基於環介導等溫擴增消光技術的轉基因玉米MIR604檢測方法與流程
2023-06-16 19:32:32 1
本發明涉及分子生物學及生物檢測技術領域，具體地說，涉及基於環介導等溫擴增消光技術的轉基因玉米MIR604檢測方法與檢測試劑盒。
背景技術：
轉基因玉米品系MIR604由瑞士先正達公司2005年研發，具有抗蟲特性，採用根瘤農桿菌介導轉化方法，轉入Cry3A基因，可表達mCry3A抗蟲毒蛋白。2007年起，美國、菲律賓、墨西哥、俄羅斯、韓國、日本、加拿大和歐盟相繼批准轉基因玉米品系MIR604可進口作為食品和飼料的加工原料，美國2012年更是批准其在境內28個州實驗種植登記。我國於2008年批准轉基因玉米品系MIR604進口作為食品和飼料的加工原料。
環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是Notomi等於2000年發明的一種新型的恆溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4-6條特異性引物，利用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在等溫條件下(60-65℃)反應，在1h內即可完成核酸擴增反應，目的片段可以擴增109倍。該方法具有特異性強、靈敏度高、擴增效率高、省時、操作簡單等優點，在核酸檢測方面具有明顯優勢。目前環介導等溫檢測技術的產物檢測方法主要有濁度法、染料法、電泳法以及核酸試紙條，但是這些方法都容易引起交叉汙染。
技術實現要素：
為了解決現有技術中存在的問題，本發明建立了一種針對於轉基因玉米MIR604的檢測方法，本發明的一個目的是提供了一套環介導等溫擴增技術快速檢測用引物；本發明的第二個目的是建立了環介導等溫擴增檢測方法；根據檢測方法實現了本發明的第三個目的，提供了使用上述檢測用引物的試劑盒；本發明的試劑盒和檢測方法具有簡便、靈敏、快速、特異性好等特點，提供了一種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因玉米MIR604的檢測方法。
本發明的第一個目的提供一種環介導等溫擴增消光技術檢測轉基因玉米MIR604方法的4條檢測引物，序列分別為：
上遊外引物，MIR604-F3：
CTGGGAGGGAGGGAGGGAAGCCCCACCTGTTCGA(SEQ ID NO.1)，
下遊外引物，MIR604-B3：
CTGGGAGGGAGGGAGGGGGCTCGCTGCTCTTGTTG(SEQ ID NO.2)；
上遊內引物，MIR604-FIP：
AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGCTGGGAGGGAGGGAGGGACCTCACCGCATCCAGTTC(SEQ ID NO.3)
下遊內引物，MIR604-BIP：
GGAGCGGCAACTACGTGAGCTGGGAGGGAGGGAGGGAGAAGGGGCTGGTGATGA(SEQ ID NO.4)
核酶是一種具有類過氧化物酶活性、富含鳥嘌呤的單鏈DNA分子，在特定的條件下能夠摺疊成G4重結構，在H2O2存在下能夠催化無色底物2,2′-連氮基-雙-(3-乙基並二氫噻唑啉-6-磺酸)二價陰離子(ABTS2-)氧化成藍綠色物質ABTS-·自由基。當存在單鏈DNA分子的互補鏈時，這種類過氧化物酶的活性降低甚至消失。將折中顯色/消光技術結合到環介導等溫擴增技術上，利用引物顯色，產物消光的手段，來驗證目的片段的存在。
本發明通過巧妙地設計引物，使引物既可高效擴增轉基因玉米MIR604的cry3A基因，又可作為具有類過氧化物酶活性單鏈DNA分子，實現上述功能。
第二方面，本發明提供了一種擴增效率高、準確度高的檢測轉基因玉米MIR604的方法，即利用環介導等溫擴增消光技術用前述引物對樣品的DNA進行擴增，通過檢測是否有擴增產物來判斷是否存在Cry3A基因，從而判斷是否存在轉基因玉米MIR604。
本發明提供的檢測轉基因玉米MIR604的方法包括以下步驟：
(1)提取待測樣品基因組模板；
(2)顯色反應：將hemin工作液與本發明SEQ ID NO.1-4所述引物混合，添加ABTS顯色液和H2O2後得到顯色反應混合液，立刻記錄顏色或在419nm處測定吸光值；
(3)環介導等溫擴增消光反應：向顯色反應混合液中添加樣品基因組模板，在60～65℃進行環介導等溫擴增消光反應40～60min；
(4)產物檢測：目視判定反應顏色，或在419nm處測定吸光值，通過與步驟(2)的結果比較，判斷是否有擴增產物，當顏色由藍色變為淺色或無色或者當OD419nm值變小，說明有目的產物，待測樣品為轉基因玉米MIR604陽性。
步驟(2)中，將40～60μM的hemin工作液與1.25μM的上遊外引物和下遊外引物以及10μM的上遊內引物和下遊內引物混合，在35～45℃條件下孵育20～30min，添加30～40mM的ABTS顯色液和50～60mM的H2O2後得到顯色反應混合液。
其中，步驟(3)是向顯色反應混合液中添加1.4～2.0mM dNTP、3～8mM MgSO4、0.6～0.8M甜菜鹼、3.6～10.0U Bst DNA聚合酶大片段、1×Thermopol buffer，2μL樣品基因組模板，再進行環介導等溫擴增消光反應。
所述hemin工作液由hemin溶於工作液配製，該工作液含有10mM NaH2PO4、100mM KCl、2mM MgCl2以及0.003％Triton X-100。
在該顯色體系條件下進行顯色反應，能夠保證引物最大程度的摺疊成G4結構，與hemin充分結合，發揮出類過氧化物酶的最大活性，保證顯色程度最佳；在該擴增體系條件下進行擴增，能夠保證引物的擴增效率不受影響，在短時間內實現快速擴增，保證儘可能多的核酶引物形成雙鏈產物，從而失去類過氧化物酶活性，使得反應體系消光。
第三方面，本發明提供一種檢測轉基因玉米MIR604的試劑盒，含有序列如SEQ ID NO.1-4所示的引物。
進一步地，本發明的試劑盒還含有工作液、hemin、ABTS粉劑、DMSO緩衝液、30％H2O2，以及1×Thermopol buffer、dNTP、MgSO4、甜菜鹼組成的反應液和Bst DNA聚合酶；所述工作液含有10mM NaH2PO4、100mM KCl、2mM MgCl2以及0.003％TritonX-100。
優選地，反應液是由體積比為5:8:1:10的1×Thermopol buffer、1.4-2.0mM dNTP、3-8mM MgSO4、0.6-0.8M甜菜鹼組成。
在所述試劑盒中，所述引物以引物混合液的形式存在，所述引物混合液中含有1.25μM的上遊外引物MIR604-F3和下遊外引物MIR604-B3，含有10μM的上遊內引物MIR604-FIP和下遊內引物MIR604-BIP。
Bst DNA聚合酶凍幹在PCR管內底部。其中混合液、工作液、ABTS粉劑、DMSO緩衝液、30％H2O2可常溫保存，反應液需4℃保存，Bst DNA聚合酶需-20℃保存。
本發明提供了上述試劑盒在檢測轉基因玉米中的應用。
本發明的有益效果在於：
1、反應快速，一般情況下在15～30min即可有大量的擴增產物生產，為了保證檢測的準確度，本發明選擇反應時長為40min，在此時間內即可將模板擴增109倍，該方法操作簡便，適於核酸分子的快速檢測。
2、特異性好，該技術對靶基因的6個區域設計引物，引物具有更高的特異性。
3、靈敏度高，該技術反應速度快，對於痕量目的基因可以達到很好的檢測效果，靈敏度比PCR方法高一到兩個數量級，該技術為轉基因產品的監督檢測提供了技術支持。
4、操作簡單，適於基層使用。本發明設計了檢測轉基因玉米MIR604的試劑盒，操作簡單，不需要專業人員操作，結果易於觀察，非常適於基層檢測使用。
附圖說明
圖1為本發明實施例5中環介導等溫消光擴增反應電泳結果；其中，泳道1為陰性擴增，泳道2為陽性擴增，M為D2000maker。
具體實施方式
下面將結合實施例對本發明的優選實施方式進行詳細說明。需要理解的是以下實施例的給出僅是為了起到說明的目的，並不是用於對本發明的範圍進行限制。本領域的技術人員在不背離本發明的宗旨和精神的情況下，可以對本發明進行各種修改和替換。
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
實施例1引物的設計與確定
通過日本榮巖株式會社環介導引物在線設計軟體LAMP primer designing software primerexplorer V4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)針對轉基因玉米MIR604的Cry3A基因序列設計引物，使引物既可擴增轉基因玉米MIR604的cry3A基因，又可作為具有類過氧化物酶活性、富含鳥嘌呤的單鏈DNA分子，使其能夠在特定的條件下摺疊成G4重結構，在H2O2存在下能夠催化無色底物2,2′-連氮基-雙-(3-乙基並二氫噻唑啉-6-磺酸)二價陰離子(ABTS2-)氧化成藍綠色物質ABTS-·自由基。當存在單鏈DNA分子的互補鏈時，類過氧化物酶的活性降低甚至消失。將折中顯色/消光技術結合到環介導等溫擴增技術上，利用引物顯色，產物消光的手段，來驗證目的片段的存在。引物由上海英濰捷基有限公司合成，將引物稀釋為10μmol/L。
經過反覆篩選研究，排除效果較差的引物組合，本發明設計的最佳檢測效果的引物為：
上遊外引物，MIR604-F3：
CTGGGAGGGAGGGAGGG AAGCCCCACCTGTTCGA(SEQ ID NO.1)，
下遊外引物，MIR604-B3：
CTGGGAGGGAGGGAGGG GGCTCGCTGCTCTTGTTG(SEQ ID NO.2)；
上遊內引物，MIR604-FIP：
AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGCTGGGAGGGAGGGAGGGACCTCACCGCATCCAGTTC(SEQ ID NO.3)
下遊內引物，MIR604-BIP：
GGAGCGGCAACTACGTGAGCTGGGAGGGAGGGAGGGAGAAGGGGCTGGTGATGA(SEQ ID NO.4)
與普通LAMP引物相比，本發明的內側引物由兩條引物以及DNAzyme序列構成，根據引物設計原則，添加DNAzyme序列後F1c與F2之間序列邊長，則要求F1c與F2之間原始序列不超過35bp，同理B1與B2c之間原始序列不超過35bp，否則，內側引物則無法摺疊成啞鈴狀結構。
實施例2轉基因玉米MIR604檢測方法的建立
(1)稱取100mg轉基因玉米MIR604粉，用CTAB方法提取基因組；
(2)選用實施例1篩選的最佳引物進行實驗，引物由上海英濰捷基有限公司合成，將引物稀釋為10μmol/L；
(3)對影響顯色反應的因素(hemin、孵育溫度、時間、ABTS、H2O2)進行了優化，確定最優的顯色/消光反應體系：50μM hemin工作液，添加1.25μM外引物MIR604-F3和MIR604-B3，10μM內引物MIR604-FIP和MIR604-BIP，40℃孵育30min，然後添加36mM ABTS顯色液，60mM H2O2，立即判定顏色，測定OD419；
(4)LAMP擴增反應體系：向(3)的反應液中添加1.6mMdNTP、6mM MgSO4、0.8M甜菜鹼，8.0U Bst DNA聚合酶、1×Thermopol buffer。擴增反應程序：65℃反應40min；
(5)結果分析：擴增後顏色由藍色變淺或無色，或OD419值變小，說明含有目的產物。
實施例3環介導等溫擴增消光反應體系及反應條件的優化
為保證顯色體系最佳，本發明對下述各反應因素進行優化。
1.顯色時間的優化
40μM hemin工作液，添加1.25μM外引物MIR604-F3和MIR604-B3，10μM內引物MIR604-FIP和MIR604-BIP，35℃孵育30min，然後添加30mM ABTS顯色液，60mM H2O2。利用紫外分光光度計測定所得反應混合液在0s、30s、1min、2min、5min、10min、30min的OD419nm值。陰性對照不添加引物，用ddH2O替代。根據表1結果可知，隨著時間的延長，陽性和陰性的顯色都會顯著增加，通過陽性和陰性的比值發現，測量時間越早越好，本發明採用顯色後立即測定OD值。
表1不同顯色時間下的顯色結果
2.孵育溫度和時間的優化
陽性反應(+)：40μM hemin工作液，添加1.25μM外引物MIR604-F3和MIR604-B3，10μM內引物MIR604-FIP和MIR604-BIP，35-45℃孵育20-30min，然後添加30mM ABTS顯色液，60mM H2O2，利用紫外分光光度計立即測定所得反應混合液的OD419nm值。陰性對照(-)不添加引物，用ddH2O替代。根據表2結果可知，隨著時間的延長，陽性和陰性的顯色都會逐漸增加，通過陽性和陰性的比值發現，後期結果差異不大，本發明採用的孵育條件為40℃，30min。
表2不同孵育溫度及時間下的顯色結果(OD419nm值)
3.濃度的優化
40-60μM hemin工作液，添加1.25μM外引物MIR604-F3和MIR604-B3，10μM內引物MIR604-FIP和MIR604-BIP，40℃孵育30min，然後添加30-50mM ABTS顯色液，60mM H2O2，利用紫外分光光度計立即測定所得反應混合液的OD419nm值。陰性對照不添加引物，用ddH2O替代。根據表3結果可知，隨著hemin濃度的增加，陽性(+)的顯色都會逐漸增加，這是由於與核酶結合的量增加了，隨著ABTS濃度的增加，陽性的顯色逐漸增加，但是陰性(-)的顯色也會逐漸增加，這是由於顯色底物本身的顏色增加了，背景值的增加造成陽性和陰性的比值下降，本發明採用的最有條件為hemin 50μM,ABTS36mM。
表3不同hemin工作液及ABTS顯色液的顯色結果(OD419nm值)
實施例4試劑盒檢測樣品中轉基因玉米MIR604的特異性及靈敏度
(1)樣品基因組模板製備：稱100mg粉狀樣品，用CTAB方法提取基因組，樣品包含：轉基因玉米MIR604，轉基因玉米MON810，轉基因玉米Bt176，非轉基因玉米，轉基因大豆GTS-40-3-2，轉基因水稻TT51-1和轉基因油菜GT73。靈敏度驗證時將轉基因玉米MIR604基因組的濃度調整為105pg/μL，然後將此濃度的基因組10倍倍比稀釋為104，103，102，10，1pg/μL，製備成系列剃度濃度的標準DNA模板。
(2)顯色反應：配製50μM hemin工作液、36mM ABTS顯色液以及60mM H2O2，在含有Bst DNA聚合酶凍乾粉的PCR管中配製反應體系，添加引物混合物9μL，hemin反應液90μL，40℃孵育30min，添加ABTS顯色液29μL以及1μL H2O2，立即判定顏色，測定OD419。
(3)環介導等溫擴增消光反應：上述混合液中，添加反應液12μL，DNA模板2μL，65℃水浴鍋中反應40min，判定顏色，測定OD419。
(4)結果分析：反應前後的OD419值見下表，規定反應前OD419為A，反應後OD419為B。顯色反應液最初呈藍色，擴增後，含有樣品基因組的反應液接近無色，OD419降低，陰性對照為不添加基因組模板反應液仍然呈藍色，OD419維持不變，由此判定含有轉基因玉米MIR604成分。
表4試劑盒檢測樣品中轉基因玉米MIR604的特異性及靈敏度
由表4可知，只有轉基因玉米MIR604發生了消光反應，其餘對照的OD419基本保持一致，證明該檢測方法具有較好的特異性。靈敏度試驗中，陽性OD419nm值隨著基因組濃度的增加而降低，陰性對照OD419nm值與原OD值基本一致，由此判定本方法的最低檢測限為10pg。
實施例5含有本發明引物的試劑盒檢測樣品中轉基因玉米MIR604成分
(1)基因組模板的提取：稱100mg待測樣品，用CTAB方法提取基因組。
(2)顯色反應：配製50μM hemin工作液、36mM ABTS顯色液以及60mM H2O2，在含有Bst DNA聚合酶凍乾粉的PCR管中配製反應體系，添加引物混合物9μL，hemin反應液90μL，40℃孵育30min，添加ABTS顯色液29μL以及1μL H2O2，立即判定顏色，測定OD419。
(3)環介導等溫擴增消光反應：上述混合液中，添加反應液12μL，DNA模板2μL，65℃水浴鍋中反應40min，判定顏色，測定OD419。
(4)結果分析：步驟(2)中顯色反應液呈藍色，OD419為0.71564，擴增後反應液接近無色，OD419為0.06258，陰性對照反應液呈藍色，OD419為0.70024，擴增後反應液維持藍色，OD419為0.69431，差異不大。經過上述環介導等溫消光擴增，得到的擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖1所示，表現出典型的LAMP階梯狀產物條帶。該結果表明本發明試劑盒可直接用於轉基因玉米MIR604的檢測。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
SEQUENCE LISTING
中國農業大學
基於環介導等溫擴增消光技術的轉基因玉米MIR604檢測方法
KHP161116349.3
4
PatentIn version 3.5
1
34
DNA
人工序列
1
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DNA
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DNA
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ggagcggcaa ctacgtgagc tgggagggag ggagggagaa ggggctggtg atga 54