為真核表達的目的構建原核基因表達島的製作方法
2023-06-19 17:02:21
專利名稱：：為真核表達的目的構建原核基因表達島的製作方法
技術領域：
：本發明涉及改造原核生物的基因調控元件，組建適於真核表達系統的表達島。更具體地，所述原核生物的基因是固氮基因。還更具體地，所述原核生物是肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae,也稱肺炎克氏桿菌)。
背景技術：
：通氫所有的生物都需要氮元素。在活細胞內，氮是所有胺基酸、核酸(DNA和RNA)及其他許多重要分子的主要成分。大部分生物不能直接利用大氣中的氮，僅能利用氮的某種形式的化合物。形成這些化合物的過程統稱為「固氮」，這時氮與其他元素結合，被「固定」在含氮的化合物中。由於全球大面積種植農作物，土壤每年因此要失去大量的氮素。如果得不到及時補充，土壌的含氮量就會下降，從而影響農作物產量。土壤可以通過兩條途徑獲得氮素ー是施用含氮肥料，包括氮素化肥和各種農家肥料；另ー是生物固氮。20世紀80年代曾有人推算過，全世界毎年施用的氮素化肥中的氮素大約有8XIO7噸，而自然界毎年通過生物固氮所提供的氮素則高達4XIO8噸。因此，如果能利用生物固氮的原理，讓小麥、水稻等糧食作物自行固氮，則有可能大大減少對氮素化肥的需求，提高農業產量，這對解決全球性糧食問題、以及對保護全球性生態環境，都具有十分重要的意義。固氮微牛物生物固氮主要由固氮微生物完成。固氮微生物分為共生和自生兩大類。共生固氮微生物典型的有與豆科植物共生才能固氮的根瘤菌。自生固氮微生物則是土壌中能夠獨立進行固氮的微生物，主要有細菌、藍藻(Cyanobacterium,也稱藍細菌)等。固氮細菌中，常見的有,好氧的巴斯德氏菌屬(Pasteurella)、兼性厭氧的克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、以及能進行光合作用的紅螺菌屬(Rhodospirillum)和紅硫菌屬(Chromatmm,也稱著色菌屬)等。目前最常用於氮肥的自生固氮菌是好氧的圓褐固氮菌(Azotobacterchroococcum)。固氮,某因在固氮菌中，研究得最多最廣泛的是肺炎克雷伯氏菌，它的固氮基因由1720個nif基因組成，依次主要有J，H，D，K，T，Y，E，N,X，U，S，V，W，Z，M，F，L，A，B,Q，它們組成以Γ7個呆縱子(QiCheng,PerspectivesinBiologicalNitrogenFixationResearch.JournalofIntegrativePlantBiology,2008)NifJ操縱子包含nifJ基因NifHDKY操縱子包含nifH、nifD、nifK、nifY基因NifENX操縱子包含nifE、nifN、nifX基因NifUSVM:操縱子包含nifU、nifS、nifV、nifM基因NifF操縱子包含nifF基因NifLA操縱子包含nifL、nifA基因NifBQ操縱子包含nifB、nifQ基因。在所有固氮微生物中中，整個固氮系統非常保守，固氮基因也有很高的同源性。例如，根瘤菌固氮基因系統中的nif基因就與肺炎克氏桿菌的nif基因同源。肺炎克雷伯氏菌固氮基因的異源表達已有人將肺炎克雷伯氏菌24kb的nif固氮基因(NCBI登錄號X13303)整個從染色體上切下來，不經分割直接連接到載體上，轉化大腸桿菌(Escherichiacoli),使本來不能固氣白勺大腸桿菌獲得固氣倉泛力(RayDixon,FrankCannon,ConstructionofaPplasmidcarryingnitrogennxationgenesfromKlebsiellapneumoniae.Nature,197。ノ。厄來，又有人嘗試將同樣的固氮基因轉移到酵母中，但所得酵母只能合成出構成固氮酶的部分蛋白質，個具有固風!!泛カ(AdaZamir,StablechromosomalintegrationoftheentirenitrogenfixationgeneclusterfromKlebsiellapneumoniaeinyeastProc.NatLAcad.Sci.USA,1981)。可見，將固氮基因從原核生物轉移到真核生物中進行表達，使小麥、水稻等真核生物實現生物固氮，還存在很大困難。
發明內容本發明嘗試改進原核基因的表達調控機制，使之適應於真核表達。所述原核基因例如固氮基因。為了更好地理解本發明，作出以下解釋表達島(expressionisland)也可以稱「調控島」，是指多個調控元件與多個基因組成的結構，其中每個調控元件可以調控一或多個基因的轉錄和/或表達。在原核基因的情形下，所述表達島可以是指，一或多個帶有調控元件的操縱子。在本發明優選的實施方案中，一方面，所述調控元件進行的調控獨立於宿主固有的表達系統，既不受其影響，也不對其造成幹擾；另ー方面，島內每一調控元件進行的調控獨立於島上的其它調控元件(如果有的話)，從而允許調控島上不同基因的不同表達水平，以實現各個基因的表達產物的功能最優化。在本發明的表達島中，所述調控元件優選並非所述基因或所述操縱子的天然調控元件，更優選所述調控元件是T7啟動子，所述T7啟動子選自T7wt，T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它的T7變體，所述變體具有T7啟動子的活性，但強度相對於野生型而言可以有不同。在本發明優選的實施方案中，表達島由BioBrick組件組成。更優選地，所述BioBrick組件是帶有T7啟動子的目標基因或目標操縱子，例如是帶有不同的T7啟動子的多個原核生物固氮基因。在ー個具體實施方案中，表達島中的多個基因選自固氮基因nifj，nifH,nifD,nifK,nifT,nifY,nifE,nifN,nifX,nifU,nifS,nifV,nifff,nifZ,nifM,nifF,nifL,nifA,nifB,和/或nifQ。在另一具體實施方案中，所述表達島不含固氮基因nifT,nifY,nifX,nifU,nifS,nifV,nifff,nifZ,nifL,nifA,和/或nifQ。在又一具體實施方案中，所述固氮基因是以天然操縱子的形式存在，但該天然操縱子的啟動子已替換為T7啟動子。在還ー個具體實施方案中，所述操縱子是T7wt+nifJ，T7wt+nifHDKY,T7M5+nifENX,T7M5+nifUSVM,T7M6+nifF，和/或T7M6+nifBQ。BioBrick該術語是BioBricks基金會(BioBricksFoundation)所擁有的商標。BioBrick組件(BioBrickpart)指ー種DNA序列性質的標準生物學組件,其中，姆ー個標準組件都具有相同的「前綴」和「後綴」，如下所示5」i.Γ:A(SΤΤΓ;C—f;,.T~'τV;AC--ItA序H」…~AΓ:丁AてA■CC；,.—ΤつCAた-:.----CsSt^TXAnOしCJ4ACATi'TC一一一一一—J1了:jiVmT:ごG::CGG、C0*--Ccriri;；>nlXbalパIitl由於具有共同的界面，BioBrick組件常常被引入諸如大腸桿菌之類的活細胞，來構建新的生物系統。因此，它們常用於合成生物學和納米技術等領域。詳情可參見例如Knight,T.(2003),IdempotentVectorDesignforStandardAssemblyofBiobricks.MITSyntheticBiologyWorkingGroupFromthecellsup,TheGuardian,10March2005；BioBrickstohelpreverse-engineerlife,EETimes,11June2004。構律BioBrick糹目件的可行件以前的文獻僅報導過將肺炎克雷伯氏菌所有nif基因作為ー個整體，直接轉化大腸桿菌(詳見
背景技術：
部分)，尚無人嘗試將這些基因拆分成以操縱子為單位的多個部分，再重新組合後，在大腸桿菌中表達固氮酶活性。本發明人將文獻記載的固氮基因，例如攜帯在質粒pRDl上的肺炎克雷伯氏菌24kbnif基因(NCBIX13303)，以單個的包含天然啟動子的操縱子形式克隆出來。將每ー個操縱子分別引入帶有BioBrick前綴和後綴結構的常規質粒，例如pBS中。再依次將BioBrick組件形式的這些操縱子引入多拷貝載體，例如pACYC184中。然後進行大腸桿菌的表達。測試表明，將這些操縱子單獨酶切後再連接，能在大腸桿菌中表達出固氮酶活性。本發明的ー個特徵是，單個的原核基因操縱子能夠單獨地操作，而不必需與天然情形下與之相連為ー個整體的其它操縱子共同操作。例如，上述BioBrick組件形式的單個操縱子，除了包含BioBrick組件的通用前綴和後綴以外，還分別包含各自特有的一個限制酶酶切位點(例如見後文表4)，這樣就能對每ー個操縱子進行選擇性地単獨操作，例如酶切。所述的特有的限制酶酶切位點可以由本領域技術人員進行選擇，不限於本發明實施例的舉例。由於將操縱子單個地進行操作，因此，在將它們以BioBrick組件形式依次引入多拷貝載體中時，先後順序並不是很重要。例如，nifJ的特有酶切位點在後文的實施例I中被設計為ScaI位點，當需要將該操縱子引入多拷貝質粒，例如pACYC184時，用相應的ScaI酶就可以特異性地將該操縱子，而不是其它操縱子切割下來。這一切割無論是在第一順位，還是，任選地，在第二、三、四、五、六、七順位，對於本發明而言，無關緊要。但是，一旦確定具體的順位，最終將得出與該具體順位相一致的組合結構。T7轉錄系統T7轉錄系統由啟動子區和RNA聚合酶區構成，是目前在大腸桿菌進行基因表達最常用也是最有效的系統。而且，T7轉錄系統在真核生物中也能有效表達基因。例如，T7轉錄系統可以在酵母的線粒體中進行基因表達。T7RNA聚合酶為單個單體蛋白，能獨立地通過僅有17bp的啟動子發揮作用，因而調控簡単。T7啟動子比較保守，如下所示，分為兩個結構功能區_17-5為結合區，負責與T7RNA聚合酶結合；_4+6為起始區，負責轉錄起始4:5AV!-5+1,5TT(17)TAA'M-AOGACIGWWTAGGGAGA對啟動子區的鹼基進行突變，得到ー些變體，經體外轉錄實驗測定，它們的強度各不相同，也不同於野生型T7wt(DianeImburgio,StudiesofPromoterRecognitionandbtartbiteSelectionbyT7RNAPolymeraseUsingaしomprehensiveしollectionοιPromoterVariantsBiochemistry,2000,39(34),10419-10430,2000),概述如下變體名稱縮寫具體突變相對強度T7M4T-4A第-4位由T變為A0.08T7M5T-2G第-2位由T變為G0.49T7M6T-4G第-4位由T變為G0.23T7M7A-15T第-15位由A變為T0.71T7M8A-15G第-15位由A變為G0.11相對強度是指，以野生型T7(「T7wt」)為I.O所確定的強度。正是由於T7系統既可以在原核系統、又可以在真核系統表達的雙重特性，使我們可以充分利用大腸桿菌這ー最成熟的遺傳作業系統，來構建完全依賴於T7RNA聚合酶的固氮基因表達系統，並在通過固氮測活驗證等實驗，證明確實可行之後，再轉入真核系統。這樣ー個可在原核與真核之間穿梭的體系，將對在真核系統中最終建立「固氮島」，使真核生物可以自主固氮起到關鍵作用(如可以先在原核體系中構建及驗證其功能，然後再向真核系統轉移，從而大大筒化研究的複雜程度)更換啟動子對於文獻報導的肺炎克雷伯氏菌整個固氮基因在酵母中表達，不能使該酵母獲得固氮能力的情形，發明人猜測ー個可能的原因是，肺炎克雷伯氏菌的原核表達調控系統不適用於真核細胞。在確認了肺炎克雷伯氏菌固氮系統並不是必需整個地被遺傳操作，而是能夠以操縱子為單位單獨地進行操作之後，為了解決真核表達的調控問題，發明人想到將這樣的原核操縱子所附帯的天然啟動子替換為能通用於原核細胞和真核細胞的啟動子，例如T7啟動子。為此，可以將肺炎克雷伯氏菌的各個nif啟動子分別引入攜帶特異性標記的質粒上，通過測定該特異性標記的表達水平或活性，來確定各個nif啟動子的強度。所述特異性標記例如是beta半乳糖苷酶基因，或其它任何常規的標記。將這樣測出的啟動子強度與文獻記載的T7啟動子強度進行比較，按照大致相當的強度水平，為每ー種天然啟動子選擇多種(例如2-3種)T7啟動子進行測試，從而選出在整個固氮系統表達中表現良好的T7啟動子來進行替換。表汰島中的nif某閔或操縱子nif轉錄的調控包括由nif基因簇以外的基因(例如ntrA,ntrB,ntrC)介導的一般性調控機制，以及，由nif基因簇中nifL和nifA基因介導的特異性調控。一般情況下，由ntrB,ntrC等感應外界的氮源來調控nifL和nifA,再由nifL和nifA調控其它固氮基因。在本發明的一個實施方案中，所述表達島包含未替換T7啟動子、而是攜帯其天然啟動子的nifLA操縱子，例如pKU7181。但在另一實施方案中，所述表達島根本不含nifLA操縱子，例如PKU7180。本發明的實驗表明，在缺失nifLA操縱子的情況下，本發明的表達島仍然可以表達出固氮酶活性。進ー步的實驗表明，用本發明的表達島表達出的固氮酶，不受溫度、氮源、NtrC和σ54因子等已知影響天然原核生物固氮酶表達的因素的影響，僅僅受Τ7本身的調控因素異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)的影響(例如，參見下表11和12)。可見，本發明的表達島成功越過了天然狀態下需要經由nifL和nifA來進行調控的途徑，使得固氮基因的表達更為簡潔，易操控。但是，本發明的表達島並不是必需包含所有的原核固氮基因或是所有的原核固氮操縱子。例如，已知在缺失nifQ基因的情況下，通過外源提供鑰，也可以使肺炎克雷伯氏菌表現出固氮活性(JournalofBacteriology,第158卷，第I其月,187-194頁，1984年4月)。又例如，本文證實，大腸桿菌缺失nifL和nifA基因，即缺失nifLA操縱子，仍具有固氮活性。又例如，前人已發現，nifH基因產物與衣藻葉綠體中同源基因chlL的產物在功能上有Jl疊(QiCheng,TheKlebsiellapneumoniaenitroRenaseFeproteinRenemifH)functionallysubstitutesforthechlLReneinChlamydomonasreinhardtii.BBRC，2005)。因此，本發明的表達島可以缺失原核固氮系統的一或多個基因而仍然表達固氮活性。例如，本發明的表達島可以缺失在相應宿主中非必需的原核固氮基因，或者可以利用宿主生物(例如真核宿主生物)固有的產物作為功能替代物，來發揮某ー個或幾個原核固氮基因(例如nif基因)產物的作用。這使得本發明表達島的結構能夠更進ー步簡化。更具體地，本發明涉及以下本發明的ー個方面涉及單個的原核固氮基因操縱子，其不含天然啟動子，但含T7啟動子。在優選實施方案中，所述T7啟動子選自T7wt,T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它的T7變體，所述變體具有T7啟動子的活性，但強度相對於野生型而言可以有不同。在更優選的實施方案中，所述原核固氮基因是肺炎克雷伯氏菌的固氮基因，例如NCBIX13303。在更優選的實施方案中，本發明的操縱子選自T7wt+nifJ，T7wt+nifHDKY，T7M5+nifENX,T7M5+nifUSVM,T7M6+nifF,和T7M6+nifBQ。本發明的另一方面涉及表達島，其包含一或多個調控元件、以及ー或多個基因。在一優選實施方案中，所述調控元件是T7啟動子，在有多個啟動子的情況下，所述啟動子可以相同或不同。在另ー優選實施方案中，所述基因是不含天然啟動子的原核固氮基因操縱子，它們由T7啟動子進行調控。在一個具體的實施方案中，本發明表達島中含T7啟動子的操縱子以BioBrick組件的形式組合。在另一具體實施方案中，本發明表達島中的操縱子還帶有與其它操縱子不同的限制酶位點，從而能夠單個地操作每ー操縱子。在一個特別優選的實施方案中，本發明的表達島包含選自下列的一或多個操縱子T7wt+nifJ,T7wt+nifHDKY,T7M5+nifENX,T7M5+nifUSVM,T7M6+nifF,和T7M6+nifBQ。本發明的原核固氮基因操縱子，或者表達島可以攜帶在質粒上。優選所述質粒為多拷貝質粒，以便能高水平表達相應的固氮基因。本發明的另一方面還涉及含T7RNA聚合酶基因的多拷貝質粒。在ー個具體實例中，所述質粒是PBR322。本發明的這種多拷貝質粒能高水平表達T7RNA聚合酶，以適應被調控的原核基因(例如原核固氮基因)表達的需要。本發明的另一方面涉及ー種表達系統，其包含含有本發明的原核固氮基因操縱子或表達島的質粒，以及本發明的含有T7RNA聚合酶基因的質粒。所述表達系統能在原核細胞或者真核細胞中進行表達，產生固氮酶活性。相應地，本發明還涉及宿主細胞，其包含本發明的操縱子，表達島，質粒，或表達系統。本發明又一方面涉及構建用於真核表達的表達島的方法，所述方法包括測定一組基因中每ー個的啟動子的強度，依據所測定的強度，將所述啟動子替換為相同或不同的T7啟動子,將帶有T7啟動子的所述基因組合成表達島。優選地,所述方法還包括,將所組合的多個基因轉移到相應宿主中進行表達。還優選地，所述帶有T7啟動子的基因以BioBrick組件的形式組合在表達島中。在優選實施方案中，所述T7啟動子選自T7wt，T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它的T7變體，所述變體具有T7啟動子的活性，但強度相對於野生型而言可以有不同。本發明還有一方面涉及T7啟動子用於協調多基因表達的用途。具體地，所述表達是指，在原核細胞或原核生物中表達，或在真核細胞或者真核生物中表達。在優選實施方案中，所述T7啟動子選自T7wt,T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它的T7變體，所述變體具有T7啟動子的活性，但強度相對於野生型而言可以有不同。實施例材料菌株大腸桿菌JM109，DH5a和BL21(DE3)都購自北京全式金生物技術有限公司，其中，大腸桿菌JM109和BL21(DE3)主要用於測試固氮酶活性，大腸桿菌DH5a主要用於確認克隆產物的序列。另外，大腸桿菌THl是基因型為F-，σ54的大腸桿菌，大腸桿菌WJ9是基因型為F-，ntrC的大腸桿菌，大腸桿菌TP2006菌是基因型為F-，xyl，cya，crp-39，IacΔx74,argHl,glp的大腸桿菌,它們均為本實驗室所有,但本領域技術人員也可以用常規技術構建得到具有相應基因型的大腸桿菌菌株。質粒本發明用到的多個常規質粒可以商購。例如，pet28a可以從Novagen購買，PACYC184可以以ATCC37033獲得。本發明還用到一些已有文獻記載的質粒，例如，P⑶926ロ丁多見GaryPitta,PlasmidsrelatedtotheDroadhostranRevector,pRK290,usefulforRenecloningandformonitoringReneexpression.Plasmid，1985；pST1021可麥見Zhu.TB，EffectofnifAproductonsuppressionofNifphenotypeofRlnmutationandconstitutivesynthesisofnitroRenaseinKlebsiellapneumoniae.Sci.Sin.1983；pRDlロ」參見RayDixon,FrankCannon，ConstructionofaPplasmidcarryingnitrogenfixationRenesfromKlebsiellapneumoniae.Nature,1976，等等下、表I舉例說明本發明的質粒。表I權利要求1.表達島，包含多個原核固氮基因和多個T7啟動子，不含所述原核固氮基因的天然啟動子，其中每個Τ7啟動子調控ー或多個所述基因，優選所述多個基因以天然操縱子的形式存在，還更優選所述基因選自nifJ,nifH,nifD,nifK,nifE,nifN,nifU、nifS、nifV,nifM,nifF,和/或nifBo2.權利要求I的表達島，所述多個T7啟動子選自T7wt，T7M4，T7M5，T7M6，T7M7，和T7M8，以及任何其它具有啟動子活性的T7變體。3.權利要求I或2的表達島，其中所述操縱子以BioBrick組件的形式組合。4.權利要求1-3任ー項的表達島，其中的操縱子還帶有與其它操縱子不同的限制酶位點。5.質粒，者含權利要求1-4之一的表達島，優選所述質粒為多拷貝質粒。6.多拷貝質粒，含T7RNA聚合酶基因。7.表達系統，含權利要求5和6的質粒。8.細胞，含權利要求1-4之一的表達島，權利要求5或6的質粒，或權利要求7的表達系統。9.構建用於真核表達的表達島的方法，包括測定ー組基因中每ー個的啟動子的強度，依據所測定的強度，將所述啟動子替換為相同或不同的T7啟動子，將帶有T7啟動子的所述基因組合。10.T7啟動子用於協調多基因表達的用途。全文摘要本發明涉及用T7啟動子改造原核固氮基因，使之適應於真核表達。文檔編號C12N1/15GK102690808SQ20111007075公開日2012年9月26日申請日期2011年3月23日優先權日2011年3月23日發明者楊雲,楊建國,王憶平,王霞,陳麗申請人:北京大學