組織纖溶酶原激活物(tPA)的純化的製作方法

2023-06-06 01:02:26 2

專利名稱：組織纖溶酶原激活物(tPA)的純化的製作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質純化領域，尤其涉及的是用於組織纖溶酶原激活物(tPA)純化的親和配體的發現及分離。
背景技術：
人組織纖溶酶原激活物或稱tPA是一種由內皮細胞產生的對包含在血的凝聚體(即血塊或血栓)中的血纖蛋白具有高親和性的蛋白酶。tPA也用於激活並將纖溶酶原(一種無活性的蛋白酶原)轉化成纖溶酶(一種溶栓酶)。由於tPA可與血栓中的血纖蛋白結合併激活纖溶酶原從而溶解血塊，因此，tPA成為用作溶栓酶)。由於tPA可與血柱中的血纖蛋白結合併激活纖溶酶原從而溶解血塊，因此，tPA成為用作溶栓劑的重要藥物。
儘管tPA已作為治療血栓的主導藥物，但其它有效的溶栓劑如鏈激酶、尿激酶仍有競爭性，因為它們雖然療效較低但費用卻低得多。為使tPA保持為最對症處方的溶栓劑或可分發給更多患者，只有探尋一條途徑使tPA的生產更為高效或費用更低。
在tPA的生產中，從生產原料流中消除雜質如細胞碎片、病原體，非人蛋白質等的有效方法也是非常重要的，這是因為任何蛋白質產物最終都是給予人類患者。
這樣，在更高效及更經濟的基礎上，需進一步探求用於tPA分離的試劑、物質及技術。
親和層析是一種可獲得顯著一步增高純度的非常有效的方法。如Narayanan(1994)報導了通過一步親和層析使純度提高了3000倍。
但親和層析不是在大規模生物分子生產中所通用的技術。理想的親和層析配體必須是在適當的費用基礎上(1)可以高親和性、高容量、高特異性及高選擇性捕捉靶生物分子；(2)不捕獲其它分子(雜質)或可使其它分子(雜質)差異洗脫；(3)在保護靶分子(即不降解或不變性)的條件下使靶分子控釋；(4)可清潔和重複使用層析基質；(5)可消除或使一些病原體滅活。但發現要提供能在藥物生產中耐受所要求的清潔及環境衛生的適當費用的高親和性配體很困難(參見Knight,1990)。
鼠單克隆抗體(MAb)已被有效地用作親和性配體。但另一方面單克隆抗體生產費用很高，且易於在與生物分子純化相關的清潔及消毒過程中濾掉及降解，導致基於MAbs的親和性基質很快失去活性(見Naraganan,1994；Boschetti,1994)。另外儘管MAbs對靶分子有高特異性，但該特異性通常不能有效地防止與靶分子密切相關的雜質的捕獲。此外，MAb的結合特性可通過免疫動物的免疫球蛋白的所有組成成分來檢測，且因此業者必須滿足於由動物免疫系統所供的結合特性，即只使用MAb技術優化或選擇特定結合或洗脫特性的機會很小。最終，每個MAb的結合位點(25Kda～75Kda)甚至MAb片段的分子量非常高。
至今為止，還沒有適於tPA純化的接近上述理想的親和配體特性的已知親和配體。這種親和配體不僅要與靶tPA分子具有高親和性，也要在所需或選擇的條件下釋放tPA，並能在tPA存在的溶液中將tPA與其它組分區分出，和/或能耐受清潔及消毒過程以提供可再生的再利用的層析基質。
本文提供了如此的親和性配體及其獲得方法。
發明概述本發明提供了呈所需或所選擇的結合特性及釋放特性的tPA親和配體的獲得方法。本發明的親和配體不僅具有親和分離tPA的有利的結合特性，也具有所需的釋放(洗脫)特性及其它所需特性如穩定性、耐降解性、持續性、再利用性及易於生產。
本發明的tPA親和配體最初可從肽文庫如噬菌體展示文庫經以下方法鑑定(a)選擇第一種溶液條件(即結合條件)，在此條件親和配體可與tPA結合；(b)選擇第二種溶液條件(即釋放條件)，在此條件tPA與親和配體的親和複合物將解離，其中第二種溶液條件不同於第一種溶液條件；(c)提供一候選結合功能域的類似物文庫，其中每個類似物與所述候選結合功能域不同之處在於功能域內一個或多個胺基酸位置的胺基酸序列的改變；(d)將所述類似物文庫與tPA在第一溶液條件下接觸足夠時間以使類似物/tPA結合複合物形成；(e)除去在第一種溶液條件下未與tPA結合的類似物；(f)將接觸步驟(e)的溶液條件轉變成第二種溶液條件；(g)在第二種溶液條件下回收釋放的候選結合類似物，其中回收的類似物即為分離的親和配體。
在此一般程序之後，一些tPA的多肽親和配體被分離，詳見下述。
附圖簡述

圖1示出組織纖溶酶原激活物(25μl 1mg/ml tPA)的層析譜，其是在具有固定化tPA親和配體的親和層析柱中，(CMTI衍生物109#，見實施例1所述)，以pH3～7梯度洗脫。在第15分鐘的峰估計含有大約90％的注射的tPA。
圖2示出Coagulation Standard(稀釋10倍)在tPA親和層析柱(CMTI衍生物109#)經上述洗脫的層析譜。在第15.6分鐘的小峰是梯度假象。
圖3示出由25μl Coagulation Standard(稀釋10倍)與25μltPA組成的混合物經pH7～pH3梯度洗脫的層析譜。在第1分鐘的峰是血漿蛋白質的收集物，在第15.4分鐘的峰是tPA。
圖4示出與圖3所示相同的但垂直刻度放大的層析譜。
優選實施方案詳述本發明通過親和層析使tPA的高效純化成為可能。
可通過各種已知方式生產tPA，包括化學合成；在轉化的宿主細胞中生產；經天然發生的或重組轉化的細菌、酵母、真菌、昆蟲細胞及哺乳動物細胞分泌入培養基中；分泌自基因工程生物體(如轉基因哺乳動物)；或在體液或組織如尿、血、乳汁等中。含有最初產生的粗製tPA的溶液有時被稱為「原料流」(feed stream)。
每種生產tPA的方法可產生在原料流中的tPA，另外還含有一些雜質(就tPA而言)。本發明一個目的是生產親和配體及包括此配體的製備物(如層析介質)，以使tPA從任何原料流中快速而高特異性純化。在本文中所得的tPA親和配體能在特異性預選條件下將tPA從特定原料流中分離。如果使用tPA的另一種生產方法產生一不同的原料流，就需一套不同的親和配體以達到相同純化水平。通過以下步驟可輕易得到新的一套配體。
本發明的tPA親和配體高親和性地與tPA結合，基本上排除了原料流中任何其它分子。另外當溶液條件改變時親和配體可釋放完全活性的tPA。
選擇結合及釋放條件為分離tPA的新配體，要選擇兩種溶液條件，即結合條件和釋放條件。結合條件是在此條件之下所發現的親和配體將與靶tPA結合的溶液條件；釋放條件是在此條件之下所發現的親和配體不與tPA結合的溶液條件。選擇的兩種條件要符合業者的標準，如條件易於達到，與其它純化步驟相容，與其它親和介質相比在兩種條件之下轉換費用較低等。優選的兩種溶液條件是(a)在tPA穩定曲線邊界內(b)針對至少一種溶液參數是極不相關的。例如，如果在寬範圍pH值內是穩定的，則適當的結合條件可以是pH7.5,150mM鹽，25℃，適當的釋放條件可以是pH3,150mM鹽，25℃。對於pH穩定範圍窄但在寬範圍鹽度可以穩定的一種不同的tPA形式，則兩種有效的條件是，結合條件為pH7.2,3M NaCl,25℃，釋放條件為pH7.2，2mMNaCl,25℃。
候選結合功能域的篩選與為tPA所需的結合與釋放而選擇的特異溶液條件相結合，要選擇一候選結合功能域作為呈現所要求的結合與釋放能力的工程化親和配體的結構模板。結合功能域可以是天然發生的或合成的蛋白質，或蛋白質的一個區域或一個功能域。候選結合功能域可基於候選結合功能域與tPA相互作用的已知知識進行篩選，但這不是關鍵。事實上，不需候選結合功能域對tPA有親和性。目的是要提供一結構，從中可產生多個類似物(文庫)，多個類似物包括一種或多種具有所需結合及釋放性質(及所選的任何其它性質)的類似物。這樣，前述的結合及釋放條件可用作為候選結合功能域的正確多肽的知識，或用候選結合功能域所屬的一類蛋白質或功能域的知識，或完全獨立於選擇候選結合功能域進行選擇。相似地，結合和/或釋放條件的選擇可用已知結合功能域與tPA之間相互作用的知識來進行，如在一種或二種溶液條件下利於其間的相互作用，或不用如此已知的相互作用的知識來選擇。兩樣，候選結合功能域的選擇可以考慮或也可以不考慮結合和/或釋放條件，但必須了解如果結合功能域類似物在結合或釋放條件下不穩定就會得到無用的親和配體。
在選擇候選結合功能域時，目的是要提供一模板或親本結構，從中可產生相似結構的類似物功能域文庫。該類似物文庫優選是偏性文庫(相對於隨機產生的文庫)，其中產生文庫的基本功能域要進行花斑化(Variegation)以利於所需親和配體的性質。
候選結合功能域的性質明顯影響進行針對tPA分子測試的衍生蛋白質(類似物)的性質。在選擇候選結合功能域中，最重要的考慮是怎樣將類似功能域呈遞給tPA，即在什麼構象中將與類似物接觸。在優選的實施方案中，例如經採用併入本文作參考的例如U.S.5,403,484(Ladner等)及U.S.5,223,409(Ladner等)所述技術，通過將編碼類似物的合成DNA插入可複製的基因包裝中，導致該功能域在微生物如M13噬菌體表面展示從而產生類似物。
構建的多肽比未構建的肽呈現出更多的作為候選結合功能域的優勢。蛋白質中表面殘基的突變通常對蛋白質的整體結構或一般性質(如大小穩定性、變性溫度)僅有輕微影響；而同時表面殘基的突變可以極度影響蛋白質的結合性質。這已經充分證實，如BPTI-同源Kunitz區(見Lodner 1995)。蛋白質或構建功能域的表面殘基的突變可導致類似物與未構建肽突變相比有較大的性質多樣性，這是由於蛋白質構架或功能域的結構使突變殘基的構象隨殘基不同而不同，隨構架不同而不同。這對疏水側鏈基團非常重要，除非其約束在結構中否則會變成隱蔽殘基。肽區段(功能域)約束越緊，其與任何特定靶分子結合的可能性越小。但如果結合，則結合會更緊密及更特異。因此，優選選擇這樣的候選結構功能域及肽類似物的結構，其被限制在具有一些剛度的構架中。或者選擇一個以上的候選結合功能域，以增加類似物文庫的大小並提供另外的多樣結構以呈遞給tPA。由於文庫大小增加了，並製備更多的多樣結構的類似物，包括有用的構架並顯示官能團的可能性增加至這樣一種程度，即可發現高親和性配體以用於從任何原料流中分離tPA。
候選結合功能域的大小也是一重要考慮。小蛋白質或多肽比大蛋白質如單克隆抗體有幾種優勢(見Ladner,1995)。首先，降低了每個結合位點的質量。具有低分子量的高穩定蛋白質功能域，如Kunitz區(～7Kda),Kazal區(～7Kda),Cucurbida maxima胰蛋白酶抑制因子(CMTI)區(～3.5KDa)及內皮肽(～2KDa)比抗體(150Kda)或單鏈抗體(30KDa)呈現更高的每克結合力。
其次，降低了非特異性結合的可能性，這是由於提供的表面較小。
第三，小蛋白質或多肽可被工程化以具有抗體不適用的唯一的限制(tethering)位點。例如小蛋白質可被工程化成只在適於限制的位點(如至層析基質)有賴氨酸，但這不適宜於抗體。通常發現，固定化抗體只有小部分是活性的，可能是由於與載體的非恰當結合所致。
多數由二硫鍵穩定的小蛋白質或多肽不含未被包含於二硫鍵中的半胱氨酸。這是由於使二硫鍵形成以用於穩定蛋白質的氧化條件也使其它未成對的半胱氨酸形成二硫鍵。這樣，具有穩定的二硫鍵及奇數半胱氨酸的小蛋白質趨於形成二硫鍵鍵合的二聚體(如同源二聚體或異源二聚體)。功能域間的二硫鍵比穩定的功能域內的二硫鍵更易於還原。這樣經選擇性還原可得有單游離巰基的單體二硫鍵穩定的功能域。該疏基可被用於經用磺乙醯胺、碘乙酸或類似的α-碘羧酸基團形成硫醚而高穩定地固定這些功能域。
小蛋白質或多肽功能域也可經化學合成，其使特異固定化基團以不幹擾與tPA的結合的方式摻入。例如如果含有二硫鍵的小蛋白質是化學合成的，胺基酸序列可經加入另外的半胱氨酸殘基加以改變，從而以與序列中的其它半胱氨酸不同的方式阻斷疏基。選擇的疏基可被去阻斷並可形成二硫鍵，然後加入的半胱氨酸可被去阻斷，且該分子可經與適當物質如含固定化的NH2-CO-CH2I的底物反應而被固定化。
第四，限制的多肽結構當與完整結構功能域從一框架轉移至另一框架時，更易保持其官能性。例如結合功能域結構易於從文庫中用於呈遞的框架(如展示於噬菌體上)轉移至從呈遞框架脫離的分離蛋白質或固定於層析基質上。
有許多小的穩定蛋白質功能域適於用作候選結合功能域，為此以下實用信息是已知的①胺基酸序列，②一些同源功能域序列，③3一維結構，④在一定範圍的pH、溫度、鹽度、有機溶劑、氧化劑濃度的穩定性數據。一些例子為Kunitz功能域(58個胺基酸，3個二硫鍵)，Cucurbida maxima胰蛋白酶抑制因子功能域(31個胺基酸，3個二硫鍵)，與鳥苷蛋白相關的功能域(14個胺基酸，2個二硫鍵)，與來自革蘭氏陰性細菌的熱穩定腸毒素IA相關的功能域(18個胺基酸，3個二硫鍵)，EGF功能域(50個胺基酸，3個二硫鍵)，Kringle功能域(60個胺基酸，3個二硫鍵)，真菌糖結合功能域(35個胺基酸，2個二硫鍵)內皮肽功能域(18個胺基酸，2個二硫鍵)，及鏈球菌G IgG-結合功能域(35個胺基酸，無二硫鍵)。大多數但不是所有這些功能域都包含可固定及穩定結構的二硫鍵。基於每個這些功能域的文庫，優選在噬菌體或其它遺傳包裝物上展示，可容易地構建並用於篩選結合類似物。
提供候選結合功能域類似物的文庫一旦篩選出候選結合功能域，則創建潛在親和配體文庫，以用於在結合及洗脫(釋放)條件下針對tPA進行篩選。該文庫可通過制出一系列類似物而產生，每個類似物除在功能域序列含有一個或多個胺基酸取代之外相應於候選結合功能域。胺基酸取代要求在不明顯改變功能域結構條件下改變功能域的結合特性，至少是對大多數胺基酸取代而言是如此。優選的是為變化而選擇的胺基酸位置(可變的胺基酸位置)是表面胺基酸位置，即在功能域的胺基酸序列中的位置是當功能域在其最穩定構型時在功能域的外表面(即暴露於溶液的表面)出現的位置。最優選的是待變化的胺基酸位置是相鄰的或互相靠近的，如此以增大取代的效用。另外，可將額外的胺基酸加入候選結合功能域的結構中。在優選的實施方案中，尤其當已知許多關於tPA與其它分子的相互作用尤其是與候選結合功能域的相互作用的信息時，可確定那些是結合相互作用所必需的胺基酸位置，並在建立類似物文庫的過程中保守(即為結合所必需的胺基酸不變化)。
產生類似物文庫的目的是提供大量與tPA分子反應的潛在親和配體，且通常在文庫中類似物越多，文庫的成員與tPA結合併在釋放所需的預選條件下釋放的可能性越大。另一方面只在胺基酸序列中6個位置的隨機取代就可提供6千萬個以上類似物，這是甚至當利用如噬菌體展示一樣強力的篩選技術時也開始出現實用限制的文庫規格。因此優選是產生一偏性文庫，其中考慮為變化而指定的胺基酸位置以使對類似物結合特性的取代功效最大化，且允許或計劃用於取代的胺基酸殘基限於那些易於使類似物對從結合條件變為釋放條件的溶液條件變化應答的胺基酸殘基。
如前所述，U.S.5,223,409中所述的技術尤其可用於製備相應於所選擇的候選結合功能域的類似物文庫，該類似物將以適於大規模篩選大量與靶tPA分子相關的類似物的形式存在。使用可複製的遺傳包裝，最優選的是噬菌體展示是一種產生新多肽結合體的有效方法，其包括將一種新DNA區段插入噬菌體(或其它可擴增的遺傳包裝)的基因組中，如此由該新DNA編碼的多肽在噬菌體表面展示。當新DNA含有序列多樣性時，每個受體噬菌體則展示由該DNA編碼的原始(或「親代」)胺基酸序列的一種變體，且噬菌體群(文庫)展示出大量不同的但相關的胺基酸序列。
將噬菌體文庫與tPA分子接觸並允許與之結合，並將非結合者從結合者中分出。以各種方式將結合噬菌體從tPA中釋出並擴增。由於噬菌體可經感染細菌細胞而擴增，所以只有少量結合噬菌體也可有效地展示編碼結合體的基因序列。使用這些技術可回收大約是文庫2千萬分之一的結合噬菌體。每種可展示1～2千萬或更多個潛在結合多肽的一種或多種文庫可被快速篩選以發現高親和性tPA配體。當進行選擇程序時，經過每一輪後文庫的多樣性會降低，直至只有良好結合者保留下來，即過程趨同。典型地，一個噬菌體展示文庫將含有一些緊密相關的結合者(1千萬之中有10～50個結合者)。趨同的指示包括增加的結合(由噬菌體滴度測定)及密切相關序列的回收。在第一套結合多肽鑑定之後，該序列信息可用於設計偏向於具有另外所需性質成員的其它文庫，所需性質如tPA與特定片段間的區別性。
該技術不僅使篩選大量類似物成為可能，而且使得實際操作上可重複結合/洗脫循環並建立為篩選滿足最初規則的類似物展示包裝的次級偏性文庫。這樣本發明實施時最優選的是(1)製備結合功能域類似物文庫以在可複製的遺傳包裝和如噬菌體上展示；(2)篩選文庫以選擇與tPA結合的遺傳包裝，其中篩選程序的結合條件與預選的親和配體所需的結合條件相同；(3)遺傳包裝可經在預選的親和配體所需的釋放條件下洗脫而獲得並繁殖；(4)其它的遺傳包裝可經在高裂解條件(如pH為2或更低，8M尿素，或飽和硫氰酸胍以克服某些所展示的結合功能域類似物與靶tPA間過分的高親和性)下洗脫而獲得並繁殖；(5)由(3)或(4)得到的增殖的遺傳包裝分別或組合地進行步驟(2)和(3)或(4)的循環，進行一次或多次循環；(6)確定回收自該循環的遺傳包裝中表達的類似物關於高親和結合物的共有序列；(7)基於最初框架(候選結合功能域)構建另外的偏性文庫，並使高親和共有序列位於每個可變的胺基酸位置上，且另外使選擇的其它胺基酸類型包括據信對結合條件與釋放條件間的變化特別敏感的胺基酸；(8)篩選該偏性文庫的如下成員(a)在結合條件下牢固結合(即高親和性)和(b)在釋放條件下完全釋放(即易於從tPA靶中解離)。
親和配體在層析中的應用在分離出在結合條件下以所需親和性與tPA結合併在釋放條件下從tPA中釋放出的一個或多個文庫成員之後，親和配體的分離可以已知方式完成。如果例如類似物文庫由在噬菌體上表達的預期的親和配體組成，則可以將釋放的噬菌體回收，增殖，分離及擴增編碼類似物的合成DNA插入物。分析DNA序列並製備所需數量的配體，如經直接合成多肽或由分離的DNA或等價編碼序列重組表達。
其它為配體所需的性質可以如上述相似步驟以將釋放性質工程化入配體中相同方式被工程化入類似物配體中。
這樣分離的親和配體對於經親和層析方法分離tPA非常有用。可使用任何常規的層析方法。優選地，本發明的親和配體被固定於例如適於填充層析柱的固體載體上。固定化的親和配體可在適於配體/tPA複合物形成的條件下上樣原料流或與原料流接觸，洗脫未結合物質，然後在適於tPA分子從配體/tPA複合物中釋放的條件下洗脫tPA。或者，可在反應容器中加入原料流及適當標記的親和配體進行批量(bulk)層析，然後使用標記物(如聚His親和標記，其可用於在複合物形成後與配體結合)分離tPA與配體的複合物，最後在未結合物已被消除後將tPA從複合物中釋放出。
需指出的是儘管精確結合及釋放性質被工程化入親和配體中，但隨後用於親和純化時可揭示相同的分離的親和配體所適用的更優化的結合及釋放條件，因此，依據本發明分離後，親和配體不必僅在導致其從文庫中分離出的結合和釋放條件下應用。
最後，需記住的是最高親和性的配體不必是tPA分子的受控或節約回收所最優的。本發明的方法使得選擇的配體具有將tPA從特定原料流中分離出的業者所尋求的一系列重要的所需特性，如tPA的特異結合及tPA的可預期和受控的完全釋放，有用的荷載容量，可接受的完全洗脫，再使用/再循環性等。
根據本發明的親和配體的分離將在以下進一步闡述。以下實施例中所包括的特異參數是為詳細闡述本發明，並無限制本發明範圍之意。
實施例1使用上述技術以分離重組人組織纖溶酶原激活物(tPA)的配體。產生tPA親和配體的方法包括三個通常步驟(1)篩選與tPA結合的穩定的親代蛋白質功能域的大約1千1百萬個變體，(2)產生少量的最相應的配體，(3)層析測試一種與活性珠結合的配體以從血漿摻加樣品中親和純化tPA。
為此，從CalBiochem購tPA(#612200)並用如Markland等(1996)所述方法將其固定在得自Pierce Chemical Company的Reacti-GelTM瓊脂糖珠上。將大約200μg的tPA與200μl Readi-GelTM漿液偶聯。
挑取噬菌體展示的蛋白質的四個文庫用於篩選過程。三個是基於脂蛋白相關促凝劑抑制物的第一個Kunitz功能域(LACI-K1)，稱為Lib#1,Lib#3和Lib#5，另一個基於Cucurbida maxima胰蛋白酶抑制物I(CMTI-I)。CMTI-I是一種發現於南瓜種子中的蛋白質，並能耐受內臟的酸度及水解蛋白質的條件。這些蛋白質每種都具有三個二硫橋，使其具有高受限性及穩定性。這些蛋白質家庭成員已呈現出具有優異的熱穩定性(780℃也未失活性)，優異的pH穩定性(在pH2,37℃溫育一夜，或在pH12,37℃1小時也不失活性)，優異的氧化穩定性。每個文庫中潛在胺基酸序列數見下表1所示表1用於tPA篩選的噬菌體展示文庫群
>本工作中針對tPA篩選的展示文庫的總多樣性估計大約有1千1百萬。Kunitz功能域和CMTI功能域可經其表面其它部分的改變而顯示更高的多樣性。
應用了二種篩選方案「慢篩選」及「快篩選」。在慢篩選中，取自每輪的噬菌體在下一輪之前在E.coli中擴增。在快篩選中，在上一輪中從tPA回收的噬菌體不經擴增投入下一輪。在快篩選中噬菌體的投入和回收數在幾輪後快速降低。在慢篩選中可以保持投入水平的恆定。慢篩選中恆定的投入使每輪間可進行對比以表示是否選擇到或未選到，但快篩選每輪間的對比難以說明問題。快篩選增加了選擇噬菌體的結合性而不是其它不相關性質(如感染性及生長率)的可能性。
與tPA結合的所述噬菌體文庫要經四輪篩選。第一輪，將噬菌體文庫混入並與tPA瓊脂糖珠在pH7磷酸鹽緩衝的鹽水(PBS)中反應。加入0.1％牛血清白蛋白(BSA)以降低非特異性結合。在pH7洗掉未結合的噬菌體，並在pH2洗脫結合噬菌體進行初次篩選。隨後的三次快篩選具有不同的洗脫方案，並使用第一次篩選的集合產物。集合體A由CMTI及Lib#1文庫的組合產物組成，集合體B由Lib#3及Lib#5文庫的組合產物組成。集合文庫的結合在pH7進行，但除去結合噬菌體的第一次洗脫在pH5進行，隨後的洗脫在pH2進行以洗脫在pH5～pH2範圍內釋放的噬菌體。這種總數為4輪的篩選重複進行2次以上。
篩選的最後三輪中噬菌體的滴度見下表2所示。一輪的產物投入下一輪中。
表2篩選前及針對tPA篩選文庫最後三輪後噬菌體滴度
由噬菌體滴度可顯示集合體A是趨同的並含有強結合物，而集合體B既未明顯趨同也無強結合物。
從每集合體的第三輪快篩選選擇物中擇出40個噬菌體克隆以進一步分析，20個擇自pH5集合體，20個擇自pH2集合體。用PCR擴增噬菌體DNA以檢測CMTI-或LACI-衍生的基因片段是否存在。
CMTI衍生的構建物在來自集合體A快篩選的40個噬菌體分離物中的38個中發現。其餘的分離物未產生PCR產物；表明是缺失的。從集合體B快篩選分離出的40個噬菌體分離物中只有10個噬菌體分離物含有合適的構建體，表明搜索沒有成功。
特定的噬菌體展示的蛋白質具有對tPA分子的高親和性的一個標誌是其被重複發現。在pH2釋放的18個CMTI衍生的噬菌體分離物中一個序列被發現5次，第二個序列被發現4次，剩下的序列中的二個序列被發現3次。這18個序列構成了所選擇的分子密切相關的家族，進一步標誌該搜索成功地趨同。
表3示出所觀測的序列作為允許的變異性及選擇pH值的函數的變異性。CMTI文庫的構建是將組合序列多樣性導入在親代CMTI蛋白質的半胱氨酸3和10之間形成表面暴露的環的密碼子。半胱氨酸由於形成結構的重要部分而是不變的。
這給出9.13×106個蛋白序列和16.8×106個DNA序列表3示出了CMTI文庫的DNA序列。殘基F-5和Y-4相應於M13mp18的信號序列(從中受體噬菌體被工程化)的14和15位殘基。假定信號肽酶(SP-Ⅰ)的裂解發生在A1和R1之間。標為100～113的殘基在CMTI變體與成熟肽Ⅲ之間形成接頭，成熟肽Ⅲ起自殘基A201。胺基酸序列Y104IEGRIV應使得接頭在R108與I109之間被牛Xa因子特異性裂解。M13相關的噬菌體(其中構建了本文庫)攜有一氨苄青黴素抗性基因(ApR)，如此文庫噬菌體感染的細胞具有Ap抗性。在每個可變胺基酸位置，野生型胺基酸殘基以其下劃線示出。示於表3的胺基酸序列標為SEQ ID NO:2，表3示出的核苷酸序列標為SEQ ID NO:3。
得自pH5篩選程序的分離物比pH2篩選物呈較高的序列多樣性(表4)。儘管有較高序列多樣性，pH5篩選物含有一密切相關的蛋白質序列家族。構成在每個位置觀測到的胺基酸型的所有組合僅有13,400(=2×4×3×4×7×5×4)種，只佔原始群體的0.15％。在檢測的20個序列中，有4個序列的發生多於一次，提示其實際多樣性少於13,400。儘管pH5篩出的序列家族與pH2篩出的序列家族顯然相關，但在兩序列群中只有一個序列相同的實例。
在6和7位，大多數(12/15)允許的胺基酸型在pH2篩選物中被排斥。從選擇的序列還不能清楚第6和7位的選定的胺基酸對結合起作用還是僅僅代表在這些位置不可接受的可能性的消除。
選擇過程的有效趨同尤其在2、4、8位的pH2篩選物中最為明顯，儘管其中可發生許多胺基酸類型，但只發現一種胺基酸型。這強有力地表明該特異的胺基酸是結合所必需的。在每一個這些位置中，pH2群的唯一選擇類型也是在pH5群中此位置最常見的類型。如果允許pH2集合體在每個位置具有觀察到的所有的胺基酸類型，則只有36種序列，佔初始群體的0.0004％。有一些序列不止一次地出現，提示pH2集合體中不同序列的數目不超過36個。
表5示出38個測序的CMTI-1類似物的花斑區(1～12胺基酸位置)的胺基酸序列。在未被設計成可變位置(11位)甲硫氨酸殘基的出現表明在文庫的構建中DNA的合成錯誤。
在表5中，具有標為101～120的序列的類似物經pH5洗脫而得，具有221～238序列的類似物經在pH2分級分離而得。
測試噬菌體結合的配體候選物的特異性是通過檢測其對其它固定化蛋白質的親和性而確定。噬菌體結合的蛋白質對與珠結合的相關的人血清蛋白酶纖溶酶及凝血酶無親和性(數據未顯示出)。另外對噬菌體分離物進行試驗以檢測與固定的tPA的相關親和性及從固定的tPA中釋放的特性。
在pH5釋放的噬菌體分離物情況下，大部分噬菌體在pH5釋放，在進一步將pH降至2時釋放的量低一個數量級。這表明合適的親和配體在pH降至5時相對完全釋放。在pH2釋放的分離物情況下，只有#232分離物在pH5真正選擇性結合，隨後在pH2釋放。
配體合成及固定化接下來，使用從噬菌體分離物的DNA確定的序列信息合成游離CMTI衍生的多肽。儘管CMTI衍生物(類似物)已可容易地被化學合成，但決定在酵母中表達多肽。選擇pH5釋放的分離物中的一個，#109(表5,SEQ ID No:12)及pH2釋放的分離物中的一個。#232(表5,SEQ ID No:35)在Pichia pastoris中表達。在第4位和第8位，#109分離物具有見於pH2篩選物中的相同胺基酸類型；在第2位，#109分離物與pH2篩選物不同。
合成適當的基因構建物，並插入Pichia pastoris表達系統中(Vedvick等，1991和Wagner等1992)以產生生產菌珠。每菌株的5升發酵導致高水平表達。預計分泌入發酵液中的蛋白質超過1g/L。將粗的發酵懸液經離心及0.2μ微量過濾澄清。該0.2μ濾液使用具30KDa NMWL截斷值的PTTK盒經超濾純化。從超濾液中用Macro-Prep High S陽離子交換載體(BioRad)進行陽離子交換層析，隨後進行二次反相分離將配體純化。反相分離使用的線性梯度起自含0.1％TFA及增加的乙腈(含0.1％TFA)的水，乙腈在90分鐘時增加至50％。所得蛋白質在5μm反相層析柱中經PDA光譜分析測定其純度高於95％。
根據生產者指導，用固定化的二氨基丙胺(Emphaze UltralinkTM；Pierce Chemical Co.)將配體候選物固定於雙一丙烯醯胺/氮內酯共聚物載體上。將大約30mg CMTI類似物#109與1mL活性層析載體偶聯。
層析柱測試將一Waters AP Minicolumn,5.0cm×0.5cm ID標稱尺寸經加入第二個流動接管(其使層析柱長度降至2.5cm)而修飾。將該柱用#109一Emphaze UltralinkTM珠經推薦方案填充並用系列增加的NaCl濃度在pH7洗柱至以1M洗柱結束。
在第一個測試的#109親和層析柱中，得自CalBiochem的組織型纖溶酶原激活物依生產者的指導而製備以提供1mg/ml的tPA溶液。Coagulation Standard(Coagulation Control Level 1，來自SigmaDiagnostics,Catalog#C-7916)凍幹的人血漿根據生產者的指導而重配，然後稀釋10倍並加入tPA。將此樣品加樣到層析柱上並在1M NaCl存在下的緩衝液中洗脫，這可有效地抑制非特異蛋白質與層析柱結合，且使pH值調控tPA的結合與釋放。有兩個獨立的峰第一個峰含有血漿蛋白質(未在層析柱中保留)；第二個峰是pH值降低後獲得的，含有tPA，不含任何血漿成分。該結果經銀染凝膠證實(未示出)。90％的tPA產物被回收。
用EAH Sepharose 4BTM瓊脂糖珠(Pharmacia；Upsala SE)作為層析載體製備使用#109 CMTI類似物的第二個親和層析柱。在由WatersInc.(Milford,MA)生產的HPLC系統中進行分離。該系統包括一個718型自動進樣器，一個600型帶有可以20ml/分鐘輸送的泵壓頭的溶劑輸送系統，及一個996型光二極體矩陣檢測器。所有的設備都根據生產者的說明書安裝。該系統由Dell Corp提供的Pentium 133IBM-兼容計算機控制。該計算機裝備有gigabyte硬驅，16兆RAM及一彩色監視器，計算機上裝有Water Inc.的Millenium軟體。
用1.2nm解析度收集200nm～300nm範圍內的光譜數據。圖1、2、3、4是在280nm收集的。用於層析研究的流動相是緩衝液A和緩衝液B緩衝液A包括25mM磷酸鉀，50mM精氨酸，及125mMNaCl，用氫氧化鉀緩衝至pH為7；緩衝液B包含50mM磷酸鉀及150mM NaCl，用磷酸緩衝至pH3。在所有情況下，將樣品在100％緩衝液A中注射，隨後用100％緩衝液A從0分鐘洗至2分鐘。在2～8分鐘用100％緩衝液B洗脫。8分鐘之後用100％緩衝液A洗脫。HPLC系統的梯度延遲體積大約為4ml，流速為0.5ml/分。
根據生產者的說明製備來自其它商業來源的tPA以提供1mg/ml的溶液。Coagulation Standard(Coagulation Control Level 1，來自SigmaDiagnostics,Catalog #C-7916)即凍幹的人血漿根據生產者的指導重配。將該溶液稀釋10倍以得到具有是tPA溶液的吸光度的約10倍的吸光度的溶液。
在圖1所示試驗中，純tPA樣品(25μl,1mg/ml tPA)通過含#109 CMTI衍生物的層析柱，並以上述方法洗脫。層析譜示出大約15分鐘後有約90％tPA物質的尖峰洗脫。在圖2所示的試驗中，Coagulation Standard(10倍稀釋液)樣品通過含#109 CMTI衍生物的層析，並如上述洗脫。從層析柱中立即洗脫下幾乎所有物質(沒有殘留)。在圖3、4所示試驗分離中，將含有加入至人血漿標準物中的tPA的樣品上樣至層析柱中並如上述洗脫。如圖3、4所示，tPA保留下來而血漿蛋白質在外水體積中洗脫。在大約15.4分鐘時結合的tPA被釋放。估計tPA在大約pH4時被釋放。收集tPA峰並用銀染的還原SDS-聚丙烯醯胺凝膠檢測，與初始物質對照發現純度＞95％。
實施例2進一步檢測分離自CMTI文庫的tPA親和配體以設計可與tPA結合的其它候選功能域。
如上所述，幾乎所有的用於建立CMTI文庫的胺基酸位置的花斑作用均發生在CMTI-Ⅰ的3位和10位兩個半胱氨酸之間(見表3)。在親代CMTI蛋白質中，這些半胱氨酸與蛋白質中其它位的半胱氨酸殘基(見SEQ ID No:1)形成二硫鍵，但隨著從CMTI文庫成功分離出親和配體，基於#109分離物的截短的15-胺基酸區段(見SEQID No:12的1～15胺基酸)的花斑作用的二級文庫被概念化。如果這些成員的C3和C10半胱氨酸形成二硫鍵，就可得到具有tPA結合性質的約束環。衍生自親和配體#109分離物的15胺基酸區段與層析載體結合的初始研究表明C3-C10環形成且固定化的環與tPA結合。
上述實驗表明了根據本發明分離的tPA親和配體的兩個新家族，包括含下列序列的多肽Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly(SEQ ID No:42)及Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8(SEQ ID No:43)，其中X1是Trp或Leu；X2是Pro,Ser,Thr或Ile；X3是Arg,Lys或Thr；X4是Ser,Tyr,Thr或Ala；X5是Ser,Tyr,Asp,Vla,Pro,Ala,His,Asn或Thr；X6是Leu,Met,Gln,Arg或Lys；X7是Glu,Gly或Arg；X8是Lys或Met。由於未預料到在序列的第11位的Met殘基有利於與tPA的結合，但結果卻有利於與tPA的結合，所以其它胺基酸如非極性胺基酸如Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro或Trp在11位的取代將可能提供其它的tPA結合類似物。
由上所述，對從任何原料流中分離tPA重要的特性可被遺傳工程化入設計的文庫的結合功能域，如此本發明的方法總能產生一些在合適的結合與釋放條件下適於tPA分離的親和配體候選物。根據本發明可以得到未失活或未破壞的、高純度的、甚至密切相關的雜質都被去除的、費用可接受並且物質可再利用或再循環的高tPA產量。經前述研究，本發明的其它實施方案及適於特定tPA形式或原料流的替換方法將是顯而易見的。所有如此實施方案及替換方法都在本發明範圍內，如以下權利要求書所限定。
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序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人戴克斯公司(ⅰ)申請人和發明人約翰·M·麥克林南(ⅰ)申請人和發明人羅伯特·C·萊德納(ⅱ)發明名稱大分子的工程親和配體(ⅲ)序列數48(ⅳ)通訊地址(A)收信人Banner Witcoff,Ltd.
(B)街道75 State Street(C)城市Boston(D)州Massachusetts(E)國家USA(F)ZIP:02109(ⅴ)計算機可讀形式(A)媒介類型3.5英寸軟盤，1.44Mb(B)計算機IBM PC兼容機(C)作業系統MS-DOS(D)軟體Microsoft Word 6.0(ⅵ)本申請資料(A)申請號(B)申請日1997年3月20日(C)分類(ⅶ)在先申請資料(A)申請號08/619,885(B)申請日1996年3月20日(ⅷ)律師/代理人信息(A)姓名Yankwich,Leon R.
(B)註冊號30,237(C)卷號DYX-1 PCT(ⅸ)電訊信息(A)電話617-345-9100(B)傳真617-345-9111(2)SEQ ID NO:1的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:1Arg Val Cys Pro Arg Ile Leu Met Glu Cys Lys Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:2的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度50個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Phe Tyr Ser Gly Ala Arg Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Lys-5 1 5 10Lys Asp Ser Asp Cys Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr15 20 25Cys Gly Ala Gly Pro Ser Tyr Ile Glu Gly Arg Ile Val Gly Ser Ala30 35 40Ala Glu45(2)SEQ ID NO:3的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度150個鹼基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型其它核酸(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:3:TTCTATTCCG GAGCCCGTNN GTGTNNTANA NNTNNTNNGR RGTGTAAGAA50GGATTCTGAT TGCTTAGCAG AATGCGTTTG CCTCGAGCAT GGTTATTGTG 100GCGCCGGTCC TTCATACATT GAAGGTCGTA TTGTCGGTAG CGCCGCTGAA 150(2)SEQ ID NO:4的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:4:Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:5的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:5:Arg Leu Cys Pro Lys Thr Tyr Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:6的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:6:Arg Trp Cys Ser Thr Tyr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:7的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:7:Arg Trp Cys Ser Thr Tyr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:8的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:8:Arg Leu Cys Pro Lys Thr Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:9的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:9:Arg Trp Cys Ser Thr Tyr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:10的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:10:Arg Leu Cys Pro Lys Thr Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:11的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:11:Arg Trp Cys Ser Lys Ser Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:12的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:12:Arg Leu Cys Pro Lys Thr Asp Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly(2)SEQ ID NO:13的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:13:Arg Trp Cys Pro Lys Ser Ser Met Gly Cys Lys Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:14的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEO ID NO:14:Arg Trp Cys Pro Arg Thr Val Gln Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:15的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:15:Arg Trp Cys Pro Thr Ala Pro Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:16的信息
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(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:34:Arg Trp Cys Pro Arg Ser Thr Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:35的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:35:Arg Trp Cys Pro Lys Thr Ser Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:36的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:36:Arg Trp Cys Pro Lys Tyr Thr Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:37的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸
(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:37:Arg Trp Cys Pro Arg Ser Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:38的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:38:Arg Trp Cys Pro Lys Ser Thr Leu Gly Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:39的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:39:Arg Trp Cys Pro Arg Ser Ser Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:40的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈
(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:40:Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:41的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:41:Arg Trp Cys Pro Arg Ser Asn Leu Glu Cys Met Lys Asp Ser Asp Cys1 5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly(2)SEQ ID NO:42的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度29個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:42:Arg Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Lys Asp Ser Asp Cys5 10 15Leu Ala Glu Cys Val Cys Leu Glu His Gly Tyr Cys Gly20 25(2)SEQ ID NO:43的信息(ⅰ)序列特徵(A)長度11個胺基酸(B)類型胺基酸(C)鏈性單鏈(D)拓撲學線性
(ⅱ)分子類型蛋白質(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:43:Arg Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa5 10
權利要求
1.一種適於將tPA從含有其的溶液中分離出的親和配體，包括一種含下述胺基酸序列的多肽Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8，其中X1是Trp或Leu；X2是Pro,Ser,Thr或Ile；X3是Arg,Lys或Thr；X4是Ser,Tyr,Thr或Ala；X5是Ser,Tyr,Asp,Val,Pro,Ala,His,Asn或Thr；X6是Leu,Met,Gln,Arg或Lys；X7是Glu,Gly或Arg；X8是Lys,Met,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro或Trp。
2.一種適於將tPA從含有其的溶液中分離出的親和配體包括一種含下述胺基酸序列的多肽Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly，其中X1是Trp或Leu；X2是Pro,Ser,Thr或Ile；X3是Arg,Lys或Thr；X4是Ser,Tyr,Thr或Ala；X5是Ser,Tyr,Asp,Val,Pro,Ala,His,Asn或Thr；X6是Leu,Met,Gln,Arg或Lys；X7是Glu,Gly或Arg,X8是Lys,Met,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro或Trp。
3.一種適於將tPA從含有其的溶液中分離出親和配體，其具有選自下列胺基酸序列的胺基酸序列RLCPKTDLGCMK；RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG；RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGA；及EARLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGA。
4.一種親和配體，其可在pH7與溶液中的tPA結合，並在pH5或更低pH下與tPA解離。
5.如權利要求4的親和配體，包括選自下列的胺基酸序列Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8，其中，X1是Trp或Leu；X2是Pro,Ser,Thr或Ile；X3是Arg,Lys或Thr；X4是Ser,Tyr,Thr或Ala；X5是Ser,Tyr,Asp,Val,Pro,Ala,His,Asn或Thr；X6是Leu,Met,Gln,Arg或Lys,X7是Glu,Gly或Arg；X8是Lys,Met,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro或Trp；及Arg-X1-Cys-X2-X3-X4-X5-X6-X7-Cys-X8-Lys-Asp-Ser-Asp-Cys-Leu-Ala-Glu-Cys-Val-Cys-Leu-Glu-His-Gly-Tyr-Cys-Gly，其中，X1是Trp或Leu；X2是Pro,Ser,Thr或Ile；X3是Arg,Lys或Thr；X4是Ser,Tyr,Thr或Ala；X5是Ser,Tyr,Asp,Val,Pro,Ala,His,Asn或Thr；X6是Leu,Met,Gln,Arg或Lys；X7是Glu,Gly或Arg；X8是Lys,Met,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro或Trp。
6.如權利要求4的親和配體，其中該親和配體具有選自以下序列的胺基酸序列RWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTYLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCSTYSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCSTYSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCSTYSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCSKSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSSMGCKKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRTVQECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPTAPLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSALDCKKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCTKTSRECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCIRTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRTVRRCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKTHKECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKTSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSTLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSTLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSTLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG和RWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
7.如權利要求4的親和配體，其包括選自以下一組的胺基酸序列RLCPKTDLGCMK；RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG；RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGA及EARLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGA。
8.一種用於分離適於將tPA從含有其的溶液中分離出的親和配體的方法，該方法包括(a)選擇第一種溶液條件，在此條件親和配體應與tPA結合；(b)選擇第二種溶液條件，在此條件tPA與親和配體的親和複合物將解離，其中第二種溶液條件不同於第一種溶液條件；(c)提供一候選結合功能域的類似物的文庫，其中每個類似物與所述候選結合功能域的不同之處在於在該功能域內的一個或多個胺基酸的位置胺基酸序列的改變；(d)在第一種溶液條件下將所述類似物文庫與tPA接觸足夠時間以使類似物/tPA複合物形成；(e)除去在第一種溶液條件下未結合的類似物；(f)將接觸步驟(e)的溶液條件改為第二種溶液條件；(g)回收在第二種溶液條件下釋放的候選結合類似物，其中回收的類似物即為分離的tPA親和配體。
9.一種用於分離適於將tPA從含有其的溶液中分離出的親和配體的方法，包括(a)經在2,4,5,6,7,8,9和11位胺基酸位置進行胺基酸取代製備Cucurbida maxima胰蛋白酶抑制劑-Ⅰ(SEQ ID No:1)的類似物文庫；(b)將所述類似物文庫與固定化的tPA在可形成類似物/tPA結合複合物且pH為7或更高的條件下接觸；(c)除去在所述接觸步驟條件下未結合tPA的類似物；(d)改變接觸步驟的條件，將pH值降至5或更低；(e)回收在pH5或更低pH下釋放的類似物。
10.一種從含tPA溶液中純化出tPA的方法，包括(a)在層析載體上固定一種包括SEQ ID No:42的胺基酸序列的多肽；(b)在pH7或更高pH下將含tPA的溶液與所述載體接觸；(c)除去與所述載體接觸的所述溶液的其它組分；(d)在pH5或更低pH下從所述載體中回收tPA。
11.一種從含tPA溶液中純化出tPA的方法，包括(a)在層析載體上固定如權利要求2的親和配體；(b)在pH7或更高pH下將含tPA的溶液與所述載體接觸；(c)除去與所述載體接觸的所述溶液的其它組分；(d)在pH5或更低pH下從所述載體中回收tPA。
12.如權利要求9的方法，其中所述親和配體具有選自以下一組的胺基酸序列RLCPKTDLGCMK；RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG；RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGA及EARLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGA。
13.如權利要求10的方法，其中所述親和配體含有選自以下一組的胺基酸序列RWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTYLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCSTYSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCSTYSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCSTYSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCSKSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSSMGCKKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRTVQECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPTAPLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSALDCKKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCTKTSRECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCLRTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRTVRRCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKTHKECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKTSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSTLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSTLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKYTLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPKSTLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSSLECMKDSDCLAECVCLEHGYCGRWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG和RWCPRSNLECMKDSDCLAECVCLEHGYCG
14.如權利要求10的方法，其中所述親和配體具有選自以下一組的胺基酸序列RWCPKTSLGCMK；RWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG；RWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGAEARWCPKTSLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGA；RLCPKTDLGCMK；RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCG；RLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGA，和EARLCPKTDLGCMKDSDCLAECVCLEHGYCGA
全文摘要
公開了一種用於獲得分離組織型纖溶酶原激活物(tPA)用的親和配體的方法,還公開了在pH7以高特異性結合tPA而在pH5或更低pH下釋放tPA的配體。另外還公開了這樣一些方法,使用這些方法可分離具有所需的預選的結合和釋放(洗脫)特性的額外的配體,從而可開發特製的配體以解決由任何特定的含tPA原料流所產生的純化問題。
文檔編號B01J20/281GK1219240SQ97194698
公開日1999年6月9日 申請日期1997年3月20日 優先權日1996年3月20日
發明者約翰·M·麥克林南, 羅伯特·C·萊德納, 託馬斯·C·蘭索霍夫 申請人:戴克斯公司