無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素及其用途的製作方法

2023-06-04 07:49:11 2

專利名稱：無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新型促紅細胞生成素及其用途，更具體地說是提供一種具有神經 保護作用，但無促紅細胞生成的副作用的新型促紅細胞生成素及其在製藥中的用途，屬 於生物製藥領域。
背景技術：
促紅細胞生成素(EPO)是由腎臟合成和分泌的一種生長因子，能促使紅細胞生 產和成熟(紅細胞生成)。最初認為EPO僅僅與紅細胞的生產和成熟有關，但最近的研 究發現EPO除了具有促進紅細胞生成的作用之外，還有很強的促進神經元生存(神經 保護)的作用。體外實驗表明，EPO可以減輕或抑制由缺糖缺氧NMDA毒性，自由基 等多種因素引起的神經元損傷。大量動物實驗表明，EPO注射可以減少缺血梗死面積， 同時可以改善神經功能恢復。最近的一個臨床實驗結果令人鼓舞在中風5小時給予 大劑量EPO注射(33000U/次)，可以明顯減少由大腦中動脈阻塞所致的腦梗死體積， 同時可以明顯提高病人的祌經功能和臨床結果。這一進展意義重大，其一，目前中風 唯一有效的藥物是t-PA，其治療窗口為中風後3小時內，而EPO擴大了治療窗口，從 而使更多中風患者得到治療；其二， EPO作為新型腦保護治療試劑可以用於中風後神 經功能康復治療。然而，由於腦保護屏障的作用，只有不到1%EP0可穿過血腦屏障 而進入大腦。因此，需要大劑量注射才內能在大腦內達到一定治療濃度，其劑量遠遠 高於治療貧血所使用的劑量。同時，EPO的祌經保護作用是通過激活一系列信號通道 而實現的，比如PI3/Akt系統，而EPO誘導的PI3/Akt信號通常僅能維持48小時，因 此需要多次注射來維持生存信號的激活。大劑量，多次注射EPO會產生一連串高風險 的副作用，比如紅細胞壓積升高而使血液變得粘稠，同時EPO可刺激血小板的生成。 這些高危因素可導致紅色血栓形成從而增加腦卒中患者發生再次中風的可能。因此， 若能選擇性的降低或去除EPO的促紅細胞生成作用，而維持其神經保護作用，將帶來 腦中風治療的變革。本發明即是提供一種新型的無促紅細胞生成作用，但有神經保護 作用的新型EPO。
EPO與EPO受體結合後，激活一系列信號通路而促進細胞的生成和成熟。在EPO 分子中，有三個區域與EPO受體結合有關，這三個區域分別是第11至15號胺基酸(詳見SEQ ID No.4)，第44至51號胺基酸(SEQ ID No.5)以及第100至108號胺基酸 (SEQIDNo.6)。研究發現，若在上述三個區域中發生點突變，EPO分子將失去與EPO 受體結合的能力，從而失去刺激紅細胞生成的功能。EPO具有神經保護作用，目前的 研究認為EPO通過與神經元上的EPO受體結合，激活與促紅細胞生成相同的信號通
路而發揮神經保護作用。因此，從理論上來講，破壞EPO受體結合位點後，EPO將不
再具有祌經保護作用。
因此現階段製備具有神經保護作用無促紅細胞作用的EPO是本領域技術人員研 究的重點。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種具有神經保護作用，但無促紅細胞生成特性 的新型促紅細胞生成素。
本發明要解決的另一個技術問題是提供這種具有神經保護作用，但無促紅細胞 生成特性的新型促紅細胞生成素在製藥領域的用途。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案
一種無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素，為野生型人促 紅細胞生成素在下述三個區域中至少一個區域進行突變而產生的變構體
(1) VLQRY:人促紅細胞生成素的第11-15號胺基酸；
(2) TKVNFYAW:人促紅細胞生成素的第44-51號胺基酸；
(3) SGLRSLTTL:人促紅細胞生成素的第100-108號胺基酸。
所述突變為單點或多點突變、單個或多個胺基酸缺失、以及突變加缺失複合突變。
所述無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素為序列表SEQ ID No.7至SEQ ID No.68中的任一胺基酸序列。
所述的無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素，特別是第14號 精氨基突變為丙氨基(序列#14)，穀氨醯胺(序列H15)以及穀氨酸(序列#16);第45 號賴氨酸突變為丙氨基(序列#21)以及穀氨酸(序列#22);第100號絲氨酸突變為丙 氨基(序列以及穀氨酸(序列tt34);第103號精氨基突變為丙氨基(序列tt39)以 及穀氨酸(序列#40);第104號絲氨酸突變為丙氨基(序列#44)，異亮氨酸(序列#45) 以及穀氨酸(序列M6)。
所述的無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素，除上述所述三 個區域外，在人促紅細胞生成素的第6， 7， 10， 20， 21， 29, 33， 38， 42， 52， 59， 63，
467， 70， 83， 96， 97， 126， 142， 149， 150， 151， 152， 153， 155， 156， 161號胺基酸
位置至少發生一個突變而產生的變構體。
所述的無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素在製備、保持、
增強神經保護作用，或用於神經功能康復治療的藥物的應用。
所述的無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素在製備用於中樞 神經系統以外的臟器，如心臟、腎臟等臟器的缺血性損傷的治療藥物中的應用。
人類EP0 cDNA(序列W)編碼193個胺基酸(序列tt2) ， EPO初級蛋白合成後， 其氨基端含27個胺基酸殘基的信號肽經切割後變為成熟EP0(序列tt3)。因此成熟的 人類EPO為166個胺基酸。下面所列出的突變型人類促紅細胞生成素的胺基酸序列均 為成熟後的胺基酸序列。
人類EPO cDNA用PCR方法進行定點突變，獲得了 62個新突變型EPO cDNA。 這些突變主要集中在以下三個與EPO受體結合有關區域內VLQRY(人促紅細胞生成 素的第11-15號胺基酸，序列SEQ ID No.4)，TKVNFYAW (人促紅細胞生成素的第44-51 號胺基酸，序列SEQ ID No.5)和SGLRSLTTL (人促紅細胞生成素的第100-108號氨 基酸，序列SEQIDNo.6)。將這些突變後的EPOcDNA裝入真核表達載體並在人胚腎 293細胞系中進行表達。通過篩選穩定高表達細胞株,我們成功製備了 62個含有單個突 變胺基酸的新型突變型EPO(mEPO)融合蛋白，這些mEPO融合蛋白的具體突變位點 如下(其中第一和第三個字母分別為正常和突變後的胺基酸，兩字母之間的數字為成 熟促紅細胞生成素的胺基酸序號，具體胺基酸序列詳見序列表)
16A-EP0(序列tt7),C7A-EPO(序列#8)，C7S-EP0(序列晚
R10I-EP0(序列,),VI1S EP0(序列ftll)，L12A-EP0(序列#12),
E13A-EP0(序列共13)，R14A-EP0(序列#14),R14Q-EP0(序列#15),
R14E-EP0(序列#16)，Y15A-EP0(序列ftl7),Y15P-EP0(序列#18),
Y15I-EP0(序列譜)，T44I-EP0(序列1120)，K45A-EP0(序列#21),
K45E-EP0(序列ft22)，V46A-EP0(序列#23)，N47A-EPO(序列#24)，
F48A-EP0(序列#25),F48I-EP0(序列共26),Y49A-EP0(序列#27),
Y49S-EP0(序列tt28),W51E-EP0(序列H29),W51F-EPO(序列#30)'
K52A-EP0(序列#31)，K97A-EP0(序列S100A-EPO(序列#33)，
S100E-EP0(序列#34),S100T-EP0(序列tt35)，G101A-EPO(序列#36),
G101I-EP0(序列tt37),L102A-EP0(序列tt38)，R103A-EPO(序列#39),R103E--EPO(序列#40),R103H--EP0(序列#41),R103N-EP0(序列#42),
R103Q--EPO(序列M3)'S104A--EPO(序列闊，S104I-EP0(序列#45),
S104E--EP0(序列糾6)，L105A--EPO(序列#47)，T106A-EP0(序列糊)，
T106I--EPO(序列#49),T107A--EPO(序列#50),T107I-EP0(序列
L108A--EPO(序列#52),L108E--EPO(序列tt53),L108K-EPO(序列#54),
L108S--EPO(序列#55)，S146A--EPO(序列#56)，N147A-EP0(序列#57)，
F148A--EPO(序列tt58)，F148Y--EPO(序列#59),L149A-EP0(序列■),
R150A--EPO(序列R150E--EPO(序列恥2)，R150I-EP0(序列#63)，
G151A--EPO(序列#64)，K152A--EP0(序列#65)，K152W-EP0(序列tt66),
C161A-EP0(序列#67)， R162A-EP0(序列貼8)
我們用體內和體外實驗對這些mEP0是否具有促進紅細胞生成的作用進行了研 究，發現mEP0喪失了維持紅細胞生成素依賴性細胞株(32D-EP0R)生存的特性；體內實 驗進一步證明大劑量、多次注射mEPO不增加小鼠的紅細胞數量和血紅蛋白值。這些實 驗數據表明mEP0喪失了促進紅細胞生成的能力。令人興奮的是這些突變體和野生型 EP0 —樣，無論在體內還是體外都具有很強的神經保護作用，不僅能夠抑制缺氧和缺 葡萄糖或麗DA毒性有道德祌經細胞死亡的作用，而且體內研究發現mEP0能夠顯著減 少小鼠大腦中動脈阻塞模型腦梗死體積。此研究結果令人意外因為目前的研究認為 EPO具有神經保護作用，而神經保護作用是通過EPO與神經元上的EPO受體結合， 激活與促紅細胞生成相同的信號通路而發揮作用。因此，從理論上來講，破壞EPO受 體結合位點後，EPO將不再具有神經保護作用。令人意想不到的是，點突變破壞了 EPO 受體結合位點後，EPO仍具有神經保護作用，使這種突變型促紅細胞生成素成為一種 無促紅細胞生成作用，但有神經保護作用的新型神經保護藥物。
到目前為止所有治療中風的試劑，若在中風48小時後給藥，均無治療效果。令人 興奮地是新型腦保護藥物在48小時後給藥(遲發性)，仍具有明顯的改善神經功能的 作用。此結果意義重大，目前中風唯一有效的藥物是t-PA，其治療窗口非常短，為中 風后3小時內，因此只有不到10%的中風患者適合t-PA治療。而EPO擴大了治療窗口 ， 從而使更多中風患者得到治療。此外，新型腦保護藥物可以長期注射而對血液系統沒 有刺激作用，特別適用於用於腦中風的康復治療。
本發明的優點與效益(1)新型腦保護藥物具有神經保護作用，但無促紅細胞生 成作用，從而避免了常規促紅細胞生成素有可能導致的繼發性血栓形成，增加了臨床
6應用的安全性；(2)新型腦保護藥物擴大了治療群體，使血液粘稠度較高而不能用常規 促紅細胞生成素進行治療的腦卒中患者得到治療；(3)到目前為止，所有治療中風的試 劑，若在中風48小時後給藥，均無治療效果，而新型腦保護藥物48小時後給藥，仍 具有明顯的改善神經功能的作用。這將使絕大多數腦卒中患者得到治療；(4)新型促紅 細胞生成素可以長期注射而對血液系統沒有刺激作用，特別適用於用於腦卒中的康復 治療。因此這種新型促紅細胞生成素在腦卒中的治療方面具有良好的臨床應用前景-突變型促紅細胞生成素擴大了腦卒中患者治療群體，使更多腦卒中患者得到治療；突 變型促紅細胞生成素可以長期注射而對血液系統沒有刺激作用，特別適用於腦卒中的 康復治療。
下面結合具體實施方式
對本發明作進一步說明，並非對本發明的限定，依照本領 域公知的現有技術，本發明的實施方式並不限於此，因此凡依照本公開內容所作出的 本領域的等同替換，均屬於本發明的保護範圍。


圖1-1為mEP0全基因序列示意圖。
圖1-2為部分突變型EP0的DNA測序結果。
圖2為表達質粒pcDNA-mEP0-his6的物理圖。
圖3為表達突變型EPO融合蛋白穩定細胞株的建立及其mEPO融合蛋白的製備 及純化pcDNA-EP0-His6轉染293細胞，用G418篩選高表達細胞株。取2ul培養基 上清液用Western blot分析rnEP0的表達。我們成功地分離純化了 62個含有單個突變 胺基酸的新型突變型EPO融合蛋白。圖3所示為S1041-EP0 (序列tt45)，其分子量約 34-40 kD(泳道2)，與野生型EP0的分子量相似(泳道1)。
圖4為體內和體外實驗，證明niEP0無促紅細胞生成特性(A)應用32D-EpoR 細胞系進行體外紅細胞生成活力檢測。細胞(2xl05)在含有1 Li/ml野生型EP0或含 有l和100 U/ml mEPO的培養基中進行孵育培養，72h後進行細胞計數。數據用平均 值土標準誤表示(n40)。圖中所示為S1041-EP0 (序列tt45)，其它序列結果與此相似。 (B)小鼠活體內紅細胞生成活力檢測。mEPO或野生型EPO以5000 U/kg總量進行 腹腔注射，每周2次，連續4周注射。每2周進行一次血中血紅蛋白濃度檢測。數據 以平均值土標準誤表示，n=8。與野生型EPO注射組相比較*p<0.05， **p<0.01。圖中 突變體S104I-EP0(序列#45)，其它序列結果與此相似。圖5為體外實驗，提示mEPO具有抗OGD和NMDA的腦保護作用(A)為暴露於 薩DA24小時後顯微鏡下(a-d)和煙酸己可鹼染色後形態學表現(e-h)。對照組神經 元見圖a和e。 NMDA導致凋亡樣(f圖內紅箭頭)和壞死樣細胞死亡(f圖內黃色 箭頭)。EP0(c， g)或mEP0(d， h)預處理24小時可減少神經元死亡。(B)為,DA 神經毒性導致的細胞死亡計數。EP0或mEP0預處理後暴露於NMDA可明顯減少高 密度細胞核形態細胞數量。(C)為單獨醒DA處理後LDH釋放量作為對照EP0和niEP0 處理的神經元釋放LDH的相對含量。(**〈0. 01 ，數據用均值+SEM來表示，n=12)。
圖6為小鼠體內實驗，證明mEPO能有效減少小鼠大腦中動脈阻塞模型腦梗死 體積成年C57/B6雄性小鼠，大腦中動脈栓塞60分鐘再灌注72小時。再灌注即刻 腹腔注射mEP0或EP0(5000U/kg)，分別在缺血24和48小時後再次給藥。MCA0 72h 後進行神經功能評分和TTC染色。(A)圖為MCAO小鼠腦的冠狀切面TTC染色照片。(B) 圖為梗死體積定量計算。(C)圖為神經功能評分。數據用均數土標準差表示，每組N =10。 林p〈0.01與空白對照組比較，*p<0.05與空白對照組比較。
圖7為新生鼠缺氧缺血模型，提示mEP0具有促進神經功能恢復的功能出生 後7天的Sprague-Dawley新生鼠給予缺氧缺血130分鐘，然後給予腹腔注射mEPO (5000U/kg),用"腳踩空實驗"檢測祌經功能。圖7A為mEP0注射，祌經功能檢測 及測定腦梗死體積時間表；儘管遲發性mEPO注射不能減少缺氧缺血所致的腦組織(圖 7B和7C)，但能顯著提高神經功能(圖7D，7E和7F)。
具體實施例方式
實施例1: EP0 cDNA定點突變
從人類腎臟cDNA文庫中擴增人類EP0cDNA，用PCR方法進行定點突變，獲得了 62個新突變型EP0 cDNA，並將這些突變後的EPO cDNA裝入真核表達載體，詳細步驟為 一、人類EPO cDNA的擴增
人類EPOcDNA編碼193個胺基酸，EPO初級蛋白合成後，其氨基端含27個氨 基酸殘基的信號肽經切割後變為成熟EPO。因此成熟的人類EPO為166個胺基酸。 基於上述研究結果，將用於分離純化的組氨酸標籤(His-6)加於EP0cDNA的3'端。 含有His-6標籤的人類EPO cDNA用PCR方法從人類腎臟Marathon-ready cDNA文 庫(Clontech , Mountain View,美國)中擴增。引物設計依照己發表的人類EPO cDNA序列(基因序列號畫000799)。其中上遊序列含有BamHI及K0ZAK序列(劃 線部分)5' -ACGGATCCGCCACCATGGGGGT GCACGAATGTCTTGC-3，。下遊引物序列為5' -/Jg水AATTClr①口rG馬蕩67Y ACCgtcccctgccctgcaggcctcccctg-3'， 從3'至5，次含有EPO下遊序列(小寫部分)，六個組氨酸組成的組氨酸標籤(斜 體部分)以及EcoRI克隆位點(方框部分)。在組氨酸標籤及EPO之間加入甘氨酸殘 基(黑體部分)，便於肽段的自由旋轉。PCR反應條件為上述兩引物各lOpmol， Marathon cDNA 2m!，Accuprime1M Taq DNA polymerase (Invitrogen, Carlsbad, 美國)1W。 94'C預變性2分鐘後，94'C變性30秒，62'C退火30秒，68'C延伸50 秒，28個循環後用瓊脂糖凝膠電泳回收PCR產物。克隆入AT克隆載體pGEM-T easy (Promega， Madison,美國)。質粒擴增及酶切鑑定後進一步進行DNA測序。mEPO 全基因序列示意圖見圖l-l。 二、 EPO cDNA定點突變
用此質粒為模板，用PCR方法進行定點突變。突變使用快速突變試劑盒(產品編 號200523, Stratagene, La Jolla,美國)按廠家說明進行操作。簡言之，取上述質 粒O. lug為模板，加入上遊及下遊突變引物各lOpmol， PfuUltra 高保真Taq酶2U 及dNTP 200幽。PCR反應條件為94。C預變性2分鐘後，94。C變性30秒，62。C退火 30秒，68'C延伸5分鐘。12個循環後加入20U DNaseI 37°C消化30分鐘。瓊脂糖 凝膠電泳回收PCR產物後，轉化JM109感受態細菌。提取質粒後進一步進行DNA測序。 所用突變引物序列如下(黑體為突變鹼基，下劃線鹼基編碼突變胺基酸)。 16A-EPO(序歹iJ #7)上遊5,-ACCACGCCTCgccTGTGACAGCCGAGTCCTGGAGAG-3，
下遊5'-GCTGTCACAggcGAGGCGTGGTGGGGCGCCCAGGACTG-3， C7A-EPO(序歹iJ #8)上遊5'-CACGCCTCATCg￡lGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTAC-3，
下遊5，-CTCGGCTGTC^g￡GATGAGGCGTGGTGGGGCGCCCAG-3' C7S-EPO(序歹U #9)上遊5，-CACGCCTCATCi￡lGACAGCCGAGTCCTGGAGAGGTAC-3，
下遊5，-CTCGGCTGTCagaGATGAGGCGTGGTGGGGCGCCCAG-3， R101-EPO(序歹U #10)上遊5，-CTGTGACAGCataGTCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAG-3，
下遊5，陽CTCTCCAGGACJMGCTGTCACAGATGAGGCGTGGTGG-3' V11S-EP0(序列#11)上遊5'-GTGACAGCCGAtcCCTGGAGAGGTACCTCTTGGAGGCC-3，
下遊5，-CCTCTCCAGG2aTCGGCTG丁CACAGATGAGGCGTGG-3' L12A-EPO(序列#12)上遊5，-CAGCCGAGTCg￡gGAGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAG-3，
下遊5，-GAGGTACCTCTCcgcGACTCGGCTGTCACAGATGAGGCG-3' E13A-EPO(序歹iJ #13)上遊5，-CCGAGTCCTGGcGAGGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAG-3，下遊5，-AGAGGTACCTCsCCAGGACTCGGCTGTCACAGATGAG-3' R14A-EPO(序歹U #14)上遊5，-GAGTCCTGGAGgcGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCC-3'下遊5,-CCAAGAGGTACgcCTCCAGGACTCGGCTGTCACAGATG-3， R14Q-EPO(序歹U #15)上遊5'-GAGTCCTGGAGcaGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCC-3，下遊5，-CCAAGAGGTACtgCTCCAGGACTCGGCTGTCACAGATG-3， R14E-EPO(序列#16)上遊5'-GAGTCCTGGAGgAGTACCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCC-3'下遊5，-CCAAGAGGTACTcCTCCAGGACTCGGCTGTCACAGATG-3' Y15A-EPO(序列#17)上遊5'-TCCTGGAGAGGgcCCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAG-3'下遊5 ，-CCTCCAAGAGGgcCCTCTCCAGGACTCGGCTGTCACAG-3' Y15P-EPO(序歹U #18)上遊5'-TCCTGGAGAGGccCCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAG-3，下遊5'-CCTCCAAGAG^ggCCTCTCCAGGACTCGGCTGTCACAG-3' Y15I-EPO(序歹U #19)上遊5，-TCCTGGAGAGGatCCTCTTGGAGGCCAAGGAGGCCGAG-3，下遊5,-CCTCCAAGAGGatCCTCTCCAGGACTCGGCTGTCACAG-3' T441-EPO(序列#20) 上遊5，-CTGTCCCAGACatCAAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAG-3，下遊5，-GAAATTAACTTTGatGTCTGGGACAGTGATATTCTCATTC陽3， K45A-EPO(序列#21)上遊5，陽TCCCAGACACCgcAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGG-3，下遊5,-TAGAAATTAACJg￡GGTGTCTGGGAAGTGATATTCTC-3' K45E-EPO(序歹U #22)上遊5'-TCCCAGACACCgAAGTTAATTTCTATGCCTGGAAGAGG-3，下遊5 ，-TAGAAATTAACTTcGGTGTCTGGGAAGTGATATTCTC-3' V46A-EPO(序歹U #23)上遊5，-CAGACACCAAAGcTAATTTCTATGCCTGGAAGAGG-3'下遊5，-GCATAGAAATTAsCTTTGGTGTCTGGGACAGTGATATTC-3， N47A-EPO(序歹U #24)上遊5，-GACACCAAAGTTgcTTTCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGG-3，下遊5，- CAGGCATAGAAAgcAACTTTGGTGTCTGGGACAGTGATA-3， F48A-EPO(序歹lJ #25)上遊5，-CCAAAGTTAATgcCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTC-3，下遊5，陽TCCAGGCATAGgcATTAACTTTGGTGTCTGGGACAGTG-3' F48I-EPO(序歹U #26)上遊5'-CCAAAGTTAATatCTATGCCTGGAAGAGGATGGAGGTC-3,下遊5 ，-TCCAGGCATAGatATTAACTTTGGTGTCTGGGACAGTG-3' Y49A-EPO(序列#27)上遊5，-AAGTTAATTTCg￡lGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGG-3，下遊5,-CTCTTCCAGGCA2cGAAATTAACTTTGGTGTCTGGGAC-3， Y49S-EPO(序歹iJ #28)上遊5'-AAGTTAATTTCTcTGCCTGGAAGAGGATGGAGGTCGGG-3'下遊5，-CTCTTCCAGGCA2AGAAATTAACTTTGGTGTCTGGGAC-3， W51E-EPO(序列#29)上遊5,-ATTTCTATGCCgaGAAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAG-3，下遊5 ，-CCATCCTCTTCtcGGCATAGAAATTAACTTTGGTGTC-3' W51F-EPO(序列#30)上遊5'-ATTTCTATGCC也AAGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAG隱3，下遊5 '-CCATCCTCTTg^GGCATAGAAATTAACTTTGGTGTC-3' K52A陽EPO(序歹iJ #31)上遊5，-TCTATGCCTGGgcGAGGATGGAGGTCGGGCAGCAGGCC-3，下遊5，-CCTCCATCCT￡g￡CCAGGCATAGAAATTAACTTTGGTG-3' K97A-EPO(序列#32)上遊5，陽GCATGTGGATgcAGCCGTCAGTGGCCTTCGCAGCCTC-3'下遊5'-CACTGACGGCTgcATCCACATGCAGCTGCAGGGGCTC-3， S100A-EPO(序歹iJ #33)上遊5，-GATAAAGCCGTCgcTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3，下遊5'-CTGCGAAGGCCAscGACGGCTTTATCCACATGCAGCTG-3' S100E-EPO(序列#34)上遊5，-GATAAAGCCGTCgaaGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3，下遊5' -CTGCGAAGGCC也GACGGCTTTATCCACATGCAGCTG-3' S100T-EPO(序歹U #35)上遊5'-GATAAAGCCGTCacTGGCCTTCGCAGCCTCACCACTCTG-3，下遊5，-CTGCGAAGGCC4glGACGGCTTTATCCACATGCAGCTG-3' G101A-EPO(序歹U #36)上遊5，-AGCCGTCAGTGcCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTC-3，下遊5'-GGCTGCGAAG2g￡ACTGACGGCTTTATCCACATGCAG-3' G101卜EPO(序列#37)上遊5，-AGCCGTCAGTatCCTTCGCAGCCTCACCACTCTGCTTC-3，下遊5，-GGCTGCGAAGGtaACTGACGGCTTTATCCACATGCAG-3' L102A-EPO(序列#38)上遊5，-CGTCAGTGGCg￡jCGCAGCCTCACCACTCTGCTTCGG-3'下遊5，-GTGAGGCTGCG4g￡GCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3' R103A-EPO(序列#39)上遊5，-TCAGTGGCCTTgcCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3'下遊:5，-TGGTGAGGCTOg^AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3' R103E-EPO(序列#40)上遊5，-TCAGTGGCCTT2aaAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3，下遊5 ，-TGGTGAGGCT^AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3' 詣3H-EPO(序歹iJ #41)上遊5'-TCAGTGGCCTTcaCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3,下遊'-TGGTGAGGCTGtgAAGGCCACTGACGGCTTTATCCACATG-3， R103N-EPO(序列#42)上遊5，-TCAGTGGCCTTaaCAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3，下遊5，-TGGTGAGGCTG"AAGGCCACTGACGGCTT丁ATCCACATG-3， R103Q-EPO(序列#43)上遊5,-TCAGTGGCCTTcagAGCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTC-3，11下遊5'-TGGTGAGGCT幽AAGGCCACTGACGGCTTTATCCACAT-3' S104A-EPO(序歹iJ #44)上遊5'-GTGGCCTTCGC2cCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTG-3，下遊5，-GAGTGGTGAGGgcGCGAAGGCCACTGACGGCTTTATC-3， S104NEPO(序歹iJ #45)上遊5，-GTGGCCTTCGCatCCTCACCACTCTGCTTCGGGCTCTG-3'下遊5，-GAGTGGTGAGGatGCGAAGGCCACTGACGGCTTTATC-3' S104E-EPO(序歹U #46)上遊5，陽GTGGCCTTCGCga2CTCACCACTCTGCTTCGGGCTC丁G-3，下遊5'-GAGTGGTGAG虛cGCGAAGGCCACTGACGGCTTTATC-3' L105A-EPO(序歹iJ #47)上遊5'- GCCTTCGCAGCgcCACCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAG-3'下遊5，- GCAGAGTGGTGgcGCTGCGAAGGCCACTGACGGCTTTA-3， T106A-EPO(序歹lJ #48)上遊5，-TCGCAGCCTCgCCACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCC-3，下遊5，-GAAGCAGAGTGGcGAGGCTGCGAAGGCCACTGACGGC-3， T106I-EPO(序列#49)上遊5'-TCGCAGCCTCatQACTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCC-3，下遊5'-GAAGCAGAGTGatGAGGCTGCGAAGGCCACTGACGGC-3' T107A-EPO(序列#50)上遊5，-CAGCCTCACCeCTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAG-3，下遊5，-CCGAAGCAGAGcGGTGAGGCTGCGAAGGCCACTGAC-3' T107I陽EPO(序歹iJ #51)上遊5，陽CAGCCTCACCatTCTGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAG-3'下遊5'-CCGAAGCAGAatGGTGAGGCTGCGAAGGCCACTGAC-3， L108A-EPO(序歹U #52)上遊5,-CCTCACCACTg^CTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3'下遊5 ，-GAGCCCGAAGCgcAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3' L108E-EPO(序列#53)上遊5，-CCTCACCACTgaGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3，下遊5，-GAGCCCGAAGCtcAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3， L108K-EPO(序歹'J #54)上遊5，-CCTCACCACTaaGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3，下遊5'-GAGCCCGAAGCttAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3， L108S-EPO(序列#55)上遊5，-CCTCACCACTtcGCTTCGGGCTCTGGGAGCCCAGAAG-3，下遊5，-GAGCCCGAAGCgaAGTGGTGAGGCTGCGAAGGCCACT-3' S146A-EPO(序列#56)上遊5，-CCGAGTCTACgCCAATTTCCTCCGGGGAAAGCTGAAG-3，下遊5,-GGAGGAAATTGGcGTAGACTCGGAAGAGTTTGCGGAA-3' N147A-EPO(序歹U #57)上遊5' -G AGTCTACTCCgcTTTCCTCCGGGG A A AGCTG A AGCTG-3'下遊5，-CCCGGAGGAAAgcGGAGTAGACTCGGAAGAGTTTGCGG-3， F148A-EPO(序列#58)上遊5，-CTACTCCAATgcCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTAC-3,下遊5，-TTCCCCGGAGGgcATTGGAGTAGACTCGGAAGAGTTTG-3' F148Y-EPO(序歹iJ #59)上遊5'-CTACTCCAATtaCCTCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTAC-3，下遊5'-TTCCCCGGAGGtaATTGGAGTAGACTCGGAAGAGTTTG-3' L149A-EPO(序歹U #60)上遊5，-CTCCAATTTCgcCCGGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAG陽3，下遊5'-GCTTTCCCCGGgcGAAATTGGAGTAGACTCGGAAGAG-3， R150A-EPO(序列#61)上遊5，-CCAATTTCCTCgcGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGG-3'下遊5 ，-TCAGCTTTCCCgcGAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAAG-3' R150E-EPO序列#62)上遊5，-CCAATTTCCTCgaGGGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGG-3，下遊5'-TCAGCTTTCCCtcGAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAAG-3' R150-EPO(序列#63)上遊5'-CCAATTTCCTC祖GGAAAGCTGAAGCTGTACACAGGG-3'下遊5'-TCAGCTTTCCgatGAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAAG-3， G151A-EPO(序列#64)上遊5，-TTTCCTCCGGgcAAAGCTGAAGCTGTACACAGGGGAG-3，下遊5，-GCTTCAGCTTTgcCCGGAGGAAATTGGAGTAGACTCGGAA-3， K152A-EPO(序列#65)上遊5，-TCCTCCGGGGAgcGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCC-3，下遊5 ，-TACAGCTTCAGCgcTCCCCGGAGGAAATTGGAGTAGAC-3' K152W-EPO(序列#66)上遊5'-TCCTCCGGGGAtgGCTGAAGCTGTACACAGGGGAGGCC-3'下遊5，-TACAGCTTCAGCcaTCCCCGGAGGAAATTGGAGTAGAC-3' C16IA-EPO(序歹lJ #67)上遊5'-CAGGGGAGGCCgcCAGGACAGGGGACAGAGGCGGCCGC-3'下遊5，-CCCTGTCCTGscGGCCTCCCCTGTGTACAGCTTCAG-3， R162A-EPO(序列#68)上遊5，-GGAGGCCTGCgcGACAGGGGACAGAGGCGGCCGCTAC-3，下遊5，-GTCCCCTGTCgcGCAGGCCTCCCCTGTGTACAGCTT-3'三、 DNA測序將突變後的質粒送至美國匹茲堡大學(University of Pittsburgh)基因組及蛋白 組學中心進行DNA測序。所用測序引物為:上遊引物為(M13F) : 5' -ACGTTGTAAAACGA CGGCCAGTG-3，；下遊引物為(M13R) :5' -GGAAACAGCTATGACCATGATTAC-3'。測序結果見圖l-2。四、 mEP0表達載體的構建將上述測序後的突變型EP0 cDNA全基因用BamHI及EcoRI雙酶切後，亞克隆至 pcDNA3. 1(+)表達載體中(clontech，美國)，命名為pcDNAiEP0-his6。13實施例2: mEPO融合蛋白製備及純化
用轉染試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國)將載體pcDNA-mEP0-his6 導入293細胞系。轉染24h後，1: 12傳代，加入G418 lmg/ml (Invitrogen,美國) 培養2周後挑選單個克隆轉入6孔板繼續培養。取10W培養基用Western blot或 稀釋1000倍後用ELISA鑑定mEP0高表達細胞株。上清用Western blot和ELISA鑑定 EP0的表達，結果見圖2。 mEP0高表達細胞株大量擴增後，收集培養基用Ni-NTA瓊脂 糖層析柱(QIAGEN， Valencia,美國)回收純化mEP0融合蛋白。簡言之，培養基用NaOH 將其pH值調至8. 0，加入5M NaCl至終濃度為300mM。
將5ml Ni-NTA瓊脂糖加入層 析柱中，用PBS洗柱兩遍後，將Ni-NTA瓊脂糖加入培養基中。4'C振搖結合2小時後， 將Ni-NTA瓊脂糖培養基加入層析柱中，用磷酸鹽緩衝液(50mM NaH2P04， 300mM NaCl, 20mM咪唑，pH8.0)洗柱6遍，然後加入洗脫液(50mM NaH2P04, 300mM NaCl， 250mM 咪唑，PH8.0) 10ml洗脫mEP0融合蛋白。將洗脫的mEPO融合蛋白加入Slide-A-Lyzer 透析盒中(PIERCE, Rockford，美國)，置於1000ml PBS中進行透析，每8小時更換 一次PBS，透析6次後收集蛋白。純化的蛋白經0.2陶濾器過濾後分裝，凍存於-80。C 或冷凍真空抽乾備用。SDS-PAGE電泳後，用考馬斯亮蘭染色鑑定蛋白純度。用ELISA 試劑盒(R&D System, Minneapolis,美國)進行定量分析。
理論上講未糖基化的mEPO分子量為23kD。 Western blot法確定純化的mEPO融合 蛋白分子量為36至40kD (圖3)，表明我們生產的mEPO為糖基化的。用此法提純的 mEP0純度可達90。/。，濃度高達50 U/W。
實施例3:檢測mEPO是否具有促紅細胞生成特性
我們用體內和體外實驗對這些niEPO是否具有促進紅細胞生成的特性進行了研究。
一、mEPO促紅細胞生成生物特性的體外分析 32D-EPOR細胞為小鼠骨髓來源的淋巴母細系32D細胞穩定轉染EPO受體後形成 的細胞系，其生存和增殖完全依賴於EPO的存在，被廣泛用於EPO生物學活特性的體 外分析。用IDEM培養基(Invitrogen)將32D-EPOR細胞接種於六孔板中，每孔約 2xl5個細胞。飢餓(無EPO存在)6小時後分別加入野生型ETO (1U/ml)或mEPO (1 和100 U/ml)或PBS (對照)，72小時後用胎盤藍染色，計數活細胞的數量。在野 生型EPO存在的條件下，32D-EP0R細胞在72小時內增殖了大約13倍(2.7x107), 而 mEPO和PBS對照一樣，只有O. 1%細胞存活，即使增加mEPO濃度100倍後對32D-EP0R細胞的存活也沒有任何影響，表明mEPO喪失了促紅細胞生成的能力。 二 、 mEP0對小鼠血紅蛋白濃度的影響
取體重25-30g， 2-3月齡C3H/HEN雌性小鼠(Taconic Laboratories, Taconic, 美國)，以每公斤體重5000單位的劑量腹腔內注射mEPO或野生型EP0，每周2次， 連續注射4周。每2周隱靜脈採血一次，用血紅蛋白儀(HemoCue AB， Angelholm，瑞 典)檢測血液中血紅蛋白濃度。隱靜脈採血具體操作如下採用氣體麻醉，1.5%異氟 垸混合70%N20和30%02經氣管插管行吸入麻醉。將覆蓋在小鼠後肢外側隱靜脈之上 的毛髮剃除，用右手拇指和食指擠壓覆蓋在外側隱靜脈之上的皮膚，使隱靜脈充盈， 酒精常規消毒後採用帶有毛細軟管的25號針頭採血。當取夠100 " 1靜脈血後迅速拔 出針頭，用棉球按壓穿刺點l-3分鐘促進創口止血。C3H/HEN雌性小鼠血紅蛋白的 正常值為14.5土2.0 g/100ml，長期大劑量mEPO注射對血紅蛋白沒有影響 (14. 3±1.8 g/100ml),而野生型EPO顯著增加血紅蛋白的含量，在第二周和第四周 分別達到注射前的115%和130%,表明mEPO喪失了促紅細胞生成的能力。
三、結果
體外實驗發現mEP0喪失了維持促紅細胞生成素依賴性細胞株(32D-EPOR)生存的 特性；體內實驗進一步證明大劑量，多次注射mEPO不增加小鼠的紅細胞數量和血紅 蛋白值，表明mEPO喪失了促紅細胞生成的能力。本發明的創造性之一在於新型腦保護 藥物無促紅細胞生成作用，從而避免了常規促紅細胞生成素有可能導致的繼發性血栓 形成，增加了臨床應用的安全性。
實施例4: mEPO腦保護作用的體外研究
為了確定純化的mEPO蛋白是否具有生物活性，我們驗證了其在NMDA毒性誘導的 祌經細胞死亡中的作用。
一、大鼠皮層神經元原代培養
按Cao等報導的方法進行(Cao G， J Neurosci. 2001, 21 (13): 4678-90)。簡言 之，取懷孕16至17天的SD大鼠胚胎，用剪刀將大腦皮層組織剪成約lmni3小塊，用 0.0W胰酶緩衝液37'C消化30分鐘後，加入馬血清滅活胰酶，用吸管吹打後過濾190g 離心10分鐘後收集細胞，重懸於Neurobasal培養基(Invitrogen)後種於poly-D-lysine coated 24孔板(3X105)或100mm盤(5X 106)中，同時加入50XB27 (+)添加 劑(invitrogen)，每72小時更換一次液體。用Neurobasal培養基所得神經元側純度
15為95%。
二、 NMDA毒性模型
生長至11天的原代培養神經元更換新鮮培養基，同時加入B27 (-)添加劑以及 mEP0或野生型EP0 (lU/ml)繼續培養。24小時後加入200幽NMDA，作用15分鐘後更 換為新鮮培養基及B27 (-)添加劑，同時加入mEP0或野生型EP0。 24小時後取培養基 上清檢測LDH活性，作為細胞死亡的標記。同時用Hoechest染色細胞核，計數濃縮及 片段化的細胞核比例。
三、 結果
如圖5所示，mEPO能顯著降低由隨DA誘導的細胞凋亡及壞死，其效果與商用標 準EP0 (股D System, Minneapolis,美國)相似。表明mEP0和野生型EP0—樣，在 抗函DA所致神經毒性方面具有相同的保護作用。
實施例5: mEPO對小鼠大腦中動脈阻塞模型腦梗死體積的影響
一、 小鼠短暫局部腦缺血模型的製作
利用單股尼龍縫合線栓塞左側大腦中動脈製作局部腦缺血模型。取體重25-30g ， 2-3月齡雄性C57/B6小鼠(The Jackson Laboratory, Bar Harbor,美國)，1. 5%異 氟烷/70°州20/30%02混和氣體氣管插管吸入麻醉。手術全程動物的直腸溫度通過反饋 恆溫加熱毯維持在37.0土0.5 'C之間，栓塞時使用鼠尾血壓監測器監測小鼠的平均動 脈壓，於栓塞後15分鐘取動脈血行血氣分析。栓塞60分鐘後於各指定時間點拔出線 栓恢復血供造成再灌注。手術完畢解除麻醉，小鼠北方回籠內飼養在2(TC恆溫的空調 屋內。
二、 梗死體積測定
梗死體積的測定採用Yang所描述方法(Stroke. 1994， 25(1) :165-70)。概括如下 於再灌注不同時間點處死動物，快速取出腦組織，冠狀位切片，共6片，每片厚2毫 米，將切好的腦片放入用PBS配置的2y。TTC (氯化2， 3, 5-三苯基四氮唑)溶液中， 37. 5'C水浴20分鐘，然後將其放入4%的多聚甲醛中固定15分鐘後取出拍照。使用圖 像分析系統(MCID, St. Catherine' s,加拿大)。計算機圖像分析系統計算各層腦組 織面積。公式為梗塞面積=非梗塞面積-梗塞側正常腦組織面積，這樣可以減小腦水 腫對計算梗塞面積的影響。總的梗塞體積^各層梗塞面積X層厚(2mm)。為了驗證TTC 染色測定梗死體積的準確性，實驗室進行了組織學染色與之對比。將動物處死後快速取腦，將腦組織放入2-甲基-丁烷在3(TC下冰凍。行冠狀位連續冰凍切片，每片厚20陶， 每隔0. 5mm取一張腦片(每個腦組織大概可取22-24張腦片)。切好的腦組織切片進行 甲酚紫染色，按上述的方法進行梗塞體積的計算。 三、結果
我們進一步證實了 mEPO在小鼠腦缺血再灌注模型中的神經保護作用。C57/B6小 鼠大腦中動脈栓塞60分鐘再灌注72小時後造成同側半球梗死，TTC染色顯示梗死體 積大約為32誦3。缺血後再灌注即刻使用5000U/kg mEPO可明顯減少梗死體積(P〈0. 01， 與空白對照組比較)，其效果與野生型EPO相似(圖6A和6B)，同時可以明顯改善神 經功能(圖6C)。表明無論是體內或體外，mEPO都具有很強很的神經保護作用。此研究 結果令人意外因為目前的研究認為EPO具有神經保護作用，而神經保護作用是通過 EPO與神經元上的EPO受體結合，激活與促紅細胞生成相同的信號通路而發揮作用。 因此，從理論上來講，破壞EPO受體結合位點後，EPO將不再具有神經保護作用。令 人意想不到的是，點突變破壞了 EPO受體結合位點後，EPO仍具有神經保護作用，使 這種突變型促紅細胞生成素成為一種無促紅細胞生成作用，但有神經保護作用的新型 神經保護藥物。
實施例6: mEP0促進神經功能恢復
到目前為止所有治療中風的試劑，若在中風48小時後給藥，均無治療效果。令人 興奮地是新型腦保護藥物在48小時後給藥(遲發性)，仍具有明顯的改善神經功能的 作用。遲發性給藥仍具有治療效果，其機制目前尚不清楚，可能與新型腦保護藥物誘 導血管再生和神經再生，從而促進神經功能的恢復有關。為了證實新型腦保護藥物是 否通過誘導血管再生和神經再生而發揮作用，我們進一步研究了新型腦保護藥物對 新生鼠缺氧缺血模型所致的神經功能損傷影響。 一、新生鼠缺氧缺血模型
應用出生後7天的新生Sprague-Dawley大鼠(Charles River實驗室，Wilmington, Mass)製備130分鐘缺氧/再灌注模型。簡而言之，在3%異氟烷麻醉下，結紮左側頸 總動脈，90分鐘後將動物放置於缺氧環境中(含氧量為8%)。 40分鐘後將動物放放回 正常環境中侍養。非缺血動物作為對照組。將野生型rEP0和變構型mEP0溶於0. 1%牛 血清白蛋白磷酸鹽緩衝溶液中，按照圖7A所示劑量腹腔注射製備野生型rEP0 (5000 U/kg)和變構型mEP0 (5000U/kg)。 0. 1%牛血清白蛋白磷酸鹽緩衝溶液注射作為非治療對照組。
二、 神經功能檢測
我們應用"腳踩空實驗"檢測神經功能。簡言之，動物被放置在升高8.5毫米 的網格地板上(34 x 29 mm)。網眼面積為2. 2 x 2. 2 cm。當大鼠在網格上移動的時 候，未受損傷的動物可以將爪子放在網架，在網上移動時可以抓牢格子。缺氧損傷的 動物不能準確地將一側前或者後肢放置踩在格子上，甚至會將前肢後肢從網眼中跌落， 即為1次"腳踩空"。觀察1分鐘，記錄腳步的總數，"腳踩空"次數。圖7D顯示缺 氧/再灌注之後感覺運動行為顯著缺失。與對照組相比，非治療組動物對側的(圖7E) 和同側的(圖7F)肢體"腳踩空"次數均顯著增高，EPO的應用可以減小這種神經功 能缺失的程度(圖7D， 7E和7F)(圖6B-D)。因此，外源性EP0在改善缺氧/再灌注後 的神經損傷是有效的。
三、 結果
出生後7天的Sprague-Dawley新生鼠給予缺氧缺血130分鐘，2, 4, 6, 9和 13天後分別給予腹腔注射mEPO (5000U/kg)，然後檢測祌經功能的恢復。我們發現盡 管遲發性mEPO注射不能減少缺氧缺血所致的梗死體積(圖7B和7C)，但能顯著提高 神經功能的恢復(圖7D, 7E和7F)，其效果與野生型EP0相似，而且mEPO可以大劑 量多次注射而不用擔心野生型EPO所致的血液學副作用。此結果意義重大，目前中風 唯一有效的藥物是t-PA，其治療窗口非常短，為中風後3小時內，因此只有不到10% 的中風患者適合t-PA治療。而EPO擴大了治療窗口，從而使更多中風患者得到治療。 此外，新型腦保護藥物可以長期注射而對血液系統沒有刺激作用，特別適用於用於腦 中風的康復治療。序列表
〈110〉曹國棟、陳俊、羅玉敏、吉訓明、邢娟
無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素及其用途

〈160〉 68
〈170> Patentln version 3.5
1 〈211〉 582 DNA <213〉人屬，人種
1 (人類促紅細胞生成素cDNA)
atgggggtgc acgaatgtcc tgcctggctg tggcttctcc tgtccctgct gtcgctccct 60
ctgggcctcc cagtcctggg cgccccacca cgcctcatct gtgacagccg agtcctggag 120
aggtacctct tggaggccaa ggaggccgag aatatcacga cgggctgtgc tgaacactgc 180
agcttgaatg agaatatcac tgtcccagac accaaagtta atttctatgc ctggaagagg 240
atggaggtcg ggcagcaggc cgtagaagtc tggcagggcc tggccctgct gtcggaagct 300
gtcctgcggg gccaggccct gttggtcaac tcttcccagc cgtgggagcc cctgcagctg 360
catgtggata aagccgtcag tggccttcgc agcctcacca ctctgcttcg ggctctgcga 420
gcccagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 480
actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 540
aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat ga 582
〈210〉 2 193 〈212〉 PRT <213〉人屬，人種
〈400〉 2 (人類促紅細胞生成素胺基酸序列)
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Pro
19Leu Gly Leu Pro Arg Tyr Leu Leu Ser Leu Asn Glu Met Glu Val Gly Val Leu Arg Gly His Val Asp Lys Ala Gin Lys Glu Thr Ala Asp Thr Lys Leu Tyr Thr
5 10 Val Leu Gly Ala Pro Pro 25 30 Glu Ala Lys Glu Ala Glu 45 50 Asn lie Thr Val Pro Asp 65 70 Gin Gin Ala Val Glu Val 85 90 Gin Ala Leu Leu Val Asn 105 110 Ala Val Ser Gly Leu Arg 125 130 Ala lie Ser Pro Pro Asp 145 150 Phe Arg Lys Leu Phe Arg 165 170 Gly Glu Ala Cys Arg Thr 185 190
15
Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val 35
Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu 55
Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp 75
Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser 95
Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu 115
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala 135
Ala Ala Ser Ala Ala Pro L>eu Arg 155
Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly 175
Gly Asp Arg
20
Leu Glu 40
His Cys 60
Lys Arg 80
Glu Ala
100 Gin Leu
120 Leu Arg
140 Thr lie
160 Lys Leu
180
〈210〉 3 166 〈212〉 PRT 人屬，人種
3 (成熟的人類促紅細胞生成素胺基酸序列)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Giu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr 45
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu 65
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu 85
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro 125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 4 <211〉 5 〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種 <400〉 4 (成熟的人促紅細胞生成素的第11-15號胺基酸) Val Leu Gin Arg Tyr
<210〉 5
〈211〉 8
〈212〉 PRT
人屬，人種
5 (成熟的人促紅細胞生成素的第44-51號胺基酸) Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp
21
Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 50 55 60
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 70 75 80
Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 90 95 100
Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 110 115 120
Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 130 135 140
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 150 155 160<210〉 6
9
PRT
<213〉人屬，人種
6 (成熟的人促紅細胞生成素的第100-108號胺基酸) Ser Gly Leu Arg Ser L>eu Thr Thr Leu
〈210〉 7 166 PRT 人屬，人種 <400〉 7 (I6A-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu 1
Glu Ala Glu
Ala Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 5 10 15
Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
105
110
75 Val
95 Gin 115
Asp Lys
Lys Ala
Glu Ala
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser 100
lie Ser 120
Arg Lys 140
Glu Ala
22145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 8 〈211> 166 〈212〉 PRT 8 (C7A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Ala Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165<210〉 9 166 人屬，人種 〈400〉 9 (C7S-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu 1
Glu Ala Glu
Val Pro Asp
Val Glu Val
Leu Val Asn
Gly Leu Arg
Pro Pro Asp
Leu Phe Arg
Cys Arg Thr
5
Asn lie 25 Thr Lys 45
Trp Gin
65 Ser Ser 85
Ser Leu
105 Ala Ala
125 Val Tyr
145 Gly Asp
165
lie Ser Asp Ser Arg Val 10
Thr Thr Gly Cys Ala Glu 30
Leu Glu Arg Tyr Leu 15
His Cys Ser Leu Asn 35
Leu Glu Ala Lys 20
Glu Asn lie
Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
50 55 Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
70
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His 90
Leu 75 Val 95
Asp
Gly Gin Ala Lys Ala Val
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie 110 115 Thr lie Thr Ala 135
Lys Leu Lys
Ser Ala Ala Pro Leu Arg 130
Ser Asn Phe Leu Arg Gly
Asp Thr Phe Arg
150
Leu 155
Tyr Thr Gly Glu
Arg
Thr 40 Ala 60 Leu 80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
10
〈211〉 166
PRT 〈213〉人屬,
人種
〈400〉 10 (R10I-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser lie Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys1 5 Glu Ala Glu Asn lie 25
Val Pro Asp Thr Lys 45
Val Glu Val Trp Gin 65
Leu Val Asn Ser Ser 85
Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
10 15
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
30 35
Vai Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
50 55
Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala
70 75
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val
90 95
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie 110 115
Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg 130 Arg 150
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr
135
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Arg
Leu Tyr Thr Gly Glu 155
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser
100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
11
〈211〉 166
〈212〉 PRT <213〉人屬
人種
<400〉 11 (VllS-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie 1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val 45
Ser Leu Glu Arg Glu His Cys Ser
Cys Asp Ser Arg 10
Thr Gly Cys Ala 30
Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met 50
Tyr 15
Leu 35
Glu 55
Leu Leu Glu Ala
Asn Glu Asn lie
Val Gly Gin Gin
Lys 20
Thr 40
Ala 60
25Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
12
〈211〉166
<212〉PRT
〈213〉人屬，人種
〈400>12 (L12A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu ]lie Cys Asp Ser Arg Val Ala Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 5055 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 7075 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 9095 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser105 Ala Als 125 Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
Pro Pro Asp Leu Phe Arg
110 115 120
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
130 135 140
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
150 155 160
Arg
〈210〉 13
166
<212〉 PRT
人屬，人種
〈400〉 13 (E13A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Ala Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
27Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
14
〈211〉 166
〈212> PRT
〈213〉人屬,,人種
〈400> 14 (R14A-EP0)
Ala Pro ProArg LeulieCys AspSerArgValLeu Glu Ala TyrLeuLeuGluAla
151015
Glu Ala GluAsn lieThrThr GlyCysAlaGluHis Cys Ser LeuAsnGluAsnlie
253035
Val Pro AspThr LysValAsn PheTyrAlaTrpLys Arg Met GluValGlyGinGin
455055
Val Glu ValTrp GinGlyLeu AlaLeuLeuSerGlu Ala Val LeuArgGlyGinAla
657075
Leu Val AsnSer SerGinPro TrpGluProLeuGin Leu His ValAspLysAlaVal
859095
Gly Leu ArgSer LeuThrThr LeuLeuArgAlaLeu Arg Ala GinLysGluAlalie
105110115
Pro Pro AspAla AlaSerAla AlaProLeuArgThr lie Thr AlaAspThrPheArg
125130135
Leu Phe ArgVal TyrSerAsn PheLeuArgGlyLys Leu Lys LeuTyrThrGlyGlu
145150155
Cys Arg ThrGly AspArg
165
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
〈210〉 15<211〉 166
<212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 15 (R14Q-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Gin Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210> 16
〈211〉 166
<212〉 PRT 人屬,
人種
〈400〉 16 (R14E-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Glu Tyr Leu Leu Glu Ala Lys1 5
Glu Ala Glu Asn lie
Val Pro Asp
Val Glu Val
Leu Val Asn
Gly Leu Arg
Pro Pro Asp
Leu Phe Arg
Cys Arg Thr
25
Thr Lys
45 Trp Gin
65 Ser Ser
85 Ser Leu
105 Ala Ala
125 Val Tyr
145 Gly Asp
165
10 15 20
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 30 35 40
Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 50 55 60
Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 70 75 80
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 90 95 100
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 110 115 120
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 130 135 140
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 150 155 160
Arg
〈210〉 17
<211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 17 (Y15A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Ala Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉18
〈211〉166
PRT
〈213〉人屬，人種
18 (Y15P-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu ]lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Pro Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
31105
Pro Pro Asp Ala Ala125
Leu Phe Arg Val Tyr145
Cys Arg Thr Gly Asp165
110 115 120
Ser Ala Ala Pro Uu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
130135 140
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
150155 160
<210〉19
〈211〉166
<212〉PRT
<213〉人屬，人種
〈400〉19 (Y15I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu ]lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg lie Leu Leu Glu1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr145 150 155
Gly GinGly GinLys AlaGlu AlaThr PheThr Gly
Ala Lys20
lie Thr40
Gin Ala60
Ala Leu80
Val Ser
100lie Ser
120Arg Lys
140Glu Ala
160
32Cys Arg Thr Gly Asp Arg165
〈210〉 20〈211〉 166〈212〉 PRT人屬，人種〈400〉 20 (T44I-EP0)Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala5 10 15
Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
25
30
35
Val Pro Asp lie Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Gly GinGly GinLys Ala
Gin
Ala
Val
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
145 150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
Lys
20Thr
40Ala
60Leu
80Ser100Ser120Lys140Ala160
21 166
<212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 21 (K45A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Ala Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 22〈211〉 166 PRT<213〉人屬:
人種
〈400〉 22 (K45E-EPO)Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys10
15
20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn
25 30 Val Pro Asp Thr Glu Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
105 110 Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu
125 130 Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
145 150 Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
Arg Thr lie Thr Ala Asp Gly Lys Leu Lys Leu Tyr
Leu 35 Glu 55 Leu 75 Val 95 Gin 115 Ala 135 Leu 155
Glu Asn lie Thr 40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
〈210〉 23
166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 23 (V46A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Ala Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
<210〉 24 〈211〉 166 〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種
〈400〉 24 (N47A-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser 1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Ala Phe Tyr 45
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu 65
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu
Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
10 15 20
Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
30 35 40
Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
50 55 60
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
70 75 80
Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
3685
Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
95 100
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
115 120
Ala Asp Thr Phe Arg Lys
135 140
Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
155 160
90 Arg 110 Leu 130 Arg 150
Ser Ala Als Pro Leu Arg Thr lie Thr
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys
Arg
〈210〉 25
〈211〉 166
〈212〉 PRT
人屬，人種
〈400〉 25 (F48A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1 5
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala 10 15 His Cys
25 30 Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Ala Tyr Ala Trp
Lys Arg
Ser Leu Asn Glu Asn lie 35
Met Glu Val Gly Gin Gin 55
45 50
Vai Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val
85 90 95
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie
110
Gly Leu Arg Pro Pro Asp
105 110 115
Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp 125 130 135
Thr Phe Arg
Lys
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser
100 Ser
120 Lys
140
37Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
26
〈211〉 166
〈212〉 PRT
人屬，人種
〈400> 26 (F48I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn lie Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165〈210〉 27
166
<212〉 PRT
<213〉人屬，人種
〈400〉 27 (Y49A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp
1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr Thr Gly
25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu
10 15
Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
30 35
Ala Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin 50 55
45
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
Cys Arg Thr
Gly 165
145 Asp
150
155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
Arg
28
〈211〉 166
〈212〉 PRT 〈213〉人屬:
人種
39)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Ser Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
29
166
〈212〉 PRT
人屬，人種
〈400〉 29 (W51E-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
40Arg Asp
30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Glu Lys Arg Met Glu Val
50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu
70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val
90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
110 115
Leu Arg Thr lie Thr Ala
130 135
Arg Gly Lys Leu Lys Leu
150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
25 Lys 45 Gin 65 Ser 85 Leu 105 Ala 125 Tyr 145 Asp 165
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
Asp
Tyr
40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
30
166
<212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
30 (W51F-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Phe Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
<210〉31
166
PRT
人屬，人種
〈400>31 (K52A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu ]1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr 25
Cys Asp Thr Gly
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu
10 15 Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
30
35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Ala Arg Met Glu Val Gly Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser 100
lie Ser 120
Arg Lys125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
130 135 Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu 150 155
140
Tyr Thr Gly Glu Ala 160
〈210〉 32
<211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
32 (K97A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Ala Ala Val
90
85
95
Gly Leu Arg Pro Pro Asp
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie 105 110 115
Ala Ala Ser Ala Ala Pro 125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp 130 135
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr 150 155
Thr Phe Arg Thr Gly Glu
Lys
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
43>人屬，人種 〈400〉 33 (S100A-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu Val Pro Asp Val Glu Val Leu Val Asn Gly Leu Arg Pro Pro Asp Leu Phe Arg Cys Arg Thr
34 166 〈212〉 PRT
5
Asn lie
25 Thr Lys
45 Trp Gin
65 Ser Ser
85 Ser Leu
105 Als Ala
125 Val Tyr
145 Gly Asp
165
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 10 15 20
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 30 35 40
Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 50 55 60
Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 70 75 80
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ala 90 95 100
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 110 115 120
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 130 135 140
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
160
150
155
Arg〈213〉人屬，人種 〈400〉 34 (S100E-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Glu
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
35
166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 35 (S100T-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr
145 150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Ala Val Thr 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
<210〉 36 〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213>人屬，人種
〈400〉 36 (G101A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
4665 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Ala Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
145 150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120 Lys 140 Ala 160
〈210〉 37
166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 37 (G101I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
15 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
65 70
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90
lie Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
105
110
55 Leu
75 Val
95 Gin 115
Arg Asp Lys
Gly Gin Gly Gin Lys Ala
Gin
Ala
Val
Glu Ala lie
Lys
20
Thr
40 Ala 60 Leu
80 Ser 100 Ser 120
47Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 38
〈211〉 166
〈212> PRT
人屬，人種
<400〉 38 (L102A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu
15 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
45 50
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
65 70
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
Gly Ala Arg Pro Pro Asp Leu Phe Arg
85 90 Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
105
110
55 Leu
75 Val
95 Gin 115
Arg Asp Lys
Gly Gin Lys Ala Glu Ala
Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
150
155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160165
39 166 〈212〉 PRT 人屬，人種 〈400〉 39 (R103A-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie 1
Glu Ala Glu Asn
5
lie 25
Thr
Cys Asp Thr Gly
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
10 15 Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
30
35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 65 70 75
Gly Gin Gly Gin
Gly Leu Ala Ser Pro Pro Asp Ala Leu Phe Arg Val Cys Arg Thr Gly
Leu 105 Ala 125 Tyr 145 Asp 165
Ser Ala Ala Pro
Ser Asn Phe Leu
Gin
Ala
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val 85 90 95
Thr Thr Leu Leu Arg Ala l>eu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie 110
Leu Arg 130
Arg Gly
150 155
115
Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg 135
Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
Lys
20 Thr
40 Ala
60 Leu
80 Ser
100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
Arg
40 166
49 PRT
〈213>人屬，人種
40(R103E-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
6570 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
8590 95 100
Gly Leu Glu Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 41
〈211〉 166
<212〉 PRT
<213〉人屬，人種
<400〉 41 (R103H-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val
90 Arg 110 Leu 130
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys 150
85
Gly Leu His Ser Leu Thr Thr Leu Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro 125 Tyr 145
Asp Arg 165
Ala Uu Arg Ala Arg Thr lie Thr
Leu Phe Arg Val Cys Arg Thr Gly
95 Gin 115 Ala 135 Leu 155
Lys Glu Ala lie Asp Thr Phe Arg
Tyr
Thr Gly Glu
40 Ala
60 Leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160
〈210〉 42 <211〉 166 〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種
〈400〉 42 (R103N-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
51Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 85 90
Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys 105 110
Ala Ser Ala Ala Pro Leu 125 130
Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 145 150
Asp Arg 165
Gly Leu Asn Ser Pro Pro Asp Ala Leu Phe Arg Val Cys Arg Thr Gly
Arg Thr lie Thr Gly Lys Leu Lys
75 Val
95 Gin 115 Ala 135 Leu 155
Asp
Tyr
80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
43
166
〈212> PRT
人屬，人種
43(R103Q-EPO)
Ala Pro ProArgLeulieCys AspSerArgVal Leu Glu ArgTyr
151015
Glu Ala GluAsnlieThrThr GlyCysAlaGlu His Cys SerLeu
253035
Val Pro AspThrLysValAsn PheTyrAlaTrp Lys Arg MetGlu
455055
Val Glu ValTrpGinGlyLeu AlaLeuLeuSer Glu Ala ValLeu
657075
Leu Val AsnSerSerGinPro TrpGluProLeu Gin Leu HisVal
859095
Gly Leu GinSerLeuThrThr LeuLeuArgAla Leu Arg AlaGin
105110115
Leu Leu Glu Ala Lys 20
Asn Glu Asn lie Thr 40
Val Gly Gin Gin Ala 60
Arg Gly Gin Ala Leu 80
Asp Lys Ala Val Ser 100
Lys Glu Ala lie Ser 120
52Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys 125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 44
〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 44 (S104A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
15 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val
Gly Gin Gly Gin Lys Als
Gin
Ala
Val
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
85 90 95
Gly Leu Arg Ala Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
145 150 155
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
Lys
20
Thr
40 Ala 60 leu
80 Ser 100 Ser 120 Lys 140 Ala 160165
<210〉 45 <211〉 166 PRT 〈213〉人屬，人種 〈400〉 45 (S104I-EP0) Ala Pro Pro Arg Leu lie 1
Glu Ala Glu Asn
5
lie 25
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15 Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
30
35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin 45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His 85 90
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
Gly Gin Lys Ala
Gly Leu Arg lie Pro Pro Asp Ala
Ser Ala Ala Pro
leu 105 Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
110 Leu 130 Arg 150
Arg Gly
Val Asp 95
Gin Lys Glu Ala 115
Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe 135
Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly 155
Als Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
〈210> 46 〈211〉 166 〈212〉 PRT
54人屬，人種<400〉 46(S104E-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Glu Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
47
〈211〉 166
〈212> PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 47 (L105A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
90 95 100
Gly Leu Arg Ser Ala Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
110 115 120
Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys130135 140
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala150155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
lie25Lys45Gin65Ser85Ala105Ala125Tyr145Asp165
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
〈210〉 48
〈211〉 166
〈212〉 PRT〈213〉人屬，人種
〈400〉 48 (T106A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Ala Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 49
〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 49 (T106I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys八la Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu lie Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
57Pro Pro Asp
Leu Phe Arg
Cys Arg Thr
105Ala Ala
125Val Tyr
145Gly Asp
165
110 115
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg
130 135
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu
Arg
150
155
120Lys140Ala160
〈210〉 50
〈211> 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 50 (T107A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Ala Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145150155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165
<210〉 51
166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 51 (T107I-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25 30 35
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr lie Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu
125 130
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg
145 150Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
115
Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe135
Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly155
Ala Lys20
lie Thr40
Gin Ala60
Ala Leu80
Val Ser
100lie Ser
120Arg Lys
140Glu Ala
160
〈210〉 52
59 166
<212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400> 52 (L108A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala L.eu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Ala Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 53
〈211〉 166
〈212〉 PRT〈213>人屬:
人種
〈400〉 53 (L108E-EPO)Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
601 5 Glu Ala Glu Asn lie 25
Val Pro Asp Thr Lys 45
Val Glu Val Trp Gin 65
Leu Val Asn Ser Ser 85
Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
10
Thr Thr Gly Cys Ala 30
Val Asn Phe Tyr Ala 50
Gly Leu Ala Leu Leu 70
Gin Pro Trp Glu Pro 90
Thr Thr Glu Leu Arg 110
Ser Ala Ala Pro Leu 130 Arg 150
15
Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn 35
Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin 55
Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin 75
Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala 95
Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala 115
Arg Thr lie Thr
Ala Asp Thr Phe 135
Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
155
20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
Arg
〈210〉 54
〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 54(L108K-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Lys Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 55
〈211〉 166
PRT 〈213〉人屬,
人種
<400〉 55(L108S-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser
1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr 45
Arg
10
Ala
30
Ala
50
Val Leu Glu Arg Glu His Cys Ser Trp Lys Arg Met
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val
65 70 Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90 Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Ser Leu Arg Ala Leu Arg Ala
Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 20 Leu Asn Glu Asn lie Thr 35 40 Glu Val Gly Gin Gin Ala
55 60 Leu Arg Gly Gin Ala Leu
75 80 Val Asp Lys Ala Val Ser
95 100 Gin Lys Glu Ala lie SerPro Pro Asp Leu Phe Arg Cys Arg Thr
105 Ala Ala
125 Val Tyr
145 Gly Asp
165
110
Ser Ala Ala Pro Leu 130
Ser Asn Phe Leu Arg 150
Arg
115 120 Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
135 140 Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
155 160
〈210> 56
166
〈212〉 PRT
〈213>人屬，人種
〈400〉 56 (S146A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr Thr Gly
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 45
Cys Tyr
Ala 30 Ala 50
35
Trp Lys Arg Met Glu Val 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 65 70 75
Gly Gin Gly Gin
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ala Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
145 150 155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
AIei Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
63Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
57
〈211〉 166
〈212> PRT
〈213〉人屬，人種
57 (N147A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
Cys Asp Thr Gly
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
5
Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn 30 35
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala
85 90 95
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
105 110 115
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Ala Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
150
155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160
<210〉 58〈211〉 166
〈212〉 PRT
人屬，人種
<400〉 58 (F148A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Ala Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 59
〈211〉 166
PRT 人屬:
人種
〈400〉 59 (F148Y-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys1 5 Glu Ala Glu Asn lie 25
Val Pro Asp Thr Lys 45
Val Glu Val Trp Gin 65
Leu Val Asn Ser Ser 85
Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125
Leu Phe Arg Val Tyr 145
Cys Arg Thr Gly Asp 165
Thr Thr Gly Cys Val Asn Phe Tyr
10 15
Ala Glu His Cys Ser Leu Asn 30 35
Ala Trp Lys Arg Met Glu Val 50 55
Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg
70 75
Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp
90 95
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys
110 115
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp
130 135
Ser Asn Tyr Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr 150 155
Arg
20
Glu Asn lie Thr 40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Als Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
〈210〉 60
〈211〉 166
〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種
<400〉 60 (L149A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
1 5 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
6645 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Ala Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
〈210〉 61
〈211〉 166
〈212〉 PRT
人屬，人種
<400〉 61 (R150A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr Thr Gly
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 45
Cys Tyr
Ala 30 Ala 50
35
Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala 85 90 95
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Ala Leu 80
Val Ser 100
67Gly Leu Arg Ser Leu 105
Pro Pro Asp Ala Ala 125 Val Tyr 145 Gly Asp 165
Leu Phe Arg Cys Arg Thr
Thr Thr Uu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser
115 120
Ala Asp Thr Phe Arg Lys
135 140
Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
155 160
Arg 110 Leu 130 Ala 150
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr
Ser Asn Phe Leu Ala Gly Lys Leu Lys
Arg
〈210〉 62
166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
<400〉 62 (R150E-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
5
Asn lie Thr Thr Gly
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn
25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe
Cys Tyr
35
Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
Ala 30 Ala
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70 75
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala 85 90 95
Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala
Gly Leu Arg Pro Pro Asp Leu Phe Arg
105 110 115
Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe
125 130 135
Val Tyr Ser Asn Phe Leu Glu Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Als L>eu 80
Val Ser 100
lie Ser 120
Arg Lys 140
Glu Ala145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
63
<211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 63 (R150I-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
1
Glu Ala Glu
Cys Asp Thr Gly
Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu 10 15
5
Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin
Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn 30 35
45 50 55
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin
65 70
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His
85 90
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala
105 110 Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu
125 130 Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu lie
145 150 Cys Arg Thr Gly Asp Arg
165
Arg Gly
75
Val Asp Lys Ala 95
Gin Lys Glu Ala 115
Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe 135
Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly 155
Ala Lys 20
lie Thr 40
Gin Ala 60
Als Leu 80
Val Ser
100 lie Ser
120 Arg Lys
140 Glu Ala
160〈210> 64
〈211〉 166
〈212〉 PRT
〈213〉人屬，人種
〈400〉 64 (G151A-EP0)
Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 15 10 15 20
Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
25 30 35 40
Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
45 50 55 60
Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu
65 70 75 80
Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser
85 90 95 100
Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser 105 110 115 120
Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys
125 130 135 140
Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Ala Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala
145 150 155 160
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
〈210〉 65
〈211〉 166
<212〉 PRT
人屬，人種
65 (K152A-EPO)
Ala Pro Pro Arg Leu lie
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val 45
Val Glu Val Trp Gin Gly 65
Leu Val Asn Ser Ser Gin 85
Gly Leu Arg Ser Leu Thr 105
Pro Pro Asp Ala Ala Ser 125
Leu Phe Arg Val Tyr Ser 145
Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165
<210〉 66 〈211〉 166 〈212〉 PRT 〈213〉人屬，人種 66(K152W-EPO) Ala Pro Pro Arg Leu lie 1 5 Glu Ala Glu Asn lie Thr 25
Val Pro Asp Thr Lys Val 45
Val Glu Val Trp Gin Gly
10
Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn 30
Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val 50
Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg 70
Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp 90
Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys 110
Ala Ala Pro Leu 130
Asn Phe Leu Arg 150
Arg Thr lie Thr Ala Asp 135
Gly Ala Leu Lys Leu Tyr
15 Leu 35 Glu 55 Leu 75 Val 95 Gin 115 Ala 135 Leu 155
20
Glu Asn lie Thr 40
Gly Gin Gin Ala 60
Gly Gin Ala Leu 80
Lys Ala Val Ser 100
Glu Ala lie Ser 120
Thr Phe Arg Lys 140
Thr Gly Glu Ala 160
Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys
10 15 20
Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr
30 35 40
Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala
50 55 60
Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser85 90 95 100Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser105 110115 120Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys125 130 135 140Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Trp Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp Arg165〈210〉 67〈211〉 166〈212〉 PRT人屬，人種 67 (C161A-EP0)Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys 1 5 10 15 20Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr 25 30 35 40Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin Gin Ala 45 50 55 60Val Giu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin Ala Leu 65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser 85 90 95 100Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala lie Ser120105110115Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 125Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe 145Ala Arg Thr Gly Asp Arg 165Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp 130 135Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr 150 155Thr Phe Arg Lys 140Thr Gly Glu Ala 160〈210〉 68 PRT〈213〉人屬，人種 68 (R162A-EPO)Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu15 10 15Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn25 30 35Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gin45 50 55Val Glu Val Trp Gin Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gin65 70 75Leu Val Asn Ser Ser Gin Pro Trp Glu Pro Leu Gin Leu His Val Asp Lys Ala85 90 95Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Arg Ala Gin Lys Glu Ala110105Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu 125 130Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg 145 150Cys Ala Thr Gly Asp Arg 165Arg GlyThr lie ThrLys Leu Lys115 Ala 135 Leu 155Asp TyrThr PheThr GlyAla Lys 20lie Thr 40Gin Ala 60Ala Leu 80Val Ser100 lie Ser120 Arg Lys140 Glu Ala1607權利要求
1.一種無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素，為野生型人促紅細胞生成素在下述三個區域中的至少一個區域進行突變而產生的變構體(1)VLQRY人促紅細胞生成素的第11-15號胺基酸；(2)TKVNFYAW人促紅細胞生成素的第44-51號胺基酸；(3)SGLRSLTTL人促紅細胞生成素的第100-108號胺基酸。
2. 根據權利要求1所述的無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素， 其特徵在於所述突變為單點或多點突變、單個或多個胺基酸缺失、以及突變加缺失複合突 變。
3. 根據權利要求1或2所述的無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生 成素，其特徵在於所述無促紅細胞生成特性的新型促紅細胞生成素為序列表SEQID No.7至SEQ ID No.68中的任一胺基酸序列。
4. 根據權利要求3所述的無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素， 其特徵在於，特別是第14號精氨基突變為丙氨基(序列#14)，穀氨醯胺(序列S15)以 及穀氨酸(序列#16);第45號賴氨酸突變為丙氨基(序列#21)以及穀氨酸(序列 #22);第100號絲氨酸突變為丙氨基(序列tt33)以及穀氨酸(序列#34);第103號精 氨基突變為丙氨基(序列tt39)以及穀氨酸(序列tt40);第104號絲氨酸突變為丙氨基(序 列M4)，異亮氨酸(序列M5)以及穀氨酸(序列1146)。
5. —種無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素，其特徵在於 除權利要求l中所述三個區域外，在人促紅細胞生成素的第6， 7， 10， 20， 21， 29， 33， 38， 42， 52， 59， 63， 67， 70， 83， 96， 97， 126， 142， 149， 150， 151， 152, 153， 155， 156， 161號胺基酸位置進行突變而產生的變構體。
6. 根據權利要求1或5所述的無促紅細胞生成特性的新型促紅細胞生成素，與其 它蛋白或多肽進行融合、置換、化學交聯而產生的新型融合蛋白。
7. —種無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素在製備保持、 增強神經保護作用、或用於神經功能康復治療的藥物中的應用。
8. —種無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素在製備用於中 樞神經系統以外的臟器，如心臟、腎臟等臟器的缺血性損傷的治療藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種無促紅細胞生成特性、具有神經保護作用的促紅細胞生成素及其用途。本發明為在野生型人促紅細胞生成素的下述三個區域中的至少一個區域及其它28個散在位點發生突變產生的變構體(1)VLQRY人促紅細胞生成素的第11-15號胺基酸；(2)TKVNFYAW人促紅細胞生成素的第44-51號胺基酸；(3)SGLRSLTTL人促紅細胞生成素的第100-108號胺基酸。本發明具有神經保護作用，但無促紅細胞生成作用，避免了常規促紅細胞生成素導致繼發性血栓形成，增加臨床應用安全性；擴大了治療群體，使血液粘稠度較高而不能用常規促紅細胞生成素進行治療的腦卒中患者得到治療；本發明48小時後給藥，仍具有明顯改善神經功能作用。可以長期注射對血液系統沒有刺激。
文檔編號C07K19/00GK101671389SQ20081022210
公開日2010年3月17日 申請日期2008年9月9日 優先權日2008年9月9日
發明者吉訓明, 曹國棟, 羅玉敏, 娟 邢, 俊 陳 申請人:曹國棟;陳 俊;羅玉敏;吉訓明;邢 娟