但大於0U/pmol的削弱的3』-5』活性，其與未修飾的Tne DNA聚合酶的3』-5核酸外切酶結構域有高於約80％低於100％的序列同一性。在一個實施方案中，未修飾的Tne DNA聚合酶的3』-5核酸外切酶結構域包含圖2所示的序列(SEQ ID NO88)。在另一個實施方案中，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶用如下實施例3所述的標準試驗測得其表現出大約6.5或更少但大於0U/pmol的削弱的3』-5』活性，其與未修飾的Tne DNA聚合酶有高於約80％低於100％的序列同一性。未修飾的Tne DNA聚合酶的胺基酸序列比如可以包含公開於美國專利No.5948614的一種TneDNA聚合酶的胺基酸序列。
在其它方面，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶用如下實施例3所述的標準試驗測得其表現出大約6.5或更少但大於0U/pmol的削弱的3』-5』活性，其與未修飾的TafDNA聚合酶的3』-5核酸外切酶結構域有高於約80％低於100％的序列同一性。在一個實施方案中，未修飾的Taf DNA聚合酶的3』-5核酸外切酶結構域包含圖3所示的序列(SEQ ID NO89)。在另一個實施方案中，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶用如下實施例3所述的標準試驗測得其表現出大約6.5或更少但大於0U/pmol的削弱的3』-5』活性，其與未修飾的Taf DNA聚合酶有高於約80％低於100％的序列同一性。未修飾的Taf DNA聚合酶的胺基酸序列比如可以包含公開於美國專利No.5,968,799的一種TafDNA聚合酶的胺基酸序列。
在其它方面，本發明提供了分離的具有表現出削弱的3』-5』活性的3』-5』核酸外切酶結構域的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中，用U/pmol表示的5』-3』聚合酶活性與用U/pmol表示的3』-5』核酸外切酶活性的比值介於約1到100之間，兩種酶的活性測定採用下面實施例3所描述的方法，而且，3』-5』核酸外切酶結構域與未修飾的Tma DNA聚合酶的3』-5核酸外切酶結構域有高於約80％低於100％的序列同一性。在一個實施方案中，本發明提供了分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其與未修飾的Tma DNA聚合酶有高於約80％低於100％的序列同一性，其中，用U/pmol表示的5』-3』聚合酶活性與用U/pmol表示的3』-5』核酸外切酶活性的比值介於約1到100之間，兩種酶的活性測定採用下面實施例3所描述的方法。未修飾的Tma DNA聚合酶的胺基酸序列比如可以包含圖1A的胺基酸序列(SEQ ID NO85)。
在其它方面，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有3』-5』核酸外切酶結構域並且表現出削弱的3』-5』活性，其中，用U/pmol表示的5』-3』聚合酶活性與用U/pmol表示的3』-5』核酸外切酶活性的比值介於約1到100之間，兩種酶的活性測定採用下面實施例3所描述的方法，而且，3』-5』核酸外切酶結構域與未修飾的Tne DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶結構域有高於約80％低於100％的序列同一性。在一個實施方案中，未修飾的Tne DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶結構域包含圖2所示的序列(SEQ ID NO88)。在另一個實施方案中，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶表現削弱的3』-5』活性，其中，用U/pmol表示的5』-3』聚合酶活性與用U/pmol表示的3』-5』核酸外切酶活性的比值介於約1到100之間，兩種酶的活性測定採用下面實施例3所描述的方法，所述聚合酶與未修飾的Tne DNA聚合酶有高於約80％低於100％的序列同一性。未修飾的Tne DNA聚合酶的胺基酸序列比如可以包含公開於美國專利No.5,948,614的一種Tne聚合酶的胺基酸序列。
在其它方面，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有3』-5』核酸外切酶結構域並且表現削弱的3』-5』活性，其中，用U/pmol表示的5』-3』聚合酶活性與用U/pmol表示的3』-5』核酸外切酶活性的比值介於約1到100之間，兩種酶的活性測定採用下面實施例3所描述的方法，而且，3』-5』核酸外切酶結構域與未修飾的Taf DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶結構域有高於約80％低於100％的序列同一性。在一個實施方案中，未修飾的Taf DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶結構域包含圖3所示的序列(SEQ ID NO89)。在另一個實施方案中，本發明分離的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶表現削弱的3』-5』活性，其中，用U/pmol表示的5』-3』聚合酶活性與用U/pmol表示的3』-5』核酸外切酶活性的比值介於約1到100之間，兩種酶的活性測定採用下面實施例3所描述的方法，所述聚合酶與未修飾的Taf DNA聚合酶有高於約80％低於100％的序列同一性。未修飾的Taf DNA聚合酶包含公開於美國專利No.5,968,799中提供的一種TafDNA聚合酶的胺基酸序列。
在其它方面，本發明提供了包含表現出削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的混合物。在一個實施方案中，該混合物用如下實施例3所述的標準試驗測得具有大約6.5或更少但大於0U/pmol的削弱的3』-5』核酸外切酶活性。在另一個實施方案中，該混合物用U/pmol表示的5』-3』聚合酶活性與用U/pmol表示的3』-5』核酸外切酶活性的比值介於約1到100之間，採用如下實施例3所描述的方法測定。
在其它方面，本發明提供了包含編碼削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶序列的核酸。在一個實施方案中，本發明提供了包含編碼削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶序列的質粒。在另一個實施方案中，質粒為一個表達載體。在另一個實施方案中，表達載體使得在微生物中表達削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在另一個實施方案中，微生物為細菌。在另一個實施方案中，細菌為大腸桿菌(E.coli)。
在其它方面，本發明提供了經遺傳工程方法處理而含有和/或表達包含編碼削弱了的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的序列的核酸的細胞。在一個實施方案中，細胞包含包括編碼削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶序列的質粒。在另一個實施方案中，質粒是一個表達載體，其使得在細胞中表達削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在另一個實施方案中，所述細胞是一種微生物。在另一個實施方案中，所述微生物是細菌大腸桿菌。
在其它方面，本發明提供了生產削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的方法，該方法包括在能夠使得表達削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱激活性DNA聚合酶的條件下培養能夠表達編碼削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱激活性DNA聚合酶的核酸的細胞並且從細胞分離具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱激活性DNA聚合酶的步驟。在一個實施方案中，細胞為微生物。在另一個實施方案中，微生物為細菌。在另一個實施方案中，細菌為大腸桿菌。在另一個實施方案中，細胞包含一個表達載體，其含有削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱激活性DNA聚合酶。
在其它方面，本發明提供了複製DNA分子的方法，該方法包括在能夠使得熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶複製DNA分子的條件下溫育DNA分子和本發明熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的步驟。DNA分子可以是任何種類的DNA分子，例如，cDNA分子，基因組DNA分子，單鏈DNA分子或雙鏈DNA分子。在一個實施方案中，削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱激活性DNA聚合酶被用來例如通過PCR擴增DNA分子。在另一個實施方案中，具有需要水平的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶被選擇出來以滿足特殊的實施條件，例如，金屬離子的類型和濃度，鹽的類型和濃度，目的核酸的長度和/或不管目的分子為單鏈DNA，雙鏈DNA或RNA。
在其它方面，本發明提供了選擇削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的方法，該方法包括檢測熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性並且如果它具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性則選擇該聚合酶的步驟。在一個實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶為被修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在另一個實施方案中，被修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶為一個突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在另一個實施方案中，如果3』-5』核酸外切酶活性在參考的聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性水平的大約0.1％和大約65％之間則將該熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶選擇出來，用下列實施例3的標準試驗檢測。在另一個實施方案中，3』-5』核酸外切酶活性在參考的聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性水平的大約0.1％和大約30％之間的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶被選擇出來。在另一個實施方案中，3』-5』核酸外切酶活性在參考的聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性水平的大約3.0％和大約20％之間的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶被選擇出來。在另一個實施方案中，3』-5』核酸外切酶活性在參考的聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性水平的大約3.0％和大約10％之間的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶被選擇出來。在另一個實施方案中，3』-5』核酸外切酶活性在參考的聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性水平的大約3.0％和大約5％之間的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶被選擇出來。在另一個實施方案中，用下列實施例3的標準試驗檢測活性水平在6.5或更小但大於0單位/pmol之間的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶被選擇出來。在另一個實施例中，5』-3』DNA聚合酶活性與3』-5』核酸外切酶活性的比值介於約1到100之間的突變熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶被選擇出來，其中用下面實施例3描述的方法檢測酶的活性。
在其它方面，本發明提供了包含至少一種削弱了3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒進一步包含用於複製DNA分子的試劑。在另一個實施例中，試劑用於在PCR擴增中複製DNA分子。在一個實施方案中，試劑為緩衝液。在另一個實施方案中，試劑一種引引物。在另一個實施方案中，試劑為脫氧核糖核苷酸。在另一個實施方案中，試劑為雙脫氧核糖核苷酸。
在其它方面，本發明提供了包含第一種具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶和第二種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的DNA聚合酶混合物。在一個實施方案中，第二種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶較第一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性低。在另一個實施方案中，第二種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶基本上沒有3』-5』核酸外切酶活性。在另一個實施方案中，第二種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶較第一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性高。在另一個實施方案中，用下面實施例3描述的標準試驗檢測酶的活性，混合物的3』-5』核酸外切酶活性大約6.5或更小但大於0單位/pmol。
在其它方面，本發明提供了用熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶混合物複製DNA分子的方法，該方法包括在能夠使得DNA聚合酶複製DNA分子的條件下用第一種具有削弱的3』-5』核酸外切酶活性的聚合酶和第二種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶溫育DNA分子的步驟。在一個實施方案中，在PCR擴增中利用聚合酶混合物複製DNA。
本發明的組合物和方法比以前可獲得的組合物和方法具有幾個優點。本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶優於沒有3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，因為本發明的聚合酶允許模板DNA序列的高保真複製和擴增。本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶優於具有高3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，因為本發明的聚合酶通過減少副產物無效反應的發生允許被複製模板的較少的降解，引物的較少降解和/或更有效地利用dNTPs和其它反應組分。本發明的突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶優於具有和不具有3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的混合物，因為本發明的聚合酶需要較少的處理和校準因此更有效並且生產和使用的成本更低。另外，令人驚訝的是，人們也發現PCR需要的本發明的聚合酶比以前需要的酶的混合物少。本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶混合物優於以前獲得的混合物因為其需要模板依賴的5`-3`DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率得到較好的控制以及因為其使得產生其中ssDNA核酸外切酶和dsDNA核酸外切酶活性的水平被分別調整的混合物。
附圖的簡要描述附圖1A表示海棲熱袍菌(Tma)DNA聚合酶的胺基酸序列(SEQ ID NOg5)。3`-5核酸外切酶區域位於大約胺基酸殘基292到487處(SEQ ID NO86)，其中殘基被加下劃線。附圖1B代表編碼附圖1A胺基酸序列的核酸序列(SEQID NO87)。
附圖2表示來自那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitana)(Tne)DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶區域的胺基酸序列(SEQ ID NO88)。
附圖3表示來自非州棲熱袍菌(Thermotoga africanus)(Taf)DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶區域的胺基酸序列(SEQ ID NO89)。
附圖4A表示嵌合熱穩定性DNA聚合酶CS5的胺基酸序列(SEQ ID NO90)。3`-5`核酸外切酶區域從大約殘基292延伸到大約487殘基，其中的殘基被加下劃線(SEQ ID NO91)。殘基1-291(SEQ ID NO92)衍生自Z05 DNA聚合酶並且殘基292-893(SEQ ID NO93)衍生自TmaDNA聚合酶，通過箭頭來顯示。第二輪誘變期間導入的胺基酸殘基直接顯示在其替換的殘基上，其用黑體表示L329A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO94；整個蛋白，SEQ ID NO95)，Q384A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO96；整個蛋白，SEQ ID NO97)，N385A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO98；整個蛋白，SEQ ID NO99)，Q384AN385A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO100；整個蛋白，SEQ ID NO101)，D389E(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO102；整個蛋白，SEQ ID NO103)，以及Y464A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO104；整個蛋白，SEQID NO105)。附圖4B表示編碼CS5的核酸序列(SEQ ID NO；106)。
附圖5A表示嵌合熱穩定性DNA聚合酶CS6的胺基酸序列(SEQ ID NO107)。3`-5`核酸外切酶區域從大約殘基292延伸到大約487殘基，其中的殘基被加下劃線(SEQ ID NO108)。殘基1-291(SEQ ID NO109)衍生自Z05DNA聚合酶且殘基292-893(SEQ ID NO110)衍生自TmaDNA聚合酶，通過箭頭來顯示，除了殘基323-325被用序列ALA替換。第一輪誘變期間導入的胺基酸殘基替代直接顯示在其替換的殘基上，其用黑體表示DEE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO111；整個蛋白，SEQ ID NO112)，DDE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO113；整個蛋白，SEQ ID NO114)，DKE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO115；整個蛋白，SEQ ID NO116)，DNE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO117；整個蛋白，SEQ ID NO118)，DQE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO119；整個蛋白，SEQ ID NO120)，DHE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO121；整個蛋白，SEQ ID NO122)，DLD(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO123；整個蛋白，SEQ ID NO124)，ELD(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO125；整個蛋白，SEQ ID NO126)，ELE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO127；整個蛋白，SEQ ID NO128)。附圖5B表示編碼CS6的核酸序列(SEQ ID NO129)。
附圖6A表示嵌合熱穩定性DNA聚合酶CS7的胺基酸序列(SEQ ID NO130)。3`-5`核酸外切酶區域從大約殘基292延伸到大約487殘基，其中的殘基被加下劃線(SEQ ID NO131)。殘基1-291(SEQ ID NO132)和485-894(SEQ IDNO133)衍生自Z05 DNA聚合酶，並且殘基292-484(SEQ ID NO134)衍生自Tma DNA聚合酶，通過箭頭來顯示。與在第二輪誘變期間導入到CS5中的那些類似的胺基酸殘基取代直接顯示在其替換的殘基上，其用黑體表示L329A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO135；整個蛋白，SEQ ID NO136)，Q384A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO137；整個蛋白，SEQ ID NO138)，N385A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO139；整個蛋白，SEQ ID NO140)，Q384A N385A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO141；整個蛋白，SEQ ID NO142)，D389E(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO143；整個蛋白，SEQ ID NO144)，以及Y464A(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO145；整個蛋白，SEQID NO146)。附圖6B表示編碼CS7的核酸序列(SEQ ID NO147)。
附圖7A表示嵌合熱穩定性DNA聚合酶CS8的胺基酸序列(SEQ IDNO148)。3`-5`核酸外切酶區域從大約殘基292延伸到大約487殘基，其中的殘基被加下劃線(SEQ ID NO149)。殘基1-291(SEQ ID NO150)和殘基485-894(SEQ ID NO151)衍生自Z05DNA聚合酶且殘基292-484(SEQID NO152)衍生自TmaDNA聚合酶，通過箭頭來顯示，除了殘基323-325被殘基ALA替換。與在第二輪CS5誘變期間導入的那些類似的胺基酸殘基替代直接顯示在其替換的殘基上，其用黑體表示DEE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO153；整個蛋白，SEQ ID NO154)，DDE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO155；整個蛋白，SEQ ID NO156)，DKE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO157；整個蛋白，SEQ ID NO158)，DNE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO159；整個蛋白，SEQ ID NO160)，DQE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO161；整個蛋白，SEQ ID NO162)，DHE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO163；整個蛋白，SEQ ID NO164)，DLD(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO165；整個蛋白，SEQ ID NO166)，ELD(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO167；整個蛋白，SEQ ID NO168)，ELE(3`-5`核酸外切酶區域，SEQ ID NO169；整個蛋白，SEQ ID NO170)。附圖7B表示編碼CS8的核酸序列(SEQ ID NO171)。
附圖8顯示了來自EcoDNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶區域和其它A家族DNA聚合酶的胺基酸序列的序列比對Tth(SEQ ID NO172)，Tca(SEQ ID NO173)，Z05(SEQ ID NO174)，Taq(SEQ ID NO175)，Tfl(SEQ ID NO176)，Tfi(SEQID NO177)，Sps17(SEQ ID NO178)，Dra(SEQ ID NO179)，HSP-B-7(SEQ IDNO180)，Bst(SEQ ID NO181)，Bca(SEQ ID NO182)，大腸桿菌(SEQ ID NO183)，Tma(SEQ ID NO184)，Tne(SEQ ID NO185)，Taf(SEQ ID NO186)，HSP-A(SEQ ID NO187)。Exo I(SEQ ID NO203)，Exo II(SEQ ID NO188)，Exo IIa(SEQID NO189)和Exo III(SEQ ID NO190)基元被用黑體顯示在Tma序列中。
附圖9A和9B表示利用本發明的突變DNA聚合酶進行1.7kb HIV模板的逆轉錄酶/PCR擴增的生長曲線。
附圖10顯示了附圖9的逆轉錄酶PCR擴增的擴增產物的電泳分析的照片。
附圖11顯示為Eco Pol IIB家族DNA聚合酶與一些其它B家族DNA聚合酶(SEQ ID NO191-202)的序列比對。
本發明的詳細描述為了有助於本發明的理解，術語的定義如下。
術語「細胞」，「細胞系」，和「細胞培養物」可以相互替換使用並且所有這些定義包括後代。因此，「轉化體」或「轉化細胞」包括原代轉化細胞和來自不同轉化次數的細胞的培養物。所有的後代可能在DNA內含物上不完全一致，因為有意或隨意的突變。與篩選自原代轉化細胞具有相同功能的突變體後代包括在轉化體的定義中。細胞可以是原核的或真核的。
術語「調控序列」是指在特定的宿主微生物中的可操作地連接編碼序列的表達所必需的DNA序列。適宜於原核生物的調控序列，例如，包括啟動子，選擇性的一個操縱子序列，核糖體結合位點，正向的逆調控元件(參見US專利4666848，這裡引作參考)，以及可能的其它序列。已知真核細胞利用啟動子，聚腺苷酸化信號，以及增強子。
術語「表達克隆」是指含有目的編碼序列和可操作連接的調控序列的DNA序列，使得用這些序列轉化的宿主能夠產生編碼的蛋白。術語「表達系統」是指用這些表達克隆轉化的宿主。為了實現轉化，表達克隆可被包括在載體上，然而，相關的DNA也可被整合到宿主染色體中。
術語「基因」是指含有蛋白，多肽或前體的產生所必需的調控和編碼序列的DNA序列。
術語「可操作地連接」是指編碼序列的定位使得調控序列啟動編碼序列編碼的蛋白的表達。因此，一個編碼序列「可操作地連接」一個調控序列是指一種結構，其中的編碼序列可在調控序列的引導下被表達。
這裡使用的術語「寡核苷酸」被定義為一種分子，其由兩個或多個脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸組成。其精確的大小依賴許多因素，其依次依賴寡核苷酸的最佳功能或用途。寡核苷酸可被通過許多合適的方法來製備，包括，例如，適當的序列的克隆和限制以及通過化學方法直接合成，例如Narang等人的磷酸三酯法，1979，Meth.Enzymol.6890--99；磷酸二酯法，Brown等人，1979，Meth.Enzymol.68109-151；二乙基磷酸氨化法，Beaucage等，1981，TetrahedronLett.221859-1862；以及固體載體法，US專利4458066，各自在這裡引作參考。合成方法的綜述被Goodchild提供，1990，Bioconjugate Chemistryl(3)165-187，這裡引作參考。
這裡使用的術語「引物」是指一種寡核苷酸，其當被置於引物延伸被啟動的條件下時能夠充當合成啟動點的作用。互補於被啟動的核酸鏈的引物延伸產物的合成在所需的四種不同的核苷三磷酸和熱穩定的或熱激活DNA聚合酶存在的條件下在合適的緩衝液中在適當的溫度下被啟動。「緩衝液」包括輔因子(例如二價金屬離子)和鹽(提供合適的離子強度)，調整到所期望的pH。
雜交於基因序列的非編碼鏈的引物(相當於，是編碼鏈的子序列)被稱為「上遊」或「正向」引物，雜交於基因序列的編碼鏈的引物被稱為「下遊」或「反向」引物。
術語「限制性核酸內切酶」和「限制性酶」是指酶，典型地是細菌來源的，其在或接近特異性核苷酸序列處切割雙鏈DNA。
具有相同側鏈的胺基酸殘基家族被在此定義。這些家族包括胺基酸，其帶有鹼性側鏈(例如，賴氨酸，精氨酸，組氨酸)，酸性側鏈(例如天冬氨酸，穀氨酸)，不帶電荷的極性側鏈(例如，天冬醯胺，穀氨醯胺，絲氨酸，蘇氨酸，酪氨酸)，非極性側鏈(例如，丙氨酸，纈氨酸，亮氨酸，異亮氨酸脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸，半胱氨酸，甘氨酸)，β-支鏈側鏈(例如，蘇氨酸，纈氨酸，異亮氨酸)以及芳香側鏈(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，組氨酸)。
術語「熱穩定性聚合酶」是指一種酶，其對熱穩定，是熱抗性的並且在施加升高的溫度對於雙鏈核酸的變性必要的時間後仍保持對隨後的引物延伸反應作用的充分的活性。核酸變性所必需的加熱條件是本領域公知的且例證於US專利4965188和4889818中，其在此引作參考。這裡所用的，熱穩定性聚合酶適用於溫度循環反應例如PCR中。
術語「熱激活的聚合酶」是指一種酶，其在確保特異性啟動和引物延伸所必需的高溫度下是激活的(例如，55-80℃)。
術語「校正活性」是指具有3`-5`核酸外切酶活性的分子也具有5`-3`DNA聚合活性。
對於DNA聚合酶活性來說，「酶促反應」是指核苷酸的正確方式的組合催化形成引物延伸產物，其互補於一個模板核酸鏈。DNA聚合酶活性被表示為單位/pmol，其通過下述實施例3所述的聚合酶試驗來測定。1單位的聚合酶活性被定義為利用下述實施例3所提供的聚合酶反應條件在30分鐘內將10nmoldNMP整合到TCA-可沉降的DNA產物中所需要的酶活的量。
對於3`-5`核酸外切酶活性而言，「酶促反應」是指通過磷酸二酯鍵的水解的催化，一個核酸鏈，多核苷酸或寡聚物的3`核苷酸殘基的依次去除。1單位的3`-5`核酸外切酶活性催化將50pmol的單鏈NJS40寡核苷酸在下述實施例3的標準試驗條件下15分鐘內轉化為較短長度的寡核苷酸。
對於5`-3`核酸外切酶活性而言，「酶促反應」是指通過磷酸二酯鍵的水解的催化，一個核酸鏈，多核苷酸或寡核苷酸的5`核苷酸殘基的依次去除。1單位的5`-3`核酸外切酶活性被定義以及5`-3`核酸外切酶活性的測定被提供在US專利5795762中。
此處所用的，胺基酸序列中的「點突變」是指單個胺基酸取代，單個胺基酸插入或單個胺基酸缺失。點突變優選被通過編碼DNA中的合適密碼子的改變來導入到胺基酸序列中。單一的胺基酸在序列中被表示為AN，其中的A是序列中胺基酸的標準一字母符號，且N是在序列中的位置。胺基酸序列中的突變被表示為A1NA2，其中A1是在未突變的蛋白序列中胺基酸的標準一字母符號，A2是在突變的蛋白序列中胺基酸的標準一字母符號，N是胺基酸序列中的位置。例如，G46D突變表示在胺基酸位置46處甘氨酸變化為天冬氨酸殘基。當指從蛋白質衍生的結構域中的突變時，胺基酸位置編號基於從中衍生包括突變的區域的全長蛋白。因此，在本發明中，來自棲熱菌屬(Thermus)種屬DNA聚合酶的蛋白的區域中的突變根據全長棲熱菌屬DNA聚合酶序列編號，而從TmaDNA聚合酶衍生的區域中的突變根據全長TmaDNA聚合酶序列編號。DNA序列中核苷酸和點突變的表示是類似的。然而，當指代嵌合蛋白或編碼嵌合蛋白的核酸時，胺基酸殘基或核酸被連續編數。
術語「肽」，「多肽」以及「蛋白」在這裡是可互換使用的。術語「核酸」和「多核苷酸」是互換使用的。胺基酸序列從氨基端到羧基端被描述，除非另有描述。單鏈核酸序列被記為5`到3`，除非另有描述。雙鏈核酸序列的上鏈是5`到3`，且下鏈為3`到5`，除非另有描述。
此處所用的，「嵌合」蛋白是指一種蛋白，其胺基酸序列表示一種至少來自兩個不同蛋白的胺基酸序列的子序列的融合產物。嵌合蛋白優選地不是由胺基酸序列的直接處理來產生，但是，而是由編碼嵌合胺基酸序列的「嵌合」基因表達。在本發明的一個實施方案中，提供一種嵌合蛋白，其由衍生自棲熱菌屬DNA聚合酶的氨基端(N-末端)區域和衍生自Tma DNA聚合酶的羧基端(C-末端)區域構成。N-末端區域是指從N端(胺基酸位置1處)延伸到中間胺基酸的一個區域。類似地，C-末端區域是指從中間胺基酸延伸到C端的一個區域。
除非另有說明，胺基酸序列同一性利用BLAST算法來確定，描述在Altschul等，J.Mol.Biol.215，403-410，(1990)以及Karlin等.，PNAS USA 905873-5787(1993)。一個特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序，其被描述在Altschul等，Methods in Enzymology，266460-480(1996)。WU-BLAST-2程序使用一些檢索參數，大部分被設置為默認值。可調整的參數被設置為下列的值重疊跨度＝1，重疊分數＝o.125，字符閾值(T)＝11。HSP S和HSP S2參數為動態的值且根據特定序列的組成和目的序列被檢索的特定資料庫的組成通過程序本身被設定；然而這些值可被調整來增加敏感度。胺基酸序列同一性的百分比的值通過匹配相同的殘基的數除以比對區域的「較長」序列的殘基的總數來確定。「較長的」序列是一個在比對範圍中具有最大實際殘基的序列(由WU-Blast-2導入的最大化比對分值的缺口被忽略)。百分胺基酸序列同源性的測定基於同源胺基酸殘基的數目與胺基酸殘基的總數的關係。
百分(％)核酸序列同一性被定義為與序列的核苷酸殘基相同的候選序列的核苷酸殘基的百分比。除非另有描述，百分核酸序列同一性通過利用WU-BLAST-2設置為預設值的BLASTN模式計算，重疊跨度和重疊分數分別被設置為1和0.125。比對可能包括待比對的序列的缺口的導入。百分核酸序列同源性的測定基於與核苷總數相關的同源核苷的數目。對於核酸序列和胺基酸序列兩者而言，「％同源性」和「％序列同源性」是可以與「％相似性」和「％序列相似性」互換使用的。
這裡的活性是「削弱的」是指其小於100％但利用下面的實施例3的標準測定方法仍是可測定的。如果活性減少到小於全能性酶的活性的0.1％，則活性是「失活的」或「基本上失活的」。
本發明的熱穩定性和熱激活性DNA聚合酶本發明提供了新的組合物，其為具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶是，例如，比以前的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶更適宜用於基於PCR的擴增方法中，例如，基於PCR的用於克隆的DNA片段的擴增。本發明的改進的PCR擴增方法包括這些熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的使用。產生具有削弱的校正活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的方法，編碼它們的DNA序列以及表達它們的載體也被提供。
1.具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶在一方面，本發明提供了一種具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在一個實施方案中，聚合酶來自嗜熱真細菌。在另一個實施方案中，嗜熱真細菌是棲熱袍菌屬的一個種。在另一個實施方案中，嗜熱真細菌是海棲熱袍菌(Tma)。在另一個實施方案中，嗜熱真細菌是那不勒斯棲熱袍菌。在另一個實施方案中，嗜熱真細菌是棲熱腔菌(Thermosipho)屬的一個種。在另一個實施方案中，嗜熱真細菌是非州棲熱腔菌(Thermosiphoafricanus)。在另一個實施方案中，嗜熱真細菌是產熱菌(Aquifex)屬的一個種。在另一個實施方案中，嗜熱真細菌是嗜火產液菌(Aquifex pyrophilus)。在另一個實施方案中，嗜熱真細菌是Aquifex aeolieus。
在另一方面，聚合酶來自嗜熱古細菌。在一個實施方案中，嗜熱古細菌是熱球菌(Thermococcus)屬的一個種。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是Thermococcus barossi。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是Thormococcuslitoralis。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是Thermococcus gorgonarius。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是火球菌(Pyrococcus)屬的一個種。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是pyrococcus sp.GB-D。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是pyrococcus woesei。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是Pyrococcus abyssi。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是熱網菌(Pyrodictium)屬的一個種。在另一個實施方案中，嗜熱古細菌是Pyrodictium abyssi。另一個實施方案中，嗜熱古細菌是隱蔽熱網菌(Pyrodictium occultum)。
在另一個方面，本發明提供了包括一或多個減小3`-5`核酸外切酶活性的定點突變(單個胺基酸取代，插入或缺失突變)的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在一個實施方案中，突變體熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性通過實施例3的標準試驗測定在野生型DNA聚合酶的大約0.1％和大約65％之間。在另一個實施方案中，突變體熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大約1.0％和大約30％之間。在另一個實施方案中，突變體聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大約3.0％和大約20％之間。在另一個實施方案中，突變聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大約3.0％和大約10％之間。在另一個實施方案中，突變聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大約3.0％和大約5％之間。
在另一方面，突變體聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性是野生型DNA聚合酶的50％或更少但大於0％，通過使用實施例4的雙鏈DNA底物和First VariantAssay測定。在另一個實施方案中，突變體聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大約4％和大約35％之間。在另一個實施方案中，突變體聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大約4％和大約17％之間。
在另一方面，突變體聚合酶的3`-5`外切酶活性是在野生型DNA聚合酶的大約0.1％和大約70％之間，通過使用實施例4的含有錯配的雙鏈DNA底物和Second Variant Assay測定。在另一個實施方案中，突變體聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大約10％和大約50％之間。在另一個實施方案中，突變體聚合酶的3`-5`核酸外切酶活性在野生型DNA聚合酶的大約10％和大約30％之間。
在另一方面，本發明提供了一種具有通過實施例3的標準試驗測定的大約6.5U/pmol或更低但大於0U/pmol的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在一個實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有在大約0.4和大約3.0U/pmol之間的3`-5`核酸外切酶活性。在另一個實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有在大約0.4和大約1.6U/pmol之間的3`-5`核酸外切酶活性。
在另一方面，本發明提供了一種具有通過實施例4的雙鏈DNA底物和FirstVariant Assay測定的大約5.5U/pmol或更低但大於0U/pmol的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在一個實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有在大約0.5和大約3.6U/pmol之間的3`-5`核酸外切酶活性。在另一個實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有在大約0.5和大約1.9U/pmol之間的3`-5`核酸外切酶活性。
在另一方面，本發明提供了一種具有通過實施例4含有錯配的雙鏈DNA底物和Second Variant Assay測定的大約0.01U/pmol和12.0U/pmol之間的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。在一個實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有在大約1.0和大約7.0U/pmol之間的3`-5`核酸外切酶活性。在另一個實施方案中，熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有在大約1.5和大約5.0U/pmol之間的3`-5`核酸外切酶活性。
在另一方面，本發明提供了一種具有5`-3`模板依賴的DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率在大約1和100之間的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中聚合酶活性和3`-5`核酸外切酶活性的測定如實施例3所述。在一個實施方案中，5`-3`模板依賴的DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率在約3.0和約50之間。在另一個實施方案中，5`-3`模板依賴的DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率在約6.0和約25.0之間。
在另一方面，本發明提供了一種具有5`-3`模板依賴的DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率在大約1和100之間的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中聚合酶活性測定如實施例3所述且3`-5`核酸外切酶活性通過實施例4的雙鏈DNA底物和First Variant Assay測定。在一個實施方案中，5`-3`模板依賴的DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率在約2.0和約50之間。在另一個實施方案中，5`-3`模板依賴的DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率在約5.0和約25.0之間。
在另一方面，本發明提供了一種具有5`-3`模板依賴的DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率在約0.75和10之間的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中聚合酶活性測定如實施例3所述且3`-5`核酸外切酶活性通過實施例4的含有錯配的雙鏈DNA底物和Second Variant Assay測定。在一個實施方案中，5`-3`模板依賴的DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率在大約12和大約5.0之間。在另一個實施方案中，5`-3`模板依賴的DNA聚合酶活性與3`-5`核酸外切酶活性的比率在大約2.0和大約4.5之間。
在本發明的另一方面，具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶衍生自Tma DNA聚合酶。在本發明的一個實施方案中，具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶衍生自包括Tma 3`-5`核酸外切酶活性區域的Tmermus/Thermatoga嵌合DNA聚合酶。Tma DNA聚合酶是具有3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性和熱激活性酶。參見US專利5624833和5374553。顯示於附圖1的Tma DNA聚合酶的大約292到大約484胺基酸殘基含有3`-5`核酸外切酶區域。在另一個實施方案中，本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶在Tma DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶區域含有一或多個突變。在另一個實施方案中，突變體Tma DNA聚合酶在L329處含有一個突變。在另一個實施方案中，突變為L329A。在另一個實施方案中，突變體Tma DNA聚合酶在D389處含有一個突變。在另一個實施方案中，突變為D389E。在另一個實施方案中，突變體Tma DNA聚合酶在Q384處含有一個突變。在另一個實施方案中，突變為Q384A。在另一個實施方案中，突變體Tma DNA聚合酶在N385處含有一個突變。在另一個實施方案中，突變為N385A。在另一個實施方案中，突變體Tma DNA聚合酶在Q384和N385處含有突變。在另一個實施方案中，突變為Q384A N385A。
產生削弱的3`-5`核酸外切酶活性的這些或其它胺基酸位置處的其它突變可被通過使用標準技術和此處的核酸外切酶活性測定來產生和測定突變來鑑定。一種產生具有削弱的3`-5`核酸外切酶活性的突變體Tma DNA聚合酶的方法是缺失一或多個胺基酸殘基或突變胺基酸使其具有不同的化學特性。例如，一個具有酸性測鏈的胺基酸殘基例如天冬氨酸可被替換成具有鹼性的，不帶電荷的極性的，非極性的，β支鏈的或芳香基側鏈的殘基。維持胺基酸的帶電特性的取代突變也可以削弱3`-5`核酸外切酶活性，例如，改變天冬氨酸殘基為穀氨酸殘基。
產生突變體熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的另外的方法是在已知的或預期影響聚合酶3`-5`核酸外切酶活性的殘基附近改變聚合酶。例如，一或多個胺基酸殘基可被插入，缺失或取代在聚合酶的3`-5`核酸外切酶區域中關鍵殘基的附近。可選擇地，一個或多個殘基可被插入，缺失或取代與蛋白的主要序列的關鍵殘基不相鄰但與聚合酶的三級結構的關鍵殘基相鄰的地方。此方法特別有助於當關鍵殘基本身的突變引起聚合酶的3`-5`中關鍵殘基外切酶活性比所期望的減少要大時，或引起其它的問題，例如聚合酶的錯誤摺疊。
除了上文所描述的定點誘變技術外，作為一個選擇，更加隨機的誘變技術也可以用來製備本發明的突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。例如，將插入、缺失和/或替換突變導入到Tma DNA聚合酶的任意位點，而不考慮上文所討論的關鍵殘基，乃至該蛋白的功能域結構。在一個實施方案中，突變被隨機導入到整個Tma DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能區。在另一個實施方案中，突變被隨機導入到整個DNA聚合酶分子中。然後如實施例的描述檢測每一種突變聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性，挑選具有理想3』-5』核酸外切酶活性水平的突變聚合酶備用。
本發明的突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶也可以通過向Tma DNA聚合酶中導入一個以上的突變來製備。例如，兩個或兩個以上的突變，其中的每一個突變自身不足以降低該突變聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性，它們在聚合酶分子中組合而將3』-5』核酸外切酶活性降低到理想範圍。可選擇地，優先降低Trma DNA聚合酶對ssDNA底物的3』-5』核酸外切酶活性的一個或多個突變與優先降低Tma DNA聚合酶對dsDNA底物的3』-5』核酸外切酶活性的一個或多個突變在一個聚合酶分子中組合。
本發明的突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶也可以通過缺失、插入、替換或重排多個相鄰殘基以產生3』-5』核酸外切酶活性被減弱的突變DNA聚合酶來製備。
並不是Tma DNA聚合酶的每個胺基酸的每一個突變都會產生具有理想的3』-5』核酸外切酶活性水平的突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。有的突變並不能充分地降低3』-5』核酸外切酶活性，有的降低得太多。例如，美國專利No.6,015,668；5,939,301和5,948,614描述了在Tma和TneDNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能區將金屬結合的天冬氨酸改變為丙氨酸殘基的突變，這些突變將這些酶的3』-5』核酸外切酶活性降低到可檢測水平以下，本發明不包括這些突變。相似地，美國專利No.5,882,904描述了在Thermococcus barossi中將天冬氨酸改變成丙氨酸的類似突變，美國專利No.5489523教導了伍氏熱球菌(Pyrococcus wosei)DNA聚合酶的雙突變D141A E143A，這些突變的聚合酶都完全不能檢測到3』-5』核酸外切酶活性。因此，本領域的普通技術人員能夠理解，必需檢驗每一種突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶以檢測其3』-5』核酸外切酶活性。檢測3』-5』核酸外切酶活性的方法見下文。其它的方法是本領域公知的，例如，參見Reemont等，1986，Proteinsl66；Derbyshire等，1991，EMBOJ.1617和Derbyshire等，1995，Methods in Enzymology 262363-85。
另一方面，本發明提供了一種突變的Tma DNA聚合酶，該聚合酶具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性且含有影響Tma DNA聚合酶一種或多種屬性的一個或多個突變。例如，這些屬性包括但不限於Tma DNA聚合酶區別dNTPs和dNTP類似物或衍生物的能力，參見，如美國專利No.5,939,292和5,614,365，5』-3』核酸外切酶活性，參見，如美國專利No.6,228,628；5,466,591和5,420,029，熱穩定性，冷穩定性，參見，如美國專利No.6,214,557，製備的容易程度和費用，持續合成能力，聚合速率等。
通過在編碼基因序列中插入合適的突變而實現胺基酸序列的突變，DNA序列中的這種突變利用本領域公知的技術來實現，進一步的描述見下文。
另一個方面，本發明提供了一種具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，該聚合酶已經被化學修飾。參見，例如美國專利No.6,183,998。在一個實施方案中，該化學修飾是翻譯後修飾。在另一個實施方案中，修飾的胺基酸殘基是本文鑑定的對於3』-5』核酸外切酶活性重要的或關鍵的殘基。該翻譯後修飾可以在體內或體外進行。翻譯後修飾的例子包括但不限於用蛋白酶處理和胺基酸殘基的磷酸化作用、糖基化作用和醯基化作用。參見，例如Molecular Biology of the cell 1994，(Alberts等編)，第三版，GarlandPublishing，New York。
上文所討論的有關TamDNA聚合酶的每一種類型的突變和修飾可以被導入到其它的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶中而產生本發明的突變熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。基於胺基酸序列排列，將DNA聚合酶分組，根據與大腸桿菌DNA聚合酶I、II和III的同源性命名為A、B和C家族。參見，例如Ito等，Nucl.Acids Res.194045-47，在此全文引為參考。棲熱袍菌屬(Thermotoga)和棲熱菌屬(Thermus)種的DNA聚合酶是A家族DNA聚合酶的成員，該家族還包括大腸桿菌DNA聚合酶I。家族A DNA聚合酶中的保守胺基酸已經被鑑定。圖8(SEQ ID NO172-187)顯示了TamDNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能區區域的胺基酸序列與其它的A家族DNA聚合酶的胺基酸序列的排比。由於A家族DNA聚合酶的胺基酸的保守性，對一種DNA聚合酶，如大腸桿菌DNA聚合酶I或Tma DNA聚合酶中影響3』-5』核酸外切酶活性的胺基酸進行的鑑定加上本文的教導，可以基於序列排列對其它的家族A DNA聚合酶中影響3』-5』核酸外切酶活性的胺基酸進行鑑定。保守序列基元Exo I、Exo II、Exo IIa和ExoIII如圖8所示。因此，在一個實施方案中，本發明提供了一種具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的突變體熱穩定或熱激活家族A DNA聚合酶。在另一個實施方案中，具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶在Exo I、Exo II、Exo IIa或Exo III中具有一個突變。在另一個實施方案中，該突變位於Exo I、Exo II或Exo III中。
根據本發明，已經鑑定了許多具有3』-5』核酸外切酶活性被減弱的DNA聚合酶的嗜熱種，代表性的真細菌種包括海棲熱袍菌(Thermotoga maritima)、那不勒斯棲熱袍菌(Thermotoga neapolitina)，參見，如美國專利No.6,077,664；6,015,668；6,001,645和5,912,155，非洲棲熱腔菌(thermosiphoafricanus)，參見，如5,968,799；Hot Spring family A。
通過對比其胺基酸序列可以鑑定這些DNA聚合酶內的相應胺基酸和區域。相應既指序列間一致的(保守的)胺基酸，也指那些不一致，但將其對比排列使總體序列達到相似性最大化的胺基酸。
利用這種對比法，本領域的普通技術人員能夠檢測A家族的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶中那些與上文所討論的Tma DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能區或關鍵殘基相應的殘基。因此，在一個實施方案中，本發明提供了一種突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，該聚合酶在相應於Tma的L329殘基的殘基處具有一個突變。在另一個實施方案中，相應於Tma的L329殘基的該殘基突變為丙氨酸。在另一個實施方案中，本發明提供了一種突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，該聚合酶在相應於Tma的D389殘基的殘基處具有一個突變。在另一個實施方案中，相應於Tma的D389殘基的該殘基突變為穀氨酸。在另一個實施方案中，本發明提供了一種突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，該聚合酶在相應於Tma的Q384殘基的殘基處具有一個突變。在另一個實施方案中，相應於Tma的Q384殘基的該殘基突變為丙氨酸。在另一個實施方案中，本發明提供了一種突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，該聚合酶在相應於Tma的N385殘基的殘基處具有一個突變。在另一個實施方案中，相應於Tma的N385殘基的該殘基突變為丙氨酸。在另一個實施方案中，本發明提供了一種突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，該聚合酶在相應於Tma的Q385和N385殘基的殘基處具有突變。在另一個實施方案中，相應於Tma的Q384和N385殘基的各個殘基突變為丙氨酸。
嗜熱真細菌的其它種已經被鑑定，並保藏在美國典型培養物保藏中心(ATCC，10801 University Boulevard，Manassas，VA 20110-2209)和德意志微生物保藏中心(DSM，Macheroder Weg 1b，D-38142 Braunschweig，Germany)。如同下文的描述，DNA聚合酶及編碼這些酶的基因可以用常規的方式從保藏的菌株中分離得到並測序。利用如GAP程序(Accelrys，Madison，WI)，對具有Tma DNA聚合酶的胺基酸序列的嗜熱真細菌A家族DNA聚合酶的胺基酸序列進行的常規序列對比，使得嗜熱真細菌的DNA聚合酶序列能夠用來產生本發明的突變DNA聚合酶。
本發明的另一個方面，具有3』-5』核酸外切酶活性的商業上可用的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶被用來製備具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的突變熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶。具有相當高的3』-5』核酸外切酶活性的商業上可用的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的例子包括VENTR和DEEPVENTRDNA聚合酶(New England Biolabs，Beverly MA)和Pfu DNA聚合酶(Stratagene，San Diego，CA)。
另一個方面，本發明的突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶來源於一種在嗜溫微生物中天然發現的DNA聚合酶，該聚合酶已經被突變或改造成熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，參見，例如Sanchez-Ruiz等，2001，TrendsBiotechnol.19132-35；Fonta，1991，Curr Opin Biotechnol.2551-60；Nosoh等，1990，Trends Biotechnol.816-20；Pace，1990，Trends Biotechnol.893-98和Peters，1998，Science 281368-69。在一個實施方案中，該聚合酶是家族A DNA聚合酶。在另一個實施方案中，該嗜溫微生物是嗜溫真細菌。在另一個實施方案中，該嗜溫真細菌是大腸桿菌，參見villobrandt deng，2000，Protein Eng.9645-54。
2、本發明的嵌合蛋白另一個方面，本發明提供了一種具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的嵌合的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，所述的聚合酶含有一個氨基末端部分和一個羧基末端部分，其中的氨基末端部分衍生於第一DNA聚合酶的氨基末端部分，羧基末端部分衍生於第二DNA聚合酶。在一個實施方案中，所述的具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶含有一個氨基末端部分和一個羧基末端部分，其中氨基末端部分衍生於第一熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的氨基末端部分，羧基末端部分衍生於第二熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，所述的第二聚合酶優選的是具有3』-5』核酸外切酶活性的聚合酶。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，所述的氨基末端和/或羧基末端來源於棲熱菌屬的一種DNA聚合酶。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，所述的氨基末端和/或羧基末端來源於棲熱袍菌屬的一種DNA聚合酶。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，所述的氨基末端和/或羧基末端來源於棲熱菌屬的一種DNA聚合酶，另一個末端部分來源於棲熱袍菌屬的一種DNA聚合酶；例如，在一個實施方案中，該氨基末端部分來源於棲熱菌屬的一種DNA聚合酶，羧基末端部分來源於棲熱袍菌屬的一種DNA聚合酶。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，氨基末端部分來源於棲熱菌屬並含有5』-3』核酸外切酶功能區，羧基末端部分來源於棲熱袍菌屬並含有3』-5』核酸外切酶功能區和聚合酶功能區。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，氨基末端部分來源於棲熱菌屬並含有5』-3』核酸外切酶功能區，且與來自棲熱菌屬的DNA聚合酶的相應氨基末端部分具有高於約80％的序列同一性，羧基末端部分與來自棲熱袍菌屬的DNA聚合酶的相應羧基末端部分具有高於約80％的序列同一性。在另一個實施方案中，所述的棲熱菌屬是Thermus sp.Z05，所述的棲熱袍菌屬是海棲熱袍菌。在另一個實施方案中，嵌合的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶含有圖4的胺基酸序列，該序列被圖中所示的一個或多個突變修飾。在另一個實施方案中，嵌合的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶含有圖5的胺基酸序列，該序列被圖中所示的一個或多個突變修飾。在另一個具體實施方案中，具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的嵌合的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶含有一個氨基末端部分、一個中間部分和一個羧基末端部分。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，氨基末端部分含有5』-3』核酸外切酶功能區。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，中間部分含有3』-5』核酸外切酶功能區。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，羧基末端部分含有聚合酶功能區。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，羧基末端部分和氨基末端部分衍生於來自棲熱菌屬的聚合酶。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，氨基末端和/或羧基末端與來自棲熱菌屬的聚合酶的相應氨基和/或羧基末端部分具有高於80％的序列同一性。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，中間部分衍生自來源於棲熱袍菌屬的聚合酶。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，中間部分與相應的來自棲熱袍菌屬的聚合酶具有高於80％，但低於100％的序列同一性。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，羧基末端部分和氨基末端部分衍生自來源於棲熱菌屬的聚合酶，中間部分來源於棲熱袍菌屬。在另一個實施方案中，在具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的所述嵌合DNA聚合酶中，棲熱菌屬是Thermus sp.Z05，棲熱菌屬是海棲熱袍菌。在另一個實施方案中，嵌合的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶含有圖6的胺基酸序列，該序列被圖中所示的一個或多個突變修飾。在另一個實施方案中，嵌合的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶含有圖7的胺基酸序列，該序列被圖中所示的一個或多個突變修飾。
另一個方面，具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的嵌合DNA聚合酶含有得自兩種或兩種以上的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的序列。在一個實施方案中，該嵌合聚合酶在其N末端含有一個衍生自來源於第一菌株的DNA聚合酶的5』-3』核酸外切酶功能區，在其C末端含有一個DNA聚合酶功能區和一個衍生自來源於第二菌株DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶功能區。在另一個實施方案中，第一菌株和第二菌株是細菌菌種。在另一個實施方案中，第一菌株和第二菌株是嗜熱菌種。在另一個實施方案中，第一菌株是棲熱菌種。在另一個實施方案中，棲熱菌種是水生棲熱菌(Thermus aquaticus)(Taq)。在另一個實施方案中，棲熱菌種是Thermus flavus(Tfl)。在另一個實施方案中，棲熱菌種是嗜熱棲熱菌(Thermus thermophilus)(Tth)。在另一個實施方案中，棲熱菌種是棲熱菌種Z05(TZ05)。在另一個實施方案中，棲熱菌種是Thermus caldofilus species17(Tsps17)。在另一個實施方案中，棲熱菌種是Thermus caldofilus(Tca)。在另一個實施方案中，第二菌株是棲熱袍菌屬。在另一個實施方案中，棲熱袍菌屬是海棲熱袍菌(Tma)。在另一個實施方案中，第一菌株是TZ05，第二菌株是Tma。
本發明的另一方面，具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的嵌合的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶含有得自一種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶和得自另一種蛋白的序列，其中得自另一種蛋白的序列給予嵌合蛋白一種有益屬性。在一個實施方案中，該有益屬性影響嵌合蛋白的表達、純化、穩定性、半衰期、對蛋白酶的敏感性、翻譯後修飾、酶學活性或熱穩定性。
來自棲熱菌屬菌種的DNA聚合酶與Tma DNA聚合酶在整體結構上是相似的，在這些DNA聚合酶中，該酶的5』核酸酶和DNA聚合酶活性存在於該蛋白的不連續區域(活性區)。表1列出了有代表性的棲熱菌屬DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶和Tma DNA聚合酶的可能的活性區。可以參見美國專利No.5,420,029。Tma DNA聚合酶中編碼3』-5』核酸外切酶活性的區域與TaqDNA聚合酶中的相應區域在長度上的差異導致或相應於TaqDNA聚合酶中3』-5』核酸外切酶活性的缺乏。表1活性區(大致的胺基酸位點)5』-3』外切3』-5』外切 聚合酶Taq DNA聚合酶1-289 --- 423-832Tma DNA聚合 1-291 292-484 485-893酶棲熱菌屬DNA聚合酶與Tma DNA聚合酶間存在相當大的胺基酸序列相似性，例如，利用默認的參數值通過GAP電腦程式(Accelrys，Madison，WI)比較有代表性的棲熱菌屬DNA聚合酶，TaqDNA聚合酶和Tma DNA聚合酶的胺基酸序列，表明一致的胺基酸序列大約佔整個胺基酸序列的44％，相似的胺基酸序列大約佔整個胺基酸序列的66％。
由於Tma與棲熱菌屬DNA聚合酶的總體結構和序列的相似性，因此可以構建Tma/棲熱菌屬嵌合酶，該嵌合酶保留了總體結構和Tma DNA聚合酶中存在的活性區域。在一個實施方案中，該嵌合酶含有Tma DNA聚合酶的C末端區域和棲熱菌屬DNA聚合酶的N末端區域。在另一個實施方案中，本發明的嵌合酶相當於一種突變的Tma DNA聚合酶，其中的5』-3』核酸外切酶功能區已經被棲熱菌屬DNA聚合酶的相應區域替換。該「相應區域」在這兒是通過胺基酸序列對比定義的，如同美國專利No.6,228,628中的描述。
本發明的另一個方面，來自Tma DNA聚合酶的區域的第一個胺基酸開始於這樣的胺基酸，該胺基酸緊接著與棲熱菌屬DNA聚合酶序列的最後一個胺基酸相應的胺基酸，並含有Tma DNA聚合酶序列的其它部分(直到第893位胺基酸)。Tma DNA聚合酶的完整胺基酸序列在圖1A中被提供(SEQ ID NO85)。優選地，將來自棲熱菌屬DNA聚合酶的胺基酸序列與來自Tma DNA聚合酶的胺基酸序列在這樣一個位點連接，在該位點兩個胺基酸序列是一致的或相似的。例如，一個實施方案由來自TaqDNA聚合酶的胺基酸1-190和來自TmaDNA聚合酶的胺基酸191-893構成。Tma DNA聚合酶的胺基酸190與TaqDNA聚合酶的胺基酸190一致，嵌合酶的Tma DNA聚合酶部分開始於下一個胺基酸，即胺基酸191。
在這兩種DNA聚合酶相一致的區域中，來自於棲熱菌屬DNA聚合酶的最後一個胺基酸的確定在該區域內是任意的。例如，因為在TaqDNA聚合酶和Tma DNA聚合酶中胺基酸191和192是相同的(且在棲熱菌屬DNA聚合酶中是保守的)，所以含有TaqDNA聚合酶的胺基酸1-190的嵌合蛋白就不能與含有TaqDNA聚合酶的胺基酸1-191或1-192的嵌合蛋白區分開。考慮到該酶的原始來源，實施例中所描述的本發明的具體實施方式
含有TaqDNA聚合酶的胺基酸1-190。
本發明的另一個方面，該嵌合DNA聚合酶由嵌合基因編碼，在該嵌合基因中，編碼Tma DNA聚合酶序列的區域至少通過大約存在於全長Tma DNA聚合酶基因的密碼子133-137處的另一個核糖體結合位點，優選地通過甲硫氨酸140起始密碼子，該區域被編碼來自棲熱菌屬DNA聚合酶的相應區域的基因序列替換。在全長Tma DNA聚合酶基因中這種可選擇性的核糖體結合位點和起始密碼子的存在使得從胺基酸140處起始的截短的Tma DNA聚合酶優先表達。正如下文所描述的那樣，Tma DNA聚合酶基因的這個區域的替換有利於全長嵌合蛋白的有效表達。因此，在本發明的嵌合DNA聚合酶的一個實施方案中，來自棲熱菌屬DNA聚合酶的N末端區域替換了Tma DNA聚合酶的一個區域，該區域至少包含了胺基酸137，優選地包含了胺基酸140。
每種棲熱菌屬DNA聚合酶與Tma DNA聚合酶的胺基酸1-137相應的區域可以根據美國專利No.6,228,628所提供的胺基酸序列對比法得到。例如，TaqDNA聚合酶與Tma DNA聚合酶的胺基酸1-137相應的區域是胺基酸1-142，TaqDNA聚合酶與Tma DNA聚合酶的M140相應的胺基酸是L145。因此，N末端區域來自TaqDNA聚合酶的具體實施方式
至少含有Tma DNA聚合酶的胺基酸1-142，優選為胺基酸1-145。相似地，對於N末端區域來自另一種棲熱菌屬DNA聚合酶的具體實施方式
來說，棲熱菌屬DNA聚合酶與TmaDNA聚合酶的胺基酸1-137和140相應的區域可以根據美國專利No.6,228,628所提供的胺基酸序列對比法得到。
本領域的普通技術人員能夠理解次要的突變、插入或缺失可以被導入到一個DNA聚合酶中而不改變該酶功能上的性質，在實現任何意圖和目的上該突變酶與未突變酶是等同的。例如，我們知道缺失TaqDNA聚合酶的幾個N末端胺基酸並不改變該酶的功能屬性。相似地，我們知道在許多胺基酸位點進行的取代突變並不產生本質的影響。根據本發明的目的，含有不改變該酶功能上的性質的次要突變的DNA聚合酶等同於未突變的DNA聚合酶。
3、熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的混合物另一個方面，本發明提供了一種含有許多種熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的混合物，其中至少有一種聚合酶具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性，如同上文的描述。在一個實施方案中，至少有一種聚合酶具有基本失活的3』-5』核酸外切酶活性。
另一個方面，利用下文實施例3中所描述標準測定法(Standard Assay)測定，該混合物的3』-5』核酸外切酶活性大約為6.5單位/pmol或更低，但高於0單位/pmol。在一個實施方案中，該混合物的3』-5』核酸外切酶活性大約在0.4-3.0單位/pmol之間。在另一個實施方案中，該混合物的3』-5』核酸外切酶活性大約在0.4-1.6單位/pmol之間。
另一個方面，混合物中模板依賴性5』-3』DNA聚合酶活性與3』-5』核酸外切酶活性的比例大約為1-100，其中用實施例3中所描述的聚合酶測定法測定聚合酶活性，用下文實施例3中所描述的標準測定法測定3』-5』核酸外切酶活性。在一個實施方案中，混合物中模板依賴性5』-3』DNA聚合酶活性與3』-5』核酸外切酶活性的比例大約為3.0-50。在另一個實施方案中，混合物中模板依賴性5』-3』DNA聚合酶活性與3』-5』核酸外切酶活性的比例大約為6.0-25.0。
4、本發明的DNA聚合酶的優點本發明的突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶比文獻中所描述的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶具有顯著的進步。具體地，本發明的DNA聚合酶提供如下性能組合(1)與野生型的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶相比減少了引物的降解；(2)與野生型的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶相比能更有效地利用dNTP，減少無產物的「空」反應；(3)與沒有3』-5』核酸外切酶活性的野生型熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶相比能增加複製的保真度；(4)與熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶混合物相比減少了操作過程和費用；(5)在重組表達系統中DNA聚合酶能被容易地並高效地表達，因此有利於該酶的商業化生產；和(6)相對於熱穩定的高保真的古細菌(archae proofreading)DNA聚合酶，本發明的DNA聚合酶能容易地與三磷酸核苷類似物結合。
本發明的DNA聚合酶所具有的這些屬性的組合在PCR中特別有用，並產生相對改進的效果。
(1)減少引物的降解在體外使用具有強烈ssDNA3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶時，該聚合酶會降解引物。這會影響反應的兩個方面第一，這會降低反應中的引物濃度；第二，這會部分地產生不同長度的降解引物。由於引物對其靶序列的特異性是由該引物的序列和長度直接決定的，截短的引物對其特定靶序列的特異性就可能降低。同時這還會導致目標序列複製降低和假序列或非目標序列複製增加。加熱使DNA鏈分離、雙鏈變性，在接著進行的以其作為模板的聚合反應循環中，ssDNA3』-5』核酸外切酶活性的存在還可能導致合成鏈的末端長度變小。因為引物與這些末端結合，所以它們長度的減小也就減小了其與引物結合的長度，這很可能會導致目的PCR產物量的減少和假PCR產物量的增加。這些影響對於PCR特別麻煩，因為擴增的靶序列與擴增的假序列的比例的減小會導致反應的特異性降低，從而降低目標檢測的敏感性。
本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶因為具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性水平而克服了這個問題。
(2)減少空反應熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的dsDNA核酸外切酶活性可以導致到達線性模板末端的聚合酶「空轉」。情況是這樣的它通過重複的聚合循環到達模板的末端，然後水解合成鏈剛剛完成的末端殘基。這種聚合和水解循環降低了反應混合物中的dNTP濃度，增加了反應混合物中的焦磷酸濃度，降低了後續循環的反應效率，於是降低了產物的產量。
本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶因為具有減弱的dsDNA 3』-5』核酸外切酶活性而克服了這個問題。在一個實施方案中，本發明的突變聚合酶具有3』-5』核酸外切酶活性，利用實施例3的單鏈DNA底物和標準測定法進行測定，該活性大約是野生型酶活性的0.1％-65％。在另一個實施方案中，本發明的突變聚合酶所具有的3』-5』核酸外切酶活性大約是野生型酶活性的1％-30％。在另一個實施方案中，本發明的突變聚合酶所具有的3』-5』核酸外切酶活性大約是野生型酶活性的3％-20％。在另一個實施方案中，本發明的突變聚合酶所具有的3』-5』核酸外切酶活性大約是野生型酶活性的3％-10％。在另一個實施方案中，本發明的突變聚合酶所具有的3』-5』核酸外切酶活性大約是野生型酶活性的3％-5％。
(3)高水平的保真度為了克服熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶3』-5』核酸外切酶活性的有害影響，以前的嘗試是使用沒有或基本沒有3』-5』核酸外切酶活性的突變聚合酶，或者使用該活性天然缺失的聚合酶。這種方法具有其固有的問題，沒有3』-5』核酸外切酶活性的聚合酶比具有該活性的聚合酶產生更高的錯誤率。例如，對於PCR的某些應用，克隆擴增序列保持低的錯誤率是重要的。另外，3』-5』核酸外切酶活性的存在提高了對更長的靶物進行擴增和/或逆轉錄酶效率，因為核苷酸的錯誤插入能被糾正。因此，完全缺乏校讀活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶較不適合於這些應用。
本發明通過提供分離的具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶而克服了這個問題。如今已經證實減弱水平的3』-5』活性通過有效去除錯誤插入的dNTP能足夠提高較長模板的PCR效率，因此利於使用較長的PCR和RT-PCR。
(4)減少操作被用於克服與強烈的3』-5』核酸外切酶活性相關的問題的另一個方法是將具有野生型水平校讀活性的聚合酶與基本上沒有校讀活性的聚合酶混合。通過調節混合物中這兩種聚合酶的比例我們可以得到校讀活性與聚合酶活性的理想比例。雖然該方法已經被成功運用，但有其自身的缺點。對於每種酶的每種製劑必須準確測定這兩種酶的3』-5』核酸外切酶活性和聚合酶活性，然後計算所需每種酶的量。而且，對於每一種反應，必須加入正確量的每種酶。這個方法還要求這兩種酶具有相當的貯藏穩定性。因此，使用酶混合物進行反應需要更多的操作，這樣就增加了費用，降低了效率。
本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶克服了這些問題，在一個實施方案中，本發明提供了一種具有理想校讀活性與聚合酶活性比例的單個聚合酶。在每一個反應中只需加入一種酶，出乎意料地，我們還發現當使用本發明的酶代替酶混合物時需要的酶總量減少。
(5)表達的效率如上文所述，本發明的一個方面提供了一種與突變的Tma DNA聚合酶相應的嵌合酶其中的5』核酸酶功能區已經被來自棲熱菌屬的DNA聚合酶的相應區域替換。該酶由與突變的Tma DNA聚合酶基因相應的嵌合基因表達，其中編碼5』核酸酶功能區的基因的區域已經被來自棲熱菌屬的DNA聚合酶基因的相應區域替換。該嵌合基因的一個非常大的優點是它能在重組表達系統中比TmaDNA聚合酶基因更有效地表達全長DNA聚合酶。
由於截短形式的蛋白的優先表達，全長DNA聚合酶從含有全長天然TmaDNA聚合酶基因序列的重組表達系統表達是有問題的，參見美國專利No.5,420,029。稱為Met140 Tma的該截短蛋白由全長蛋白的胺基酸140-893組成，從位點140處的甲硫氨酸開始翻譯產生。在密碼子133-137處推斷的核糖體結合位點的存在進一步表明了該截短蛋白產生於內部甲硫氨酸處開始的翻譯。Met140Tma截短蛋白的優先表達使全長Tma DNA聚合酶的表達和純化產生相當大的困難。
在本發明的一個實施方案中，嵌合DNA聚合酶基因中含有棲熱菌屬DNA聚合酶基因序列，其相應於至少含有大約在全長Tma DNA聚合酶基因的密碼子133-137處的另一個核糖體結合位點，優選地含有內部起始密碼子，即密碼子140處的區域。於是，該Tma DNA聚合酶基因序列中直到包含核糖體結合位點和，優選地，負責Met140 Tma的翻譯的起始密碼子的區域，已被棲熱菌屬DNA聚合酶基因的相應區域替換。棲熱菌屬DNA聚合酶基因的該相應區域並不提供截短蛋白的非需要的內部起始。所以，含有嵌合DNA聚合酶基因的重組表達系統專有地表達全長的嵌合DNA聚合酶。
(6)三磷酸核苷類似物的插入另一個方面，相對於熱穩定的校正古細菌DNA聚合酶(例如VENTTM，DEEPVENTTM，Pfu，Pwo，Poc，Pab，Tgo等)，本發明的熱穩定性或熱激活性校正DNA聚合酶能忍受和容易地插入三磷酸核苷類似物，如dUTP和dITP。這是因為這些聚合酶不受模板鏈中存在的dUTMP或dIMP或存在的dUTP或dITP的抑制。相反，上述熱穩定的校正古細菌DNA聚合酶或含有校正古細菌DNA聚合酶的混合物受模板鏈中存在的dUTMP或dIMP或存在的dUTP或dITP的抑制。因此，利用dUTP和dTTP或替換dTTP或利用dITP和dGTP或替換dGTP的許多優點可以利用本發明的酶，而不是古細菌熱穩定DNA聚合酶實現。參見，例如PCR ApplicationsProtocols for functional Genomics，1991，Innis等.(編)，Academic Press，San Diego，pages4，5，142和143。因此，以前所描述的古細菌DNA聚合酶或含有古細菌DNA聚合酶的混合物不能利用dUTP或dITP進行引物延伸或PCR擴增。在一個實施方案中，本發明的熱穩定和熱激活DNA聚合酶適於利用這些類似物。
5、本發明的DNA聚合酶的製備編碼Tma DNA聚合酶的基因在美國專利No.5,420,029和5,466,591中被描述，該Tma DNA聚合酶基因的核苷酸序列和編碼的蛋白的全長胺基酸序列在那裡也被描述。專利『029的實施例5中描述了起始於質粒pTma01(ATCCNo.68471，保藏於1990年11月7日，於1998年5月22再次保藏，保藏號為ATCCNo.98764)和pTma04(ATCC No.68472，保藏於1990年11月7日，於1998年5月22再次保藏，保藏號為ATCC No.98765)，含有全長Tma DNA聚合酶基因的不同質粒構建體，如質粒pTma12-1和pTma13。任何這些表達質粒都適合作為Tma DNA聚合酶基因的來源。
其它的具有3』-5』核酸外切酶活性，能突變成本發明的聚合酶的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶包括， 但不限於在美國專利No.6,077,664；6,015,668；6,001,645和5,912,155(那不勒斯棲熱袍菌)，美國專利No.6,066,483；5,874,282；5,834,253；5,747,298；6,013,451和5,830,714，美國專利No.5,882,904和5,602,011(Thermococcus barossi)，美國專利No.5,322，785和5,210,036(Thermococcus litoralis)，美國專利No.5,948,663和5,866,395；Dabrowski等，1998，Protein Expr Purif 14131-38(激烈熱球菌)，參見，例如美國專利No.5,834，285(Pyrococcus sp.GB-D)和Dabrowski(1998)(伍氏熱球菌)中描述的那些。
另一個方面，本發明的DNA聚合酶是嵌合酶，該嵌合酶含有衍生自棲熱菌屬DNA聚合酶的部分和衍生自Tma DNA聚合酶的部分。在一個實施方案中，本發明的DNA聚合酶是嵌合酶，該嵌合酶由衍生自棲熱菌屬DNA聚合酶的部分和衍生自Tma DNA聚合酶的部分構成。該嵌合酶是由嵌合基因製備的，即編碼嵌合酶的DNA，該DNA由衍生自棲熱菌屬DNA聚合酶基因的部分和衍生自Tma DNA聚合酶基因的部分構成。該嵌合基因是用分子生物學領域公知的標準基因操作技術由棲熱菌屬DNA聚合酶基因和Tma DNA聚合酶基因製得的，詳細描述見下文。
許多棲熱菌屬的DNA聚合酶的編碼基因，包括DNA聚合酶基因的核苷酸序列和編碼的蛋白的胺基酸序列都已經被描述。這些基因的許多可以從公用質粒中得到，其它棲熱菌屬的這種基因可以從宿主生物中得到，利用美國專利No.5,079,352；5,618,711；5,455,170；5,405,774和5,466,591中描述的方法，在此分別引為參考。
編碼TaqDNA聚合酶的基因在美國專利No.5,079,352和5,466,591中被描述，TaqDNA聚合酶基因的核苷酸序列和編碼的蛋白的全長胺基酸序列在那兒也被描述。專利『352的實施例V-VII描述了起始於質粒pFC83(ATCCNo.67422，保藏於1987年5月29日，於1998年5月22再次保藏，保藏號為ATCCNo.98763)和pFC85(ATCC No.67421，保藏於1987年5月29日，於1998年5月22再次保藏，保藏號為ATCC No.98762)，含有全長TaqDNA聚合酶基因的不同表達質粒構建體，如質粒pLSG1、pLSG2、pSYC1578，pLSG5和pLSG6。任何這些表達載體都適合作為TaqDNA聚合酶基因的來源。
編碼TthDNA聚合酶的基因、獲得該基因的方法和含有該基因的表達質粒在美國專利No.5,618,711和5,466,591中被描述。
編碼TZ05DNA聚合酶的基因、獲得該基因的方法和含有該基因的表達質粒在美國專利No.5,455,170和5,466,591中被描述。
編碼Tsps17DNA聚合酶的基因、獲得該基因的方法和含有該基因的表達質粒在美國專利No.5,405,774和5,466,591中被描述。
TflDNA聚合酶基因在Akhmetzjanov等，1992，Nucleic Acids Research 205839中被描述，在此全文引為參考。
TfiDNA聚合酶基因可以利用參考專利中描述的方法從ATCC43280中得到，還可參見1984，FEMS Microbiol.Lett.22149-53。
TcaDNA聚合酶基因在Kwon，1997，Mol.Cells 7264-71中被描述，核苷酸序列可以在EMBL/GenBank中獲得，登記號為No.U62584。
其它的棲熱菌屬DNA聚合酶基因可以用上文所引用的專利中描述的技術從下列ATCC保藏物中得到ATCC43814和43815，參見Alfredsson，1986，Appl.Environ.Microbiol.521313-16；ATCC27978，參見Ramaley，1970，J.Bacteriol.114556-62；1973；ibid.103527-528；ATCC31674，參見美國專利No.4,442,214和4,480,036；ATCC35948(T.ruber，參見Loginova，1984，Int.J.Syst.Bacterio1.34498-99)。在此所有的參考文獻全文引為參考。
其它的棲熱菌屬DNA聚合酶基因可以用上文所引用的專利中描述的技術從下列德意志微生物保藏中心(DSM)的保藏物中得到DSM1279(NUM2244)，參見Loginova等，1975，Izv.Akad.Nauk SSSR Ser.Biol.304-07；DSM579；DSM625(NUM2248)，參見Degryse等，1978，Arch.Microbiol.189196；DSM1279(NUM3844)，參見Loginova等，1984，Int.J.Syst.Bacteriol498-99；和DSM625(NUM1002)，參見Brock等，1969，J.Bateriol289-97。在此所有的參考文獻全文引為參考。
已經被描述的其它棲熱菌屬包括奧費氏棲熱菌(Toshimai)，參見Williams等，1996，Int.J.Syst.Bacteriol.46403-08；Tsilvanus和喜溫稍熱菌(Tchliarophilus)，參見Tenreiro等，1995，Int.J.Syst.Bacteriol.45633-39；水管致黑棲熱菌(Tscotoductus)，參見Tenreiro等，1995，ResMicrobiol.146315-24和紅色稍熱菌(T.ruber)，參見Shadrina等，1982，Mikrobiologiia 51611-15；在此所有的參考文獻全文引為參考。
根據本說明書的教導和公知技術，本領域的普通技術人員能夠用DNA聚合酶基因製備任何含有嵌合基因，適於在任何不同宿主系統中表達本發明的嵌合的DNA聚合酶的表達載體。
一個方面，本發明的嵌合酶含有來自205 DNA聚合酶的胺基酸1-291和具有合適突變而使相關的3』-5』核酸外切酶活性降低的來自Tma DNA聚合酶的胺基酸292-893。在一個實施方案中，本發明的嵌合酶由來自205 DNA聚合酶的胺基酸1-291和具有合適突變而使相關的3』-5』核酸外切酶活性降低的來自Tma DNA聚合酶的胺基酸292-893構成。這些具體實施方式
可以由Z05DNA聚合酶和Tma DNA聚合酶基因直接構建，也可以從上文所描述的保藏的質粒中得到或從宿主微生物中回收。
由於遺傳密碼冗餘，有代表性的是，大量的DNA序列編碼任何給定的胺基酸序列，在這個意義上來說，它們是等價的。正如下文所描述的，基於表達載體待插入的宿主細胞偏好的密碼子利用情況，可能期望在某個表達載體中選擇一種或另一種等價的DNA序列。本發明的意圖是包含所有編碼該嵌合酶的DNA序列。因此，本發明的嵌合基因不限於只包含來自一種野生型棲熱菌種及Tma DNA聚合酶基因的序列，還包含了編碼本發明的嵌合DNA聚合酶的任何一種DNA序列。
本發明的酶的生產是通過利用一種重組表達克隆來進行的。重組表達克隆的構建、表達克隆對宿主細胞的轉化、以及轉化後的宿主細胞在啟動表達的條件下的培養，都可以運用本領域所熟知的分子生物學技術以多種方式進行。上述各步驟的方法在下面進行一般性描述並在實施例中具體描述。
一個可操作的表達克隆通過在表達載體中將編碼序列可操作地連接於一合適的調控序列而構建。該載體可以設計在宿主細胞中自主複製或者整合到宿主細胞的染色體中。所得的克隆用來轉化合適的宿主，在適於編碼序列表達的條件下培養轉化後的宿主。從培養基或細胞中分離表達的蛋白，儘管在某些情況下蛋白的回收和純化可能不是必需的。
構建包含編碼序列和合適的調控序列的合適的克隆採用的是本領域所熟知的標準連接及酶切技術。一般地，分離的質粒、DNA序列或人工合成的寡聚核苷酸被剪切、修飾並按預期的方式再連接。如果正常青況下不存在，可以在編碼序列的末端添加合適的限制性酶切位點以有利於表達克隆的構建。
位點特異性的DNA剪切是通過用一種合適的限制性內切酶(或酶)在本領域通常理解的條件下處理並根據商業來源的限制性內切酶的製造商的具體規定來進行的。參見，例如，Amersham產品目錄(Arlington Heights，IL)，RocheMolecular Biochemicals(Indianapolis，IN)，以及New England Biolabs(Beverly，MA)。一般而言，大約1μg質粒或其它DNA用一單位的酶在大約20μl緩衝液中進行剪切；在下面的例子中，通常採用過量的限制性內切酶以保證DNA的完全消化。有代表性的是在特定酶的最佳溫度下保溫大約1-2個小時。每次保溫完畢，通過苯酚和氯仿抽提除去蛋白；之後還可以進行乙醚抽提並用乙醇沉澱從含水級分中回收DNA。如果需要，還可以運用標準技術通過聚丙烯醯胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳對剪切的片段進行大小分離。參見例如Maxam等，1980，Methods in Enzymology 65499-560。
帶有單鏈「突出」(「overhang」)末端的限制性內切酶剪切的DNA片段可以通過大腸桿菌E.coli DNA聚合酶I大片段(Klenow)在四種脫氧核苷三磷酸(dNTPs)存在的條件下進行如下處理鈍末端化(雙鏈末端)，在50mM Tris，pH 7.6，50mMNaCl，10mM MgCl2，10mM DTT及5-10μM dNTPs中，在20-25℃，保溫時間大約是15-25分鐘。即使4種dNTPs都存在，Klenow片段能夠填補5』突出末端，而消化掉突出的3』單鏈。如果需要，可以在突出末端的特性所限定的範圍內通過添加一種或多種選擇的dNTPs對其進行選擇性修補。Klenow處理後，混合物用苯酚/氯仿抽提並用乙醇沉澱。用S1核酸酶也能得到相似的結果，因為在合適的條件下用S1核酸酶處理可導致核酸任何單鏈部分的水解。
連接是在15-30μl體積中在下述標準條件和溫度下進行的20mM Tris-HCl，pH7.5，10mM MgCl2，10mM DTT，33μg/ml BSA，10-50mM NaCl，或者與40μM ATP和0.01-0.02(韋氏)單位的T4DNA連接酶在0℃連接(用於連接帶有互補單鏈末端的片段)或者與1mM ATP和0.3-0.6單位的T4DNA連接酶在14℃連接(用於平端連接)。帶有互補末端的片段的分子間連接通常在33-10014μg/ml總DNA濃度(5-100nM總末端濃度)下進行。平端分子間連接(通常採取20-30倍摩爾過量分子的接頭，可選的)在1μM總末端濃度下進行。
在載體構建中，載體片段通常由細菌或小牛腸鹼性磷酸酶(BAP或CIAP)處理以除去5』磷酸基並防止載體的再連接或再構建。BAP和CIAP的消化條件是本領域公知的，而且實驗流程通常伴隨著商業來源的BAP和CIAP酶一同出版。為了回收核酸片段，製備物用苯酚-氯仿抽提並用乙醇沉澱以除去磷酸酶並純化DNA。作為選擇，如果存在合適的酶切位點，可以在連接前後用限制性內切酶消化以阻止不希望的載體片段的再連接。
質粒構建體的正確連接可以運用本領域已知的任何合適的方法來驗證。在下面列舉的構建步驟中，質粒構建體的正確連接已經被證實，首先用連接混合物轉化合適的宿主，比如大腸桿菌菌株DG101(ATCC 47043)或DG116(ATCC53606)。成功的轉化子通過氨苄青黴素、四環素或其它抗生素抗性或敏感性或者通過其它標記來篩選，視質粒構建體的模式而定，這是本領域公知的。然後根據Clewell等，1969，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 621159的方法從轉化子中製備質粒，可選擇地隨之進行氯黴素擴增，參見Clewell，1972，J.Bacteriol.110667。可選擇地，質粒DNA可以利用Bethesda Research Laboratories出版物Focus 5(2)第11頁的「酸鹼」抽提法製備，而且通過將該實驗流程中的第12步到第17步替換為CsCl/溴化乙錠超速離心DNA可以獲得非常純的質粒DNA。作為另一種可選擇的方法，商業來源的質粒DNA分離試劑盒，比如HISPEEDTM，QIAFILTERTM和QIAGEN質粒DNA分離試劑盒(Qiagen，Valencia CA)可以根據零售商提供的實驗流程來使用。分離的DNA可以通過限制性內切酶消化和/或Sanger等的雙脫氧方法測序進行分析，Sanger等，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 745463，該方法在Messing等，1981，Nuc.Acids Res.9309中有進一步的描述，或者通過Maxam等的方法進行分析，Maxam等，1980，Methods in Enzymology 65499。
調控序列、表達載體和轉化方法都有賴於所用的表達基因的宿主細胞的類型。一般說來，原核、酵母、昆蟲或哺乳動物細胞都可用作宿主。原核宿主通常是生產重組蛋白最有效和最方便的，所以優選用來表達所述的蛋白。
表達重組蛋白最常使用的原核細胞就是大腸桿菌。不過，也可以用大腸桿菌以外的微生物菌株重組表達蛋白，例如芽孢桿菌屬(bacilli)，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，假單胞桿菌屬(Pseudomonas)和沙門氏桿菌屬(Salmonella)的不同菌種，以及其它細菌菌株。在這樣的原核系統中，一般使用包含複製位點和來自宿主或與宿主相容的菌種調控序列的質粒載體。
為了表達在大多數細菌啟動子控制下的構建體，大腸桿菌K12株MM294可以用來作為宿主，在大腸桿菌基因庫中心(Genetic Stock Center)獲取號為GCSC#6135。為了表達帶有PLNRBS或PLT7RBS調控序列的表達載體，可以使用大腸桿菌K12株MC1000λ溶原性細菌，N7N53cI857 SusP80，ATCC 39351。於1987年4月7日保藏在ATCC的大腸桿菌DG116(ATCC 53606)和於1985年3月29日保藏在ATCC的大腸桿菌KB2(ATCC 53075)也是很有用的宿主細胞。至於M13嗜菌體重組體，使用的是易受嗜菌體侵染的大腸桿菌菌株，比如大腸桿菌K12株DG98(ATCC 39768)。DG98株於1984年7月13日保藏在ATCC。
舉例來說，如Bolivar等，1977，Gene 295的描述，大腸桿菌有代表性地由pBR322衍生物轉化。質粒pBR322含有氨苄青黴素和四環素抗性基因。這些藥物抗性標記在構建所需的載體時要麼被保留要麼被破壞，以有助於檢測所需的重組物的存在。通常採用的原核調控序列，例如用於轉錄起始的啟動子，任選地帶有一個操縱子，連同一個核糖體結合位點序列，包括β-內醯胺酶(青黴素酶)和乳糖(lac)啟動子系統，見Chang等，1977，Nature 1981056；色氨酸(trp)啟動子系統，見Goeddel等，1980，Nuc.Acids Res.84057；以及λ來源的PL啟動子，見Shimatake等，1981，Nature 292128；和N基因核糖體結合位點(NRBS)。一種可轉座的調控系統序列盒在美國專利號4711845中闡述，該專利在1987年12月8日公開。該序列盒包含一個可操作地連接於NRBS的PL啟動子，而NRBS依次位於第3種DNA序列上遊，並帶有至少一個限制性酶切位點，以使其在NRBS序列的3』端6個鹼基對的範圍內被剪切。同樣有用的是Chang等在歐洲專利公開No.196864中描述的磷酸酶A(phoA)系統，發表於1986年10月8日。不過，任何已有的與原核細胞相容的啟動子系統都可以用來構建本發明的表達載體。
除了細菌之外，真核微生物，比如酵母，也可以用來作為重組宿主細胞。實驗室菌株釀酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)、貝克氏酵母是最常用的，儘管通常也使用一定數目的其它菌株。儘管使用2μ複製起始原點的載體很常見，見Broach，1983，Meth.Enz.101307，其它適於酵母表達的質粒載體也是已知的，參見Stinchcomb等，1979，Nature 28239；Tschempe等，1980，Gene 10157；及Clarke等，1983，Meth.Enz.101300。酵母載體的調控序列包括合成糖酵解酶的啟動子，見Hess等，1968，J.Adv.Enzyme Reg.7149；Holland等，1978，Biotechnology 174900；及Holland等，1981，J.Biol.Chem.2561385。本領域已知的另外的啟動子包括3-磷酸甘油激酶的啟動子，見-Hitzeman等，1980，J.Biol.Chem.2552073，以及其它糖酵解酶的啟動子，比如甘油醛3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構酶、磷酸葡萄糖異構酶以及葡萄糖激酶。其它的具有通過生長條件調控轉錄這一額外優勢的啟動子是乙醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關的降解酶、以及負責麥芽糖和半乳糖利用的酶(Holland，同上)的啟動子區域。
當終止子序列置於編碼序列的3』末端時也可以用來增強表達。這樣的終止子被發現位於酵母來源的基因的編碼序列的3』端未翻譯區。任何一個包含與酵母相容的啟動子、複製原點及其它調控序列的載體都適於用來構建酵母表達載體。
該編碼序列也可以在來源於多細胞有機體的真核宿主細胞培養物中予以表達。參見CellTissue CultureLaboratory Procedures，Wiley，Doyle等編輯(1993)。可用的宿主細胞系包括COS-7、COS-A2、CV-1、鼠細胞比如鼠骨髓瘤細胞N51和VERO、HeLa細胞、以及中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。用於這些細胞的表達載體一般包括能與哺乳動物細胞相容的啟動子和調控序列，比如象常用的來自猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期啟動子，見Fiers等，1978，Nature 273113，或其它病毒啟動子例如來源於多瘤病毒、腺病毒2、牛乳頭狀瘤病病毒(BPV)、或禽類肉瘤病毒的啟動子，或免疫球蛋白啟動子及熱休克啟動子。一個利用BPV載體系統在哺乳動物系統中表達DNA的系統已在美國專利No.4419446中公開。對該系統的修飾在美國專利No.4601978中予以描述。關於哺乳動物細胞宿主系統轉化的一般概念已由Axel在美國專利No.4399216中予以描述。「增強子」區域在優化表達中也很重要；通常，它們是位於啟動子區域上遊的一些序列。如果需要，複製原點可自病毒來源獲得。不過，整合到染色體中是真核細胞中DNA複製的常見機制。
植物細胞也可用作宿主，而且與植物細胞相容的調控序列也可使用，例如胭脂鹼合酶啟動子和腺苷醯化信號序列，見Depicker等，1982，J.Mol.Appl.Gen.1561。利用杆狀病毒載體提供的調控序列使用昆蟲細胞的表達系統也已有描述，見Miller等，Genetic Engineering(1986)，Setlow等，PlenumPublishing，Vol.8，pp.277-97。基於昆蟲細胞的表達可以在草地夜蛾(Spodopterafrugipeida)中實現。上述系統也能成功地生產重組酶。
依據所用的宿主細胞，利用適合這些細胞的標準技術進行轉化。使用氯化鈣進行的鈣處理，如Cohen，1972，在Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110中所描述的，被用於原核細胞及其它具有堅固的細胞壁屏障的細胞。用根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)進行的感染被用於某些植物細胞，見Shaw等，1983，Gene 23315。至於哺乳動物細胞，優選Grahamet等，1978，Virology 52546的磷酸鈣沉積法。酵母的轉化是根據Van Solingen等，1977，J.Bact.130946和Hsiao等，1979，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 763829的方法進行的。
修飾編碼本發明的酶的DNA序列而不改變其所編碼的蛋白的胺基酸序列以提供一個，比方說，更適應於宿主細胞密碼子利用的序列是可能的。對初始的5-6個密碼子進行這樣的修飾可以提高表達效率。為提高表達效率而修飾過而又編碼相同的胺基酸序列的DNA序列被認為是等價的，全都包括在本發明之中。
大量引物指導的位點特異性的誘變方法已經存在，且為本領域熟知的，參見Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989，第二版，第15.51章，「寡核苷酸介導的誘變」，在此引用作為參考。可用聚合酶鏈式反應(PCR)進行位點特異性誘變。在本領域另外一個標準技術中，用人工合成的編碼所需突變的寡核苷酸作為引物，以指導合成單鏈載體中所含的核酸序列的互補鏈，例如pBSM13+衍生物，作為模板用以合成突變引物的延伸產物。突變DNA轉化進宿主細菌，轉化的細菌培養物塗平板並被鑑定。對修飾載體的鑑定可以包括將篩選的轉化子的DNA轉移到硝化纖維素膜或其它膜上，然後將「揭膜」(lifts)與酶促合成的突變引物在特定的溫度下雜交，該溫度允許與修飾後序列準確配對的雜交但是防止與原始未突變鏈雜交。隨後培養包含了能與探針雜交的DNA的轉化子(該DNA的序列一般通過序列分析加以確認)，並作為修飾後的DNA的保藏庫。
一旦蛋白在重組宿主細胞中表達了，就可能希望純化該蛋白。很多純化步驟都可以用來純化本發明的重組熱穩定或熱激活的DNA聚合酶。例子包括美國專利No.4889818、5352600和5079352中描述的純化Taq DNA聚合酶的方法；美國專利No.5618711和5310652中描述的純化來自嗜熱棲熱桿菌(Thermusthermophilis)(Tth)DNA聚合酶的方法；美國專利No.5374553和5420029中描述的純化Tma DNA聚合酶的方法。純化這些DNA聚合酶的方法在美國專利No.5466591中也有描述。所有上述專利都在此引用作為參考。
本發明的一個方面，所述的DNA聚合酶在大腸桿菌，一種中溫菌宿主細胞中表達。由於大腸桿菌宿主的大多數蛋白是熱敏的，所述的重組熱穩定或熱激活的DNA聚合酶可以通過熱失活裂解物原液而大量富集。該步驟是在存在足夠量的鹽(有代表性地是0.2-0.4M硫酸銨)的條件下進行的，以降低DNA聚合酶與其它細胞裂解蛋白相互間的離子作用。在一個實施方案中，純化的DNA聚合酶的活性是通過下面實施例3中描述的方法進行分析的。
為了保持長期穩定，純化的DNA聚合酶必須儲存在含有一種或多種非離子型聚合物洗滌劑的緩衝溶液中。這樣的洗滌劑通常具有大約100到25000優選大約4000到200000道爾頓範圍的分子量，並在pH值從大約3.5到大約9.5優選從大約4到8.5時使酶穩定。所述洗滌劑的例子包括那些在McCutcheon’sEmulsifiers ＆ Detergents北美版(1983)的295-298頁具體給出的，由MCPublishing公司McCutcheon分部出版，地址175 Rock Road，Glen Rock，NJ(USA)，其公開的全部內容在此引用作為參考。在一個實施方案中，洗滌劑選自乙氧基脂肪醇醚和月桂醚、乙氧基烷基苯酚、辛基苯氧基聚乙氧基乙醇化合物、修飾的乙氧基和/或丙氧基直鏈醇、聚乙二醇一油酸化合物、多乙氧基醚化合物、以及酚脂肪醇醚。在另一個實施方案中，洗滌劑選自Tween 20TM，來自ICI Americas Inc.(Wilmington，DE)公司的一種多聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐甘油一月桂酸酯，以及IconolTMNP-40，來自BASF Wyandotte Corp.(Parsippany，NJ)公司的一種乙氧基烷基苯酚(壬基)。
6.本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的用途本發明的熱穩定或熱激活酶可以用於必需或需要具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的任何目的。在一個實施方案中，本發明的酶被用於PCR。使用該PCR的應用例子包括，例如，直接克隆基因組DNA或cDNA、體外誘變和DNA的設計、法醫樣品的遺傳指紋圖譜分析、傳染因子存在的鑑定、產前遺傳病的診斷、等位基因序列多樣性的分析、RNA轉錄本結構的分析、基因組足跡分析法、以及基因組DNA和cDNA的直接核苷酸序列測序。參見例如Current Protocols In Molecular Biology，2001，Ausubel等(編輯)，John Wiley ＆ Sons，第15章；以及PCR Strategies，1995，Innis等(編輯)，AcademicPress，Inc.，在此全文引用作為參考。
7.試劑盒本發明的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶適於製備試劑盒。運用公知的技術，包含本發明突變DNA聚合酶的試劑盒能夠用於可檢測的標記DNA分子、測序DNA、或擴增DNA分子，根據組成試劑盒的內含物而定。這樣的試劑盒可以包含一個分隔成室的承載裝置，以在密閉的空間內接收一個或多個諸如瓶、試管及其它類似的容器裝置。每一個這樣的容器裝置盛有進行DNA測序、DNA標記或DNA擴增所必需的成分或成分混合物。
用於DNA測序的試劑盒可以包含一定數目的容器裝置。例如，第一個容器裝置可以，包含本發明的足夠純的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶樣品，第二個容器裝置可以包含一種或數種類型的合成DNA模板的互補DNA分子所需的核苷酸，第三個容器裝置可以包含一種或數種不同類型的雙脫氧核苷三磷酸。除了上述的容器裝置之外，該試劑盒還可以包括含有一種或數種DNA引物的額外的容器裝置。
用於DNA擴增的試劑盒可以包含，比方說，含有本發明的足夠純的突變DNA聚合酶的第一個容器裝置，以及含有單獨類型的核苷酸或核苷酸混合物的一個或數個額外的容器裝置。擴增DNA的試劑盒中可以包括、也可以不包括各種引物。
如果需要，本發明的試劑盒還可以包括含有可檢測的標記核苷酸的容器裝置，該標記的核苷酸可用於DNA分子的合成及測序。可選多種標記物中的一種來檢測這樣的核苷酸。說明性的標記物包括，但不局限於，放射性同位素、螢光標記物、化學發光標記物、生物發光標記物和酶標記物，以及其它任何一種直接或間接標記核苷酸或核酸的標記物。
在以下非限制性的實施例中，除非另外指出，所有百分比對於固體而言均為重量百分比，而對於液體來說則為體積百分比。
實施例1pCS6和pCS5的突變該實施例描述了熱穩定及熱激活DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶結構域的定點突變。
在第一輪的誘變中，採用定點誘變方法來改變熱穩定DNA聚合酶的殘基，這些殘基要麼是已知的對於協調二價金屬陽離子具有重要作用的、Klenow片段高保真結構域中活性位點的同源殘基，要麼就是位於這些同源殘基之間。見Derbyshire等，1995，Methods In Enzymology 262363-85，在此全文引用作為參考。利用了編碼突變的嵌合熱穩定DNA聚合酶CS6的質粒pCS6，見圖5。CS6是嵌合熱穩定DNA聚合酶CS5的一種突變型，見圖4。CS5的N-末端部分為來自棲熱菌種Z05(Thermus species Z05)DNA聚合酶N-末端的291個殘基，編碼其5』-3』核酸外切酶活性，見美國專利No.6228628。CS5的其餘部分為來自TmaDNA聚合酶C-末端的602個殘基，具有其3』-5』核酸外切酶活性及DNA聚合酶活性。除了在其3』-5』核酸外切酶結構域具有突變D323A和E325A以外(除非另外具體指出，自始至終都是使用野生型Tma酶的殘基編號)，CS6與CS5是相同的。正如這裡所顯示的，這些突變導致CS6沒有可檢測的3』-5』核酸外切酶活性。
以323位和325位的酸性殘基以及324位的亮氨酸殘基為靶，每一個突變(D323E除外，如下所述)都利用相同的基本方法進行。如表2所示，人工合成簡併的寡聚核苷酸對。每對中的一個簡併寡聚核苷酸是11個殘基(11-mer)，另一個是17個殘基。除了簡併的核苷酸，每對寡聚核苷酸中11個殘基與該對中17個殘基的寡聚核苷酸中的11個核苷酸序列完全互補。至於D323E突變，如表2所示，設計了一對非簡併的互補寡聚核苷酸。每對中的簡併寡聚核苷酸在退火條件下混合以便寡聚核苷酸彼此之間完全互補，包括在其簡併位點上，退火形成一個11對殘基的雙鏈DNA且其兩側一端具有3』-TA臂(overhang)、另一端具有5』-CTAG臂，如表2所示。這些末端分別與限制性內切酶Sgf I和Spe I產生的末端相適配。這樣，每種退火反應都產生一些如表2所示的完全互補並且退火的寡聚核苷酸對混合物。
隨後將5μg pCS6在25μl反應體系中37℃消化2.5小時，該體系包含15單位的限制性內切酶Spe I、50mM Tris·HCl、10mM MgCl2、100mM NaCl、pH7.5。通過75℃加熱10分鐘使酶失活，然後冷卻到室溫。再加入15單位的限制性內切酶Sgf I，繼續在37℃保溫2小時。然後將反應液在25℃儲存過夜。這些步驟使得pCS6線性化並移去了編碼323位和325位酸性殘基(在pCS6中是突變的)以及324位的亮氨酸殘基的密碼子，而且也留下了與退火的簡併引物對的末端相適配的末端。
在另外的反應中，0.5pmol的每種退火的寡聚核苷酸對混合物與0.1pmol的線性化pCS6及0.5單位的T4DNA連接酶(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala Sweden)在其提供的緩衝溶液中混合併於4℃下保溫過夜。
然後將每種連接混合物1μl(20ng)利用GENE PULSERTM電轉化儀(Bio-RadLaboratories，Hercules CA)基本上根據製造商的說明來轉化大腸桿菌DG116。電擊的細胞由1ml SOC培養基稀釋，並於30℃振蕩培養1小時。50或100μl的等份重懸細胞塗布於添加了100μg/ml氨苄青黴素的LB平板上，以便篩選轉化的細胞，然後培養過夜。
對每種轉化挑取5個克隆進行PCR擴增和酶切分析以鑑別其含有哪一種突變的pCS6質粒，如果有的話。每個克隆懸浮於50-主混合物中(master mix)，該混合物含有PCR緩衝液II(PE-Applied BioSystems，Redwood City，CA)，40μMdNTP混合物及CS4和CS1A引物各20pmol。
CS1AGTATGTAGTACGCTTCCTTTGGTTTGAA (SEQ ID NO35)CS4 TGGCTTTGGGAGAAGTACGGCCT (SEQ ID NO36)每個克隆擴增的DNA由表3所示的鑑定性限制性內切酶矩陣消化，以確定其是否正確地引入了合成的寡聚核苷酸，如果是，引入的又是哪一個突變序列。酶切位點模式正確的克隆隨之在插入區域進行測序分析，以保證所選擇的每個待進一步應用的質粒都只引入了所需的突變。表2第一輪所用的寡聚核苷酸

表3Tma L324 E/D/K/N/Q/H及323/325突變酶的限制性內切酶位點

*在Dam+大腸桿菌中無；在PCR產物及Dam-大腸桿菌中有。
在第二輪的突變中，以那些已知的或者據猜測與3』-5』核酸外切酶活性底物結合有關的殘基為靶，利用了基於PCR的定點誘變方法。如表4所示，每一個突變都設計了引物對，每個引物對允許擴增pCS5中聚合酶編碼基因的一部分。只有一個引物對用於L329A突變，在這個突變中，該對中的一個引物在擴增子中引入突變，兩個引物在其末端附近都含有限制性酶切位點，使得它們能夠亞克隆到用同樣酶消化的pCS5中，從而產生編碼攜帶L329A突變的Z05-Tma雜合DNA聚合酶的表達質粒。第二輪突變中其它的每一個突變的產生都使用了2個引物對。對於每一個突變，每對引物中的一個包含了所需的突變，但除此之外與pCS5是互補的；每對中的另一個引物是與pCS5的某部分完全互補的。用pCS5作模板以每對引物各自進行PCR，這些反應產生了大約有35個核苷酸重疊的擴增子，擴增子重疊的部分含有所需的突變。接著進行另外一個PCR擴增，其中混合了兩個部分重疊的擴增子、並且使用了每對引物中的側翼序列引物(例如，不包含突變序列的各個引物對的單獨擴增引物)。該反應得到了一個大的擴增子，它由先前的PCR所產生的兩個部分重疊的擴增子組成。所述的側翼序列引物被設計成與聚合酶編碼基因中含有有利於克隆的限制性酶切位點的那部分互補。擴增子及pCS5隨之用那些限制性內切酶消化、混合併連接，以產生含有所需突變的表達質粒。連接產物被用來按前述方法轉化大腸桿菌。如上所述，利用表5所列的酶切位點對成功的突變進行核實。
表4第二輪所用的引物


表5第二輪所用的引物及其限制性內切酶位點

實施例2突變熱穩定DNA聚合酶的生產和純化上述連接所得的質粒含有在λPL啟動子調控下的聚合酶基因。用該質粒轉化包含cI857(熱不穩定型)λ抑制子的宿主細胞(DG116，ATCC#53606)。轉化了含有野生型或突變聚合酶基因的質粒的DG116細胞被用來接種10ml添加氨苄青黴素(100μg/ml)的標準搖瓶培養基(SFM；由葡萄糖、維生素B1、酪蛋白水解物及基本培養基組成)，在30℃，250rpm過夜生長。用5ml過夜培養物接種450ml SFM+氨苄青黴素培養基並於30℃，250rpm搖床培養直到培養物OD600達到0.6-0.8。隨後將培養物轉移到37℃，250rpm過夜生長，以獲取溫度誘導表達的聚合酶。參見例如美國專利No.5079352、5420029和5618711。3000×g離心15分鐘收集過夜培養物沉澱。
沉澱重懸於30ml裂解緩衝液中(50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT，1mM Pefabloc，1μg/ml亮抑酶肽，0.2mM TLCK)，並且用弗氏壓碎器在16000磅/平方英寸(psi)裂解細胞。細胞裂解懸浮液加入0.2M(NH4)2SO4並在75℃加熱15分鐘以使大腸桿菌宿主蛋白失活和變性。加熱的抽提液於0℃冷卻15分鐘，加入0.6％聚乙烯胺以沉澱宿主DNA，並於16000×g離心30分鐘。澄清的提取液加載到預先由50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mMDTT，0.2M(NH4)2SO4平衡好的2ml苯基瓊脂糖柱子上。柱子用6ml平衡液衝洗，然後用2ml含50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT的溶液衝洗，最後用2ml含50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT，20％乙二醇的溶液衝洗。蛋白用50mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT，2.5尿素洗脫。洗脫液中加入100mM KCl並加載到預先由25mM Tris-HCl，pH7.5，1mMEDTA，1mM DTT，100mM KCl平衡好的2ml肝素瓊脂糖柱子上。柱子用6ml平衡液衝洗，並用6ml含25mM Tris-HCl，pH7.5，10mM EDTA，1mM DTT，400mM KCl的溶液洗脫。最終的洗脫液通過透析和稀釋加入20mM Tris-HCl，pH8.0，0.1mM EDTA，1mM DTT，100mM KCl，0.2％吐溫20，50％體積比的甘油，並儲存於-20C。
實施例33』-5』核酸外切酶活性的標準分析以下的實施例提供了測定熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶3』-5』核酸外切酶活性的標準分析方法以及1單位3』-5』核酸外切酶活性的定義。
為了比較CS5突變衍生物的3』-5』核酸外切酶活性，對羧基螢光素(FAM)標記的單鏈寡聚核苷酸底物NJS40的降解進行了測量。
NJS40FAM-GCGCTAGGGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC (SEQID NO80)標準分析方法(40μl體系)在50mM Tricine，pH8.3，25mM KOAc，5％重量/體積比的DMSO，0.5mM Mn(OAc)2及5％(體積比)酶儲存緩衝液組份(在反應液中1mM Tris，pH8.0，0.005mM EDTA，0.05mM DTT，5mM KCl，0.025％吐溫20，2.5％甘油)中含有4pmol(100nM)EAM標記的單鏈寡聚核苷酸NJS40。通過加入NJS40和Mn(OAc)2而起始反應，並在63℃保溫15分鐘，通過加入40μl 50mMEDTA而終止反應。調整酶濃度和反應時間以得到線性化結果。反應在起始寡聚核苷酸大約有1-20％轉化為較短產物的範圍內呈線性，對應的酶濃度是0.5-10毫單位；酶濃度總是小於底物濃度。反應終止液用甲醯胺稀釋到0.1nM寡聚核苷酸並通過毛細管電泳(ABI3100，Applied Biosystems，Foster City，CA)進行分析。起始大小的及降解的寡聚核苷酸的峰高用GENESCANTM軟體(AppliedBiosystems，Foster City，CA)測定。寡聚核苷酸轉化為較短寡聚核苷酸的pmol數等於{1-(15分鐘後剩餘的Pn相對量)}×(反應起始時Pn的pmol數)其中Pn是指具有原始長度n的底物寡聚核苷酸(NJS40)。15分鐘後剩餘的Pn相對量是通過測量相應於起始大小的寡聚核苷酸的峰高並除以所有峰高的總和來確定的。因而該分析測量了NJS40寡聚核苷酸3』末端核苷酸的釋放速率。在標準分析條件下，1單位3』-5』核酸外切酶活在15分鐘內催化50pmol單鏈NJS40寡聚核苷酸轉化為更短的寡聚核苷酸。
利用該標準分析方法對由上述方法製得的突變DNA聚合酶進行了表徵。分析結果示於表6標記為「ssDNA」的一欄中。
利用美國專利No.4889818教導的分析方法對每個突變體的聚合酶活性進行了測量。簡言之，保存在儲存緩衝液中(20mM Tris，0.1mM EDTA，1mM DTT，100mM KCl，0.5％吐溫20，50％甘油)的一定量的酶儲物在酶稀釋液中(25mMTris-HCl，pH8.0，50mM KCl，1mMβ-巰基乙醇，0.5％吐溫20，0.5％NP40，100μg/ml明膠)稀釋以在每個分析中產生大約0.02到0.1單位的聚合酶活性。5μl稀釋酶加到45μl反應緩衝液中(25mM TAPS，pH9.4，50mM KCl，2mMMgCl2，1mMβ-巰基乙醇，200μMd(GTA)TP，100μMα-33P-dCTP，30μg活化的鮭魚精DNA(「活化的」DNA是用DNA酶I部分水解直到5％的DNA轉化為酸溶性片段後所得的天然製備物))。反應在74℃保溫10分鐘，然後用10μl60mMEDTA終止。每種終止液50μl加到含有1mlpH8.0的2mMEDTA及50μg/ml載體DNA(通過21號標準針孔剪切過的鮭魚精DNA)的試管中。加入1ml 20％的三氯乙酸(TCA)和2％焦磷酸鈉並將試管在渦流振蕩器上溫和振蕩，再將試管置於冰上溫育10到20分鐘以使DNA完全沉澱。沉澱的DNA由多頭真空抽濾裝置上的GF/C過濾器收集。過濾器先用5％TCA和1％焦磷酸鈉各衝洗3次、再用20％TCA衝洗3次、最後用95％乙醇衝洗3次。兩個空白過濾器用相似的步驟進行了處理，以確定儀器的背景誤差。利用OMNIFLUOR(Packard BioScience B.V，Groningen，The Netherland)和一個LS6000ICTM閃爍計數器(Beckman Coulter，Fullerton CA)對沉澱DNA中結合的放射性進行了量化。1個單位的聚合酶活性定義為在上文提供的分析條件下在30分鐘內TCA沉澱的DNA中總共結合10nmol的dNMP所需的酶活量。
實施例4測量3』-5』核酸外切酶活性的變形分析方法還利用兩種變形的標準分析方法對上述的突變熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性進行了標示。除了各自利用了不同的底物之外，這兩種變形分析方法與標準分析是相同的。正如標準分析中那樣，在每個變形分析中，測量了寡聚核苷酸NJS40的3』末端的核苷酸釋放速率。不過，在變形分析中，NJS40雜合了一個互補寡聚核苷酸。第一個變形分析採用了一個完全配對的雙鏈DNA底物NJS403′FAM-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC(SRQ ID NO80)NJS435′pAGCGATCCCGCGACCGTTCACATCGCCAGTGCGACGCGCATTGGTGGTGTGGGCGGCGCC(SEQ ID NO81)在表6標記為「dsDNA」的一欄中提供了利用第一個變形分析方法對上述突變體分析所得的結果。
第二個變形分析採用了含有一對錯配鹼基的一個雙鏈DNA底物NJS403′FAM-GCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCAC(SEQ ID NO80)NJS445′pAGCGATCCCGCGACCGTTCACATCGCCAGTTCGACGCGCATTGGTGGTGTGGGCGGCGCC(SEQ ID NO82)在表6標記為「含錯配鹼基的dsDNA」的一欄中提供了利用第二個變形分析方法對上述突變體分析所得的結果。

#速率是值0.25nM酶的速率。
實施例5突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶與突變的大腸桿菌DNA聚合酶3』-5』核酸外切酶活性的比較該實施例表明突變的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶活性不能夠從相似的Eco DNA Pol I突變聚合酶所具有的酶學特性推斷出來。表7給出了第二輪突變聚合酶與相似的大腸桿菌Pol I突變體3』-5』核酸外切酶活性的比較。
表7

*基於Derbyshire等，1995，Methods In Enzymology 262363-85的方法

來自表6表7給出的結果表明，相對於相應的野生型酶的活性，在Eco和CS5 DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶結構域中相似的突變通常對這些酶的校正活性帶來不同的效果。Eco Q419A突變和CS5 Q384A突變之間的比較顯示在這兩個酶中的相似突變能夠相似地影響其3』-5』核酸外切酶活性。然而，對於某些相似突變，卻觀察到酶活性具有明顯的差別。在某些突變對中，該差別僅僅是數量上的。舉例來說，Eco Y497A突變較之於CS5 Y464A突變對ssDNA和dsDNA兩種底物的殘餘酶活都相對要大得多。其它的一些相似突變則顯示了質的區別。舉例來說，Eco L361A和D424E突變對ssDNA底物都比對dsDNA底物具有高得多的活性。不過，相似的CS5突變(分別為L329A和D389E)對ssDNA和dsDNA兩種底物的殘餘活性都差不多。
實施例6利用具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的突變熱穩定DNA聚合酶進行PCR
利用HIV抗藥性分析方法測試了突變體酶Y464A，D389E，L329A，Q484A/N385A，Q384A，N385A和L324Q的逆轉錄酶/PCR活性。用120單位CS6(不具有可檢測的3』-5』核酸外切酶活性)和5單位CS5(具有野生型3』-5』核酸外切酶活性)的混合物作為對照。採用1.7kbHIVr分析條件(50mM Tricine pH8.3，45mM KOAc pH7.5，0.9mM Mn(OAc)2，5％DMSO，0.2mM d(AGC)TP，0.3mMdUTP，0.03mM dTTP，0.2x SYBR Green I，G46E CS5/CS6酶混合物(5/125單位)或60或30單位聚合酶活性的各種突變體酶，1單位UNG，和0.4-M各種(-1)2』-氨基修飾的引物(RN326和RN328)以及動力熱循環，見Myers等，2000，AntiviralTherapy 5Abstract 49)以特異性的靈敏的擴增這些蛋白酶的基因和HIV逆轉錄酶基因的前400個密碼子。
RN326GAGGGGTATTGACAAACTCCCACTCAGGAATCXA (X＝2』氨基脫氧胞嘧啶核苷酸)(SEQ ID NO83)RN328GCG3AATTTTCTTCAGAGCAGACCAGAGCCAAXA(X＝2』氨基脫氧胞嘧啶核苷酸)(SEQ ID NO84)利用GENEAMPTM5700 SDS熱循環儀(PE Biosystems，Foster City，CA)按以下熱循環步驟進行50℃2分鐘，60℃60分鐘，95℃1分鐘，隨之在95℃20秒、58℃15秒、65℃1分45秒循環4次，隨後在90℃ 20秒、58℃15秒、65℃1分45秒循環36次，隨後65℃10分鐘結束。圖9顯示了PCR擴增的增長曲線。還用相同的步驟對不同數量的酶進行了擴增並用凝膠電泳進行了分析。PCR後酶100μl反應液中取5μl加樣到1％瓊脂糖凝膠中，基本上按照Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，1989，第二版描述的方法進行電泳。凝膠用1μg/ml溴化乙錠溶液染色，所得的凝膠顯示於圖10。在圖10中，第20、40和48泳道＝作為分子量標記的BstII消化的λDNA(New England Biolabs，Beverly，MA)；第36-38及58-60泳道＝陰性對照(5U CS5，125U CS6，無模板)；第33-35及55-57泳道＝陽性對照(5UCS5，125U CS6)；第1-3泳道＝60UY464ACS5；第4-6泳道＝30UY464ACS5；第7-9泳道＝60U D389E CS5；第10-12泳道＝30U D389E CS5；第13-15泳道＝60U L329A CS5；第16-18泳道＝30U L329A CS5；第21-23泳道＝60UQ384A-N385ACS5；第24-26泳道＝30UQ384A-N385ACS5；第27-29泳道＝60U Q3g4A CS5；第30-32泳道＝30U Q384A CS5；第41-43泳道＝60U N385ACS5；第44-46泳道＝30U N385A CS5；第49-51泳道＝60U L324Q CS5；第52-54泳道＝30U L329Q CS5(其中所有單位均指DNA聚合酶活性)。
根據其CT值(圖9)、以及通過對擴增產物的凝膠分析(圖10)所檢測到的它們所產生的特異和非特異擴增產物來判斷突變體酶。這些結果表明那些具有大於3％但是小於20％野生型校正活性的突變體(正如利用上文實施例3中描述的標準分析方法所測量的)能夠很好地對1.7kb HIV RNA模板進行逆轉錄PCR擴增。這些突變體還具有在0.4-1.6U/pmol之間的特異性酶活性，以及大於6.0但是小於25.0U pol/U eXo的聚合酶活性比3』-5』核酸外切酶活性比例，這些酶活性是用實施例3中描述的方法測量的，而且產生的PCR結果可以比得上利用CS5和CS6的混合物得到的結果。根據對其擴增產物的凝膠分析來判斷，Q384A CS5和N385A CS5也能較好地進行逆轉錄PCR擴增，儘管不如根據其GT值判斷的那樣好。
實施例7減弱熱穩定或熱激活A家族DNA聚合酶3』-5』核酸外切酶活性的位點特異性突變的靶殘基的鑑別該實施例提供了一種方法，用於鑑別熱穩定或熱激活A家族DNA聚合酶中能夠被突變而且可以通過實驗檢測出具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的突變體的那些殘基。
在其3』-5』核酸外切酶位點與DNA結合成複合物的大腸桿菌Pol I的X射線衍射結構(見Brautigan等，1998，J.Mol.Biol.277363-77)利用XSAE程序的「3D＞序列接觸」(「3D＞sequence contacts」)特性(見Higgins等，1992，Cabios8，189-91)進行分析，以鑑別所選的蛋白中(PolI；1kfs.pdb，A鏈)那些距DNA底物(1kfs.pdb，B鏈)5A範圍之內的所有殘基。利用該方法，在大腸桿菌Pol I中鑑別出了表8中的殘基。通過對聚合酶序列對比情況的檢查(例如象圖8中所示的)，可以在熱穩定或熱激活A家族DNA聚合酶中鑑別出相似殘基。然後通過例如前面實施例3所描述的標準分析方法，這些候選殘基可以被突變並檢測是否具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性。
表8大腸桿菌PolI的侯選殘基D355 T356E357 T358S360 L361Q419 N420K422 Y423M443 R455H456 D457M458 D459F473 E474Q483 F486Y497 D501E541 S658Y659 H660實施例8具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的B家族突變DNA聚合酶的鑑別正如本文所公開的，本領域技術人員在當前所披露的內容的指導下，可以顯而易見的製備具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的A家族突變DNA聚合酶，舉例來說，在其3』-5』核酸外切酶結構域產生相應於本文所描述的在Tma DNA聚合酶的3』-5』核酸外切酶結構域所產生的突變。這樣一種基於序列的方法在設計具有減弱的校正活性的B家族突變DNA聚合酶方面僅僅具有局限性的應用，因為在Tma DNA聚合酶和B家族DNA聚合酶3』-5』核酸外切酶結構域之間唯一具有相當程度的序列相似性的區域是「DXE』金屬結合基序。不過，X射線衍射晶體學研究表明A家族和B家族聚合酶的3』-5』核酸外切酶結構域具有相似的三維結構。見Zhao等，1999，Structure Fold Des.71189-99、Karam等，2000，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol.6465-96、Hopfner等，1999，Proc Natl Acad SciUSA 963600-5、Wang等，1997，Cell 891087-99。所以建立了一種基於結構的方法來鑑別那些可被突變以產生具有減弱的校正活性的B家族DNA聚合酶的殘基。
圖11提供了大腸桿菌PolIIDNA聚合酶、B家族聚合酶與一定數量的其它B家族DNA聚合酶序列之間的對比。並不是基於殘基的保守性即意味著它們對於校正功能很重要這一假設，就簡單地鑑別出那些在所有或者幾乎所有所述蛋白中保守的殘基，而是仔細研究了分離自嗜菌體RB69的B家族DNA聚合酶3』-5』核酸外切酶結構域的三維結構(Shamoo等，1999，Cell 99155-66；結構可在PDB ID No.1 CLQ序號下自蛋白資料庫得到(Berman等2000，NucleicAcids Res.28235-42))，並將其與Tma的校正結構域進行了比較。每個蛋白中預計可能與其校正結構域所結合的單鏈DNA序列的3』末端核苷酸接觸的所有殘基都已經被鑑別了。圖11中的信息及序列對比被用來鑑別其它B家族DNA聚合酶中的相似殘基，如圖9所示，見下文。這些數據意味著在這些特定位點的突變會產生具有減弱的3』-5』核酸外切酶活性的DNA聚合酶分子。
表9

上述的實施例，既有預見性又具真實性，僅僅是以闡釋本發明的方式被提供的，而不是在任何方面用來限制本發明的保護範圍的。
本文所引述的所有參考文獻都是全文引用。
權利要求
1.一種分離的含有一個3`-5`核酸外切酶區域並且通過標準試驗測定顯示出削弱的大約6.5或更低但大於0U/pmol的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中所述的3`-5`核酸外切酶區域含有選自下列序列基元的一個序列基元(a)一個具有通式DX1EX2X3SX4的序列基元，其中D為天冬氨酸殘基，X1為任意胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為任意胺基酸殘基，X3為任意胺基酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為任意胺基酸殘基，或(b)一個具有通式X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14的序列基元(SEQ ID NO1)，其中X5為任意胺基酸殘基，X6為任意胺基酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為任胺基酸殘基，X9為苯基丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為任意胺基酸殘基，X11為任意胺基酸殘基，X12為任意胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，和X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基，或(c)一個具有通式DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23的序列基元(SEQ IDNO2)，其中D為天冬氨酸殘基，X15為脯氨酸，丙氨酸，亮氨酸或蘇氨酸殘基，X16為亮氨酸或甲硫氨酸殘基，X17為亮氨酸或異亮氨酸殘基，X18為任意胺基酸殘基，X19為丙氨酸或絲氨酸殘基，Y為酪氨酸殘基，X20為亮氨酸殘基，異亮氨酸殘基或纈氨酸殘基，X21為亮氨酸殘基或色氨酸殘基，X22為天冬氨酸殘基，天冬醯胺殘基，穀氨酸殘基或穀氨醯胺殘基，和X23為脯氨酸殘基或絲氨酸殘基，或(d)一個具有通式X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36的序列基元(SEQID NO3)，其中X24為脯氨酸或丙氨酸殘基，X25為任意胺基酸殘基，X26為穀氨酸，天冬氨酸或脯氨酸殘基，X27為賴氨酸，精氨酸或穀氨酸殘基，X28為任意胺基酸殘基，X29為任意胺基酸殘基，X30為穀氨酸，精氨酸或天冬醯胺殘基，X31為任意胺基酸殘基，X32為絲氨酸，丙氨酸或半胱氨酸殘基，X33為任意胺基酸殘基，X34為穀氨酸或蘇氨酸殘基，X35為任意胺基酸殘基，和X36為丙氨酸殘基。
2.一種分離的含有一個3`-5`核酸外切酶區域並且具有5`-3`聚合酶活性和削弱的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中所述的以U/pmol表示的5`-3`聚合酶活性和所述的以U/pmol表示的3`-5`核酸外切酶活性的比率在大約100和1之間，酶活性測定如實施例3所述，並且所述的3`-5`核酸外切酶區域含有選自下列序列基元的一個序列基元(a)一個具有通式DX1EX2X3SX4的序列基元，其中D為天冬氨酸殘基，X1為任意胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為任何胺基酸殘基，X3為任意胺基酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為任意胺基酸殘基，或(b)一個具有通式X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14的序列基元(SEQ ID NO1)，其中X5為任意胺基酸殘基，X6為任意胺基酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為任意胺基酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為任意胺基酸殘基，X11為任意胺基酸殘基，X12為任意胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基，或(c)一個具有通式DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23的序列基元(SEQ IDNO2)，其中D為天冬氨酸殘基，X15為脯氨酸，丙氨酸亮氨酸或蘇氨酸殘基，X16為亮氨酸或甲硫氨酸殘基，X17為亮氨酸或異亮氨酸殘基，X18為任意胺基酸殘基，X19為丙氨酸或絲氨酸殘基，Y為酪氨酸殘基，X20為亮氨酸殘基，異亮氨酸殘基或纈氨酸殘基，X21為亮氨酸殘基或色氨酸殘基，X22為天冬氨酸殘基，天冬醯胺殘基，穀氨酸殘基或穀氨醯胺殘基，和X23為脯氨酸殘基或絲氨酸殘基，或(d)一個具有通式X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36的序列基元(SEQID NO3)，其中X24為脯氨酸或丙氨酸殘基，X25為任意胺基酸殘基，X26為穀氨酸，天冬氨酸或脯氨酸殘基，X27為賴氨酸，精氨酸或穀氨酸殘基，X28為任意胺基酸殘基，X29為任意胺基酸殘基，X30為穀氨酸，精氨酸或天冬醯胺殘基，X31為任意胺基酸殘基，X32為絲氨酸，丙氨酸或半胱氨酸殘基，X33為任意胺基酸殘基，X34為穀氨酸或蘇氨酸殘基，X35為任意胺基酸殘基，和X36為丙氨酸殘基。
3.一種分離的修飾的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中所述的修飾的聚合酶含有3`-5`核酸外切酶區域，具有修飾之前的熱穩定性DNA聚合酶通過標準試驗測定的3`-5`核酸外切酶活性的大約0.1到65％，並且所述的3`-5`核酸外切酶區域含有選自下列序列基元的一個序列基元(a)一個具有通式DX1EX2X3SX4的序列基元，其中D為天冬氨酸殘基，X1為任意胺基酸殘基，或沒有殘基，E為穀氨酸殘基，X2為任何胺基酸殘基，X3為任意胺基酸殘基，S為絲氨酸殘基，和X4為任意胺基酸殘基，或(b)一個具有通式X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14的序列基元(SEQ ID NO1)，其中X5為任意胺基酸殘基，X6為任意胺基酸殘基，X7為半胱氨酸或亮氨酸殘基，X8為任何胺基酸殘基，X9為苯丙氨酸或酪氨酸殘基，X10為任意胺基酸殘基，X11為任意胺基酸殘基，X12為任意胺基酸殘基，X13為異亮氨酸或纈氨酸殘基，X14為亮氨酸或苯丙氨酸殘基，或(c)一個具有通式DX15X16X17X18X19YX20X21X22X23的序列基元(SEQ IDNO2)，其中D為天冬氨酸殘基，X15為脯氨酸，丙氨酸亮氨酸或蘇氨酸殘基，X16為亮氨酸或甲硫氨酸殘基，X17為亮氨酸或異亮氨酸殘基，X18為任意胺基酸殘基，X19為丙氨酸或絲氨酸殘基，Y為酪氨酸殘基，X20為亮氨酸殘基，異亮氨酸殘基或纈氨酸殘基，X21為亮氨酸殘基或色氨酸殘基，X22為天冬氨酸殘基，天冬醯胺殘基，穀氨酸殘基或穀氨醯胺殘基，和X23為脯氨酸殘基或絲氨酸殘基，或(d)一個具有通式X24X25X26X27X28X29X30X31X32X33X34X35X36的序列基元(SEQID NO3)，其中X24為脯氨酸或丙氨酸殘基，X25為任意胺基酸殘基，X26為穀氨酸，天冬氨酸或脯氨酸殘基，X27為賴氨酸，精氨酸或穀氨酸殘基，X28為任意胺基酸殘基，X29為任意胺基酸殘基，X30為穀氨酸，精氨酸或天冬醯胺殘基，X31為任意胺基酸殘基，X32為絲氨酸，丙氨酸或半胱氨酸殘基，X33為任意胺基酸殘基，X34為穀氨酸或蘇氨酸殘基，X35為任意胺基酸殘基，和X36為丙氨酸殘基。
4.一種分離的修飾的含有一個3`-5`核酸外切酶區域並顯示出削弱的大約6.5或更低但大於0U/pmol的3`-5`核酸外切酶活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，其中所述的3`-5核酸外切酶區域與未修飾的Tma DNA聚合酶的3`-5`核酸外切酶區域有大於約80％但小於100％的序列同一性。
全文摘要
本發明涉及帶有削弱的3′－5′核酸外切酶(「校正」)活性的熱穩定性或熱激活性DNA聚合酶，用於其合成的方法，其使用的方法，以及含有其的試劑盒。此酶在很多的重組DNA技術特別是通過聚合酶鏈式反應(PCR)的核酸擴增中是有用的。
文檔編號C12N1/21GK1482240SQ0313123
公開日2004年3月17日 申請日期2003年4月2日 優先權日2002年4月2日
發明者N·J·舍恩布倫納, T·W·邁爾斯, D·H·格爾弗蘭德, N J 舍恩布倫納, 格爾弗蘭德, 邁爾斯 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司