高保真性限制性內切核酸酶的製作方法
2023-06-06 07:23:36 1
專利名稱：高保真性限制性內切核酸酶的製作方法
高保真性限制性內切核酸酶
背景技術：
限制性內切核酸酶是以序列特異性方式切割雙鏈DNA的酶(Roberts，R.J. Proc Natl Acad Sci USA 102:5905-5908 (2005) ；Roberts,et al. Nucleic AcidsRes31:1805-1812 (2003) ；Roberts, et al. Nucleic Acids Res 33:D230-232 (2005)；Alves, et al. restriction endonucleases (限制件內切核酸酶),「Protein Engineeringof Restriction Enzymes (限制酶的蛋白質工程)，，，ed. Pingoud, Springer-Verlag BerlinHeidelberg, New York, 393-407 (2004))。它們廣泛存在於原核生物體中(Raleigh, etal. , Bacterial Genomes Physical Structure and Analysis (細菌基因組物理結構和分析),Ch. 8, eds. De Bruijin, et al. , Chapman & Hall, New York, 78-92 (1998)),其中它們形成限制-修飾系統的部分，該限制-修飾系統主要由內切核酸酶和甲基轉移酶組成。相關的甲基轉移酶甲基化其配對內切核酸酶識別的相同特定序列，並使修飾的DNA抵抗內切核酸酶的切割，以便適當保護宿主DNA。然而，當有外源DNA，尤其是噬菌體DNA侵入吋， 外源DNA將在其被完全甲基化之前降解。限制性修飾系統的主要生物學功能是保護宿主免於噬菌體感染(Arber Science 205:361-365(1979))。也提出了其它功能，如涉及重組和轉座(Carlson, et al. Mol Microbiol, 27:671-676 (1998) ；Heitman, Genet Eng (NY) 15:57-108(1993) ；McKane, et al. Genetics 139:35-43(1995))。大約3，000種已知限制性內切核酸酶對其250種以上的不同靶序列的特異性可以被認為是它們最令人感興趣的特徵。在發現了第一種限制性內切核酸酶的序列特異性性質(Danna, et al. , Proc Natl Acad Sci USA 68:2913-2917(1971) ；Kelly, et al. , J MolBiol 51:393-409(1970))之後，不久科學家們就發現，某些限制性內切核酸酶在非最佳條件下切割與其限定的識別序列相似但不一致的序列(Polisky, et al.，Proc Natl AcadSci USA, 72:3310-3314(1975) ；Nasri, et al. , Nucleic Acids Res 14:811-821(1986))。這種鬆弛的特異性(relaxed specificity)被稱為限制性內切核酸酶的星號活性(staractivity;。星號活性是分子生物學反應中的問題。星號活性在克隆載體或其它DNA中引入不期望的切割。在諸如其中某些DNA底物需要被限制性內切核酸酶切割以產生獨特指紋的法醫應用的情況中，星號活性將改變切割圖式特性，從而使分析複雜化。避免星號活性在諸如鏈置換擴增(Walker, et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 89:392-396 (1992))和基因表達系列分析(Velculescu, et al. , Science 270:484-487 (1995))的應用中也是至關重要的。
發明內容
在本發明的實施方式中，提供了確定限制性內切核酸酶及其變體的保真性指數(FI)的方法，其包括選擇反應緩衝液和含有限制性內切核酸酶的結合和切割位點的DNA底物；允許連續稀釋的限制性內切核酸酶或其變體切割DNA底物；和測定限制性內切核酸酶和一種或多種其變體的每ー種的FI。在實施方式中，該方法還包括比較限制性內切核酸酶及其變體的FI，以獲得變體的改進因子，例如大於2。在本發明的實施方式中，選擇緩衝液，其包含醋酸鉀、三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽和醋酸鎂；或氯化鎂。另外的實施方式包括(a)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. I的酶，其中，一個或多個突變的位置選自S36、K77、P154、E163、Y165和K185。(b)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 2的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K198和Q148。(C)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 3的 酶，其中，一個或多個突變的位置選自S15、H20、E34、M58、Q95、R106、K108、T181、R187和R199。(d)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 4的酶，其中，一個或多個突變的位置選自D16、D148和E132。(e)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 5的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K75、N146和D256。(f)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 6的酶，其中，一個或多個突變的位置選自E198和D200。(g)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 7的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K229、E025、R034和Q261。(h)組合物，其包括包含其中突變位置是K225的SEQ ID No. 8的酶。(i)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 9的酶，其中，一個或多個突變的位置選自H137、D177、K363、K408、R411、Q215、Q226和Q230。(j)組合物，其包括包含其中突變位置是F376的SEQ ID No. 10的酶。(k)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 11的酶，其中，一個或多個突變的位置選自R78、T140、E152、R199和F217。(I)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 12的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 G26、P105、T195、Q210、Y147、Y193、K114、T197、S245、D252 和 Y027。(m)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 13的酶，其中，一個或多個突變的位置選自H10、N208、K48、K74、R75、Y56、K58和M117。(η)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 14的酶，其中，一個或多個突變的位置選自Κ014、Q069、Ε099、R105、R117、G135和Υ035。(ο)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 15的酶，其中一個或多個突變的位置選自Ν106、Q169、Ε314和R126。(P)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 16的酶，其中，一個或多個突變的位置選自Τ20、Ρ52、Υ67、Κ68、R75、Ε86、Q90、S91、Q93、Η121和G172。(q)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 17的酶，其中，一個或多個突變的位置選自E059、P065、S108、N172、K174、Q179、G182和Y055。
(r)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 18的酶，其中，一個或多個突變的位置選自N212和L213。(s)組合物，其包括包含突變位於位置N65的SEQ ID No. 19的酶。(t)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 20的酶，其中，一個或多個突變的位置選自E007、D011、E049、R073、R114、G137、S210和R213。(U)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 21的酶，其中，一個或多個突變的位置選自P079、E086、H096和E218。(V)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 22的酶，其中，一個或多個突變的位置選自E32、S081、G132、F60和S61。(w)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 23的 酶，其中，一個或多個突變的位置選自 G013、G016、K018、P052、R053、K070、E071、D072、G073、S84、E086、R090、K094、R095、P099、P103、K113、N135、S151、P157、G173、T204、S206、K207、E233、N235、E237、S238、D241、K295、S301 和 S302。(X)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 24的酶，其中，一個或多個突變的位置選自S64、S80、S162、T77/T96和N178。(y)組合物，其包括包含其中位置R232被突變的SEQ ID No. 25的酶。(Z)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 26的酶，其中，一個或多個突變的位置選自S50、Y8UN93和W207。(aa)組合物，其包括包含在G26處具有突變的SEQ ID No. 27的酶。(bb)組合物，其包括包含在El 12 / R132處具有突變的SEQ ID No. 28的酶。(cc)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 29的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 N016、S33、P36、H76、P87、N89、R90、T138、K141、K143、Q221、Q224、N253、Q292、R296、T152、G326 和 T324。(dd)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 30的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K024、P214、E146、N251和Y095。(ee)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 31的酶，其中，一個或多個突變的位置選自G075、Q099、G155、P022和R90。(ff)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 32的酶，其中，一個或多個突變的位置選自S097和E125。(gg)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 33的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K021、1031和T120。(hh)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 34的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K7、T10、N11、N14、Q232和T199。(ii)組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQ ID No. 35的酶，其中，一個或多個突變的位置選自P92、P144、G197和M198。任何上述組合物進ー步的特徵在於突變酶在預定緩衝液中的FI大於在預定緩衝液中沒有突變的酶的FI。附圖簡述圖IA和IB顯示PvuI-HF和PvuI-WT活性的比較。
在圖IA中，星號(*)符號表示左邊的泳道(泳道2)，其中不再檢測到星號活性。數字(#)符號表示右邊的泳道(泳道8)，其中發生部分消化。PvuI-WT的起始濃度被計算為77単位。在圖IB中，直到泳道15才觀察到完全消化，然後，觀察到星號活性。允許完全消化的稀釋窗ロ(window of dilution)在系列中從6倍稀釋擴展到15倍稀釋。PvuI-HF的起始濃度被計算為至少9600單位。圖2A 和 2B 顯示 HindIII-HF 和 HindIII-WT 活性的比較。在圖2A中，星號(*)符號表示左邊的泳道(泳道9)，其中不再檢測到星號活性。數字(#)符號表示右邊的泳道(泳道15)，其中發生部分消化。HindIII-WT的起始濃度被計算為9，600單位。 在圖2B中，直到泳道13才觀察到完全消化，然後，觀察到星號活性。允許完全消化的稀釋窗ロ在系列中從6倍稀釋擴展到13倍稀釋。HindIII-HF的起始濃度被計算為至少2,400單位。圖3A和3B顯示DraIII-HF和DraIII-WT活性的比較。在圖3A中，星號(*)符號表示左邊的泳道(泳道12)，其中不再檢測到星號活性。數字(#)符號表示右邊的泳道(泳道12)，其中發生部分消化。沒有觀察到星號活性和部分消化的DNA。DraIII-WT的起始濃度被計算為1，200單位。在圖3B中，直到泳道12才觀察到完全消化，然後，觀察到星號活性。DraIII-HF的起始濃度被計算為至少1，200単位。圖4A和4B顯示KpnI-HF和KpnI-WT活性的比較。在圖4A中，*符號表示左邊的泳道(泳道9)，其中不再檢測到星號活性。#符號表示右邊的泳道(泳道13)，其中發生部分消化。在圖4A中，KpnI-WT的起始濃度被計算為2,000単位。在圖4B中，自始至終都觀察到完全消化而沒有發生星號活性或部分消化。KpnI-HF的起始濃度被計算為大於12，000単位。圖5A-5B 顯示 StyI-HF 和 StyI-WT 的比較。在圖5A中，*符號顯示星號活性在其左側(泳道6)開始，#符號顯示部分活性在其右側(泳道12)開始。Sty-WT的起始量被計算為1，000單位。在圖5B中，在最初2個泳道中觀察到星號活性，並且，從泳道14或15觀察到部分消化。StyI-HF的起始量被計算為4，000単位。圖6 顯示 BglI-HF 和 BglI-WT 對 pXba 的比較。BglI-HF 的 FI 至少為 8，000，而BglI-WT的FI為32,提供至少為250的改進因子(improvement factor)。右邊的圖為理論消化圖式。圖 7 顯示 BsrDI-HF 和 BsrDI-WT 對 pBR322 的比較。BsrDI-HF 的 FI 在 NEB4 中至少為1，000，而BsrDI-WT的FI為1/2，提供至少2，000的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。圖8 顯示在 NEB4 中 BclI-HF 和 BclI-WT 對 λ (danT)的比較。BclI-HF 的 FI 為至少2，000，而BclI-WT的FI為32，提供至少64的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。圖 9 顯示 BglII-HF 和 BglII-WT 對 pXba 的比較。BglII-HF 的 FI 為至少 32，000，而BglII-WT的FI為16，提供至少2，OOO的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。圖 10 顯示 BstEII-HF 和 BstEII-WT 對 λ DNA 的比較。BstEII-HF 的 FI 為至少2，000，而BstEII-WT的FI為4，提供至少500的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。
圖11顯示SfiI-HF和SfiI-WT對pBC4的比較。SfiI-HF在NEB4中的FI為至少8，000，而SfiI-WT的FI為64，提供至少120的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。圖 12 顯示 SmaI-HF 和 SmaI-WT 對 pXba 的比較。SmaI-HF 的 FI 為至少 256，000，而SmaI-WT的FI為64，提供至少4，000的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。圖 13 顯示 BsmBI-HF 和 BsmBI-WT 對 λ DNA 的比較。BsmBI-HF 的 FI 在 ΝΕΒ4 中為250，而BsmBI-WT的FI為4，提供至少64的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。 圖 14 顯示 BstNI-HF 和 BstNI-WT 對 pBR322 的比較。BstNI-HF 在 NEB4 中的 FI 為500，而BstNI-WT的FI為4，提供至少120的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。圖15顯示MluI-HF和MluI-WT對λ DNA的比較。MluI-HF在ΝΕΒ4中的FI為至少32，000，而MluI-WT的FI為32，提供至少1，000的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。圖 16 顯示 NspI-HF 和 NspI-WT 對 pUC19 的比較。NspI-HF 在 ΝΕΒ4 中的 FI 為 500，而NspI-WT的FI為32，提供至少16的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。圖 17 顯示 BsrFI-HF 和 BsrFI-WT 對 pBR322 的比較。BsrFI-HF 在 NEB4 中的 FI 為至少500，而BsrFI-WT的FI為16，提供至少32的改進因子。右邊的圖是理論消化圖式。實施方式的詳細描述對單ー序列具有提高的特異性的限制性內切核酸酶突變體的產生並不一帆風順。遇到了許多問題。這些問題包括以下突變酶具有降低的活性或沒有活性，不具有降低的星號活性或實際上具有提高的星號活性。可選地，突變酶不能被克隆，因此不能被分析。不能產生突變體是由各種可能的原因中的任意ー種原因引起的，包括以下任意一種。這可能是由於失敗的反向PCR。也有可能產生新比活的突變對宿主細胞有毒性，即使它在對於非突變限制性內切核酸酶的表達通常是保護性的條件下表達相關的甲基化酶。在這些情況下，不能獲得可存活的突變克隆。可選地，突變體可能偏愛特定的緩衝液，因此當在另ー緩衝液中被測試時，不能檢測到活性。遇到的另ー困難是儘管每一次突變的粗溶解產物(Iyzate)通常被檢測，但在一些情況中，酶需要被純化以檢測活性，當在溶解產物中沒有檢測到活性時，將分析記分為負值。在若干實例中令人驚奇地注意到，脯氨酸向丙氨酸的變化產生這樣的變體，其具有至少大於250的期望的FI並產生至少兩倍的改進因子。這在PvuI、BamHI、NruI和SpeI的變體中示例。產生高保真性突變體的其它挑戰包括編碼某些限制性內切核酸酶的DNA的大小。假設模板的大小大，則該DNA會難以通過PCR進行擴增。此外，在一些情況下，PCR產物並不容易轉化到新的宿主中。即使宿主細胞轉化是成功的，但轉化的細胞不總是產生菌落，因此不容易被檢測到。在一些情況下，即使通過轉化獲得了菌落，它們也不能在任何條件下被培養。突變體的比活性降低的原因可能緣於以下任何ー種突變幹擾蛋白質的摺疊，這大大降低表達水平,或突變影響特異性酶的活性。例如，這對StyI 突變體N34A、F35A、D58A、F65A、K66A、K67A、F100A、N148A、E213A、F250A、T251A、D258A、D262A、N283A、R293A、F294A、R295A、R296A、D298A、D299A、M304A、M3IOA、D318A、S337A、S346A 和 F371A 被觀察到。酶活性的喪失可能是由於包括以下任何ー種的原因引起的突變缺失了在催化作用中重要的殘基；或突變改變在摺疊中重要的殘基，因此錯摺疊的突變蛋白質失活。例如，這對StyI 突變體M33A、D37A、F41A、D55A、D71A、N77A、R79A、E80A、F81A、T82A、E83A、F97A、F101A、E136A、W137A、M138A、M140A、K144A、Q145A、R151A、R255A、R259A、S261A、T264A、F278A、R281A、T284A、M297A、H305A、N306A、D314A、D338A 和 E382A 被觀察到。產生高保真性突變體要求辛苦的工作。選擇和測試多個突變體,並且,僅相對少數的突變體顯示高保真性。不可能通過推斷來預測哪一個突變體可能顯示改進的特性。進行識別限制性內切核酸酶的高保真性變體的分析的實例顯示在圖1-17中。所述圖顯示在単一緩衝液中野生型和高保真性變體的結果。所有圖均顯示在凝膠上從左到右 一系列兩倍稀釋之後DNA切割的數量和類型，同時酶的濃度沿著三角形的方向降低。表I詳細說明33種示例性酶的結果。實例中使用的限制性內切核酸酶反應緩衝液(緩衝液1-4)在，例如在NEB目錄(2009/10)中被限定。可以根據使用者的偏愛來選擇其它的緩衝液。分析產生的FI是最高限制酶濃度——不顯示通過與星號活性有關的條帶的存在所確定的明顯星號活性——與在標準NEB緩衝液中在限定的溫度下在50 μ I反應中於I小時內完全消化Iug標準DNA底物的限制酶濃度的比率。在圖6-17中，在圖中設置框以顯示星號活性條帶。在本發明的實施方式中，FI為，例如優選至少250，例如大於500，例如大於1000，例如大於5000。保真性改進值被計算為變體的FI除以非突變型酶的FI的比。在本發明的實施方式中，改進值為，例如優選至少2，例如至少4，例如至少8，例如至少16。在一個實施方式中，FI是指不顯示明顯的星號活性的最高限制酶的量與在標準NEB緩衝液中在特定溫度下在50 μ I反應中於I小時內完全消化I μ g標準DNA底物的量的比率。表I :HF酶的特性概括
權利要求
1.確定限制性內切核酸酶及其變體的保真性指數(FI)的方法，包括 選擇反應緩衝液和含有所述限制性內切核酸酶的結合和切割位點的DNA底物； 允許連續稀釋的限制性內切核酸酶或其變體切割所述DNA底物；和 測定所述限制性內切核酸酶及ー種或多種其變體中每ー個的FI。
2.權利要求I所述的方法，還包括比較所述限制性內切核酸酶及所述其變體的FI，以獲得所述變體的改進因子。
3.權利要求2所述的方法，其中，所述改進因子大於2。
4.權利要求I所述的方法，其中，所述反應緩衝液包含醋酸鉀、三羥甲基氨基甲烷醋酸鹽和醋酸鎂；或氯化鎂。
5.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. I的酶，其中，一個或多個突變的位置選自S36、K77、P154、E163、Y165和K185。
6.權利要求5所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
7.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 2的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K198和Q148。
8.權利要求7所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
9.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 3的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 S15、H20、E34、M58、Q95、R106、K108、T181、R187 和 R199。
10.權利要求9所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
11.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 4的酶，其中，一個或多個突變的位置選自D16、D148和E132。
12.權利要求11所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
13.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 5的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K75、N146和D256。
14.權利要求13所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
15.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 6的酶，其中，一個或多個突變的位置選自E198和D200。
16.權利要求15所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
17.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 7的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K229、E025、R034和Q261。
18.權利要求17所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
19.組合物，其包括包含其中突變位置是K225的SEQID No. 8的酶。
20.權利要求19所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
21.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 9的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 H137、D177、K363、K408、R411、Q215、Q226 和 Q230。
22.權利要求21所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
23.組合物，其包括包含其中突變位置是F376的SEQID No. 10的酶。
24.權利要求23所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
25.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 11的酶，其中，一個或多個突變的位置選自R78、T140、E152、R199和F217。
26.權利要求25所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
27.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 12的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 G26、P105、T195、Q210、Y147、Y193、K114、T197、S245、D252和 Y027。
28.權利要求27所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
29.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 13的酶，其中，一個或多個突變的位置選自H10、N208、K48、K74、R75、Y56、K58和Μ117。
30.權利要求29所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
31.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 14的酶，其中，一個或多個突變的位置選自Κ014、Q069、Ε099、R105、R117、G135和Υ035。
32.權利要求31所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
33.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 15的酶，其中，一個或多個突變的位置選自N106、Q169、E314和R126。
34.權利要求33所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
35.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 16的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 T20、P52、Y67、K68、R75、E86、Q90、S91、Q93、H121 和 G172。
36.權利要求35所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
37.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 17的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 E059、P065、S108、N172、K174、Q179、G182 和 Y055。
38.權利要求37所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
39.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 18的酶，其中，一個或多個突變的位置選自N212和L213。
40.權利要求39所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
41.組合物，其包括包含在位置N65處具有突變的SEQID No. 19的酶。
42.權利要求41所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
43.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 20的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 E007、D011、E049、R073、R114、G137、S210 和 R213。
44.權利要求43所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
45.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 21的酶，其中，一個或多個突變的位置選自P079、E086、H096和E218。
46.權利要求45所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
47.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 22的酶，其中，一個或多個突變的位置選自E32、S081、G132、F60和S61。
48.權利要求47所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
49.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 23的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 G013、G016、K018、P052、R053、K070、E071、D072、G073、S84、E086、R090、K094、R095、P099、P103、K113、N135、S151、P157、G173、T204、S206、K207、E233、N235、E237、S238、D241、K295、S301 和 S302。
50.權利要求49所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
51.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 24的酶，其中，一個或多個突變的位置選自S64、S80、S162、T77/T96和N178。
52.權利要求51所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
53.組合物，其包括包含其中位置R232被突變的SEQID No. 25的酶。
54.權利要求53所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
55.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 26的酶，其中，一個或多個突變的位置選自S50、Y81、N93和W207。
56.權利要求55所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
57.組合物，其包括包含在G26處具有突變的SEQID No. 27的酶。
58.權利要求57所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
59.組合物，其包括包含在E112/ R132處具有突變的SEQ ID No. 28的酶。
60.權利要求59所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
61.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 29的酶，其中，一個或多個突變的位置選自 N016、S33、P36、H76、P87、N89、R90、T138、K141、K143、Q221、Q224、N253、Q292、R296、T152、G326 和 T324。
62.權利要求61所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
63.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 30的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K024、P214、E146、N251和Y095。
64.權利要求63所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
65.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 31的酶，其中，一個或多個突變的位置選自G075、Q099、G155、P022和R90。
66.權利要求65所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
67.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 32的酶，其中，一個或多個突變的位置選自S097和E125。
68.權利要求67所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
69.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 33的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K021、I031和Τ120。
70.權利要求69所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
71.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 34的酶，其中，一個或多個突變的位置選自K7、T10、N11、N14、Q232和T199。
72.權利要求71所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
73.組合物，其包括包含其中一個或多個胺基酸已經被突變的SEQID No. 35的酶，其中，一個或多個突變的位置選自P92、P144、G197和M198。
74.權利要求73所述的組合物，其中，所述突變的酶在預定緩衝液中的FI大於在所述預定緩衝液中沒有所述突變的酶。
全文摘要
提供用於工程化改造具有降低的星號活性的突變酶的方法和組合物，其中，所述突變酶在特定緩衝液中的保真性指數(FI)大於非突變酶在相同緩衝液中的FI。
文檔編號C12N9/22GK102834510SQ201180017016
公開日2012年12月19日 申請日期2011年2月7日 優先權日2010年2月5日
發明者朱振宇, A·昆比, 管勝昔, 孫大鵬, 黃益澍, 賴煦卉, 陳少康, 李向暉, 徐雙勇, 張春花 申請人:新英格蘭生物實驗室公司