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一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒及其製備方法

2023-06-05 23:56:41

專利名稱:一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒及其製備方法
技術領域:
本發明涉及水產類肉食品中藥物的快速診斷用器具及其製備方法,屬於生 物技術領域,具體為一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒及其製備方法。(二) 背景技術隱性孑L雀石綠(Leucomalachite green, LMG)是孑L雀石綠(malachite green,MG)在生物體內主要代謝殘留物,對人類有致癌危險。孔雀石綠又稱為苯胺綠、維多利亞綠或中國綠,是一種具有金屬光澤的綠 色晶體,溶於水、乙醇和甲醇,水溶液的顏色為藍綠色(最大吸收波長為618nm), 最早在1913年有人發現孔雀石綠等染料可破壞病原菌而不引起宿主損害,從而 使這些染料用做防腐劑、殺錐蟲藥和其它醫療作用。自磺胺類藥物和其它抗菌 素的出現,孔雀石綠作為抗菌素在畜牧業中的應用已日漸衰退。然而在水產養 殖中由於價格低廉和抗菌、抗真菌效果好,廣泛用於進行水體消毒和防止魚水 黴病。近年來發現孔雀石綠特別是其代謝物在水產體內有明顯的蓄積殘留現象, 殘留時間也較長。由於其化學官能團三苯甲烷是一種致癌物質,所以國外一些 發達國家,如歐盟、美國已宣布禁止其在經濟魚類(觀賞魚除外)養殖過程中 使用。我國農業部發布的《無公害食品中華絨鰲蟹》(NY5064-2001)和農業部 發布的《食品動物禁用的獸藥及其它化合物清單》文件(農牧發[2002]1號)中 明確規定所有可食組織中禁用孔雀石綠。《2000年度中國出口動物源性食品中有毒有害物質殘留監控計劃》首次將 鰻魚中隱性孔雀石綠項目的監控列入年度計劃,並延續至今。試驗證實孔雀石 綠在動物體內8小時後50%轉變為隱性孔雀石綠,24小時後84%轉變成隱性孔 雀石綠,而長期滯留在組織中。國內外檢測LMG主要採用以色譜技術(HPLC) 檢測技術,雖然靈敏、定量準確,但大批量檢測時速度慢,成本相對較高。以 金標檢測試紙盒為代表的快速篩選法是免疫學主流技術,快速、成本低、可以大批量檢測,國內外尚無該技術報導。
發明內容針對上述問題,本發明提供了一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒及其製備 方法,該檢測試紙盒檢測快速、準確、明顯、靈敏度高,為此,本發明還提供 了該測試紙盒的製備方法。一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒,其包括試紙條,所述試紙條被封裝於 盒殼體,所述盒殼體上面開有注樣孔,觀測孔,其特徵在於所述試紙條用聚 氯乙烯或聚乙烯作背襯,在試紙條一端的注樣區粘貼吸附含有膠體金-抗隱性孔 雀石綠單克隆抗體結合物的玻璃纖維膜;在試紙條中間的測試區粘貼硝酸纖維 素膜,玻璃纖維膜的一小段重疊在硝酸纖維素膜上,在試紙條另一端吸水區粘 貼吸水紙;在硝酸纖維素膜上從注樣區到吸水區的方向,依次設置有材質為隱 性孔雀石綠-卵清白蛋白的檢測線,和材質為羊抗鼠IgG質控線,所述硝酸纖維 素膜上覆蓋有濃度為1%牛血清白蛋白層;所述注樣孔對應於所述試紙條注樣區 的玻璃纖維膜,所述觀測孔對應於試紙條的測試區。其進一步特徵在於所述硝酸纖維素膜厚度為12(Vm,蛋白質負載量為5Hg /cm2 20pg/cm2,聚氯乙烯或聚乙烯背襯厚度為lOOpm,試紙條的尺寸為 (55 65) mmX (3 5) mm,檢測線和質控線的寬度為0.5 mm lmm。一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒的製備方法,其特徵在於其包括以下 步驟(1) 隱性孔雀石綠金標檢測試紙條的製備將膠體金-抗隱性孔雀石綠單克 隆抗體結合物稀釋至0.5pg/ml 2.0pg/ml,放入10mmX300mm玻璃纖維膜,浸 泡10分鐘 20分鐘,37。C烘乾,4匸 8。C保存,粘貼在背襯一端的注樣區;在 背襯中間檢測區粘貼硝酸纖維素膜,在硝酸纖維素膜上噴塗濃度為100pg/ mL 500嗎/ mL隱性孔雀石綠-卵清白蛋白作檢測線,噴塗濃度為50嗎/ mL 200pg/mL羊抗鼠IgG作質控線,再用1%牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜; 在背襯另一端吸水區粘貼吸水紙;(2) 所得隱性孔雀石綠金標檢測試紙條包封在開有注樣孔和觀測孔的盒殼 體內,所述注樣孔對應於所述試紙條注樣區的玻璃纖維膜,所述觀測孔對應於 試紙條的測試區。其進一步特徵在於 膠體金的製備取50ml 0.01%的氯金酸溶液,1000r/min磁力攪拌下,加熱至110°C,迅速 加入1。/。檸檬酸鈉水溶液2ml,保持反應溫度和攪拌轉速不變,沸騰反應5min, 溶液顏色剛剛變為清亮橘紅色後停止反應;獲得的膠體金平均粒徑為10.7nm。抗隱性孔雀石綠(LMG)單克隆抗體及其溶液的製備50嗎LMG—BSA偶聯抗原用50 pl生理鹽水配成1嗎 1抗原溶液,與等 體積完全福氏佐劑混勻,充分乳化,供首次免疫用;加強免疫時用同量的不完 全福氏佐劑代替完全福氏佐劑;首次免疫採用小鼠腹腔內直接注射,免疫劑量 為50pg/只小鼠;以後每隔2周加強免疫一次,加強免疫釆用尾靜脈注射,免疫 劑量10pg/只;最後一次免疫採用脾內注射,4天後取脾融合;將分離的免疫小 鼠脾細胞與處於對數生長期的骨髓瘤細胞SP-2/o以10:1比例混合;離心,去除 上清;在50S 卯S內將1 ml 50%聚乙二醇(分子量為1500)加至細胞中,充分 混勻,使其融合,lmin後加入20mlDEM培養液,終止融合;水浴靜止10min 後離心,去除上清;將融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養基懸浮後, 以最後濃度為口104飼養細胞/0.1 ml接種於以小鼠腹腔巨噬細胞作飼養層的96 孔培養板中,於5%0)2, 37'C條件下培養,8天後,每培養孔更換2/3 HT培養 液;10天 20天後,開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔,取上清液進行篩 選,對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆;雜交瘤篩選採用固 相抗原間接非競爭ELISA法進行;以LMG-OVA為包被抗原,以免疫小鼠的血 清為陽性對照,以SP-2/o骨髓瘤細胞培養的上清液為陰性對照;陽性細胞孔的 判定標準為(A微-A扣)/(A對照-A空白)》.l;對分泌陽性抗體的細胞進行克隆。 採用有限稀釋法,將陽性克隆細胞吹勻,取一微滴至培養瓶內,倒置顯微鏡下 準確計數細胞個數,稀釋為70個/ml再取lml稀釋20倍,接種入96孔培養 板中進行亞克隆;直至所有細胞孔的培養上清均呈陽性為止;對10 13周齡 Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0,3ml/只 0.5ml/只,8天 10天後,腹腔注射培 養至對數期的雜交瘤細胞,5乂105細胞/只;5天後注意觀察,收集腹水,離心 去除沉澱,加甘油於-20'C保存;完全福氏佐劑是由下列材料配比而成,液體石蠟:羊毛脂:卡介苗=12 g:20ml:0.105g;不完全福氏佐劑是由下列材料配比而成,液體石蠟洋毛脂=12 g:20 ml;
膠體金-抗隱性孔雀石綠單克隆抗體結合物的製備在一定體積的膠體金溶
液中,緩慢滴加0.1 mg/ml抗隱性孔雀石綠(LMG)單克隆抗體溶液溶於0.01M pH7.4的PBS緩衝液中,超聲波混勻2min,靜置0.5 h後通過4'C冷凍離心進 行純化,首次離心轉速10000 r/min,時間45 min,棄上清,沉澱用10。/。BSA溶 液溶解,進行下次離心;第二次用10°/。 30%甘油密度梯度離心,轉速7000 r/min, 時間45min,用於除去未標記的蛋白和金顆粒聚集體,收集中間紅褐色部分即 可。
採用本發明中的測試紙盒檢測水產類肉食品中隱性孔雀石綠的含量,檢測 時只需將檢測樣品滴入注樣孔中,稍許,即可在觀測區中觀察檢測線和質控線 的變色情況,確定樣品中隱性孔雀石綠含量是否超標,與現有測試方法相比, 不需要大型檢測儀器,檢測快速、準確、明顯、靈敏度高。
(四)


圖1隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒檢測示意圖; 圖2隱性孔雀石綠金標檢測試紙條結構圖。
(五)
具體實施例方式
見圖l、圖2,本發明包括試紙條2,試紙條2被封裝於盒殼體1 ,盒殼體l 上面開有注樣孔8,觀測孔9,試紙條2用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯,在試紙條 2 —端的注樣區粘貼吸附含有膠體金-抗隱性孔雀石綠單克隆抗體結合物的玻璃 纖維膜3;在試紙條中間的測試區粘貼硝酸纖維素膜4,璃纖維膜3的一小段重 疊在硝酸纖維素膜4上,在試紙條2另一端吸水區粘貼吸水紙7;在硝酸纖維素 膜4上從注樣區到吸水區的方向,依次設置有材質為隱性孔雀石綠-卵清白蛋白 的檢測線5,盒材質為羊抗鼠IgG質控線6,硝酸纖維素膜4上覆蓋有濃度為1 %牛血清白蛋白層;注樣孔8對應於試紙條2注樣區的玻璃纖維膜3,觀測孔9 對應於試紙條2的測試區。硝酸纖維素膜4厚度為120fim,蛋白質負載量為5pg /cm2 20jig/cm2,最佳為12.5pg / cm2,聚氯乙烯或聚乙烯背襯厚度為100pm, 試紙條2的尺寸約為(55 65) mmX (3 5) mm,檢測線5和質控線6的寬 度為0.5 mm lmm,最佳為0.75 mm。下面結合附圖描述本發明中隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒的製備方法,
膠體金的製備取50ml 0.01%的氯金酸溶液,1000r/min磁力攪拌下,加 熱至11(TC,迅速加入iy。檸檬酸鈉水溶液2ml,保持反應溫度和攪拌轉速不變, 沸騰反應5min,溶液顏色剛剛變為清亮橘紅色後停止反應,獲得的膠體金平均 粒徑為10. 7ran。
抗隱性孔雀石綠(LMG)單克隆抗體及其溶液的製備
50 Pg LMG—BSA偶聯抗原用50 W生理鹽水配成1 Pg/l^l抗原溶液,與等 體積完全福氏佐劑混勻,充分乳化,供首次免疫用。完全福氏佐劑由下列材料 配比而成,液體石蠟:羊毛脂:卡介苗=12 g:20 ml:O. 105g;加強免疫時用同量 的不完全福氏佐劑代替完全福氏佐劑。不完全福氏佐劑由下列材料配比而成, 液體石蠟:羊毛脂=12 g:20 ml;首次免疫採用小鼠腹腔內直接注射,免疫劑量 為50 Pg/只小鼠;以後每隔2周加強免疫一次,加強免疫採用尾靜脈注射,免 疫劑量10 Pg/只,最後一次免疫採用脾內注射,4天後取脾融合,將分離的免 疫小鼠脾細胞與處於對數生長期的骨髓瘤細胞SP-2/。以10:1比例混合;離心, 去除上清;在50秒 90秒內將lml 50%聚乙二醇(分子量為1500)加至細胞中, 充分混勻,使其融合,1 min後加入20 ml DEM培養液,終止融合;水浴靜止 10 min後離心,去除上清;將融合細胞用含20%小牛血清的HAT選擇性培養基 懸浮後,以最後濃度為1乂104飼養細胞/0. 1 ml接種於以小鼠腹腔巨噬細胞作飼 養層的96孔培養板中,於5%〔02, 37'C條件下培養,8天後,每培養孔更換2/3 HT培養液;10天 20天後,開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔,取上清 液進行篩選,對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆;雜交瘤篩 選採用固相抗原間接非競爭EL工SA法進行;以LMG-OVA為包被抗原,以免疫小 鼠的血清為陽性對照,以SP-2/o骨髓瘤細胞培養的上清液為陰性對照;陽性細 胞孔的判定標準為(A微-A加)/(A對照-A fis)〉2. 1;對分泌陽性抗體的細胞進 行克隆;採用有限稀釋法,將陽性克隆細胞吹勻,取一微滴至培養瓶內,倒置 顯微鏡下準確計數細胞個數,稀釋為70個/ml再取1 ml稀釋20倍,接種入 96孔培養板中進行亞克隆;直至所有細胞孔的培養上清均呈陽性為止;對10 13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3ml/只 0.5ml/只,8天 10天後, 腹腔注射培養至對數期的雜交瘤細胞,5XlQ5細胞/只;5天後注意觀察,收集
9腹水,離心去除沉澱,加甘油於-2(TC保存。
膠體金-抗隱性孔雀石綠單克隆抗體結合物的製備
在一定體積的膠體金溶液中,緩慢滴加0.1mg/ml抗隱性孔雀石綠(LMG) 單克隆抗體溶液溶於0.01M pH7.4的PBS緩衝液中,超聲波混勻2min,靜置 0.5h後通過4。C冷凍離心進行純化,首次離心轉速10000 r/min,時間45 min, 棄上清,沉澱用10。/。BSA溶液溶解,進行下次離心;第二次用10% 30%甘油 密度梯度離心,最佳為20%,轉速7000r/min,時間45 min,用於除去未標記的 蛋白和金顆粒聚集體,收集中間紅褐色部分即可;
將膠體金-抗隱性孔雀石綠單克隆抗體結合物稀釋至O. 5 ug/ml 2. Oug/ml, 最佳為1.25 ug/ml,放入10腿X300mm玻璃纖維膜,浸泡10分鐘 20分鐘, 最佳為15分鐘,37'C烘乾,4'C 8'C保存,最佳為6匸,粘貼在背襯一端的注 樣區;在背襯中間檢測區粘貼硝酸纖維素膜,在硝酸纖維素膜上噴塗濃度為 100Pg / mL 500l^g / mL,最佳濃度為300Pg/mL,隱性孔雀石綠-卵清白蛋白作 檢測線,噴塗濃度為50Pg / mL 200l^g / mL,最佳濃度125^g/mL,羊抗鼠IgG 作質控線,再用1%牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜;在背襯另一端吸水區粘貼 吸水紙;所得隱性孔雀石綠金標檢測試紙條包封在開有注樣孔和觀測孔的盒殼 體內,注樣孔對應於試紙條注樣區的玻璃纖維膜,觀測孔對應於試紙條的測試 區。
本發明實施中,有關抗隱性孔雀石綠抗體的產生見如下方法 半抗原
隱性孔雀石綠(Leucomalachite green)分子量很小(330.4道爾頓),是半抗 原物質,只具備抗原性而無免疫原性,,不能直接免疫動物而製備抗體。因此, 為了製備本發明的完全抗原,對隱性孔雀石綠進行了活化,並製得了本發明的 半抗原。
如本發明所指的"半抗原"或"氨基一隱性孔雀石綠衍生物"是指經本發明 的衍生反應得到的具有結構式1的物質,其結構如式1所示formula see original document page 11式1
完全抗原
通常,半抗原需要和大分子如KLH (血藍蛋白)或BSA (牛血清白蛋白) 以共價鍵方式偶聯,成為既具有免疫反應性,又具有免疫原性的完全抗原。
如本文所用,本發明的"完全抗原"是指本發明的半抗原與適當的蛋白質 載體結合後的產物。
如本文所用,本發明中的"蛋白質載體"是指任何在免疫學上可接受的用 於形成完全抗原的蛋白質,其可為例如,血藍蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白 或Y球蛋白等。
本發明用於隱性孔雀石綠檢測及抗體製備的完全抗原的結構如式2所示formula see original document page 11
式2
其中,X為蛋白質載體,本發明中優選牛血清白蛋白(BSA)或血藍蛋白 (KLH);與X載體共價交聯的部分為隱性孔雀石綠的衍生物1-氨基-隱性孔雀 石綠。
在本發明的一個優選的方案中,X為牛血清白蛋白,完全抗原為隱性孔雀 石綠-BSA,作為免疫用抗原,用於製備分泌抗隱性孔雀石綠單克隆抗體的雜交 瘤細胞。
在本發明的另一個優選的方案中,X為血藍蛋白,完全抗原為隱性孔雀石 綠-KLH,作為檢測用抗原,用於製備檢測去甲氯胺酮的單克隆抗體免疫檢測板。本發明的完全抗原的製備方法如下
首先將隱性孔雀石綠活化,得到其衍生物1-氨基-隱性孔雀石綠,再將其 與適合的蛋白質載體(例如,BSA、 KLH)進行連接,得到完全抗原。其中X為 蛋白質載體,本發明中優選牛血清白蛋白(BSA)或血藍蛋白(KLH);與X載體
共價交聯的部分為隱性孔雀石綠的衍生物l-氨基-隱性孔雀石綠;
l-氨基-隱性孔雀石綠的製備取25ml圓底燒瓶,加入10ml 65%濃硝酸, 冰浴冷卻到-5"C,取lg隱性孔雀石綠在攪拌下,緩慢加入,待全部加完後,立 即將反應液傾入足量冰水中,將濃硝酸稀釋,吸收其反應熱,並在低溫條件下, 迅速用濃氨水調節溶液pH值達到9以上,使硝基隱性孔雀石綠析出,保持低溫, 抽濾。將濾餅置於20ml乙醇中,加入5mL的濃鹽酸使所得的硝基隱性孔雀石綠 完全溶解,另取5g SnC12溶於15mL濃鹽酸。將上述兩種溶液混合,緩慢升溫 至55'C,此時幾乎所有的固體均已溶解,保持0.5小時,溶液由混濁變澄清透 明。加入60ml蒸餾水稀釋,冷水浴冷卻,用固體NaOH調節其pH值達到12以 上,並不斷攪拌,使溶液析出沉澱物,抽濾後進行冷凍乾燥。
本發明的半抗原和蛋白質載體的連接可使用本領域己知的任何連接方式。 例如但不限於重氮法、琥珀酸法等。
本發明製備的完全抗原,隱性孔雀石綠-BSA有很好的免疫原性,能刺激小 鼠產生強烈的免疫反應,經過1次基礎免疫、3次加強免疫,抗血清效價可達 1:7200;完全抗原隱性孔雀石綠-BSA很好的保留了隱性孔雀石綠的免疫反應性。
抗隱性孔雀石綠單克隆抗體的製備
本文所用的術語"單克隆抗體"是指獲自基本上同源的抗體群的抗體,艮P, 組成該群體的抗體個體都相同,除了可能存在少量可能的白髮突變。因此,修 飾語"單克隆的"是指該抗體的性質不是離散抗體的混合物。
本發明的檢測原理是樣品中的隱性孔雀石綠(LMG)首先與膠體金顆粒表 面的抗隱性孔雀石綠(LMG)單克隆抗體反應,如果樣品中隱性孔雀石綠的含量 超過限值,膠體金的抗體位點將不再有剩餘,當膠體金顆粒層析經過檢測線時, 膠體金顆粒將不會停留在該線的所在位置,繼續上行時與控制線上噴塗的羊抗 鼠IgG的反應,呈現出膠體金的紅色。如果樣品中不含隱性孔雀石綠或隱性孔 雀石綠含量低於限值,膠體金表面的抗體將與檢測線上的化合物反應呈現出紅色,質控線也呈現紅色。
權利要求
1、一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒,其包括試紙條,所述試紙條被封裝於盒殼體,所述盒殼體上面開有注樣孔,觀測孔,其特徵在於所述試紙條用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯,在試紙條一端的注樣區粘貼吸附含有膠體金-抗隱性孔雀石綠單克隆抗體結合物的玻璃纖維膜;在試紙條中間的測試區粘貼硝酸纖維素膜,玻璃纖維膜的一小段重疊在硝酸纖維素膜上,在試紙條另一端吸水區粘貼吸水紙;在硝酸纖維素膜上從注樣區到吸水區的方向,依次設置有材質為隱性孔雀石綠-卵清白蛋白的檢測線,和材質為羊抗鼠IgG質控線,所述硝酸纖維素膜上覆蓋有濃度為1%牛血清白蛋白層;所述注樣孔對應於所述試紙條注樣區的玻璃纖維膜,所述觀測孔對應於試紙條的測試區。
2、 根據權利要求1所述一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒,其特徵在於 所述硝酸纖維素膜厚度為120Mm,蛋白質負載量為5Pg / cm2 20^ / cm2,聚氯 乙烯或聚乙烯背襯厚度為lOOMm,試紙條的尺寸為(55 65) mmX (3 5)咖, 檢測線和質控線的寬度為0.5咖 lmm。
3、 一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒的製備方法,其特徵在於其包括以 下步驟(1) 隱性孔雀石綠金標檢測試紙條的製備將膠體金-抗隱性孔雀石綠單 克隆抗體結合物稀釋至0. 5Pg/ml 2. OPg/ml,放入10mmX300mm玻璃纖維膜, 浸泡10分鐘 20分鐘,37。C烘乾,4。C 8-C保存,粘貼在背襯一端的注樣區; 在背襯中間檢測區粘貼硝酸纖維素膜,在硝酸纖維素膜上噴塗濃度為lOOl^g/ mL 50(Hig/mL隱性孔雀石綠-卵清白蛋白作檢測線,噴塗濃度為50^g / mL 200Pg/mL羊抗鼠IgG作質控線,再用1%牛血清白蛋白封閉硝酸纖維素膜;在背襯另一端吸水區粘貼吸水紙;(2) 所得隱性孔雀石綠金標檢測試紙條包封在開有注樣孔和觀測孔的盒殼 體內,所述注樣孔對應於所述試紙條注樣區的玻璃纖維膜,所述觀測孔對應於 試紙條的測試區。
4、 根據權利要求3所述一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒的製備方法,其 特徵在於所述膠體金的製備,取50ml0.0P/。的氯金酸溶液,1000r/min磁力攪拌下,加熱至ll(TC,迅速 加入1%檸檬酸鈉水溶液21111,保持反應溫度和攪拌轉速不變,沸騰反應5min, 溶液顏色剛剛變為清亮橘紅色後停止反應;獲得的膠體金平均粒徑為10. 7nm。
5、 根據權利要求4所述一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒的製備方法,其 特徵在於抗隱性孔雀石綠(LMG)單克隆抗體及其溶液的製備,50 Pg LMG—BSA偶聯抗原用50 W生理鹽水配成1 4g/W抗原溶液,與等 體積完全福氏佐劑混勻,充分乳化,供首次免疫用;加強免疫時用同量的不完 全福氏佐劑代替完全福氏佐劑;首次免疫採用小鼠腹腔內直接注射,免疫劑量 為50Mg/只小鼠;以後每隔2周加強免疫一次,加強免疫採用尾靜脈注射,免 疫劑量10 Pg/只;最後一次免疫採用脾內注射,4天後取脾融合;將分離的免 疫小鼠脾細胞與處於對數生長期的骨髓瘤細胞SP-2A)以10:1比例混合;離心, 去除上清;在50S 90 S內將l ml 50%聚乙二醇(分子量為1500)加至細胞中, 充分混勻,使其融合,1 min後加入20 ml DEM培養液,終止融合;水浴靜止 10min後離心,去除上清;將融合細胞用含20X小牛血清的HAT選擇性培養基 懸浮後,以最後濃度為1乂104飼養細胞/0. 1 ml接種於以小鼠腹腔巨噬細胞作詞 養層的96孔培養板中,於5%0)2, 37'C條件下培養,8天後,每培養孔更換2/3 HT培養液;10天 20天後,開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養孔,取上清 液進行篩選,對檢測結果呈陽性的細胞立即用有限稀釋法進行克隆;雜交瘤篩 選採用固相抗原間接非競爭ELISA法進行;以LMG-OVA為包被抗原,以免疫小 鼠的血清為陽性對照,以SP-2/o骨髓瘤細胞培養的上清液為陰性對照;陽性細 胞孔的判定標準為(A微-A加)/(A對照-A卽)>2. 1;對分泌陽性抗體的細胞進 行克隆。採用有限稀釋法,將陽性克隆細胞吹勻,取一微滴至培養瓶內,倒置 顯微鏡下準確計數細胞個數,稀釋為70個/ml再取1 ml稀釋20倍,接種入 96孔培養板中進行亞克隆;直至所有細胞孔的培養上清均呈陽性為止;對10 13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3ml/只 0.5ml/只,8d 10d後,腹 腔注射培養至對數期的雜交瘤細胞,5X105細胞/只;5d後注意觀察,收集腹水, 離心去除沉澱,加甘油於-2(TC保存。
6、 根據權利要求5所述一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒的製備方法,其 特徵在於完全福氏佐劑是由下列材料配比而成,液體石蠟:羊毛脂:卡介苗=12g:20 ml:0.105g;不完全福氏佐劑是由下列材料配比而成,液體石蠟羊毛 脂=12 g:20 ml。
7、根據權利要求6所述一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒的製備方法,其 特徵在於膠體金-抗隱性孔雀石綠單克隆抗體結合物的製備,在一定體積的膠 體金溶液中,緩慢滴加O. lmg/ml抗隱性孔雀石綠(LMG)單克隆抗體溶液溶於 0.01MpH7.4的PBS緩衝液中,超聲波混勻2 min,靜置0. 5 h後通過4。C冷凍 離心進行純化,首次離心轉速10000 r/min,時間45 min,棄上清,沉澱用10%BSA 溶液溶解,進行下次離心;第二次用10% 30%甘油密度梯度離心,轉速7000 r/min,時間45min,用於除去未標記的蛋白和金顆粒聚集體,收集中間紅褐色 部分即可。
全文摘要
本發明涉及一種隱性孔雀石綠金標檢測試紙盒。該檢測試紙盒檢測快速、準確、靈敏度高,為此,本發明還提供了測試紙盒的製備方法。其包括試紙條,所述試紙條被封裝於盒殼體,所述盒殼體上面開有注樣孔,觀測孔,其特徵在於所述試紙條用聚氯乙烯或聚乙烯作背襯,在試紙條一端的注樣區粘貼吸附含有膠體金-抗隱性孔雀石綠單克隆抗體結合物的玻璃纖維膜;在試紙條中間的測試區粘貼硝酸纖維素膜,玻璃纖維膜的一小段重疊在硝酸纖維素膜上,在試紙條另一端吸水區粘貼吸水紙;在硝酸纖維素膜上從注樣區到吸水區的方向,依次設置有材質為隱性孔雀石綠-卵清白蛋白的檢測線,和材質為羊抗鼠IgG質控線,所述硝酸纖維素膜上覆蓋有濃度為1%牛血清白蛋白層;所述注樣孔對應於所述試紙條注樣區的玻璃纖維膜,所述觀測孔對應於試紙條的測試區。
文檔編號G01N33/558GK101308140SQ20081013179
公開日2008年11月19日 申請日期2008年6月30日 優先權日2008年6月30日
發明者劉一軍, 進 葉, 傑 吳, 周群蘭, 孫蔚榕, 張東升, 張凌裳, 徐幫興, 沈雯琰, 王文靜, 蔡建榮, 蔡正森, 俊 謝, 趙春城, 趙曉聯, 燕 龔 申請人:江蘇省蘇微微生物研究有限公司

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