粒子分析儀用參照物的製作方法
2023-06-06 08:58:06 1
專利名稱：粒子分析儀用參照物的製作方法
技術領域：
本發明涉及用於粒子分析儀精度管理等的粒子分析儀用參照物。
背景技術：
眾所周知，粒子分析儀是用螢光色素對尿液和血液等生物試樣中的粒子染色，再用光束照射粒子，通過測定粒子發出的螢光和前方散射光來對粒子進行分類和計數的。
這種粒子分析儀必須隨時進行精度管理，以獲取正確的檢測結果。即當用粒子分析儀檢測精度管理用參照物得不到正確的檢測值時，必須校正粒子分析儀使參照物的檢測值達到所規定的範圍。
美國專利No.5,888,823中描述的標準液為流式細胞儀使用的，該檢查儀包括對尿液中含有的有形成份用色素進行螢光染色處理的測定試樣製備部分和從螢光染色後的有形成份中檢測出螢光的螢光檢測器。這個標準液中含有標準粒子。標準粒子經螢光染色處理可以顯示出與被測有形成份同樣的螢光強度。一旦流式細胞儀的測定試樣製備部分發生問題，無法正常染色時，通過測定上述標準粒子即可檢出染色設備異常。
用美國專利No.5,888,823中描述的標準液對粒子分析儀進行精度管理的話，得出的測定值(螢光強度)如果在所規定的範圍之外，可以通過調整螢光檢測器的感光度來校正，以得出適當的測定值。
但是，美國專利No.5,888,823對於用粒子分析儀測定參照物以檢查出裝置的異常部位沒有任何描述。
發明內容
本發明的目的是提供可以推斷出粒子分析儀的異常部位的參照物。同時，本發明還提供可以用參照物推斷粒子分析儀異常部位的方法及裝置。
即，本發明提供對生物試樣中所含被測粒子用色素進行螢光染色處理、再分析經螢光染色的被測粒子的粒子分析儀用參照物，提供含有以下第一標準粒子和第二標準粒子的參照物。
·經前述螢光染色處理染色的第一標準粒子。
·預先製備成含有一定螢光色素(predetermined fluorescencedye)的第二標準粒子。
同時，本發明提供推斷粒子分析儀異常部位的方法。該粒子分析儀包括將生物試樣與第一螢光色素混合、製備測定試樣的測定試樣製備部分；用於照射測定試樣的光源及用於檢測試樣發出的螢光的螢光檢測器。提供包括以下步驟(a)及步驟(b)的方法。
·步驟(a)用上述粒子分析儀測定第一標準粒子和第二標準粒子，檢測出與第一標準粒子相關的第一螢光和與第二標準粒子相關的第二螢光。上述第一標準粒子被上述第一螢光色素染色，上述第二標準粒子是預先含有第二螢光色素的粒子。
·步驟(b)根據前述(a)步驟中得到的第一螢光的檢測結果和第二螢光的檢測結果推斷粒子分析儀的異常部位。
另外，本發明提供包括以下部分的粒子分析儀。
·測定試樣製備部分將含有第一標準粒子和第二標準粒子的參照物與第一螢光色素混合，製備測定試樣。上述第一標準粒子被該第一螢光色素染色，上述第二標準粒子是已含有第二螢光色素的粒子。
·光源對上述測定試樣進行光照。
·檢測部分檢測與上述測定試樣中所含的第一標準粒子相關的第一螢光和與第二標準粒子相關的第二螢光。
·分析部分根據第一螢光的檢測結果和第二螢光的檢測結果推斷粒子分析儀的異常部位。
圖1尿液有形成份分析儀外觀示意圖。
圖2尿液有形成份分析儀的內部結構概略圖。
圖3尿液有形成份分析儀的檢測單元的流式細胞儀的說明圖。
圖4尿液有形成份分析儀細菌測定結果顯示圖。
圖5尿液有形成份分析儀白血球測定結果顯示圖。
圖6尿液有形成份分析儀在本發明實施形式下的細菌用標準粒子的測定結果顯示圖。
圖7尿液有形成份分析儀在本發明實施形式下的白血球用標準粒子測定結果顯示圖。
圖8顯示尿液有形成份分析儀推斷異常部位的流程圖。
圖9顯示尿液有形成份分析儀推斷異常部位的流程圖。
具體實施例方式
粒子分析儀用參照物是用於對生物試樣中所含被測粒子進行色素螢光染色處理、再對染色後的被測粒子進行分析的粒子分析儀的參照物，其包括經上述螢光染色處理的第一標準粒子和事先製備有一定螢光色素的第二標準粒子。上述第一標準粒子在粒子分析儀的螢光染色處理過程中被染色，顯示出螢光的強度。與此相反，上述第二標準粒子實際上並未染色，本身已含有一定的螢光色素，故可顯示出一定的螢光強度。
用粒子分析儀測定上述參照物時，因可以分別檢測出具有不同特性的第一和第二標準粒子的各檢測值，從而使檢測裝置故障比以往更精確。具體來說，就是可以判斷出粒子分析儀發生異常的部位。據此可以在校對裝置時對需要校對的設備等進行準確的維修，防患於未然。
用於粒子分析儀精度管理的具有染色性能的第一標準粒子優選測定時使用色素染色時可以染成發出與生物試樣中的被測粒子同等強度螢光的粒子。而實際上不具染色性、但能發螢光的第二標準粒子優選以適當方法預先製備成含螢光色素、可以發出與生物試樣中的被測粒子同等強度螢光的粒子。
下面對本實施方式的參照物進行說明，但本發明並不限於這一實施方式。
本實施方式的參照物用於分析生物試樣中所含粒子的粒子分析儀的精度管理與校正。參照物含有經螢光染色處理染色的第一標準粒子和預先製備為含一定螢光色素的第二標準粒子。上述第二標準粒子因含有一定的螢光色素，故可以顯示出一定的螢光強度。
作為本實施方式的標準粒子所適用的粒子分析儀有諸如血液分析儀(analyzer for analyzing blood cell)、尿液有形成份(尿液沉渣)分析儀(analyzer for analyzing particle components in urea)等分析儀，這些分析儀具有用螢光色素對尿液和血液等生物試樣染色、製備測定試樣的測定試樣製備系統，將製備好的測定試樣提供給流式細胞儀，用光束照射通過流式細胞儀的測定試樣中的粒子，再用螢光檢測器檢測並分析被染色粒子發出的螢光。
下面以本實施方式的標準粒子適用的粒子分析儀之一尿液有形成份分析儀為例進行說明。此尿液有形成份分析儀可以測定尿液中所含粒子白血球、紅血球、上皮細胞、管型體(cylinder)和細菌。該裝置特別提高了對被測粒子中微小細菌的測定精度，針對細菌使用細菌測定用稀釋液和細菌測定用染色液，對於其他四種粒子(白血球、紅血球、上皮細胞、管型體)使用四粒子測定用稀釋液和染色液進行測定。下面把四粒子測定用稀釋液稱為第一稀釋液，把四粒子測定用染色液稱為第一染色液，細菌測定用稀釋液稱為第二稀釋液，細菌測定用染色液稱為第二染色液。
圖1是尿液有形成份分析儀的外觀示意圖。該尿液有形成份分析儀有儀器本體1、雷射電源2和空壓源3。儀器本體1包括電源開關4、移送裝有尿樣的樣品管(sample tube)自動輸送到吸濾器5的輸送單元6、從樣品管抽吸尿液的吸濾器5、啟動吸濾器5的開關7和供使用者進行操作輸入、同時顯示尿液分析結果等信息的觸控螢幕式液晶顯示面板8。
分析儀本體1如圖2所示，有試樣製備部分11、檢測部分41、分析部分56。試管14中的生物試樣(尿液)被注射泵15抽入吸管16。抽入的生物試樣用樣品閥17定量，分別供給反應室18和19。也就是說，同一生物試樣源要定量注入不同的反應室18、19。容納第二稀釋液(細菌用稀釋液)的容器20和容納第二染色液(細菌用染色液)的容器21與反應室18連接，第二稀釋液和第二染色液分別被注射泵22、23通過軟管定量輸送到反應室18。容納第一稀釋液(四粒子用稀釋液)的容器24和容納第一染色液(四粒子用染色液)的容器25與反應室19連接，第一稀釋液和第一染色液分別被注射泵26、27通過軟管定量輸送到反應室19，製備四粒子測定試樣(以下稱測定試樣A)。
檢測部分41用於檢測測定試樣中所含各種粒子發出的螢光和散射光等光學信息，由流式細胞儀構成。
流式細胞儀有輸送測定試樣的流通池42、照射通過流通池42的測定試樣的雷射器47、接受測定試樣中粒子發出的側向螢光的光電倍增管52、接受前向散射光的發光二極體49。
圖3對流式細胞儀做了詳細描述。如圖2所示，反應室18和19與流通池42相接。測定試樣通過的流通池42是雷射照射的部分，有內徑非常細的銳孔43、向上面的銳孔噴射測定試樣的噴嘴44、包裹液供給口45、廢液口46。雷射光源47是發射波長633nm雷射的紅色半導體雷射器。檢測部分41中有將雷射器發出的雷射聚向流通池42的聚光鏡48、用於接受被雷射照射的測定試樣中的粒子發出的前向散射光，並轉換成電信號的發光二極體49、負責將前向散射光聚集到發光二極體49的集光鏡50和小孔51、接受被雷射照射的測定試樣的粒子發出的螢光，將其轉換為電信號的光電倍增管52、負責向光電倍增管匯聚螢光的集光鏡53、濾光器54、小孔55、將發光二極體49和光電倍增管52輸出的電信號放大，作為前向散射光信號和螢光信號輸出到分析部分56的放大器57、58。一旦測定試樣流入流通池42，試樣中所含的粒子就會橫向截斷雷射器47發射的雷射照射區域，每當這時，就會產生螢光和散射光。光電倍增管52和發光二極體49分別將側向螢光和前向散射光接收，並進行光電轉換，再將稱作側向螢光信號和前向散射光信號的光檢測信號輸送到分析部分56。
圖3的分析部分56由放大檢測部分41檢測出的每個粒子的光檢測信號並除去雜波的電路和由CPU、ROM、RAM等構成的計算機組成。分析部分56將存儲檢測部分41檢測出的每個粒子的光檢測信號，然後對存儲的每個粒子的光檢測信號進行分析，制出平面分布圖，對測定試樣中所含粒子計數，即可從光檢測信號的脈衝峰值級得出信號強度。螢光信號的強度表示從測定試樣的各粒子中檢測出的螢光強度，將成為反映用螢光色素染色程度的參數。前向散射光信號的強度表示從測定試樣的各粒子檢測出的前向散射光的強度，將成為反映粒子大小的參數。將這些參數組合起來就繪製出平面分布圖。關於出現在分布圖上的粒子，通過計算出現在依測定試樣所含粒子各自的出現位置而定的區域內的粒子點數，獲得測定結果。
另外，如圖2所示，分析部分56與觸控螢幕式液晶顯示面板8連接，經其分析得出的測定結果顯示在觸控螢幕式液晶顯示面板上。
下面以尿液有形成份分析儀用的參照物為例進行說明。參照物由相應於被測粒子的標準粒子和分散標準粒子的溶劑構成。標準粒子使用的是可以與被測粒子基本同程度染色的第一標準粒子和預先製備成含有一定螢光色素的第二標準粒子。在此，經色素染色的第一標準粒子呈現的螢光強度與被色素染色的被測粒子所呈現的螢光強度大致相同。第二標準粒子實際上並未被色素染色，但也能呈現出與經染色的被測粒子所呈現的螢光強度差不多的螢光強度。
下面，用與白血球對應的白血球用標準粒子作為第一標準粒子、與細菌對應的細菌用標準粒子作為第二標準粒子，製備出參照物的一例，並用上述尿液有形成份分析儀1測定。
標準粒子細菌用標準粒子使用的是平均粒徑為1μm的螢光膠乳粒子(Duke公司制、DUKE4010A+螢光1.0％)。白血球用標準粒子使用的是平均粒徑7μm的醋酸乙烯基聚合物粒子。
緩衝液1和緩衝液2的製備在1L蒸餾水中添加氯化鈉、防腐劑、醋酸，使三者在溶液中的濃度分別達0.3％、0.08％、0.035％，製備緩衝溶液1。再在這個緩衝溶液中添加氯化鈉直至其最終濃度達到1.65％，再添加丙三醇使其最終濃度達到9.0％，配製出緩衝液2。
細菌用標準粒子懸浮液的製備在250μl螢光膠乳粒子(500個/μl)中添加1ml濃度為6％的聚乙烯醇溶液，進行渦流式攪拌，使螢光膠乳粒子懸浮。將錐型腔體(horn)8mm的超聲波細胞粉碎機設定為50mW、30sec，用丙三醇包封懸浮液中的螢光膠乳粒子。在此懸浮液中適量加入上述緩衝液1淨化，用12000rpm離心力除去上清液。反覆兩次這種淨化工序後，添加2ml上述緩衝液2配製出細菌用標準粒子懸浮液。
白血球用標準粒子懸浮液的製備在250μl醋酸乙烯基聚合物粒子(200個/μl)中加入適量緩衝液1，用3000rpm離心力除去上清液。反覆二次後添加2ml上述緩衝液2，即配製出白血球用標準粒子懸浮液。
上述製備的細菌用標準粒子懸浮液和白血球用標準粒子懸浮液混合後作為參照物使用。
四粒子測定用稀釋液(第一稀釋液)的製備第一稀釋液是用1L蒸餾水中添加HEPES 50mM、EDTA-3K 0.40％、2-苯氧基乙醇0.75％、丙酸鈉0.6％、苛性鈉0.052％、C5H4NOSNa350ppm、Proxel GX-L(一種防腐劑商品名)350ppm配製而成的。
細菌測定用稀釋液(第二稀釋液)的製備第二稀釋液是添加檸檬酸100mM、硫酸鈉90mM、氨基磺酸100mM、十四(烷)三甲基銨溴0.1％，並添加苛性鈉，使溶液的PH值達到pH2.5配製而成的。
四粒子測定用染色液(第一染色液)的製備將以下化學式1所示的螢光色素NK-529(日本感光色素研究所(株)制)240ppm、化學式2所示的螢光色素NK-136(日本感光色素研究所(株)制)25.2ppm溶解到乙二醇中得到的即是第一染色液。
化學式1 化學式2
細菌測定用染色液(第二染色液)的製備以下化學式3所示螢光色素溶解到乙二醇中40ppm即得到第二染色液。
化學式3 首先，分別將第二稀釋液裝入尿液有形成份分析儀1的容器20，第二染色液裝入容器21，第一稀釋液裝入容器24，第一染色液裝入容器25，測定尿樣。以發光二極體49檢測出的前向散射光強度為縱坐標、光電倍增管52檢測出的側向螢光強度為橫坐標的分布圖如圖4和圖5所示。圖4比圖5提高了前向散射光感光度。
圖4是從由尿樣、第二稀釋液和第二染色液製備的測定試樣B中得出的測定結果。為了測定尿樣中所含細菌，圖4提高了前向散射光感光度，在圖中的A區(前向散射光強度約70～110道、螢光強度約100～160道)觀察到了細菌。
圖5是從由尿樣、第一稀釋液和第一染色液製備的測定試樣A中得出的測定結果。圖5前向散射光感光度比圖4設定得低，因此，在圖中C區觀察到細菌，B區(前向散射光強度約170～230道，螢光強度約30～170道)觀察到白血球。
接著，用尿液粒子分析儀1測定參照物。所得分布圖如圖6和圖7。圖6是從由參照物、第二稀釋液和第二染色液製備的測定試樣B得出的測定結果。圖7是從由參照物、第一稀釋液和第一染色液製備的測定試樣A中得到的測定結果。圖6和圖7是以前向散射光強度為縱坐標、側向螢光強度為橫坐標的分布圖。與圖4和圖5的情況一樣，圖6比圖7前向散射光感光度高。
圖6在細菌出現區域A區內觀察到細菌用標準粒子(螢光膠乳粒子)。這個細菌用標準粒子的分布範圍在細菌出現區域A的略靠中間處，其前向散射光強度約為81～88溝道(channel)，螢光強度約為110～140溝道。細菌用標準粒子實際上並未被第二染色液染色。
圖7是在白血球出現區域B區內觀察到白血球用標準粒子(醋酸乙烯基聚合物粒子)的。觀測到的白血球用標準粒子的分布範圍為前向散射光強度約為200～220溝道、螢光強度約為30～140溝道。此外，還在區域C觀察到細菌用標準粒子，細菌用標準粒子實際上並未被第一染色液染色。
與圖7顯示白血球用標準粒子的出現區域和細菌用標準粒子的出現區域相反，圖6未明確顯示白血球用標準粒子的出現區域。這是因為圖6為了測定試樣中的細菌提高了前向散射光的感光度。如上所述，細菌用標準粒子和白血球用標準粒子的粒徑相差很大，加之前向散射光是反映粒子大小的參數，故從細菌用標準粒子得到的前向散射光強度和從白血球用標準粒子得到的前向散射光強度其大小不同。因此，對於圖6，可以通過繪製降低前向散射光感光度的分布圖來確認白血球用標準粒子的出現區域。
用尿液有形成份分析儀1分析尿樣時檢測出的粒子螢光強度取決於以下兩個條件(1)檢測部分41的條件比如螢光檢測器(光電倍增管52)的感光度(輸出電壓)和雷射器47的發光強度等(2)試樣製備部分11的條件比如染色液的注入量等。在此，假設比較通過測定標準粒子得到的螢光強度平均值和螢光強度的規定範圍，判斷其結果為±(正常範圍內)、+(比正常範圍高10)、-(比正常範圍低10)。當由第一稀釋液和第一染色液製備出的測定試樣A獲得的第一標準粒子和第二標準粒子的判斷結果如下表1所示時，可以推斷檢測部分41和試樣製備部分11(特別是與用第一稀釋液和第一染色液製備測定試樣A相關的部分)的故障。
表1
從第二稀釋液和第二染色液製備的測定試樣B得出的第一標準粒子及第二標準粒子的判斷結果也同樣，通過上述分析，可以推斷出檢測部分41和試樣製備部分11(特別是與用第二稀釋液及第二染色液製備測定試樣B相關的部分)的故障。
本實施方式中使用的尿液有形成份分析儀1可如上所述自動判斷異常部位。下面用圖8就其判斷過程進行說明。
首先，使用者將含有第一標準粒子及第二標準粒子的參照物放入規定位置，按啟動開關7，開始抽吸參照物。
步驟S1步驟S1製備測定試樣A和測定試樣B。
裝在試管14中的參照物被注射泵15經吸管16推入。推入的參照物由樣品閥17定量，分別注入反應室18、19。裝在容器20中的第二稀釋液被注射泵22通過軟管定量供給反應室18，裝在容器21的第二染色液被注射泵23通過軟管定量供給反應室18。這樣，測定試樣B就被製備出來。裝在容器24的第一稀釋液被注射泵26通過軟管定量供給反應室19，裝在容器25中的第一染色液被注射泵27通過軟管定量供給反應室19，這樣，測定試樣A即製備出來。
步驟S2步驟S2是從各測定試樣所含第一標準粒子和第二標準粒子中獲得螢光強度和前向散射光強度。
首先，反應室19中的測定試樣A從噴嘴44噴入流通池內，同時，包裹液從包裹液供給口45噴入包裹液流通池。測定試樣A在流通池內被包裹液包封，再由銳孔43呈細流流出。雷射器47發出的雷射被聚光鏡聚光後照射從銳孔43流過的測定試樣A，受光照的測定試樣A中的第一標準粒子和第二標準粒子發出的前向散射光在發光二極體被接受，並進行光電轉換，作為前向散射光信號輸出。測定試樣A中的第一標準粒子和第二標準粒子發出的側向螢光被光電倍增管52接受，並進行光電轉換，作為側向螢光信號輸出。各種信號輸出到分析部分56。分析部分56對檢測部分檢測出的前向散射光信號和側向螢光信號進行分析，獲得前向散射光強度和螢光強度。如此，從測定試樣A中的第一標準粒子獲得第一螢光強度和第一前向散射光強度；從測定試樣A中的第二標準粒子獲得第二螢光強度和第二前向散射光強度。
同樣，反應室18中的測定試樣B從噴嘴44噴入流通池內，流過流通池。受雷射照射的測定試樣B中的第一標準粒子和第二標準粒子發出的前向散射光在發光二極體49被接受，並被進行光電轉換，作為前向散射光信號輸出。測定試樣B中的第一標準粒子和第二標準粒子發出的側向螢光被光電倍增管52接受並轉換為電信號，作為側向螢光信號輸出。各種信號均輸出到分析部分56。分析部分56對檢測部分41檢測出的前向散射光信號和側向螢光信號進行分析，得出前向散射光強度和螢光強度。這樣即可從測定試樣B中的第一標準粒子得到第三螢光強度和第三前向散射光強度。還可從測定試樣B中的第二標準粒子得到第四螢光強度和第四散射光強度。
步驟S3在步驟S3，分析部分56儲存前述步驟S2所獲得的前向散射光強度和螢光強度。
步驟S4步驟S4，分析部分56取得有關第一標準粒子的螢光強度的判斷結果和關於第二標準粒子的螢光強度的判斷結果，並根據這個判斷結果以與表1同樣的標準推斷異常部位。
首先，分析部分56就獲得的第一螢光強度計算出其平均值(以下稱平均值X)，然後，如果所得平均值X在所規定的上限值和下限值的範圍內，則判斷為±(正常範圍內)，如果超過其上限值，則判斷+(值高於正常範圍)，若低於下限值，則判斷為-(值低於正常範圍)。同樣，分析部分56對第二螢光強度、第三螢光強度和第四螢光強度也分別算出其平均值，做出上述同樣的判斷。
如此，分析部分56獲得有關第一標準粒子螢光強度(第一螢光強度和第三螢光強度)的判斷結果和關於第二標準粒子螢光強度(第二螢光強度和第四螢光強度)的判斷結果，並根據這個判斷結果以與表1同樣的標準推斷異常部位。
步驟S5步驟S5將上述步驟S4中推斷異常部位的結果輸出到觸控螢幕式液晶顯示面板8上。
如上所述，通過使用本例的標準粒子，諸如試樣製備部分的螢光染色性能下降、螢光檢測器的感光度升高等情況下，過去的技術檢測不出來的異常都可以檢測出來，由於知道異常發生的部位，對儀器進行維修也變得更加容易。
另外，在上述實施方式中，描述了通過測定標準粒子的螢光強度來探知異常部位的情況，其實還可以測定螢光脈衝持續時間來探知異常部位。不僅標準粒子的螢光，通過測定散射光(強度或脈衝持續時間)也可以確認散射光檢測器有無故障。
在上述實施方式中，雖然就使用含有第一標準粒子和第二標準粒子的參照物進行測定的過程進行了說明，但本發明並非僅限於此。比如，還可以使用含有第一標準粒子的第一參照物和含有第二標準粒子的第二參照物。下面用圖9就這種情況下的過程進行說明。
首先，使用者將含有第一標準粒子的第一參照物和含有第二標準粒子的第二參照物分別放入規定的位置，按啟動開關7，則第一參照物和第二參照物依次被吸入。
步驟S6步驟S6由第一參照物製備第一測定試樣A和第一測定試樣B。有關製備各測定試樣的儀器的運行步驟與上述步驟S1相同。
步驟S7步驟S7從上述步驟S6製備的各測定試樣所含的第一標準粒子和第二標準粒子獲得螢光強度和前向散射光強度。有關獲得螢光強度和前向散射光強度的儀器的運行步驟與上述步驟S2相同。如此，從上述步驟S6製備的第一測定試樣A中的第一標準粒子獲得第一螢光強度和第一前向散射光強度；從測定試樣B中的第一標準粒子取得第三螢光強度和第三前向散射光強度。
步驟S8在步驟S8，分析部分56對上述步驟S7獲得的前向散射光強度和螢光強度進行存儲。
步驟S9步驟S9從第二參照物製備第二測定試樣A和第二測定試樣B。關於製備各測定試樣的儀器的運行步驟與上述步驟S1相同。
步驟S10步驟S10從上述步驟S9製備的各測定試樣所含的第一標準粒子和第二標準粒子獲得螢光強度和前向散射光強度。有關獲得螢光強度和前向散射光強度的儀器的運行步驟與上述步驟S2相同。如此，從上述步驟S9製備的第二測定試樣A中的第一標準粒子獲得第二螢光強度和第二前向散射光強度；從測定試樣B中的第一標準粒子獲得第四螢光強度和第四前向散射光強度。
步驟S11在步驟S11，分析部分56對上述步驟S10獲得的前向散射光強度和螢光強度進行存儲。
步驟S12在步驟S2，分析部分56得出有關第一標準粒子的螢光強度的判斷結果和關於第二標準粒子的螢光強度的判斷結果，並根據這些判斷結果以與表1相同的基準推斷異常部位。儀器有關檢測結果的判斷和異常部位的推斷等運行步驟與上述步驟S4相同。這樣即取得有關第一標準粒子的螢光強度(第一螢光強度和第三螢光強度)的判斷結果和關於第二標準粒子的螢光強度(第二螢光強度和第四螢光強度)的判斷結果，並根據這個判斷結果以與表1同樣的標準推斷異常部位。
步驟S13步驟S13是將上述步驟S12中推斷異常部位的結果輸出到觸控螢幕式液晶顯示面板8。
在步驟S5或步驟S13，不僅異常部位的推斷結果，第一標準粒子和第二標準粒子的±、+或-的結果也可以顯示在觸控螢幕式液晶顯示面板8上。
上述實施方式中雖然使用白血球用標準粒子作為相應於第一標準粒子的標準粒子，使用細菌用標準粒子作為相應於第二標準粒子的標準粒子，但並不僅限於此。例如，作為第一標準粒子除白血球用標準粒子外，還可以使用紅血球用標準粒子、上皮細胞用標準粒子和管型體用標準粒子等。
作為與白血球對應的白血球用標準粒子，可以使用醋酸乙烯基聚合物粒子和多孔矽石粒子等。這種標準粒子用色素染色後能顯示出與白血球大致相同的螢光強度，理想的是能顯示與白血球大致相同的散射光強度、平均粒徑5～15μm、最好是7～12μm的粒子。
作為對應於上皮細胞的上皮細胞用標準粒子，可使用聚丙烯醯胺粒子和纖維素凍膠粒子、親水性乙烯基聚合物凍膠粒子等。該標準粒子經色素染色，可顯示與上皮細胞相近的螢光強度，優選能顯示與上皮細胞略同的散射光強度、平均粒徑為20～150μm、最好是45～90μm的粒子。
作為對應於管型體的管型體用標準粒子，可使用親水性乙烯基聚合物粒子和橋連瓊脂凍膠等。這種標準粒子用色素染色後可顯示出與管型體相近的螢光強度，優選可顯示與管型體相近的散射光強度、平均粒徑5～60μm、最好10～40μm的粒子。
作為相應於紅血球的紅血球用標準粒子，可使用膠乳粒子和高純度二氧化矽粒子等。這種標準粒子用色素染色後會顯示出與紅血球相近的螢光強度，優選能顯現與紅血球相近的散射光強度、平均粒徑為3～20μm最好5～10μm的粒子。
作為對應於細菌的細菌用標準粒子，可使用螢光膠乳粒子等，這種標準粒子優選對粒子分析儀使用的色素實際上不會染色的粒子，而且它最好能顯示與被色素螢光染色的細菌相近的螢光強度，顯示與細菌相近的散射光強度的更好，其平均粒徑為0.5～5μm、最好為0.8～3μm。
在實施方式中，雖然對應於細菌的標準粒子使用的是螢光膠乳粒子，對應於白血球的標準粒子使用的是在粒子分析儀中經螢光染色處理的粒子，但並不僅限於此。比如，對應於細菌的標準粒子可以使用被色素螢光染色得與細菌相近的粒子，對應於白血球、紅血球、上皮細胞或管型體的標準粒子也可以使用預先製備成含有一定螢光色素的螢光粒子。為了提高作為標準粒子使用的膠乳粒子等的分散性，也可以對膠乳粒子施以聚乙烯醇塗覆。
作為參照物使用的溶劑可以使用水性溶劑，最好使用緩衝劑。為了提高標準粒子的分散性，緩衝劑中也可加入表面活性劑等分散性提高劑。
與尿樣混合製備測定試樣的試劑最好象上述實施方式那樣，分別使用測定紅血球、白血球、上皮細胞和管型體用的第一染色液和第一稀釋液及測定細菌用的第二染色液和第二稀釋液。這是因為尿樣所含粒子中，細菌比其他粒子小，使用檢測細菌專用的稀釋液和染色液可以提高細菌的檢測精度。
比如，尿樣中常常可以看到粘液絲、結晶、無晶性鹽類和細胞碎片等所謂的雜物，這些大小相似，妨礙對細菌的檢測。從雜物檢出的前向散射光的強度與從細菌檢測出的強度重合，有時難以辨別。因此，最好製備可以抑制雜物染色且能溶解雜物的第二稀釋液。
為了提高細菌的染色性、抑制雜物染色且一定程度溶解雜物，第二稀釋液最好製備在pH2.0～4.5、最理想的是pH2.0～3.0範圍內。
為了維持第二稀釋液的上述pH值，可以使用酸或pKa 1～5的緩衝劑。只要能維持上述pH範圍，並沒有特別限定，但最好使用檸檬酸鹽、磷酸鹽、鄰苯二酸鹽、甘氨酸、丁二酸、乳酸、β-氨基丙酸、ε-氨基己酸和富馬酸等。使用量以可維持上述pH值的量和10～500mM的範圍內即可。
另外，在第二稀釋液中添加表面活性劑最好添加陽離子型表面活性劑，可以破壞細菌的細胞膜，使色素容易滲入，其結果是細菌更好地染色，更易與雜物甄別。另一方面，粘液絲和紅血球、細胞碎片等會溶解或收縮，從而減少對細菌檢測的影響。
陽離子型表面活性劑並沒有特別限定，比較合適的可以舉出以下化學式4所示的四級銨鹽。在化學式4中R10表示碳數6～18的烷基或(C6H5)-CH2-，R11、R12及R13表示碳數1～3的烷基或苯甲基，Y-表示滷離子。另外，R11、R12和R13可以相同，也可以不同。
化學式4 例如癸基三甲銨鹽、十二(烷)三甲銨鹽、十四(烷)三甲銨鹽、十六(烷)三甲銨鹽和十八(烷)三甲銨鹽均適宜使用。使用量可以是10～30000mg/L，最好為100～3000mg/L。
用於細菌的螢光染色處理的色素只要可以在上述pH值範圍內使細菌染色即可，並無特別要求。至於濃度，每種色素的適宜濃度各異，但在諸如0.1～100ppm(最終濃度)的範圍內使用即可。另外，從檢測細菌的能力這一點來說，使用的色素至少應與細菌的構成成份之一結合，使用發螢光的螢光色素比較有利。
具體來說，以下化學式5所示色素比較理想。在化學式5中，R1表示氫原子或碳數1～3的烷基，R2和R3表示氫原子、碳數1～3的烷基或碳數1～3的烷氧基，R4表示氫原子、醯基或碳數1～3的烷基，R5表示氫原子、可取代的碳數1～3的烷基、Z表示硫原子、氧原子或以碳數1～3的烷基取代的碳原子，n表示1或2整數，X-表示陰離子。
化學式5 另一方面，檢測尿樣中除細菌以外的紅血球、白血球、上皮細胞和管型體四種粒子用的稀釋液(第一稀釋液)最好製備到紅血球不溶血的滲透壓強和pH的範圍。
為了把第一稀釋液製備在紅血球不溶血的滲透壓強和pH的範圍內，可以添加緩衝劑和滲透壓強補償劑。第一稀釋液的pH值可在3.8～10.5、最好6.3～8.5的範圍內。這是因為一旦第一稀釋液的pH值呈強鹼性，紅血球就可能溶血，若呈酸性，則尿檢體中的pH變化大，可能造成紅血球受損或尿液中的粒子的染色性整體下降。
添加在第一稀釋液中的緩衝劑可用歷來大家熟悉的東西，諸如飽和酚(Tris)、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS等好的緩衝劑。所用緩衝劑的濃度通常為20～500mM、最好為50～200mM之間。
作為添加在第二稀釋液的滲透壓強補償劑可選用無機鹽和丙酸鹽等有機鹽類、糖類等。無機鹽類可使用的有氯化鈉、氯化鉀、溴化鈉等。在有機鹽類中作為丙酸鹽可使用丙酸鈉、丙酸鉀、丙酸銨等。其他有機鹽類有溴酸鹽、醋酸鹽等。糖類可使用山梨(糖)醇、葡萄糖、甘露(糖)醇等。添加滲透壓強補償劑的目的是防止紅血球溶血、得到穩定的螢光強度。尿液的滲透壓強分布很廣，為50～1300mOsm/kg。分析用試劑的滲透壓強過低，紅血球的溶血會在早期進行，過高則尿樣中的粒子受損加大，因此，滲透壓強最好在100～600mOsm/kg，150～500mOsm/kg更好。
為了減少出現在尿樣中的非晶鹽類(如磷酸銨、磷酸鎂、碳酸鉀)的影響，還可在四粒子用稀釋液添加溶解這些鹽類的螯合劑。螯合劑只要是脫鉀劑、脫鎂劑即可，沒有特定的種類。例如EDTA鹽、CyDTA、DHEG、DPTA-OH、EDDA、EDDP、GEDTA、HDTA、HIDA、Methyl-EDTA、NTA、NTP、NTPO、EDDPO等。最合適的是EDTA鹽、CyDTA、GEDTA。濃度在0.05～5w/w％範圍內即可，最好是0.1～1w/w％。在此所謂的脫鉀劑或脫鎂劑指與鉀離子或鎂離子結合，形成水溶性化合物的物質。
若尿樣中出現酵母樣真菌，則從酵母樣真菌檢測出的前向散射光和螢光的強度會與從紅血球檢測出的強度重合，造成分辨困難。因此，可以在有形成份用稀釋液中添加使酵母樣真菌與紅血球之間螢光色素的染色性產生差異的物質，通過添加這種物質，就可以使從酵母樣真菌和紅血球檢測出的螢光強度不同，從而提高紅血球的辨別準確度。這種物質可以是破壞酵母樣真菌細胞膜、加速色素對細胞內部的滲透而不損傷紅血球細胞膜的物質。紅血球的細胞膜一旦受損，就會發生溶血，給紅血球計數帶來困難。滿足上述條件的物質以有苯環的非離子型有機化合物為好，如苄醇、β苯乙醇、苯酚、1-苯氧基乙酸-2-丙醇、2-苯氧基乙酸乙醇等芳族醇、2-氨基苯噻唑和苯噻唑等噻唑化合物以及醋酸苯基等。
本實施方式中可染色的粒子和用於給尿樣有形成份染色的螢光色素可以使用以下化學式6和化學式7中所示縮合苯衍生物。
化學式6 在化學式6中，R1和R2表示氫原子或碳數1～6的烷基或用氫氧基取代的碳數1～6的烷基。A和B表示硫或氧或氮或含從甲基和乙基中選擇的低級烷基的碳。n為1或2，X-是陰離子。
化學式7 在化學式7中，R1表示碳數1～6的烷基。R2表示氫或碳數1～3的烷氧基。R3表示碳數1～3的烷氧基、被碳數1～3的烷基取代的次低級烷基胺基和N(CH3)C2H4CN。A表示硫或氧或含從甲基和乙基選擇的低級烷基的碳。m表示1或2，n則是0或1。
以上列舉了在尿液有形成份分析儀1上應用本發明的參照物的實施方式，該尿液有形成份分析儀1用試樣製備部分製備並測定用於測定白血球、紅血球、上皮細胞和管型體四粒子的測定試樣A和用於測定細菌的測定試樣B。但是，並非僅限於此，只要是對生物試樣中的粒子進行螢光染色處理的試樣製備裝置和具備螢光檢測器的粒子分析儀都可使用本發明的參照物。比如，這種粒子分析儀還有在尿液有形成份分析儀1中未安裝細菌測定試樣製備裝置(容器20和21、注射泵22和23、反應室18)只用一個試樣製備裝置(容器24和25、注射泵26和27、反應室19)製備測定白血球、紅血球、上皮細胞、管型體和細菌用的測定試樣的儀器。
本發明涉及的參照物作為可以對自動粒子分析儀進行精度管理或校正的參照物是有用的。
權利要求
1.一種粒子分析儀用參照物，該粒子分析儀用色素對生物試樣中所含被測粒子進行螢光染色處理，然後分析被螢光染色的被測粒子；該參照物包括·經上述螢光染色處理而螢光染色的第一標準粒子；及·預先含有一定螢光色素的第二標準粒子。
2.根據權利要求1的粒子分析儀用參照物，其特徵是所述第二標準粒子是一種實際上並未被所述色素染色的粒子。
3.根據權利要求1的粒子分析儀用參照物，其特徵是所述第一標準粒子被所述色素染色，以顯示與生物試樣中所含第一被測粒子相近的螢光強度；所述第二標準粒子顯示與經所述色素染色的試樣中所含第二被測粒子相近的螢光強度。
4.根據權利要求3的一種粒子分析儀用參照物，其特徵是所述第一標準粒子顯示與所述第一被測粒子相近的散射光強度，所述第二標準粒子顯示與所述第二被測粒子相近的散射光強度。
5.根據權利要求3的一種粒子分析儀用參照物，其特徵是所述生物試樣為尿液；所述第一被測粒子選自白血球、紅血球、上皮細胞及管型體構成的群體；所述第二被測粒子是微生物。
6.根據權利要求1的一種粒子分析儀用參照物，其特徵是所述第一標準粒子是選自以下粒子群中的至少一種粒子醋酸乙烯基聚合物粒子、聚丙烯醯胺粒子、親水的乙烯基聚合物粒子、膠乳粒子和二氧化矽粒子；所述第二標準粒子是螢光膠乳粒子。
7.根據權利要求1的一種粒子分析儀用參照物，其特徵是所述粒子分析儀包括以下部分·將生物試樣與所述色素混合，製備測定試樣的測定試樣製備部分·用光束照射測定試樣的光源·檢測發自測定試樣的螢光的螢光檢測器。
8.根據權利要求7的一種粒子分析儀用參照物，其特徵是所述粒子分析儀包括接受上述測定試樣發出的散射光的散射光檢測器。
9.一種推斷粒子分析儀異常部位的方法，該粒子分析儀包括用於混合生物試樣和第一標準粒子的螢光色素以製備測定試樣的測定試樣製備部分、對測定試樣進行光照的光源以及檢測測定試樣發出的螢光的螢光檢測器，該方法包括以下步驟(a)用上述粒子分析儀測定第一標準粒子和第二標準粒子，檢測出與第一標準粒子相關的第一螢光和與第二標準粒子相關的第二螢光；上述第一標準粒子被上述第一螢光色素螢光染色；上述第二標準粒子是預先含有第二螢光色素的粒子；(b)根據在上述(a)步驟中獲得的第一螢光的檢測結果和第二螢光的檢測結果，推斷粒子分析儀的異常部位。
10.根據權利要求9的推斷粒子分析儀異常部位的方法，在所述(a)步驟中，將含有上述第一標準粒子和上述第二標準粒子的參照物與上述第一螢光色素混合，製備測定試樣，再從製備出的測定試樣中檢測出與第一標準粒子相關的第一螢光和與第二標準粒子相關的第二螢光。
11.根據權利要求9的推斷粒子分析儀異常部位的方法，在所述(a)步驟中，將含有上述第一標準粒子的第一參照物與上述第一螢光色素混合，製備第一測定試樣，從製備出的第一測定試樣中檢測出與第一標準粒子相關的第一螢光；從含有上述第二標準粒子的參照物中製備測定試樣，從製備出的第二測定試樣中檢測出與第二標準粒子相關的第二螢光。
12.根據權利要求9的推斷粒子分析儀異常部位的方法，在所述(b)步驟中，將所述第一螢光的檢測結果與第一標準粒子的條件進行比較，取得第一比較結果；將所述第二螢光的檢測結果與第二標準粒子的條件進行比較，取得第二比較結果；根據所述第二比較結果推斷出光源或螢光檢測器的故障；根據所述第一比較結果和上述第二比較結果推斷出試樣製備部分的故障。
13.根據權利要求9的推斷粒子分析儀異常部位的方法，所述粒子分析儀還包括接受上述測定試樣發出的散射光的散射光檢測器；在所述(a)步驟中，檢測出與第一標準粒子相關的第一散射光和與第二標準粒子相關的第二散射光；在所述(b)步驟中，根據所述(a)步驟中取得的第一散射光檢測結果和第二散射光檢測結果，推斷光源或散射光檢測器的故障。
14.根據權利要求9的推斷粒子分析儀異常部位的方法，所述第二標準粒子是一種實際上並未被上述第一螢光色素染色的粒子。
15.一種粒子分析儀，其包括以下部分·測定試樣製備部分將含有第一標準粒子和第二標準粒子的參照物與第一螢光色素混合，製備測定試樣；上述第一標準粒子被上述第一螢光色素染色；上述第二標準粒子是一種預先含有第二螢光色素的粒子；·光源用光束照射上述測定試樣；·螢光檢測器用於檢測與上述第一測定試樣中的第一標準粒子相關的第一螢光和與上述第二測定試樣中的第二標準粒子相關的第二螢光；·分析部分根據第一螢光檢測結果和第二螢光檢測結果推斷粒子分析儀的異常部位。
16.一種粒子分析儀，其包括以下部分·測定試樣製備部分將含有第一標準粒子的第一參照物與第一螢光色素混合，製備出第一測定試樣，從含有第二標準粒子的第二參照物中製備第二測定試樣；上述第一標準粒子被上述第一螢光色素染色；上述第二標準粒子是一種預先含有第二螢光色素的粒子；·光源用光束照射上述第一和第二測定試樣；·螢光檢測器檢測與上述第一測定試樣中的第一標準粒子相關的第一螢光，檢測與上述第二測定試樣中的第二標準粒子相關的第二螢光；·分析部分根據第一標準粒子的螢光檢測結果和第二標準粒子的螢光檢測結果，推斷粒子分析儀的異常部位。
17.根據權利要求15或16的粒子分析儀，所述分析部分比較上述第一螢光檢測結果和第一條件，獲得第一比較結果；比較上述第二螢光檢測結果和第二條件，獲得第二比較結果；根據上述第二比較結果，推斷光源或螢光檢測器的故障；根據上述第一比較結果和上述第二比較結果，推斷試樣製備部分的故障。
18.根據權利要求15或16的粒子分析儀，所述粒子分析儀包括接受上述測定試樣發出的散射光的散射光檢測器；上述散射光檢測器可檢測與第一標準粒子相關的第一散射光和與第二標準粒子相關的第二散射光；上述分析部分根據第一散射光檢測結果和第二散射光檢測結果，推斷光源或散射光檢測器的故障。
19.根據權利要求15或16的粒子分析儀，所述第二標準粒子實際上並未被第一螢光色素染色。
全文摘要
本發明提供一種可以檢測出以往參照物無法檢測出的粒子分析儀故障的參照物。上述參照物是粒子分析儀用參照物，該粒子分析儀對生物試樣中所含被測粒子用一定的色素進行螢光染色處理，再對經螢光染色的被測粒子進行分析。參照物由經上述螢光染色處理的第一標準粒子和預先經染色製備的、可以顯示一定螢光強度的第二標準粒子組成。本發明還提供用參照物推斷粒子分析儀的異常部位的方法和裝置。
文檔編號G01N33/50GK1880942SQ200610098740
公開日2006年12月20日 申請日期2006年7月12日 優先權日2005年7月12日
發明者川手康德 申請人:希森美康株式會社