蛋白質錯摺疊的治療的製作方法

2023-06-04 02:15:21

專利名稱：：蛋白質錯摺疊的治療的製作方法
技術領域：
：本發明總體而言涉及用於治療蛋白質錯摺疊疾病(proteinmisfoldingdisease)的方法。特別地，本發明關注(concems)利用熱休克蛋白90腺苷三磷酸酶激活劑(Aha)基因的調諧子(modulators)進行治療的方法。例如，本發明提供通過施用減量調節Aha表達的雙鏈RNA(dsRNA)來治療與不希望出現的Aha活性有關的病症的組合物和方法。介紹內質網(ER)是特化的摺疊環境，約三分之一真核基因組編碼的蛋白質在其中易位和摺疊為腔內分泌性蛋白(lumenalsecretedprotein)或跨膜蛋白。產生轉運小泡運送貨物(cargo)至高爾基體的多聯體複合物II(COPII)系統(machinery)將蛋白質從ER中輸出((Leeetal.,Annu.RevCellDev.Biol.20,87(2004))。ER相關的摺疊(ERAF)途徑也受到ER相關的降解(ERAD)途徑的協調，由此將錯摺疊的蛋白質作為目標易位至胞質蛋白酶體系統(Wegeleetal.,RevPhysiolBiochemPharmacol151,1(2004);Youngetal.,TrendsBiochem.Sci,28,541(2003》。多種錯摺疊疾病的發生在於內質網腔內貨物或跨膜貨物的變體未正確摺疊，進入COPII輸出系統失敗並在ER中降解，導致失去功能表型。嚢性纖維化(CF)是一種遺傳性兒童疾病，主要由CF跨膜傳導調控蛋白(CFTR,—種在鋪陳於許多組織的極化上皮的頂膜中存在的多結構域cAMP調控的氯離子通道)的不完全摺疊和從ER中輸出而誘發(Riordan,Annu.Rev.Physiol.67,701(2005))。CFTR由2個跨膜結構域組成(TMD1和2),通過胞質定向的N禾口C端結構i或(cytosolorientedN-andC-termialdomains)和調4空離子通道電導率(channelconductance)的NBD1、R和NBD2結構域將它們在生物合成水平分開。CFTR的轉運涉及指導摺疊和從ER中輸出的分子伴侶(Amaral,J.Mol.Neurosci.23,41(2004);Wangetal.,J.Struct.Biol.146,44(2004》，以及銜接蛋白質，其指導從跨高爾基體(transGolgi)的運輸(Chengetal.,J.Biol.Chem,280,3731(2005))和通過胞吞途徑的回收以維持細胞表面適當水平的氯離子通道活性(Gentzschetal.，Mol.Biol.Cell15,2684(2004);Swiatecka-Urbanetal"J.Biol.Chem.280,36762(2005))。超過90%的CF患者在CFTR的胞質NBD1ATP結合結構域中攜帶至少一個Phe508缺失的等位基因(AF508),導致嚴重的疾病形式。AF508破壞CFTR在ER中的摺疊(Quetal.,J.Bioenerg.Biomembr.29,483(1997);Riordan,同上)。報導顯示，AF508NBD1的摺疊在動力學上受損(Quetal.,supra;Quetal"J.Biol.Chem.272,15739(1997);Qu和Thomas,J.Biol.Chem.271,7261(1996))。作為這種摺疊過程中能量缺陷的後果，AF508在ER中未能獲得野生型摺疊，未能進入COPIIER輸出系統(Wang等，同上)並作為ER相關的降解(ERAD)的標靶(Nishikawaetal"JBiochem(Tokyo)137，551(2005))。因此，在治療CF時提供某些方法以預防AF508CFTR錯摺疊的後果將是理想的。熱休克蛋白90腺苷三磷酸酶1激活劑(Ahal)是Hsp90的腺苷三磷酸酶活性的激活劑並能激發酵母Hsp90固有活性(inherentactivity)U倍和人Hsp90固有活性50倍(Panaretou，B.,etal.,Mol.Cell2002,10:1307—1318)。生化研究顯示，Ahal結合Hsp90的中間區域(Panaretouetal.,2002,同上，Lotz,G.P.,etal.,J.Biol.Chem.2003,278:17228-17235),而最近對Ahal-Hsp90核心複合物的結構研究暗示輔分子伴侶(co-chaperone)促進Hsp90中間片段催化環(370-390)的構象轉換，這種轉換釋放催化性的Arg380並輔助其在N-末端核香酸結合結構域與ATP的相互作用(Meyer,P.,etal.,EMBOJ.2004,23:511-519)。分子伴侶熱休克蛋白90(Hsp90)負責特定主顧蛋白(clientprotein)的體內激活或成熟(Picard，D,,CellMol.LifeSci.2002，59:1640—1648;Pearl,L.H.和Prodromou,C.,Adv.ProteinChem.2002，59:157-185;Pratt,W.B.和Toft,D.O.，Exp.Biol.Med.2003，228:111—133;Prodromou,C和Pearl,L.H.,Curr.CancerDrugTargets2003,3:301-323)。對此激活至關重要的是Hsp90的基本腺苦三磷酸酶活性(Panaretou,B.,etal.，EMBOJ.1998,17:4829-4836),其驅動涉及Hsp90二聚體內N-末端核苷酸結合結構域瞬時結合的構象循環(Prodromou,C.,etal.,EMBOJ.2000,19:43834392)。作為分子伴侶，HSP卯促進大量構象不穩定的主顧蛋白成熟並維持其穩定性，其中多數涉及在肺瘤細胞內經常是紊亂的(deranged)生物過程，例如信號轉導、細胞周期進行和細胞凋亡。因此，與其他分子定向治療劑相反的是，HSP卯的抑制劑通過在癌細胞中同時破壞許多致癌物質來獲得前景光明的(promising)抗癌活性(WhitesellL和DaiC.,FutureOncol.2005;1:529-540;WO03/067262)。另外，已經暗示HSP90與嚢性纖維化跨膜傳導調控蛋白(CFTR)的降解有關。作為HSP90腺苷三磷酸酶活性的後果，CFTR基因中的突變導致該蛋白質不完全的摺疊和泛素化作用。緊隨泛素化作用的是CFTR在能夠到達其活性位點之前降解。活性CFTR的缺失將導致嚢性纖維化在具此突變的人受試者中發展。因此，HSP90活性的抑制可能對於受癌症或嚢性纖維化困擾的受試者有益處。Hsp卯構成總細胞蛋白質的約1-2%(Pratt,W.B.，Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.1997,37:297-326),而通過拮抗物或抑制劑的方法抑制如此大量蛋白質將潛在地需要將過量的抑制劑或拮抗物引入細胞。另一種方法是抑制以較小量存在的HSP90腺苷三磷酸酶活性的激活劑，例如Ahal。通過減量調節細胞中存在的Ahal量，HSP90的活性可以顯著地減低。顯著的序列同源性存在於人(Homosapiens)(NM—012111.1)、小家鼠(Musmusculus)(NM—146036.l)和黑猩猩(Pantroglodytes)(XM—510094.1)Aha1之間。明確的褐家鼠(rattusnorvegicus)Aha1同源物(homologue)還未鑑定，不過有一個褐家鼠(XM一223680.3)基因已基於其與酵母Ahsa2的序列同源性而被命名為熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑同源物(homolog)2(Ahsa2)。其序列與小家鼠RIKENcDNA1110064P04基因(NM—172391.3)同源，因而(intum)在序列上除N末端截短之外與小家鼠(Ausmusculus)Aha1相似。人Ahsa2(NM一152392.1)也已被預觀'J，但是序列同源性有限。這後三個基因的功能還未充分地進行闡釋。但是，在所有以上序列中存在一個區域是相同的，其可能用作RNAi試劑的標靶。抑制多於一個Aha基因的活性可能是有利的。最近已經顯示，dsRNA通過稱為RNA幹擾(RNAi)的高度保守的調控機理阻斷基因表達。WO99/32619(Fire等)公開了使用長度為至少25個核苷酸的dsRNA抑制秀麗隱杆線蟲(C.e/egara)的基因表達。已經顯示，dsRNA也可降解其他生物體包括植物(參見如WO99/53050,Waterhouse等；和WO99/61631,Heifetz等)、果蠅屬CDmsopfe7a)(參見如Yang,D.,等，C紅腸/.(2000)10:1191-1200)和哺乳動物(參見WO00/44895,Limmer;和DE10100586.5,Kreutzer等)的靶RNA。此天然機制已成為用於開發新類型藥劑的焦點，所述新類型藥劑用於治療由異常或非期望的基因調控而引起的病症。儘管RNAi領域有顯著的進展並在治療由HSP90介導的病理過程中有進展，但是仍有對能夠選擇性和高效性地削弱HSP90腺苷三磷酸酶活性的試劑的需要，例如通過利用細胞自身的RNAi系統。此類試劑可同時具有高生物活性和體內穩定性，並可有效地抑制靶Aha基因(例如Ahal)的表達，用以治療直接或間接地由Aha表達(例如Ahal的表達)介導的病理過程。此類試劑也可有效地抑制功能性Ahal蛋白質的活性，例如熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑活性。概述因此，本發明人們的成功在於發現降低功能性Ahal(—種熱休克蛋白(Hsp)的輔分子伴侶和腺苷三磷酸酶激活劑)的水平能夠導致CF相關的CFTR的AF508變體能量上的穩定化。這導致AF508摺疊、運輸和功能的重建。因此，本發明包含用於治療由蛋白質錯摺疊所導致的疾病的組合物和方法。組合物通常可以包含用以抑制細胞中功能性Aha蛋白質表達的dsRNA、載體、短髮夾RNA(shRNA)、小分子、抗體、反義核酸、適配體、核酶和它們的任意組合。例如，所述dsRNA可以包含有義鏈和反義鏈，其中所述反義鏈包含具有與Aha靶序列基本上互補的序列的互補性區域，其中所述靶序列的長度少於30個核苷酸，其中所述有義鏈與所述反義鏈基本上互補，而其中所述dsRNA在與表達功能性Aha蛋白質的細胞接觸時將功能性Aha蛋白質的表達抑制至少20%。在許多方面，Aha靶序列可以包含選自由SEQIDNO12-56組成的組中的序列。另一方面，dsRNA可以包含有義鏈和與有義鏈互補的反義鏈；所述有義鏈具有選自下組的序列SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143和SEQIDNO:145;所述反義鏈具有選自下組的序列SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:122、SEQIDNO:124、SEQIDNO:126、SEQIDNO:128、SEQIDNO:130、SEQIDNO:132、SEQIDNO:134、SEQIDNO:136、SEQIDNO:138、SEQIDNO:140、SEQIDNO:142、SEQIDNO:144和SEQIDNO:146。在另一個實例中，用於在細胞中表達用以抑制功能性Ahal表達的shRNA的載體可以包含有義鏈、髮夾接頭和反義鏈。在多個方面，有義鏈可包含具有與Aha靶序列基本上互補的序列的互補性區域，其中所述靶序列的長度少於30個核苷酸，反義鏈與所述有義鏈可以基本上互補，並且dsRNA在與表達功能性Aha蛋白質的細胞接觸時能夠將功能性Aha蛋白質的表達抑制至少20%。在多個方面，Aha靶序列可以包含選自由SEQIDNO12-56組成的組中的序列。另一方面，載體可以包含具有選自SEQIDNO:147、SEQIDNO:149或SEQIDNO:151中序列的有義鏈；和具有選自SEQIDNO:148、SEQIDNO:150或SEQIDNO:152中序列的反義鏈。在另一個實例中，用於在細胞中抑制功能性Ahal蛋白質表達的shRNA可以包含具有與Aha靶序列基本上互補的序列的互補性區域，其中所述耙序列的長度少於30個核苷酸，其中所述shRNA在與表達功能性Aha蛋白質的細胞接觸時將功能性Aha蛋白質的表達抑制至少20%。在多個方面，Aha靶序列可以包含選自由SEQIDNO12-56組成的組中的序列。另一方面，shRNA可以包含選自由SEQIDNO:153、SEQIDNO:154和SEQIDNO:155組成的組中的序列。本發明也提供包含dsRNA、載體和/或shRNA的細胞或細胞群體。在另一個實例中，抗體可以特異性地結合功能性Ahal、Hsp90腺苷三磷酸酶的功能性Ahal結合位點和/或功能性Ahal-Hsp90腺苷三磷酸酶複合物。在另一個實例中，試劑可以包括小分子、抗體、反義核酸、適配體、dsRNA和核酶的任意組合。本發明也提供治療與蛋白質錯摺疊相關的疾病的方法。所述方法可以包括對需要施用的受試者施用治療有效量的降低功能性Ahal蛋白質胞內水平的至少一種試劑。在多個方面，試劑可以選自下組小分子、抗體、反義核酸、適配體、siRNA、核酶和它們的組合。在多個方面，所述疾病可以包括嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症(Marfansyndrome)、法布萊病(Fabrydisease)、高歇病(Gaucher，sdisease),色素性視網膜炎3(retinitispigmentosa3)、阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease),II型糖尿病(TypeIIdiabetes)、帕金森病(Parkinson'sdisease)禾口克雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease)。另一方面，聲斤述4普4斤疊的蛋白質可以是錯誤摺疊的CFTR。另一方面，錯誤摺疊的蛋白質可以是AF508蛋白質。所述方法也可以包括對需要施用的受試者施用治療有效量的功能性Ahal表達的至少一種dsRNA抑制劑，所述dsRNA包含有義鏈和反義鏈。在多個方面，反義鏈可以包含具有與Aha靶序列基本上互補的序列的互補性區域，其中所述靶序列的長度少於30個核苷酸，有義鏈與所述反義鏈基本上互補，並且所述dsRNA在與表達功能性Aha蛋白質的細胞接觸時將功能性Aha蛋白質的表達抑制至少20%。在多個方面，所述疾病可以包括嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。另一方面，所述錯摺疊的蛋白質可以是錯摺疊的CFTR。另一方面，錯摺疊的蛋白質可以是AF508蛋白質。所述方法也可包括對需要施用的受試者施用治療有效量的功能性Ahal表達的至少一種dsRNA抑制劑。在多個方面，dsRNA抑制劑可以包含基於以下方面選擇的序列a)所述dsRNA包含約19個核苷酸到約25個核苷酸的有義鏈序列和約19個核苷酸到約25個核苷酸的反義鏈序列；和b)所述有義鏈序列或反義鏈序列包含不多於15個與連續序列相同的連續核苷酸，所述連續序列包含在功能性Ahal之外的任何基因或mRNA的5'非翻譯區域、3，非翻譯區域、內含子或外顯子中。在多個方面，所述疾病可以包括嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。另一方面，所述錯摺疊的蛋白質可以是錯摺疊的CFTR。另一方面，錯摺疊的蛋白質可以是AF508蛋白質。本發明的方法也可以包括篩選用於治療與蛋白質錯摺疊相關的疾病的試劑。在多個方面，所述方法可以包括提供表達功能性Ahal的細胞或細胞群體；對細胞或細胞群體施用候選試劑；定量細胞或細胞群體中功能性Ahal的活性；和測定候選試劑是否降低細胞或細胞群體中的功能性Ahal活性，由此功能性Ahal活性的降低指示蛋白質錯摺疊的減少。在多個方面，候選試劑可以是抑制功能性Ahal表達的dsRNA。另一方面，dsRNA可以包含a)約19個核苦酸到約25個核苦酸的序列，和b)所述序列含有不多於15個與連續序列相同的連續核苷酸，所述連續序列包含在除Aha基因或mRNA之外的任何基因或mRNA的5'非翻譯區域、3'非翻譯區域、內含子或外顯子中。在多個方面，Aha基因或mRNA是人Aha基因或mRNA。另一方面，所述疾病可以選自下組嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。另一方面，所述錯摺疊的蛋白質可選自下組錯摺疊的CFTR、錯摺疊的肌原纖蛋白、錯摺疊的a-半乳糖苦酶、錯摺疊的(3-葡糖腦苷脂酶、錯摺疊的視紫紅質、聚集的澱粉狀蛋白(3和t、聚集的支鏈澱粉、聚集的a-突觸核蛋白和聚集的朊病毒(prion)。另一方面，錯摺疊的蛋白質可以是錯摺疊的CFTR。另一方面，錯摺疊的蛋白質可以是AF508蛋白質。篩選方法也可以包括提供表達功能性Ahal的細胞或細胞群體；對細胞或細胞群體施用候選試劑；定量細胞或細胞群體中的Hsp90/ADP複合物、Hsp90/ATP複合物或其組合；和測定候選試劑是否降低細胞或細胞群體中Hsp90/ADP複合物、Hsp90/ATP複合物或其組合的量，由此Hsp90/ADP複合物或Hsp90/ATP複合物量的減少指示蛋白質錯摺疊的減少。在多個方面，候選試劑可以是抑制功能性Ahal表達的dsRNA。另一方面，dsRNA可以包含a)約19個核苷酸到約25個核苷酸的序列；和b)所述序列含有不多於15個與連續序列完全相同的連續核苷酸，所述連續序列包含在除Aha基因或mRNA之外的任何基因或mRNA的5，非翻譯區域、3'非翻譯區域、內含子或外顯子中。另一方面，Aha基因或mRNA可以是人Aha基因或mRNA。在許多方面，所述疾病可以選自下組嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。另一方面，所述錯摺疊的蛋白質可選自下組錯摺疊的CFTR、錯摺疊的肌原纖蛋白、錯摺疊的a-半乳糖苷酶、錯摺疊的(3-葡糖腦苷脂酶、錯摺疊的視紫紅質、聚集的澱粉狀蛋白P和t、聚集的支鏈澱粉、聚集的a-突觸核蛋白和聚集的朊病毒。另一方面，錯摺疊的蛋白質可以是錯摺疊的CFTR。另一方面，錯摺疊的蛋白質可以是AF508蛋白質。本文教導的這些和其他特徵、方面和優點將會由以下描述、實例和附加的權利要求作為參考更好地為人所理解。附圖本領域技術人員將理解下述的附圖僅作說明性目的。附圖不意圖在任何方面限制本發明的範圍。圖1:CFTR蛋白質相互作用組(interactome)的描述。圖2:(A)ER摺疊網絡的描述，和(B)描述野生型(WT)和AF508型表達細胞中蛋白質表達水平的免疫印跡。圖3:描述Hsp卯輔分子伴侶p23對AF508摺疊和從ER中輸出的影響的條線圖系列。圖4:描述Hsp90輔分子伴侶FKBP8對AF508摺疊和從ER中輸出的影響的條線圖系列。圖5:描述Hsp90輔分子伴倡HOP對AF508摺疊和從ER中輸出的影響的條線圖系列。圖6:說明AF508向細胞表面的輸出可以通過減量調節功能性Ahal來重建的條線圖系列。圖7:顯示dsRNAAhal對CFBE41o-細胞系碘外流(iodideefflux)影響的點線圖和條線圖。圖8:Hsp90分子伴估/輔分子伴侶相互作用引導的CFTR摺疊的系列描述。圖9:dsRNAAha1對Hsp90的作用的說明(使用免疫印跡)。詳述縮寫和定義為了有助於對本發明的理解，以下定義了一些本文用到的術語和縮寫，如下:"G"、"C"、"A"、"T，，和"U，，(無論寫為大寫或小寫字母)各自通常代表依次含有鳥噤呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶作為鹼基的核苷酸。但是應當理解，術語"核糖核苷酸"或"核苷酸"也可以指修飾的核苦酸(如下詳述)或者替代物代替的部分(surrogatereplacementmoiety)。技術人員熟知鳥口票呤、胞嘧啶、腺噤呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶可以被其他部分替代而基本上不改變含有具此替換部分的核苷酸的寡核苷酸的鹼基配對性質。例如，但不限於，含有肌苦作為鹼基的核苦酸可以與含有腺噤呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸鹼基配對。因此，本發明的核苷酸序列中可將含有尿嗜啶、鳥。票呤或腺噤呤的核苷酸用含有例如肌苷的核苷酸代替。本文使用的術語"功能性Ahal蛋白質，，或"功能性Ahal"意在包括具有熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑活性的人Ahal多肽(SEQIDNO:4)和具有熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑活性的與Ahal相關的分子。此類與人Ahal相關的分子包括具有熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑活性和與功能性Ahal具有至少80。/。同源性的多肽。例如，相關分子可以與人Ahal具有80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性並可以具有熱休克蛋白腺苦三磷酸酶激活劑活性。此類分子可以包括例如SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8。另外，此類與人Ahal相關的分子包括具有更長或更短胺基酸序列並且具有熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑活性的多肽。熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑活性可以用標準測定法進行測定，例如，通過測定由Hsp90產生的無機磷(Pi)。Pi的產生可以通過例如測量或測定報告分子的產生或消耗來測定。一個此類方法利用再生腺苷三磷酸酶測定法，該測定法使用了Pi的產生可以用分光光度法測定的丙酮酸激酶/乳酸脫氫酶偶聯測定法(Ali等，Biochemistry(1993)32:2717-2724)。其他分光光度方法包括那些由以下所描述的Lanzetta等(1979)Anal.Biochem.100,95-97;Lill等,(1990)Cell60，271-280;和Cogan等，Anal.Biochem.(1999)271:29-35。本領域技術人員也會明白其他測定熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑活性的方法。本文使用的"Aha基因"是指能夠表達功能性Ahal蛋白質的熱休克蛋白卯腺苷三磷酸酶的激活劑基因。"Ahal，，表示熱休克蛋白90腺苷三磷酸酶1的激活劑基因，其非窮舉性的實例為Genbank登錄號NM_012111.1(人)、NM—146036.1(小家鼠)和XM—510094.1(黑猩猩)。本文使用的"靶序列"是指在Aha基因轉錄過程中所形成的mRNA分子核苷酸序列的一個連續的部分，包括對初級轉錄產物進行RNA加工後作為產物的mRNA。本發明中任意給定的RNAi試劑的靶序列是指X個核苷酸的mRNA序列，其依靠RNAi試劑的反義鏈對此序列的互補性而作為該RNAi試劑的標草巴，並且當反義鏈與所述mRNA接觸時可以與其雜交，其中X是反義鏈的核苷酸數目加上有義鏈單鏈突出端的核苷酸數目(如果有的話)。本文使用的術語"包含序列的鏈"是指寡核苷酸，其包含使用標準的核苷酸命名法表示的序列所描述的核苷酸鏈。除非另作說明，本文使用的術語"互補，'，如本領域技術人員公知的，當用來描述第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的關係時，是指含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定條件下與含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸雜交並形成雙鏈結構的能力。這些條件可以是例如嚴緊條件，而嚴格條件可包括400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、1mMEDTA、50°C或70。C下12-16小時後洗滌。其他條件也可應用，例如有機體內可遇到的生理上相關的條件。技術人員將能夠依據雜交核苷酸最終的用途來決定最適合用於互補性測試的條件設定。這包括將含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸與含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在所述第一和第二核苷酸序列的完整長度上進行鹼基配對。這類序列在本文可以稱為相對於彼此"完全互補"。但是，當第一序列在本文被稱為與第二序列"基本上互補"時，這兩個序列可以是完全互補的，或者它們可以在雜交時形成一個或多個，但通常不多於4個、3個或2個錯配鹼基對，同時在與它們的最終用途最相關的條件下保持雜交的能力。但是，當兩個寡核苷酸按照設計在雜交時形成一個或多個單鏈突出端時，在測定互補性時不應當將這類突出端視為錯配。例如，含有一個21個核苷酸長的寡核香酸和另一個23個核苷酸長的寡核苦酸的dsRNA,其中長一些的寡核苷酸含有與短一些的寡核苷酸完全互補的21個核苷酸的序列，就本發明而言這也可以稱為"完全互補"。本文使用的"互補，，序列也可以包括，或完全由非Watson-Crick鹼基對和/或從非天然的和修飾的核苷酸形成的鹼基對形成，只要針對它們雜交能力的上述要求可以滿足。術語"互補"、"完全互補"和"基本上互補，，此處可按照使用它們的上下文理解為關於dsRNA有義鏈和反義鏈之間或者dsRNA反義鏈和靶序列之間的鹼基配對。本文使用的與信使RNA(mRNA)的"至少一部分基本上互補"的多核苷酸是指與感興趣的mRNA(例如編碼Ahal的)的連續部分基本上互補的多核苷酸。例如，如果序列與編碼Ahal的mRNA的非間斷的部分基本上互補，多核苷酸即與AhalmRNA的至少一部分互補。本文使用的術語"雙鏈RNA"或"dsRNA"是指核糖核酸分子複合物，其具有包含兩條反平行並且基本上互補(如上定義)的核酸鏈的雙鏈結構。形成雙鏈結構的兩條鏈可以是一個較大的RNA分子的不同部分，或者它們可以是單獨的RNA分子。當兩條鏈是一個較大的分子的一部分，因而是通過一條鏈的3，端和相應形成雙鏈結構的另一條鏈的5，端經由非間斷核苷酸鏈連接時，連接性的RNA鏈被稱為"髮夾環，，，並且整個結構被稱為"短髮夾RNA"或"shRNA"。當兩條鏈不是通過一條鏈的3，端和相應形成雙鏈結構的另一條鏈的5'端之間的非間斷核苷酸鏈的方法共價連接時，連接性的結構被稱為"接頭"。在多個方面，接頭可以包括序列AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC和UUCAAGAGA。RNA鏈可以具有相同或不同數目的核苷酸。鹼基對的最大數目是dsRNA中最短鏈的核苷酸數目減去雙鏈中存在的任何突出端。除雙鏈結構外，dsRNA還可以包含一個或多個核苷酸突出二山*。本文使用的"核普酸突出端，，是指當dsRNA—條鏈的3'端延伸至另一條鏈的5，端之後時，或相反的情況下，從dsRNA的雙鏈結構伸出的未配對的一個核香酸或多個核苷酸。"平"或"平端"是指在dsRNA的那端沒有未配對的核香酸，即沒有核苷酸突出端。"平端的"dsRNA是分子的任一端都沒有核苷酸突出端的dsRNA。術語"反義鏈，，是指dsRNA中包含與靶序列基本上互補的區域的鏈。本文使用的術語"互補性區域，，是指反義鏈上與序列，例如靶序列，如本文定義的基本上互補的區域。當互補性區域與靶序列不完全互補時，最容許的(mosttolerated)是錯配在末端區域，並且如果有，錯配一般處在末端區域，或者例如在5，和/或3，末端的6個、5個、4個、3個或2個核苷酸之內的區域中。在本發明的某些方面，所述錯配可以處在反義鏈5，末端和/或有義鏈3，末端的6個、5個、4個、3個或2個核苷酸之內。本文使用的術語"有義鏈，，是指dsRNA中包含與反義鏈的區域基本上互補的區域的鏈。如本領域技術人員理解的那樣，當"引入細胞，，指dsRNA時，意為有助於攝取(uptake)或吸收(absorption)至細胞中。dsRNA的吸收或攝取可以通過獨立的(unaided)擴散性的或主動的細胞過程或者通過輔助性試劑或設備進行。此術語的意義不限於體外的細胞；也可以將dsRNA"引入細胞，，，其中所述細胞是活的有機體的一部分。這種情況下，向細胞中引入將包括向有機體的遞送。例如，對於體內遞送，可以將dsRNA注入組織位點或系統性地施用。在體外向細胞中引入包括本領域公知的方法，例如電穿孔和脂轉染。本文使用的術語"降低水平、已降低的水平或正在降低的水平(decrease，decreasedordecreasinglevels)"旨在包括在細胞中抑制Ahal熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑活性和降低功能性Ahal蛋白質的量。例如，抗體或dsRNA能夠通過幹擾或沉默熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑活性而不將Ahal蛋白質從細胞中去除來降低功能性Ahal蛋白質的水平。另一個實例中，核酶能夠切割功能性Ahal蛋白質以減少細胞中全Ahal蛋白質的量。另一個實例中，dsRNA能夠使Aha基因(如Ahal基因)的表達沉默以降低從Aha基因轉錄的mRNA的量。術語"沉默，，和"抑制表達，，當它們指Aha基因(如Ahal基因)時，此處代表對Aha基因(如Ahal基因)表達的至少部分抑制，表現為從可以分離自第一細胞或細胞組的Aha基因轉錄的mRNA量在與第二細胞或細胞組相比時減少，在所述第一細胞或細胞組中Aha基因被轉錄並受到處理因而使Aha基因的表達受到抑制，所述第二細胞或細胞組與第一細胞或細胞組基本上相同但沒有受到所述處理(對照細胞)。在本發明的多個方面，所述細胞可以是HeLa或MLE12細胞。抑制的程度通常表述為(對照細胞中的mRNA)-(經處理細胞中的mRNA)工(對照細胞中的mRNA)0或者，抑制的程度也可以根據與Aha基因轉錄功能性相關的參數的降低來表示，如細胞分泌的或是這些細胞裂解後的溶液中存在的Aha基因所編碼蛋白質的量，或顯示特定表型(如細胞凋亡或細胞表面CFTR)的細胞的數目。Aha基因沉默原則上可以在表達靶物的任何細胞中測定，不論是組成性的還是通過基因組工程構建的細胞，並且可以通過任何合適的測定法來測定。但是，為了確認給定的dsRNA是否在一定程度上抑制Aha基因的表達而需要參考並且因而將其涵蓋在本發明範圍中時，下面提供的實施例中的測定法將會作為此種參考。例如在某些情況下，通過施用本發明的雙鏈寡核苷酸將Aha基因(如Ahal基因)的表達抑制至少約20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%或50%。在多個方面，通過施用本發明的雙鏈寡核苷酸將Aha基因(如Ahal基因)的表達抑制至少約51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%或80%。在多個方面，通過施用本發明的雙鏈寡核苷酸將Aha基因(如Ahal基因)的表達抑制至少約81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在本文Aha表達(如Ahal表達)的上下文中使用的術語"治療(treat)"、"治療(treatment)"等是指減輕(relieffrom)或緩和(alleviation)Aha表達介導的病理過程。在本發明的上下文中，在其涉及下文所述的任何其它狀況(除了Aha表達介導的病理過程之外的狀況)時，術語"治療(treat)"、"治療(treatment)"意為減輕或緩和至少一種與此狀況相關的症狀，或者減緩或反轉該狀況的發展。本文使用的短語"治療有效量，，和"預防有效量"是指在治療、預防或控制由Aha表達介導的病理過程或由Aha表達介導的病理過程的明顯症狀時提供治療益處的量。治療有效的特定量可以由普通開業醫生方便地決定，並且可能根據本領域公知的因素改變，例如如Aha表達所介導的病理過程的類型、患者的病史和年齡、Aha表達所介導的病理過程的時期(stage)和其他對抗Aha表達所介導的病理過程的試劑的施用。本文使用的"藥物組合物"包含藥理學有效量的dsRNA和可藥用的載體。本文使用的"藥理學有效量"、"治療有效量，，或筒單的"有效量，，是指足夠產生預定的藥理學的、治療的或預防性結果的RNA量。例如，如果當伴隨疾病或病症的某種可測定參數有至少25%降低時即認為給定的臨床治療是有效的，那麼治療這種疾病或病症的藥物的治療有效量就是為了實現那種參數的25%的降低而必需的劑量。術語"可藥用的載體，，是指用於施用治療劑的載體。這些載體包括但不限於鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖(dextrose)、水、甘油、乙醇和它們的組合。此術語特別排除細胞培養基。用於口服施用藥物的可藥用載體包括但不限於可藥用的賦形劑，例如惰性稀釋劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑、甜味劑、調味劑、著色劑和防腐劑。合適的惰性稀釋劑包括鈉和鈣的碳酸鹽、鈉和鈣的磷酸鹽以及乳糖，而玉米澱粉和褐藻酸(alginicacid)是合適的崩解劑。黏合劑可以包括澱粉和明膠；而潤滑劑(如果有的話)將通常是硬脂酸鎂、硬脂酸或滑石。如果需要，可以用如甘油單硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯包覆藥片以延緩在胃腸道內的吸收。本文使用的"轉化的細胞，，是引入了可以表達dsRNA分子的載體的細胞。蛋白質錯摺疊的治療本發明提供通過降低功能性Ahal蛋白質(如SEQIDNO:4)和/或具有類似功能的其他相關分子的水平來治療錯摺疊疾病的方法，以及篩選用以治療蛋白質錯摺疊疾病的有用試劑的方法。本文描述的技術部分基於如下觀察，即降低水平的功能性Ahal,—種Hsp卯腺苷三磷酸酶激活劑，能夠明顯地將AF508(SEQIDNO:3的AF508多肽)，一種特徵在於508的苯丙氨酸缺失的CRTR(SEQIDNO:1的CFTRmRNA;SEQIDNO:2的CFTR多肽)突變體，穩定在COPII輸出系統可處理(accessible)以使其運輸至細胞表面的摺疊狀態。本文描述的多種治療策略的目標是在受試者體內減量調節功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子、補救CFTR突變抹的錯摺疊、重建Hsp90介導的向細胞表面的運輸和至少部分恢復通道功能。降低功能性Ahal的試劑降低功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子的水平的試劑能夠靶向功能性Ahal和/或Hsp90腺苷三磷酸酶，因此通過該試劑對一種組分或兩種組分的結合會導致熱休克蛋白腺苷三磷酸酶激活劑的活性、Hsp90腺苷三磷酸酶的激活狀態和/或已激活的Hsp90腺苷三磷酸酶活性水平的降低，繼而導致錯摺疊蛋白質的穩定。已經報導了Hsp90和Ahal之間的複合物的晶體結構(Meyer等(2004)EMBOJ.23,511-519)。鑑於對Ahal、Hsp90腺苷三磷酸酶和兩者之間形成的結合複合物的結構的和動力學的理解，設計能夠結合(例如離子地或共價地)一種或兩種組分並且因而降低功能性Ahal對Hsp90腺苷三磷酸酶的激活的試劑屬於本領域技術範圍之內。此處作為降低功能性Ahal水平和/或具有類似功能的相關分子水平的試劑使用的多種類型的試劑通常包括但不限於RNA幹擾分子、抗體、小的無機分子、反義寡核苷酸和適配體。RNA幹擾(RNAi)可用以降低功能性Ahal(和/或具有類似功能的其他相關分子)的水平(參見如實施例8-10)。RNAi方法可以使用雙鏈RNA，例如小幹擾RNA(siRNA)、短髮夾RNA(shRNA)和微小RNA。下述討論將基本上聚焦於dsRNA，但本領域技術人員會認識到對其他RNAi分子，如miRNA,可以適用的多種方法。特別針對功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子的RNAi分子也可從多種來源以商業途徑獲得(如SilencerInVivoReadydsRNAs、AhaldsRNAID#s1136422、136423、36424、19683、19588、19773,Ambion,TX;SigmaAldrich,MO;Invi加gen,CA)。幾個使用多種運算法則的dsRNA分子設計程序是本領域公知的(參見如Cenix算法，Ambion;BLOCK-iTTMRNAiDesigner(BLOCK-iTRNAi設計器)，Invitrogen;dsRNAWhiteheadInstituteDesignTools(dsRNA懷特赫德研究所^殳計工具)，Bioinofrmatics&ResearchComputing)。定義最佳dsRNA序列時具有重要影響的特性(trait)包括dsRNA末端的G/C含量、dsRNA特定內部結構域的Tm、dsRNA長度、CDS(編碼區)內靶序列的位置和3'突出端的核苷酸組成。特異性地針對功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子的dsRNA的施用能夠影響RNAi介導的靶(如Ahal)mRNA的降解。例如，可以向需要施用的患者施用治療有效量的特異性地針對Ahal的dsRNA來治療蛋白質錯摺疊的疾病。在一個方面，導致功能性Ahal水平降低的dsRNA具有包括SEQIDNOs:57-146(參見下面的表2)的核苷酸序列。一般來說，dsRNA分子的有效量可以包含在錯摺疊的位點處或該位點附近的細胞間濃度為約1納摩爾(nM)到約100nM,在多個方面是約2nM到約50nM,而另一些方面是約2.5nM到約10nM。可以預期，可以施用更多或更少量的dsRNA。dsRNA可以通過任何適合於遞送RNAi分子到感興趣的細胞的方法來向受試者施用。例如，可以用基因槍、電穿孔或通過其他合適的腸胃外的或腸道的施用途徑如玻璃體內注射來施用dsRNA分子。RNAi分子可以局部地(肺組織)或經由肺部遞送系統地(循環系統)施用。在向受試者遞送功能性Ahal特異性的RNAi分子時，可以有多種肺部遞送裝置是有效的(見下文)。RNAi分子可以與多種遞送和靶向系統如以下進一步詳述的那樣聯合使用。例如可以將dsRNA包入為促進有效負載內化(payloadinternalization)而設計的靶向多聚體運送系統(targetedpolymericdeliverysystem)中。dsRNA可以靶向到功能性Ahal(或具有類似功能的其他相關分子)mRNA靶序列，如SEQIDNOs:12-56(參見下面表l)中少於30個連續核苷酸，通常為大約19-25個連續核苷酸的任何序列段(stretch)上。可以進行對人基因組資料庫的搜索(BLAST)以確保選定的dsRNA序列不會靶向到其他基因轉錄物。為dsRNA選定靶序列的技術是本領域公知的(參見如Reynolds等(2004)NatureBiotechnology22(3),326—330)。因此，此dsRNA的有義鏈可以包含與功能性Ahal(或具有類似功能的相關分子)的靶mRNA中約l9到約25個核苷酸的任何連續序列段相同的核苷酸序列。通常情況下，耙mRNA上的耙序列可以從給定的耙mRNA對應的cDNA序列中選擇，例如從起始密碼子下遊(即3，方向)50到100nt開始。但是，靶序列可以位於5，或3'非翻譯區域或者靠近起始密碼子的區域。本發明的dsRNA可以包含具有少於30個核苷酸長(通常為19-25個核苷酸長)的區域的RNA鏈，並與Aha基因的mRNA轉錄物的至少一部分基本上互補。這些dsRNA的使用使得靶向降解下述基因的mRNA成為可能，所述基因涉及哺乳動物體內癌細胞的複製和/或維持，和/或涉及錯摺疊的嚢性纖維化跨膜調控蛋白(CFTR)的降解。使用基於細胞的測定法和動物測定法，非常低劑量的此類dsRNA能夠特異地和有效地介導RNAi,導致對Aha基因的表達的顯著抑制。因此，包含此類dsRNA的本發明的方法和組合物通過靶向蛋白質降解中涉及的基因，可用於治療由Aha表達介導的病理學過程，如蛋白質錯摺疊，包括癌症和/或嚢性纖維化。下面的詳述公開了如何製備和使用抑制Aha基因表達的dsRNA和包含dsRNA的組合物，還有用於治療由Aha基因表達引起的疾病和病症如癌症和/或嚢性纖維化的組合物和方法。本發明的藥物組合物包含具有反義鏈的dsRNA和可藥用載體，所述反義鏈包含長度少於30個核苷酸的，通常長度為19-25個核苷酸的互補性區域，並且所述互補性區域與Aha基因的RNA轉錄物的至少一部分基本上互補。因此，本發明的某些方面提供包含本發明的dsRNA和可藥用載體的藥物組合物、使用所述組合物抑制Aha基因表達的方法和使用所述藥物組合物治療由Aha基因表達所引起疾病的方法。本發明的一個方面提供抑制細胞或哺乳動物中Aha基因(如Ahal基因)表達的dsRNA分子，其中所述dsRNA包含反義鏈，所述反義鏈包含與Aha基因(如Ahal基因)表達所形成的mRNA的至少一部分互補的互補性區域，並且其中所述互補區域的長度少於30個核苷酸，通常長度為19-25個核苷酸。所述dsRNA可以與表2所示的dsRNA之一相同，或者它可以實現對表2所示dsRNA之一的靶序列內編碼Aha基因的mRNA的切割。表l.人AhalmRNA靶序列(序列位置基於GenBank登錄號NM—012111.1(SEQIDNO:11;Ensembl基因報告號ENSG00000100591)編碼序列)1.基於Aha基因序列AAATTGGTCCACGGATAAGCT的mRNA草巴序列AAAUUGGUCCACGGAUAAGCU(SEQIDNO:12)基因序列中的位置992.基於Aha基因序列AAGCTGAAAACACTGTTCCTG的mRNA耙序列AAGCUGAAAACACUGUUCCUG(SEQIDNO:13)基因序列中的位置1153.基於Aha基因序列AAAACACTGTTCCTGGCAGTG的mRNA耙序列AAAACACUGUUCCUGGCAGUG(SEQIDNO:14)基因序列中的位置1214.基於Aha基因序歹'JAAAATGAAGAAGGCAAGTGTG的mRNA草巴序列AAAAUGAAGAAGGCAAGUGUG(SEQIDNO:15)基因序列中的位置1495.基於Aha基因序列AATGAAGAAGGCAAGTGTGAG的mRNA靶序列AAUGAAGAAGGCAAGUGUGAG(SEQIDNO:16)基因序列中的位置1516.基於Aha基因序列AAGAAGGCAAGTGTGAGGTGA的mRNA靶序列:AAGAAGGCAAGUGUGAGGUGA(SEQIDNO:17)基因序列中的位置1557.基於Aha基因序列AAGTGAGTAAGCTTGATGGAG的mRNA靶序列AAGUGAGUAAGCUUGAUGGAG(SEQIDNO:18)基因序列中的位置1798.基於Aha基因序列AACAATCGCAAAGGGAAACTT的mRNA萃巴序歹'J:AACAAUCGCAAAGGGAAACUU(SEQIDNO:19)基因序列中的位置2119.基於Aha基因序列AATCGCAAAGGGAAACTTATC的mRNA革巴序列AAUCGCAAAGGGAAACUUAUC(SEQIDNO:20)基因序列中的位置21410.基於Aha基因序列AAAGGGAAACTTATCTTCTTT的mRNA耙序列AAAGGGAAACUUAUCUUCUUU(SEQIDNO:21)基因序列中的位置22011.基於Aha基因序列AAACTTATCTTCTTTTATGAA的mRNA耙序列AAACUUAUCUUCUUUUAUGAA(SEQIDNO:22)基因序列中的位置22612.基於Aha基因序列AATGGAGCGTCAAACTAAACT的mRNA草巴序列:AAUGGAGCGUCAAACUAAACU(SEQIDNO:23)基因序列中的位置24513.基於Aha基因序列AAACTAAACTGGACAGGTACT的mRNA草巴序列:AAACUAAACUGGACAGGUACU(SEQIDNO:24)基因序列中的位置25614.基於Aha基因序列AAACTGGACAGGTACTTCTAA的mRNA耙序列AAACUGGACAGGUACUUCUAA(SEQIDNO:25)基因序列中的位置26115.基於Aha基因序列AAGTCAGGAGTACAATACAAA的mRNA耙序列:AAGUCAGGAGUACAAUACAAA(SEQIDNO:26)基因序列中的位置28016.基於Aha基因序列AATACAAAGGACATGTGGAGA的mRNA靶序列:AAUACAAAGGACAUGUGGAGA(SEQIDNO:27)基因序列中的位置29317.基於Aha基因序列AATTTGTCTGATGAAAACAGC的mRNA靶序列AAUUUGUCUGAUGAAAACAGC(SEQIDNO:28)基因序列中的位置31918.基於Aha基因序列AAAACAGCGTGGATGAAGTGG的mRNA耙序列AAAACAGCGUGGAUGAAGUGG(SEQIDNO:29)基因序列中的位置33219.基於Aha基因序列AAGTGGAGATTAGTGTGAGCC的mRNA革巴序列AAGUGGAGAUUAGUGUGAGCC(SEQIDNO:30)基因序列中的位置34720.基於Aha基因序列AAAGATGAGCCTGACACAAAT的mRNA乾序列AAAGAUGAGCCUGACACAAAU(SEQIDNO:31)基因序列中的位置37321.基於Aha基因序列AAATCTCGTGGCCTTAATGAA的mRNA草巴序列AAAUCUCGUGGCCUUAAUGAA(SEQIDNO:32)基因序列中的位置39022.基於Aha基因序列AATGAAGGAAGAAGGGGTGAA的mRNA耙序列:AAUGAAGGAAGAAGGGGUGAA(SEQIDNO:33)基因序列中的位置40523.基於Aha基因序列AAGGAAGAAGGGGTGAAACTT的mRNA靶序列AAGGAAGAAGGGGUGAAACUU(SEQIDNO:34)基因序列中的位置40924.基於Aha基因序列AAGAAGGGGTGAAACTTCTAA的mRNA靶序列AAGAAGGGGUGAAACUUCUAA(SEQIDNO:35)基因序列中的位置41325.基於Aha基因序列AAGGGGTGAAACTTCTAAGAG的mRNA草巴序列:AAGGGGUGAAACUUCUAAGAG(SEQIDNO:36)基因序列中的位置41626.基於Aha基因序列AAACTTCTAAGAGAAGCAATG的mRNA耙序列AAACUUCUAAGAGAAGCAAUG(SEQIDNO:37)基因序列中的位置42427.基於Aha基因序列AAGAGAAGCAATGGGAATTTA的mRNA耙序列AAGAGAAGCAAUGGGAAUUUA(SEQIDNO:38)基因序列中的位置43228.基於Aha基因序列AAGCAATGGGAATTTACATCA的mRNA耙序列AAGCAAUGGGAAUUUACAUCA(SEQIDNO:39)基因序列中的位置43729.基於Aha基因序列AATGGGAATTTACATCAGCAC的mRNA靶序列AAUGGGAAUUUACAUCAGCAC(SEQIDNO:40)基因序列中的位置44130.基於Aha基因序列AATTTACATCAGCACCCTCAA的mRNA靶序列AAUUUACAUCAGCACCCUCAA(SEQIDNO:41)基因序列中的位置44731.基於Aha基因序列AATGAATGGAGAGTCAGTAGA的mRNA靶序列AAUGAAUGGAGAGUCAGUAGA(SEQIDNO:42)基因序列中的位置50132.基於Aha基因序列AATGGAGAGTCAGTAGACCCA的mRNA草巴序列AAUGGAGAGUCAGUAGACCCA(SEQIDNO:43)基因序列中的位置50533.基於Aha基因序列AAGCCTGCTCCTTCAAAAACC的mRNA革巴序列AAGCCUGCUCCUUCAAAAACC(SEQIDNO:44)基因序列中的位置56534.基於Aha基因序列AAAATCCCCACTTGTAAGATC的mRNA耙序列AAAAUCCCCACUUGUAAGAUC(SEQIDNO:45)基因序列中的位置60735.基於Aha基因序列AATCCCCACTTGTAAGATCAC的mRNA耙序列AAUCCCCACUUGUAAGAUCAC(SEQIDNO:46)基因序列中的位置60936.基於Aha基因序列AAGATCACTCTTAAGGAAACC的mRNA孝巴序列AAGAUCACUCUUAAGGAAACC(SEQIDNO:47)基因序列中的位置62237.基於Aha基因序列AAGGAAACCTTCCTGACGTCA的mRNA革巴序列AAGGAAACCUUCCUGACGUCA(SEQIDNO:48)基因序列中的位置63438.基於Aha基因序列AACATTAGAAGCAGACAGAGG的mRNA耙序列AACAUUAGAAGCAGACAGAGG(SEQIDNO:49)基因序列中的位置72039.基於Aha基因序列AAGCAGACAGAGGTGGAAAGT的mRNA耙序列:AAGCAGACAGAGGUGGAAAGU(SEQIDNO:50)基因序列中的位置72840.基於Aha基因序列AAAGTTCCACATGGTAGATGG的mRNA耙序列:AAAGUUCCACAUGGUAGAUGG(SEQIDNO:51)基因序列中的位置74441.基於Aha基因序列AACGTCTCTGGGGAATTTACT的mRNA革巴序列AACGUCUCUGGGGAAUUUACU(SEQIDNO:52)基因序列中的位置76642.基於Aha基因序列AATTTACTGATCTGGTCCCTG的mRNA耙序列AAUUUACUGAUCUGGUCCCUG(SEQIDNO:53)基因序列中的位置77943.基於Aha基因序列AAACATATTGTGATGAAGTGG的mRNA草巴序列AAACAUAUUGUGAUGAAGUGG(SEQIDNO:54)基因序列中的位置80244.基於Aha基因序列AAGTGGAGGTTTAAATCTTGG的mRNA耙序列AAGUGGAGGUUUAAAUCUUGG(SEQIDNO:55)基因序列中的位置81745.基於Aha基因序列AAACAGACCTTTGGCTATGGC的mRNA輩巴序歹寸AAACAGACCUUUGGCUAUGGC(SEQIDNO:56)基因序列中的位置982表2.用於減量調節人功能性Aha蛋白質表達的dsRNA試劑1.基於Aha基因靶序列1的dsRNA有義鏈dsRNA:AUUGGUCCACGGAUAAGCU(SEQIDNO:57)反義鏈dsRNA:AGCUUAUCCGUGGACCAAU(SEQIDNO:58)2.基於Aha基因靶序列2的dsRNA有義鏈dsRNA:GCUGAAAACACUGUUCCUG(SEQIDNO:59)反義鏈dsRNA:CAGGAACAGUGUUUUCAGC(SEQIDNO:60)3.基於Aha基因靶序列3的dsRNA有義鏈dsRNA:AACACUGUUCCUGGCAGUG(SEQIDNO:61)反義鏈dsRNA:CACUGCCAGGAACAGUGUU(SEQIDNO:62)4.基於Aha基因革巴序列4的dsRNA有義鏈dsRNA:AAUGAAGAAGGCAAGUGUG(SEQIDNO:63)反義鏈dsRNA:CACACUUGCCUUCUUCAUU(SEQIDNO:64)5.基於Aha基因靶序列5的dsRNA有義鏈dsRNA:UGAAGAAGGCAAGUGUGAG(SEQIDNO:65)反義鏈dsRNA:CUCACACUUGCCUUCUUCA(SEQIDNO:66)6.基於Aha基因靶序列6的dsRNA有義鏈dsRNA:GAAGGCAAGUGUGAGGUGA(SEQIDNO:67)反義鏈dsRNA:UCACCUCACACUUGCCUUC(SEQIDNO:68)7.基於Aha基因耙序列7的dsRNA有義鏈ds脂A:GUGAGUAAGCUUGAUGGAG(SEQIDNO:69)反義鏈dsRNA:CUCCAUCAAGCUUACUCAC(SEQIDNO:70)8.基於Aha基因草巴序列8的dsRNA有義鏈dsRNA:CAAUCGCAAAGGGAAACUU(SEQIDNO:71)反義鏈dsRNA:AAGUUUCCCUUUGCGAUUG(SEQIDNO:72)9.基於Aha基因靶序列9的dsRNA有義鏈dsRNA:UCGCAAAGGGAAACUUAUC(SEQIDNO:73)反義鏈dsRNA:GAUAAGUUUCCCUUUGCGA(SEQIDNO:74)10.基於Aha基因靶序列10的dsRNA有義鏈dsRNA:AGGGAAACUUAUCUUCUUU(SEQIDNO:75)反義鏈dsRNA:AAAGAAGAUAAGUUUCCCU(SEQIDNO:76)11.基於Aha基因靶序列11的dsRNA有義鏈dsRNA:ACUUAUCUUCUUUUAUGAA(SEQIDNO:77)反義鏈dsRNA:UUCAUAAAAGAAGAUAAGU(SEQIDNO:78)12.基於Aha基因靶序列12的dsRNA有義鏈dsRNA:UGGAGCGUCAAACUAAACU(SEQIDNO:79)反義鏈dsRNA:AGUUUAGUUUGACGCUCCA(SEQIDNO:80)13.基於Aha基因靶序列13的dsRNA有義鏈dsRNA:ACUAAACUGGACAGGUACU(SEQIDNO:81)反義鏈dsRNA:AGUACCUGUCCAGUUUAGU(SEQIDNO:82)14.基於Aha基因靶序列14的dsRNA有義鏈dsRNA:ACUGGACAGGUACUUCUAA(SEQIDNO:83)反義鏈ds固A:UUAGAAGUACCUGUCCAGU(SEQIDNO:84)15.基於Aha基因靶序列15的dsRNA有義鏈dsRNA:GUCAGGAGUACAAUACAAA(SEQIDNO:85)反義鏈dsRNA:UUUGUAUUGUACUCCUGAC(SEQIDNO:86)16.基於Aha基因靶序列16的dsRNA有義鏈dsRNA:UACAAAGGACAUGUGGAGA(SEQIDNO:87)反義鏈dsRNA:UCUCCACAUGUCCUUUGUA(SEQIDNO:88)17.基於Aha基因靶序列17的dsRNA有義鏈dsRNA:UUUGUCUGAUGAAAACAGC(SEQIDNO:89)反義鏈dsRNA:GCUGUUUUCAUCAGACAAA(SEQIDNO:90)18.基於Aha基因靶序列18的dsRNA有義鏈dsRNA:AACAGCGUGGAUGAAGUGG(SEQIDNO:91)反義鏈dsRNA:CCACUUCAUCCACGCUGUU(SEQIDNO:92)19.基於Aha基因靶序列19的dsRNA有義鏈dsRNA:GUGGAGAUUAGUGUGAGCC(SEQIDNO:93)反義鏈dsRNA:GGCUCACACUAAUCUCCAC(SEQIDNO:94)20.基於Aha基因靶序列20的dsRNA有義鏈dsRNA:AGAUGAGCCUGACACAAAU(SEQIDNO:95)反義鏈dsRNA:AUUUGUGUCAGGCUCAUCU(SEQIDNO:96)21.基於Aha基因靶序列21的dsRNA有義鏈dsRNA:AUCUCGUGGCCUUAAUGAA(SEQIDNO:97)反義鏈dsRNA:UUCAUUAAGGCCACGAGAU(SEQIDNO:98)22.基於Aha基因靶序列22的dsRNA有義鏈dsRNA:UGAAGGAAGAAGGGGUGAA(SEQIDNO:99)反義鏈dsRNA:UUCACCCCUUCUUCCUUCA(SEQIDNO:100)23.基於Aha基因靶序列23的dsRNA有義鏈dsRNA:GGAAGAAGGGGUGAAACUU(SEQIDNO:101)反義鏈dsRNA:AAGUUUCACCCCUUCUUCC(SEQIDNO:102)24.基於Aha基因靶序列24的dsRNA有義鏈dsRNA:GAAGGGGUGAAACUUCUAA(SEQIDNO:103)反義鏈dsRNA:UUAGAAGUUUCACCCCUUC(SEQIDNO:104)25.基於Aha基因靶序列25的dsRNA有義鏈dsRNA:GGGGUGAAACUUCUAAGAG(SEQIDNO:105)反義鏈dsRNA:CUCUUAGAAGUUUCACCCC(SEQIDNO:106)26.基於Aha基因靶序列26的dsRNA有義鏈dsRNA:ACUUCUAAGAGAAGCAAUG(SEQIDNO:107)反義鏈ds固A:CAUUGCUUCUCUUAGAAGU(SEQIDNO:108)27.基於Aha基因靶序列27的dsRNA有義鏈dsRNA:GAGAAGCAAUGGGAAUUUA(SEQIDNO:109)反義鏈dsRNA:UAAAUUCCCAUUGCUUCUC(SEQIDNO:110)28.基於Aha基因把序列28的dsRNA有義鏈dsRNA:GCAAUGGGAAUUUACAUCA(SEQIDNO:111)反義鏈dsRNA:UGAUGUAAAUUCCCAUUGC(SEQIDNO:112)29.基於Aha基因耙序列29的dsRNA有義鏈dsRNA:UGGGAAUUUACAUCAGCAC(SEQIDNO:113)反義鏈dsRNA:GUGCUGAUGUAAAUUCCCA(SEQIDNO:114)30.基於Aha基因靶序列30的dsRNA有義鏈dsRNA:UUUACAUCAGCACCCUCAA(SEQIDNO:115)反義鏈dsRNA:UUGAGGGUGCUGAUGUAAA(SEQIDNO:116)31.基於Aha基因靶序列31的dsRNA有義鏈dsRNA:UGAAUGGAGAGUCAGUAGA(SEQIDNO:117)反義鏈dsRNA:UCUACUGACUCUCCAUUCA(SEQIDNO:118)32.基於Aha基因靶序列32的dsRNA有義鏈dsRNA:UGGAGAGUCAGUAGACCCA(SEQIDNO:119)反義鏈dsRNA:UGGGUCUACUGACUCUCCA(SEQIDNO:120)33.基於Aha基因靶序列33的dsRNA有義鏈dsRNA:GCCUGCUCCUUCAAAAACC(SEQIDNO:121)反義鏈dsRNA:GGUUUUUGAAGGAGCAGGC(SEQIDNO:122)34.基於Aha基因耙序列34的dsRNA有義鏈dsRNA:AAUCCCCACUUGUAAGAUC(SEQIDNO:123)反義鏈dsRNA:GAUCUUACAAGUGGGGAUU(SEQIDNO:124)35.基於Aha基因耙序列35的dsRNA有義鏈dsRNA:UCCCCACUUGUAAGAUCAC(SEQIDNO:125)反義鏈dsRNA:GUGAUCUUACAAGUGGGGA(SEQIDNO:126)36.基於Aha基因靶序列36的dsRNA有義鏈dsRNA:GAUCACUCUTJAAGGAAACC(SEQIDNO:127)反義鏈dsRNA:GGUUUCCUUAAGAGUGAUC(SEQIDNO:128)37.基於Aha基因靶序列37的dsRNA有義鏈dsRNA:GGAAACCUUCCUGACGUCA(SEQIDNO:129)反義鏈dsRNA:UGACGUCAGGAAGGUUUCC(SEQIDNO:130)38.基於Aha基因靶序列38的dsRNA有義鏈ds脂A:CAUUAGAAGCAGACAGAGG(SEQIDNO:131)反義鏈dsRNA:CCUCUGUCUGCUUCUAAUG(SEQIDNO:132)39.基於Aha基因靶序列39的dsRNA有義鏈dsRNA:GCAGACAGAGGUGGAAAGU(SEQIDNO:133)反義鏈dsRNA:ACUUUCCACCUCUGUCUGC(SEQIDNO:134)40.基於Aha基因靶序列40的dsRNA有義鏈dsRNA:AGUUCCACAUGGUAGAUGG(SEQIDNO:135)反義鏈dsRNA:CCAUCUACCAUGUGGAACU(SEQIDNO:136)41.基於Aha基因靶序列41的dsRNA有義鏈dsRNA:CGUCUCUGGGGAAUUUACU(SEQIDNO:137)反義鏈dsRNA:AGUAAAUUCCCCAGAGACG(SEQIDNO:138)42.基於Aha基因靶序列42的dsRNA有義鏈dsRNA:UUUACUGAUCUGGUCCCUG(SEQIDNO:139)反義鏈dsRNA:CAGGGACCAGAUCAGUAAA(SEQIDNO:140)43.基於Aha基因靶序列43的dsRNA有義鏈dsRNA:ACAUAUUGUGAUGAAGUGG(SEQIDNO:141)反義鏈dsRNA:CCACUUCAUCACAAUAUGU(SEQIDNO:142)物44.基於Aha基因靶序列44的dsRNA有義鏈dsRNA:GUGGAGGUUUAAAUCUUGG(SEQIDNO:143)反義鏈dsRNA:CCAAGAUUUAAACCUCCAC(SEQIDNO:144)45.基於Aha基因靶序列45的dsRNA有義鏈dsRNA:ACAGACCUUUGGCUAUGGC(SEQIDNO:145)反義鏈dsRNA:GCCAUAGCCAAAGGUCUGU(SEQIDNO:146)表3.轉錄用以減量調節人功能性Aha蛋白質表達的shRNA的載體的引1.基於Aha基因靶序列1(SEQIDNO:12)的引物有義鏈ACCAATTTTTTTGGAAA(SEQIDNO:147)反義鏈TTATCCGTGGACCAATG(SEQIDNO:148)2,基於Aha基因靶序列7(SEQIDNO:18)的引物有義鏈ACTCACTTTTTTGGAAA(SEQIDNO:149)反義鏈CATCAAGCTTACTCACG(SEQIDNO:150)3.基於Aha基因耙序列13(SEQIDNO:24)的引物有義鏈TTTAGTTTTTTTGGAAA(SEQIDNO:151)反義鏈ACCTGTCCAGTTTAGTG(SEQIDNO:152)表4編碼載體轉錄的shRNA序列1.GUGGACCAAUUUUUUUGGAAA(SEQIDNO:153)2.GCUUACUCACUUUUUUGGAAA(SEQIDNO:154)3.CCAGUUUAGUUUUUUUGGAAA(SEQIDNO:155)在本發明的多個方面，dsRNA的每條鏈可以與表2所示dsRNA之一的至少一條鏈，在多個方面與表2所示dsRNA之一的兩條鏈，有至少5個、至少10個、至少15個、至少18個或至少20個相同的連續核苷酸。^>向到表2提供的dsRNA之一的耙序列中其他位置的可供選4,的dsRNA可以容易地用單巴序列和Ahal側翼序列(flankingAhalsequence)來確定。dsRNA含有兩條互補的可雜交形成雙鏈結構的RNA鏈。dsRNA的一條鏈(反義鏈)包含互補性區域，該互補性區域與源自Aha基因表達過程中形成的mRNA的序列的靶序列基本上互補，通常是完全地互補；另一條鏈(有義鏈)包含與反義鏈互補的區域，因而當在合適的條件下結合時，所述兩條鏈可雜交並形成雙鏈結構。通常情況下，雙鏈結構的長度是15-30,更通常是18-25，還更通常是19-24,並且最通常是19-21個鹼基對。類似地，靶序列的互補性區域的長度是15-30,更通常是18-25，還更通常是19-24，並且最通常是19-21個核苦酸。本發明的dsRNA還可包含一個或多個單鏈核苷酸突出端。例如，脫氧核糖核苦酸序列"tt"或核糖核苦酸序列"UU"可以連接到正義和反義鏈的3，-端形成突出端。dsRNA可以通過如下面詳述的本領域公知的標準方法合成，i口通過j吏用DNA自動合成4義，例i口可,人i口Biosearch、AppliedBiosystems，Inc通過商業途徑獲得。在本發明的一個方面，Aha基因可以是人Ahal基因。在多個方面，dsRNA包含至少兩條選自該組的序列，其中所述至少兩條序列中的一條與所述至少兩條序列中的另一條互補，並且所述至少兩條序列中的一條與Aha基因(如Ahal基因)表達生成的mRNA的序列基本上互補。技術人員熟知已經聲稱包含20到23個，但特別是21個鹼基對的雙鏈結構的dsRNA在誘導RNA幹擾時特別有效(Elbashir等，EMBO2001,20:6877-6888)。但是其他人已發現更短或更長的dsRNA也是有效的。本發明的dsRNA可以包含一個到三個對靶序列的錯配。如果dsRNA的反義鏈包含對耙序列的錯配，優選該錯配區域不處在互補性區域的中心。如果dsRNA的反義鏈包含對靶序列的錯配，優選將該錯配限制在任一末端的5個核苷酸，如互補性區域的5，或3'端的5、4、3、2或1個核苷酸，並且優選是5，-端。例如，對於與Aha基因的某個區域互補的23個核苷酸的dsRNA鏈，此dsRNA在中間的13個核香酸內通常不含有任何錯配。另一方面，dsRNA的反義鏈在從反義鏈的位置1或2到位置9或10(從5'數到3')的區域中不含任何錯配。本發明描述的方法能夠用於確定含有對靶序列的錯配的dsRNA是否能有效地抑制Aha基因的表達。考慮帶有錯配的dsRNA在抑制Aha基因表達時的功效是有用的，特別是當已知Aha基因的特定互補性區域在群體中具有多態性序列變異時。一方面，dsRNA的至少一端具有1到4個，通常情況下1個或2個核苷酸的單鏈核苷酸突出端。具有至少一個核苷酸突出端的dsRNA與它們的平端對應物相比具有不可想像的卓越的抑制特性。另外，本發明人們(inventors)已發現只有一個核苷酸突出端存在使dsRNA的幹擾活性加強，而不影響它的總體穩定性。已經證明，只有一個突出端的dsRNA在體內和多種細胞、細胞培養基、血液和血清中特別地穩定和有效。通常情況下，單鏈突出端位於反義鏈的3，-末端或有義鏈的3，-末端。dsRNA也可以具有通常位於反義鏈5，-端的平端。此類dsRNA具有改進的穩定性和抑制活性，因而允許低劑量的施用，即少於每天5mg/kg受者體重。通常情況下，dsRNA的反義鏈在3，-端具有核苷酸突出端，而5，-端是平的。另一方面，將突出端的一個或多個核苦酸用闢b^石壽酉吏4亥苦(nucleosidethiophosphate)耳又^。栽體編碼的RNAi試劑本發明的dsRNA也可以在體內從重組病毒載體細胞內表達。本發明的重組病毒載體包含編碼本發明的dsRNA的序列和用於表達dsRNA序列的任何合適的啟動子。合適的啟動子包括，例如U6或HIRNApolIII啟動子序列和巨細胞病毒啟動子。其他合適啟動子的選擇也在本領域技術範圍之內。本發明的重組病毒載體也可包含用以在特定組織或特定胞內環境表達dsRNA的誘導型或可調控的啟動子。在體內使用重組病毒載體將本發明的dsRNA遞送至細胞會在下面詳細討論。本發明的dsRNA可以從重組病毒載體表達為兩個分開的、互補的RNA分子，或者表達為有兩個互補區域的單個RNA分子。本領域技術人員會明白任何能夠接受要表達的dsRNA分子的編碼序列的病毒載體都可使用，例如源自腺病毒(AV)、腺伴隨病毒(AAV)、反轉錄病毒(如慢病毒(lentiviruses)(LV)、棒狀病毒(Rhabdovirus)、鼠類白血病病毒)、皰滲病毒等。病毒載體的向性可以通過用來自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原假型包裝載體或者通過適當地替換不同的病毒衣殼蛋白來進行修飾。例如，本發明的慢病毒載體可以用來自皰疹性口腔炎病毒(vsv)、狂犬病、依波拉(Ebola)、莫科拉(Mokola)等的表面蛋白質進行假型包裝。本發明的AAV載體可以通過工程改造載體以表達不同衣殼蛋白血清型來使其靶向不同的細胞。例如，將表達血清型2基因組上的血清型2衣殼的AAV載體稱為AAV2/2。可以將AAV2/2載體上的這種血清型2衣殼替換為血清型5衣殼基因以產生AAV2/5載體。構建表達不同衣殼蛋白質血清型的AAV載體的技術在本領域的技術範圍之內；參見如RabinowitzJE等(2002)，JVirol76:791-801,將其全文通過引用併入本文。適合本發明使用的重組病毒載體的選擇、用於向載體中插入表達dsRNA的核酸序列的方法和將病毒載體遞送到感興趣的細胞的方法在本領域的技術範圍之內。參見如DomburgR(1995),GeneTherap.2:301-310;EglitisMA(1988)，Biotechniques6:608-614;MillerAD(1990),HumGeneTherap.1:5-14;AndersonWF(1998),Nature392:25-30;和RubinsonDA等，NatGenet.33:401-406,將它們的全文通過引用併入本文。例如，將本發明的dsRNA從含有如U6或HIRNA啟動子或者巨細胞病毒(CMV)啟動子的重組AAV載體表達為兩個分開的、互補的單鏈RNA分子。XiaH等(2002),Nat.Biotech.20:1006-1010描述了用於表達本發明dsRNA的合適AV載體、用於構建重組AV載體的方法和將該載體遞送至耙細胞的方法。SamulskiR等(1987),J.Virol.61:3096-3101;FisherKJ等(1996),J.Virol,70:520-532;SamulskiR等(1989),J.Virol.63:3822-3826;美國專利No.5,252,479;美國專利No.5,139,941;國際專利申請No.WO94/13788和國際專利申請No.WO93/24641描述了用於表達本發明dsRNA的合適AAV的載體、用於構建重組AV載體的方法和將該載體遞送至靶細胞的方法，將它們的全文通過引用併入本文。非dsRNA藥劑抗體可用以降低功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子的水平。例如，抗體能夠通過與功能性Ahal、Hsp90腺苦三磷酸酶的功能性Ahal結合位點和/或功能性Ahal-Hsp90腺苷三磷酸酶複合物的特異結合來降低功能性Ahal水平。本發明範圍內的抗體包括，例如多克隆抗體、單克隆抗體、抗體片段和基於抗體的融合分子。抗體的工程改造、生產、篩選、純化、片段化(fragmentation)和治療用途是本領域公知的(概括地參見Carter(2006)NatRevImmunol.6(5),343-357;Coligan(2005)ShortProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,ISBN0471715786);Teillaud(2005)ExpertOpinBiolTher.5(Supp.1)S15-27;Subramanian,ed.(2004)Antibodies:Volume1:ProductionandPurification,Springer,ISBN0306482452;Brent等，ed.(2003)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&SonsInc,ISBN047150338X;Lo,ed.(2003)AntibodyEngineeringMethodsandProtocols,HumanaPress,ISBN1588290921;Ausubel等，ed.(2002)ShortProtocolsinMolecularBiology5thEd"CurrentProtocols,ISBN0471250929)。功能性Ahal特異性的多種類型的抗體也可通過許多商業渠道獲得。血漿中抗體的終末半衰期(terminalhalf-life)可以在一個很廣的範圍內調節，例如幾分鐘到幾周，來配合治療蛋白質錯摺疊疾病的臨床目標(參見如Carter等(2006)NatRevImmunol.6(5),343-357,353)。嵌合的、人源化的和純人源的(fUllyhuman)MAb能夠有效地克服使用源自非人源的抗體治療蛋白質錯摺疊疾病時的潛在限制，因而提供降低的免疫原性和優化的效應分子功能(參見如Teillaud(2005)ExpertOpin.Biol.Ther.5(1),S15-S27;Tomizuka等(2000)Proc,Nat.Acad.Sci.USA97,722-727;Carter等(2006)NatRevImmunol.6(5),343-357,346-347)。可以改變或選擇抗體以獲得高效的抗體內化。同樣地，抗體可以更高效地與胞內的耙分子相互作用，這些胞內的靶分子如功能性Ahal和/或具有類似功能的相關分子，或包括它們的複合物。另外，抗體-藥物綴合物(conjugate)能夠增加抗體內化的效率。有效的抗體內化對於遞送功能性Ahal特異性的抗體至胞內環境來拯救缺陷性摺疊和轉運以次優(suboptimal)摺疊能量學為特徵的蛋白質是理想的。抗體與多種能夠有助於抗體細胞內化的作用物的綴合是本領域公知的(概括地參見Wu等(2005)NatBiotechnol.23(9),1137-1146;McCarron等(2005)MolInterv5(6),368-380;Niemeyer(2004)BioconjligationProtocols,StrategiesandMethods:HumanaPress,ISBN1588290980;Hermanson(1996)BioconjugateTechniques,AcademicPress,ISBN0123423368)。與熱休克蛋白分子伴侶，如Hsp90輔分子伴侶Ahal,特異性相互作用的小無機分子可用以降低功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子的水平。功能性Ahal的藥物抑制劑或小分子抑制劑的鑑定可以容易地通過標準高通量篩選方法來完成。另外，可以將標準的醫用化學方法應用到這些試劑來增強或修飾他們的活性以產生更多的試劑。特異性地識別和結合功能性Ahal(或具有相似功能的其他相關分子)核苷酸或蛋白質的純化的適配體可用以降低功能性Ahal(和/或具有相似功能的其他相關分子)的水平。適配體是從大的隨機序列集合(largerandomsequencepool)選出的結合特定靶分子的核酸或肽分子。適配體的小尺寸使它們更容易合成和進行化學修飾，並且使它們能夠接近抗原表位，否則該抗原表位即可能被阻擋(block)或隱藏。並且由於它們和內源性分子非常相似，適配體通常是非毒性的且弱的抗原。適配體的生成、選擇和遞送在本領域的技術範圍之內(參見如Lee等(2006)CurrOpinChemBiol.10，1-8;Yan等(2005)FrontBiosci10,1802-1827;Hoppe-Seyler和Butz(2000)JMolMed.78(8)，426-430)。負選擇方法會產生能夠精確識別分子間不同的適配體。例如負選擇步驟可產生能夠識別Hsp90/ADP和Hsp90/ATP或者能夠識別功能性Ahal、Hsp卯腺苷三磷酸酶和功能性Ahal-Hsp90腺苷三磷酸酶複合物的適配體。適配體也可用以在細胞和有機體中在時間上和空間上調節蛋白質功能(如功能性Ahal的功能)。例如，配體調節性肽(LiRP)系統提供一種常規的方法，其中胞內肽的結合活性受到肽適配體的調控，而所述肽適配體則受到可透過細胞的小分子的調控(參見如Binkowski(2005)Chem&Biol.12(7),847-55)。通過使用LiRP或類似的遞送系統，功能性Ahal的結合活性可以通過可透過細胞的小分子來控制，所述小分子與引入的胞內功能性Ahal特異性蛋白質適配體相互作用。因此，適配體能夠提供降低功能性Ahal水平的有效方法，例如通過直接結合功能性AhalmRNA、功能性Ahal表達的蛋白質、Hsp90腺苷三磷酸酶的功能性Ahal結合位點和/或功能性Ahal-Hsp90腺苦三磷酸酶複合物。特異性地識別和結合編碼功能性Ahal(和/或具有類似功能的其他相關分子)的核糖核苷酸的純化反義核酸可用以降低功能性Ahal(和/或具有類似功能的其他相關分子)的水平。本發明的反義核酸分子是在細胞環境下與編碼如功能性Ahal蛋白質的細胞mRNA和/或基因組DNA特異性雜交(如結合)的那些，在某種意義上抑制此蛋白質的表達，如通過抑制轉錄和/或翻譯。有效降低功能性Ahal水平的反義分子可以用本領域公知的方法(參見如Chan等(2006)ClinicalandExperimentalPharmacologyandPhysiology33(5-6),533-540)來設計、生成和施用。設計為催化性地切割靶mRNA轉錄物的核酶分子也能夠用於降低功能性Ahal和/或具有類似活性的相關分子的水平。對於功能性Ahal特異性的核酶分子可以用本領域公知的方法(參見如Fanning和Symonds(2006)HandbookExperimentalPharmacology173,289-303G,reviewingtherapeuticuseofhammerheadribozymesandsmallhairpinRNA(糹宗述了4垂頭4大4亥酶禾口小髮夾RNA的治療用途))來設計、生成和施用。形成三鏈體的寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotide)可用以降低功能性Ahal和/或具有類似活性的相關分子的水平(概括地參見Rogers等(2005)CurrentMedicinalChemistry5(4),319-326)。施用用於本文中所述方法的試劑可以通過多種本
技術領域：
公知的方法遞送。外產生或製造並向身體施用的試劑。內源試劑是那些通過某種類型的設備(生物的或其他)在體內產生或製造的用以在體內器官內遞送或遞送至體內其他器官的試劑。本文描述的試劑可通過任何常規方式使用一種或多種可藥用的載體和/或U武形劑來配製，如在例如Remington'sPharmaceuticalSciences(雷明登藥物科學)(A.R.Gennaro，Ed.),第21版，ISBN:0781746736(2005)中描述的，將其全文通過引用併入本文。這些劑型將包含治療有效量的優選是純化形式的所述試劑和適量的載體來提供向受試者進行適當施用的形式。劑型應當適合施用的模式。本發明使用的試劑可以通過公知的方法配製，用於使用數種途徑向受試者施用，這些途徑包括但不限於腸胃外、肺、口服、局部(topical)、皮內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、鼻內、硬膜外、目艮、口和直腸。單獨的試劑也可以與一種或多種本發明的其他試劑和/或其他生物學上有活性的或生物學上惰性的試劑一起施用。這些生物學上有活性的或惰性的試劑可以與所述試劑具有流體或才幾械相互作用(influidormechanicalcommunication),或者通過離子、共價、範德華力、疏水、親水作用或其他物理力附著於所述試劑。當在本發明的方法中使用時，治療有效量的本文所述試劑之一可以以純的形式，或者如杲存在的話，以可藥用的鹽的形式，在含有或不含有可藥用的賦形劑的情況下應用。例如，本發明的試劑可以按照可應用於任何醫學治療的合理效益/風險比率以足夠的量施用，所述量足以在受試者體內重建以次優摺疊能量學為特徵的蛋白質的胞內和/或胞外運輸，和/或至少部分地恢復通道的功能。這些試劑的毒性和治療功效可以通過在細胞培養物和/或實驗動物中確定LD50(對群體中的50。/。致死的劑量)和ED50(對群體中的50%治療有效的劑量)的標準藥學方法來測定。毒性和治療效果之間的劑量比率是可以表達為LD50/ED50比的治療指標，其中大治療指標是優選的。可與可藥用的載體組合產生單一製劑形式(singledosageform)的試劑的量會根據治療的主體(host)和施藥的特定方式改變。本領域技術人員可以理解每一製劑形式的單劑(individualdose)所含有的試劑的單位含量本身不需要達到治療有效量，因為必要的治療有效量可以通過施用多個單劑來達到。試劑的施用可以作為單次事件發生或發生一段治療時間內。例如，可以每天、每周、每兩周或每月施用試劑。在一些情況下，治療可以從幾星期延長至幾個月，或者甚至是一年或更長。對於任何特定受試者的特定治療有效劑量水平依賴於多種因素，這些因素包括所治療的病症和該病症的嚴重程度；使用的特定試劑的活性；使用的特定組合物；患者的年齡、體重、大致健康狀況(generalhealth)、性別和飲食；施用的時間；施用的途徑；使用的特定試劑的排洩率；治療的持續時間；與使用的特定試劑聯合使用或巧合使用的藥物和醫學領域公知的類似因素等。有經驗的開業醫生會理解本發明使用試劑的總的每日用量(totaldailyusage)將由主治醫師在合理醫學判斷的範圍內決定。降低功能性Ahal或具有類似功能的其他相關分子的水平的試劑也可以與其他治療模式一起組合使用。因此，在本文描述的治療方法之外，也可為受試者提供已知對特定蛋白質錯摺疊疾病有效的其他治療方法。可以配製控釋(或持續釋放)的製備物來延長試劑的活性和減少給藥頻率。控釋製備物也用以影響開始作用的時間或其他特徵，如試劑的血液水平，並且因而影響副作用的發生。控釋製備物可以設計為首先釋放可產生期望療效的試劑量，然後在延長體內接近恆定水平的試劑，所述試劑可以按照可取代新陳代謝掉的試劑量和/或排出體外的試劑量的速度從試劑形式釋放。試劑的控釋可以通過多種誘導物激發，如pH的改變、溫度的改變、酶、水或者其他生理條件或分子。控釋系統可以包括，例如注入泵(infUsionpump),其可用於以類似於遞送胰島素或化療劑(chemotherapy)至特定器官或腫瘤的方式施用試劑。通常而言，使用這種系統時將試劑與生物可降解的、生物相容性的多聚體植入物(見下文)組合施用，所述植入物在選定的位點經過一段受控制的時間釋放試劑。多聚體材料的實例包括多聚酸酐、多正酯(polyorthoester)、聚乙醇酸、聚乳酸、聚乙烯乙酸乙烯酯(polyethylenevinylacetate),和它們的共聚物和組合。另夕卜，可以將控釋系統置於治療目標的附近，因而只需要系統性劑量的一部分。本發明的試劑可以通過其他本領域普通技術人員公知的控釋方法或遞送裝置來施用。這些包括，例如，羥丙基曱基纖維素(hydropropylmethylcellulose)、其他多聚體基質、凝膠、透性膜、滲透系統、多層包被(multilayercoating)、微粒、脂質體、微球或類似物或者上述的任意組合來提供期望的按照不同比例的釋放語(releaseprofile)(見下)。控釋遞送試劑的其他方法是技術人員公知的並在本發明的範圍之內。降低功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子水平的試劑可以通過本領域公知的多種途徑施用。實例包括涉及直接注射(如系統性的或立體定向的)、經過工程改造以分泌目的因子的細胞的植入、釋放藥物的生物材料、可植入的基質裝置、可植入的泵、可注射的凝膠和水凝膠、脂質體、微團(micelle)(i口大至30口m)、納5求(nanosphere)(j口小於1口m)、孩iJ求(如1-100口m)、儲存裝置(reservoirdevice)等。大分子(macromole)和/或藥物(如本文描述的試劑)的肺遞送為肺部的局部組織或體循環的循環系統提供相對簡單的無損傷(non-invasive)施用(參見如Cryan(2004)AAPSJ.7(1)article4，E20-41,提供對肺遞送技術的綜述)。肺遞送的優點包括無損傷、大的吸收表面面積(75m2)、允許快速吸收的薄的(0.1到0.5口m)肺泡上皮、首過代謝(firstpassmetabolism)的缺失、降低的蛋白水解活性、快速發生作用和高生物利用率。含有或不含賦形劑和/或可分散液體的用於肺遞送的藥物劑型是本領域公知的。基於載體的生物分子遞送系統，如多聚體遞送系統、脂質體和微化的碳水化合物(micronizedcarbohydrate)可與肺遞送結合使用。滲透促進劑(penetrationenhancer)(如表面活性劑、膽汁鹽、環糊精)、酶抑制劑(如胰凝乳蛋白酶抑制劑、抑酶醛肽(leupeptin)、桿菌肽)和載體(如微球和脂質體)可用來增強穿過肺泡上皮細胞的為了系統性分布的攝取。可用以運送本文描述的生物分子的多種吸入遞送裝置，如定量吸入器(metered-doseinhaler)、噴霧器和乾粉吸入器是本領域公知的(如AErx(Aradigm,CA);Respimat(Boehringer，Germany);AeroDose(AerogenInc.,CA))。如本領域公知的那樣，裝置選擇可以依賴於所用生物分子的狀態(如溶液或乾粉)、貯存的方法和狀態、賦形劑的選擇以及劑型和裝置之間的相互作用。乾粉吸入裝置對基於蛋白質的試劑的肺遞送是特別優選的(如Spinhaler(FisonsPharmaceuticals,NY);Rotohaler(GSK,NC);Diskhaler(GSK,NC);Spiros(DuraPharmaceuticals,CA);Nektar(NektarPharmaceuticals,CA))。提供好的流動性、分散能力和穩定性的活性生物成分的乾粉劑型是本領域技術人員乂>^口的。使功能性Ahal水平降低的試劑可以膠囊化並在多種載體遞送系統中施用。載體遞送系統的實例包括微球、水凝膠、多聚體植入物、智能多聚體載體(smartpolymericcarrier)和脂質體。遞送生物分子試劑的基於載體的系統能夠提供胞內遞送；調適(tailor)生物分子/試劑的釋放速率；增加到達其作用位點的生物分子的比例；改進藥物到其作用位點的轉運；允許與其他試劑或賦形劑的共區域化(colocalized)沉積；改進體內試劑的穩定性；通過減少清除率(clearance)延長試劑在其作用位點的留駐時間；降低試劑到非目的組織的非特異性遞送；降低試劑引起的刺激(irritation);降低試劑高的初始劑量帶來的毒性；改變試劑的免疫原性；降低給藥頻率、趕緊產品的味道；和/或提高產品的貨架壽命(shelflife)。多聚微球可以使用天然存在的或合成的多聚體生產，其為大小範圍在O.l到500jim的顆粒系統(particulatesystem)。多聚孩i團和多聚體組(polymeromes)是與孩i球具有相似特徵的多聚體遞送運載體(polymericdeliveryvehicle),它也可以有助於膠嚢化和遞送本文描述的生物分子。對於許多生物分子淨荷的微球的裝配(fabrication)、膠嚢化和穩定在本領域技術範圍之內(參見如Varde&Pack(2004)ExpertOpin.Biol.4(1)35-51)。微球的釋放速率可以通過多聚體類型、多聚體分子量、共聚物組成、添加到微球劑型的賦形劑和微球大小來調適。對形成微球有用的多聚體材料包括PLA、PLGA、DPPC包被的PLGA、DPPC、DSPC、EVAc、明膠、清蛋白、殼聚糖、右旋糖酐(dextmn)、DL-PLG、SDLMs、PEG(如ProMaxx)、透明質酸鈉、二酮哌溱衍生物(如Technosphere)、磷酸4丐-PEG顆粒和寡糖衍生物DPPG(如Solidose)。膠嚢化可以例如使用水/油單享'L劑方法(water/oilsingleemulsionmethod)、？K-油-又又享L劑方法(water-oil-waterdoubleemulsionmethod)或凍幹法來實現。幾個商業化的膠嚢化技術是可以獲得的(如ProLease、Alkerme)。膠嚢化本文所述試劑的微球可以多種方式來施用，包括腸胃外、口服、肺、植入和泵送裝置。由親水的多聚體例如膠原、血纖蛋白和藻酸鹽組成的多聚體水凝膠可以用於降低功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子水平的試劑的持續釋放(通常參見Sakiyama等(2001)FASEBJ.15，1300-1302)。毫米到釐米規模的三維多聚植入物可以與降低功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子水平的試劑一起加載(通常參見Teng等(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99,3024-3029)。多聚體植入物通常提供生物活性因子的較大儲藏。植入物也可以裝配成結構支撐體以配合其應用的幾何學(如形狀、大小、多孔性)。也可以通過商業途徑獲得具有多種大小和遞送譜(deliveryprofile)的可才直入的基於基質的遞送系統(如InnovativeResearchofAmerica,Sarasota,FL)。"智能"多聚載體可用於施用降低功能性Ahal和/或具有相似功能的其他相關分子水平的試劑(概括地參見Stayton等(2005)OrthodCraniofacialRes8,219-225;Wu等(2005)NatureBiotech(2005)23(9),1137-1146)。這類載體使用在生理pH下為親水和隱身-樣(stealth-like)的多聚體，但所述多聚體在攝入至內體區室(endosomalcompartment)(即來自內體pH梯度的酸性刺激物)之後就變為疏水和膜去穩定的(membrane-destabilizing)多聚體，它們在內體區室中增強貨物分子向胞質中的釋放。智能多聚載體的設計可以引入pH敏感的功能性、疏水性膜去穩定基團、允許藥物引入的多種綴合和/或絡合元件以及可選的細胞靶向成分。潛在的治療性大分子貨物包括致使功能性Ahal和/或具有類似功能的相關分子水平降低的肽、蛋白質、抗體、多核苷酸、質粒DNA(pDNA)、適配體、反義寡聚脫氧核苷酸、沉默RNA(silencingRNA)和/或核酶。作為實例，通過受體介導的胞吞作用內化的智能多聚載體可以增強靶向功能性Ahal的dsRNA和/或其他本文描述的試劑的細胞質遞送。多聚載體包括，例如聚(烷基丙歸酸)多聚體家族，具體實例包括聚曱基丙烯酸、聚(乙基丙烯酸)(PEAA)、聚(丙基丙烯酸)(PPAA)和聚(丁基丙烯酸)(PBAA),其中烷基依次增加一個亞曱基基團。具有很強pH響應性、膜去穩定活性的智能多聚載體可設計為腎臟排洩的大小限制以下。例如，聚(EAA-co-BA-co-PDSA)和聚(PAA-co-BA-co-PDSA)多聚體分別在9和12kDa的低分子量時表現出高溶血/膜去穩定活性。多種接頭化學可用來為蛋白質、核酸和/或靶向部分提供可降解的綴合。例如吡啶基二硫丙烯酸酯(pyridyldisulfideacrylate)(PDSA)單體允許通過二硫鍵的有效綴合反應，所述二硫鍵在治療物胞內易位之後可在胞質中還原。脂質體可用於施用降低功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子水平的試劑。脂質體的藥物攜帶能力和釋放速率可取決於脂質組成、大小、電荷、藥物/脂質比率和遞送方法。常規的脂質體由中性或陰離子脂質(天然的或合成的)組成。一般使用的脂質是磷脂醯膽鹼(lec池in),例如(磷脂醯膽鹼(phosphatidylcholines^磷脂醯乙醇胺(PE)、鞘磷脂、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油(PG)和磷脂醯肌醇(PI)。脂質膠嚢化的方法是本領域公知的(Galovic等(2002)Eur.J.Pharm.Sci.15,441-448;Wagner等(2002)J.LiposomeRes.12,259-270)。耙向的脂質體(targetediiposome)和反應性脂質體也可用以遞送本發明的生物分子。靶向的脂質體有附著至其表面的尋靶配體，例如單克隆抗體或凝集素，允許與特定受體和/或細胞類型的相互作用。反應性或多形性脂質位(phase)和結構的傾向(如pH敏感的脂質體)(參見如Lasic(1997)LiposomesinGeneDelivery,CRCPress,FL)。多種其他遞送方法是本領域公知的並可用來施用本發明的試劑。進一步地，可以組合和/或#"飾這些和其他遞送系統來最優化本發明的試劑的施用。包含dsRNA的藥物組合物在多個方面，本發明提供包含如本文描述的dsRNA和可藥用載體的藥物組合物。包含dsRNA的藥物組合物對於治療與Aha基因的表達或活性的疾病或病症(如Ahal表達介導的病理過程)是有用的。這些藥物組合物基於遞送模式配製。一個實例是通過腸胃外遞送為系統性施用而配製的組合物。本發明的藥物組合物是用足以抑制Aha基因表達的劑量施用的。本發明人已經發現，因為它們改進的功效，含有本發明的dsRNA的組合物可以以令人驚訝的低劑量施用。每天每千克受者體重最大5mg的dsRNA劑量足以抑制或完全阻抑Aha基因的表達。通常情況下，dsRNA的合適劑量在每天每千克受者體重0.01微克到5.0毫克的範圍內，通常在每天酶千克體重1微克到1mg的範圍內。藥物組合物可以每天施用一次，或者dsRNA可以在一天中合適的間隔以兩次、三次或更多次亞劑量(sub-dose)施用或者甚至通過控釋劑型使用連續的灌輸(infosion)或運送來施用。那種情況下，每個亞劑量含有的dsRNA必須相應地小一些來達到總的日劑量。劑量單位也可配製(compoimd)為用於歷時幾天的遞送，如使放劑型是本領域公知的並對試劑的陰道遞送特別有用，例如能夠與本發明的試劑一起使用。在多個方面，劑量單位包含日劑量的相應多倍。技術人員將會明白一些因素會影響有效地治療受試者所需要的劑量和時間安排，其包括但不限於疾病或病症的嚴重程度、以前的治療、受試者的大體健康狀況和/或年齡和存在的其他疾病。另外，用治療有效量的組合物治療受試者可以包括單獨的治療或一系列的治療。本發明包括的對單個dsRNA的有效劑量和體內半衰期的估計可以使用常規的方法學或在使用合適動物模型的體內實驗(如本文其他部分所述)的基礎上進行。小鼠遺傳學上的進展已經產生了許多用於研究不同人類疾病，如Aha表達介導的病理過程的小鼠模型。這些模型可用於dsRNA的體內實驗，也可用於測定治療有效劑量。本發明也包括含有本發明的dsRNA化合物的藥物組合物和劑型。本發明的藥物組合物也可根據多種方法施用，這些方法取決於需要局部還是系統治療和接受治療的區域。施用可以是局部的(topical),肺的，如通過吸入或吹入粉末或氣溶膠，包括通過噴霧器；氣管內的、鼻內的、表皮的和經皮的，口服或腸胃外的。腸胃外的施用包括靜脈內的、動脈內的(intraartierial)、皮下的、腹膜內的或肌內的注射或灌輸；或顱內的，如鞘內的或心室內的施用。局部施用的藥物組合物和劑型可以包括經皮膚的貼片(transdermalpatches)、壽欠膏(ointment)、洗液(lotion)、乳膏(cream)、湊是月交、滴齊寸(drop)、牙全劑(suppository)、噴霧劑(spmy)、液體和粉末。常規的藥用載體，水的、粉末的或油狀的基底，稠化劑(thickener)等可能是必要的或理想的。塗覆的保險套、手套等也可能有用。例如，局部劑型包括這樣一些劑型，在這些劑型中將本發明的dsRNA與局部遞送試劑(如脂質、脂質體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑)混合。在多個方面，脂質和脂質體可以包括中性的(如二油醯磷脂醯乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine)=DOPE、二豆蔻醯磷脂醯膽鹼(dimyristoylphosphatidylcholine)=DMPC、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(distearolyphosphatidylcholine))、電負性的(negative)(二豆蔻醯磷脂醯甘油(dimyristoylphosphatidylglycerol)=DMPG)和電正性的(cationic)(二油醯四曱基氨基丙基(dioleoyltetramethylaminopropyl)=DOTAP和二油醯磷脂醯乙醇胺(dioleoylphosphatidylethanolamine)=DOTMA)。本發明的ds認A可以包裹入脂質體或在那裡形成複合物，特別是和陽離子的脂質體。或者，dsRNA可以與脂質，特別是陽離子的脂質形成複合物。在多個方面，脂肪酸和酯可以包括但不限於花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、辛酸、癸酸、豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸(dicaprate)、三癸酸(tricaprate)、單油酸甘油酯(monoolein)、甘油二月桂酸酯(dilaurin)、1-單癸酸甘油酯(glyceryl1-monocaprate)、1-十二》克基氮雜玉不庚-2-酉同(1-dodecylazacycloheptan-2-one)、醯基肉鹼(acylcamitine)、醯基膽鹼或C^烷基酯(如異丙基肉桂酸酯(isopropylmyristate)IPM)、單酸甘油酯、甘油二酯或它們的可藥用的鹽。本領域技術人員將了解口服施用的組合物和劑型可以包括粉末或顆粒、微顆粒、納顆粒(nanoparticulate)、水的或非水基質的懸液或溶液、膠嚢、凝膠膠嚢、嚢劑(sachet)、片劑或小片劑(minitablet)。稠化劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑(dispersingaids)或黏合劑(binder)可能是理想的。口腔劑型可以是那些在其中本發明的dsRNA與一種或多種滲透促進劑、表面活性劑和螯合劑。表面活性劑可以包括脂肪酸和/或它們的酯或鹽、膽汁酸(bileacid)和/或其鹽。優選的膽汁酸/鹽包括鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholicacid)(CDCA)和烏索脫氧鵝脫氧月旦酸(ursodeoxychenodeoxycholicacid)(UDCA)、膽酸(cholicacid)、脫氬膽酸、脫氧膽酸、葡糖膽酸(glucholicacid)、glycholicacid(gly膽酸)、糖脫氧膽酸(glycodeoxycholicacid)、牛磺膽酸、牛磺脫氧膽酸、牛磺-24,25-二氫-梭鏈孢酸鈉(sodiumtauro-24,25-dihydro-fosidate)和糖二氫梭鏈孢酸鈉(sodiumglycodihydrofosidate)。脂肪酸可以包括花生四烯酸、十一烷酸(undecanoicacid)、油酸、月桂酸、辛酸、癸酸、豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸、亞麻酸、二癸酸、三癸酸、單油酸甘油酯、甘油二月桂酸酯、1-單癸酸甘油酯、l-十二烷基氮雜環庚-2-酮、醯基肉鹼、醯基膽鹼、單酸甘油酯、甘油二酯或它們的可藥用的鹽(如鈉鹽)。滲透促進劑的組合可能是有用的，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽的組合。例如，組合可以是月桂酸、癸酸和UDCA的鈉鹽。更多的滲透促進劑可以包括聚氧乙烯-9-月桂基醚(polyoxyethylene-9-laurylether)、聚氧乙烯-20-十六坑基醚(polyoxyethylene-20-cetylether)。本領域技術人員也將了解本發明的dsRNA可以以包括噴霧乾燥的顆粒或複合形成微顆粒或納顆粒通過口服遞送。dsRNA複合試劑包括聚胺基酸；聚亞胺(polyimine);聚丙烯酸鹽/酯(polyacrylate);聚烷基丙烯酸鹽/酯(polyalkylacrylate)、聚氧雜環丁烷(polyoxethane)、聚烷基氰基丙烯酸鹽./酯(polyalkylcyanoacrylate);陽離子化明膠、清蛋白、澱粉、丙烯酸鹽/酯、聚乙二醇(PEG)和澱粉；聚烷基氰基丙烯酸鹽/酯；DEAE-衍生化聚亞胺(DEAE-derivatizedpolyimines)、支鏈澱粉(pollulan)、纖維素和澱粉。複合試劑可以包括殼聚糖、N-三曱基殼聚糖、聚-L-賴氨酸、聚組氨酸、聚鳥氨酸、聚精胺(polyspermine)、魚精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙氨基曱基乙烯P(TDAE)(polythiodiethylaminomethylethyleneP(TDAE))、聚氨苯乙烯(如對氨基)、聚(曱基氰基丙烯酸酯)、聚(乙基氰基丙烯酸酯)、聚(丁基氰基丙烯酸酯)、聚(異丁基氰基丙烯酸酯)、聚(已己基氰基丙烯酸酯)、DEAE-異丁烯酸鹽/酯、DEAE-己基丙烯酸鹽/酯、DEAE-丙烯醯胺、DEAE-清蛋白和DEAE-葡聚糖、聚曱基丙烯酸鹽/酯、聚己基丙烯酸鹽/酯、聚(D,L-乳酸)、DL-乳酸乙醇酸共聚物(poly(DL-lactic-co-glycolicacid);PLGA)、藻酸鹽和聚乙二醇(PEG)。用於腸胃外、鞘內或心室內遞送的組合物和劑型可以包括可含有緩沖溶液、稀釋劑和其他合適添加劑的無菌水溶液，添加劑例如但不限於穿滲透促進劑、載體化合物和其他可藥用載體或賦形劑。本發明的藥物組合物包括但不限於溶液、乳劑和含有脂質體的劑型。這些組合物可以從許多成分中生產，所述成分包括但不限於預成液(preformedliquid)、自乳化的固體和自乳化的半固體。可以方便地以單位劑量形式呈現的本發明的藥物劑型可以根據製藥工業公知的常規技術來製備。這些技術包含把活性成分和藥用載體或賦形劑組合到一起的步驟。通常情況下，如下製備劑型通過均一地和緊密地把活性成分和液體載體或精細地分開的固體載體或它們兩者組合到一起，然後如果需要的話將產物成型。本發明的組合物可以配製成許多可能的製劑形式中的任何一種，這些製劑形式包括但不限於片劑、膠嚢、凝膠膠嚢、液體糖漿、軟膠嚢(softgd)、栓劑和灌腸劑。本發明的組合物也可配製成水的、非水的或混合介質中的懸液。水制懸液還可以包括增強懸液粘度的物質，所述物質包括例如羧曱基纖維素鈉、山梨糖醇和/或右旋糖酐。懸液也可包含穩定劑。在本發明的多個方面，可以將藥物組合物配製成並用作泡沫。藥用泡沫包括例如但不限於如下劑型乳劑、微乳劑、藥膏、膠凍劑(jelly)和脂質體。本質基本相似的情況下，這些劑型的區別在於終產物的成分和稠度。這類組合物和劑型的製備對於製藥和劑型領域的技術人員通常是公知的，並可以應用到本發明的組合物的劑型。篩選本發明的另一個方面涉及對功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子產生作用的候選試劑的篩選系統，其可用於開發治療性或預防性處理蛋白質摺疊疾病的組合物。測試法(assay)可以在活的哺乳動物細胞中進行，其更緊密地接近了特定血清水平的藥物在體內的效果。表達具有能量上欠佳的(energeticallydisfavourable)摺疊特性的蛋白質的細胞系可用於評估潛在的生物活性試劑針對功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子或者是針對從培養的細胞系製備的提取物的活性是有用的。使用提取物的研究提供了對直接的試劑/酶相互作用進行更嚴格測定的可能性。因此，本發明可以提供評估可降低功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子的水平，並且因而穩定哺乳動物宿主(例如人宿主)體內具有能量欠佳摺疊特性的蛋白質的摺疊的方法。本測試法可以包括將表達錯摺疊蛋白質的轉基因細胞系或其提取物與預先選定量的試劑在合適的培養基或緩沖液中接觸，然後測定在與不存在所述試劑的對照細胞系或部分提取物和/或表達目的蛋白質非錯摺疊變體的對照細胞系對比時，功能性Ahal和/或具有類似功能的其他相關分子的水平。例如，篩選方法可以鑑別具有以下功能的試劑降低功能性Ahal水平、降低結合Hsp卯的胞內Ahal、降低Hsp90腺苷三磷酸酶的激活、降低Hsp90/ATP的胞內水平和/或增加Hsp90/ADP的胞內水平。更具體地說，治療蛋白質錯摺疊疾病的候選試劑可以如下篩選提供在合適的培養基或緩衝液中穩定地表達目的錯摺疊蛋白質的細胞，對所述細胞施用候選試劑，測定該細胞中功能性Ahal的水平，和決定所述候選試劑是否降低胞內功能性Ahal的水平。另外，治療蛋白質錯摺疊疾病的候選試劑可以如下篩選提供在合適的培養基或緩衝液中穩定地表達目的錯摺疊蛋白質的細胞，對所述細胞施用候選試劑，測定與Hsp90結合的胞內Ahal和Hsp90腺苷三磷酸酶的激活水平，和決定所述候選試劑是否降低此類結合和/或激活。理想的候選者通常具有降低細胞內功能性Ahal水平的能力。穩定地表達錯摺疊蛋白質的細胞的供應在本領域的技術範圍之內(參見如實施例1-11)。檢測功能性Ahal和/或具有類似功能的相關分子的水平或它們形成的複合物的水平的任何合適的方法都可以應用於檢測因施用候選試劑所得的水平(參見如實施例5-9)。可以應用的常規方法中有共免疫沉澱、交聯、通過梯度或層析柱的共純化和與Ahal功能相關的活性測定。應用方法(例如這些方法)使得對感興趣的蛋白質和/或複合物的鑑定成為可能。篩選中鑑定的試劑將通常展現與功能性Ahal和/或具有類似功能的相關分子相互作用的能力，其相互作用的方式是引起具有次優摺疊動力學的蛋白質的穩定化，並因此導致增加的蛋白質轉運。例如，鑑定的試劑可以降低功能性Ahal的水平、降低與Hsp90結合的胞內Ahal、降低Hsp90腺苷三磷酸酶的激活、降低Hsp90/ATP的胞內水平和/或增加Hsp卯/ADP的胞內水平。這些試劑可以包括但不限於核酸、多肽、dsRNA、反義分子、適配體、核酶、三螺旋、抗體和小的無機分子。另外，上述描述的篩選方法可以應用另一種穩定表達非錯摺疊蛋白質變體的細胞。通過與其它細胞(表達次優摺疊動力學的蛋白質的細胞)基本相似的方式施用候選試劑，並測定非錯摺疊蛋白質的轉運水平，技術人員可以確定候選試劑是否基本上降低非錯摺疊蛋白質的轉運水平。優選地，鑑定的試劑基本上不幹擾非錯摺疊蛋白質的摺疊和/或轉運。同樣，穩定表達其他蛋白質的細胞也可以類似地用來決定試劑是否影響其他相關或不相關蛋白質的摺疊和/或轉運。例如，鑑定的降低功能性Ahal水平的試劑優選地基本上不削弱具有能量上更穩定的摺疊的其他蛋白質的轉運。本發明也包括鑑定特異結合功能性Ahal和/或具有相似功能的其他相關分子的方法。一個此類的方法包括如下步驟提供固定的純化了的功能性Ahal蛋白質和至少一種測試試劑；將固定的蛋白質和測試試劑相接觸；洗脫未結合到固定蛋白質的試劑；和檢測測試試劑是否與固定的蛋白質結合。這些仍然與固定的蛋白質結合的試劑是與功能性Ahal蛋白質特異性地相互作用的那些試劑。本發明也包括在發現藥物的嘗試中，使用功能性Ahal(和/或具有類似功能的其他分子)來闡明功能性Ahal(和/或具有類似功能的其他分子)和疾病(例如蛋白質錯摺疊疾病)的狀態、表型或症狀之間存在的關係。這些方法包括檢測或降低Ahal多核苷酸的水平，其包括用本發明的試劑接觸樣品、組織、細胞或有機體；測定功能性Ahal的核酸或蛋白質水平，和/或在處理之後的某個時間的相關表型的或化學的終止點(chemicalendpoint);和任選地將測量值與未處理的樣品或用本發明的其他試劑處理過的樣品進行比較。這些方法也可以平行地或與其他實驗組合實施以對於靶物質有效性驗證方法來確定未知基因的功能，或者確定特定的基因產物作為治療或預防特定疾病、症狀或表型的靶物質的有效性。治療性的處理本發明的一個方面提供治療蛋白質摺疊疾病的方法。不受限於特定的理論，以下現象是可能的降低功能性Ahal的水平，因而降低Hsp90腺苷三磷酸酶活性可以給予動力學上遇到挑戰的AF508突變體更多時間來利用重建分子伴侶來製造更適合輸出的摺疊(moreexportcompetentfold)。因此，在需要治療的受試者體內，能夠通過施用降低功能性Ahal和/或具有類似功能的其它相關分子的水平的試劑來治療蛋白質摺疊。另外，同樣不受限於特定的理論，以下現象是可能的Hsp90-ADP狀態有利於貨物和ERAD途徑的關聯，而依據Ahal和p23公知的生物化學特性，基於對功能性Ahal(參見如圖8B,X)或p23(參見如圖8B,Y)的應答Hsp90-ATP狀態提供與COPII的偶聯。因此，蛋白質錯摺疊疾病的另一個預防或治療方法可包括對需要施用的受試者施用可以降低功能性Ahal與Hsp卯腺苷三磷酸酶結合和/或降低因功能性Ahal和Hsp90腺香三磷酸酶的結合而導致的激活水平的試劑。優選地，所述試劑的施用基本上不幹擾其他胞內蛋白質的摺疊和/或轉運。例如，優選地，施用降低功能性Ahal的水平、降低功能性Ahal與Hsp90腺苦三磷酸酶的結合和/或降低因功能性Ahal和Hsp90腺苷三磷酸酶的結合而導致的激活水平的試劑優選不顯著的削弱其他蛋白質的轉運，例如，具有能量上更穩定摺疊的其他蛋白質。表示出需要本發明的上下文中的治療和/或適合(amenableto)本文描述的治療方法學的疾病狀態和症狀包括蛋白質錯摺疊疾病，例如CF、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、二型糖尿病、帕金森病，海綿狀腦病如克雅病、原發性系統性澱粉樣變性病、繼發性系統性澱粉樣變性病、老年系統性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣多神經病I、遺傳性腦澱粉樣血管病、血液透析相關性澱粉樣變性病、家族性澱粉樣多神經病III、費氏遺傳性系統性澱粉樣變性病(Finnishheriditarysystemicamyloidosis),曱狀腺髓樣癌(medullarycarcinomaofthethyroid)、心房澱粉樣變性病(atrialamyloidosis)、遺傳性非神經性系統性澱粉樣變性病(hereditarynon-neuropathicsystemicamyloidosis)、注射定4立'!"生；定4分才羊變寸生病(injection-localizedamyloidosis)和遺傳性腎澱粉樣變性(heriditaryrenalamyloidosis)。例如，根據本文描述的方法可治療的蛋白質錯摺疊疾病包括錯摺疊的蛋白質導致從ER中的蛋白質轉運減少和蛋白質降解增加的那些疾病，例如CF、馬方綜合症、法布萊病、高歇病和色素性視網膜炎3。作為另一個例子，根據本文描述的方法可治療的蛋白質錯摺疊疾病包括錯摺疊的蛋白質導致不溶的聚集物沉積的那些疾病，例如阿爾茨海默病、二型糖尿病、帕金森病和海綿狀腦病(例如克雅病)。上述所列的蛋白質錯摺疊疾病可以是，至少部分是，由下列物質的錯誤摺疊引起的CFTR、肌原纖蛋白、a-半乳糖苷酶、(3-葡糖腦苷脂酶、視紫紅質、澱粉狀蛋白卩和t(胰島澱粉樣多肽)、支鏈澱粉(amylin)、a-突觸核蛋白(alpha-synuclein)、朊病毒、免疫球蛋白輕鏈、血清澱粉樣A、運曱狀腺素蛋白、半胱氨酸蛋白酶抑制劑C、p2-微球蛋白、脫脂載脂蛋白A-l、凝溶膠蛋白、降血鈣素、心鈉素、溶菌酶、胰島素和纖維蛋白原(fibrinogen)。是否需要治療的決定因素通常是通過與疾病相關的病史和身體檢查來評估。例如，CF的診斷可以包括臨床標準和汗液Cl-數值分析的結合。另外，可以進行AF508的DNA分析。這種CF診斷在本領域範圍之內(參見如Cutting(2005)AnnuRevGenomicsHumGenet6，237-260，綜述了CF)。具有確定的治療需要的受試者包括那些具有下列特徵的受試者經診斷有蛋白質錯摺疊疾病或蛋白質錯摺疊疾病指徵(indication)應遵循本文所描述的治療處理的受試者，和已經接受治療、正在治療和將要治療蛋白質錯摺疊疾病的受試者。受試者優選地是動物，包括但不限於哺乳動物、爬行動物和鳥類，更優選地是馬、牛(cow)、犬、貓、綿羊、豬和雞，最優選地是人。本發明的另一個方面涉及拯救受到蛋白質錯摺疊影響的細胞。這類方法定位於細胞功能，並可以在體外、體內或先體外後體內地實施。在一個實施例中，拯救受到蛋白質錯摺疊影響的細胞可以發生在來自培養的細胞系的細胞。在另一個實施例中，拯救受到蛋白質錯摺疊影響的細胞可以發生在取自受試者並且隨後重新導入受試者的細胞。在另一個實施例中，拯救受到蛋白質錯摺疊影響的細胞可以原位發生在受試者體內的細胞中。將可以降低功能性Ahal和/或具有類似功能的相關分子水平的試劑向發生蛋白質錯摺疊的細胞施用可以有助於能量上不穩定的摺疊穩定化，導致對受損的蛋白質胞內和/或胞外轉運的重建。例如，對表達錯摺疊的AF508CFTR的細胞施用可以降低Hsp90輔分子伴侶和功能性Ahal的試劑可以增強AF508的ER穩定性、重建AF508到細胞表面的轉運、增加細胞表面AF508的可用性和/或至少部分地重建通道功能(參見如實施例10)。優選地，為了拯救受到蛋白質錯摺疊影響的細胞而施用降低功能性Ahal水平的試劑基本上不幹擾其他胞內蛋白質的摺疊和/或轉運。使用dsRNA的治療處理本發明特別地涉及到為了治療嚢性纖維化而使用dsRNA或從其製備的藥物組合物。由於對於Ahal表達的抑制作用，本發明的dsRNA或從其製備的藥物組合物可以提高嚢性纖維化患者的生活質量。另外，本發明涉及目的在於治療癌症(如為了抑制腫瘤生長和胂瘤轉移)的dsRNA或本發明的藥物組合物的用途。例如dsRNA或從其製備的藥物組合物可用於治療實體瘤像乳腺癌、肺癌、頭頸癌(headandneckcancer)、腦癌、腹癌(abdominalcancer)、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神經膠質瘤(glioma)、肝癌、舌癌、成神經細胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、成視網膜細胞瘤、維耳姆斯瘤(Wilm，stumor)、多發性骨髓瘤，和用於治療皮膚癌像黑素瘤，用於治療淋巴瘤和血癌。本發明還涉及到使用本發明的dsRNA或從其製備的藥物組合物來抑制不同種類的癌症中Ahal的表達和/或抑制腹水的積聚和胸腔積液，這些癌症如乳腺癌、肺癌、頭癌、頸癌、腦癌、腹癌、結腸癌、結腸直腸癌、食道癌、胃腸癌、神經膠質瘤、肝癌、舌癌、成神經細胞瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、成視網膜細胞瘤、維耳姆斯瘤、多發性骨髓瘤、皮膚癌、黑素瘤、淋巴瘤和血癌。由於對於Ahal表達的抑制作用，本發明的dsRNA或從其製備的藥物組合物可以提高癌症患者的生活質量。本發明還涉及dsRNA或其藥物組合物與其他藥物和/或其他治療方法如已知藥物和/或已知治療方法組合的用途，如用於治療嚢性纖維化或癌症或用於預防腫瘤轉移，所述已知藥物和/或已知治療方法例如現今用來治療嚢纖維化或癌症和/或防止腫瘤轉移的那些。當藥物組合物的目的為治療嚢性纖維化時，可以將該組合物例如與以下組合提供每日胸部物理療法、口服的胰腺酶、對抗肺部感染的每日口服或吸入的抗生素、吸入的抗哮喘治療物、皮質類固醇片劑、膳食維生素補充品(特別是A和D)、吸入Pulmozyme、減輕便秘或改進酶補充物活性的藥物、針對CF相關糖尿病的胰島素、針對CF相關肝病的藥物和幫助呼吸的氧氣。當藥物組合物的目的為治療癌症和/或防止腫瘤轉移時，組合物可以是，例如與放療和化療劑例如順鉑、環磷醯胺、5-氟尿嘧啶、阿黴素、道諾黴素或它莫西芬相結合來提供。本發明也可以通過4吏特定的RNAi試劑包含另一種抗癌症的化療劑如任何常規的化療劑來應用。特定結合劑(bindingagent)和這類其他試劑的組合可以增強化療方法。從技術人員的角度來看，多種化療方法可以導入本發明的方法中。可以使用任何化療劑，包括烷化劑、抗代謝物、激素和拮抗物、放射性同位素，以及天然產物。例如本發明的化合物可以與以下一起施用抗生素例如多柔比星和其他蒽環類抗生素類似物，氮芥如環磷醯胺，嘧啶類似物如5-氟尿嘧啶，順鉑，羥基脲，紫杉醇及其天然和合成衍生物等。在另一個實例中，在混合瘤的情況下，例如其中的肺瘤包括促性腺激素依賴的和促性腺激素不依賴的細胞的乳腺癌，所述化合物可以與亮丙瑞林(leuprolide)或戈舍瑞林(goserelin)(LH-RH的合成肽類似物)一起施用。另一個抗胂瘤方法包括將四環素化合物和另一種治療形式如手術、放射等一起使用，此處也稱為"輔助的抗肺瘤形式"。因此，本發明的方法可以與此類常規的療法(regimen)一起應用來獲得減輕副作用和增強功效的益處。實施例本發明的方面可以通過以下實施例得到更好的理解，實施例不應當理解為以任何的方式對本發明的範圍進行限制。實施例1:CFTR蛋白質相互作用組(interactome)為了確定在胞吐和胞吞途徑中CFTR的轉運和功能所涉及的總體蛋白質相互作用(globalproteininteraction),將包含CFTR的蛋白質複合物從表達野生型CFTR的細胞系中免疫分離(參見如圖1),用蛋白酶消化並用多維蛋白鑑定技術(MudPIT)確定肽混合物的組成((Lin等，BiochimBiophysActa1646,1(2003))。CFTR是從過量表達野生型或AF508CFTR的穩定BHK細胞系，或表達野生型CFTR的Calu-3、HT29和T84細胞系免疫沉澱得到的。將穩定表達野生型或AF508CFTR的幼倉鼠腎細胞(BHK)保存在補充有F12、5%胎牛血清(FBS)、青黴素和鏈黴素(Pen/Strep)各100單位/ml和500pM甲氨蝶呤(methotrexate)的DMEM(XanodynePharmacal,Inc.,Florence,KY)中。將不表達CFTR的親代BHK細胞培養在除不含曱氨蝶呤外其他均相同的培養基中。都表達內源性野生型CFTR的人肺細胞系Calu-3和人腸細胞系HT29和T84是從ATCC購買的，並根據製造商的說明進行保存。將全細胞去垢劑裂解物中的CFTR和共免疫沉澱蛋白質結合到偶聯有抗CFTR的單克隆抗體M3A7的瓊脂糖珠(Sepharosebead)。為了捕獲(capture)CFTR在不同的亞細胞區室內轉運時的瞬時的或微弱的相互作用，免疫沉澱在有或沒有在細胞裂解之前向完整的細胞加入可切割的化學交聯劑二硫代二琥珀醯亞胺丙酸酯(dithiobissuccinimidylpropionate)(DSP)的情況下進行。為了對照出蛋白質和珠的非特異結合，使用了幾種情況來顯示背景還原，其包括在以下條件下溫育細胞裂解物只有珠存在時，或珠與對抗VSV-G的單克隆抗體偶聯時，VSV-G是一種僅存在於感染了皰滲性口腔炎病毒的細胞中的蛋白質(Calu-3、T84和H89數據集)。在BHK細胞的情況下，將從穩定表達野生型和AF508的細胞中的免疫沉澱物直接與不表達CFTR的親本細胞系比較。在Excel文件中提供的數據集中，匯集了從非偶聯和偶聯兩種方法中回收的蛋白質。免疫沉澱之後，將蛋白質複合物通過在新鮮製備的8M鹽酸胍中變性來消化，然後稀釋到2M。用內蛋白酶LysC消化蛋白質8小時，接著稀釋到1M胍鹽酸，並用PorozymeTM胰蛋白酶珠進行胰蛋白酶消化。所有的消化都在37。C進行。將蛋白酶消化的免疫複合物用MudPIT來進行LC/LC/MS/MS分析。此方法已經由幾位作者詳細描述了(Link等，1999NatBiotechnol17，676-682;MacCoss等，2002,ProcNatlAcadSciUSA99，7900-7905;MacCoss等，2002,AnalChem74，5593-5599;McDonald等，2002IntJMassSpect219，245-251;Washburn等，2001NatBiotechnol19,242-247)。簡而言之，將變性、還原並烷基化的蛋白質分為三份並在37°C用三種不同的蛋白酶(胰蛋白酶、枯草蛋白酶(subtylisin)和彈性蛋白酶)過夜消化。得到的肽混合物用蟻酸(5%)酸化。然後，通過勻漿填充~7cm的5-|imAquaC18材料(Aqua，Phenomimex)到100jam的熔融石英毛細管構建三相微毛細管柱，所述熔融石英毛細管先前已經用SutterInstruments;敫光4立4申器(SutterManufacturing,Novato,CA)4立長到尖端直徑5jLim。接著，先後將3cm的5卞mPartisphere強陽離子交換樹脂(Partisphere:Whatman)和另一個3cm的5屮mAquaC18層析材料填充到柱上。然後在用高壓裝置(highpressurecell)把肽混合物上樣至三相層析柱的後端之前，用5%乙腈/0.1%蟻酸平衡柱子~30分鐘。上樣肽消化物之後，將柱子與Agilent1100四元HPLC連在一起(placeinline)並用改進的6步分離方法分析。緩衝溶液為5%乙腈/0.1%蚊酸(緩衝溶液A)、80%乙腈/0.1%蟻酸(緩衝溶液B)和500mM乙酸銨/5%乙腈/0.1%蟻酸(緩衝溶液C)。第1步由100分鐘的從0-100。/o的緩衝溶液B的梯度組成。第2-5步設定如下3分鐘100%緩沖溶液A、2分鐘X。/。的緩衝溶液C、10分鐘的0-15%梯度的緩衝溶液B和97分鐘的15-45%梯度的緩衝溶液B。所述2分鐘的緩沖溶液C的百分比(X)對6步分析來說分別是10、20、30、40%。在最後一步，梯度包括3分鐘100%的緩沖溶液A、20分鐘100%的緩衝溶液C和10分鐘的0-15%梯度的緩沖溶液B和107分鐘的15-70%梯度的緩衝溶液B。當肽從微毛細管柱洗脫出來，將它們用末梢2.4kV噴射電壓(distal2.4kVsparyvoltage)直接電噴射入LCQ-Deca質譜儀。在多維分離的每一步過程中，始終連續地重複在35。/。標準化的碰撞能量下的一個全掃描質譜(400-1400m/z)之後接著3個的數據依賴性MS/MS質譜的循環。質譜儀掃描功能和HPLC溶劑梯度的應用由Xcalibur數據系統控制。然後用下列方法分析串聯質譜(tandemmassspectra)。首先，使用軟體算法(2to3)從多電荷的肽質i普中來確定合適的電荷狀態(+2或+3)，並除去低質量的譜(Sadygov等，2002,JProteome(蛋白質組)Res1,211-215)。在Beowolf計算機簇(~75cpu)上用SEQUESTTM的並行虛擬機(PVM)版本(Yates等，1995,AnalChem67,3202-3210;Yates等，1995,AnalChem67,1426-1436),在構建自Refseq的人、小鼠和大鼠資料庫的聯合資料庫(HMR)的蛋白質資料庫中搜索2to3之後所得的MS/MS質譜。用DTASelect程序(Tabb等，2002,JProteome(蛋白質組)Res1,21-26)過濾、分類和顯示資料庫搜索結果。使用預設的DTASelect標準(即，+11.8,+22.5,+33.5,ACN0.08和每個位點至少2將從重複的免疫沉澱鑑定的蛋白質成分合併，並將得到的數據集用NIH提供的EASE分析程序標註GO—Annotation(GO註解)(Hosack等，2003,GenomeBiol《R70)。在減去對照的蛋白質組中，將GO—Molecular—Function(GO分子功能)註解為屬於結合核酸的或結構類別的蛋白質去除，這些蛋白質通常是來自全細胞蛋白質組實驗的普通汙染物。得到的蛋白質列表主要包括了胞質分子伴侶、內質網(ER)腔內蛋白質、分泌途徑的後部成分(latesecretorypathwaycomponent)、細胞表面相互作用因子和蛋白酶體/泛素化作用成分。圖1的草圖描繪了作為網絡中的節點包含在CFTR蛋白質相互作用組中的成分(淺色橢圓形已經建立的相互作用；深色橢圓形本研究找回的新的相互作用)，並且將其分為可能有助於在ER(I)、ERAD(II)、膜轉運(III)和後ER調節因子和效應物(IV)中蛋白質摺疊的次級網絡(subnetwork)。深色的線是網絡中的邊緣，其顯示CFTR和MudPIT鑑定的標示成分(indicativecomponent)之間直接或間接蛋白質相互作用。淺灰色的線說明的邊緣定義了基於Tmm共表達資料庫用Cytoscape平臺獲得的相互作用。表7顯示的是對蛋白質進行陣列(array)的結果，所述蛋白質是在所示的表達野生型CFTR的細胞種類中用多維蛋白質鑑定技術(MudPIT)回收的蛋白質，通過質譜以分級的序列覆蓋率的順序排歹寸(arrangedintheorderoffractionalsequencecoveragebymassspectrometry)。結果顯示，鑑定的蛋白質生成了定義CFTR蛋白質組或蛋白質相互作用組的蛋白質相互作用網絡(參見如圖1)。組成CFTR蛋白質相互作用組的蛋白質可以分為共同定義了功能性組的次級網絡，所述功能性組包括摺疊和從ER輸出需要的成分(參見如圖1-1)、介導ERAD的成分(參見如圖l-II)、指導胞吐和胞吞區室之間運輸的成分(參見如圖l-III)和在細胞表面的CFTR功能和調節中涉及的有可能的結合配偶體(bindingpartner)的成分(參見如圖IB-IV)。在細胞表面發現的相對於成熟的野生型CFTR存在的許多蛋白質相互作用證實所述資料庫的有效性(參見如表8)。例如，CFTR是活性由依賴cAMP的蛋白質激酶和蛋白質磷酸酶調節的門控氯離子通道(Guggino和Banks-Schlegel,2004)。蛋白質磷酸酶2A(PP2A)或PP2C在許多細胞類型的CFTR去磷酸化和CFTR活性的減量調解中具有作用。雖然大概由於它們的非常短暫的相互作用，激酶在任何測試過的細胞系中都沒有檢測為穩定的相互作用配偶體，但是野生型CFTR在幾乎所有的細胞系中都顯出與PP2A調節亞基和催化亞基二者強烈的相互作用(Thelin等，2005;Vastiau等，2005)。除了PP2A,鈉氫交換劑(sodium-hydrogenexchanger;NHE)同種型(isoform)3調節因子1和3(NHERF-1/3)(Mohler等，1999;Yun等，1997)也在CFTR蛋白質組中回收。NHERF位於肺細胞的頂端表面，並已充分證明其通過C末端的PDZ結構域與CFTR相互作用(Guggino和Banks-Schlegel,2004,AmJRespirCritCareMed170,815-820)。一種以前未知的相互作用因子包括4丐粒蛋白B(S100-A8),其是包含EF-手的胞質Ca"結合蛋白的去垢劑S100家族的成員(Donato,2003，MicroscResTech60,540-551;Heizmann，2002,MethodsMolBiol172,69-80)。已有暗示鈣粒蛋白B涉及到CF炎性途徑(Fanjul等，1995,AmJPhysiol268,C1241-1251;Renaud等,1994，BiochemBiophysResCommun201,1518-1525;Xu等，2003,JBiolChem278,7674-7682),暗示了可能的與CFTR肺病理生理學相關的調控作用。結果也說明在通常情況下，多個內吞作用轉運成分的鑑定說明CFTR內化和回收在正常功能中的重要性。第二組成分強調出野生型CFTR與質膜轉運系統的直接或間接的相互作用(參見如表7)。這些包括選蛋白相關受體L(sortilinrelatedreceptorL)(SORLl)、失去功能的同系物2(Dab2)、含有RalBPl相關Eps結構域的蛋白質(Reps1)、ARF4、網格蛋白輕鏈、空泡分選蛋白4(vacularsortingprotein4)(Vps4p)、夕卜蛋白(enthoprotin)和分選連才妾蛋白(sortingnexin)(SNX)4和9。SORL1具有單一跨膜結構域，其定位於回收內體並涉及到多個配體的內化(Jacobsen等，2001，JBiolChem276,22788-22796)。Dab2功能是作為貨物選擇性的內吞作用網格蛋白接頭(clathrinadaptor)(Bonifacino和Traub,2003,AnnuRevBiochem72,395-447;Mishra等,2002,EmboJ21,4915-4926),而Repsl能夠結合到包含CFTR中發現的NPF內化基序的蛋白質(Yamaguchi等，1997，JBiolChem272,31230-31234)並通過包含AP2、Dab2的貨物選"t奪系統偶:f關到內吞作用GTPase調控因子的Rabll-FIP2家族(Bilan等，2004,JCellSci117,1923-1935;Cullis等，2002,JBiolChem277,49158-49166;Gentzsch等，2004,MolBiolCell15,2684-2696;Swiatecka-Urban等，2005,JBiolChem280,36762-36772)。ARF4是在內吞作用/回收區室中顯示的小GTPase(Donaldson和Honda，2005,BiochemSocTrans33,639-642;Langhorst等，2005，CellMolLifeSci62，2228-2240;Morrow和Parton,2005,Traffic6,725-740)，其中VPS4很可能在從後期保內區室(lateendosomalcompartment)到融酶體的蛋白質運輸中發揮作用(Bowers等，2004,Traffic5,194-210;Hislop等，2004,JBiolChem279,22522-22531;Scheuring等，2001,JMolBiol312，469-480;Scott等，2005，EmboJ24,3658-3669)。外蛋白與網格蛋白接頭API相互作用，與位於高爾基體的含有y耳(y-earcontaining)的ARF結合蛋白質2相互作用(McPherson和Ritter,2005,MolNeurobiol32,73-87;Wasiak等,2003,FEBSLett555,437-442;Wasiak等，2002,JCellBiol158,855-862),並通過它的羧基末端結構域與網格蛋白重鏈的末端結構域相互作用來刺激網格蛋白包被的嚢泡的形成(Kalthoff等，2002,MolBiolCell13,4060-4073;Wasiak等，2003,同上；Wasiak等，2002,同上)，與網格蛋白輕鏈的回收(Ybe等，2003,Traffic4,850-856)和已有的網格蛋白在CFTR回收中的功能相一致(Cheng等，2004,JBiolChem279,1892-1898;Hu等，2001,BiochemJ354,561-572;Lukacs等,1997，BiochemJ328(Pt2),353-361;Peter等，2002,JBiolChem277，49952-49957;Picciano等，2003,AmJPhysiolCellPhysiol285,C1009-1018;Weixel和Bradbury,2000,JBiolChem275,3655-3660;Weixel和Bradbury,2001,PflugersArch443Suppl1,S70-74;Weixel和Bradbury,2001，JBiolChem276，46251-46259)。蛋白質相互作用組中鑑定的其他接頭包括Snx4和Snx9(Carlton等，2005，Traffic6,75-82;Lundmark和Carlsson，2003,JBiolChem278,46772-46781;Wasiak等，2003，JCellBiol158,855-862)。Snx9與AP2的卩附屬結構域(P-appendagedomain)結合併協助AP2在質膜上由網格蛋白和發動蛋白介導的內化作用中的功能(Lin等，2002,同上；Lundmark和Carlsson,2003,同上；Lundmark和Carlsson,2004,JBiolChem279，42694-42702;Lundmark和Carlsson,2005,MethodsEnzymol404,545-556;Soulet等，2005,MolBiolCell16,2058-2067;Teasdale等，2001,BiochemJ358,7-16)。已經報導，Snx4與兩性蛋白(amphiphysin)相互作用以有助於鐵傳遞蛋白(transferrin)和其他循環成分的內吞作用轉運(Hettema等，2003,EmboJ22,548-557;Leprince等，2003，JCellSci116,1937-1948)。儘管以上結果聚焦於影響因子和轉運成分，野生型和AF508CFTR都通過包含泛素和蛋白酶體成分的ERAD途徑降解(Amaral,2004,JMolNeurosci23,41-48)(參見如表8)。來自表達野生型和AF508CFTR的細胞中的蛋白質組都包括ERAD涉及的成分。這些成分包括易位/脫位Sec61通道和指導轉運至蛋白酶體的分子伴侶VCP/p97/Cdc48。蛋白酶體的作用通過蛋白質相互作用組中的26S蛋白酶體亞基和泛素化途徑成分的富集得到顯示(參見如表8)。有趣的是，蛋白質組中回收的泛素化結合蛋白(ubiqutinating-conjugatingUbc6的相互作用，Ubc6是一類經常引起ERAD包括CFTR的E2泛素結合酶(Lenk等，2002,JCellSci115,3007-3014)。這些連接酶是否僅在ER的水平上涉及到ERAD中，還是在細胞表面也通過胞吞作用/溶酶體定向的途徑參與CFTR的減量調節還未確定(Gentzsch等,2004,MolBiolCell;Sharma等，2004，JCellBiol164,923-933;Swiatecka-Urban等，2005，同上)。除了以上討論的那些實例之外，經預測，其他成分也具有與CFTR的直接或間接的相互作用(參見如表1和2)。以上是輔以MudPIT蛋白質組學技術靈敏度的系統生物學方法，採取MudPIT蛋白質組學技術用以鑑定對CFTR摺疊和轉運途徑有貢獻的瞬時相互作用，CFTR蛋白質相互作用組。儘管一些已經顯示與後-ER區室(post-ERcompartment)相互作用的蛋白質未得到鑑定，這可能反映了質語技術的局限性、在研究中優化以期一致的免疫沉澱條件和一個事實，那就是蛋白質相互作用組很可能是由非常動態過程組成的，因而瞬時相互作用是很難捕捉的並且高度依賴於細胞種類和生長狀況。包含所有已知相互作用的蛋白質相互作用組(參見如圖l)可以提供新的基線來啟動評估對CFTR在頂端細胞表面獲得和維持功能必要的許多不同的蛋白質複合物。Table5.後-ER與CFTR相互作用的已知功能的蛋白質*參考序列登陸碼蛋白質名稱％覆蓋率獨特整體細胞表面轉運因子和調節因子NM—004252NHERF-1**20%56NM—004785NHERF-2***14%4麗001285CECA12%22後ER運輸系統的成分NM—003105NM016760SORL1網格蛋白，輕鏈1%13%131211麗_003794分選連接蛋白43%35雨—014666外蛋白9%4NM—007479ARF416%24NM一—023118Dab25%33NM—_016451卩COP5%22NM—013245VPS4A5%22麗_009503VCP7%22僱__009048Repsl6%22NM一016224分選連接蛋白95%22恵008028閥蛋白25%22*顯示的是如通過質譜鑑定的百分比序列覆蓋率(％覆蓋率)，獨特肽譜數(獨特)，和整體肽譜數(整體)**顯示的是BHK細胞的肽數據。對於HT29為11%,2,2。***顯示的是Calu-3細胞的肽數據。對於HT29為20%,7,10。Table6.與CFTR結合的降解蛋白質組參考序列AF508WT#登陸碼蛋白質名稱A*B*C*A*B*C*麗一—017314泛素C6%51175%336NM_011664泛素B16%55212%16NM一007126VCP/p97/Cdc4825%10147%22蛋白酶體26S，非腺苷三考fe"而臺午敗NM—002808酶,213%784%22NM一—008944蛋白酶體,a型217%2NM—002795蛋白酶體,P型,324%33NM_011185蛋白酶體,P型123%33NM一O11967NM—006503NM—008948NM—002796NM—002815NM—013336NM—004652NM—000462NM—004238薩018144蛋白酶體，a型523%33蛋白酶體26S腺苷三磷酸酶，412%23蛋白酶體26S,腺苦三磷酸酶38%23蛋白酶體，卩型,416%22蛋白酶體26S，非腺香三磷酸酶,ll5%22Sec61a亞基同種型111%4泛素特異性蛋白酶91%2泛素蛋白連接酶E3A6%2THR相互作用因子122%2Sec61,a亞基211%27222#從BHK(野生型CFTR)、Calu-3、HT29、T84細胞系回收的蛋白質*顯示的是如通過質鐠鑑定的百分比序列覆蓋率(A)，獨特肽譜的數目(B),以及整體肽譜的數目(C)。Table7:表達野生型CFTR的細胞系的CFTR蛋白質組序列覆蓋率(％)蛋白RefSeqAC基因名稱BHKCalu-3HT29T84序號wt1而—000492嚢性纖維化跨膜傳導調控蛋白0.5990.5260.4550.4072雨_008379核周蛋白(輸入蛋白(importin))卩10.5790.2870.0680.0753NM一009037網鉤結合蛋白(reticulocalbin)0.4954NM006597Hsc700.46603750.354NM—001539Hsp40-Al啊2)0.4030.0810.1136NM—006391輸入蛋白70.3340.0780.0467NM—022310GRP780.3280.1880.137formulaseeoriginaldocumentpage66NM—005507NM—005880畫002715NM001316僱002717NM—011992NM—002901NM—008302麗一O12030NM—006098NM—002902NM—011313NM—018243NM—009906NM—002882麗—007479NM—003400麗002716激動蛋白絲切蛋白0.307(cofilin)1(非月幾肉)Hsp40-A2(Hdj3)0.2820.133蛋白質磷酸酶20.2750.11(原為2A)，催化亞基，a同種型CSEl染色體分離1樣0.2550.1430.048(酵母)蛋白質磷酸酶20.248(原為2A),調節亞基B(PR52),a同種型網4丐結合蛋白20.221網4丐結合蛋白1,0.2150.145EF手形釣結合結構域Hsp90f30.2140.1710.076NHERJF-10.1970.112鳥噤呤核苷酸結合蛋白0.189(G蛋白)，卩多肽2樣1網4丐結合蛋白2,EF手形4弓結合結構域S1004丐結合蛋白A6(鈣周期蛋白)假設蛋白FLJ108490.175蠟樣質-脂褐素增多症，0.16神經的2RAN結合蛋白10.159ADP-核糖基化因子40.156核輸出蛋白10.154(CRM1同源物,酵母)蛋白質磷酸酶20.151(原為2A),調節亞基A0.1830.1860.1230.180.0930.0530.142(PR65),卩同種型28NM-_001681SERCA20.150.09229畫一—021594ERM-結合磷蛋白0.14930麗一—005998含有TCPl的伴侶蛋白，亞基3(y)0.1431NM_007637伴侶蛋白亞基5(s)0.13132NM-—011664泛素B0.1210.07233畫_—021671db830.11734NM_013336蛋白質轉運蛋白SEC61ot亞基同種型1o.m0.1130.09935麗一028152MMS19(MET18酉良酒酵母)-樣0.1136NM一004282BAG-20.10437NM一001746釣聯接蛋白0.0960.09538NM——012470轉運蛋白-SR(transportin-SR)0.09439麗一025291類固醇受體RNA激活因子10.09140麗一—013686TCPl0.0941NM_005345Hsp70-1AO駕0.3150.08342NM一—020645染色體11開讀框140.08343NM——018307ras同源物基因家族，成員Tl0.08144NM一—021979Hsp70-20.0780.1280.1020.07845NM_0012194丐腔蛋白0.070.11146NM—006430含有TCPl的伴侶蛋白，亞基4(S)0.06747NM_006310氨肽酶噤呤黴素敏感性0.06648NM一—006325RAN，成員RAS0.065癌基因家族50麗-_005348Hsp90,a0.06151NM-—007995纖維膠凝蛋白A0.057(ficolinA)52NM_019685RuvB樣蛋白10.05753NM—004461苯丙氨酸-tRNA0.055合成酶樣54雨_000917前膠原-脯氨酸，0.0542-酮戊二酸4-雙加氧酶(脯氨酸4-羥化酶)，a多肽I55僱_—019942隔蛋白6(septin6)0.04956NM_017314泛素C0.04657NM_—004522驅動蛋白家族成員5C0.0458NM_007508腺苷三磷酸酶，0.039H+轉運,V1亞基A,同種型159NM—030706三基序蛋白2(tripartite0.039motifprotein2)60NM—009955二氫嘧口定酶樣20.03761NM_032069穀氨酸受體0.036相互作用蛋白62NM—002155Hsp70B'0.03463NM_003794分選連接蛋白40.03364NM一033309假設蛋白MGC46550.03265NM—016338輸入蛋白110.03266NM_—004521驅動蛋白家族成員5B0.02867鹿一007054驅動蛋白家族成員3A0.02768NM一008633微管相關蛋白40.02569NM—023115原鈣粘著蛋白150.024(protocadherin15)70麗016448RA調節性核基質0,0150.1070.0340.102相關蛋白71NM_—000038腺瘤病結腸息肉病0.01472NM一—004624血管活性腸肽受體10.01473麗_004652泛素特異性蛋白酶9，0.014X染色體(肥胖小眼面(fatfacets)樣果蠅)74NM_022954MEGF10.01275NM_000296多嚢腎病10.009(常染色體顯性)76NM—000層半胱氨酸蛋白酶0.337抑制劑B(stefmB)77麗一007108轉錄延伸因子B(SIII),0.314多肽2(18kDa,延伸蛋白B(elonginB))78NM_002965S1004丐結合蛋白A90,246(4丐粒蛋白B)79NM_畫008143鳥噤呤核苷酸結合蛋白，0.243卩2,相關序列180NM_007355熱《木克90kDa蛋白1,卩0.22981NM—002818蛋白酶體(前體，巨0.226蛋白因子(macropain))激活因子亞基2(PA28p)82NM_002306凝集素,半乳糖苷0,212結合性,可溶性,3(半乳凝素3)83NM—017147激動蛋白絲切蛋白10.20584NM_002963S100《丐結合蛋白0.198A7(芥子氣1)85僱_006070TRK融合基因0.19586僱016647間質幹細胞蛋白0.1780.3980.3140.1980.178878889909192939596979899100101102NM—021199NM—004785畫—002156畫—005527固014225NM012111NM—006415NM一004208畫—022934NM—021863NM—019390NM000462NM002808NM—024334NM004327DSCD75闢^化物醌還原酶樣(酵母)NHERF-2熱休克60kDa蛋白1(伴侶蛋白)熱休克70kDa蛋白1樣蛋白質磷酸酶2(原為2A),調節亞基A(PR65),a同種型Ahal,熱〗木克90kDa蛋白腺苷三磷酸酶同源物1激活因子(酵母)絲氨酸棕櫚醯轉移酶，長鏈基部亞基1程序性細胞死亡8(細胞凋亡誘導因子)DnaJ樣蛋白睪丸特異性熱休克蛋白相關基因hst70核纖層蛋白A泛素蛋白連接酶E3A(人乳頭瘤病毒E6相關蛋白，Angelman綜合症)蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)26S亞基，非腺苷三磷酸酶,2假設蛋白MGC3222斷裂點簇區0.1510.0730.1510.1390,1330.1310.1260.340.1210.1160.0930.0810.0620.0580.0550.040.0220.0170.1980.1090.0810.1030.0790.162103NM—001035104NM_—005648106雨_005389107NM一—008786108NM_013232109NM一—010481110麗_—000117112麗一—018144114麗_009795115麗——007126116僱—030971117麗一—022314118NM—_006149119NM——014612120NM_—016451121NM_005358122NM013245藍諾定(ryanodine)受體2(心的)轉錄延伸因子B(SIII),多肽1(15kDa,延伸蛋白C)蛋白-L-異天冬氨酸(D-天冬氨酸)O-轉曱基酶蛋白-L-異天冬氨酸(D-天冬氨酸)O-轉曱基酶l程序性細胞死亡6GRP75伊默菌素(埃德二氏肌營養不良)很可能為小鼠SEC61的直向同系物，a亞基2(釀酒酵母)《丐蛋白酶,小亞基1含纈酪肽蛋白與大鼠三羧酸載體樣蛋白相似原肌球蛋白3,y凝集素，半乳糖苷結合性，可溶性，4(半乳凝素4)染色體9開讀框10外被體蛋白複合物，亞基卩LIM域僅7空泡蛋白分選(vacuolarproteinsorting)4A(酵母)0.0060.3570.330.6170.2910.2150.1890.2620.1810.1130.1080.1340.0960.0930.0850.3490.0560.0530.0510.0510.050.046123NM_016739GPI-錨定膜蛋白10.046124NM一_007245共濟失調蛋白20.044相關蛋白125NM一—004238曱狀腺激素受體0.015相互作用因子12126NM_006904蛋白激酶,DNA活化的，0.0140.013催化多肽127NM一031819FAT胂瘤抑制因子0.004(果蠅)同源物128NM一001540熱休克27kDa蛋白10.346129NM一013474載脂蛋白A-II0.324130麗——000611CD59抗原pi8-200.297(單克隆抗體16.3A5,EJ16，EJ30,EL32和G344鑑定的抗原)131NM—一031469SH3域結合性富穀氨酸0.29蛋白樣2132麗_023009MARCKS樣蛋白質0.251133麗一018362lin-7同源物C0.228(秀麗隱杆線蟲)134NM一006118HS1結合蛋白0.201135NM——014666外蛋白0.174136僱_—023945跨膜4_域,亞家族A,0.17成員5137畫_002067鳥嘌呤核苷酸結合蛋白0.162(G蛋白)，all(Gq類)138NM一001833網格蛋白,輕鏈多肽0.138(Lea)139NM——002354肺瘤相關的鈣信號0.131轉導物1140NM018188假設蛋白FLJ107090.128NM-_017724亮氨酸富含重複0.118(FLII中)相互作用蛋白2142NM—016963原肌球調節蛋白30.116143NM_031033鳥噤呤核苷酸結合0.111蛋白a11亞基144而_004447表皮生長因子受體0.101途徑底物8145薩一002070鳥噪呤核苷酸結合蛋白0.082(G蛋白)，a抑制活性多肽2146NM_001835網格蛋白,重鏈多肽樣10.077147麗一002087顆粒體蛋白0.074148NM——019653具有SOCS盒1的0.074含WD-40-重複序列的蛋白149薩一009386緊密連接蛋白10.073150NM—002778原皂化蛋白(Prosaposin)0.071(變體高歇病和變體異染性白質營養不良)151NM_004360鈣黏著蛋白1,1型，0.068E-鈣黏著蛋白(上皮的)152NM—031922Repsl0.062153NM一014935磷酸肌醇3-磷酸-0.06結合蛋白-3154NM—022098布I設蛋白LOC639290.055155NM_001343Dab20.053156麗_004475閥蛋白20,05157NM_016224分選連接蛋白90.05158薩014271白細胞介素10.049受體輔助蛋白樣1159NM_014812KARP-l-結合蛋白0.049160NM—002958RYK受體樣酪氨酸激酶0.048161麗——033299磷脂酶D基因20.045162麗一—023063贅生物中0.044丟失的上皮蛋白163雨——014428緊密連接蛋白30.039(閉鎖小帶3)164麗一—031382睪丸表達基因160.037165麗__033049粘蛋白13,上皮跨膜的0.037166麗—016745腺苷三磷酸酶，0.0320&++轉運,廣泛存在的167麗—031823Wolfram綜合症10.027168NM—001115腺苷酸環化酶8(腦的)0.024169麗一007454AP-l,卩1亞基0.024170NM一001285CLCA10,023171NM一—003253T細胞淋巴瘤0.023浸潤和轉移1172麗一003174超絨毛蛋白(supervillin)0.019173麗_015756施魯姆(shroom)0.018174麗003105S0RL10.01Table8:野生型和AF508CFTRBHK蛋白質組的比較序列』蛋白BHK質號RefseqAC基因名稱蓋率(％)BHK△F508野生型1麗_000492嚢性纖維化跨膜傳導調控蛋白0.5690.5992NM—008379核周蛋白(輸入蛋白)卩10.2090.5793NM一009037網4丐結合蛋白0.2740.4954NM_006597Hsc700.5820.4665NM—001539Hsp40扁Al(Hdj2)0.3070.4036NM—006391輸入蛋白70.0437鹿—_022310GRP780.3978鹿——005507激動蛋白絲切蛋白1(非肌肉)0.3379雨—005880Hsp40-A2(Hdj3)0.318蛋白質磷酸酶2(原為2A),10NM-—002715催化亞基，a同種型0.08411NM—001316CSE1染色體分離1樣(酵母)0.045蛋白質磷酸酶2(原為2A),12NM——002717調節亞基B(PR52)，a同種型0.23513NM_023565染色體分離l樣(酉良酒酵母)0.04514NM_011992網4丐結合蛋白20.087網4丐結合蛋白1,15NM一002901EF手形釣結合結構域0.22416NM—008302Hsp卯，卩0.35817NM一012030NHERF-10.152鳥噤呤核苷酸結合蛋白(G蛋白)，18NM_J306098P多肽2樣1網鉤結合蛋白2,19NM__002902EF手形鈣結合結構域S1004丐結合蛋白A620而一011313(鈣周期蛋白)22NM—018243假設蛋白FLJ108490.18423NM——009906蠟樣質-脂褐素增多症,神經的224NM一002882RAN結合蛋白125NM—007479ADP-核糖基化因子426NM—003400核輸出蛋白1(CRM1同源物,酵母)蛋白質磷酸酶2(原為2A),27NM—002716調節亞基A(PR65),(3同種型0.20128NM_001681SERCA20.08529NM021594ERM結合磷蛋白0.1040.3340.3280.3070,2820.2750.2550.2480.2380.2210.2150.2140.1970.1890.1830.180.1750.160.1590.1560.1540.1510.150.14930NM—005998包含TCP1的伴侶蛋白,亞基3(y)0.1431NM—007637伴4呂蛋白亞基5(s)0.13132NM—011664泛素B0.1610.12133NM—021671db830.117蛋白質轉運蛋白SEC6134NM—013336a亞基同種型l0.11135NM—028152MMS19(MET18釀酒酵母)樣0.1136NM—004282BAG-20.280.10437NM—001746鈣聯接蛋白0.1640.09638NM—012470轉運蛋白-SR0.09439NM一025291類固醇受體RNA激活因子10.09140NM:一013686TCPl0.0950.0941NM—005345Hsp70-1A0.1930.08342NM—020645染色體11開讀框140.08343NM—018307ras同源物基因家族,成員Tl0.08144NM—021979Hsp70-20.1560.07845NM—0012194丐月空蛋白0.0746NM—006430包含TCPl的伴倡蛋白，亞基4(S)0.06747NM—006310氨肽酶噤呤黴素敏感0.06648NM—006325RAN,成員RAS癌基因家族0.06550NM—005348Hsp90，a0.3920.06151NM—007995纖維膠凝蛋白A0.05752NM—019685RuvB樣蛋白質l0.1430.05753NM—004461苯丙氨酸-tRNA合成酶樣0.055前膠原-脯氨酸，2-酮戊二酸4—雙加氧酶(脯氛酸4-幾化酶)，54NM—000917a多肽I0.05455NM—019942隔蛋白60.04956NM—017314泛素C0.060.04657NM004522驅動蛋白家族成員5C0.0610.04腺苷三磷酸酶，H+轉運58NM_—007508VI亞基A,同種型10,03959NM-—030706三基序蛋白20.03960NM—009955二氫嘧啶酶樣20.03761NM—032069穀氨酸受體相互作用蛋白0.03662NM—_002155Hsp70B'0.0960.03463NM_003794分選連接蛋白40.03364NM_—0333094支設蛋白MGC46550.0320.03265NM——016338輸入蛋白110.0450.03266NM一—004521驅動蛋白家族成員5B0駕0.02867NM—007054驅動蛋白家族成員3A0.02768NM一—008633微管相關蛋白40.02569畫一_023115原鈣粘著蛋白150週70NM一016448RA調節性核基質相關蛋白0.0150.01571雨一000038^^瘤病結腸息肉病0.0130.01472NM一004624血管活性腸肽受體1泛素特異性蛋白酶9，0.01473NM一004652X染色體(肥胖小眼面樣果蠅)0.01474雨一—022954MEGF10.01275僱一■296多嚢腎病1(常染色體顯性)蛋白質磷酸酶2(原為2A),0.0310.00976NM一014225調節亞基A(PR65),a同種型0.41378NM一022934DnaJ樣蛋白0.3479NM一—010481GRP750.33780NM一.007175染色體8開讀框20.32481NM一002965S1004丐結合蛋白A9(4丐粒蛋白B)0.26382畫一—007126含纈酪肽蛋白蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)0.24683NM一002795亞基，P型，30.23984麗一005866I型sigma受體0.229蛋白酶體c前體，巨蛋白因子;)85NM—011185亞基，卩型i0.229蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)86NM——002793亞基，p型，i0.228蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)87NM—011967亞基,a型50.228與秀麗隱杆線蟲蛋白質88NM—006459C42C1.9相似0.171蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)89NM——008944亞基，a型20.17190NM_007688激動蛋白絲切蛋白2,肌肉0.16991NM—010223FKBP80.166蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)92NM—011971亞基,P型30.16693NM一—024661々I設蛋白FLJ124360.162蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)94畫一002796亞基，P型，40.15995NM一006601p230.15696NM一019766端粒酶結合蛋白，p230.15697NM—025736RIKENcDNA4921531Gl4基因0.145鳥噤呤核苷酸結合蛋白，98NM—008143卩2,相關序列10.14299畫一000942親環蛋白(cyclophilin)B0.13蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)100麗一00280826S亞基,非腺苷三磷酸酶,20.129蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)101NM—00650326S亞基,腺苦三磷酸酶,40.124102麗一013863BAG-30.121103僱一016737H叩0.114104NM一013559Hspl050.095105NM—016127假設蛋白MGC87210.088蛋白質磷酸酶2a,催化亞基，106僱_017374卩同種型0細107NM-—011889隔蛋白30.082108NM-—014673KIAA0103基因產物0.081110雨—016742Cdc370.079蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)111NM一00894826S亞基,腺苷三磷酸酶30.077112NM—018085輸入蛋白90.077113NM—025754RIKENcDNA4933425L11基因0.074114NM-—018448TBP相互作用蛋白0.072115NM_—002271核周蛋白(輸入蛋白)卩30.063蛋白質磷酸酶2(原為2A),116NM—004576調節亞基B(PR52)，卩同種型0.063117NM—015129隔蛋白60.062118麗一—011304RuvB樣蛋白20.06119僱_016395丁酸鹽誘導的轉錄物10.056120雨一009864鈣黏著蛋白10.055很可能為包含小鼠膜結合C2域121NM_015292的蛋白的直向同系物0.053蛋白酶體(前體，巨蛋白因子)122NM—00281526S亞基，非腺苷三磷酸酶，110.05123NM—018695erbb2相互作用蛋白0.048124NM一008803磷酸二酯酶8A0.045125NM—004734雙皮層蛋白和CaM激酶樣10.044126NM_008450驅動蛋白20.044127NM_006640MLL隔蛋白樣融合0.042穀氨酸受體，親離子的，128NM—031508紅藻氨酸鹽50.042129NM—019548滋養蛋白(trophinin)0.041130NM—004320SERCA10.033131NM_017249含有膜結合C2域的蛋白0.026132NM_000014a-2-巨球蛋白0.023133NM—019120原4丐粘著蛋白卩80.022134NM—004274A激酶(PRKA)錨蛋白60.019含三核苷酸重複11135NM—005120(THR相關蛋白，230kDa亞基)0.018136NM—019226動力蛋白，細胞質的,重鏈10.015137NM—031819FAT肺瘤抑制因子(果蠅)同源物0.008138NM—001036藍諾定受體30.005Ahal，熱休克卯kDa蛋白腺苷三磷酸酶同源物1139NM一012111激活因子(酵母)0.150.34實施例2:CFTRi普關聯(CFTRSpectralinkage)從蛋白質相互作用組觀察的大量相互作用(wealthofinteractions)(參見實施例1),從ER中輸出AF508的缺陷的基礎是通過了解最普通的CF的形式的方法來考察的。響應於Phe508缺失的蛋白質摺疊能量學上的改變(Sekijima等，2005,Cell121,73-85;Strickland和Thomas,1997,JBiolChem272,25421-25424)導致AF508CFTR偶聯到COPII出芽系統的失敗(COPIIbuddingsystem)(Wang等,1998，FEBSLett427，103)，導致ER相關的降解(ERAD)(Nishikawa2005,JBiochem(Tokyo)137,551)。現在認為通過ERAD(Sekijima等，2005，同上)途徑顯著地影響CFTR摺疊的分子伴侶成分包括在ER的腔內存在的鉤聯接蛋白(Farinha和Amaral,2005,MolCellBiol25,5242;Okiyoneda等，2004,MolBiolCell15,563;Pind等，1994，JBiolChem269,12784)，以及胞質分子伴侶複合物Hsc-Hsp70/40和Hsp卯(Albert等，2004,MolBiolCell15,4003;Amaral,2004,同上;Loo等，1998,EmboJ17,6879;Meacham等，1999,EmboJ18,1492;Meacham等，2001,NatCellBiol3,100;Strickland等，1997,JBiolChem272,25421;Younger等，2004，同上)。與這些結果相一致的是，依據回收的整體譜(參見如表7),表達野生型CFTR的細胞的蛋白質組(參見如圖1)顯示了與鈣聯接蛋白、Hsc-Hsp70/40和Hsp卯胞質內分子伴侶的強大關聯。這些分子伴侶組分很有可能定義有助於野生型CFTR摺疊的核心系統(圖2),如同對其他蛋白質已經觀察到的那樣(McClellan等，2005,NatCellBiol7,736-741)。結果顯示，依據回收的整體譜(參見如表7),表達野生型CFTR的細胞的蛋白質組(參見如圖1)顯示了與4丐聯接蛋白、Hsc-Hsp70/40和Hsp卯胞質內分子伴侶的強大關聯。這些結果與如下的報導一致現在認為會通過ERAF(Sekijima等，2005,同上)途徑顯著影響CFTR摺疊的分子伴侶成分包括在ER腔內發現的鈣聯接蛋白(Farinha和Amaral,2005,同上；Okiyoneda等，2004,同上；Pind等，1994,JBiolChem269，12784-12788),以及胞質內的分子伴佔複合物Hsc-Hsp70/40和Hsp90(Albert等，2004,同上；Amaral，2004，同上；Loo等，1998,同上；Meacham等，1999,同上；Meacham等，2001,同上；Strickland等，1997,同上；Younger等，2004,同上)。這些分子伴侶組分很有可能定義了有助於野生型CFTR摺疊的核心系統(參見如圖2A),如同對於其他蛋白質已經觀察到的那樣(McCldlan等，2005，同上)。Table9.CFTRER相關摺疊蛋白質組*AF508CFTR野生型CFTR參考序列％序列％序列AC蛋白質名稱覆蓋率獨特整體覆蓋率獨特整體ABCABCNM—000492CFTR57NM一024351Hsc7060NM——022310GRP78#40NM—021979Hsp70-216NM_001746鈣聯接蛋白#16NM—008302Hsp，36恵010481GRP753422924816033341726636948391323085331737235787171352104724492111182340NM—005348Hsp90392437645NM一022934DnaJ樣蛋白Hsp40陽Al341135NM_001539卿)311033401325NM—005345Hsp70-1A191220846NM_004282BAG-2Hsp40-A2287201022NM—005880,)3291928616NM_—002155Hsp70B'1081433NM一013559Hspl05106NM—013686TCP110393NM一—010223FKBP38174NM—013863BAG-3124麗一016737Hop1144NM——016742Cdc3782NM—■942親環蛋白B#1322麗一006601p231622NM一012111Ahal15715341020NM—009037網釣結合蛋白#網鈞結合蛋白2758501419NM——0119922#93422612NM001219鈞腔蛋白#7;33*表示的是在檢驗的細胞系中如通過質譜檢測(圖1)，BHK細胞中相互作用的蛋白質，它們的百分比序列覆蓋率(A),獨特譜的數目(B)和整體譜的數目(C)。"ER腔內分子伴侶。實施例3:CFTR和AF508的定位和相互作用為了鑑定蛋白質相互作用組中AF508偶聯到ER輸出系統失敗所涉及的成分，將從BHK細胞免疫沉澱的野生型和AF508CFTR蛋白質組進行比較。將不表達CFTR的親本BHK細胞系用作非特異性相互作用的陰性對照(參見如圖2)。圖2是對ER摺疊網絡的一系列的描述。表8顯示了蛋白質陣列的結果，這些蛋白質是從不表達CFTR的BHK細胞(對照)或那些表達AF508或野生型CFTR的細胞中用MudPIT回收的，並通過質譜以分級序列覆蓋率的順序排列。圖2A的草圖描述的是包含CFTR的ER摺疊和降解的蛋白質組網絡的複合視圖(compositeview)。淺灰邊界表示與CFTR潛在的直接或間接相互作用；深色邊界表示依據來自HPRD、BIND和IntAct蛋白質相互作用資料庫的數據已知的成分之間的物理相互作用。淺綠色圈表示核心摺疊分子伴侶；淺粉色圈表示調控性輔分子伴侶和ERAD成分。圖2B的SDS-PAGE免疫印跡圖像顯示的是在表達野生型和AF508CFTR的細胞中觀察到的條帶B和C典型的穩態水平。更多的方法學信息請參見實施例1。對於SDS-PAGE和免疫印跡，細胞用500|il冰冷的PBS洗兩次並通過加入添加了1%TritonX-100和每ml裂解緩衝液2mg的蛋白酶抑制劑混合物(cocktail)(Pierce)的45jal新鮮製備的TBS(50mMTris-HClpH7.0,150mMNaCl)來裂解，在冰上溫育30分鐘，不時攪動。收集裂解物，在16,000xg,4。C下離心20分鐘並收集上清做蛋白質濃度分析。裂解物(每條泳道蛋白質總量25jug)通過SDS-PAGE分離並轉移到硝化纖維素(nitrocellulose)膜上作Western印跡分析。將肌動蛋白的免疫印跡(Chemicon,Temecula,CA)用作針對樣品上樣一致性的額外內在對照(未顯示)。CFTR是用針對在第二核苷酸結合結構域C末端處的表位的單克隆抗體(M3A7腹水)(Kartner等，1992)來檢測的。p23用p23腹水(JJ3，Abeam,Cambridge,MA)來檢測，HOP用兔多克隆血清來檢測，FKBP8用兔多克隆血清來檢測，而Ahal用兔Ahal多克隆血清來檢測。同樣用到的是針對皰疹口腔炎病毒糖蛋白(VSV-G)C末端胞質尾區的單克隆抗體(P5D4)。每個感興趣的蛋白的量通過使用AlphalnnotechFluorochemSP(Alphalnnotech,SanLeandro,CA)的光密度法來量化。實驗均以一式三份進行，平均值和平均值的標準差是用不配對雙尾T檢驗(unpairedtwo-tailedt-test)得到的。結果顯示，在生理溫度(37。C)下，野生型CFTR主要(〉80-90%)在條帶C中，條帶C是細胞表面存在的經過高爾基體處理的糖形(glycoform),而在條帶B中檢測到其餘的CFTR,條帶B是與ER相關的核心糖基化的糖形(參見如圖2B)。與之相反的是，37。C表達AF508的細胞中，由於顯著降低的為了輸出的摺疊和穩定性，通常只有5-20%的蛋白質(反映細胞類型和生長狀況)可以在條帶C中檢測到。在這種情況下，蛋白質很大程度上限制在未成熟的核心糖基化的條帶B的ER糖形(參見如圖2B),其中將所述蛋白定向到ERAD(Jensen等，1995,Cell83,129-135;WardandKopito，1994,JBiolChem269,25710-25718;Ward等，1995，Cell83,121-127)。除了很可能包含在ERAD中的成分(表6),ER摺疊蛋白質相互作用組(參見如圖2A)揭示了AF508也像野生型CFTR—樣，顯示出與腔鉤聯接蛋白和胞質的Hsc-Hsp70/40和Hsp90胞質成分的強烈相互作用(參見如表7)。這些結果說明，AF508與指導野生型CFTR摺疊的核心系統相互作用(參見如圖2A)。實施例4:在AF508ER蛋白質相互作用組中的Hsp卯輔分子伴侶成分分析AF508ER蛋白質相互作用組中Hsp90輔分子伴侶成分的存在性。多種主顧蛋白的Hsp90依賴性摺疊受到輔分子伴侶的瞬時調控(Picard,2002,CellMolLifeSci59，1640-1648;Young等，2003,同上;Young等，2001，同上)。以往的研究已經顯示，AF508的摺疊是動力學上受損的(Qu等，1997,JBioenergBiomembr29,483-490;Qu等，1997,JBiolChem272,15739-15744;Qu和Thomas,1996,JBiolChem271,7261-7264)。因此，可以預計，在AF508蛋白質相互作用組中存在的蛋白質會包括那些與對Phe508缺失敏感的摺疊中間物相關的蛋白質，所述摺疊中間物可能響應於摺疊途徑中的動力缺陷而積累。結果顯示，AF508ER蛋白質相互作用組中許多Hsp90輔分子伴侶成分通常在野生型蛋白質組中^r測不到(參見如圖2A)。這一發現與對AF508中Phe508缺失敏感的摺疊中間物積累的預測相一致。通常在野生型蛋白質組中檢測不到的AF508ER蛋白質相互作用組中的Hsp90輔分子伴侶成分包括了Hsc-Hsp70/Hsp90組織蛋白(HOP)、p23、Cdc37、抑免蛋白FKBP8和Ahal。已經研究了Hsp90輔分子伴侶作為Hsp90-主顧相互作用的調控因子調節亞穩定的主顧蛋白摺疊的作用，所述主顧蛋白包括類固醇激素受體(SHR)和信號轉導激酶(Wegele,等，2004,同上)。檢測到的其它分子伴侶調控因子包括BAG-2/3,已經研究了這些調控因子在調節CFTR降解過程中的Hsc-Hsp70功能(Amdt等，2005,MolBiolCell;Dai等，2005,JBiolChem280,37634)、Hspl05和摺疊分子伴侶TCP1中的功能。Hsc-Hsp70/40、Hsp90和有可能包含在它們的調控中的蛋白質之間已知的相互作用網絡闡明了用於ER輸出的AF508和野生型CFTR摺疊路徑的潛在的複雜性(參見如圖2A)。實施例5:HEK293細胞中輔分子伴侶對AF508摺疊的影響穩定表達AF508的HEK293細胞中關鍵輔分子伴侶調控因子p23的作用(Pratt和Toft,2003，ExpBiolMed(Maywood)228,111-133;Prodromou和Pearl,2003,CurrCancerDrugTargets3,301-323;Wegele等，2004,同上)在幾個溫度下進行了測定。P23與HOP和FKBP8—起在環狀的Hsp90-主顧相互作用途徑中影響ATP依賴性的摺疊步驟。為了開始確定Hsp卯在AF508CFTR摺疊和輸出中的作用，使用dsRNA和瞬時轉染來控制選^:的影響環狀Hsp90-主顧相互作用途徑中ATP依賴性摺疊步驟的Hsp90輔分子伴侶的表達，所述輔分子伴倡包括p23(參見實施例5)、HOP(參見實施例6)和FKBP8(參見實施例7)。在Hsc-Hsp70/40複合物識別例如CFTR的主顧分子之後，遍在的輔分子伴侶HOP將新生的Hsc-Hsp70/40-主顧複合物連接到Hsp90(Johnson等，1998,JBiolChem273,3679-3686)。然後，輔分子伴侶調控因子p23在ATP存在的情況下取代Hsc-Hsp70/40和HOP而形成成熟的ATP結合狀態下的Hsp90-p23-主顧複合物(Wegele等，2004,同上)。包含p23的Hsp90-主顧複合物的循環由抑免蛋白調控(Johnson和Toft,1994,JBiolChem269,24989-24993;Wu等，2004,ProcNatlAcadSciUSA101,8348-8353)。在原型Hsp卯主顧蛋白類固醇激素受體(SHR)(Pratt和Toft,2003,ExpBiolMed(Maywood)228,111-133;Prodromou和Pearl,2003，同上)的情況下，抑免蛋白FKBP52的缺失使中間物Hsp90-主顧輔分子伴侶複合物去穩定而阻止了激素的裝載(Cheung-Flynn等，2005,MolEndocrinol19,1654-1666)。將HEK293細胞保持在如上所述的添加10%FBS和Pen/Strep的DMEM中。穩定表達AF508CFTR的HEK293細胞保持在如上相同的培養基加150jag/ml潮黴素B中。用dsRNA和瞬時轉染控制p23的蛋白質表達水平。從ATCC(Manassas,VA)購買p23的cDNA克隆並將其亞克隆到pcDNA表達載體，並且通過DNA測序分析炎症編碼區的序列。dsRNA溶液如下製備在12孔皿的每個孔中混合血清和無抗生素的DMEM或MEM-a，DMEM或MEM-a含有工作濃度為0.6|LiM的所示dsRNA(人p23,Ambion(Austin,TX)目錄號16704ID18391)，和6|il的HiPerFect(Qiagen,Valencia,CA)。將對照dsRNA(Dharmacon目錄號CONJB-000015)按照與測試dsRNA相等的濃度加入。將dsRNA混合物(100iil)加入以終濃度50nM加入含有1.1ml合適培養基的小室中，在37。C/5。/。C02條件下培養48小時。此培養完成之後，將培養液除去並替換為1.1ml新鮮的完全培養基和100pl新鮮製備的dsRNA溶液並在37°C/5%C02條件下再培養33小時。如有說明，接下來將細胞轉移到30。C/5%C02培養器或保持在37。C/5%C02條件下繼續培養15小時。人p23的過量表達是如前所述通過痘苗病毒的感染用表達CFTRAF508和p23的質粒共轉化HEK293來進行(Wang等，2004,同上)。對於在許可溫度下分析的樣品，將細胞在收穫之前轉到30。C培養15小時。SDS-PAGE和免疫印跡如實施例3所述。圖3是描述Hsp90輔分子伴侶p23對AF508的摺疊和從ER中輸出的影響的一系列條線圖。圖3A是一對顯示ER糖形AF508(B)、細胞表面糖形AF508(C)和p23表達的穩態池的百分比最高水平的條線圖。使用針對p23的人dsRNA(左側小圖)來降低37。C下所示蛋白質的表達。用亂序的dsRNA(scrambleddsRNA)作為對照。使用針對p23的人dsRNA(右側小圖)在37。C下過量表達所示蛋白質。嵌入的小圖是ER糖形(條帶B)和細胞表面糖形(條帶C)的穩態池的SDS-PAGE免疫印記圖像。使用免疫印跡測定條帶B和C的穩態池。圖3B是如圖3A所描述的，除了細胞是在許可溫度(30。)下培養以促進摺疊和從ER中輸出。星號("表明統計學顯著性(p^).05)。將實驗以一式三份獨立地重複至少三次並顯示代表性的結果。更多的方法學信息請參見實施例5。結果顯示，dsRNA使p23水平降低70%導致條帶B的ER糖形的穩態池和條帶C的細胞表面糖形的小池相對於亂序的模擬對照均有相當的(60-70%)減弱(參見如圖3A,左側小圖)。相反，過量表達(3-5倍)部分地穩定了條帶B,但是沒有造成條帶C的顯著增加(參見如圖3A,右側小圖)。有趣的是，dsRNA使p23水平降低對於HEK293野生型CFTR條帶B和C的穩定性具有相似的影響(未顯示)，說明p23影響正常摺疊的動力學。由於AF508CFTR是溫度敏感的摺疊突變體(Denning等，1992，Nature358,761-764)，細胞在許可溫度(30。)而非37。C培養時可提供能量學上更有利的摺疊環境，導致顯著水平的定位於細胞表面的AF508。結果顯示，在穩態(從37。C到30。C溫度轉換之後的15小時)，HEK293細胞中總AF508池的40-50%通常存在於條帶C中(Denning等，1"2,同上)(參見如圖3B,左側小圖)。很明顯地，即使在許可摺疊溫度(30。C),dsRNA引起的p23減少也會造成條帶B的穩定性和對條帶C的加工的顯著減低(參見如圖3B,左側小圖)。在30。C,過量表達對條帶B沒有影響，但卻阻止了對條帶C的加工(參見如圖3B,右側小圖)。對於其它Hsp90依賴的信號途徑，已經觀察到p23過量表達具有類似的顯著的負面影響，反映了對成熟的主顧複合物的過度穩定化(Pratt和Toft,2003,同上)。因此，與對野生型CFTR的影響相一致，p23是在限制和許可摺疊條件下均會影響ERAF508穩定性的摺疊調控成分。這些結果強調了局部分子伴侶環境對動力學受損的AF508摺疊的潛在的不同作用。實施例6:輔分子伴侶FKBP8在HEK293細胞的AF508摺疊中的影響對穩定表達AF508的HEK293細胞中輔分子伴侶調控因子FKBP8的作用進行了研究。雖然SHR摺疊中涉及的FKBP52(Cheung-Flynn等，2005,同上)在AF508CFTR蛋白質組中未能得到鑑定，但卻檢測到了抑免蛋白家族成員FKBP8(Nielsen等，2001，Genomics83,181-192;Pedersen等，1999,Electrophoresis20,249-255)。FKBP8是膜相關的抑免蛋白，已有報導其同時定位於線粒體和ER(Kang等，2005，FEBSLett579，1469-1476;Shirane和Nakayama,2003,NatCellBiol5，28-37;Weiwad等，2005,FEBSLett579,1591-1596)。用dsRNA和瞬時轉染控制FKBP8的蛋白質表達水平。從ATCC(Manassas,VA)購買FKBP8的cDNA克隆並將其亞克隆到pcDNA表達載體，並且通過DNA測序分析驗證編碼區的序列。dsRNA溶液如實施例5製備'但使用人FKBP8，Ambion目錄號16704ID45182。人FKBP8的過量表達如前所述通過痘苗病毒的感染用表達CFTRAF508和FKBP8的質粒共轉化HEK293來進行(Wang等，2004,同上)。對於在許可溫度下分析的樣品，將細胞在收穫之前轉到30°C保持15小時。SDS-PAGE和免疫印跡如實施例3所述。圖4是描述Hsp90輔分子伴侶FKBP8對AF508的摺疊和從ER中輸出的影響的一系列條線圖。圖4A是一對顯示ER糖形AF508(B)、細胞表面糖形AF508(C)和FKBP8表達的穩態池的百分比最高水平的條線圖。使用針對FKBP8的人dsRNA(左側小圖)來降低37。C下所示蛋白質的表達。將亂序的dsRNA作為對照。使用FKBP8的人cDNA(右側小圖)在37。C過量表達所示蛋白質。嵌入的小圖是ER糖形(條帶B)和細胞表面糖形(條帶C)的穩態池的SDS-PAGE免疫印記圖像。圖4B(B)是如圖4A所描述的，除了細胞是在許可溫度(30。)下溫育以促進摺疊和從ER中輸出。星號(*)表明統計學顯著性(p$0.05)。將實驗以一式三份獨立地重複至少三次並顯示代表性的結果。更多的方法學信息請參見實施例6。結果顯示，FKBP8與ER標記蛋白4丐聯接蛋白有實質性的重疊(未顯示)，這一結果與以前的才艮道相一致。與p23dsRNA的作用相似，^L察到了在37°C響應於dsRNA使FKBP8的減少，AF508顯著地去穩定化(參見如圖4A,左側小圖)。有趣的是，37。C時的過量表達也使CFTR去穩定化(參見如圖4A,右側小圖)，提高了FKBP8的功能與Hsp90穩態濃度相關的可能性。與之相反，30°C時dsRNA導致的FKBP8表達的減少降低了(30-40%)AF508CFTR的穩定性，和相應的條帶C水平的降低(-50。/。)(參見如圖4B，左側小圖)，因而30。C時的過量表達僅對穩定性有中等的影響，但它卻幹擾條帶C的加工(參見如圖4B,右側小圖)。這些結杲說明Hsp90輔分子伴侶FKBP8像p23—樣作為摺疊調製因子控制ER中AF508的穩定性。這些結果強調了局部分子伴侶環境對動力學受損的AF508摺疊的潛在的不同作用。實施例7:HEK293細胞中輔分子伴侶HOP對AF508摺疊的影響對穩定表達AF508的HEK293細胞中輔分子伴侶調控因子HOP的作用進行了研究。用dsRNA和瞬時轉染控制HOP的蛋白質表達水平。從ATCC(Manassas,VA)購買HOP的cDNA克隆並將其亞克隆到pcDNA表達載體，並且通過DNA測序分析驗證編碼區的序列。dsRNA溶液如實施例5製備，但使用人HOP,Ambion目錄號16704ID18719。人HOP的過量表達如前所述通過痘苗病毒的感染用表達CFTRAF508和HOP的質粒共轉化HEK293來進行(Wang等，2004,同上)。對於在許可溫度下分析的樣品，將細胞在收穫之前轉到30°C保持15小時。SDS-PAGE和免疫印跡如實施例3所述。圖5是描述Hsp90輔分子伴侶HOP對AF508的摺疊和從ER中輸出的影響的一系列條線圖。圖5A是一對顯示ER糖形AF508(B)、細胞表面糖形AF508(C)和HOP表達的穩態池的百分比最高水平的條線圖。使用針對HOP的人dsRNA(左側小圖)來降低3。C下所示蛋白質的表達。用亂序的dsRNA作為對照。使用針對HOP的人dsRNA(右側小圖)在3"C下過量表達所示蛋白質。嵌入的小圖是ER糖形(條帶B)和細胞表面糖形(條帶C)的穩態池的SDS-PAGE免疫印記圖像。圖5B是如圖5A所描述的，除了細胞是在許可溫度(30。)下溫育以促進摺疊和從ER中輸出。星號("表明統計學顯著性(pS0.05)。將實驗以一式三份獨立地重複至少三次並顯示代表性的結果。更多的方法學信息請參見實施例7。結果顯示，與dsRNA導致p23和FKBP8二者減少的作用相反，HEK293細胞中觀察到響應於dsRNA的HOP最大量的減少(40-60%)對條帶B的穩定性或條帶C的水平產生極少改變(參見如圖5A,左側小圖)，而過量表達(4倍)部分地使B和C二者去穩定化(參見如圖5A,右側小圖)。同樣，在30。C時HOP的dsRNA不影響AF508的摺疊或輸出(參見如圖5B，左側小圖)。但是，過量表達將蛋白質顯著地去穩定化說明，在許可摺疊條件下與Hsc-Hsp70/40延長的聯繫傾向於靶向降解(參見如圖5B，右側小圖)。這些結果說明，HOP有助於降解中AF508CFTR和Hsc-Hsp70/40功能的連接(Amdt等，2005，同上；Meacham等，1999,surpa;Meacham等，2001,同上；Younger等，2004，同上)。這些結果強調了局部分子伴侶環境對動力學受損的AF508摺疊的潛在的不同作用。實施例8:HEK293細胞中輔分子伴侶Ahal對AF508摺疊的影響對穩定表達AF508的HEK293細胞中輔分子伴侶調控因子Ahal的作用進行了研究。最新鑑別的Hsp90輔分子伴侶家族的成員是Ahal。Ahal結合到Hsp卯的中部結構域(middledomain),並且提出其功能為調控Hsp90的ATP循環的腺芬三磷酸酶激活蛋白(Harst等，2005,BiochemJ387,789-796;Mayer等，2002,MolCell10,1255-1256;Meyer,2004，EmboJ23,1402-1410;Meyer等，2003，MolCell11,647-658;Pa騰tou等，2002,MolCell10,1307-1318;Siligardi等，2004，JBiolChem279,51989-51998)。用dsRNA和瞬時轉染控制Ahal的蛋白質表達水平。Ahal的cDNA克隆通過PCR使用C-末端"^c-標籤來擴增，並克隆到pCDNA3.1+,序列通過測序進行確認。dsRNA溶液如實施例5那樣製備，但12孔皿的每個孔中使用2(iM人Ahal,兩種dsRNA(Dharmacon,Lafyette,CO)各使用1pM，所述兩種dsRNA是針對人Ahal序列attggtccacggataagct(SEQIDNO:9;mRNA轉錄物SEQIDNO:12)和gtgagtaagcttgatggag(SEQIDNO:10;mRNA轉錄物SEQIDNO:18)的兩種dsRNA,以及6jul的HiPerFect(Qiagen,Valencia,CA)。加入與AhaldsRNA相等濃度的對照dsRNA(Dharmacon目錄號CONJB-000015)。人Ahal的過量表達如前所述通過痘苗病毒的感染用表達CFTRAF508和Ahal的質粒共轉化HEK293來進行(Wang等，2004,同上)。對於在許可溫度下分析的樣品，將細胞在收穫之前轉到30。C保持15小時。SDS-PAGE和免疫印跡如實施例3所述。圖6是表明AF508向細胞表面的輸出可以通過減量調節功能性Ahal來重建的一系列條線圖。圖6A是一組顯示ER糖形AF508(B)、細胞表面糖形AF508(C)和Ahal表達的穩態池的百分比最高水平的條線圖。在表達AF508的HEK293細胞中，分別用人的AhaldsRNA(左側小圖)或人的AhalcDNA(右側小圖)在3"C(上方小圖)或30。C(下方小圖)來減少或過量表達Ahal。嵌入的小圖是ER糖形(條帶B)和細胞表面糖形(條帶C)的穩態池的SDS-PAGE免疫印記圖像。圖6B是如圖5A所描述的，除了是用人AhaldsRNA在37°C(左側小圖)或30°C(右側小圖)在表達AF508的CFBE"o-細胞中減少Ahal表達。星號(*)表明是用非配對雙尾t檢驗(一式三份樣品)得到的統計學顯著性(p^).05)。一式三份顯示的代表性結果來自四個獨立的實驗。更多的方法學信息請參見實施例8-9。結果顯示，HEK293細胞中Ahal內源性水平由於dsRNA引起的50-70%的減少導致AF508條帶B明顯的3到4倍的穩定化(參見如圖6A,左上小圖)。在30。C觀察到甚至更顯著的穩定化(4到5倍)(參見圖6A，左下小圖)。不可思議的是，在37。C和30。C，穩定化伴隨著條帶C的相應增加，反映了顯著的細胞表面遞送(參見圖6A，左側小圖)，這是在其他輔分子伴侶中未觀察到過的結果(參見如圖3-5)。因為Hsp90輔分子伴侶的表達水平能夠影響AF508在許可(30。C)和限制(37。C)摺疊溫度下的摺疊和輸出，所以AF508CFTR可能是響應於通常有助於野生型CFTR摺疊的內源胞質Hsp90分子伴侶的匯集，在動力學上陷於途徑中亞穩定的摺疊狀態(cm-pathway,metastablefoldedstate)。重建的條帶C對內切糖苷酶H的加工有抗性(未顯示)，這是通過高爾基複合體轉運的特點。與dsRNA的影響相反，在表達AF508的HEK293細胞中Ahal的過量表達(4倍)在37°C(-60%)和30°C(>卯％)均使條帶B顯著地去穩定化，並伴隨著對條帶C的加工的相應缺失(參見如圖6A，右側小圖)。在這些情況下，沒有檢測到Hsc-Hsp70或BIP總體池的變化，表明不太可能是由Ahal的適度減少誘導了一般性的ER應激(Schroder和Kaufman,2005,AnnuRevBiochem74,739-78)(結果未顯示)。以Hsp90在已知摺疊途徑中的動力學作用(Wegele等，2004,同上；Pratt和Toft,2003,ExpBiolMed(Maywood)228,111-133;Prodromou和Pearl,2003,同上)類推，以上結果說明，通過與輔分子伴侶相繼的相互作用調節CFTR主顧與Hsp卯的相互作用可以暫時協調結構域內的摺疊和/或協調結構域間的摺疊，以在實現野生型構象的過程中避免ERAD。對協調結構域內和結構域間摺疊的需要與AF508不能實現NBD1和TMD1恰當的結構域間相互作用來產生穩定摺疊這一事實一致(Riordan,2005，同上；Du等，2005,NatStructMolBiol12，17-25)。另夕卜，同樣因TMD2的合成暫時分開的NBD2結構域(Riordan,2005,同上)在表達AF508CFTR的細胞中錯摺疊，而且必須與NBD1結構域二聚化來為通道功能激活核酸結合袋結構(pocket)之一(Lewis,2004,EmboJ23，282-293)。AF508摺疊途徑中停滯的(stalled)中間物很可能是聚集某些成分的靶，這些成分例如CHIP和它們的結合Hsc-Hsp70/40複合物並將CFTR定向到ERAD的調控因子HsBPl和Bag-l/2(Alberti等，2004,MolBiolCell15，4003-4010,;Meacham等，2001,同上)。現在很有可能的是，有關Hsc-Hsp70/40和Hsp90二者的特異調控因子和輔分子伴侶成分的相對豐度和有可能的話其平衡性顯著地影響野生型和AF508CFTR為了從ER輸出而摺疊的能力。這一結論與通常的觀察一致，即AF508的ER穩定性和細胞表面可用性在不同的細胞類型之間是高度變化的。實施例9:CFBE41o-細胞中輔分子伴侶Ahal對AF508摺疊的影響由於HEK293細胞通常不表達AF508，從而可以代表對Ahal活性水平由獨特敏感性的特殊情況(參見實施例8),因此在一種表達內源水平AF508的肺細胞系(CFBE41o-)中對37°C下AhaldsRNA的影響作了研究。將來自CF患者的AF508CFTR純合的人支氣管細胞系CFBE41o-和修正的HBE細胞系保持在補充有10%FBS、Pen/Strep、2mM額外的穀氨醯胺和2jig/ml噤呤黴素的MEM中。dsRNA的製備和轉染、dsRNA溶液和Ahal的過量表達如實施例8中所述。SDS-PAGE和免疫印跡如實施例3所述。與在HEK293細胞中觀察到的結果類似，Ahal的減少導致在37。C(參加如圖6B,左側小圖)或30。C(參見如圖6B,右側小圖)與亂序的對照相比條帶B的穩定化(-4-倍(mold))，和條帶C相應的4到5倍的增加，這一水平高於在表達野生型CFTR的CFBE41o-細胞系(HBE)中觀察到的水平(Bmscia等，2002,GeneTher9,683-685)(見下)。表達AF508的CFBE41o-中的脈衝追蹤分析揭示了在輸出到細胞表面之前條帶B在ER中2-3倍的穩定化(未顯示)。相反，用脈衝追蹤分析沒有觀察到AhaldsRNA對野生型CFTR的穩定化作用(未顯示)或使用HBE細胞系的條帶C的穩態細胞表面水平說明AF508突變體需要對內源性Ahal池的調整來促進更高效的輸出。條帶B的穩定化和響應於改變的Ahal水平的AF508條帶C的恢復說明，降^^的Ahal活性可能調控Hsp90分子伴侶動力學來促進AF508與COPIIER輸出系統的偶聯。實施例10:沉默Ahal的siRNAi殳計用於靶向Ahal基因的候選shRNA序列是從來自Ambion的搜索工具(http:〃www.ambion.com/techlib/misc/siRNA—finder.html)獲得的。用hAhal的cDNA序列(Ensembl登錄號ENSG00000100591)生成示例列表。這些序列提供少於50%的GC含量並且避免4個或更多個的連續G或C。表1提供了完整的列表。每個shRNA都針對人基因組進行了BLAST已鑑別可能在其他基因中的耙外位點。對選出的3個具有約40%的GC含量並在其他基因中基本上沒有輩巴外位點的dsRNA進行了選擇99(SEQIDNO:12)、179(SEQIDNO:18)和256(SEQIDNO:24)。這3個19鹼基對的序列中每一個都不含有多於15個的與任何其他基因的任何5，或3，未翻譯區域、內含子或外顯子連續同一的位點(consecutiveidentity)。將這3個基因克隆到pSilencer載體(Ambion)產生hAhal表達降低的穩定Hela細胞系。為本文提供的實驗生成對應於以上序列99和179的dsRNA(DharmaconandQiagen)。實施例11:表達AF508的CFBE41o-細胞中Aha1dsRNA對卣化物電導的影響由於對抗endoH(內切糖苷酶H)的條帶C糖形的加工是從ER轉運到高爾基體內側區室(cis/medialGolgicompartment)的標誌(參見如實施例8-9)，重建的蛋白質陷於晚期高爾基體外區室或胞內區室(latetransGolgiorendocyticcompartment)是可能的，反映了在後ER途徑中Phe508缺失對不正常分選的意料之外的貢獻(參見如圖1)(Gentzsch等，2004a;Sharma等，2004;Swiatecka-Urban等，2005)。為了測試這種可能性，用AhaldsRNA處理表達△F508的CFBE41o-細胞並用碘外流測定法(iodideeffluxassay)(Loo等，2005,同上)來檢測表面卣化物電導。作為正對照，對表達野生型CFTR的修正HBE細胞系的滷化物電導進行了測定。在石典外流測定法中，將野生型和AF508CFBE41o-細胞以每60mm皿5.0x105個細胞的密度^#，在如上所列的環境下培養5天並每2天更換培養液。用每60mm皿20)il的HiPerFect(Qiagen)如上所述進行dsRNA處理。在碘外流分析之前將CFBE41o-細胞轉換到30°C的許可溫度保持15小時(Hughes等，2004)。用上樣緩衝溶液(136mMNal;3mMKN03;2mMCa(N03)2;20mMHepes和11mM葡萄糖)洗細胞5次並用2.5ml上樣緩衝溶液在室溫下溫育l小時。然後將細胞用外流緩衝溶液(136mMNaN03;3mMKN03;2mMCa(N03)2;20mMHepes和11mM葡萄糖)洗15次，用2.5ml外流緩衝溶液在室溫下溫育1分鐘並將培養液收集做分析。將此溫育重複總共4分鐘。然後將細胞與2.5ml刺激緩衝溶液(含有10毛喉素(Sigma)和50iiM染料木黃酮(Sigma)的外流緩衝溶液)在室溫下溫育l分鐘並收集培養液做分析。將此溫育重複總共4分鐘。其後用2.5ml外流緩沖溶液在室溫下溫育1分鐘並將培養液收集做分析。將此溫育重複總共12分鐘。用碘選擇性電才及(AnalyticalSensors&Instruments)牙口Beckmanmodel360pHi十(VWR)只十才羊品中的橫含量進行分析。收集的培養液中碘的量通過從已知Nal濃度的標準曲線的推算得到。SDS-PAGE和免疫印跡如實施例3所述。圖7是顯示CFBE41o-細胞系中dsRNAAhal對石典外流影響的點線圖和條線圖。圖7A是描述碘隨時間外流的點線圖。在以下細胞中檢測碘外流轉染了Ahal(空心圓圈)或亂序的(空心方框)dsRNA的表達野生型CFTR的HBE細胞中(實心方框)或在37°C或如有說明為在30°C的許可溫度(最後15小時)下培養的表達AF508的CFBEWo-細胞中(實心圓圈)。CFTR通道通過從1分鐘起在歷時4分鐘的時間段內加入10pM毛喉素和50|iM染料木黃酮來激活，然後用外流緩衝溶液洗出。嵌入的小圖中顯示了溫度轉換和dsRNA對CFTR成熟(從條帶B到條帶C的糖形)和Ahal穩定性的影響。圖7B是描述加入毛喉素/染料木黃酮之前(0分鐘)和第2分鐘時卣素外流峰值期的卣素電導比率的條線圖。星號C)顯示溫度^f多正的(泳道a)和dsRNA處理的(泳道c)CFBE41o-細胞與亂序的dsRNA處理的對照(泳道b)之間用非配對雙尾t檢驗(一式三份樣品)得到的統計顯著性(p^).05)。溫度修正的(泳道a)和dsRNA修正的CFBE41o-細胞(泳道c)的卣素電導率之間沒有統計學上顯著的區別(p=0.2)。將實驗獨立地重複至少三次並顯示代表性結果。更多方法學信息，參見實施例10。結果顯示，用AhaldsRNA處理CFBE41o-細胞系產生70-80。/o內源性Ahal的敲低(knock-down)，導致AF508條帶B和C在30°C時相對於溫度修正的對照有1.5倍的穩定化，並且條帶B相對於亂序的dsRNA處理的細胞有4倍的穩定化(參見如圖7A，嵌入的小圖)。儘管HBE細胞顯示了很強的囟素電導率，但在用亂序的dsRNA處理的對照CFBE41o-細胞中沒有檢測到電導率(參見如圖7A)。CFBE41o-轉換到30°C導致HBE細胞中觀察到80-90%電導率的恢復(參見如圖7A)。不可思議的是，用dsRNA而不是亂序的處理的CFBE41o-細胞與溫度修正細胞中觀察到的卣素電導率相比顯示50-80%卣素電導率的恢復(參見如圖7B)。這些結果證明Aha1dsRNA可恢復表達AF508的CFBE41o-細胞的卣素電導率，因而獲得CFTR的功能重建。圖8是描述指導CFTR摺疊的Hsp90分子伴侶/輔分子伴侶相互作用的一系列圖示。圖8A是強調參與野生型和AF508CFTR摺疊的成分的圖示。它們包括腔內分子伴侶(l),和包括核心成分Hsc-Hsp70/40(2)和Hsp90(3),以及許多Hsp70/40(2)和Hsp90(3)輔分子伴侶調控因子的雙態胞質系統(two-statecytosolicsystem)。其他分子伴侶如TCP1(Spiess等，2004,同上)和Hspl05/S100(3a)也可能對摺疊有利。這些蛋白質相互作用中的一個或多個受到Phe508缺失在動力學上的破壞，這導致Hsp90腺苷三磷酸酶循環的破壞和CF的病生理。圖8B是Hsp90和輔分子伴侶在AF508CFTR的摺疊和重建中的潛在作用的闡述。調控為了通過ERAF輸出或定向於ERAD的摺疊的ATP/ADP循環能夠由輔分子伴侶調控因子(X和Y)動態控制來對摺疊途徑的動力學和能量學調節分子伴倡循環的動力學。例如，通過dsRNA(X)對Ahal腺苷三磷酸酶活性的減量調節會通過降低Hsp90腺苷三磷酸酶活性而傾向於為了輸出的AF508穩定化，而p23(Y)的減量調節將傾向於導致ERAD的去穩定化。圖8C是闡明以下三者關係的圖示胞質中(輔)分子伴侶濃度(X軸)，由全局蛋白質能量學定義的假定的"摺疊穩定性分數"(Sekijima等，2005,Cell121,73-85)(Z軸)和反映轉運到細胞表面的水平的"輸出效率，，(Y軸)。儘管能量學上更穩定的野生型CFTR(虛折線)響應於由正常Ahal濃度引起的CFTR分子伴侶的摺疊活性(有格柵的方框，"正常分子伴侶，，)，AF508減弱的摺疊能量學(左側實線曲線)在此摺疊環境中不穩定而未能輸出。減量調節Ahal(灰色方框，"拯救分子伴侶，，)提供的Hsp90ATP/ADP循環的設定點的改變通過調節分子伴侶摺疊能力(格柵方框)對AF508的摺疊(左側曲線)提供了更有益的解決方案(productivesolvent),而保持了野生型CFTR摺疊的功能性(右側實線曲線，格柵方框)。格爾德黴素(GA),—種Hsp90抑制劑，通過直接與Hsp90結合併阻滯摺疊循環來阻止野生型和AF508CFTR的摺疊和輸出(左下角)(Loo等，同上)。作為總結，以上結果顯示，突變CFTR的內在摺疊缺陷在動力學上與Ahal敏感的Hsp90腺苷三磷酸酶循環的活性相聯繫。從本文的結果發展而來的工作模式強調環境敏感的從正常細胞摺疊途徑的解偶聯(uncoupling)。這樣看來，控制Hsp90-主顧複合物相互作用的Hsp90ATP/ADP循環的內在速率與通過輔分子伴侶活性摺疊野生型CFTR的能量學相配合。儘管推動野生型CFTR輸出的摺疊能量學相對於正常的細胞分子伴侶池得到了優化(圖8),Ahal和潛在的其他輔分子伴倡的活性變化可以改變這些(圖8)和分子伴侶摺疊/輸出途徑的容量。在Ahal的情況下，Hsp90腺苷三磷酸酶活性的降低可以給動力學上有缺陷的AF508突變體更多時間(圖8)以使用"拯救，，分子伴侶池(圖8)以有助於穩定性和為了輸出的摺疊。因為Ahal池的部分減少不會顯著地削弱能量上更穩定的野生型摺疊(圖8),這些結果強調了Phe508缺失的摺疊能量學可能在正常的分子伴侶的摺疊範圍之外。獨特的局部分子伴侶聚集可以調控摺疊的能力與最近的觀察是一致的，即現在發現摺疊分子伴侶可以調控特定的胞內蛋白質摺疊途徑(Albanese等，2006,Cell124，75-88),而不僅是具有蛋白質聚集的抑制劑作用(Wickner等，1999，Science286,1888-1893)。從進化的角度來看，遺傳修飾劑(Qu和Thomas,1996，同上)目前很可能包括為功能減弱的突變體提供有利的遺傳或外遺傳(epigenetic)(Cowen和Lindquist,2005，Science309,2185;Queitsch等，2002,Nature417,618)環境的摺疊分子伴侶，還有當遇到激動劑例如霍亂毒素的挑戰時的生存值，其中與野生型種群比較減弱的氯離子通道功能將會降低脫水和死亡的可能性(Gabriel等，1994,Science266,107;Thiagarajah和Verkman，2005，TrendsPharmacolSci26,172)。因此，分子伴侶池的活性可以定義CF和其他蛋白質錯摺疊疾病的耐受多態性和有害突變之間的區別。實施例12:Hsp90與CFTR的結合響應於Ahal活性為了確定Ahal敲低對於AF508和Hsp90相互作用的影響，在用AhaldsRNA處理細胞之後，我們分析了結合到CFTR的Hsp90的恢復。表達AF508的細胞在37。C下在亂序的或AhaldsRNA存在下培養。將細胞收穫，免疫沉澱CFTR,並通過免疫印跡量化與AF508結合的Hsp90的量。對於這些實驗，我們分析了Hsp90與從免疫沉澱中回收的CFTR的比率來確定在對照和敲低條件下結合到CFTR的Hsp90相對量。圖9闡述了dsRNAAhal對Hsp90的影響。表達AF508的HEK293細胞在37。C下在存在或缺失AhaldsRNA時進行培養。收穫細胞，免疫沉澱CFTR,並通過免疫印跡量化與AF508—起回收的Hsp90的量。左側小圖Hsp90與從免疫沉澱中回收的CFTR的比率。右側小圖AhaldsRNA處理之後與亂序的對照相比細胞中剩餘的Ahal分數。在我們觀察到~60%Ahal敲低(圖9，右側小圖)的情況下，我們在降低的Ahal水平觀察到了結合的Hsp9050-60%的降低(圖9,左側小圖)。相反，在這些條件下，與亂序的對照相比，我們沒有檢測到鈣聯接蛋白、BiP、Hsp40、Hsc-Hsp70、Hsp90、HOPFKBP8/38和p23在細胞水平上的變化，顯示Ahal的減少可以改變ER中與Hsp90相關的AF508的穩態池。這一結果與如下的觀察相一致CFTR野生型蛋白質相互作用組中Hsp90和Hsp卯輔分子伴侶的回收相對於AF508蛋白質相互作用組是降低的，儘管條帶B的水平相當。這些結果證明，降低Ahal輔分子伴侶調控因子的水平可以修飾AF508與Hsp90的動力學相互作用，從而有助於更高效地通過摺疊途徑向前推進，因而有利於輸出。其他方面提供以上展示的細節描述是為了幫助本領域技術人員實施本發明。但是此處描述和請求保護的發明不限於本文公開的特定方面的範圍，因為這些方面是為了作為本發明幾個方面的闡述。任何等同的方面都應當是在本發明的範圍之內。事實上，除了此處展示和描述的那些之外，根據前文所述，在沒有脫離本發明性的發現的精神或範圍的前提下，本發明的多種修飾對於本領域技術人員將是顯而易見的。引用的參考文獻本文對參考文獻的引用不應當理解為承認其為本發明的現有技術。特別應當認為其在本發明範圍之內，並用通過引用將其全文併入的是以下出版物Wang,X.等,Hsp90cochaperoneAhaldownregulationrescuesmisfoldingofCFTRincysticfibrosis,Cell(2006Nov17)127(4):673-5。權利要求1.用於抑制細胞中功能性Aha蛋白質表達的dsRNA，所述dsRNA包含有義鏈和反義鏈，其中所述反義鏈包含互補性區域，該區域具有與Aha靶序列基本上互補的序列，其中所述靶序列的長度小於30個核苷酸，其中所述有義鏈與所述反義鏈基本上互補，並且其中所述dsRNA在與表達功能性Aha蛋白質的細胞接觸時，將功能性Aha蛋白質的表達抑制至少20％。2.根據權利要求1的dsRNA,其中所述Aha靶序列包含選自由SEQIDNOs:12-56組成的組中的序列。3.根據權利要求1的dsRNA,其中所述dsRNA包含有義鏈，有義鏈具有選自下組中的序列SEQIDNO:57、SEQIDNO:59、SEQIDNO:61、SEQIDNO:63、SEQIDNO:65、SEQIDNO:67、SEQIDNO:69、SEQIDNO:71、SEQIDNO:73、SEQIDNO:75、SEQIDNO:77、SEQIDNO:79、SEQIDNO:81、SEQIDNO:83、SEQIDNO:85、SEQIDNO:87、SEQIDNO:89、SEQIDNO:91、SEQIDNO:93、SEQIDNO:95、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:101、SEQIDNO:103、SEQIDNO:105、SEQIDNO:107、SEQIDNO:109、SEQIDNO:111、SEQIDNO:113、SEQIDNO:115、SEQIDNO:117、SEQIDNO:119、SEQIDNO:121、SEQIDNO:123、SEQIDNO:125、SEQIDNO:127、SEQIDNO:129、SEQIDNO:131、SEQIDNO:133、SEQIDNO:135、SEQIDNO:137、SEQIDNO:139、SEQIDNO:141、SEQIDNO:143和SEQIDNO:145;和與所述有義鏈互補的反義鏈，其具有選自下組中的序列SEQIDNO:58、SEQIDNO:60、SEQIDNO:62、SEQIDNO:64、SEQIDNO:66、SEQIDNO:68、SEQIDNO:70、SEQIDNO:72、SEQIDNO:74、SEQIDNO:76、SEQIDNO:78、SEQIDNO:80、SEQIDNO:82、SEQIDNO:84、SEQIDNO:86、SEQIDNO:88、SEQIDNO:90、SEQIDNO:92、SEQIDNO:94、SEQIDNO:96、SEQIDNO:98、SEQIDNO:100、SEQIDNO:102、SEQIDNO:104、SEQIDNO:106、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:112、SEQIDNO:114、SEQIDNO:116、SEQIDNO:118、SEQIDNO:120、SEQIDNO:formulaseeoriginaldocumentpage34.根據權利要求1的dsRNA,其中所述dsRNA包含具有SEQIDNO:57的序列的有義鏈和具有SEQIDNO:58的序列與所述有義鏈互補的反義鏈。5.根據權利要求1的dsRNA,其中所述dsRNA包含具有SEQIDNO:69的序列的有義鏈和具有SEQIDNO:70序列的與所述有義鏈互補的反義鏈。6.根據4又利要求1的dsRNA，其中所述dsRNA包含具有SEQIDNO:81的序列的有義鏈和具有SEQIDNO:82序列的與所述有義鏈互補的反義鏈。7.用於表達shRNA以抑制細胞中功能性Ahal表達的載體，所述載體包含有義鏈、髮夾接頭和反義鏈，其中所述有義鏈包含互補性區域，該區域具有與Aha靶序列基本上互補的序列，其中所述靶序列的長度小於30個核苷酸，其中所述反義鏈與所述有義鏈基本上互補，並且其中所述dsRNA在與表達功能性Aha蛋白質的細胞接觸時，將功能性Aha蛋白質的表達抑制至少20%。8.根據權利要求7的載體，其中所述Aha靶序列包含選自由SEQIDNOs:12-56組成的組中的序列。9.根據權利要求7的載體，其中所述載體包含有義鏈，所述有義鏈具有選自由SEQIDNO:147、SEQIDNO:149和SEQIDNO:151組成的組中的序列；和反義鏈，所述反義鏈具有選自由SEQIDNO:148、SEQIDNO:150和SEQIDNO:152組成的組中的序列。10.用於抑制細胞中功能性Ahal蛋白質表達的shRNA,所述shRNA包含互補性區域，該區域具有與Aha靶序列基本上互補的序列，並且其中所述靶序列的長度小於30個核苷酸，並且其中所述shRNA在與表達功能性Aha蛋白質的細胞接觸時，將功能性Aha蛋白質的表達抑制至少20%。11.根據權利要求10的shRNA,其中所述Aha靶序列包含選自由SEQIDNOs:12-56組成的組中的序列。12.根據權利要求10的shRNA，其中所述shRNA包含選自由SEQIDNO:&153、SEQIDNO:154和SEQIDNO:155組成的組中的序列。13.細胞或細胞群體，其包含根據權利要求1的dsRNA。14.細胞或細胞群體，其包含根據權利要求7的載體。15.細胞或細胞群體，其包括根據權利要求10的shRNA。16.分離的抗體，其特異性地結合功能性Ahal、Hsp90腺苷三磷酸酶的功能性Ahal結合位點和/或功能性Ahal-Hsp90腺苷三磷酸酶複合物。17.降低功能性Ahal蛋白質胞內水平的試劑，所述試劑選自下組小分子、抗體、反義核酸、適配體、dsRNA、核酶和它們的任意組合。18.治療與蛋白質錯摺疊相關的疾病的方法，所述方法包括對需要施用的受試者施用治療有效量的降低功能性Ahal蛋白質胞內水平的至少一種試劑，其中所述試劑選自下組小分子、抗體、反義核酸、適配體、siRNA、核酶和它們的組合。19.根據權利要求18的方法，其中所述疾病選自下組嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、II型糖尿病、帕金-糴病和克《偉病。20.根據權利要求18的方法，其中所述疾病是CF。21.根據權利要求18的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是錯摺疊的CFTR。22.根據權利要求18的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是AF508蛋白質。23.治療與蛋白質錯摺疊相關的疾病的方法，所述方法包括對需要施用的受試者施用治療有效量的功能性Ahal表達的至少一種dsRNA抑制劑，所述dsRNA包含有義鏈和反義鏈，其中所述反義鏈包含互補性區域，該區域具有與Aha靶序列基本上互補的序列，其中所述靶序列的長度小於30個核苷酸，其中所述有義鏈與所述反義鏈基本上互補，並且其中所述dsRNA在與表達功能性Aha蛋白質的細胞接觸時，將功能性Aha蛋白質的表達抑制至少20%。24.根據權利要求23的方法，其中所述疾病選自下組嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、II型糖尿病、帕金力糴病和克雅病。25.根據權利要求23的方法，其中所述疾病是CF。26.根據權利要求23的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是錯摺疊的CFTR。27.根據權利要求23的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是AF508蛋白質。28.治療與蛋白質錯摺疊相關的疾病的方法，所述方法包括對需要施用的受試者施用治療有效量的功能性Ahal表達的至少一種dsRNA抑制劑，其中所述<dsRNA抑制劑包含基於下列各項選擇的序列a)所述dsRNA包含約19到約25個核苷酸的有義鏈和約19到約25個核苷酸的反義鏈；和b)所述有義鏈序列或反義鏈序列包含不超過15個連續核苷酸與包含在除功能性Ahal之外任何基因或mRNA的5，非翻譯區域、3'非翻譯區域、內含子或外顯子中的連續序列相同。29.根據權利要求28的方法，其中所述疾病選自下組嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、II型糖尿病、帕金^糴病和克雅病。30.根據權利要求28的方法，其中所述疾病是CF。31.根據權利要求28的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是錯摺疊的CFTR。32.根據權利要求28的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是AF508蛋白質。33.篩選用於治療與蛋白質錯摺疊相關的疾病的試劑的方法，所述方法包括提供表達功能性Ahal的細胞或細胞群體；對所述細胞或細胞群體施用候選試劑；量化所述細胞或細胞群體中功能性Ahal的活性；和測定所述候選試劑是否降低所述細胞或細胞群體中功能性Ahal的活性，而功能性Ahal活性的降低表示減少的蛋白質錯摺疊。34.根據權利要求33的方法，其中所述候選試劑是抑制功能性Ahal表達的dsRNA。35.根據權利要求34的方法，其中所述dsRNA包含a)約19個核苷酸到約25個核苷酸的序列，和b)所述序列包含不超過15個連續核苷酸與包含在除Aha基因或mRNA之外任何基因或mRNA的5'非翻譯區域、3，非翻譯區域、內含子或外顯子中的連續序列相同。36.根據權利要求35的方法，其中所述Aha基因或mRNA是人Aha基因或mRNA。37.根據權利要求33的方法，其中所述疾病選自下組嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、II型糖尿病、帕金-絮病和克l,病。38.根據權利要求33的方法，其中所述疾病是CF。39.根據權利要求33的方法，其中所述錯摺疊蛋白質選自下組錯摺疊的CFTR、錯摺疊的肌原纖蛋白、錯摺疊的a-半乳糖苷酶、錯摺疊的(3-葡糖腦苷脂酶、錯摺疊的視紫紅質、聚集的澱粉狀蛋白卩和t、聚集的支鏈澱粉、聚集的a-突觸核蛋白和聚集的朊病毒。40.根據權利要求33的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是錯摺疊的CFTR。41.根據權利要求33的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是AF508蛋白質。42.篩選用於治療與蛋白質錯摺疊相關的疾病的試劑的方法，所述方法包括提供表達功能性Ahal的細胞或細胞群體；對所述細胞或細胞群體施用候選試劑；量化所述細胞或細胞群體中的Hsp90/ADP複合物、Hsp90/ATP複合物或其組合物；和測定所述候選試劑是否降低所述細胞或細胞群體中Hsp90/ADP複合物、Hsp90/ATP複合物或其組合的量，而Hsp90/ADP複合物或Hsp90/ATP複合物量的降低表示減少的蛋白質錯摺疊。43.根據權利要求42的方法，其中所述候選試劑是抑制功能性Ahal表達的dsRNA。44.根據權利要求43的方法，其中所述dsRNA包含a)約19個核苷酸到約25個核苷酸的序列，和b)所述序列包含不超過15個連續核苷酸與包含在除Aha基因或mRNA之外任何基因或mRNA的5'非翻譯區域、3'非翻譯區域、內含子或外顯子中的連續序列相同。45.根據權利要求44的方法，其中所述Aha基因或mRNA是人Aha基因或mRNA。46.根據權利要求42的方法，其中所述疾病選自下組嚢性纖維化(CF)、馬方綜合症、法布萊病、高歇病、色素性視網膜炎3、阿爾茨海默病、II型糖尿病、帕金森病和克雅病。47.根據權利要求42的方法，其中所述疾病是CF。48.根據權利要求42的方法，其中所述錯摺疊蛋白質選自下組錯摺疊的CFTR、錯摺疊的肌原纖蛋白、錯摺疊的a-半乳糖苷酶、錯摺疊的(3-葡糖腦苷脂酶、錯摺疊的視紫紅質、聚集的澱粉狀蛋白(3和T、聚集的支鏈澱粉、聚集的oc-突觸核蛋白和聚集的朊病毒。49.根據權利要求42的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是錯摺疊的CFTR。50.根據權利要求42的方法，其中所述錯摺疊蛋白質是AF508蛋白質。全文摘要本發明針對預防蛋白質錯摺疊的後果，例如那些與蛋白質摺疊疾病相關的後果。提供了治療方法，這些方法涉及施用降低熱休克蛋白腺苷三磷酸酶Aha1和/或具有類似功能的相關分子水平的試劑。這些方法能夠導致具有非最優摺疊動力學的蛋白質的摺疊、運輸和功能的重建(rescue)。也提供了篩選方法以鑑定用於治療蛋白質錯摺疊疾病的試劑。文檔編號C07H21/04GK101454335SQ200780018209公開日2009年6月10日申請日期2007年5月21日優先權日2006年5月19日發明者保羅·G·拉普安特,威廉·E·鮑爾奇,王曉冬,約翰·D·維納布爾,約翰·R·耶茨申請人:斯克裡普斯研究所