針對登革病毒四種血清型的免疫接種方法

2023-06-04 05:03:41 1

專利名稱：：針對登革病毒四種血清型的免疫接種方法針對登革病毒四種血清型的免疫接種方法
技術領域：
：本發明涉及可在患者體內誘導針對四種登革病毒(dengue)血清型(serotype)的同源性寸呆護(protectionhomologue)的方法，包4舌只十所述患者的相繼(s—ntielle)給藥(i)一劑量(unedosede)第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，其中疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥後至少30天和最長1年給藥。登革熱是由黃病毒屬的四種病毒導致的，其血清型相似但是從抗原角度看又不同(Giibleretal"1988In:Epidemiologyofarthropod-borneviraldisease.MonathTPM,editor,BocaRaton(FL):CRCPress:223-60;Kautneretal"1997,J.ofPediatrics,131:516-524;Rigau畫P6rezetal.,1998，Lancet;352:971-977;Vaughnetal.,1997,JInfectDis;176:322-30)。感染登革病毒血清型可以產生不同臨床疾病，從非特異性的病毒性症狀到致死性的嚴重出血性疾病。蚊子叮咬後發生登革熱的潛伏期大約是4天(從3天到14天)。登革熱的特徵是雙相熱、頭疼、身體不同部位疼痛、衰竭、皮滲、淋巴結病和白細胞減少(Kautneretal.,1997，J.ofPediatrics,131:516-524;Rigau措ezetal"1998,Lancet;352:971-977)。病毒血症期與發熱性疾病相同(Vaughnetal.,1997,J.Infect.Dis.;176:322-30)。登革熱的康復發生在7到10天後，但是通常會有長時間的疲乏。常見白細胞和血小板數量變化的疾病。出血性登革熱是一種嚴重的發熱性疾病，特徵是內環境異常和血管通透性的增加導致血容量過低和低血壓(登革中風症狀)，通常伴有嚴重的內出血。出血性登革熱的死亡率在不治療的情況下可以高達10%,但是在大多數有經-瞼的醫療中心經治療後死亡率僅為l%(WHOtechnicalGuide,1986.Denguehaemorrhagicfever:diagnosis,treatmentandcontrol,pi-2.WorldHealthOrganization,Geneva,Switzerland)。登革熱的常規實驗室診斷是基於病毒分離和/或登革病毒特異性抗原的一企測。登革熱是僅次於瘧疾的第二類常見熱帶傳染病，超過全球一半的人口(25億)生活在有登革熱流行傳播風險的區域。估計每年登革熱患者5000萬到l億，出血性登革熱住院患者50萬，死亡患者2.5萬。登革熱在亞洲、太平洋區域、非洲、拉丁美洲和加勒比地區流行。登革病毒感染在超過IOO個熱帶國家流行，其中60個國家有出血性登革熱的記載(Gubler,2002,TRENDSinMicrobiology.10:100-103;Monath,1994，Proc.Natl.Acad.Sci;91:2395-2400)。一些詳細描述的因素似乎與登革熱有關人口增長；非計劃和控制的城市化，尤其是同時伴隨貧窮；空中旅行的增加；缺乏對蚊子的有效控制以及衛生基礎設施和公共衛生的惡化(Gubler，2002，TRENDSinMicrobiology.10:100-103)。對於旅行者和流浪者，關於登革熱的警告不斷增加(Shirtcliffeetal.，1998，J.Roy.Coll.Phys.Lond..;32:235-237)。登革熱在熱帶區域地方性流行期間成為構成美國軍隊發熱性疾病的主要原因之一(DeFraitesetal.，1994,MMWR1994;43:845-848)。登革病毒在涉及人類和埃及伊蚊(Je6/M^gy/")的循環中存在，埃及伊蚊是一種白天叮人的家蚊，喜好叮咬人類。人類的感染開始於感染的埃及伊蚊吸血過程中病毒的注入。唾液中的病毒主要在血管外組織中沉積。潛伏期過後第一類受感染的細胞是樹突細胞，此後遷移到淋巴結(Wuetal，2000,NatureMed;7:816-820)。在皮膚和淋巴結早期複製後，在急性發熱期出現在血液中，通常3-5天。與樹突細胞一樣，單核細胞和巨嗜細胞是登革病毒的第一批耙細胞。預防同種類型的再感染的保護是徹底的並且通常是持續終生的，但是不同類型的登革病毒之間的交叉保護僅持續幾周或者幾月(Sabin，1952,Am.J.Trop.Med.Hyg;1:30-50)。因此，同一個個體可以感染不同的血清型。二次感染登革病毒在理論上是發生嚴重登革熱疾病的一個危險因素。然而，出血性登革熱是多因素導致的這些因素包括涉及的病毒抹，以及患者的年齡，免疫狀態和基因的遺傳缺陷。兩種因素在出血性登革熱的發生中起到關鍵作用伴隨嚴重病毒血症的快速病毒複製(與病毒血症水平相關的疾病的嚴重程度；Vaughneta1,2000,J.Inf，Dis;181:2-9)和伴隨高水平炎症介質釋》文的嚴重的炎症反應(RothmanandEnnis,1999,Virogogy;257:1-6)。沒有針對登革熱的特異性治療。登革熱的治療是對症治療，包括臥床休息、用退燒藥和鎮痛藥控制體溫和疼痛，以及足夠的液體攝入量。出血性登革熱的治療需要補充體液損失，替代凝血因子和注射肝素。目前預防性措施是基於控制傳病媒介和採取個人防護措施，這些措施都很難實施並且成本很高。到目前為止沒有預防登革熱的疫苗被批准。考慮到四種登革熱血清型在全世界中存在並且有報導稱其與登革出血熱有關，理想狀態下，疫苗應該能夠防禦登革病毒的全部四種血清型。以前實施過相繼疫苗接種策略，目的是誘導產生不同登革病毒血清型之間的異源性保護。因此，Price(1968,Am.J.Epid，88:392-397)介紹了防禦登革熱的相繼疫苗接種方法，包括登革病毒血清型1和其後登革病毒血清型2的兩次感染，在用登革病毒血清型3和4感染的試驗中提供保護。Whitehead等人(1970，Am.J.Trop.Med.Hyg，19:94國102)探索確定4種登革病毒血清型中的2或3種相繼一價感染對異源性免疫的影響。因此，Gibbons首先感染登革病毒血清型1,2,3或4型。隨後二次感染另外一種不同的血清型，檢測到的病毒血症不同，這主要取決於感染的順序，尤其是第一次感染的血清型。更具體地說，最初感染血清型2，3或4後感染血清型1，2或4後再次發生病毒血症。Scherer等人(1972,Am.J.Epid，95:67-79)描述了相繼一價感染，包括首先感染四種登革病毒血清型中的一種，隨後第二次感染，或者甚至第三次感染同種或者不同種的血清型。提出的方案並沒有獲得防禦異源性血清型感染的滿意的保護效果。Halstead等人(1973,Am.J.Trop.Med.Hyg,22:365-374)評價了在猴子的一種預防登革熱的相繼免疫接種方法，包括登革病毒血清型1到4中的不同的2種，3種或者4種血清型的一價感染。作者得出結論，通過相繼接種血清型1,2然後4，可以獲得防禦血清型3感染的保護作用。並未描述和建議二價免疫接種。此外，考慮到相繼免疫接種費時費力和效果的隨機性，作者建議不釆用相繼免疫接種。Halstead等人(1973，Am.J.Trop.Med.Hyg,22:375-381)也發現兩種不同登革病毒血清型的二價免疫接種，在防禦第三種登革病毒血清型的感染中，不起保護作用，或者僅僅起部分保護作用。本發明的目的是誘導防禦4種登革病毒血清型的同源性保護。發明人證實,當相繼成對給藥(administr6ss6quentiellementdeuxpardeux)曰於,產生包括中和4種血清型的抗體的免疫反應是可能的。發明人特別顯示了DEN-1，2二價免疫接種後2個月二價免疫接種DEN-3，4在所有免疫接種的猴子中誘導產生防禦四種血清型的強烈反應。這種方法產生的免疫反應數量和質量上更強(包含所有的血清型)。根據第一個主題，所以本發明涉及疫苗組合物，其包含(i)一劑量第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，作為防禦登革熱(dengue)的相繼給藥的疫苗組合物(composition)的組合(combinaison)，疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥後至少30天和最長1年給藥。根據本發明的疫苗組合物的一個實施方案，所述疫苗病毒(ii)在疫苗病毒(i)給藥後30天到3個月期間給藥。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述疫苗病毒(ii)在疫苗病毒(i)給藥後30天後給藥。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒(i)以二價疫苗組合物形式給藥。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒(ii)應該以二價疫苗組合物形式給藥。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述所述疫苗登革病毒血清型1選自由VDV1毒林(souche)和ChimeriVaxDEN-1組成的組。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型2選自由VDV2毒抹和ChimeriVaxDEN-2組成的組。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型1是VDV1毒抹，所述疫苗登革病毒血清型2是VDV2毒抹。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型1是ChimeriVaxDEN-l,所述疫苗登革病毒血清型2是ChimeriVaxDEN-2。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型3是ChimeriVaxTMDEN-3。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型4是ChimeriVaxTMDEN-4。根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，第一種和第二種血清型分別是CYDDENl和CYDDEN2,第三種和第四種血清型分別是CYDDEN3和CYDDEN4.根據本發明的疫苗組合物的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型1，2，3和4的每一種的劑量範圍均是從103到105DICC50。本發明的另一個主題是第三種血清型的疫苗登革病毒和第四種血清型疫苗登革病毒的用途，用於製造登革疫苗，以便向曾經在至少30天到最多1年前使用過一劑量第一種血清型的革病毒疫苗和一劑量第二種血清型的登革病毒疫苗的患者給藥。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，第三和第四種血清型以二價疫苗組合物的形式給藥。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，第一和第二種血清型以二價疫苗組合物的形式給藥。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型1選自由VDV1毒林和ChimeriVaxDEN-1組成的組。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型2選自由VDV2毒抹和ChimeriVaxDEN-2組成的組。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型1是VDV1毒林，所述疫苗登革病毒血清型2是VDV2毒抹。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型1是ChimeriVaxDEN-1，所述疫苗登革病毒血清型2是VChimeriVaxDEN-2。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型3是ChimeriVaxDEN-3。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，所述疫苗登革病毒血清型4是ChimeriVaxDEN-4。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，第一種和第二種血清型分別是CYDDENl和CYDDEN2,第三種和第四種血清型分別是CYDDEN3和CYDDEN4.根據本發明的用途的另一個具體實施方案，第三種和第四種血清型在第一種和第二種血清型給藥後30天到3個月期間給藥。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，第三種和第四種血清型在第一種和第二種血清型給藥30天給藥。根據本發明的用途的另一個具體實施方案，疫苗登革病毒血清型1，2，3和4的每一種的劑量範圍均是從103到105DICC50。在說明書下文中將進一步詳細地描述本發明。定乂"登革病毒"或"DENs"是單股正鏈RNA病毒，屬於黃病毒科(y/av/Wn'Jaew/(y)黃病毒屬CF/av/wVw力。RNA基因組包含5'端的I型帽結構，但是3'端缺乏poly-A尾。基因組結構包括以下組件5'端非編碼區域(NCR)，結構蛋白(衣被膜蛋白(C)，前膜/膜蛋白(prM/M)，被膜蛋白(E)和非結構蛋白(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5)，以及3'端非編碼區域NCR。基因組病毒RNA與殼體蛋白結合形成核殼體。至於其他的黃病毒，DEN病毒基因組編碼翻譯為單個多聚蛋白的不間斷編碼區域。"VDV"或"細胞毒素登革疫苗(vaccindengueVero)"表示一種適用於Vero細胞的活性減毒登革病毒抹，可以誘導產生特異的體液免疫，包括在靈長類和人類誘導產生中和抗體。"VDV-r是從野生型毒林DEN-l16007中獲得的毒林，其經歷PDK細胞傳11代(DEN-l16007/PDK11),然後在Vero細胞上於32。C擴增，將其RNA純化並轉染到Vero細胞中。與疫苗毒才朱DEN-l16007/PDK13(在PDK-原代狗腎細胞-細胞傳13代)相比，VDV-1毒抹有14種額外的突變。DEN-l16007/PDK13毒抹,也稱作"LAVl"，在瑪希隆大學的專利申請EP1159968中有詳細描述，並且保藏在CNCM(國家微生物培養物保藏中心)，編號為1-2480。VDV-1毒林的完整序列在序列SEDIDNO:l中給出。所述的毒才朱可以通過所述序列快速複製。VDV-1毒衝朱製備的方法和特徵在以SanofiPasteur和疾病預防控制中心名義提交的國際專利申請PCT/IB2006/001313中描述過。"VDV-2"是獲自野生型毒林DEN-216681的毒林，將野生型毒林DEN-116007在PDK細胞傳50代(DEN-216681/PDK50),噬斑純化，提取純化RNA然後轉染到Vero細胞。然後通過對Vero細胞的噬斑純化和擴增獲得VDV-2毒林。與疫苗毒抹DEN-216681/PDK53(在PDK細胞傳53代)相比VDV-2毒林有IO種額外的突變，4種突變是不表達的。DEN-216681/PDK53毒抹也稱為"LVA2"，在瑪希隆大學的專利申請EP1159968中有描述，並且保藏於CNCM(微生物培養國家收藏)，編號為1-2481。VDV2毒抹的完整序列在序列SEDIDNO:2中給出。VDV-2毒抹可以通過所述的序列快速複製。VDV-2毒林製備的方法和特4正在以SanofiPasteur和疾病預防控制中心名義^是交的國際專利申請PCT/IB2006/001513中描述過。術語"ChimeriVaxTM登革病毒"或"CYD，，是指嵌合體黃熱(YF)(f《vrejaune(YF)chim6re)病毒，它包含黃熱病毒的骨架，其中編碼前膜蛋白和被膜蛋白(prolined'e鵬loppe)的序列已經被DEN病毒的序列(sequences)所替換。因此，用術語"CYD-1或CYDDEN-1"描述包含登革熱血清型1毒林(DEN-1)prM和E序列的嵌合體黃熱病毒。用術語"CYD-2或CYDDEN-2"描述包含DEN-2毒林prM和E序列的嵌合體黃熱病毒。用術語"CYD-3或CYDDEN-3"描述包含DEN-3毒抹prM和E序列的嵌合體黃熱病毒。用術語"CYD-4或CYDDEN-4"描述包含DEN-4毒抹prM和E序列的嵌合體黃熱病毒。這些ChimeriVax登革病毒的製備方法在國際專利申請WO98/37911和WO03/101397中有詳細描述，關於其製備方法的精確描述參考上述專利。實施例中描述的嵌合體是利用來自DEN1PU0359，DEN2PR159,DEN3PaH881和DEN4TVP980毒林的prM和E序列產生的。登革病毒的任何毒林都可以用在本發明中來構建嵌合體。優選地，嵌合體黃熱病毒包含減毒(att6nu6e)黃熱毒抹YF17D的骨架(TheilerM,andSmithHH(1937)JExp.Med65,p767畫786.)(YF17D/DEN-1,YF17D/DEN-2,YF17D/DEN-3,YF17D/DEN-4病毒)。可以使用的YF17D毒林的例子包括YF17D204(YF-Vax，SanofiPasteur,Swifwater,PA，USA;Stamaril,SanofiPasteur,Marcyl，Etoile,France;ARILVAX,Chiron，Speke,Liverpool,UK;FLAVIMUN,BernaBiotech,Bern,Switzerland;YF17D-204France(X15067，X15062);YF17D-204,234US(Riceetal.,1985，Science,229:726-733);或者其他的相關毒抹YF17DD(Genbanknum6rod,acc6sU17066)YF17D-213(Genbanknum6rod，acc6sU17067)以及Galler等描述的YF17DD(1998,Vaccines16(9/10):1024-1028)。任何其它用於人類的顯著減毒的黃熱病毒毒4朱都可以使用。"一價(monovalent)，，疫苗包含單一登革病毒血清型。"二價(bivalent)，，疫苗包含兩種不同的登革病毒血清型。"三價(trivalent)"疫苗包含三種不同的登革病毒血清型。"四價(t6travalent)"疫苗包含四種不同的登革病毒血清型。術語"患者"是指可能感染登革熱的個體(兒童或者成人)，尤其是感染高風險個體，例如，登革熱流行區域的旅遊者或者居住者。發明人已經顯示四種血清型的兩個相繼二價給藥的方式可以獲得防禦四種血清型的有效同源性保護。因此，根據本發明的方法在預防登革熱的免疫接種策略中非常有價值。因此，發明人提出在患者體內誘導產生防禦4種登革病毒血清型的中和抗體反應的方法，包括對所述患者相繼給藥(i)一劑量第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，其中疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥後至少30天和最長3個月給藥。在本發明中，術語"疫苗登革病毒"是指能夠誘導特異性同源反應的登革病毒的任何病毒形式。優選地疫苗登革病毒能夠用在針對登革病毒感染的人類免疫接種項目中。所以，術語"疫苗登革病毒，，通常指一種滅活病毒(virusinactiv6)，減毒病毒(vimsatt6nu6),以及重組蛋白，例如登革病毒被膜蛋白。疫苗病毒滅活是指在許可的細胞中不能複製。疫苗病毒減毒是指在Huh-7,VERO細胞和/或C6/C36細胞中37°C或者39°C生長後，在相同的培養條件下使用相同的滴度測定方法，測定這種病毒的滴度比野生型的最大滴度^氐至少十4咅(untelviruspr6senteuntitrequiestaumoins10foisinf6rieurautitremaximaldutypesauvage)。苗病毒被認為是本發明中所述減毒的。可以用於人類的疫苗病毒有符合投放市場的規則要求的正面益處/危險係數。本發明中使用的疫苗登革病毒優選是減毒的，這樣它不會在人類導致發病。這種類型的疫苗病毒產生有利的結果，在大多數接種的個體最多只導致適度的(即，中等到低，或者甚至不發生)不良反應，而同時保留它誘導包含中和抗體的同源性反應的能力。可以用於本發明中的疫苗登革病毒的非限制性例子為，滅活登革病毒，減毒登革病毒，如減毒毒才朱VDV-1和VDV-2,例如，申請WO02/66621,WO00/57904,WO00/57908,WO00/507909,WO00/57910,WO02/0950075中描述的毒4朱，以及嵌合體。嵌合體病毒表現上述減毒病毒的特性。任何表達登革病毒被膜蛋白並且導致誘導包含中和血清型抗體免疫反應的嵌合體病毒都可以用在本發明中，其中所述蛋白衍生自所述血清型。非限制性的實例為，例如，在W098/37911中所述的ChimeriVax登革病毒，還可以是，例如，在專利申請WO96/40933和WO01/60847中所述的登革病毒/登革病毒嵌合體，疫苗登革病毒血清型1，可以是，例如，疫苗毒抹VDV1或者ChimeriVaxDEN-1,尤其是YF17D/DEN-1病毒，或者其他的DEN-116007/PDK13毒抹。疫苗登革病毒血清型2,可以是，例如，疫苗毒抹VDV2或者ChimeriVaxTMDEN-2，尤其是YF17D/DEN-2病毒，或者其他的DEN-216681/PDK53病毒。疫苗登革病毒血清型3可以是ChimeriVaxDEN-3，尤其是YF17D/DEN-3病毒。疫苗登革病毒血清型4可以是ChimeriVaxTMDEN-4,尤其是YF17D/DEN-4病毒。也可以是"LAV4"或者"DEN畫41036/PDK48"毒林，例如，在PDK細胞傳代48次減毒的DEN-41036毒抹。這種毒林在瑪希隆大學的專利申請EP1159968中有描述，並且保藏在CNCM，編號為1-2483。每種ChimeriVaxTM單價疫苗登革病毒(血清型1,2,3和4)通過在Vero細胞上擴增各種血清型製備。更具體地，四種病毒分別在無血清介質中黏附的Vero細胞上產生。病毒收集物經過濾除去細胞碎片後，通過超濾和層析進行沉澱並純化，以便除去宿主細胞DNA。加入穩定劑後，將疫苗毒抹在使用前以冰凍或凍幹形式儲藏，然後臨時進行重構。同樣的方法適用與四種嵌合體。通過在Vero細胞上擴增製備VDV1和VDV2毒林。收穫產生的病毒並且通過過濾除去細胞碎片。通過酶處理消化DNA。通過超濾除去雜質。通過濃縮可以提高感染滴度。加入穩定劑後，將疫苗毒株在使用前以冰凍或凍幹形式儲藏，然後臨時進行重構。通過簡單混合單價組合物得到多價組合物。根據本發明，四種血清型可以以任何順序給藥，前提是它們是相繼成對給藥，並且在30天到1年期間內，例如30天，45天，60天，3個月，6個月，9個月以及1年，進行觀察，有利地在30天到3個月期間，尤其是l個月到2個月期間，兩系列相繼服藥期間進行觀察。所以，根據本發明的方法可以通過下面描述的實施方案加以實施(i)血清型1和2;((i)血清型1和3;((i)血清型1和4;((i)血清型2和3;((i)血清型2和4;((i)血清型3和4;(ii)血清型3和4;或者ii)血清型2和4;或者ii)血清型2和3;或者ii)血清型1和4;或者ii)血清型1和3;或者ii)血清型1和2;根據具體的實施方案，所以本發明覆蓋以下方案-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-2;(ii)CYDDEN-3和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-3;(li)CYDDEN-2和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-2和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-2和CYDDEN-3;(ii)CYDDEN-1和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-2和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-1和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-3和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-1和CYDDEN-2-(i)VDV-l和CYDDEN-2;CYDDEN-3和CYDDEN畫4-(i)VDV-l和CYDDEN畫3;(ii)CYDDEN-2和CYDDEN-4-(i)VDV-l和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-2和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-2和CYDDEN-3;(ii)VDV-1和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-2和CYDDEN-4;(ii)VDV-1和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-3和CYDDEN-4;(ii)VDV-1和CYDDEN-2-(i)CYDDEN-1和YDV-2;(ii)CYDDEN-3和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-3;(ii)VDV-2和CYDDEN-4-(i)CYDDEN-l和CYDDEN-4;(ii)VDV-2和CYDDEN陽3-(i)VDV-2和CYDDEN-3;(ii)CYDDEN-l和CYDDEN-4-(i)VDV-2和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-1和CYDDEN-3-(i)CYDDEN-3和CYDDEN-4;(ii)CYDDEN-l和VDV-2-(i)VDV-l和VDV-2;(ii)CYDDEN-3和CYDDEN-4-(i)VDV-l和CYDDEN-3;(ii)VDV-2和CYDDEN-4-(i)VDV-l和CYDDEN-4;(ii)VDV-2和CYDDEN-3-(i)VDV-2和CYDDEN-3;(ii)VDV-l和CYDDEN-4-(i)VDV-2和CYDDEN-4;(ii)VDV-1和CYDDEN-3和-(i)CYDDEN-3和CYDDEN-4;(ii)VDV-1和VDV-2。在本發明中，術語"免疫病毒劑量"是指包含"免疫有效量"免疫病毒的組合物，例如，充分誘導產生同源性中和抗體反應的病毒量，例如，可以通過以下例1中描述的血清中和實^^的方法證實。當中和抗體滴度超高或者等於1:10時，就認為血清中和抗體陽性。免疫毒林數量通常用病毒噬斑形成單位(PFU)或者50%組織培養感染劑量(TCID5Q)，或者50%細胞培養感染劑量(DICCsQ)表示。例如，根據本發明的組合物可以包含10到106DICC50,尤其是從103到1(^DICC5Q的疫苗登革病毒血清型1，2,3,和4型一價或二價組合物。因此，根據本發明的組合物或用途中，疫苗登革病毒血清型1,2,3或4每種劑量優選在10到106010(:50的範圍內，如10，101,102,103，104,105或106DICC50,尤其是在103到15DICC5o的範圍內。免疫病毒可以使用相同或不同的劑量，其可以根據使用的疫苗病毒的特性以及獲得免疫反應的強度調整。優選地，同源性中和抗體反應可以長時間持續，即，它可以在登革熱血清型(ii)給藥後至少6個月在血清中檢測到。在根據本發明的相繼給藥中，第三種和第四種血清型的疫苗登革病毒在第一種和第二種血清型疫苗登革病毒給藥後至少30天和最多12個月給藥。例如，在本發明中，第三種和第四種血清型疫苗登革病毒在第一種和第二種血清型疫苗登革病毒給藥後30天到1年之間給藥，例如30天，45天，60天，3個月，6個月，9個月或者1年，最好在30天到3個月，尤其是1個月到2個月。一劑量第一種血清型疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型疫苗登革病毒以兩個一價組合物的形式同時給藥或者以單一二價組合物形式同時給藥。類似的，一劑量第三種血清型疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型疫苗登革病毒同時給藥。例如，第三種血清型和第四種血清型以兩個一價組合物的形式同時給藥或者以單一二價組合物形式同時給藥。疫苗病毒以疫苗組合物的形式給藥，疫苗組合物可根據任何本領域技術人員公知的方法來製備。通常，一般為低壓凍幹形式的病毒，與藥用賦形劑混合，例如水或者磷酸緩衝鹽溶液，溼潤劑或穩定劑。術語"藥用賦形劑，，意指任何溶劑，分散介質，填充劑等，它們在人類和動物體內不會產生類似過敏反應等的不良反應。根據選擇的藥物劑型、方法和服用方法選擇賦形劑。合適的賦形劑和藥物劑型的要求在"Remington:TheScience&PracticeofPharmacy"中有描述，它是本領域參考書的代表。優選地，疫苗組合物以注射劑形式製備，並且可以對應液體溶劑，懸液和乳濁液。特別地，這種組合物包含水溶緩沖液，從而維持pH接近在6至9之間(環境溫度下用pH計測定)。儘管並非必須添加佐劑，然而組合物可以包括這樣的化合物，即疫苗毒林給藥同時誘導產生提高、刺激或加強細胞或體液(humorale)免疫反應物質。本領域技術人員能夠在疫苗領域常規使用的佐劑中選擇適合本發明的佐劑。方式給藥，例如胃腸外給藥(尤其是皮內注射，皮下注射或者肌內注射)。優選地，疫苗組合物是可注射組合物，通過在三角肌部位皮下注射給藥。組合物的給藥體積取決於給藥途徑。對於皮下注射來說，體積一般是在0.1到l.Oml之間，優選大約0.5ml。第一種和第二種血清型的給藥最佳時期，或優選地血清型1到4的給藥最佳時期是接觸登革病毒之前的大約1到3個月。在兒童和成人給藥中，這種疫苗可以作為登革病毒感染預防性治療給藥。因此目標人群包括登革病毒首次接種(即，之前未接種過)或者非首次接種的個體。還可以進行疫苗登革病毒血清型1到4的加強給藥，例如，在第三種和第四種血清型給藥後的6月到IO年之間進行加強，例如6個月，1年，3年，5年或10年。本發明還提供包含4種不同血清型的4種疫苗登革病毒的免疫接種試劑盒，其中每種血清型以疫苗劑量形式提供，或者其中至少2種，或者甚至4種血清型以二價組合物的形式提供。關於疫苗劑量或一價或二價組合物以及優選實施方案的描述，參照與根據本發明的免疫方法相關的過往描述。通過以下實施例i兌明本發明。實施例實施例1:在猴子體內相繼免疫接種在猴子模型中^^測病毒血症和免疫原性。尤其是病毒血症被確定為與人體病毒血症和疾病嚴重性相關的因素之一，因此，構成應該考慮的一個重要參數。而對於免疫原性在評價保護作用的情況下是一個關鍵參數。1.1材料與方法根據關於動物實驗的歐洲指令開展猴子實驗。對來自毛利塔尼亞的短尾猴(獼猴屬)開展免疫接種。免疫接種之前隔離猴子6周。在猴子臂部皮下注射0.5ml疫苗組合物進行免疫。使用氯氨酮(ImalgeneMerial)輕微麻醉後，從腹股溝的或隱靜脈穿刺取血。在第0天和28天，分別耳又血樣5ml，用來評價抗體反應，同時，在第2天到第IO天期間，取血樣lml用來評估病毒血症。在冰上取血並且存放在冰上直到血清分離。在4°C離心血液20分鐘，並且將收集的血清存;改在-80"C直到檢測。測量病毒血症PCR)監測免疫接種後病毒血症。採用位於DEN1和DEN2毒林NS5基因的兩套引物和探針來分別量化VDV-1RNA和VDV-2RNA。使用位於YF病毒NS5基因的第三套引物和探針來量化CYDRNA。最後，採用位於E(DEN)/NS-1(YF)基因連接處的四套針對不同血清型的特異性引物和探針來量化YFNS5RNA陽性的血清型(見表l)。每個RT-PCT的實驗(essai)，包含7個質粒，受T7啟動子控制，該區域被轉錄到體外從而生成一系列的合成RNAs，它們每個RT-PCT實驗中被包括進去作為內部參照。採用分光光度法測定這些合成RNAs，獲得的RNA的數量轉換成RNA拷貝數並且用GEQ(基因組當量)表示。根據產品說明書，使用MachereyNagel"Nucleospin96virus"RNA提取試劑盒提取0.140ml猴血清，然後用0.140ml(0.090ml，然後0.05ml)去核糖核酸酶的水洗脫純化的RNA。為了避免反覆凍融，應該在RNA提取後立即對5|ul所述RNA產物進行第一次定量。剩餘的量凍存在-7(TC。反應混合物除了包含"QiagenQauntitect探針"RT-PCT定量試劑盒(Qiagen)的成分夕卜，還有每種引物lOpicomol,每種才笨4十4picomole以及5(ilRNA，總體積25pl。對於要檢測的RNAs，直接將5]ul的純化製品加到反應混合物中，不需要進行預先稀釋的步驟。合成RNAs按照1/10比例加到去核糖核酸酶水中稀釋，同時平行定量5|ul中含有大約10到106GEQ的7份稀釋液，從而得到標準曲線。在應用生物系統ABIPrism700TM設備上開展定量反應，採用以下程序50。C/30min,95°C/15min，然後95°C/15sec-60°C/60sec40個循環。在這個實驗中病毒RNA定量的範圍是從2.9到3.3log1GEQ/ml(800到2000GEQ/ml;4到10GEQ/反應)，這與PCR的對象有關(標準偏差+/-0.3log10)。在本實驗的平行實驗中確定感染滴度與病毒RNA定量之間的關係，通過分析0.140ml陰性猴血清樣本(DO)，已知該血清感染免疫接種病毒(CYD或VDV)的顆粒數量。準備兩份所述對照血清稀釋液，分別在5|ul中包含接近1PFU和大約100PFU(分別是2.3和4.3log10PFU/ml)在下面表l中列出了使用的引物和探針，對每個試驗，按照正義反義引物和探針順序列舉。表1序列YF-NS5sens5'GCACGGATGTAACAGACTGAAGA(23bases)YFNS5anti5'CCAGGCCGAACCTGTCAT(18bases)>YF-NS55'Fan>CGACTGTGTGGTGCGGCCCATC-Tamra(22bas@_CYD1-sens5'CATTGCW3TTGGCCTGOTAA(20b)CYD1-arrti!5'C丌TGGCAAGAGAGAGCTCAAGT(23b〉CYD1-■__5'FairvCC6ATCAAGGATGCGCCATGVTamra(21b)_CYD2-sens5'6TGGGAGTCGTGACGCTGTA(20b)CYD2-antl5'OTTGATGGCGCATCCTTGATC(21b)CYD2__5'Fan>TGGGAGTTATGGTGGGCGCCG-Tamra(21b)_CYD}~~sens'5'AAAACACTTCCATGTCATTTTCATG(25b)CYD3"anti:5'GOTGATGGCGCATCCTTGATC(21WCYD3~__5'FanrfTGCGATAGGAATTATCACACTCTA丁CTGGGAGOTamra(33b)CYD牟'sens5'CTTAGTA丌GTGGATTGGCACGAA(24b)CYManti:5'GCGCCAACTGTGAAACCTAGA(21b)CYD4~__5'-Fan>AGAAACACTTCAATGGCAATGACGTGCAT-Tamra(29b)VCW1-MS5sens5'TCGCAACAGCCTTAACAGC(13b)VDV1-NS5antl'5'ACTATCTCCCTCCCATCCTTC(21b)VDV1-NS5..5'Fan>TTCACACCACTTCCAOMGB/NFQ(16b)__VW2-NS5sens5'AATGACAGACACGACTCC。8b)VDV2-NS5a他5'CCCAAAACCTACTATCTTCAA.C(22b)VW2-NS55'FatThTGGAAGTCGGCACGTGA-MGB/NFQ(17b)中和抗體測量(血清中和實驗)(SN50)習慣上，使用PRNT50(PFU數量減少50%中和實驗)實驗測量登革病毒抗體。因為這個實驗費時費力並且消耗大量的材料，我們發明了SN50實驗，這個實驗是基於DICC5。試驗檢測的單位數量減少50%設計的。在96孔板上，每個孔中將0.120ml去補體血清加入到0.480ml稀釋液(ISCOVE4%胎牛血清)。通過將0.150ml血清加入到0.450ml稀釋液中製備6倍系列稀釋液。將2.7log10DICC50/ml的450ul病毒稀釋液加入每個孔，從而達到25DICCso/孔。將平板在37。C孵育1小時。然後，將每種稀釋液各100ul加到96孔板的6個孔中，這6個孔在實驗開始前3天接種8000細胞/孔濃度的Vero細胞到含有4%胎牛血清的100ulISCOVE培養基中。在37。C,5%(:02存在條件下孵育6天後，用乙醇/丙酮(70/30)混合物在4。C條件下固定細胞15分鐘，用PBS洗3次，然後在37。C,50ul抗黃病毒單克隆抗體(mAb4G2)的1/2000稀5AO山d8￡aAOSAOads33dS釋液條件下孵育1小時。然後洗兩次，在37。C,50ul鹼性磷酸酶共軛抗鼠IgG抗體的1/1000稀釋液條件下孵育1小時。加入50ul染色液BCIP/NBT後可以看到溶胞噬斑。採用下面的Karber公式計算中和抗體滴度log10SN50=d+f/N(X+N/2)，其中d代表導致100%中和的稀釋液(即6陰性複製，也就是不表現感染的複製)f代表loglO中的稀釋係數(例如1:4的稀釋係數，f=0.6)N代表複製/稀釋的數量(N=6)X代表不表現感染症狀的孔的總數量，稀釋d例外病毒檢測的範圍是10SN50(即1.01og10SN50)用來中和的病毒毒抹是DEN116007,DEN216681,DEN316562或DEN41036毒林。為了對照，重新滴定最初的病毒稀釋液。SN50實驗測量的中和滴度與傳統的PRNT50實驗測量的中和滴度的耳關係是log10PRNT50=log10SN50+0.2通過計算線性表達的幾何平均值確定平均滴度(GMT);習慣上，滴度低於檢測閾值的樣本，按照閾值的一半計算。1.2相繼免疫接種的評價免疫接種年齡和體重相當的3組猴子，每組4隻(見表2)。用23G1針在臂部皮下注射進行免疫接種，CYDDEN1到4疫苗的各種血清型劑量為105DICC5。。VDV-1和VDV-2的劑量分別為3.961og。和4.84log10。表2:各組組成和免疫接種步驟tableseeoriginaldocumentpage21表3中給出了一次免疫接種(D28)和兩次免疫接種(D84)後得出的免疫原性結果。表4給出了病毒血癥結果。tableseeoriginaldocumentpage22tableseeoriginaldocumentpage23種VDV-1，2後接種CYD-3,4時觀察到同樣的反應。畫值得注意的結果是CYD-3,4血清型對最初免疫接種後CYD-1,2誘導反應的強烈刺激作用。可以觀察到同源性，但也有異源性的中和抗體的增高。抗-NS-黃熱反應對抗-E反應的正面影響可以解釋這種現象，沒有免疫顯性。具有交叉反應的E表位可能也發揮作用。相反，四價加強免疫後未觀察到這種刺激影響，只是最初免疫接種(此處為3)誘導的顯性E反應被加強。-關於CYD疫苗，CYD-4導致明顯的病毒血症(表4)，並且沒有觀察到兩次相繼二價給藥和單次四價給藥之間的差別(組2和組3)。因此，預測兩次二價免疫接種和單次四價免疫接種的安全性沒有差別。進一步觀察到根據本發明的免疫接種方案導致的病毒血症程度更輕；參見，例如，組2和組3的比較。實施例2:間隔1個月對猴子進行相繼免疫接種。比較接種CYD-1，2後接種CYD-3,4和接種CYD-2,3後接種CYD-1,4兩個方案與前面的實施例一樣，才企測猴子模型中的病毒血症和免疫原性。在本實施例中，兩次免疫接種之間間隔1個月，而前一個實施例兩次免疫接種之間間隔2個月。第一次免疫接種使用對猴子免疫原性最低的兩種疫苗病毒(CYD-2,3)，然後接種兩種免疫顯性的疫苗病毒(CYD-1，4)。2.1材泮+和方法:同實施例l2.2評價間隔一個月的相繼免疫接種免疫接種年齡和體重相當的3組猴子，每組4隻(見表5)。與實施例1類似，用23G1針在臂部皮下注射進行免疫接種，CYDDEN1到4疫苗病毒的各種血清型劑量均為105DICC50。表5:各組組成和免疫接種步驟tableseeoriginaldocumentpage25表6中給出了一次免疫接種(D28)和兩次免疫接種後得到的免疫原性結果。病毒血癥結果與例1中給出的結果類似，顯示CYD4誘導較弱的病毒血症並且不同組之間沒有顯著的差別。tableseeoriginaldocumentpage26簡要的說，這些結果補充了實施例1得出的結論，可以總結如下-根據本發明的給藥方案使得定性和定量地提高同源性中和抗體反應成為可能，所述中和抗體反應是通過四^介疫苗在1個月間隔期內2次免疫接種獲得的。-二價免疫接種CYD-1，2後1個月免疫接種CYD-3，4(組2)在全部猴子中均誘導對抗4種血清型的高同源性反應，血清型l和4呈顯性。-在本組中，對血清型l和2的加強效果在l個月後二次給藥情況下弱於實施例1中的2個月後的二次給藥。-當首先接種免疫原性低的血清型(CYD-2,3),並用最強的血清型(CYD-1,4)加強接種時，獲得的反應較平衡，血清型l和4呈低顯性(moindredominance)(組3)。這些結果證實了實施例1中得出的結論，表明兩次二價相繼免疫接種在所有動物中均有效誘導對抗所有血清型的反應，即使在初次免疫接種後僅僅1個月時進行加強免疫也有效。權利要求1、一種疫苗組合物，其包含(i)一劑量第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，作為防禦登革熱的相繼給藥的疫苗組合物的組合，其中疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥後至少30天和最多1年給藥。2、權利要求1所要保護的疫苗組合物，其中所述疫苗病毒(ii)在疫苗病毒(i)給藥後30天到3個月期間給藥。3、權利要求1或2所要保護的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒(i)以二價疫苗組合物形式給藥。4、權利要求1-3任一項所要保護的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒(ii)以二價疫苗組合物形式給藥。5、權利要求1-4任一項所要保護的疫苗組合物，所述疫苗登革病毒血清型1選自由VDV1毒抹和ChimeriVaxDEN-1組成的組。6、權利要求1-5任一項所要保護的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型2選自由VDV2毒抹和ChimeriVaxDEN-2組成的組。7、權利要求1-6任一項所要保護的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型1是VDV1毒林，所述疫苗登革病毒血清型2是VDV2毒抹.8、權利要求1-6任一項所要保護的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型1是ChimeriVaxDEN-1,所述疫苗登革病毒血清型2是ChimeriVaxDEN-2。9、權利要求1-8任一項所要保護的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型3是ChimeriVaxDEN-3。10、權利要求1-9任一項所要保護的疫苗組合物，其中所述疫苗登革病毒血清型4是ChimeriVaxTMDEN-4。11、權利要求1-6和8-IO任一項所要保護的疫苗組合物，其中第一種和第二種血清型分別是CYDDEN1和CYDDEN2,第三種和第四種血清型分別是CYDDEN3和CYDDEN4。12、權利要求1-11任一項所要保護的疫苗組合物，其中疫苗病毒(ii)在疫苗病毒(i)給藥後30天給藥。13、權利要求l-12任一項所要保護的疫苗組合物，其中疫苗登革病毒血清型1,2，3和4的每一種的劑量範圍是103到105DICCs。。14、第三種血清型的疫苗登革病毒和第四種血清型疫苗登革病毒的用途，用於製造登革疫苗，以便向曾經在至少30天到最多l年前使用過一劑量第一種血清型的革病毒疫苗和一劑量第二種血清型的登革病毒疫苗的患者給藥。15、權利要求14所要保護的用途，其中第三種和第四種血清型以二價疫苗組合物的形式給藥。16、權利要求14和15任一項所要保護的用途，其中第一種和第二種血清型以二價疫苗組合物的形式給藥。17、權利要求14-16任一項所要保護的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型1選自由VDV1毒抹和ChimeriVaxDEN-1組成的組。18、權利要求14-17任一項所要保護的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型2選自由VDV2毒抹和ChimeriVaxDEN-2組成的組。19、權利要求14-18任一項所要保護的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型1是VDV1毒抹，所述疫苗登革病毒血清型2是VDV2毒抹。20、權利要求14-18任一項所要保護的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型1是ChimeriVaxDEN-1,所述疫苗登革病毒血清型2是ChimeriVaxDEN-2。21、權利要求14-20任一項所要保護的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型3是ChimeriVaxDEN-3。22、權利要求14-21任一項所要保護的用途，其中所述疫苗登革病毒血清型4是ChimeriVaxDEN-4。23、權利要求14-18和20-22任一項所要保護的用途，其中第一種和第二種血清型分別是CYDDEN1和CYDDEN2,第三種和第四種血清型分別是CYDDEN3和CYDDEN4。24、權利要求14-23任一項所要保護的用途，其中第三種和第四種血清型在第一種和第二種血清型給藥後30天到3個月期間給藥。25、權利要求24所要保護的用途，其中第三種和第四種血清型在第一種和第二種血清型給藥後30天後給藥。26、權利要求14-24任一項所要保護的用途，疫苗登革病毒血清型1，2，3和4的每一種的劑量範圍是103到105DICC5。。全文摘要本發明涉及在患者體內誘導針對四種登革病毒血清型的同源性保護的方法，包括對所述患者的相繼給藥(i)一劑量第一種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第二種血清型的疫苗登革病毒，和(ii)一劑量第三種血清型的疫苗登革病毒和一劑量第四種血清型的疫苗登革病毒，其中疫苗登革病毒(ii)在疫苗登革病毒(i)給藥後至少30天和最長1年給藥。文檔編號A61K39/12GK101489585SQ200780026376公開日2009年7月22日申請日期2007年7月11日優先權日2006年7月12日發明者B·古伊,J·蘭,R·福拉特,V·巴班申請人:賽諾菲巴斯德有限公司