用於組織樣本中核酸的局部或空間檢測的方法和產品的製作方法

2023-06-10 08:14:16 3

用於組織樣本中核酸的局部或空間檢測的方法和產品的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種組織樣本中的核酸的局部或空間檢測的方法和產物，尤其是一種對組織樣本中的核酸的局部檢測方法，包括（a）提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，所述探針每種在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有3』自由端，以能以探針作為引物來引導引物延長反應或引物連接反應，其中所述捕獲探針的每種都包括核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括：（i）定位域，所述定位域與陣列上的探針位置相對應，和（ii）捕獲域；（b）令所述陣列與組織樣本相接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和組織樣本上的位置相關聯，並允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交；（c）以所述捕獲探針為延長引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子生成DNA分子，其中所述延長後或連接後的DNA分子以定位域標記；（d）可選地，生成所述被標記DNA的互補鏈和/或可選地，擴增所述被標記的DNA；（e）從陣列表面釋放至少部分被標記DNA分子和/或他們的互補鏈或擴增子，其中所述部分包括定位域或其互補鏈；以及（f）直接或間接分析被釋放DNA分子的序列。
【專利說明】用於組織樣本中核酸的局部或空間檢測的方法和產品
【技術領域】
[0001]本發明主要涉及組織樣本中核酸的局部或空間檢測。所述核酸可以是RNA或DNA。因此，本發明提供的方法可用於檢測和/或分析RNA (例如RNA轉錄體)或基因組DNA，以獲取組織樣本(例如個體細胞)中有關基因定位、分布或表達的空間信息，或確切地說，任何基因組變異(不一定非得是基因中的變異)的定位或分布的空間信息。因此，本發明使空間基因組學和空間轉錄組學研究成為可能。
[0002]一種定量和/或定性的方法，能夠分析組織樣本中的基因組序列分布、位置或表達，其中所述組織樣本中保有空間表達、分布或定位格局。因此，所述新方法提供了一種實施「空間轉錄組學」或「空間基因組學」研究的流程，令使用者能同時測定組織樣本中所含的已表達表達基因、基因或基因組位點的表達格局或定位/分布格局。
[0003]具體來說，本發明是基於陣列技術與高通量DNA測序技術的聯用，捕獲並以定位標記來標記組織樣本中的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)，尤其是mRNA或DNA。然後，合成DNA分子，並對其進行測序和分析，以確定該組織樣本的任何部分中哪些基因獲得了表達。優選地，可以同時獲取該組織樣本中每個細胞單獨、分開、特定的轉錄組。因此，本發明的方法可說是提供了組織樣本中個體細胞高度並行的綜合轉錄組籤名，且不會丟失所述受測組織樣本中的空間信息。本發明還提供了一種實施本發明方法的陣列及製作本發明陣列的方法。
【背景技術】
[0004]人體含有超過1 00萬億個細胞，這些細胞組成了超過250個不同的器官和組織。我們還遠未理解大腦等複雜器官的發育和組織，因此，還有必要利用量化的方法剖析這些組織中所表達基因的表達形式，確定控制這些組織發育和功能的基因。這些器官自身便是分化細胞的混合體，所述細胞使得如營養運輸、防禦等各種身體機能得到協同和維持。因此，細胞功能取決於該細胞在特定組織結構中的位置和它與該組織中其它細胞間直接和間接的相互作用。因此，有必要理清這些相互作用如何在轉錄水平上影響組織中的每個細胞。
[0005]RNA深度測序的最新發現表明，人體細胞系中的大多數轉錄體都能被檢測，且大部分(75%)的人類蛋白質編碼基因都在大多數組織中有所表達。類似地，一項針對1%的人類基因組的詳細研究表明，染色體進行的是泛轉錄，全部鹼基中有大部分被包含在初級轉錄體中。因此，可以說該轉錄機制在全局水平上是混雜的。
[0006]眾所周知，轉錄體僅是蛋白質豐度的近似指標，因為從任何一個轉錄體生成的蛋白質數量都受到RNA翻譯、降解速度等的影響。對此，最近有一項人體器官和組織的免疫分析暗示，組織特異性是通過對蛋白質水平的精確時間、空間控制來獲得的，且身體不同組織獲取其獨有特質的途徑，並非通過控制蛋白質表達的種類，而是通過控制每種蛋白質的表
達數量。
[0007]然而，接下來有全局研究比較了轉錄組和蛋白質組的相關性，證明全體基因中的大部分都得到了表達。有趣的是，研究發現個體基因產物的RNA變化和蛋白質水平間存在高相關性，這就表明，對個體細胞轉錄組的研究對了解蛋白質的功能角色上具有生物學意義。
[0008]的確，對生物組織的細胞組織和表達格局的分析，是生物醫學研究和診斷學上的裡程碑。細胞組織學運用各種染色技術，在一個多世紀前便首先確定了健康器官的基本結構機制和常見病理學變化。該領域的發展，帶來了以免疫組織化學和原位雜交的基因表達來研究蛋白質分布的可能性。
[0009]但是，愈發先進的組織學和基因表達技術並行發展，卻導致了成像技術與轉錄組分析的分離，因而在本發明提供的方法之前，還沒有任何將空間解析度用於全轉錄組分析的可行辦法。
[0010]作為原位技術的替代方式或補充方式，蛋白質和核酸的體外分析方法也得到了發展，即:從完整組織樣本、單一細胞類型或甚至單個細胞中提取分子，並在所述提取物中通過ELISA、qPRC等方法對特定分子進行定量。
[0011]基因表達分析的最新發展，為利用微陣列或RNA測序評估組織的完整轉錄組提供了可能，這些發展有助於我們對生物過程的理解和診斷學研究。然而，典型的轉錄組分析以從整塊組織(或者甚至完整生物體)提取的mRNA為實施對象，但是要收集較小的組織區域或個體細胞用於轉錄組分析，卻一般非常費力、費錢且精確度低。
[0012]因此，大多數基於微陣列或下一代RNA測序的基因表達研究，都採用包含許多細胞的代表性樣本，由此一來，研究結果代表的是受測基因的平均表達水平。在某些情況下，除全局基因表達平臺外，還對具有顯著差異的細胞進行了分離(Tang F et al，NatProtoc.2010;5:516-35;Wang D & Bodovitz S,Trends Biotechnol.2010;28:281-90),獲得了關於細胞間差異的非常精確的信息。然而，至今為止，還沒有以高解析度來研究完整組織中的轉錄活性的高通量方法。

【發明內容】

[0013]因此，基因表達格局分析的現有技術一次僅能提供一個或幾個基因的轉錄信息，或在提供同一樣本中的所有基因信息的同時損失其位置信息。因此，顯然需要能夠同時、分另O、特異測定樣本中每個細胞的轉錄組的方法，即是說，需要能夠提供含空間解析度的轉錄信息的組織樣本全局基因表達分析方法，而本發明就滿足了這一需要。
[0014]本發明中所述方法和產物的創新途徑，採用了目前業已完善的陣列和測序技術來獲得一個樣本中全部基因的轉錄信息，且同時保留每個轉錄體的位置信息。對本領域技術人員來說，這顯然是生命科學中的一個裡程碑。該新技術開創了所謂「空間轉錄組學」的新領域，並可能將對我們對所有多細胞生物的組織發育和組織、細胞功能方面的認識帶來深遠的影響。顯然，這樣的技術在促進對疾病狀態的成因和發展的理解和開發針對這些疾病的有效治療措施方面將尤其有用，例如癌症。本發明的方法還可應用在許多疾病的診斷中。
[0015]雖然如下具體所述，本發明最初的目的在於轉錄組研究，本發明的原理和方法還可以應用於DNA分析，由此也能用於基因組分析(「空間基因組學」)。由此一來，在最廣泛意義上，本發明主要可用於核酸的檢測和/或分析。
[0016]陣列技術，特別是微陣列，發源於史丹福大學的研究，該研究將少量DNA寡核苷酸成功地貼附在玻璃表面，呈有序排列，即所謂的「陣列」，並用其監控了 45個基因的轉錄(Schena M et al, Science.1995;270:368-9，371)。
[0017]自此以後，全世界的科學家們運用微陣列技術已經發表了超過3萬篇論文。多種微陣列被開發出來，以適應各種應用，例如，檢測單核苷酸多態性(SNPs)或基因型或重新測序突變基因組，且微陣列技術的一項重要應用是基因表達分析。的確，基因表達微陣列的發明目的是用作一種分析特定樣本中已表達基因材料水平的方法，但其真正的成功卻在於為同時比較許多基因的表達水平帶來了可能。針對此類實驗，市場上有若干現成的微陣列平臺商品，但也可以製作定製的基因表達陣列。
[0018]雖然微陣列在基因表達研究中的應用現已普及，但顯然，更加先進並全面的所謂「下一代DNA測序」(NGS)技術正開始替代DNA微陣列在許多應用中的位置，例如，深度轉錄組分析。
[0019]用於超快速基因組測序的NGS技術的開發，是生命科學中的一座裡程碑(Petterson E et al, Genomics.2009;93:105-11)。這些新技術已經急劇地降低了 DNA 測序的成本，並能在前所未有的速度下測定高等生物的基因組，包括特定個體的基因組(WadeCM et al Science.2009; 326:865-7; Rubin J et al, Nature2010; 464: 587-91 )。高通量基因組學的新進展已給生物學研究格局帶來了天翻地覆的變化，除基因組完整鑑定外，還能用數位化定量的方式來研究全轉錄組。近年來，用於此類全方位數據組的可視化和整合的生物信息學工具也得到了顯著的進步。
[0020]然而，人們驚奇地發現，對於以二維空間解析度為其信息特徵的組織樣本來說，利用細胞組織學技術、微陣列技術和NGS技術的獨特結合，可從該樣本的多個細胞獲得全面的轉錄或基因組信息。因此，從一個極端角度來說，本發明的方法可用於分析樣本中單一細胞的單一基因的表達，同時保留該細胞在其組織樣本中的空間信息；而從另一個極端及本發明的優選方面來說，所述方法可用於同時確定一個樣本中每個細胞，或基本上所有細胞的每個基因的表達，即:一個組織樣本中的全局空間表達格局。顯然，本發明的方法也可用於中間分析。
[0021]以下簡要說明本發明的最簡化形式。本發明需要反轉錄(RT)引物，該引物還包括獨有的定位標記(結構域)，並將該引物在如玻璃載片等目標基板上排列產生「陣列」。這些獨有的定位標記對應於該RT引物在陣列上的位置(陣列特徵)。將組織薄片放置於陣列上，並在目標載片上進行反轉錄反應。該RT引物與組織樣本中的RNA結合(或雜交)，以結合的RNA作為模版並延長獲得cDNA，所得cNDA也因此貼附在所述陣列表面。由於RT引物的獨一無二定位標記的存在，每個cDNA序列都載有模版RNA在組織切片中的位置信息。在cDNA合成步驟之前或之後，可通過染色或拍照等方法令該組織薄片可視化或成像，令cDNA分子中的定位標記得以與組織樣本中的某個位置相關聯。對該cDNA進行測序，獲得含有準確位置信息的轉錄組結果。該過程的示意圖如圖1所示。然後，可將測序數據與組織樣本中的某個位置配對，令測序數據與組織切片共同可視化，如藉由電腦，例如，展示整個組織上任何感興趣的基因的表達格局(圖2)。類似地，還可以在電腦屏幕上標記組織切片的不同區域，選取任意感興趣的區域並獲得所選區域間不同的表達基因的信息。顯然，本發明的方法可獲得的數據與運用研究mRNA群的現有方法獲得的數據具有鮮明對比。舉例來說，基於原位雜交的方法僅能提供單一 mRNA轉錄體的相對信息。因此，本發明的方法比現有的原位技術具有明顯的優勢。本發明的方法可獲得的全局基因表達信息還可包括共表達信息和轉錄豐度的定量估計。顯然，本方法是一種廣泛適用的方法策略，可應用於任何物種，例如，動物、植物和真菌的任何組織的分析。
[0022]如上所述，並將在下文中詳細論述，該基本方法顯然還可以容易地擴展應用於基因組DNA分析，例如，用於包含一個或多個特異突變的組織樣本的細胞鑑定。舉例來說，可以將基因組DNA斷裂成片段，並與引物(相當於如上所述的RT引物)雜交，該引物能捕獲DNA片段(例如，可在所述DNA片段上連接一個具有所述引物的互補序列的接合物，或可用酶促等方法延長DNA片段，向其序列末端加入額外的核苷酸，如poly-A尾，來生成能與該引物互補的序列)並引導對捕獲分子的互補鏈的合成。該分析的餘下步驟可如上所述。因此，下文中基於轉錄體分析的背景來描述的本發明具體實施例，也可在適宜情形下用於基因組DNA的分析方法中。
[0023]從以上說明中可以看出，與位置信息結合的轉錄組或基因組信息具有巨大的價值。舉例來說，它能夠以高解析度進行全局基因表達繪圖，而這一技術可應用於許多方面，例如包括癌症研究和診斷學研究。
[0024]進一步來說，顯然本發明所述方法與前述用於組織樣本全轉錄組分析的方法間具有顯著差異，且這些差異具有眾多優點。本發明基於一項令人驚奇的發現，即:使用組織薄片並不會干擾由貼附於陣列表面的引物(例如反轉錄引物)所引導的DNA (例如，cDNA)的合成。
[0025]因此，在其首要且最廣泛的意義上，本發明提供一種組織樣本中的核酸局部檢測方法，包括:
[0026](a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類所述探針在所述陣列中 各佔不同位置，且定向為具有3』自由端以使所述探針能作為引導延長反應或連接反應的引物,其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子,所述核酸分子在5』至3』方向上包括:
[0027](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對應，和
[0028](ii)捕獲域；
[0029](b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關聯，並允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交；
[0030](c)以所述捕獲探針作為延長引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子上產生DNA分子，其中所述被延長或連接的DNA分子以定位域標記；
[0031 ] (d)可選地，生成所述被標記DNA的互補鏈和/或可選地，擴增所述被標記DNA ；
[0032](e)從陣列表面釋放至少部分被標記DNA分子和/或它們的互補鏈或擴增子，其中所述部分包括定位域或其互補鏈；
[0033](f)直接或間接分析被釋放DNA分子的序列。
[0034]本發明的方法與本領域其他空間轉錄組學方法相比具有顯著優勢。例如，本發明描述的方法可獲得組織樣本中所有轉錄體的全局和空間分布；此外，還可以量化陣列上的每個位置或特徵上的每個基因的表達，因此能在一個簡單陣列的數據基礎上實施多種分析。因此，本發明的方法使檢測和/或量化單一組織樣本的所有基因的空間表達成為可能。此外，由於轉錄體的豐度非直接可視，例如，通過螢光反應，與標準微陣列相似，即使同一樣本中的所述轉錄體以迥然相異的濃度存在，也可以測量單一樣本中的基因表達。[0035]相應地，在另一個更具體的方面，本發明可看作提供了一種用於測定和/或分析組織樣本轉錄組的方法，包括:
[0036](a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類所述探針在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有3』自由端以使所述探針能作為反轉錄(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括:
[0037](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對應，和
[0038](ii)捕獲域；
[0039](b)令所述組織樣本與陣列接觸，以使陣列上的捕獲探針的位置與組織樣本上的位置相關聯，且允許該組織樣本上的RNA與所述捕獲探針上的捕獲域雜交；
[0040](C)利用所述捕獲探針作為RT引物，從已捕獲的RNA分子生成cDNA分子，且可選地，擴增所述cDNA分子；
[0041](d)從陣列表面釋放至少部分所述cDNA分子和/或可選地，其擴增子，其中所述被釋放的分子可以是cDNA的 第一和/或第二鏈分子或其擴增子，且其中所述部分包括定位域或其互補鏈；
[0042](e)直接或間接地分析被釋放分子的序列。
[0043]如下文所述，所述分析步驟中可以採用任何核酸分析方法。典型地，該步驟可以包括測序，但進行序列測定實際上並非必要步驟。舉例來說，可以採用序列特異性分析方法。例如，可以實施序列特異性擴增反應，比如通過使用引物，且該引物對所述定位域和/或一種特定的目標序列，例如，一種待測的特定目標DNA (即:與一種特定的cDNA/RNA或基因相對應等)，具有特異性。一種典範性的分析方法是序列特異性的PCR反應。
[0044]按照步驟(e)所得到的的序列分析信息可被用於獲得樣本中RNA的空間信息。換句話說，該序列分析信息可以提供有關樣本中RNA的位置信息。該空間信息可從測得的序列分析信息的性質來推定，例如，其可以揭示一種特定RNA的存在，而該RNA可能在所用組織樣本的環境中本身就具有空間信息意義，以及/或者可以結合陣列上組織樣本的位置和測序信息來推定空間信息(例如，空間定位)。因此，本方法可以僅包括將序列分析信息與組織樣本的某個位置相關聯的步驟，例如，利用定位標記和其與組織樣本上某位置間的關聯性。但是，如上所述，作為本發明的一種優選實施方式，可以通過關聯序列分析數據和組織樣本圖像來便利地獲得空間信息。相應地，在一個優選實施例中，所述方法還可以包括一個步驟，即:
[0045](f)將所述序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關聯，其中該組織樣本在步驟(C)之前或之後成像。
[0046]從其最廣義上來說，本發明的方法可以用於組織樣本中某一核酸的局部檢測。因此，在一個實施例中，本發明的方法可用於測定和/或分析組織樣本中的全部轉錄組或基因組，例如，組織樣本的全轉錄組。但是，本方法並不局限於此，而是包括測定和/或分析全部或部分轉錄組或基因組。因此，本方法可以包括測定和/或分析轉錄組或基因組的部分或子集，例如與一個基因子集相對應的轉錄組，又如，一個特定基因子集，如與一種特定的疾病或症狀、組織類型等相關的基因子集。
[0047]從另一方面來看，如上所述的本方法步驟可以看作是提供了一種用於獲取具有空間限定的轉錄組或基因組的方法，特別是含空間限定的組織樣本全局轉錄組或基因組。
[0048]從另一方面來看，本發明的方法可被看做是一種用於組織樣本中的核酸(即DNA或RNA)的局部或空間檢測方法，或用於組織樣本核酸(DNA或RNA)的局部或空間測定和/或分析的方法。特別地，本方法可用於組織樣本中基因表達或基因組變異的局部或空間檢測、確定和/或分析。該局部/空間檢測/確定/分析意味著可對RNA或DNA在組織樣本的細胞或組織中的天然位置或位點進行定位。因此，舉例來說，可將RNA或DNA定位於樣本上的一個細胞、細胞群或細胞類型，或組織樣本中的特定區域。所述RNA或DNA的天然位點或位置(或者換句話說，所述RNA或DNA在組織樣本中的位點或位置),例如，一個已表達的基因或基因組位點，可得到確定。
[0049]本發明還可被看作是提供了一種用於本發明的方法中的陣列，包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類所述探針在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有3』自由端以使所述探針能作為反轉錄(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上含有:
[0050](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對應，和
[0051](ii)捕獲域，用於捕獲與所述陣列相接觸的組織樣本的RNA。
[0052]在一個相關方面上，本發明還提供了一種陣列的用途，該陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類所述探針在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有3』自由端以使所述探針具有反轉錄(RT)引物的功能，其中所述捕獲探針的每一種類包括一個核酸分子，該核酸分子從5』端至3』端的方向上含有:
[0053](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對應，和
[0054](ii)捕獲域；
[0055]用於捕獲與所述陣 列相接觸的組織樣本的RNA。
[0056]優選地，所述用途是用於測定和/或分析組織樣本的轉錄組，特別是全轉錄組，且進一步包括以下步驟:
[0057](a)以所述捕獲探針作為RT引物，從已捕獲的核酸分子生成cDNA分子，且可選地，擴增所述cDNA分子；
[0058](b)從所述陣列表面釋放至少部分所述cDNA分子和/或可選地，其擴增子，其中所述被釋放的分子可以是cDNA分子的第一和/或第二鏈或其擴增子，且其中所述部分包括定位域或其互補鏈；
[0059](c)直接或間接地分析被釋放分子的序列；且可選地
[0060](d)將所述序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關聯，其中所述組織樣本在步驟(a)之前或之後成像。
[0061]因此可知曉，本發明的陣列可用於捕獲RNA，例如與所述陣列接觸的組織樣本的mRNA。所述陣列還可以用於測定和/或分析組織樣本的全轉錄組或部分轉錄組，或用於獲取組織樣本中含空間限定的部分或全局轉錄組。本發明的方法因此可看作組織樣本中一個和多個基因的空間表達的量化方法。換句話說，本發明的方法可用於檢測組織樣本中一個或多個基因的空間表達。再換句話說，本發明的方法可用於同時測定組織樣本中一個或多個位點的一個或多個基因的表達。更進一步，本發明的方法可看作是用二維空間解析度對組織樣本進行部分或全局轉錄組分析的方法。[0062]所述RNA可以是細胞中存在的任何RNA分子。因此，它可以是mRNA、tRNA、rRNA、病毒 RNA、核內小 RNA (snRNA)、核仁小 RNA (snoRNA)、微小 RNA (miRNA)、小幹涉 RNA (siRNA)、與Piwi蛋白相互作用的RNA (piRNA)、核糖體RNA、反義RNA或非編碼RNA。但是，優選為mRNA ο
[0063]上述方法中(與上述優選使用形式中的步驟(a)相對應的)步驟(C)，從已捕獲的RNA為模板生成cDNA,可看作涉及cDNA的合成。其包括已捕獲的RNA的反轉錄步驟，以已捕獲的RNA為模板，延長具有RT引物功能的捕獲探針。該步驟產生所謂的cDNA第一鏈。下面將詳細敘述，在從陣列上釋放cDNA第一鏈之後，可以可選地在陣列上進行cDNA第二鏈的合成，或在一個分開的步驟中進行。下面還將詳細敘述，在某些實施例中，第二鏈的合成可以發生在被釋放的cDNA分子第一鏈擴增的第一個步驟中。
[0064]下文將討論及描述陣列在核酸分析中的一般應用和在DNA分析中的具體應用。在此描述的運用於RNA環境下的陣列和捕獲探針的具體細節和實施方式，(在適當情況下)同樣適用於所有此類陣列，包括用於DNA的陣列。
[0065]本發明中的措辭「多種」意為兩種或以上，或至少兩種，例如，3、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、400、500、1000、2000、5000、10000，或更多，等等。因此，
舉例來說，捕獲探針的數目可以是上述任意兩個數字之間的任一整數。但是，可知曉，根據設想，也可以使用含有成百、上千、上萬、十萬或甚至百萬個捕獲探針的傳統型陣列。
[0066]因此，在此概述的方法採用了高密度核酸陣列，所述陣列含有「捕獲探針」，用以捕獲和標記組織樣本中所 有單個細胞的轉錄體，，所述組織樣本例如組織樣品薄片，即「切片」。用於分析的組織樣本或切片以高度平行的方式製備，以保存所述切片中的空間信息。每個細胞中已捕獲的RNA (優選為mRNA)分子，或「轉錄組」，被轉錄為cDNA並進行cDNA分析，例如，進行高通量測序。可通過整合在排布於陣列中的核酸探針上的所謂識別碼序列(或ID標記，在此定義為定位域)，將所得數據與切片等原始組織樣本的圖像相關聯。
[0067]高密度核酸陣列或微陣列，是在此所述的空間轉錄組標記方法的核心部分。微陣列是一種用於分子生物學的多重技術。一個典型的微陣列包括一系列陣列排布的寡核苷酸微點(一個陣列上可整合成千上萬個微點，通常為上萬個)。每個核酸(寡核苷酸)微點的不同位置(每一種類的寡核苷酸/核酸分子)稱為「特徵」(因此上述方法中捕獲探針的每一種類皆可看作是陣列的一個特定特徵；每一特徵在陣列上佔有不同的位置)，且典型地，每個單獨的特徵含有皮摩爾(10_12摩爾)量級的特定DNA序列(一種「種類」)，即所稱的「探針」(或「報告子」)。典型情況下，所述探針可以是一小段基因或其他核酸成分，能夠在高嚴格度的雜交條件下與cDNA或cRNA樣本(即「目標」)進行雜交。但是，如下所述，本發明中的探針不同於標準微陣列中的探針。
[0068]在基因表達微陣列中，以探針為目標的雜交反應常通過對視覺信號的檢測來進行檢測和量化，例如連接在所有目標上的螢光團、銀離子或化學螢光標記。該視覺信號的強度與樣本中每個目標核酸的相對豐度有關。由於一個陣列可以含有上萬個探針，一個微陣列實驗可以完成許多基因的並行測試。
[0069]在標準微陣列中，探針與環氧矽烷、氨基矽烷、賴氨酸或聚丙烯醯胺等化學基質通過共價鍵結合附著在固體表面或基板上。典型的基板是玻璃、塑料、矽質晶片或載片，但也有其他的已知微陣列平臺，例如微珠。[0070]探針可通過任何適當的方法附著在本發明的陣列上。在一個優選實施例中，探針通過化學固定法固定在基板上，所述化學固定法可以是基板(支撐材料)和探針間基於化學反應的相互作用。這樣的化學反應一般不依賴於熱或光的能量輸入，但可以通過施加熱量(例如給予化學反應的某個理想溫度)或某波長的光來促進反應。舉例來說，基板上的功能基團和探針上的對應功能要素之間可以發生化學固定反應。探針的此類對應功能要素可以是探針所固有的化學基團，例如羥基，或另外引入的基團。此類功能基團的一個例子是胺基。典型情況下，待固定的探針含有功能性胺基，或通過化學修飾引入了功能性胺基。此類化學修飾的方法和途徑已被熟知。
[0071]待固定的探針中的所述功能基團的定位，可用於控制和塑造探針的結合行為和/或方向，例如，該功能基團可以放置於探針的5』端、3』端或探針序列之中。待固定的探針的典型基板含有能與該探針相結合的基團，例如，能與胺基功能化的核酸相結合的基團。此類基板的示例包括羧基、醛類或環氧基板。此類材料已為本領域技術人員所知。能在由於引入胺基而具有化學活性的探針間引發連接反應的功能基團，以及陣列基板，都為本領域技術人員所知曉。
[0072]可用於探針固定的可選基板可能需要經過化學活化，例如，對陣列基板上的功能基團的活化。術語「活化的基板」涉及一種材料，該材料含有能夠相互作用或具有反應活性的化學基團，且所述基團已通過本領域技術人員所知的化學修飾步驟建立或啟動。例如，一種含有羧基的基板必須經過活化才能使用。進一步來說，有現成的含有能與核酸探針已有特定基團相反應的功能基團的基板。
[0073]可選地，所述探針可以直接在基板上合成。此類方法的適當步驟為本領域技術人員所知。例如,Agilent Inc.>Affymetrix Inc.、Roche Nimblegen Inc.或 Flexgen BV PJf開發的製造技術 。典型情況下，採用雷射和鏡組對待添加核苷酸的微點進行特定活化。此類方法可以提供如30 μ m或以上的光斑大小(即特徵)
[0074]因此，所述基板可以是本領域技術人員所知的任何適當基板。該基板可以採取任何恰當的形式或格式，例如，可以是扁平的，或彎曲的，如相對於組織樣本和基板發生相互作用的區域凸起或凹進。特別優選地，基板是一種平面，即二維的晶片或載片。
[0075]典型地，基板是固相載體，因此基板上的探針能獲得準確並可追溯的定位。基板的一個示例是含有功能性化學基團的固相材料或基板，所述化學基團為例如胺基或胺基功能化基團。本發明所設想的基板為無孔基板。優選的無孔基板為玻璃、矽、聚賴氨酸塗層材料、硝化纖維、聚苯乙烯、環狀烯烴共聚物(COCs )、環狀烯烴高分子(COPs )、聚丙烯、聚乙烯和聚碳酸酯。
[0076]可採用任何本領域技術人員所知的適當材料。典型情況下採用的是玻璃或聚苯乙烯。聚苯乙烯是疏水性材料，適合用於結合負電荷大分子，因為其通常幾乎不含親水性基團。對於固定於玻璃載片上的核酸來說，進一步已知，通過增加玻璃表面的疏水性，可增進核酸固定。這一增進可允許相對來說更為密集的陣型。除聚賴氨酸塗層或表面處理外，該基板，尤其是玻璃基板，還可以進行矽烷化處理，例如，進行環氧矽烷或氨基矽烷處理，烷化處理，或聚丙烯醯胺處理。
[0077]市場上有若干現成的標準陣列商品，其特徵的數量和大小都可以變化。本發明中，特徵的排列可隨著不同組織或器官所具有的細胞尺寸和/或密度而改變。例如，典型的動物細胞橫斷面在1-100 μ m左右，而典型的植物細胞的橫斷面可能在1-10000 μ m範圍內變化。因此，對動物或真菌的組織樣本，優選採用具有多達210萬特徵或420萬特徵，且特徵大小為13微米的Nimblegen?|陣列，而對植物組織樣本來說，其他格式，例如8x130k特徵的格式就足夠了。對於序列分析，尤其是NGS技術，也有現成的商品陣列，或已知可用於此領域的商品陣列。此類陣列亦可用作本發明範圍中的陣列表面，例如，Illumina微珠陣列。除本身可以定製化的現成商品陣列外，還可以製作定製或非標準的「自製」陣列，且製作陣列的方法已經完善確立。無論標準和非標準陣列，只要含有下文定義的探針，便可在本發明的方法中使用。
[0078]優選地，取決於陣列的化學基質，微陣列上的探針通過5』或3』端固定在陣列上，即:附著或結合於陣列上。典型情況下，對於可購得的商品陣列來說，探針通過3』端的連接實現附著，因此留下5』端為自由端。但是，也有通過5』端的連接實現附著，留下3』端為探針自由端的陣列，且如本發明其他部分所述，此類陣列可以通過本領域公知的標準技術加以合成。
[0079]將核酸探針連接在陣列基板上的共價鍵，既可看作直接連接，也可看作間接連接，因為雖然探針的附著是通過「直接」的共價鍵實現的，但可能存在某些化學部分或連接物，將核酸探針的「第一個」核苷酸從玻璃或矽質等材料的基板上分隔開，即:間接連接。就本發明的目的而言，利用共價鍵和/或化學連接物固定到基板上的探針，一般看作是直接固定或附著於基板上。
[0080]本發明的捕獲探針可以直接或間接固定於陣列或與陣列相互作用，對此，下文中將會更詳細地加以描述。因此，捕獲探針無需直接結合在陣列上，而是可以間接地相互作用，例如，與一個直接或間接地結合在陣列上的分子相結合(例如，捕獲探針可以和捕獲探針結合伴侶相互作用(例如，結合或與之雜交)，所述結合伴侶即直接或間接結合在陣列上的表面探針)。但是，一般來說，捕獲探針將直接或間接(通過一種或多種中間媒介)地結合或固定在陣列上。
[0081]本發明的用途、方法和陣`列可以包括通過5』或3』端固定的探針。但是，當捕獲探針直接固定到陣列基板上時，其採用的固定方式必須保證捕獲探針的3』端可供自由延長，例如，通過5』端固定該探針。可以間接固定該捕獲探針，以使其具有自由的3'端，即可供延長的3』端。
[0082]已延長或可延長的3』端，意味著可以將更多的核苷酸添加於核酸分子(例如捕獲探針)的3』端末端核苷酸上，以延長核酸分子的長度，即:利用標準聚合反應來延長核酸分子，例如，利用聚合酶催化的模版化聚合反應。
[0083]因此，在一個實施例中，陣列含有以其3』端直接固定的探針，即下文中定義的所謂表面探針。每一種類的表面探針都含有與一種種類的捕獲探針互補的區域，以能令捕獲探針與表面探針雜交，形成具有自由可延長的3』端的捕獲探針。本發明的一種優選方面中，若陣列含有表面探針，則在陣列上原位合成捕獲探針。
[0084]陣列探針可以由核糖核苷酸和/或脫氧核糖核苷酸，以及能夠參與Watson-Crick或類似類型的鹼基互配反應的合成核苷酸殘基所組成。因此，所述核酸可以是DNA或RNA或其任何修飾產物，例如，PNA或其他含有非核苷酸骨架的衍生物。但是，在轉錄組分析環境中，捕獲探針的捕獲域必須能夠引導反轉錄反應，生成與已捕獲的RNA分子互補的cDNA。下文中會進一步詳細敘述，在基因組分析環境中，捕獲探針的捕獲域必須能夠與DNA片段結合，結合對象可以是DNA片段上添加的結合域。在一些實施例中，所述捕獲探針的捕獲域可以引導DNA延長(聚合酶)反應，生成與已捕獲的DNA分子互補的DNA。在其他一些實施例中，捕獲域可以作為模版參與已捕獲的DNA分子和直接或間接固定於基板上的表面探針間的連接反應。在其他一些實施例中，捕獲域可以連接至已捕獲的DNA分子的其中一條鏈上。
[0085]本發明的一個優選實施例中，捕獲探針至少在其捕獲域中含有或只含有脫氧核糖核苷酸(dNTPs )。在一個特定的優選實施例中，整個捕獲探針都含有或只含有脫氧核糖核苷酸。
[0086]本發明的一個優選實施例中，捕獲探針直接固定在陣列基板上，即:通過其5』端固定，其3』端自由可延長。
[0087]本發明的捕獲探針含有至少兩種結構域，即捕獲域和定位域(或特徵標識標籤或特徵標識域；可選地，所述定位域可定義為標識(ID)域或標籤，或定位標籤)。捕獲探針可以進一步含有如下文中定義的通用域。當捕獲探針通過與表面探針雜交而間接附著於陣列表面時，捕獲探針需有與表面探針互補的序列(例如，一個部分或結構域)。此類互補序列可以與表面探針的定位/標識域和/或通用域互補。換句話說，定位域和/或通用域可以構成探針上與表面探針互補的區域或部分。但是，捕獲探針還可以含有與表面探針互補的附加域(或區域、部分或序列)。如下文所述，為便於合成，此類與表面探針互補的區域可以是捕獲域中的部分或捕獲域的延長部分(此類部分或延長部分自身不用於或不能夠與RNA等目標核酸結合)。
[0088]典型的捕獲域位於捕獲探針的3』端，且含有可供延長的自由3』端，例如，通過模版化的聚合反應。捕獲域含有能夠跟與陣列接觸的組織樣本中的細胞的核酸雜交的核苷酸序列，所述核酸例如RNA (優選為mRNA )。
[0089]優選地，可以對捕獲域進行選擇或設計，使其可以選擇性或特異性地結合(或更寬泛地說，可以有能力結合)特定核酸，例如所需檢測或分析的RNA。舉例來說，捕獲域可以經過選擇或設計來選擇性地捕獲mRNA,如本領域中熟知,基於與mRNA的poly-A尾的雜交反應實現。因此，在一個優選實施例中，捕獲域含有poly-T DNA寡核苷酸，即:一系列以磷酸二酯鍵連接的連續脫氧胸腺喃唳核苷殘基，能夠與mRNA的poly-A尾雜交。可選地,捕獲域可以含有與poly-T功能類似或結構類似的核苷酸,即有能力選擇性地與poly-A選擇性結合的核苷酸，例如Poly-U寡核苷酸，或由脫氧胸腺嘧啶核苷類似物組成的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸保留了與poly-A結合的功能特性。在一個特定的優選實施例中，捕獲域，或更具體地說，捕獲域的poly-T元件，含有至少10個核苷酸，優選為至少11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個核苷酸。在一個進一步的實施例中，捕獲域，或更具體地說，捕獲域的poly-T元件，含有至少25、30或35個核苷酸。
[0090]如本領域所知，捕獲核酸還可以用隨機序列，例如，隨機六聚體或類似序列，因此，此類隨機序列可用於組成全部或部分捕獲域。舉例來說，隨機序列可與poly-T (或poly-T類似物等)序列共同使用。因此，含有poly-T (或「poly-T類似物」)寡核苷酸的捕獲域，還可以含有隨機寡核苷酸序列。例如，所述隨機寡核苷酸序列可以位於poly-T序列的5』或3』端方向，例如位於捕獲探針的3』端，但此類隨機序列的位置並無關鍵意義。這樣的結構有利於捕獲mRNA的poly-A尾的起始端。可選地，捕獲域可以整個是隨機序列。再者，如本領域所知原理，還可以使用簡併捕獲域。
[0091]捕獲域能夠選擇性地與所需的核酸亞型或子類結合，舉例來說，RNA，例如某個特定種類的RNA，如前述列舉的mRNA或rRNA等；或者，能夠與指定RNA類型的特定子集結合，例如，一種特定的mRNA，如與某一特定基因或基因群對應的mRNA。此類捕獲探針可以基於想要捕獲的RNA的序列來選擇或設計，因此可以是針對特定RNA目標或群體目標(目標群等)的序列特異性捕獲探針。因此，按照本領域熟知的原理，所述捕獲探針可以是基於特定基因序列或特定序列基元或共有/保守序列等。
[0092]一些實施例中，捕獲探針通過例如與表面探針的雜交而間接固定於陣列基板上，其捕獲域可以進一步含有能夠與表面探針的5』端雜交的一個上遊序列(位於與RNA等組織樣本核酸雜交的序列的5』端方向)。單獨來看，捕獲探針的捕獲域可以看作是捕獲域寡核苷酸，在捕獲探針間接固定在陣列上的實施例中，所述捕獲域寡核苷酸可用於捕獲探針的合成。
[0093]捕獲探針的定位域(特徵標識域或特徵標識標籤)位於捕獲域的直接上遊或間接上遊，即靠近捕獲探針核酸分子的5』端。優選地，定位域與捕獲域直接相鄰，即捕獲域和定位域之間沒有間隔序列。在一些實施例中，定位域構成捕獲探針的5』端，能直接或間接固定在序列基板上。
[0094]如上文論述，陣列的每一特徵(即不同位置)都含有一種核酸探針的微點，其中每個特徵中存在的定位域都是獨一無二的。因此，探針「種類」根據其具有的定位域來限定；同一種類的捕獲探針具有同樣的定位域。但是，並不要求一個種類下的每個捕獲探針都具有完全相同的序列。特別是，由於捕獲域可以是或可以含有隨機或簡併序列，因此一個種類中的個體探針的捕獲域可能多種多樣。相應地，一些實施例中，捕獲探針的捕獲域相同，每個特徵中存在單一的探針序列，但是在另一些實施例中，捕獲探針則各不相同，一個探針種類下的成員不會含有一模一樣的序列，雖然該種類中每個成員的定位域序列是相同的。需要滿足的要求是:陣列的每個特徵或位置各自具有單一種類的捕獲探針(具體來說，每一特徵或位置載有的捕獲探針具有等同的定位標籤，即每個特徵或位置上具有單一定位域)。每個種類的探針具有不同的定位域，以區分種類。但是，一個種類下的每個成員，在一些情況下，如在此進一步詳細敘述所說，可以具有不同的捕獲域，因為捕獲域可以是隨機或簡併的，或含有隨機或簡併的組件。這意味著，在一個指定的特徵或位置上，探針的捕獲域可以不同。
[0095]因此，在其中一些實施例，但不一定是全部實施例中，固定在特定特徵上的任一探針分子與固定於同一特徵的其他探針分子具有相同的核苷酸序列，但每個特徵上的探針與固定在其他各特徵的探針的核苷酸序列彼此之間各不相同、差別迥異或可以區別。優選地，每個特徵含有一種不同種類的探針。但是，在一些實施例中，優選地，可以製作一個含有相同種類探針的特徵群，即製造一個有效覆蓋陣列某一區域的特徵，該特徵大於單一特徵，例如，可降低陣列的解析度。在該陣列的其他實施例中，一個特定特徵上固定的任一探針分子可以和固定在同一特徵的其他探針分子具有相同的定位域核苷酸序列，但其捕獲域可以不同。但是，捕獲域通常可以設計成捕獲相同種類的分子，例如mRNA。
[0096]捕獲探針的定位域(或標籤)含有專屬於每個特徵的序列，充當定位或空間標記(標識標籤)。這樣一來，通過將某一細胞中的核酸如RNA (例如轉錄體)等連接到陣列中捕獲探針的獨有定位域序列上，就能利用所述陣列的全陣列空間解析度辨識組織樣本的每個區域或結構域，例如組織中的每個細胞。通過定位域，陣列中的捕獲探針可以與組織樣本的某一位置相關聯，例如，可以與樣本中的某一細胞相關聯。因此，捕獲探針的定位域可被看作是核酸標籤(標識標籤)。
[0097]任何合適的序列都可以用作本發明的捕獲探針的定位域。合適的序列的意思是，其作為定位域，不會幹涉(即抑制或扭曲)組織樣本的RNA和捕獲探針的捕獲域之間的反應。例如，定位域應當設計為不具有與組織樣本中的核酸分子相雜交的特異性。優選地，捕獲探針定位域的核酸序列與組織樣本核酸序列之間的序列一致性低於80%。優選地，捕獲探針的定位域與組織樣本中大部分的核酸分子的序列一致性低於70%、60%或40%。序列一致性可以通過本領域已知的適當方法測定，例如，使用BLAST比對算法。
[0098]在一個優選實施例中，每種捕獲探針的定位域都含有獨一無二的識別碼序列。識別碼序列可以通過隨機序列生成。接下來，所述隨機生成的序列可通過映射於所有種類的常見參考基因組和預設的Tm間隔、GC含量和與其他識別碼序列間的限定距差來進行嚴格篩選，以保證識別碼序列不會對核酸捕獲過程形成幹涉，例如不會對來自組織樣本的RNA的捕獲形成幹涉，並且識別碼序列之間能夠毫無困難地相互區分。
[0099]如上所述,在一個優選實施例中，捕獲探針還包括一個通用域(或連接域或連接標籤)。捕獲探針的通用域位於定位域的直接上遊或間接上遊，即靠近捕獲探針核酸分子的5』端。優選地，通用域與定位域直接相鄰，即定位域和通用域之間沒有間隔序列。在一些實施例中，捕獲探針含有通用域，所述通用域形成捕獲探針的5』端，用以直接或間接固定在陣列基板上。
[0100]本發明的方法和用途中，通用域可以有多種用途。舉例來說，本發明的方法包括從陣列表面釋放(例如移除)至少一部分已合成的(即已延長或連接的)核酸(例如cDNA)分子的步驟。如本發明其它部分所述，這一步驟可以用多種方法實現，其中一種方法包括將核酸(例如cDNA)分子從陣列表面上剪切下來。因此，通用域自身可以含有一個剪切域，即:可以通過化學方法，或優選地，通過酶促方法，進行特異剪切的序列。
[0101]因此，剪切域可以含有可被一個或多個具有核酸分子剪切功能(即有能力斷開兩個或以上核苷酸之間的磷酸二酯鍵)的酶所識別的序列。例如，剪切域可以含有限制性核酸內切酶(限制酶)識別序列。限制性酶在稱為「限制性位點」的特異識別核酸序列處切斷雙鏈或單鏈DNA，適用的酶為本領域所熟知。例如，特別優選地，可以使用稀有剪切限制酶，即具有長限制性位點(長度至少為8個鹼基對)的酶，以降低誤剪cDNA等核酸分子上其他位置的可能性。在此方面，可知曉，移除或釋放至少部分cDNA等核酸分子，需釋放的部分為cDNA等核酸分子中含有定位域的部分及其下遊的整個序列，即:定位域後3』端方向的整個序列。因此，cDNA等核酸分子的剪切應當在定位域的5』端方向實施。
[0102]舉例來說，剪切域可以含有po I y-U序列，對所述po I y-U序列的剪切可以用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和市場上稱為USER?酶的DNA糖基化酶-裂解酶核酸內切酶VIII。
[0103]剪切域的進一步運用示例可見於捕獲探針間接(即通過表面探針)固定在陣列基板上的實施例。其中，剪切域可以含有一個或多個錯配的核苷酸，即:表面探針的互補部分和捕獲探針並非100%互補。此類錯配通過例如MutY和T7核酸內切酶I來識別，結果為對錯配位點的核酸分子的剪切。[0104]本發明的一些實施例中，捕獲探針的定位域含有剪切域，其中所述剪切域位於定位域的5』端。
[0105]通用域還可以含有擴增域，作為剪切域的附加或替代部分。本發明的一些實施例中，如本發明其他部分所述，優選地，可以在核酸分子(如cDNA)從陣列基板釋放(例如移除或切除)後對其進行擴增。但是可知曉，擴增的初始循環，或者以及其後的任一或全部的後續擴增循環還可以在陣列上原位實施。擴增域含有能與擴增引物雜交的獨特序列。優選地，每個種類的捕獲探針的通用域的擴增域相同。因此，一次擴增反應將足以擴增所有核酸分子(如cDNA等)(無論所述核酸分子是否在擴增反應前從陣列基板上釋放)。
[0106]任何合適的序列都可用作本發明的捕獲探針的擴增域。「合適的序列」的意思是，其作為擴增域不會幹涉(即抑制或扭曲)組織樣本核酸(如RNA等)和捕獲探針的捕獲域之間的相互作用。進一步來說，所述擴增域應當含有與組織樣本核酸(如RNA)的任何序列不同或大體不同的序列，以保證擴增反應的引物在反應的擴增條件下僅能同擴增域雜交。
[0107]舉例來說，所述擴增域應當設計為，該擴增域或其互補序列不會與組織樣本中的核酸分子特異雜交。優選地，捕獲探針擴增域的核酸序列及其互補鏈與組織樣本核酸序列的序列一致性低於80%。優選地，捕獲探針的擴增域與組織樣本中大部分核酸分子的序列一致性低於70%、60%或40%。序列一致性可以通過本領域已知的適當方法測定，例如，使用BLAST比對算法。
[0108]因此，單獨來看，捕獲探針的通用域可以看做是一個通用域寡核苷酸，在捕獲探針間接固定於陣列上的實施例中，所述通用域寡核苷酸可用於捕獲探針的合成。
[0109]本發明的一個代表性實施例中，只有每種捕獲探針的定位域是獨一無二的。因此，同一實施例中的任何特定陣 列上，每種捕獲探針的捕獲域和通用域(若適用)分別相同，以保證對組織樣本核酸(例如RNA)的捕獲具有全陣列一致性。但是,如上文論述,在一些實施例中，一些捕獲域可能因為包含了隨機或簡併序列而產生區別。
[0110]在一些實施例中，捕獲探針間接固定(例如通過與表面探針雜交)在陣列基板上，此類捕獲探針可按下文所述在陣列上合成。
[0111]表面探針直接用其3』端或於其3』端固定在陣列基板上。表面探針的每個種類與陣列上的每個特徵(不同位置)為唯一對應關係，並與上文中定義的捕獲探針部分互補。
[0112]因此，表面探針的5』端含有一個結構域(互補捕獲域)，所述互補捕獲域能與捕獲域中不與組織樣本核酸(如RNA)結合的部分相互互補。換句話說，所述互補捕獲域能與捕獲域寡核苷酸至少部分雜交。表面探針進一步含有一個與捕獲探針的定位域互補的結構域(互補定位域或互補特徵標識域)，該互補定位域位於互補捕獲域的直接下遊或間接下遊(即其3』端方向)，即:互補定位域和互補捕獲域之間可以用一個間隔序列或連接序列相分隔。在一些實施例中，捕獲探針在陣列表面合成，所述陣列的表面探針總在其3』端方向，SP定位域的直接或間接下遊方向，含有一個與捕獲探針的通用域互補的域(互補通用域)，換句話說，含有一個能與通用域寡核苷酸至少部分雜交的域。
[0113]本發明的一些實施例中，表面探針的序列與定位域和通用域之間，以及與捕獲域中不與組織樣本核酸(如RNA)結合的部分之間，具有100%的互補性或序列一致性。在其他實施例中，表面探針序列與捕獲探針的這些結構域之間的序列一致性則可能低於100%，例如，低於99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%。本發明的一個特定優選實施例中，互補通用域與捕獲探針的通用域之間的序列一致性低於100%。
[0114]本發明的一個實施例中，捕獲探針在陣列基板上合成或生成。在一個代表性實施例中(見圖3)，陣列含有如上文定義的表面探針。與捕獲探針的捕獲域和通用域相對應的寡核苷酸與陣列相接觸，並能夠與表面探針的互補域相雜交。過量的寡核苷酸可以通過在標準雜交條件下進行洗滌來移除。所得的陣列含有部分單鏈探針，其中表面探針的5』和3』端均為雙鏈，而互補定位域為單鏈。可以用聚合酶來處理陣列，依靠模版來延長通用域寡核苷酸的3』端，以合成捕獲探針的定位域。可利用連接酶等連接已合成的定位域的3』端與捕獲域寡核苷酸的5』端，來生成捕獲探針。可知曉，為達成此目的，可以使捕獲域寡核苷酸的5』端磷酸化來實現連接反應。由於每一種類的表面探針都含有獨一無二的互補定位域，因此每一種類的捕獲探針將含有獨一無二的定位域。
[0115]在此使用的術語「雜交反應」或「雜交」，指的是具有足夠的互補性，可通過Watson-Crick鹼基配對結合成雙鏈的核苷酸序列之間的雙鏈形成反應。兩個核苷酸序列相互「互補」，指的是其分子的鹼基配對具有組織結構同源性。「互補」的核苷酸序列在適當的雜交條件下特異結合，形成穩定的雙鏈。舉例來說，如果第一條序列上的一部分與第二條序列上的一部分能夠以逆向平行的方式相結合，其中一個序列的3』端與對方序列的5』端相結合，且序列之一的每個A、T (U)、G和C都能與對方序列的T (U)、A、C和G分別結合，則這兩條序列互補。RNA序列還可以含有互補的G=U或U=G鹼基序列。因此，本發明中的兩個「互補」序列無需具有完美的同源性。一般來說，如果兩條序列在其分子的一段指定長度上，至少有90% (優選為至少約95%)的核苷酸的鹼基配對組織結構相同，則這兩條序列具有足夠的互補性。因此，捕獲探針和表面探針的結構域中含有一個互補區域。進一步地，捕獲探針的捕獲域中含有一個互補區域，能與組織樣本核酸，例如RNA (優選為mRNA)互補。
[0116]還可以利用聚合酶延長反應(與上文所述類似)和末端轉移酶加「尾」反應，在陣列基板上合成捕獲探針，所加的「尾」可以構成捕獲域，下文的實施例7中對此做了進一步描述。使用末端轉移酶向寡核苷酸末端添加核苷酸序列的技術為本領域所知，例如，引入一條同聚物尾巴，如poly-T尾。相應地，在此類合1`成反應中，與捕獲探針的通用域對應的寡核苷酸可以與陣列相接觸，並與表面探針的互補域雜交。過量的寡核苷酸可以通過在標準雜交條件下進行洗滌來移除。所得的陣列含有部分單鏈探針，其中表面探針的5』和3』端均為雙鏈，互補定位域為單鏈。可以用聚合酶來處理陣列，依靠模版來延長通用域寡核苷酸的3』端，以合成捕獲探針的定位域。然後，要引入捕獲域，例如含有poly-T序列的捕獲域，可通過末端轉移酶來添加poly-T尾，以生成捕獲探針。
[0117]本發明的典型陣列以及用於本發明的方法中的陣列，可以含有多個微點，或「特徵」。特徵可定義為陣列基板上的區域或不同位置，該位置上固定有單一種類的捕獲探針。因此，每一特徵將含有同一種類的多個探針分子。可知曉，在此設定下，雖然相同種類的每個捕獲探針可以具有相同的序列，但這並非必要的條件。捕獲探針的每個種類將具有相同的定位域(即:同一種類的每個成員，乃至於同一特徵中的每個探針，都具有相同的「標記」)，但同一特徵(種類)的每個個體探針的序列可以不同，這是因為捕獲域的序列可以有區別。如上所述，可以採用隨機或簡併的捕獲域。因此，同一特徵中的捕獲探針可以含有不同的隨機或簡併序列。陣列上的特徵數量和密度將決定陣列的解析度，即:組織樣本的轉錄組或基因組用於分析的細節層次。因此，一般來說，特徵的密度提高，陣列的解析度也會隨之增加。
[0118]如上所述，本發明的陣列特徵的大小和數量取決於組織樣本的性質和所需的解析度。因此，如果只想要確定組織樣本內的成片細胞(或樣本含有大細胞)的轉錄組或基因組，便可減少陣列特徵的數量和/或密度(即:減少特徵的最大可能數量)和/或增加特徵的大小(即:每個特徵的面積可以大於最小的可能特徵)，例如，含有少量大特徵的陣列。可選地，如果想要確定樣本中個體細胞的轉錄組或基因組，便可能需要使用最大可能數量且最小可能尺寸的特徵，例如，含有許多小特徵的陣列。
[0119]雖然單一細胞解析度可以是本發明的一個優選特徵，但其並非必要目的；細胞群水平的解析度也是本發明的目的之一，例如，檢測或分辨特定的細胞類型或組織區域，如正常細胞vs腫瘤細胞。
[0120]本發明的代表性實施例中，陣列可以含有至少2、5、10、50、100、500、750、1000、1500、3000、5000、10000、20000、40000、50000、75000、100000、150000、200000、300000、400000、500000、750000、800000、1000000、1200000、1500000、1750000、2000000、2100000.3000000,3500000,4000000 或 4200000 個特徵。雖然 4200000 代表了目前可購得
的商品陣列的最大可能特徵數量，但根據本發明的構思，本發明中可以製備特徵超過此數量的陣列，且此類陣列為發明目的之一。如上所述，可以降低特徵大小並在相同或相似面積中提高特徵的數量。舉例來說，這些特徵可以被容納在約20cm2、10cm2、5cm2、lcm2、1mm2、orlOO μ m2以下的面積中。
[0121]因此，本發明的一些實施例中，每個特徵的面積可以是約I μ m2、2 μ m2、3 μ m2、4ym2、5ym2、10ym2、12ym 2、15ym2、20ym2、50ym2、75ym2、100ym2、150y m2、200 μ m2、250 μ m2、300 μ m2、400 μ m2 或 500 μ m2.[0122]可知曉，本發明的方法可以用在任何生物體的組織樣本上，例如，植物、動物或真菌。本發明的陣列可用於捕獲細胞中任何能夠進行轉錄和/或翻譯的核酸，例如mRNA分子。本發明的陣列和方法特別適用於分離和分析樣本中的細胞的轉錄體或基因組，且需要獲取轉錄組或基因組的空間解析度的時候，例如，在細胞相互連通或與相鄰細胞直接接觸的情況下。然而，對本領域技術人員來說，本發明的方法顯然還可以用於樣本中不同細胞或不同細胞類型的轉錄組或基因組分析，哪怕所述細胞並無直接相互作用，例如，血液樣本。換句話說，陣列可適用的細胞無需是組織細胞，也可以單個細胞(例如，從未固定組織中分離的細胞)。所述單個細胞無需是固定在組織的某個位置上的細胞，但仍可以放置在陣列的某個位置上，並可單獨進行辨認。因此，在對無直接相互作用的細胞或非組織細胞進行分析的時候，所述方法的空間性質可以用於獲取或檢索個體細胞的獨有或獨立的轉錄組或基因組信肩、O
[0123]因此，樣本可以是死體或活體組織樣本，或可以是培育樣本。代表性的示例包括臨床樣本，例如全血或血製品、血細胞、組織、活體組織或培育組織、細胞等等，包括其細胞懸液。例如，可以用細胞懸液(例如含有血細胞)製備人工樣本。可以將細胞固定在一種基質(例如，凝膠基質，如瓊脂、瓊脂糖等等)中，然後以常規方法切片。此類操作在本領域的免疫組織化學中為人所知(例如，見Andersson et al2006, J.Histochem.Cytochem.54(12):1413-23.Epub2006Sep6)ο
[0124]組織製備形式和製得樣本的處理方式，可能對本發明的轉錄組或基因組分析造成影響。另外，各種不同的組織樣本可能具有不同的物理特徵，本領域技術人員可以實施必要的操作來獲得本發明的方法中使用的組織樣本。但是，從本公開中，顯而易見，本發明中可以使用任何適當的樣本製備方法來獲得組織樣本。例如，任何厚度在約I個細胞或更薄的細胞層都可以用在本發明的方法中。在一個實施例中，組織樣本的厚度可以薄於細胞橫截面的0.9,0.8,0.7,0.6,0.5,0.4,0.3,0.2或0.1倍。然而，如上所述，本發明並不限於單一細胞解析度，因此，並不要求組織樣本的厚度薄於單個細胞直徑或更小；如果需要，可以採用較厚的組織樣本。例如，可以採用冷凍切片，其厚度可能是例如10-20 μ m。
[0125]可以用任何基於方便或需要的方式製備組織樣本，本發明不限於任何特定的組織製備類型。新鮮的、冷凍的、固定的、未固定的組織都可以使用。可以基於需要和便利，用本領域中知曉、記載的任何方法對組織樣本進行固定或包埋。因此，可以使用任何已知的固定劑或包埋材料。
[0126]作為本發明中使用的組織樣本的第一個代表性示例，可以在適合保持或保藏組織結構完整性(即物理特徵)的溫度下對組織進行深度冷凍的製備，例如，低於_20°C，優選地，低於-25、-30、-40、-50、-60、-70或_80°C。可以對冷凍組織樣本進行切片，即以任何方法切成薄片且置於陣列表面。舉例來說，製備組織樣本可以利用冷凍超薄切片機，溫度設置適合保持組織樣本結構完整性和樣本核酸化學性質的低溫箱，例如低於_15°C，優選為低於-20或-25°C。因此，對樣本的處理應當令組織中的核酸(例如RNA)的退化或降解最小化。此類操作條件為本領域所熟知，任何程度的降解都可以通過核酸提取來監控，例如，在組織樣本製備的各階段進行總RNA提取和質量分析。
[0127]在第二個代表性示例中，可以用福馬林固定和石蠟包埋(FFPE)的標準辦法製備組織，所述方法在本領域中已非常完善。在組織樣本固定及以石蠟或樹脂封閉物包埋之後，可以對組織樣本進行切片，即:切成薄片置於陣列上。如上所述，也可以採用其他固定劑和/或包埋材料。
[0128]顯然，實施本發明的方法之前，需要處理組織樣本切片，來去除樣本上的包埋材料，例如，通過脫蠟，即去除石蠟或樹脂。該步驟可以通過任何適當的方法來完成，且本領域中去除樣本上的石蠟或樹脂或其他材料的方法已經建立完善，例如，通過以適當的溶劑，例如二甲苯，(在陣列表面)培養樣本，例如培養兩次，各10分鐘，接著以乙醇淋洗，例如用99.5%的乙醇淋洗2分鐘，96%的乙醇淋洗2分鐘以及70%的乙醇淋洗2分鐘。
[0129]對本領域技術人員來說，以FFPE或其他固定和包埋方法製備的組織切片中的RNA，顯然比冷凍組織中的RNA更可能產生部分降解。然而，本發明無意受到任何特殊理論的限定，因此，採用前者組織對本發明方法來說可以是一種優選形式。舉例來說，如果樣本中的RNA部分降解，則相對於未降解的樣本來說，其RNA聚核苷酸的平均長度更短，且或多或少得到了隨機化。因此可以推定，在本發明其他部分中所述的各種處理步驟中，例如，接合體(擴增域)的連接反應、cDNA分子的擴增及測序中，部分降解的RNA所帶來的誤差更少。
[0130]因此，在本發明的一個實施例中，採用FFPE或其他固定和包埋方法製備組織樣本，即與陣列相接觸的組織樣本的切片。換句話說，樣本可以是已固定的，例如，經過固定和包埋的。本發明的一個可選實施例中，通過深度冷凍來製備組織樣本。在又一個實施例中，可以採用組織的印片，其操作流程為本領域所知。在另外一些實施例中，可以採用未固定的樣本。[0131]本發明的方法中使用的組織樣本的厚度，可以依照樣本製備方法和組織物理特性來決定。因此，本發明的方法可以使用任何適當厚度的切片。本發明的代表性實施例中，組織樣本切片的厚度為至少0.1 μ m，進一步優選為至少0.2,0.3,0.4,0.5,0.7,1.0,1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或ΙΟμπι。在另外一些實施例中，組織樣本切片的厚度為至少10、12、13、14、15、20、30、40或50μπι。但是，厚度並不是關鍵性因素，以上列舉的僅為代表性的數值。基於需要和方便，可以採用較厚的樣本，例如，70或100 μ m或以上。典型地，組織樣本切片的厚度在 1-1OO μ m、1-50 μ m、1-30 μ m、1-25 μ m、1-20 μ m、1-15 μ m、1-10 μ m、2_8 μ m、3_7 μ m或4-6 μ m之間，但如上所述，還可以使用更厚的樣本。
[0132]當組織樣本切片與陣列接觸時，例如移除包埋材料的步驟如脫蠟以後，組織樣本中的核酸分子(如RNA)將與固定在陣列上的捕獲探針結合。在一些實施例中，優選地，可以對核酸分子(如RNA)與捕獲探針的結合予以促進。典型地，促進雜交包括改善雜交發生的條件。能夠改善的主要條件包括反轉錄步驟前，在陣列上培養組織切片的時間和溫度，在本發明其他部分中有所描述。
[0133]舉例來說，當組織樣本切片與陣列相接觸時，可以將陣列培養至少I小時，以便允許核酸(如RNA)與捕獲探針相雜交。優選地，陣列可以培養2、3、5、10、12、15、20、22或24小時，或直到組織樣本切片乾燥為止。陣列培養時間並非關鍵條件，任何方便或需要的時間都可以被採用。典型的陣列培養時間可以高達72小時。因此，可以用任何適當的溫度進行培養，例如室溫，但在一個優選實施例中，陣列上組織樣本切片的培養溫度至少為25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37°C。本領域中，一般採用至多55°C的培養溫度。在一個特定優選實施例中，組織樣本切片在陣列上37°C乾燥24小時。一旦組織樣本切片乾燥，便可以將陣列在室溫下保存，直至實施反轉錄步驟。可知曉，如果允許組織樣本切片在陣列表面乾燥，那麼在對已捕獲的核酸進行進一步操作前，例如在已捕獲的RNA進行反轉錄步驟前，須得對切片進行補水。
[0134]因此，本發明的方法可以含有一個進一步的步驟，即在樣本與陣列接觸後，對組織樣本進行補水。
[0135]在一些實施例中，優選地,在捕獲探針與陣列上的組織樣本相接觸前,對捕獲探針進行封閉(例如，遮蓋或修飾)，尤其是在組織樣本中的核酸在已捕獲於陣列上之前經過修飾的情況下。具體來說，優選地，對捕獲探針的自由3』端進行封閉或修飾。在一個特定實施例中，組織樣本中的核酸，例如，可以對基因組DNA片段進行修飾，以便其已捕獲探針捕獲。舉例來說，下文中將會進一步詳述，接合體序列(含有能與捕獲探針的捕獲域相結合的結合域，)可以被添加到核酸(例如基因組DNA片段)的末端。該步驟可以通過例如接合體的連接反應或核酸的延長反應來完成,例如,用酶在序列末端追加核苷酸,例如poly-A尾。在組織樣本與陣列接觸前，有必要對捕獲探針進行封閉或修飾，尤其是捕獲探針的自由3』端，以避免捕獲探針受到修飾，例如，避免poly-A尾誤加至捕獲探針的自由3』端。優選地，可以在捕獲探針的合成時向其添加封閉域。但是，也可以在捕獲探針合成後再添加封閉域。
[0136]在一些實施例中，可以用任何適當且可逆的方法來封閉捕獲探針，以避免在組織樣本與陣列相接觸後，捕獲域在組織樣本核酸修飾過程中發生修飾。換句話說，可以可逆地掩蓋或修飾捕獲探針，以使得捕獲探針的捕獲域不含自由3』端，即使得所述3』端被移除、修飾，或不可接觸，以令捕獲探針不會在組織樣本核酸的修飾過程中受到影響，例如通過連接反應或延長反應，或移除附加的核苷酸來露出和/或恢復捕獲探針的捕獲域的3』端。
[0137]舉例來說，可以用封閉探針與捕獲探針相雜交，以掩蓋捕獲域的自由3』端，所述封閉探針例如是髮夾探針或含部分雙鏈的探針，所述探針的適當示例為本領域所知。捕獲域的自由3』端可以用化學修飾加以封閉，例如，將疊氮甲基作為可逆的化學頂帽加入，使得捕獲探針不含自由3』端。可選的適當化學頂帽也被本領域熟知，例如捕獲域的末端核苷酸可以是可逆的終止子核苷酸，在捕獲探針合成期間或之後加入到探針中。
[0138]可選地或附加地，可以對捕獲探針的捕獲域加以修飾，以便移除捕獲探針在組織樣本核酸分子的修飾過程中獲得的任何修飾，例如，附加核苷酸。舉例來說，捕獲探針可以在捕獲域的下遊，即捕獲域的3』端方向，含有一條附加序列，稱為封閉域。其形式可以是，例如，限制性內切酶識別序列或可由特定酶活性切除的核苷酸序列，如尿嘧啶。組織樣本的核酸修飾步驟後，可以對捕獲探針進行酶促剪切，來移除封閉域或任何在修飾過程中添加到捕獲探針3』端的附加核苷酸。封閉域的移除可以露出和/或恢復捕獲探針的捕獲域的自由3』端。封閉域可以作為捕獲探針的一部分來加以合成，或通過原位反應(即:作為現有陣列的修飾)添加給捕獲探針，例如，通過與捕獲域之間的連接反應。
[0139]可以用上述封閉機制的任意組合對捕獲探針進行封閉。
[0140]組織樣本的核酸，例如基因組DNA片段，一旦修飾完成，能夠與捕獲探針的捕獲域相雜交，就必須對捕獲探針進行解封，例如，通過解離封閉寡核苷酸，移除化學頂帽和/或封閉域。
[0141]為將從陣列的每個特徵獲得的序列分析或轉錄組信息或基因組信息與組織樣本的分區(即:區域 或細胞)相關聯，參照陣列特徵對組織樣本進行定向。換句話說，將組織樣本放置於陣列上，使得陣列上的捕獲探針的位置與組織樣本的位置相關聯。由此，便可以辨認每個種類捕獲探針的位置(或陣列的每個特徵)在組織樣本中對應的位置。換句話說，即:可以辨認每個種類捕獲探針的位置所對應的組織樣本位置。該步驟可以通過陣列上的定位探針來完成，如下文所述。為了方便起見，但非必需步驟，可以在組織樣本與陣列接觸後對其進行成像。該步驟可以在組織樣本核酸的處理步驟之前或之後進行，例如，在本方法的cDNA生成步驟，尤其是通過反轉錄生成cDNA第一鏈的步驟之前或之後。在一個優選實施例中，組織樣本的成像步驟在釋放陣列上的已捕獲及已合成(即:已延長或已連接)的DNA (如cDNA)的步驟之前。在一個特定優選實施例中，對組織的成像步驟發生在組織樣本核酸的處理步驟之後，例如，在反轉錄步驟之後；並且，在從陣列上釋放分子(如cDNA)之前，移除(例如，洗滌)了陣列上所有殘餘組織。在一些實施例中，可在處理捕獲核酸的步驟(例如反轉錄步驟)中，去除陣列表面的殘餘組織，例如，當所使用的組織為以深度冷凍製備的組織時。在此情況下，組織樣本的成像可以在處理步驟前發生，例如cDNA合成步驟前。一般來說，成像步驟可以在組織樣本與表面接觸後的任何時候進行，但應在所有降解或移除組織樣本的步驟之前完成。如上所述，這取決於組織樣本。
[0142]優選地，所述陣列可以含有有助於組織樣本或其圖像相對於陣列特徵進行定向的標記。任何標記陣列的適當方法都可以使用，只要其能在組織樣本成像時能夠被檢測。舉例來說，可以將能夠生成信號，優選為視覺信號的分子，例如，螢光分子，直接固定在陣列表面。優選地，陣列表面的不同位置上含有至少2種標記，進一步優選地，至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100種標記。可以方便地使用幾百或甚至幾千種標記。標記可以具有格局，例如，形成陣列外圍邊框，如陣列特徵的整個外框；可以是含信息的其他格局，例如陣列的截線，以便於組織樣本圖像與陣列的對齊，或者一般來說，陣列特徵與組織樣本的關聯。因此，標記可以是被固定的分子，其能與發送信號的分子相互作用，產生信號。在一個代表性示例中，陣列可以含有標記特徵，例如，固定在陣列基板上且與被標記核酸相雜交的核酸探針。舉例來說，被標記的核酸分子，即標記核酸，可與能在特定波長(或波長範圍)的光線下產生螢光(即被激活)的化學部分相連接或結合。此類標記核酸分子與陣列接觸的時機，可以在組織樣本為可視化或成像而進行染色之前、之中或之後。但是，標記必須在組織樣本成像後能夠被檢測。因此，在一個優選實施例中，可以採用與可視化組織樣本相同的成像條件來對標記進行檢測。
[0143]本發明的一個特定的優選實施例中，陣列含有標記特徵，且所述標記特徵與已標記，優選為已螢光標記的標記核酸分子(例如，寡核苷酸)相雜交。
[0144]可以使用本領域中任何方便的組織學方法來進行組織成像步驟，例如，光、明視場、暗視場、相位差、螢光、鏡像、幹涉、共聚顯微鏡或其組合。典型情況下，組織樣本在可視化之前先進行染色，以在組織樣本不同區域(例如細胞間)形成對比。採用的染色劑類型取決於組織類型和需染色的細胞區域。此類染色操作流程為本領域所知。在一些實施例中，採用了多種染色劑來可視化(成像)組織樣本的不同方面，例如，組織樣本的不同區域、特定細胞結構(例如，細胞器)或不同細胞類型。在其他一些實施例中，可以通過組織染色以外的方法進行組織樣本可視化或成像，例如，在組織樣本已經含有色素，能夠提供足夠的對比，或者採用了特殊形式的顯微鏡的情況下。
[0145]在一個優選實施例中，採用螢光顯微鏡對組織樣本進行可視化或成像。
[0146]如果想要實施成像且未在反轉錄之前實施成像，則優選地，在從陣列釋放cDNA分子的步驟之前移除組織樣本，即在反轉錄步驟和可選的成像步驟後仍與陣列基板相接觸的殘餘組織。因此，本發明的方法可以含有一個洗滌陣列的步驟。殘餘組織樣本的移除可以採用任何適當的方法，取決於組織樣本。在最簡單的實施例中，可以用水洗滌陣列，水中可含有多種添加劑，例如表面活性劑(例如洗滌劑)、酶等，來幫助清除組織。在一些實施例中，採用含有蛋白酶(及適當的緩衝液)的溶液來洗滌陣列，例如蛋白酶K。在其他的一些實施例中，所述溶液還可以含有，或可選地含有，纖維素酶、半纖維素酶或幾丁質酶，例如，當組織樣本源自植物或真菌的時候。在進一步的實施例中，洗滌陣列的溶液溫度可以是例如至少30°C，優選為至少35、40、45、50或55°C。顯然，洗滌溶液對已固定的核酸分子的破壞應當最小化。舉例來說，在一些實施例中，核酸分子可以間接地固定在陣列基板上，例如，通過捕獲探針和RNA之間以及/或者捕獲探針和表面探針之間的雜交，因此，洗滌步驟應當不幹擾陣列上已固定的分子間的相互作用，即:應當不引起核酸分子的變性。
[0147]陣列和組織樣本接觸的步驟之後，在組織樣本的核酸分子，例如RNA(優選為mRNA)與捕獲探針相互雜交的適宜條件下，進行對已雜交的核酸分子的固定(獲取)。對已雜交的核酸的固定或獲取，包括已雜交核酸的互補鏈與捕獲探針間的共價附著(即:通過核苷酸鍵，即兩個緊鄰的核苷酸之間的並置3』 -羥基與5』 -磷酸鹽末端之間形成的磷酸二酯鍵)，由此標識或標定已捕獲的 核酸，所述已捕獲的核酸帶有一個定位域，能與對其進行捕獲的特徵進行特異結合。
[0148]在一些實施例中，對已雜交的核酸(例如單鏈核酸)進行固定，可以包括延長捕獲探針來生成已捕獲核酸的副本，例如，從已捕獲(已雜交)的RNA生成cDNA。可知曉，此步驟指的是已雜交核酸的互補鏈的合成，例如，基於已捕獲的RNA模版(即雜交於捕獲探針捕獲域的RNA)生成cDNA。因此，在捕獲探針的延長反應(如cDNA生成)的初始步驟中，已捕獲(已雜交)的核酸(例如RNA)成為延長步驟(例如反轉錄)的模版。在其他一些實施例中，如下文所述，對已雜交的核酸(例如含部分雙鏈的DNA)進行固定，可以包括在已雜交的核酸(例如DNA片段)與捕獲探針之間進行共價結合，例如，通過連接反應，將捕獲探針連接至同捕獲探針相雜交的核酸的互補鏈上。
[0149]反轉錄反應涉及利用反轉錄酶從RNA，優選為mRNA (信使RNA)合成cDNA (DNA互補鏈或DNA副本)的步驟。因此，cDNA可看作是在組織樣本被採集時存在於細胞中的RNA的副本，即:所述cDNA呈現的是所述細胞在隔離時刻所表達的全部或部分基因。
[0150]捕獲探針,尤其是捕獲探針的捕獲域,在為雜交於捕獲探針的核酸生成互補鏈時充當引物，如反轉錄引物。因此，由延長反應(例如反轉錄反應)所生成的核酸分子(如cDNA)包含了捕獲探針序列，即是說，延長反應(如反轉錄反應)可以看作是一種對組織樣本上與陣列的每個特徵相接觸的核酸(例如轉錄體)進行間接標記的方法。因此，所有在特定特徵上合成的核酸分子，例如cDNA，將含有相同的核酸「標籤」。
[0151]在陣列的每個特徵上合成的核酸分子(如cDNA)，可以代表與該特徵相接觸的組織樣本的區域或面積上的基因組或表達的基因，例如一種組織、細胞類型、細胞群或其細胞亞群，還可以進一步代表特定條件下所表達的基因，例如在特定時刻、特定環境、特定發育階段或響應特定刺激等。因此，任一單個特徵上的cDNA可能代表著單個細胞中表達的基因，或，在該特徵與樣本的細胞連接處相接觸的情況下，其cDNA可能代表多個細胞中的基因。類似地，如果單個細胞與多個特徵相接觸，那麼每個特徵可能代表所述細胞中所表達基因中的一部分。類似地，在一些實施例中，所述已捕獲的核酸是DNA，任一單個特徵可能代表單個或多個細胞的基因 組。可選地，單個細胞的基因組可以由多個特徵所代表。
[0152]捕獲探針的延長步驟，例如反轉錄，可以利用本領域的許多適當的酶和操作流程中的任一種來實施，如下文所述。但是，顯然，無需為核酸(如cDNA)第一鏈的合成提供引物，因為捕獲探針的捕獲域即充當了該引物，例如反轉錄引物。
[0153]優選地，本發明的範圍中，被綁定的核酸(即:與捕獲探針共價結合的核酸)(例如cDNA)經處理含有雙鏈DNA。但是，在一些實施例中，已捕獲的DNA可能已經含有雙鏈DNA，例如，在含有部分雙鏈的DNA片段與捕獲探針相連接的情況下。從已捕獲核酸生成雙鏈DNA的處理步驟可以在僅生成DNA (如cDNA)第二鏈的單一反應中完成，即:只生成雙鏈的DNA分子而不增加雙鏈DNA分子的數量，或在擴增反應中生成第二鏈的多個副本，所述副本可以是單鏈DNA (例如，線性擴增)或雙鏈DNA (例如cDNA )(例如，指數擴增)。
[0154]第二鏈DNA (例如cDNA)的合成步驟可以在陣列上原位進行，既可以是單獨的第二鏈合成步驟，例如如下文中詳述的採用隨機引物，也可以作為擴增反應的初始步驟。可選地，可以從陣列上釋放DNA (例如cDNA)的第一鏈(所述第一鏈含有或說結合了捕獲探針)，然後再進行第二鏈合成，例如，在溶液中進行反應，可以作為一個單獨步驟或作為擴增反應中的一個步驟。
[0155]當第二鏈合成在陣列上(即原位)進行時，本方法可以包括一個可選的步驟，即在第二鏈合成前移除已捕獲的核酸，如RNA，例如採用RNA硝化酶(RNase)InRNase H。此步驟的操作流程為本領域所熟知並有記載。但是，此步驟一般並無必要，且在大多數情況下，RNA會自然降解。從陣列上除去組織樣本的步驟，一般也會移除陣列上的RNA。若想要增加RNA移除的強度，可採用RNase H。
[0156]舉例來說，在含有大量RNA的組織樣本中，生成雙鏈cDNA的步驟可以產生足量的cDNA,(從陣列釋放後)可直接用於測序。在這種情況下，cDNA第二鏈合成可以如下文所述，通過本領域所知的任何方法來完成。第二鏈合成反應可以在將cDNA固定在陣列上的同時，或優選地，在cDNA從陣列基本上釋放之後，直接在陣列上進行，如下文所述。
[0157]在其他的實施例中，有必要增加(即擴增)已綁定的核酸(例如合成的cDNA)，以產生足夠進行DNA測序的數量。在該實施例中，已綁定核酸(例如cDNA分子)的第一鏈，還含有陣列特徵的捕獲探針，充當了擴增反應中的模版，例如，聚合酶鏈式反應。該擴增反應的第一反應產物是DNA (如cDNA)的第二鏈，其自身便可充當擴增反應進一步循環的模版。
[0158]如上所述的任一實施例中，DNA (如cDNA)的第二鏈含有捕獲探針的互補鏈。如果捕獲探針含有通用域，尤其在該通用域中含有擴增域，則其可以用在DNA (例如cDNA)的後續擴增反應中，例如該擴增反應可以包括含有與擴增域相同序列的引物，即與擴增域的互補鏈互補(即雜交)的引物。在捕獲探針上，擴增域處於定位域的上遊(在已綁定的核酸如cDNA第一鏈中)，從此角度來看， 定位域的互補鏈將併入DNA (例如cDNA分子)的第二鏈中。
[0159]在一些實施例中，DNA (例如cDNA)的第二鏈在單一反應中生成，第二鏈合成可以通過任何適當的方法達成。舉例來說，從陣列基板上釋放的cDNA的第一鏈，優選地但非必需地，可以用隨機引物(例如六聚體引物)和DNA聚合酶，優選為鏈置換聚合酶(例如klenow(exo))，在適宜進行模版化DNA合成的條件下加以培養。該過程將產生各種長度的雙鏈cDNA分子，並不大可能生成完整長度的cDNA分子，即與作為合成模板的整個mRNA相對應的cDNA分子。隨機引物會與cDNA分子第一鏈的隨機位點(即在序列中而不是序列末端)雜交。
[0160]倘若想要生成完整長度的DNA (例如cDNA)分子，即與整個已捕獲的核酸(例如，RNA分子)相對應的分子(若該核酸如RNA在組織樣本中部分降解，則已捕獲的核酸分子，例如RNA，將不會是「完整長度」的轉錄體，也不會與基因組DNA的初始片段長度相同)，那麼，可以對已O綁定的核酸分子(如cDNA第一鏈)進行修飾。舉例來說，可以為cDNA分子的3』端連接一個連接子或接合體。該步驟可以採用單鏈合成酶來完成，例如T4RNA連接酶或Circligase? (Epicentre Biotechnologies)。
[0161]可選地，可以利用雙鏈連接酶，例如T4DNA連接酶，將一個助手探針(能夠與cDNA分子第一鏈的3』端相雜交的部分雙鏈DNA分子)與已綁定的核酸(如cDNA第一鏈)分子的3』端相連接。本領域中還有其他適合用於該連結步驟的已知酶,包括例如Tth DNA ligase、Taq DNA Iigase>Thermococcus sp.(strain9° N)DNA ligase (9° N? DNA ligase、NewEngland Biolabs)和 Ampligase? (Epicentre Biotechnologies)。所述助手探針還含有一個特定序列；利用助手探針與已綁定的核酸(如cDNA第一鏈)相連接的部分的互補鏈作為引物，可從所述特定序列引導DNA (例如cDNA)分子的第二鏈合成。進一步，一種可選方法包括使用末端轉移酶活性酶來將聚核苷酸尾(例如poly-A尾)併入被結合的核酸(例如cDNA第一鏈)分子的3』端。第二鏈合成可以用poly-T引物來引導，所述引物也可以含有特定擴增域，用於進一步擴增。生成「全長」雙鏈DNA (例如cDNA)分子(或最大長度第二鏈合成)的其他方法為本領域所熟知。
[0162]在一些實施例中，第二鏈合成可以採用模板轉換的方法，例如，採用Clontech?的SMART? 技術。SMART (RNA 模版 5』端轉換裝置，即 Switching Mechanism at5』End of RNATemplate)技術已在本領域中發展完善,該技術基於Superscript? n (Invitrogen)等反轉
錄酶能夠在延長的cDNA分子的3』端添加若干核苷酸的發現，即生成在3』端懸有單鏈DNA的DNA/RNA雜交產物。該外懸DNA可以提供一條目標序列，作為寡核苷酸探針的雜交目標，為cDNA分子的進一步延長提供附加的模版。優選地，與外懸的cDNA雜交的寡核苷酸探針含有一個擴增域序列，所述擴增域序列的互補鏈併入cDNA第一鏈合成產物。含有擴增域序列的引物，將與併入cDNA第一鏈的互補擴增域序列雜交；可以將所述引物加入反應混合物引導第二鏈合成，並使用適當的聚合酶和cDNA第一鏈作為模版。該方法避免了將接合體連接到cDNA第一鏈3』端的要求。雖然模版轉換法最初是為具有5』帽結構的全長mRNAs而開發，該方法已被證明可以同樣良好運用於無帽結構的截短mRNAs。因此，模板轉換可以用於本發明的方法中，以生成全長和/或部分或截短的cDNA分子。因此，在本發明的一個優選實施例中，第二鏈的合成可以利用模版轉換，或通過模版轉換完成。在一個特定優選實施例中，原位實施(即在捕獲探針仍舊直接或間接固定於陣列的同時)模版轉換反應，即進一步延長cDNA第一鏈以併入互補擴增域的反應。優選地，第二鏈合成反應也原位實施。
[0163]在一些實施例中，可能有必要，或優選地，增加、豐富或擴增DNA (例如cDNA)分子，則可以將擴增域併入DNA (例如cDNA)分子。如上所述，當捕獲探針具有含擴增域的通用域時，第一擴增域可以併入被綁定的核酸分子，例如cDNA分子的第一鏈。在這些實施例中，第二鏈合成可以合併第二個擴增域。舉例來說，用於生成cDNA第二鏈的引物，例如，隨機六聚體引物，poly-T引物、與助手探針互補的引物，可能在5』端含有擴增域，即可以與擴增引物雜交的核苷酸序列。因此，所得的雙鏈DNA可以在雙鏈DNA (例如cDNA)分子的兩個5』端，或靠近兩個5』端的方向上，含有一個擴增域。這些擴增域可以用做擴增反應(如PCR)中引物的目標。可選地，與被綁定的核酸分子(例如cDNA第一鏈分子)的3』端連接的連接子或接合體，可以含有第二個通用域，所述通用域含有第二個擴增域。類似地，第二個擴增域可以通過模版轉換併入cDNA第一鏈分子。
`[0164]在一些實施例中其捕獲探針不含有通用域，尤其是含有擴增域的通用域，則可以按照前文描述合成cDNA分子的第二鏈。所得雙鏈DNA分子產物可以通過修飾，在DNA (例如cDNA)分子的第一鏈的5』端合併一個擴增域，以及併入DNA (如cDNA)第二鏈的5』端(第二個擴增域)，如果後者未在DNA (如cDNA)第二鏈合成步驟中完成的話。此類擴增域可以通過例如將雙連結合體連接至DNA (如cDNA)分子的末端來併入。該連結步驟適用的酶為本領域所知，包括例如TthDNA連接酶、Taq DNA ligase、Thermococcus sp.(9° N菌株)DNA ligase (9。N? DNA 連接酶，New England Biolabs)、Ampligase? (EpicentreBiotechnologies)和T4DNA連接酶。在一個優選實施例中，第一和第二擴增域含有不同的序列。
[0165]由上可知，顯然，通用域可以含有擴增域，能通過本領域中的各種方法、技術及技術組合添加到已綁定(即已延長或連接)的DNA (例如cDNA)分子或其互補鏈(例如第二鏈)上，例如，通過使用含有此域的引物、接合體的連接反應、末端轉移酶的使用和/或模版轉換方法。如上述可知，此類結構域可以在DNA分子從陣列上釋放之前或之後添加。[0166]從上文敘述中可見，顯然，從按照本發明的方法合成的單一陣列中的所有DNA (例如cDNA)分子可以全部含有相同的第一和第二擴增域。由此一來，單一的擴增反應，例如PCR，便足以擴增所有的DNA (例如cDNA)分子。因此，在一個優選實施例中，本發明的方法可以含有一個DNA (例如cDNA)分子的擴增步驟。在一個實施例中，擴增步驟在DNA (例如cDNA)分子從陣列基板上釋放之後實施。在其他的實施例中，擴增反應可以在陣列(即:在陣列上原位)上實施。本領域已知，擴增反應可以在陣列上實施，且已有可實施此類反應的片上熱循環儀。因此，在一個實施例中，本領域已知作為測序平臺或用於任何形式的序列分析(例如,在下一代測序技術中)的陣列,均可以用作本發明的陣列的基礎(例如，11 Iumina微珠陣列等)。
[0167]對於DNA(例如cDNA)第二鏈的合成，如果從陣列基板上釋放的cDNA含有部分雙鏈核酸分子，則優選採用鏈置換聚合酶(例如，Φ29?ΝΑ聚合酶、Bst (exo_)DNA聚合酶、klenow(exo_)DNA聚合酶)。舉例來說，在一些實施例中，捕獲探針通過表面探針間接固定在陣列基板上，且釋放DNA (例如cDNA)分子的步驟含有一個剪切步驟，則被釋放的核酸至少為部分雙鏈(例如，DNA:DNA、DNA:RNA或DNA:DNA/RNA雜合物)。為保證cDNA第二鏈合成反應將定位域(特徵標識域)的互補鏈併入DNA (例如cDNA)第二鏈，鏈置換聚合酶是必要的。
[0168]顯然，從陣列表面或基板上釋放至少部分DNA (例如cDNA)分子或其擴增子的步驟，可以通過許多方法來完成。該釋放步驟的主要目的在於產生能合併(或包含)捕獲探針的定位域(或其互補鏈)的分子，以便所述DNA (例如cDNA)分子或其擴增子能根據其在陣列上的特徵(或位置)被「標記」。因此，該釋放步驟從陣列上除去了 DNA (例如cDNA)分子或其擴增子，且所述DNA (例如cDNA)分子或其擴增子合併了定位域或其互補鏈(通過藉由例如捕獲探針的延長將其併入已綁定的核酸(例如cDNA第一鏈)，並可選地，如果在陣列上進行第二鏈合成，也拷入DNA第二鏈，或者如果在陣列上進行擴增，便拷入擴增子)。因此，為了生成能夠與組織樣本的各種區域相關聯的序列分析數據，被釋放的分子中含有捕獲探針的定位域(或其互補鏈)是必要條件。
[0169]由於被釋放的分子可以是DNA (例如cDNA)分子或擴增子的第一鏈或第二鏈，且由於捕獲探針可以間接固定在陣列上，可知曉，雖釋放步驟中可能含有將DNA (例如cDNA)分子從陣列上剪切的步驟，所述釋放步驟並非必需核酸剪切步驟；DNA (例如cDNA)分子或其擴增子可以僅通過令雙鏈分子變性來釋放，例如從cDNA第一鏈釋放cDNA第二鏈，或從模版上釋放擴增子，或從表面探針釋放cDNA分子第一鏈(即:已延長的捕獲探針)。相應地，DNA(例如cDNA)分子可以通過核酸剪切和/或變性(例如，通過加熱來令雙鏈分子變性)來從陣列上釋放。若在陣列上原位實施擴增反應，則顯然需要將變性釋放擴增子包含在循環反應中。
[0170]在一些實施例中，DNA (例如cDNA)分子在剪切域處由酶促剪切釋放，所述剪切域可以位於捕獲探針的通用域或定位域中。如上所述，該剪切域必須位於定位域的上遊(5』端方向)，以便令被釋放的DNA (例如cDNA)分子中含有定位(標識)域。適宜用於核酸剪切的酶包括限制性內切酶，例如Rsal。其他的酶，例如尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化-裂解內切酶VIII (USER?酶)的混合物，或MutY和T7核酸內切酶I的組合，是本發明方法的優選實施方式。
[0171] 在一個可選實施例中，DNA (例如cDNA)分子可以通過物理方法從陣列的表面或基板上釋放。舉例來說，在一些實施例中，捕獲探針間接地(例如，通過與表面探針雜交)固定在陣列基板上，那麼，破壞核酸分子之間的相互作用就足夠了。破壞核酸分子間相互作用的方法，例如令雙鏈核酸分子變性，為本領域所熟知。釋放DNA (例如cDNA)分子的一種直接辦法(即將合成的DNA (例如cDNA)分子從陣列上剝落的方法)是使用能夠幹擾雙鏈分子的氫鍵的溶液。在本發明的一個優選實施例中，可以通過熱水處理來釋放DNA (例如cDNA)分子，例如，使用溫度至少在85°C的水或緩衝液，優選為至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99°C。除足以破壞氫鍵的溫度外，作為一種替代或補充方式，該溶液還可以含有鹽、表面活性劑等，進一步動搖核酸分子間的相互作用，達成DNA (例如cDNA)分子的釋放。
[0172]可知曉，使用高溫溶液，例如90_99°C的水，可能足以破壞用以將捕獲探針或表面探針固定在陣列基板上的共價鍵。因此，在一個優選實施例中，可以通過向陣列施加熱水，破壞共價固定的捕獲探針或表面探針的方法來釋放DNA (例如cDNA)分子。
[0173]不言而喻，被釋放的DNA (例如cDNA)分子(含有被釋放的DNA (例如cDNA)分子的溶液)將被收集起來，用於進一步操作，例如，第二鏈合成和/或擴增。儘管如此，本發明的方法可以含有收集或回收被釋放的DNA (例如cDNA)分子的步驟。如上所述，在原位擴增的情況下，被釋放的分子可以包含已綁定的核酸(例如cDNA)的擴增子。
[0174]本發明的一些實施例中，可能需要去除所有未延長或未連接的捕獲探針。例如，該步驟可能處於從陣列釋放DNA分子的步驟之後。可以用任何想用或方便的方法來進行此類移除，包括，例如，使用酶來降解未延長或未連接的探針，例如核酸外切酶。
[0175]DNA(例如cDNA)分子或其擴增子從陣列上釋放之後，可能已獲得如上所述的修飾，接著對其進行分析研究(例如，測定序列，雖然如上所述，並不要求實際的序列測定，但可以使用任何序列分析方法)。因此，可以採用任何核酸分析方法。序列分析步驟可以識別定位域，由此將接受分析的分子定位在組織樣本的某個位點上。類似地，可以測定分析對象分子的性質或身份。以此方式，可以測定陣列上乃至組織樣本上指定位置的核酸，例如RNA。由此一來，該分析步驟可以包括或使用任何方法來辨認分析對象分子(乃至「目標」分子)及其定位域。一般來說，此類方法是序列特異性方法。舉例來說，該方法可以使用序列特異性引物或探針，尤其是定位域和/或待檢測或待分析的特定核酸分子的特異引物或探針，例如，與待測的核酸分子(如RNA或cDNA)相對應的DNA分子。典型地，在此類方法中，可以使用序列特異性擴增引物，例如PCR引物。
[0176]在一些實施例中，可能需要分析目標相關分子的子集或同族，例如，共享序列相似度和/或保守結構域的一種特定蛋白組(例如一種受體蛋白族)的所有編碼序列。因此，此述擴增和/或分析方法可以採用簡併的或基因家族特異性的引物或探針，來實現與已捕獲的核酸或其衍生核酸(例如擴增子)相雜交。在一個特定的優選實施例中，擴增和/或分析方法可以同時採用通用引物(即:所有已捕獲序列通用的引物)和簡併或對目標分子的子集具有特異性的基因家族特異性的引物。
[0177]因此，在一個實施例中，採用了基於擴增反應，特別是基於PCR反應的序列分析方法。
[0178]但是，修飾和/或擴增被釋放的DNA (例如cDNA)分子的步驟可能在樣本中引入其他的成分，例如，酶、引物、核苷酸等。因此，本發明的方法，可以在序列分析之前，進一步包括一個對含有被釋放的DNA (例如cDNA)分子或擴增子的樣本的純化步驟，例如，移除可能干擾測序反應的寡核苷酸引物、核苷酸、鹽等。可以採用任何適當的DNA (例如cDNA)分子純化方法。
[0179]如上所述，可以對被釋放的DNA進行直接或間接的序列分析。因此，序列分析基質(可看作是面臨序列分析步驟或流程的分子)可以是直接從陣列上釋放的分子，或可以是其衍生物。因此，舉例來說，在包含測序反應的序列分析步驟中，測序模版可以是從陣列釋放的分子或其衍生分子。舉例來說，從陣列釋放的DNA (例如cDNA)分子的第一鏈和/或第二鏈可以直接進行序列分析(例如測序)，即可以直接參與序列分析反應或過程(例如測序反應或測序過程，或作為測序分子或以其它方式辨認的分子)。在原位擴增的情況下，被釋放的分子可以是擴增子。可選地，被釋放的分子可以在序列分析(例如，測序或其他辨認方式)前，進行第二鏈合成步驟或擴增步驟。因此，序列分析基質(例如模版)可以是擴增子，或從陣列直接釋放的分子的第二鏈。
[0180]雙鏈分子的兩條鏈都可以進行序列分析(例如，測序)，但本發明並不限於此，還可以分析(例如，測序)單鏈分子(例如，cDNA)。舉例來說，可以採用各種測序技術來進行單分子測序，例如，Helicos或Pacbio技術，或正在開發中的納米孔測序技術。因此，在一個實施例中，可以對DNA (例如cDNA)的第一鏈進行測序。DNA (例如cDNA)分子的第一鏈可能需要經過3』端修飾才能進行單分子測序。該步驟可以通過與處理DNA (例如cDNA)分子第二鏈類似的方法完成。此類操作為本領域所知。
[0181]本發明的一個優選方面中，序列分析會辨認或揭示部分已捕獲的核酸(如RNA)序列和定位域的序列。定位域(或標籤)的序列會標識捕獲mRNA等核酸分子的特徵。已捕獲的核酸分子(例如RNA)的序列可以與樣本來源生物的序列資料庫進行對比，以確定其對應的基因。通過確定組織樣本的哪一區域(例如，細胞)與特徵接觸，便可能確定組織樣本的哪一區域正在表達所述基因(或含有該基因，例如，在空間基因組學研究中)。此分析可以用於本發明的方法中製得的所有DNA (例如cDNA)分子，獲得組織樣本的空間轉錄組或基因組。
[0182]在一個代表性示例中，可以分析測序數據來將捕獲探針按照特定種類分類，例如，按照定位域的序列。例如，該步驟可以通過使用FastX軟體工具盒的FASTQ識別碼分解器工具，將序列按照捕獲探針定 位域(標籤)序列分別歸入單獨文檔。可以對每一種類(即來自每一特徵)的序列加以分析，以確定轉錄體的身份。舉例來說，可以使用如Bastn軟體來辨認序列，將序列與一種或多種基因組資料庫相比較，優選為組織樣本來源生物的資料庫。若某資料庫序列與本發明的方法製得的序列相似度最高，則將所述資料庫序列的身份分配給本發明製得的序列。一般來說，只有確定性為至少le_6，優選為le_7、le_8或le_9的匹配會被看作是成功辨認。
[0183]顯然，任何核酸測序方法都可以用於本發明的方法中。但是，所謂的「下一代測序」技術在本發明尤為適用。高通量測序在本發明的方法中尤為有用，因為它對大量核酸在非常短的時間內進行部分測序。從近期爆發式增長的全部或部分得到測序的基因組數量來看，要確定每個分子所對應的基因，並不是非得對製得的DNA (例如cDNA)分子進行全長測序不可。舉例來說，DNA (例如cDNA)分子各端的前100個核苷酸應該足夠用來辨認捕獲原核酸(例如mRNA)的特徵和所表達的基因。從DNA (例如cDNA)分子的「捕獲探針端」的序列反應可以獲得定位域的序列以及轉錄體特異序列數據中至少約20個鹼基，優選為30或40個鹼基。「非捕獲探針端」的序列反應可以獲得轉錄體特異序列數據中至少約70個鹼基，優選為80、90或100個鹼基。
[0184]在一個代表性示例中，測序反應可以基於可逆染色終止劑，例如用於Illumina?技術中。舉例來說，DNA分子可以先在例如玻璃片或矽片上與引物連接並擴增，形成局部克隆群落(橋式擴增)。加入4種ddNTPs，並洗除未結合的核苷酸。與焦磷酸測序不同的是，DNA —次可以只延長I個核苷酸。用照相機對螢光標記核苷酸拍照，然後用化學方法移除染色劑和DNA上的3』端末端封閉物，以便進行下一次循環。可重複該步驟直至獲得要求的序列數據。使用這一技術，可以在僅僅一塊載片上對上千核酸進行同時測序。
[0185]其他高通量測序技術也可以同樣適用於本發明的方法，例如，焦磷酸測序。該方法中，DNA擴增反應在油溶液(微乳液PCR)中的水滴中進行，每一水滴含有附著於塗有單一引物的微珠之上的單一 DNA模版，然後形成克隆群落。測序儀器含有許多皮升容量孔，每孔含有一個微珠及測序酶。焦磷酸測序採用螢光素酶發光來檢測添加至新生DNA的個體核苷酸，並用合併數據生成序列讀數。
[0186]正在開發中的技術的一個示例，是對DNA聚合反應中釋放的氫離子的檢測。用單一種類的核苷酸關注含有待測序的模版DNA鏈的微孔。若引入的核苷酸與模版的前導核苷酸互補，則將其加入增長中的互補鏈；隨之釋放的一個氫離子，觸動高靈敏度的離子感應器，從而指示反應的發生。如果模版序列中存在同聚物重複，則單個循環中便會有多個核苷酸得到結合，從而引起對應數量的氫離子的釋放，以及成比例的較高電信號。
[0187]因此，顯然未來的測序形式正在緩慢地成為可用形式；這些平臺的主要特點之一在於運行時間更短，顯然，其他的測序技術將來也會用於本發明的方法中。
[0188]本發明的一個必要特點，如上所述，是將已捕獲的核酸分子的互補鏈結合在捕獲探針上的步驟，例 如，對已捕獲的RNA分子進行反轉錄。反轉錄反應為本領域所熟知，且代表性的反轉錄反應中，反應混合物包括反轉錄酶、dNTP和適當的緩衝液。反應混合物可以含有其他成分，例如Rnase抑制物。引物和模版分別是捕獲探針的捕獲域和已捕獲的RNA分子，如上所述。在所述方法主題中，典型地，每種dNTP的用量在10-5000 μ M之間，通常是從約20-1000μΜ。顯然，可以使用DNA聚合酶活性的酶，通過等同的反應來生成捕獲的DNA分子的互補鏈。此類反應為本領域所熟知，且下文中將會進一步詳細敘述。
[0189]所需的反轉錄酶活性可以由一種或多種不同的酶來提供，其中適合的例子有:M-MLV>MuLV>AMV>HIV、ArrayScript?>MultiScribe?、ThermoScript? 以及SuperScript? 1、IIIII 酶。
[0190]反轉錄酶反應可以在任何適當溫度下進行，取決於酶的性質。典型地，反轉錄酶反應在37-55°C間實施，但此範圍之外的溫度也可能適合。反應時間可以短至1、2、3、4或5分鐘，或者長達48小時。典型地，反應時間在5-120分鐘之間，根據選擇，優選為5-60、5-45或5-30分鐘，或者1-10或1-5分鐘。反應時間並非關鍵因素，根據意願可以採用任何的反應時間長度。
[0191]如上所述，本方法的某些實施例包括擴增步驟，用以增加所製得的DNA(例如cDNA)分子的拷貝數，例如為了充實樣本，以更好地表現從組織樣本中捕獲的核酸(轉錄體)。根據需要，擴增反應可以是線性的或者指數的，適用的代表性擴增反應操作流程包括，但不限於，聚合酶鏈式反應(PCR);等溫擴增反應，等等。
[0192]聚合酶鏈式反應(PCR)為本領域所熟知，如申請號為4，683，202 ;4，683，195 ；4，800，159 ；4, 965，188和5，512，462的美國專利中所述，所述專利以援引的方式併入本公開。在代表性的PCR擴增反應中，反應混合物含有上述從陣列釋放的DNA(例如cDNA)分子，所述DNA (例如cDNA)分子與一種或多種用於引物延長反應中的引物合併,例如，與第一和/第二擴增域相雜交的PCR引物(例如用於幾何(或指數)擴增反應的正向引物和反向引物，或用於線性擴增反應的單個引物)。與被釋放的DNA (例如cDNA)分子(方便起見，下文中稱為模版DNA)相接觸的寡核苷酸引物將具有足夠的長度，來支持退火處理條件下與互補模板DNA的雜交反應(下文中將更詳細敘述)。引物的長度取決於擴增域的長度，但總地來說至少有10bp，通常至少15bp，更常見的是至少16bp長，且可以長達30bp或以上；引物的長度範圍一般可在18-50bp之間，通常是約20-35bp。模版DNA可以與單個引物或一對引物(正向引物和反向引物)接觸，取決於是否需要進行模版DNA的引物延長、線性或指數擴增。
[0193]除上述成分以外，本方法主題中製得的典型反應混合物還包括聚合酶和脫氧核糖核酸三磷酸鹽(dNTPs)。可以通過一種或多種不同的聚合酶來提供所需的聚合酶活性。在許多實施例中，反應混合物至少包括A族(Family A)聚合酶,且適用的典型A族聚合酶包括，但不限於:棲熱水生菌(Thermus aquaticus)聚合酶,包括天然聚合酶(Taq)及其衍生物和同系物，例如 Klentaq(如 Barnes et al, Proc.Natl.Acad.Sci USA( 1994)91:2216-2220 所述)；嗜熱細菌(Thermus thermophilus)聚合酶,包括天然聚合酶(Tth)及其衍生物和同系物，以及類似物。在某些實施例中，所實施的擴增反應是高保真度反應，反應混合物可以進一步包括具有3』-5』端核酸外切酶活性的聚合酶，例如，可以有B族(Family B)聚合酶提供該酶活性，且適用的B族聚合酶包括,但不限於:海濱嗜熱球菌(Thermococcus litoralis)DNA 聚合酶(Vent)，如 Perler et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1992) 89:5577-5581 所述；熱球菌屬物種GB_D(Pyrococcus species GB-D)(Deep Vent);如Lundberget al., Gene(1991) 108:1-6所述的激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus) DNA聚合酶(Pfu),烏茲熾熱球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)以及類似物。若反應混合物中同時含有A族和B族聚合酶，則反應混合物中的A族聚合酶的含量可以高於B族聚合酶，其活性差通常至少為10倍，更常見的是至少約100倍。一般 來說，反應混合物包括4中不同類型的dNTPs，與4種天然鹼基相對應，即dATP、dTTP、dCTP和dGTP。在本方法主題中，典型地，每種dNTP的含量範圍約在10-5000 μ Μ,通常在約20-1000 μ M之間。
[0194]本方法主題的反轉錄酶和/或擴增反應步驟中製得的反應混合物可以進一步包括一種水性緩衝介質，所述介質中含有一價離子源、二價陽離子源和緩衝劑。可以採用任何便於使用的一價離子源，例如KC1、醋酸鉀、醋酸銨、穀氨酸鉀、NH4C1、硫酸銨及類似物。二價陽離子可以是鎂、錳、鋅及類似物，且陽離子一般是鎂。任何便利的鎂離子源都可以採用，包括MgCl2、醋酸鎂及類似物。緩衝液中Mg2+的含量範圍可以在0.5-10mM之間，但優選範圍在3-6mM之間，理想值為5mM。緩衝液中可能存在的代表性緩衝介質或鹽類包括三羥甲基氨基甲烷(Tris)、三甲基甘氨酸(Tricine)、羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、丙磺酸(MOPS)及類似物，其中緩衝劑的典型含量範圍在約5-150mM之間，通常為約IO-1OOmM之間，更常見的是約20-50mM，且在某些優選實施例中，緩衝介質的含量足以提供約為6.0-9.5的pH範圍，其中最為優選的是72°C時pH為7.3。緩衝介質中可以含有的其他介質包括螯合劑，例如EDTA、EGTA及類似物。
[0195]在本方法主題的各步驟所需的反轉錄酶、DNA延長或擴增反應混合物的製備中，可以按照任何方便的順序合併各種成分。舉例來說，在擴增反應中，可以先向緩衝液中加入引物、聚合酶，然後是模版DNA，或者同時混合所有的各種成分來製備反應混合物。
[0196]如上所述，本發明的一個優選實施例中，可以通過向核酸分子的末端添加擴增域來修飾DNA (例如cDNA)分子，該過程可以包括連接反應。當捕獲探針間接固定在陣列表面的時候，陣列上捕獲探針的原位合成也需要通過連接反應來完成。
[0197]如本領域中所知，連接酶催化兩個緊鄰的核酸間並置的3』-羥基和5』-磷酸末端之間的磷酸二酯鍵的形成。可以採用任何方便的連接酶，其中適用的代表性連接酶包括，但不限於:熱敏性和熱穩定性連接酶。熱敏性連接酶包括，但不限於，噬菌體T4DNA連接酶、噬菌體T7連接酶和大腸桿菌連接酶。熱穩定性連接酶包括，但不限於，Taq連接酶、Tth連接酶和Pfu連接酶。熱穩定性連接酶可以從嗜熱或者極端嗜熱的生物中獲得，包括但不限於，原核生物、真核生物或古細菌。本發明的方法中可以採用某些RNA連接酶。
[0198]該連結步驟中，將適當的連接酶和根據必要性和/或醫院選用的任何試劑與反應混合物合併，並在適合相關寡核苷酸進行連接反應的條件下維持。連接反應條件為本領域技術人員所熟知。連接反應中，某些實施例中的反應混合物可以保持在約4°C至約50°C，例如在約20°C至約37°C的溫度下保持一段時間，所述時間為約5秒鐘至約16小時，例如從約I分鐘至約I小時。但在其他一些實施例中，反應混合物可以在約35°C至約45°C的範圍內，例如從約37°C至約42°C，如在(約)38°C、39°C、40°C或41V維持一段時間，所述時間範圍在約5秒鐘至約16小時之間，例如從約I分鐘至約I小時，包括從約2分鐘至約8小時。在一個代表性實施例中，連接反應混合物包括50mM Tris (pH7.5)、IOmM MgCl2UOmM DTTUmMATP、25mg/ml BSA、0.25units/ml RNase 抑制物和 0.125units/ml T4DNA 連接酶。在又一個代表性實施例中，採用了 2.125mM鎂離子、0.2units/ml RNase抑制物和0.125units/mlRNase DNA連接酶。反應中所用的接合體含量取決於樣本中的DNA (例如cDNA)分子的濃度，通常在DNA (例如cDNA)的摩爾含量的10-100倍之間。
[0199]在一個代表性示例中，本發明的方法可以含有以下步驟:
[0200](a)將陣列與組織樣本相接觸，其中所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，且每一種類在所述陣列中各佔不同位置，且所述探針定向為具有3』自由端，以使所述探針能作為反轉錄酶(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括:
[0201](i)與陣列上的捕獲探針位置相對應的定位域，和
[0202](ii)捕獲域；
[0203]以令組織樣本的RNA與所述捕獲探針相雜交。
[0204](b)對陣列上的組織樣本成像；
[0205](c)對捕獲的mRNA分子進行反轉錄以生成cDNA分子；
[0206](d)洗滌陣列以去除殘餘組織；
[0207]Ce)從陣列表面釋放至少部分cDNA分子；
[0208](f)對釋放的cDNA分子實施cDNA第二鏈合成；
[0209]以及
[0210](g)分析(例如測序)cDNA分子的序列。
[0211]在一個可選的代表性示例中，本發明的方法可以含有以下步驟:[0212](a)將陣列與組織樣本相接觸，其中所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了至少兩種捕獲探針，且每一種類在所述陣列中各佔不同位置，且所述探針定向為具有3』自由端，以使所述探針能作為反轉錄酶(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括:
[0213](i)與陣列上的捕獲探針位置相對應的定位域，和
[0214](ii)捕獲域；
[0215]以令組織樣本的RNA與所述捕獲探針相雜交；
[0216](b)可選地，對組織樣本進行補水；
[0217](C)對已捕獲的mRNA分子進行反轉錄，以生成cDNA分子的第一鏈，且可選地，合成cDNA分子的第二鏈；
[0218](d)對陣列上的組織樣本成像；
[0219](e)洗滌陣列以去除殘餘組織；
[0220]Cf)從陣列表面釋放至少部分cDNA分子；
[0221](g)對釋放的cDNA分子實施cDNA第二鏈合成；
[0222]以及
[0223](h)分析(例如測序)cDNA分子的序列。
[0224]在一個代表性示例中，本發明的方法可以含有以下步驟:
[0225](a)將陣列與組織樣本相接觸，其中所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，且每一種類在所述陣列中各佔不同位置，且所述探針定向為具有3』自由端，以使所述探針能充當反轉錄酶(RT)引物，其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括:
[0226](i)與陣列上的捕獲探針位置相對應的定位域，和
[0227](ii)捕獲域；
[0228]以令組織樣本的RNA與所述捕獲探針相雜交。
[0229](b)可選地，對陣列上的組織樣本成像；
[0230](c)對捕獲的mRNA分子進行反轉錄以生成cDNA分子；
[0231](d)可選地，若未進行步驟(b)的成像步驟，則對陣列上的組織樣本成像；
[0232](e)洗滌陣列以去除殘餘組織；
[0233](f)從陣列表面釋放至少部分cDNA分子；
[0234](g)對已釋放的cDNA分子實施cDNA第二鏈合成；
[0235](h )擴增雙鏈cDNA分子；
[0236]( i )可選地，純化cDNA分子，以除去可能干擾測序反應的成分；
[0237]以及
[0238]( j )分析(例如測序)cDNA分子的序列。
[0239]本發明包括上述方法中各步驟的任何適當組合。可知曉，本發明還包括這些方法的變形，例如，在陣列上進行原位擴增，以及包括了省略成像步驟的方法。
[0240]本發明還可以被看做是包括一種製作或生產陣列的方法，所述陣列(i)用於從與其相接觸的組織樣本上捕獲mRNA;或(ii)用於確定和/或分析組織樣本的(例如，部分或全局)轉錄組，所述方法包括在陣列基板上直接或間接地固定多種捕獲探針，其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括:
[0241](i)與陣列上的捕獲探針位置相對應的定位域，和
[0242](ii)捕獲域；
[0243]本發明用於生產陣列的方法可以進一步限定為，固定在陣列上的每種捕獲探針都作為一個特徵。
[0244]將捕獲探針固定於陣列的方法，可以採用如上所述的任何適當方法來完成。當捕獲探針間接固定在陣列上時，捕獲探針可以在陣列上合成。所述方法可以含有一個或多個以下任意步驟:
[0245](a)將多種表面探針直接或間接固定在陣列基板上，其中表面探針含有:
[0246](i)能夠與部分捕獲域寡核苷酸(不用於捕獲RNA等核酸的部分)相雜交的結構域；
[0247](ii)互補定位域；以及
[0248](iii)互補通用域；
[0249](b)將捕獲域寡核苷酸和通用域寡核苷酸與固定在陣列上的表面探針相雜交；
[0250](c)通過模版化的聚合反應，延長通用域寡核苷酸，以生成捕獲探針的定位域；以及
[0251](d)將定位域連接至捕獲域寡核苷酸，以生成捕獲寡核苷酸。
[0252]步驟(d)中的連接反應可以與`步驟(C)中的延長反應同時進行，因此，該反應並非必須在單獨的一步中進行，當然，根據意願也可以這樣做。
[0253]按照本發明的上述陣列生產方法製造出來的陣列，其特徵可以如上所述進行進一步限定。
[0254]雖然如上所述，本發明涉及RNA的檢測或分析以及轉錄組的分析或檢測，但可知曉，所述原理可以同理應用於細胞DNA的檢測或分析以及用於基因組研究。因此，從更廣闊的視角來看，本發明一般說來可以看做是用於檢測核酸，從更具體的方面來說，可以看作是提供了 DNA的分析或檢測方法。空間信息可能會對基因組學相關研究具有價值，即帶空間解析度的DNA分子檢測和/或分析。根據本發明，這可以通過基因組標籤來達成。此類局部或空間檢測方法可以會在例如組織的不同細胞或區域中的基因組變異研究中有用，例如比較正常和病態細胞或組織(如正常vs.腫瘤細胞或組織)，或研究疾病進程中的基因組變化等。舉例來說，腫瘤細胞可以包含具有不同的基因組變異體的細胞異源種群(例如，變異和/或其他基因異常，如染色體重排、染色體擴增/刪除/插入等)。不同細胞中基因組變異或不同基因組位點的局部檢測，在這樣的情況下會有用，例如，研究基因組變異的空間分布。此方法的一個主要用途在於腫瘤分析。例如，在本發明的範圍中，可以製備出為捕獲一個特徵的整個細胞的基因組所設計的陣列。因此，可以比較組織樣本的不同細胞。顯然，本發明並不局限於這一設計，而可能存在其他可能的變化方式，其中對DNA進行局部檢測，且陣列上DNA的捕獲位置與組織樣本的某個位置或位點相關聯。
[0255]相應地，在一個更廣泛的方面，本發明可以看作是提供了組織樣本中核酸的局部檢測方法,包括:
[0256](a)提供一種陣列，所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，令每一種類探針在所述陣列中各佔不同位置且定向為具有3』自由端，以使所述探針能充當延長反應或引物連接反應的引物，其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括:
[0257](i)與所述陣列上的所述探針的位置對應的定位域，和
[0258](ii)捕獲域；
[0259](b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上捕獲探針的位置能與所述組織樣本上的某個位置相關聯，並允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交；
[0260](c)以所述捕獲探針作為延長引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子上生成DNA分子，其中所述被延長或連接的DNA分子通過定位域來標記；
[0261](d)可選地，產生一條所述被標記DNA的互補鏈，和/或可選地，擴增所述被標記DNA ；
[0262](e)從所述陣列表面釋放至少部分被標記DNA分子和/或他們的互補鏈或擴增子，其中所述部分包括定位域或其互補鏈；
[0263](f)直接或間接分析被釋放DNA分子的序列(例如，測序)。
[0264]如上文中更為詳細的描述，任何核酸分析方法都可以用來進行分析步驟；典型地，可以包括測序，但實施序列確定並不是必要的。例如，可以採用序列特異性的分析方法。例如可以實施序列特異性的擴增方式，如使用定位域特異性的引物和/或針對特定目標序列的引物，例如，待測的特定目標DNA (即:與特定的cDNA/RNA、基因、基因變異體、基因組位點或基因組變異 等相對應的DNA).一種範例分析方法是序列特異性PCR反應。
[0265]步驟(f)中獲得的序列分析(例如測序)信息可以用於獲得樣本的核酸相關的空間信息。換句話說，序列分析信息可以提供樣本的核酸的位置相關信息。該空間信息可以來自已確定或辨認的序列等的分析信息，例如可以揭示特定核酸分子的存在，該特定核酸分子的存在可能本身在所用組織樣本中就含有有用空間信息，和/或可以結合組織樣本在陣列上的位置與序列分析信息來推定空間信息(例如，空間定位)。但是，如上所述，可以通過將序列分析數據與組織樣本的圖像相關聯來方便地獲取空間信息，這體現在本發明的一個優選實施例中。
[0266]相應地，在一個優選的實施例中，本方法還可以包括如下步驟:
[0267](g)將所述陣列分析信息與所述組織樣本圖像相關聯，其中組織樣本在步驟(C)之前或之後成像。
[0268]步驟(a)中涉及的引物延長反應可以限定為聚合酶催化的延長反應，其作用在於，獲取與捕獲探針共價連接的已捕獲核酸分子的互補鏈，也就是，以捕獲探針作為引物和以已捕獲的核酸作為模版，合成互補鏈。換句話說，所述延長反應可以是通過任何聚合酶來實施的任何引物延長反應。所述核酸可以是RNA或DNA。相應地，所述聚合酶可以是任何聚合酶；可以是反轉錄酶或DNA聚合酶。連接反應可以通過任何連接酶實施，其作用在於將已捕獲的核酸分子的互補鏈綁定在捕獲探針上，即:其中已捕獲的核酸分子(雜交於捕獲探針上)含部分雙鏈，且其互補鏈與捕獲探針相連接。
[0269]這一方法的一個優選實施例，即為如上所述用於轉錄組的確定和/或分析或者用於RNA測定的方法。在一個替代方式的優選實施例中，所述待測核酸分子為DNA。在此種實施例中，本發明提供了一種組織樣本中DNA的局部檢測方法，包括:
[0270](a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，且每一種類在所述陣列中各佔不同位置，且其方向上具有3』自由端，以使所述探針能作為引物引導引物延長反應或引物連接反應，其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括:
[0271](i)與所述陣列上的所述探針的位置對應的定位域，和
[0272](ii)捕獲域；
[0273](b)將所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關聯，並允許所述組織樣本上的DNA與所述捕獲探針的捕獲域雜交；
[0274](c)將所述組織樣本中的DNA片段化，其中所述片段化在陣列與組織樣本相接觸的步驟(b)之前、之中或者之後實施；
[0275](d)以已捕獲的DNA片段作為模版，通過引物延長反應來延長所述捕獲探針，或通過連接反應將已捕獲的DNA片段連接在捕獲探針上，以產生DNA分子，其中所述被延長或連接的DNA分子通過定位域來標記；
[0276](e)可選地，產生一條所述被標記DNA的互補鏈和/或可選地，擴增所述被標記DNA ；
[0277](f)從所述陣列表面釋放至少部分被標記DNA分子和/或他們的互補鏈或擴增子，其中所述部分包括所述定位域或其互 補鏈；
[0278](g)直接或間接分析被釋放DNA分子的序列。
[0279]該方法還可以進一步包括以下步驟:
[0280](h)將所述陣列分析信息與所述組織樣本的圖像相關聯，其中組織樣本在步驟(d)之前或之後成像。
[0281]在空間基因組學研究中，且目標核酸是DNA時，某些情況下優選包括成像步驟以及圖像關聯步驟。
[0282]在一些捕獲DNA的實施例中，所述DNA可以是細胞中出現的任何DNA分子。因此，它可以是基因組(即細胞核的)DNA、線粒體DNA或質粒DNA，如葉綠體DNA。在一個優選實施例中，所述DNA為基因組DNA。
[0283]可知曉，當在步驟(b)所述接觸(即在組織樣本放置於陣列上)之後才實施片段化時，DNA的片段化發生於同捕獲域相雜交之前。換句話說，DNA片段與所述捕獲探針的捕獲域相雜交(或更具體地說，允許雜交)。
[0284]本發明在此方面的一個特定實施例中，優選地，但並非必須地，可以為組織樣本的DNA片段引入一個結合域，來允許或促進陣列上的捕獲探針對所述片段的捕獲。相應地，所述結合域能夠與捕獲探針的捕獲域雜交。因此，所述結合域可以被看做是捕獲域的互補鏈(即:可以被看做是互補捕獲域)，但並不要求捕獲域和結合域之間的絕對互補，僅要求結合域的互補程度足以允許有效雜交的發生，即:令組織樣本中的DNA片段能夠與捕獲探針的捕獲域相雜交。引入這樣一個結合域，可以保證樣本DNA直到片段化步驟之後才與捕獲探針結合。可以通過本領域熟知的操作流程向DNA片段提供結合域，例如，通過令可含有結合域的接合體或連接子序列相連接。舉例來說，可以使用含有一個伸出端的連接子序列。結合域可以存在於此連接子的單鏈部分，以便於接下來該連接子與DNA片段的連接；含有結合域的單鏈部分能用於與捕獲探針的捕獲域的雜交。可選地，在一個優選實施例中，可以通過末端轉移酶引入聚核苷酸尾(例如，同聚體尾，如poly-A結構域)來引入結合域。該步驟可以通過使用與上述RNA方法中引入通用域的類似操作來實施。因此，在優選的實施例中，可以引入一個共同結合域。換句話說，就是所有DNA片段共同的結合域，可以用於達成陣列上的片段捕獲。
[0285]實施加尾反應來引入(共同)結合域時，可以保護陣列上的捕獲探針不受加尾影響，即:可如前文封閉或遮蔽捕獲探針。該步驟可以通過，例如用封閉寡核苷酸與捕獲探針雜交來達成，例如與捕獲探針的伸出端(如單鏈部分)雜交。舉例來說，當捕獲域含有Poly-T序列時，該封閉寡核苷酸可以是poly-A寡核苷酸。該封閉寡核苷酸可以含有已封閉的3』端(即:無法延長或加尾的一端)。如上所述，對捕獲探針，還可以通過化學和/或酶促修飾的方法來加以保護，即加以封閉。
[0286]當按照前文通過連接子的連接反應來引入結合域時，可知曉，與其延長捕獲探針來生成一個含有捕獲探針引物的定位標籤的已捕獲DNA片段互補副本，還可以將DNA片段連接至捕獲探針3』端。如上所述，連接反應要求待連接的5』端磷酸化。相應地，在一個實施例中，新增的連接子的5』端，即將要連接至捕獲探針的一端(即新增至DNA片段的連接子的非伸出端)，會經過磷酸化。在該連接反應的實施例中，相應地，可知曉，可以將一個連接子連接到雙鏈DNA片段上，所述連接子具有含有結合域的單鏈伸出3』端。與陣列接觸之時，所述伸出端便與捕獲探針的捕獲域相雜交。該雜交反應將捕獲探針的3』端與新增的連接子的5』端(非伸出端)並置及連接。因此，捕獲探針，乃至定位域，都通過該連接反應併入已捕獲的DNA片段。該實施例的原理如圖21所示。
[0287]因此，在一種更具體的實施方式中，本發明在該方面的方法可以包括:
[0288](a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多種捕獲探針，每一種類在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有3』自由端，以使所述探針能充當延長反應或引物連接反應的引物，其中所述捕獲探針的每一種類都包括一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括:
[0289](i)與陣列上的探 針位置對應的定位域，和
[0290](ii)捕獲域；
[0291](b)將所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關聯；
[0292](c)將所述組織樣本中的DNA片段化，其中所述片段化在陣列與組織樣本相接觸的步驟(b)之前、之中或之後實施；
[0293](d)為所述DNA片段引入一個結合域，所述結合域可以與所述捕獲域雜交；
[0294](e)允許所述DNA片段與所述捕獲探針的捕獲域雜交；
[0295]Cf)以已捕獲的DNA片段作為模版，通過引物延長反應延長所述捕獲探針，或通過連接反應將已捕獲的DNA片段連接在捕獲探針上，以生成DNA分子，其中所述被延長或連接的DNA分子通過定位域來標記；
[0296](g)可選地，產生一條所述被標記DNA的互補鏈和/或可選地，擴增所述被標記DNA ；
[0297](h)從所述陣列表面釋放至少部分被標記DNA分子和/或他們的互補鏈或擴增子，其中所述部分包括所述定位域或其互補鏈；
[0298]( i )直接或間接分析被釋放DNA分子的序列。[0299]可選地，該方法還可以進一步包括以下步驟:
[0300]( j )將所述陣列分析信息與所述組織樣本的圖像相關聯，其中組織樣本在步驟(f )之前或之後成像。
[0301]如上所述的核酸或DNA檢測方法中，生成被標記核酸/DNA的互補副本亦或擴增被標記DNA的可選步驟，可以包括按照前文RNA/轉錄組分析/檢測方法中所述的原理，使用鏈置換聚合酶。適當的鏈置換聚合酶如上所述。該步驟的目的在於，保證定位域被複製引入所述互補副本或擴增子，尤其是在捕獲探針通過與表面探針雜交固定在陣列上的情況下。
[0302]但是，本步驟中，鏈置換聚合酶的使用並不是必要的。舉例來說，可以同時利用非鏈置換聚合酶和與定位域雜交的寡核苷酸的連接反應。該流程類同於上述捕獲探針在陣列上的合成。
[0303]在一個實施例中，本發明的方法可以用於確定和/或分析組織樣本的全部基因組，例如，組織樣本的全基因組。但是，本方法並不限於此，還包括確定和/或分析全部或部分基因組。因此，本方法可以包括確定和/或分析基因組的部分或子集，例如，對應於染色體的一個基因子集或基因群的部分基因組，如特定基因群或染色體群、或基因組的特定區域或部分，例如涉及某一特定疾病、狀況、組織類型等。因此，本方法可以用於檢測或分析腫瘤組織與正常組織相比之下的基因組序列或基因組位點，或者甚至一個組織樣本中的不同細胞類型。還可以檢測不同細胞、細胞群、組織、局部組織、組織類型的不同基因組變異或位點的存在、缺失、分布或定位。
[0304]從另一方面來看，本方法的上述步驟可以看作是提供了一種獲取關於核酸的空間信息的方法，例如組織樣本的基因組序列、變異體或位點。換句話說，本發明的方法可以用於標記(或標識)基因組，尤其是個體或空間分布的基因組。
[0305]從另一 角度來看，本發明的方法可以看作是一種組織樣本的DNA的空間檢測方法，或一種以空間解析度檢測DNA的方法，或一種對組織樣本的DNA進行局部或空間確定和/或分析的方法。尤其是，本方法可以用於組織樣本中基因或基因組序列或基因組變異體或位點(例如，基因組變異體或位點的分布)的局部或空間檢測、確定和/或分析。局部/空間檢測/確定/分析的意思是，可以對組織樣本DNA在細胞或組織中的原生位置或位點進行定位。因此，舉例來說，可以將DNA在樣本中的一個細胞、細胞群或細胞類型，或組織樣本的特定區域進行定位。可以確定DNA (或換句話說，組織樣本中DNA的位點或位置)的原生位點或位置，例如基因組變異體或位點。
[0306]因此，可知曉，本發明的陣列可以用於捕獲核酸，例如，與所述陣列相接觸的組織樣本DNA。該陣列還可以用於確定和/或分析組織樣本的部分或全局基因組，或用於獲取組織樣本中含空間限定信息的部分或全局基因組。因此，本發明的方法可以被看做是組織樣本中一種或多種基因組序列(或變異體，或基因位點)的空間分布的量化方法。換句話說，本發明的方法可以用於檢測組織樣本中一種或多種基因組序列、基因組變異體或基因組基因位點。再換句話說，本發明的方法可用於同時確定組織樣本中一種或多種基因組序列、基因組變異體或基因組基因位點的位置或分布。更進一步地，該方法可以看做是以空間解析度，例如二維空間解析度，對組織樣本的核酸(如DNA))進行部分或全局分析的方法。
[0307]本發明還可以看作是為本發明的方法提供一種陣列，所述陣列包括基板，所述基板上含有多種直接或間接固定的捕獲探針，且每種探針在陣列上佔據不同位置並定向為具有自由3』端，以能令所述探針具有延長引物或連接引物的作用，其中所述捕獲探針的每個種類都含有一個核酸分子，所述核酸分子在其5』至3』端的方向上含有:
[0308](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對應，以及
[0309](ii)捕獲域，用於捕獲與所述陣列相接觸的組織樣本的核酸。
[0310]在其中一個方面中，已捕獲的核酸分子為DNA。捕獲域可以針對待檢測的一種特定DNA或DNA的特定種類、群組具有特異性，例如，按照前文所述RNA檢測的類同方法，令捕獲域與目標DNA特定基元序列，如保守序列，進行特異性雜交。可選地，可以為待捕獲的DNA引入一個結合域，例如，如上所述的共同結合域，所述結合域可以被捕獲探針的捕獲域識別。因此，如上所述，結合域可以是例如同聚物序列，如poly-A。同樣地，可以按照類似前文所述設計RNA/轉錄組分析或檢測的原理和方法來獲得該結合域。在此情形下，捕獲域可以與被引入組織樣本DNA分子的結合域互補。
[0311]如前文RNA相關內容所述，捕獲域可以是一個隨機或簡併序列。因此，可以通過令DNA與一個隨機或簡併捕獲域結合，或與含有至少部分隨機或簡併序列的捕獲域結合，來捕獲 DNA。
[0312]在一個相關的方面，本發明還提供一種陣列的應用，包括基板，所述基板上直接或間接固定了多種捕獲探針，每種探針在陣列上居於不同位置且定向為具有3』端自由端，以便使所述探針能夠充當延長反應或連接反應的引物，其中所述探針的每個種類都含有一個核酸分子，所述核酸分子在5』至3』端的方向上含有:
[0313](i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對應，以及
[0314](ii)捕獲域；
[0315]所述捕獲域用於捕獲與所述陣`列相接觸的組織樣本的核酸，如DNA或RNA。
[0316]優選地，所述應用用於組織樣本核酸的局部檢測，且進一步包含以下步驟:
[0317](a)利用所述捕獲探針作為延長引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子生成DNA分子，其中所述被延長或連接的分子通過定位域加以標記；
[0318](b)可選地，生成所述被標記核酸的互補鏈和/或擴增所述被標記的核酸；
[0319](C)從陣列表面釋放至少部分被標記的DNA分子和/或其互補鏈或擴增子，其中所述部分包括定位域或其互補鏈；
[0320](d)直接或間接分析被釋放的DNA分子的序列；且可選地
[0321](e)將所述的序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關聯，其中所述組織樣本的成像完成於步驟(a)。
[0322]組織樣本DNA片段化的步驟可以根據意願，通過任何本領域所知方法實施。因此，可以採用物理方法實施片段化，例如聲波降解法或超聲處理。相關化學方法亦已知曉。還可以採用酶促方法實現片段化，例如，利用核酸內切酶，如限制性酶。同樣地，該步驟的方法和酶為本領域所熟知。片段化可以在製備待用於陣列的組織樣本的步驟(例如製備組織切片的步驟)之前、之中或者之後。方便的是，固定組織的步驟就可能造成片段化。因此，舉例來說，福馬林固定可以造成DNA的片段化。其他的固定劑可以帶來類似結果。
[0323]關於本發明的這些方面中製備和使用陣列的細節，可知曉，前文中所述RNA方法中給出的描述和細節也可同理應用於此述的更為廣泛的核酸檢測和DNA檢測方法。因此，上述的所有方面和細節同理可用。舉例來說，關於反轉錄酶引物和反應等的論述可同理適用於上述延長引物、聚合酶反應等的任何方面。同樣地，cDNA第一鏈和第二鏈合成的參考方法也可以同理適用於被標記的DNA分子及其互補鏈。序列分析可以採用如上所述的方法。
[0324]舉例來說，捕獲域可以如上述用於捕獲探針。含有或僅含有poly-T的捕獲域可用於，例如，向DNA片段引入含有poly-A序列的結合域的情況。
[0325]可為捕獲探針/標記DNA分子(即:帶標記並經延長或連接的分子)引入上述的通用域，例如，用於擴增和/或剪切。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0326]下面將結合非限制性的實施例並引用如下附圖，對本發明作進一步描述。
[0327]圖1所示為利用「識別碼」寡脫氧胸苷酸探針的陣列來從組織切片捕獲mRNA並用於轉錄組分析的整體概念。
[0328]圖2所示為相應組織切片的轉錄體豐度可視化的原理示意圖。
[0329]圖3所示為3』至5』表面探針的構成以及間接固定於陣列表面的5』至3』方向的捕獲探針的合成。
[0330]圖4所示為自製陣列的酶促(USER或Rsal)剪切效率和Agilent生產的陣列在99 V熱水中的剪切效率，以探針釋放後，螢光標記的探針與陣列表面的雜交反應來測定。
[0331]圖5所示為Agilent生產的商品陣列在99°C熱水介導下進行DNA表面探針釋放後所捕捉的螢光圖像。熱水處理後，進行了螢光檢測探針的雜交。最上方的陣列為未處理的對照組。
[0332]圖6所示為固定於轉錄組捕獲陣列之上的小鼠腦組織切片，已經過cDNA合成並分別以胞質染色劑(上，標記為NeuN)和核酸染色劑(中，標記為Nuclei)處理，兩種染色劑都展示於合併圖像中(下，標記為merge)。
[0333]圖7所示為表格，列出了示意圖所示的低密度自製DNA捕獲陣列中按來源位點分類的Read。
[0334]圖8所示為一個識別碼微陣列中，以核酸和Map2特異染色劑染色的FFPE小鼠腦組織。
[0335]圖9所示為以核酸染色劑(白色)染色的FFPE小鼠腦嗅球及可見形態。
[0336]圖10所示為以核酸染色劑(白色)染色的FFPE小鼠腦嗅球(約2x2mm)，與低解析度陣列的理論點樣格局相重疊。
[0337]圖11所示為以核酸染色劑(白色)染色的FFPE小鼠腦嗅球(約2x2mm),與中等解析度陣列的理論點樣格局相重疊。
[0338]圖12所示為FFPE小鼠腦嗅球的小球區域的放大顯示(即圖9右上部)。
[0339]圖13所示為在擴增反應中，用由B_handle連接的隨機六聚體引物(R6) (B_R6)進行USER釋放的所得產物；產物以生物分析儀繪製。
[0340]圖14所示為 在擴增反應中，用由B_handle連接的隨機八聚體引物(R8) (B_R8)進行USER釋放的所得產物；產物以生物分析儀繪製。
[0341]圖15所示為一項在覆蓋整個陣列的FFPE腦組織上進行的實驗的結果。在表面合成及釋放cDNA後，以ID特異性及基因特異性引物(B2M外顯子4)擴增的ID5 (左)和ID20(右);擴增後的ID5和ID20。[0342]圖16所示為實施例4中所述方法的原理的示意圖，即固定有載有空間標記序列(定位域)的DNA寡核苷酸(捕獲探針)的微陣列的使用。所述微陣列的寡核苷酸的每一特徵都載有I)特有的標記(定位域)和2)捕獲序列(捕獲域)。
[0343]圖17所示為實施例5中以預先片段化為平均大小為200bp的基因組DNA來實施所述的空間基因組實驗流程所得的實驗結果。在陣列上擴增內部產物，標記併合成了 DNA。測得的峰值大小符合預期。
[0344]圖18所示為實施例5中以預先片段化為平均大小為700bp的基因組DNA來實施所述的空間基因組實驗流程所得的實驗結果。在陣列上擴增內部產物，標記併合成了 DNA。測得的峰值大小符合預期。
[0345]圖19所示為以預先片段化為平均大小為200bp的基因組DNA來實施實施例5中所述的空間基因組實驗流程所得的實驗結果。以表面寡核苷酸所含的一個內引物和一個通用序列對產物進行擴增。在陣列上進行擴增，標記併合成了 DNA。由於隨機片段化和基因組DNA的末端轉移酶標記會產生極為多樣化的樣本池，預期產物具有拖尾。
[0346]圖20所示為以預先片段化為700bp的基因組DNA來實施實施例5中所述的空間基因組實驗流程所得的實驗結果。以表面寡核苷酸所含的一個內引物和一個通用序列對產物進行擴增。在陣列上進行擴增，標記併合成了 DNA。由於隨機片段化和基因組DNA的末端轉移酶標記會產生極為多樣化的樣本池，預期產物具有拖尾。
[0347]圖21所示為連接子連接到DNA片段的連接反應示意圖，該反應在poly-T捕獲域中引入用於雜交的結合域，以達成與捕獲探針的後續連接。
[0348]圖22所示 為高密度捕獲陣列中所採用的5』至3』方向的捕獲探針的構成。
[0349]圖23所示為高密度陣列的框架，用於組織樣本的定向，通過螢光標記探針的雜交可視化。
[0350]圖24所示為高密度陣列上已剪切和未剪切的捕獲探針，其中框架探針由於不含尿嘧啶鹼基而未被剪切。捕獲探針以與poly-A寡核苷酸連結的螢光素加以標記。
[0351]圖25所示為以從小鼠嗅球捕獲的轉錄體所製備的文庫的生物分析儀製圖。
[0352]圖26所示為從小鼠嗅球所提取的總RNA中所捕獲的轉錄體的Matlab可視化。
[0353]圖27所示為採用Matlab可視化程序對從小鼠嗅球組織捕獲的Olfr (嗅覺受體)轉錄體的全捕獲陣列可視化。
[0354]圖28所示為自製41-1D-標記微陣列的噴點格局。
[0355]圖29所示為捕獲具有poly-A尾的基因組片段再進行A431特異性易位後製得的空間基因組文庫。
[0356]圖30所示為在捕獲陣列上，在10%和50%上具有峰值的含poly-A尾的基因組片段被捕獲後，經過A431特異性易位成為含poly-A尾的U20S基因組片段的檢測結果。
[0357]圖31所示為將在41-1D標記的自製陣列上從小鼠嗅球組織所捕獲的含ID標記的轉錄體，經Matlab可視化後，與組織圖像的重疊。為清晰起見，對辨識出特定基因的特定特徵加以了圈定。
【具體實施方式】
[0358]實施例1[0359]陣列的製備
[0360]以下實驗展示了如何將寡核苷酸探針通過其5'或3'端附著於陣列基板上，來得到含有能與mRNA雜交的捕獲探針的陣列。
[0361]製備含5'至3'端方向的探針的自製噴點微陣列
[0362]在玻璃載片上點樣20個各有標記序列的RNA捕獲寡核苷酸(標記1_20，表1)作為捕獲探針。所述探針以一個5』-端氨基連接子和一個C6間隔子合成。所有的探針均由Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)合成。RNA捕獲探針以150mM的磷酸鈉製成濃度為 20 μ M、pH 為 8.5 的懸液，並以 Nanoplotter NP2.1/E 噴點系統(Gesim, Grosserkmannsdorf, Germany)在 CodeLink? Activated 微陣列載片(7.5cm χ2.5cm; Surmodics, EdenPrairie，MN，USA)上點樣。噴點完成後，按照廠家說明書進行表面封閉。所述探針在載片上噴為16個等同陣列，且每個陣列含有一種預設的噴點格局。雜交反應中，所述16個子陣以16 格遮光框(ChipClip? Schleicher&Schuell BioScience, Keene, NH, USA)進行分隔。
[0363]
【權利要求】
1.對組織樣本中的核酸的進行局部檢測的方法，包括: (a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多個種類的捕獲探針，每個種類的捕獲探針在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有一 3』自由端以使所述探針能作為引物引導引物延長反應或引物連接反應，其中每個種類的捕獲探針都包括一核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括: (i)定位域，該定位域與陣列上的捕獲探針的位置相對應，和 (ii)捕獲域； (b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和組織樣本上的位置相關聯，並允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交； (c)以所述捕獲探針作為延長引物或連接引物，從已捕獲的核酸分子上產生DNA分子，其中所述經延長或連接的DNA分子具有定位域標記； Cd)可選地，生成被標記的DNA的互補鏈，和/或可選地，擴增所述被標記的DNA ； (e)從陣列表面釋放至少一部分被標記的DNA分子和/或他們的互補鏈或擴增子，其中所述部分包括定位域或其互補鏈；及 Cf)直接或間接地分析被釋放的DNA分子的序列。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，進一步包括步驟(g):將序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關聯，其中該組織樣本在步驟(c)之前或之後成像。
3.根據權利要 求1所述的方法，該方法作為測定和/或分析組織樣本的轉錄組的方法，包括: (a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多個種類的捕獲探針，每個種類的捕獲探針在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有一 3』自由端以使所述探針能作為引物引導引物延長反應或引物連接反應，其中每個種類的捕獲探針都包括核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括: (i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對應，和 (ii)捕獲域； (b)令所述組織樣本與陣列接觸，以使陣列上的捕獲探針的位置與組織樣本上的位置相關聯，且允許組織樣本上的RNA與所述捕獲探針上的捕獲域雜交； (c)以所述捕獲探針為RT引物，從已捕獲的RNA分子合成cDNA分子，且可選地，擴增所述cDNA分子； Cd)從陣列表面釋放至少部分所述cDNA分子和/或其擴增子，其中所述被釋放的分子可以是cDNA分子的第一和/或第二鏈或其擴增子，且其中所述部分包含定位域或其互補鏈； Ce)直接或間接地分析被釋放分子的序列；且可選地 (f)將序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關聯，其中該組織樣本在步驟(C)之前或之後成像。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其特徵在於，所述捕獲探針是DNA分子。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的方法，其特徵在於，所述捕獲探針進一步包含通用域，所述通用域在定位域的5』端方向且含有: (i )擴增域，用於擴增所生成的DNA分子；和/或(ii)剪切域，用於將所生成的DNA分子從陣列表面釋放。
6.根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其特徵在於，每個種類的捕獲探針的定位域都含有獨一無二的條形碼序列。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的方法，其特徵在於，所述捕獲域包括至少含10個脫氧胸腺嘧啶核苷殘基的poly-T DNA寡核苷酸和/或隨機或簡併的寡核苷酸序列。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其特徵在於，所述捕獲探針以其5』端直接固定於陣列表面。
9.根據權利要求1-7中任一項所述的方法，其特徵在於，所述捕獲探針通過與表面探針雜交而間接固定於陣列表面，其中所述捕獲探針的捕獲域包含上遊序列，所述上遊序列可與固定在陣列上的表面探針的5』端雜交。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，所述表面探針的3』端固定在陣列表面。
11.根據權利要求9或10所述的方法，其特徵在於，所述表面探針包括與下列各項互補的序列: (i)所述捕獲域的至少一部分； (ii)所述定位域；和 (iii)所述通用擴增域的至少一部分。
12.根據權利要求1-11中的任一項中所述的方法，其特徵在於，在所述被標記的DNA分子或所述cDNA分子從陣列表面釋放之前或之後，生成所述互補鏈或所述cDNA第二鏈。`
13.根據權利要求1-12中任一項中所述的方法，其特徵在於，cDNA第二鏈的互補鏈的合成中採用了鏈置換聚合酶。
14.根據權利要求1-13中任一項中所述的方法，其特徵在於，所述互補鏈或cDNA第二鏈的合成中採用了隨機引物。
15.根據權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述隨機引物含有擴增域。
16.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述隨機引物的擴增域和捕獲探針的擴增域含有不同的核酸序列。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的方法，其特徵在於，令接合體與被標記分子或其互補鏈或cDNA分子的一端或兩端連接。
18.根據權利要求1-17中任一項所述的方法，其特徵在於，在序列分析前進一步包括對所標記的分子或cDNA分子進行擴增的步驟。
19.根據權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述擴增步驟在被標記的DNA或cDNA分子從陣列基板釋放之後實施，或所述擴增步驟在陣列上原位實施。
20.根據權利要求18或19所述的方法，其特徵在於，所述擴增步驟包括PCR。
21.根據權利要求1-20任一項所述的方法，其特徵在於，所述分子通過如下方法從陣列表面釋放: (i)核酸剪切； (ii)變性；和/或 (iii)物理方法。
22.根據權利要求21(i)所述的方法，其特徵在於，所述分子通過酶切從剪切域釋放，所述剪切域位於捕獲探針的通用域或定位域中。
23.根據權利要求21(ii)或(iii)所述的方法，其特徵在於，通過將熱水或緩衝液應用至所述陣列來釋放所述分子。
24.根據權利要求1-23任一項所述的方法，其特徵在於，在測序之前進一步包括對被釋放的分子進行純化的步驟。
25.根據權利要求1-24任一項所述的方法，其特徵在於，所述基板選自下列材料:玻璃、矽、多聚賴氨酸塗層材料、硝化纖維、聚苯乙烯、環狀烯烴共聚物(COCs)、環狀烯烴高分子(COPs )、聚丙烯、聚乙烯和聚碳酸酯。
26.根據權利要求1-25任一項所述的方法，其特徵在於，所述組織樣本為組織切片。
27.根據權利要求26所述的方法，其特徵在於，所述組織切片從固定組織製備，例如，以福馬林固定石蠟包埋(FFPE)的組織或深度冷凍的組織。
28.根據權利要求1-27任一項所述的方法，其特徵在於，在樣本與陣列接觸之後且步驟(c)之前，進一步包括給組織樣本補水的步驟。
29.根據權利要求1-28任一項所述的方法，其特徵在於，所述組織樣本來自植物、動物或真菌。
30.根據權利要求1-29任一項所述的方法，其特徵在於，進一步包括洗滌陣列以除去殘餘組織的步驟，該步驟位於從陣列釋放所述分子之前。
31.根據權利要求1-30任一項所述的方法，其特徵在於，所述陣列包含至少一個定位標記，來為陣列上的組織樣本定向。
32.根據權利要求31所述方法，其特徵在於，所述陣列在陣列表面的不同位置包括至少 10、50、100、200、500、1000 或 2000 個定位標記。
33.根據權利要求31或32所述方法，其特徵在於，所述定位標記能與帶標記的標記核酸分子雜交，所述標記核酸分子優選為帶突光標記的標記核酸分子。
34.根據權利要求2-33中任一項所述方法，其特徵在於，所述組織樣本的成像是利用光、明視場、暗視場、相位差、螢光、鏡像、幹涉或共聚焦顯微鏡或其組合。
35.根據權利要求34所述的方法，其特徵在於，所述組織樣本的成像利用螢光顯微鏡。
36.根據權利要求1-35所述的方法，其特徵在於，所述序列分析步驟包括測序步驟，且優選地，所述測序步驟包括基於可逆染色終止劑的測序反應。
37.一種用於製作或生產陣列的方法，用於(i)從與所述陣列相接觸的組織樣本上捕獲核酸，或(ii)對組織樣本的核酸進行局部檢測；所述方法包括將多個種類的捕獲探針直接或間接固定於陣列基板，其中每個種類的捕獲探針均包括核酸分子，且所述核酸分子從5』至3』的方向上含有: (i)定位域，所述定位域與所述陣列上的所述探針的位置相對應；和 (ii)捕獲域。
38.根據權利要求37所述的方法，其特徵在於，每個種類的捕獲探針都在所述陣列上居於不同的位置。
39.根據權利要求37或38所述的方法，進一步包括一個或多個以下步驟: Ca)直接或間接將多個表面探針固定在陣列基板上，其中所述表面探針包含: (i)能與捕獲域寡核苷酸部分雜交的結構域(所述部分與核酸的捕獲無關); (ii)互補定位域；和(iii)互補通用域； (b)令捕獲域寡核苷酸和通用域寡核苷酸與固定於陣列上的表面探針雜交； (c)利用模版聚合反應延長所述通用域寡核苷酸，以生成捕獲探針的定位域；和 Cd)將定位域連接至捕獲域寡核苷酸，以生成捕獲寡核苷酸。
40.一種陣列，用於(i)從與所述陣列接觸的組織樣本上捕獲核酸對組織樣本的核酸進行局部檢測；所述陣列包括基板，所述基板上直接或間接地固定了多個種類的捕獲探針，每個種類的所述探針在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有3』自由端以使所述探針能作為引物引導引物延長反應或引物連接反應，其中每個種類的捕獲探針都含有核酸分子，所述核酸分子從5』到3』的方向上具有: (i )定位域，與所述陣列上的核酸的位置相對應，和 (ii)捕獲域，用於捕捉與所述陣列相接觸的組織樣本上的核酸。
41.根據權利要求37-39任一項所述的方法或權利要求40中所述的陣列，其特徵在於，所述捕獲探針為根據權利要求4-9中任一項中所限定的捕獲探針，所述表面探針為根據權利要求10或11中所限定的表面探針，所述基板為根據權利要求25所限定的基板，所述組織樣本為根據權利要求26、27、28中任一項所限定的組織樣本，所述陣列為根據權利要求31-33中任一項所限定的陣列，且所述定位標記為根據權利要求33中所限定的定位標記。
42.根據權利要求1或2所述的方法，該方法作為對組織樣本中的DNA進行局部檢測的方法，包括: (a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多個種類的捕獲探針，每個種類的所述探針在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有3』自由端以使所述探針能作為引物引導引物延長反應或引物連接反應，其`中每個種類的所述捕獲探針都包括核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括: (i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對應，和 (ii)捕獲域； (b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關聯，並允許組織樣本上的核酸與所述捕獲探針的捕獲域雜交； (c)將所述組織樣本中DNA片段化，其中所述片段化步驟實施於步驟(b)中令陣列與所述組織樣本接觸的之前、之間或之後； Cd)利用已捕獲的DNA片段作為模版，以引物延長反應延長所述捕獲探針，得到延長的DNA分子，或以連接反應將已捕獲的DNA片段連接至所述捕獲探針上，得到連接後的DNA分子，其中所述延長或連接後的DNA分子以定位域標記； Ce)可選地，產生所述被標記DNA的互補鏈，和/或可選地，擴增所述被標記DNA ； (f)從所述陣列表面釋放至少部分被標記DNA分子和/或他們的互補鏈和/或擴增子，其中所述部分包括所述定位域或其互補鏈； (g)直接或間接分析(例如，測序)被釋放DNA分子的序列；且可選地 (h)將所述序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關聯，其中所述組織樣本在步驟(d)之前或之後成像。
43.根據權利要求42所述的方法，包括: (a)提供包括基板的陣列，所述基板上直接或間接地固定了多個種類的捕獲探針，每個種類的所述探針在所述陣列中各佔不同位置，且定向為具有3』自由端以使所述探針能作為引物引導引物延長反應或引物連接反應，其中每個種類的所述捕獲探針的都包括核酸分子，所述核酸分子在5』至3』方向上包括: (i)定位域，與陣列上的捕獲探針的位置相對應，和 (ii)捕獲域； (b)令所述陣列與組織樣本接觸，以使得陣列上的捕獲探針的位置能和所述組織樣本上的位置相關聯； (c)將所述組織樣本中DNA片段化，其中所述片段化步驟實施於步驟(b)中令陣列與所述組織樣本接觸的之前、之間或之後； Cd)為所述DNA片段提供能夠與所述捕獲域雜交的結合域； Ce)允許所述DNA片段與所述捕獲探針的捕獲域相雜交； Cf)利用已捕獲的DNA片段作為模版，以引物延長反應延長所述捕獲探針，得到延長的DNA分子，或以連接反應將已捕獲的DNA片段連接至所述捕獲探針上，得到連接後的DNA分子，其中所述延長或連接後的DNA分子以定位域標記； (g)可選地，生成所述被標記DNA的互補鏈，和/或可選地，擴增所述被標記DNA； (h)從所述陣列表面釋放至少部分被標記DNA分子和/或他們的互補鏈和/或擴增子，其中所述部分包括定位域或其互補鏈； (i)直接或間接地分析(例如，測序)被釋放DNA分子的序列；且可選地 (j )將所述序列分析信息與所述組織樣本的圖像相關聯，其中所述組織樣本在步驟(f )之前或之後成像。
【文檔編號】C12Q1/68GK103781918SQ201280029001
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年4月13日 優先權日:2011年4月13日
【發明者】喬納斯·弗瑞森, 派屈克·斯塔爾, 喬亞基姆·倫德貝格 申請人:空間轉錄公司