防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法
2023-06-19 22:37:16
專利名稱：防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法
技術領域：
本發明涉及卵黃免疫球蛋白的製備方法，具體地說是一種防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法。
背景技術：
仔豬腹瀉是規模化養殖場新生仔豬和斷奶仔豬的常見病，其發病急、傳播快、死亡率高，給養豬業造成巨大的經濟損失。據統計，40%的臨床腹瀉病例是由產腸毒素大腸桿菌感染引起。目前生產上多採用產腸毒素大腸桿菌多價苗免疫母豬，通過提高初乳的抗體水平達到預防仔豬腹瀉的目的。然而母源抗體持續時間短，斷奶後短期內將消失，無法保護仔豬的整個生長階段。通過口服大腸桿菌高免血清也能夠預防仔豬腹瀉，但因其成本較高很難在實際生產中大規模推廣應用。獸醫臨床上，卵黃免疫球蛋白已廣泛用於雞(傳染性法氏囊、新城疫、雞白痢等)、鴨(肝炎)、鵝(小鵝瘟)、犢牛(腹瀉)、羔羊(輪狀病毒腹瀉)等疫病的緊急治療和預防。
發明內容
本發明的目的在於提供一種防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法，由該方法獲得的卵黃免疫球蛋白對 防治仔豬大腸桿菌性腹瀉具有較好的療效。為實現上述目的，本實用發明採用以下方案防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法，其特徵在於包括以下步驟
I)、採集未經藥物治療的腹瀉仔豬所攜帶的大腸桿菌；
2)、將獲得的純大腸桿菌接種於試管麥康凱瓊脂斜面培養基上，菌種在3-5°C下保
存；
3)、將菌種接種於基礎培養基，37°C下振蕩培養24h後，製成菌懸液，加入O. 5%濃度的甲醛滅活；
4)、按體積比將7號白油與Span-80以93-95:5_7混合，然後加入佔二者總體積1. 5-2. 5%的硬脂酸鋁溶解混勻後，110-1201高溫滅菌25-35 min獲得油相，按體積比將滅活的菌懸液和Tween-80以94_98:3_5混合獲得水相，將水相與油相按體積比以1:1混合，充分乳化後即為大腸桿菌油苗，分裝，3-5°C下保存；
5)、用製備好的大腸桿菌油苗接種10隻3周齡健康小鼠，每隻肌肉注射O.5mL，觀察10天均健康成活；
6)、選擇健康成年產蛋雞50隻，分別在第1、7、15天胸肌注射大腸桿菌油苗，注射量分別為第一天O. 5mL/只、第7天1. Oml/只、第15天1. Oml/只；
7)、收集注射過大腸桿菌油苗的雞所產蛋中的卵黃，用濃度為O.8-1. 0%的生理鹽水稀釋4. 5-5. 5倍，然後按重量比加入3-4%的PEG 6000混勻後過濾取上清，可得卵黃免疫球蛋白粗提物。
上述方案的步驟4)中，Span-80以94:6混合，硬脂酸鋁佔二者總體積的2%，菌懸液和Tween-80以96:4混合。上述方案的步驟7)中，卵黃用濃度為O. 9%的生理鹽水稀釋5倍，然後按重量比加入3. 5%的PEG 6000混勻後過濾取上清。卵黃免疫球蛋白能像初乳中的抗體一樣通過小腸上皮進入機體，同時卵黃免疫球蛋白和抗原的親和力遠比哺乳動物抗體和同種抗原的親和力強，因此，卵黃免疫球蛋白可以通過多種途徑在仔豬被動免疫時發揮抗腹瀉的作用。首先，它可與特異性菌毛抗原結合減少或阻斷特異性菌毛與宿主腸上皮的結合，使產腸毒素性大腸桿菌不能在小腸定植，從而防止腹瀉的發生。其次，抗特定病原菌的卵黃免疫球蛋白還可直接粘附於病原菌的細胞壁上，改變病原菌細胞的完整性，直接抑制病原菌的生長；第三，一部分抗特異病原的卵黃免疫球蛋白在腸道內被消化酶降解為結合片段，這些片段含有抗體的末端高度可變的小肽。這些小肽很容易被腸道吸收發揮防治腹瀉的作用。本發明提供的卵黃免疫球蛋白製備方法工藝簡單，生產成本低；所獲得的卵黃免疫球蛋白性質均一、易提取，可有效避免非特異性免疫反應發生，且使用後無藥物殘留和耐藥性。
具體實施例方式以下結合一實施例進一步說明本發明。本實施例提供的防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法具有以下步驟1.病料收集用消毒棉籤採集未經藥物治療的腹瀉仔豬糞便、小腸內容物、黏膜刮取物和病死豬肝臟、心臟、血液等病料`。2.大腸桿菌分離培養和鑑定確診為純大腸桿菌後，再接種於試管麥康凱瓊脂斜面培養基上，菌種4°C保存備用。3.增菌培養將大腸桿菌接種於基礎培養基，37°C振蕩培養24h後，製成菌懸液，加入O. 5%濃度的甲醒滅活。基礎培養基為常規的用於大腸桿菌的培養基。4.油苗的製備按體積比例將7號白油與Span-80按94:6比例混合，再加入總量2%的硬脂酸鋁溶解混勻後，116°C高溫滅菌30 min即為油相。按體積比將滅活的菌懸液和Tween-80以96:4的比例混合作為水相，將水相與油相按體積比以1:1混合，充分乳化後即為油乳劑滅活苗，分裝，4°C保存備用。5.疫苗的安全性檢驗用製備好的滅活苗接種10隻3周齡健康小鼠，每隻肌肉注射O. 5mL,觀察10天均健康成活。6.免疫程序選擇健康成年產蛋雞50隻，分別在第1、7、15天胸肌注射大腸桿菌油苗，注射量分別為第一天O. 5mL/只、第7天1. Oml/只、第15天1. Oml/只。7.免疫球蛋白提取收集卵黃用O. 9%生理鹽水稀釋5倍，加入3. 5%的PEG 6000混勻後過濾取上清，可得卵黃免疫球蛋白粗提物。本發明提供的卵黃免疫球蛋的使用方法為1、防治仔豬腹瀉，預防量口服，5 -1Oml/頭/次，I次/日，連服3天。2、治療仔豬腹瀉，口服15 20mL/頭/次，I次/日，連服3天。
以下結合療效證據進一步說明本發明的使用效果。臨床治療試驗在2010年3月至2012年8月期間，選擇規模化豬場自然感染大腸桿菌典型病豬，隨機分成2組，一組肌注治療劑量氟苯尼考(20mg/kg BW)，1次/日，連續3天，另一組口服卵黃免疫球蛋白溶液，口服15 20mL/頭/次，I次/日，連服3天。以上兩組治療效果如下表
腹瀉仔豬治療試驗結果
權利要求
1.防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法，其特徵在於包括以下步驟I)、採集未經藥物治療的腹瀉仔豬所攜帶的大腸桿菌；2)、將獲得的純大腸桿菌接種於試管麥康凱瓊脂斜面培養基上，菌種在3-5°C下保存；3)、將菌種接種於基礎培養基，37°C下振蕩培養24h後，製成菌懸液，加入O. 5%濃度的甲醛滅活；4 )、按體積比將7號白油與Span-80以93-95:5_7混合，然後加入佔二者總體積1.5-2. 5%的硬脂酸鋁溶解混勻後，110-120°C高溫滅菌25-35 min獲得油相，按體積比將滅活的菌懸液和Tween-80以94_98:3_5混合獲得水相，將水相與油相按體積比以1:1混合，充分乳化後即為大腸桿菌油苗，分裝，3-5°C下保存；5)、用製備好的大腸桿菌油苗接種10隻3周齡健康小鼠，每隻肌肉注射O.5mL，觀察10天均健康成活；6)、選擇健康成年產蛋雞50隻，分別在第1、7、15天胸肌注射大腸桿菌油苗，注射量分別為第一天O. 5mL/只、第7天1. Oml/只、第15天1. Oml/只；7)、收集注射過大腸桿菌油苗的雞所產蛋中的卵黃，用濃度為O.8-1. 0%的生理鹽水稀釋4. 5-5. 5倍，然後按重量比加入3-4%的PEG 6000混勻後過濾取上清，可得卵黃免疫球蛋白粗提物。
2.根據權利要求1所述的防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法，其特徵在於步驟4)中，Span-80以94:6混合，硬脂酸鋁佔二者總體積的2%，菌懸液和Tween-80 以 96:4 混合。
3.根據權利要求1所述的防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法，其特徵在於步驟7)中，卵黃用濃度為O. 9%的生理鹽水稀釋5倍，然後按重量比加入3. 5%的PEG 6000混勻後過濾取上清。
全文摘要
防治仔豬大腸桿菌性腹瀉的卵黃免疫球蛋白製備方法，包括以下步驟採集腹瀉仔豬所攜帶的大腸桿菌；將純大腸桿菌接種於試管麥康凱瓊脂斜面培養基上；將菌種接種於基礎培養基，製成菌懸液，加入甲醛滅活；將7號白油與Span-8O混合，然後加入硬脂酸鋁溶解混勻後，高溫滅菌獲得油相，將菌懸液和Tween-80混合獲得水相，將水相與油相混合，充分乳化後即為大腸桿菌油苗；用大腸桿菌油苗接種健康小鼠，觀察10天均健康成活；選擇健康成年產蛋雞，在第1、7、15天注射大腸桿菌油苗；收集注射過大腸桿菌油苗的雞所產蛋中的卵黃，用生理鹽水稀釋，加入PEG6000混勻後過濾取上清，可得卵黃免疫球蛋白粗提物。用本卵黃免疫球蛋白治療仔豬腹瀉與現有的治療藥物相比，治癒率較高、費用降低。
文檔編號C07K16/12GK103030694SQ20121059063
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者周玉剛, 唐紅, 許百年, 其他發明人請求不公開姓名 申請人:蚌埠市畜牧獸醫技術推廣站