用於控制幹細胞分化的方法

2023-05-27 05:46:56 2

專利名稱：用於控制幹細胞分化的方法
關於聯邦贊助研究的聲明
本發明部分由來自國立衛生研究院(National Institutes of Health)的撥款號RO1 GM58839支助。政府在本發明中可能具有一定的權利。
背景技術：
本發明的特徵在於用於開發和維持哺乳動物幹細胞及其衍生物的改進。
幹細胞是獨特的細胞群體，其具有分裂(自我更新)無限時間段的能力，和在正確條件或信號下分化成構成生物的許多不同細胞類型的能力。來源於胚泡內細胞團的幹細胞被稱為胚胎幹(ES)細胞。來源於原生殖細胞且通常發育為成熟配子(卵和精子)的幹細胞被稱為胚胎生殖幹(EG)細胞。因為其分化成所有3種胚胎胚層(內胚層、中胚層和外胚層)衍生物的獨特能力，所以這兩種類型的幹細胞被稱為多潛能細胞。
多潛能幹細胞可以進一步特化為通常來源於成體組織的另一種類型的多能幹細胞。多能幹細胞也能夠經歷自我更新和分化，但與胚胎幹細胞不同，定向於產生具有特定功能的細胞。成體幹細胞的例子包括造血幹細胞(HSC)、骨髓衍生幹細胞(BMSC)和神經幹細胞(NSC)，所述HSC可以增殖和分化以產生淋巴樣和髓樣細胞類型；所述BMSC可以分化成脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、肝細胞、心肌細胞和神經元；且所述NSC可以分化成星形膠質細胞、神經元和少突膠質細胞。多能幹細胞也已來源於上皮和脂肪組織和臍帶血(UCB)。
通過與幹細胞分離和繁殖有關的近期工作在再生醫學和基因療法領域中已產生相當大的興趣。幹細胞在培養中無限繁殖的能力結合其產生多種組織類型的能力使得來自這些細胞的治療潛能幾乎是無限的。
用於治療目的的幹細胞開發中的主要限制之一涉及足夠時間的從自我更新轉變成分化的調節，以允許臨床醫生或研究人員處理細胞用於治療或研究目的。用於維持未分化狀態中的幹細胞的當前方法包括在小鼠胚胎成纖維細胞的飼養層上培養細胞，在牛血清中培養，在從小鼠腫瘤提取的細胞的平板塗布基質中培養，和添加試劑，例如白血病抑制因子、成纖維細胞生長因子(FGF)、Map激酶激酶抑制劑PD98059和Oct-4(也被稱為Oct-3/4)。所有這些方法在其潛能方面有限，因為其不能阻斷分化，且因為可能有動物產品、病原體、飼養細胞的汙染，或在人幹細胞的情況下，有非人細胞的汙染。
需要用於培養和處理未分化幹細胞的改進方法以幫助實現這些細胞的全部治療潛能。
發明概述 本發明基於下述發現X染色體失活(XCI)使得幹細胞能夠分化，且抑制或阻斷XCI可以導致阻斷分化，從而提供了用於控制幹細胞分化的機制。此類方法包括靶向和滅活在X失活中心基因座內的任何內源基因，或引入可以阻止細胞經歷X染色體失活的轉基因。控制幹細胞分化的這些方法的使用促進和增強幹細胞的治療和臨床潛能。
XCI是其中一個X染色體在雌性細胞(XX)中關閉的過程，以補償與雄性(XY)細胞比較具有額外的X染色體。這意味著每個胚胎必須配備計數X染色體(XX對XY)的機制，且隨後在雌性的2條X染色體之間隨機選擇以開始失活過程，同時在所有後期分裂中維持相同X染色體的失活。所述步驟分別被稱為「計數」、「選擇」和「沉默」。此外，染色體間配對也包括在XCI過程中。
這些步驟受到稱為X失活中心(Xic)的主調節區的控制，所述主調節區包含許多罕見的非編碼基因，所述非編碼基因一起發揮作用以確保XCI只在XX雌性中、只在1條染色體上、且以發育特異性方式發生。在Xic上的3種非編碼基因Xist、Tsix和Xite與這個過程有關，且每種產生RNA而不是蛋白質。Xist只由將來失活的X產生，且產生「包被」失活X的20kb RNA，從而開始基因沉默過程。Tsix是Xist的反義調節物，且通過阻止Xist RNA沿著X染色體伸展來發揮作用。因此，Tsix指定未來的活性X。Xite連同Tsix一起發揮作用以確保X的活性狀態。Xite產生一系列基因間RNAs且呈現具體的染色質構象。它的作用增強了反義Tsix的表達，從而與Tsix協同指定未來的活性X。Tsix和Xite一起控制「選擇」步驟，而Xist控制「沉默」步驟。Tsix和Xite還通過X-X配對調節計數和互斥的選擇。
本發明基於下述發現通過過量的Xic、Tsix和Xite或Xic、Tsix和Xite的缺失中斷XCI過程可以阻斷分化。在本方法中，XCI過程的中斷通過使用來源於Xic、Tsix或Xite序列或其片段的轉基因或小RNAs來完成，將所述轉基因或小RNAs引入幹細胞內且阻止幹細胞經歷X染色體失活和在培養中分化。轉基因的去除逆轉對分化的阻斷且可以根據需要誘導幹細胞分化。在不存在細胞或動物產品汙染的情況下，這些方法允許臨床醫生或研究人員有足夠的時間根據需要處理幹細胞，以增強其治療潛能。小RNA分子的使用避免了去除轉基因的需要，因為小RNA分子具有有限的半衰期且將自然降解。本發明的方法還減少或消除了使用飼養細胞的需要，由於被飼養細胞汙染的可能性減少這還導致細胞更適合於治療目的。因此，這些方法和由這些方法產生的細胞克服了幹細胞研究的2個主要限制。
因此，在第一個方面，本發明的特徵在於用於延遲幹細胞分化的方法，所述方法包括將至少一種轉基因引入幹細胞內，所述轉基因選自Xic轉基因、Tsix轉基因、Xite轉基因、Tsix/Xite轉基因及其任何片段。
在另一個方面，本發明的特徵在於控制幹細胞分化的方法，所述方法包括步驟(a)將至少一種轉基因引入幹細胞內，所述轉基因選自Xic轉基因、Tsix轉基因、Xite轉基因、Tsix/Xite轉基因及其片段，從而延遲幹細胞分化；和(b)需要時，滅活轉基因，從而允許幹細胞分化。在這種方法中，轉基因可以進一步包括選擇標記。轉基因還可以由重組酶識別序列側接，所述識別序列包括但不限於LoxP或FRT序列。在該方法的步驟(b)中，滅活轉基因可以包括從幹細胞中去除轉基因，例如通過通過在幹細胞中表達重組酶(例如，Cre重組酶或翻轉酶(FLP)重組酶)，以從基因組DNA中去除轉基因或去除包含轉基因的附加體(例如，通過刪除複製起點)。在優選實施方案中，重組酶的表達是瞬時的。該方法還可以包括在滅活步驟之前將第2種轉基因引入幹細胞內。如果需要，可以在滅活步驟之前將超過一種的另外轉基因引入幹細胞內。
在另一個方面，本發明的特徵在於用於延遲幹細胞分化的方法，所述方法包括將小RNA引入幹細胞內，所述小RNA基本上與轉基因的至少15個核苷酸相同或互補，所述轉基因選自Xic轉基因、Tsix轉基因、Xite轉基因、Tsix/Xite轉基因、Xist轉基因及其任何片段。小RNA分子可以是雙鏈RNA或siRNA分子。小RNA長度為至少15個核苷酸，優選地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個核苷酸，且長度甚至最高達50或100個核苷酸(包括在中間的所有整數)。理想地，小RNA分子長度為15-32個核苷酸。
對於任何上述方面，優選的Xic轉基因包括基本上等同於SEQ IDNOs1、2、3、39或其任何片段的任何核酸序列。優選的Tsix轉基因包含基本上等同於SEQ ID NOs5、6、9、10、12、13、14、21、22、23、28、29、30、31、32、36、40或其任何片段的任何核酸序列。特別優選的Tsix轉基因包括SEQ ID NOs9、10、12、21、22和28-32中所示的核酸序列。另外優選的Tsix轉基因包括SEQ ID NOs13、14、28-32或40中任何一個的至少一個拷貝、至少2個拷貝、至少3個拷貝、至少4個拷貝和至少5個拷貝。優選的Xite轉基因包括基本上等同於SEQID NOs15、16、17、24、25、26、27、38或其任何片段的任何核酸序列。優選的Tsix/Xite轉基因包括基本上等同於SEQ ID NOs4、11、19、37或其任何片段的任何核酸序列。關於任何上述區域的優選轉基因可以抑制內源X-X配對，例如，如使用本文所述方法測定的，通過誘導X和轉基因之間的從新配對。
任何轉基因都可以與任何另外的轉基因組合使用。在一個例子中，SEQ ID NO23可以與任何另外的轉基因組合使用，以增強對分化的阻斷。此外，轉基因可以作為單個拷貝或作為多聚體(例如，多個拷貝或串聯繫列的序列)使用。例如，SEQ ID NOs13、14、28-32和40作為多聚體是特別有用的。
在上述方面的優選實施方案中，幹細胞是胚胎幹細胞，理想地雌性胚胎幹細胞。哺乳動物胚胎幹細胞或來自任何農業動物的胚胎幹細胞在本發明的方法中是特別有用的。在優選實施方案中，幹細胞是人或小鼠胚胎幹細胞。幹細胞可以是任何時期的胚胎幹細胞，優選地胚泡期幹細胞、胚胎生殖幹細胞、或來自滋養核(somatic nuclei)的克隆幹細胞。
在另一個方面，本發明的特徵在於幹細胞，所述幹細胞包括的Xic轉基因基本上等同於SEQ ID NOs1、2、3、39或其任何片段中所示的核酸序列。
在另外一個方面，本發明的特徵在於幹細胞，所述幹細胞包括的Tsix轉基因基本上等同於SEQ ID NOs5、6、9、10、12、13、14、21、22、23、28-32、36、40或其任何片段中所示的核酸序列。
在另外一個方面，本發明的特徵在於幹細胞，所述幹細胞包括的Xite轉基因基本上等同於SEQ ID NOs15、16、17、24、25、26、27、38或其任何片段中所示的核酸序列。
在另外一個方面，本發明的特徵在於幹細胞，所述幹細胞包括的Tsix/Xite轉基因基本上等同於SEQ ID NOs4、11、19、37或其任何片段中所示的核酸序列。
在上述方面的優選實施方案中，轉基因在幹細胞中表達。理想地，幹細胞是胚胎幹細胞，所述胚胎幹細胞可以是雄性或雌性的，優選雌性胚胎幹細胞。哺乳動物胚胎幹細胞或來自任何農業動物的胚胎幹細胞在本發明的方法是特別有用的。在優選實施方案中，幹細胞是人或小鼠胚胎幹細胞。幹細胞可以是任何時期的胚胎幹細胞，優選胚泡期幹細胞、胚胎生殖幹細胞、或來自滋養核的克隆幹細胞。
對於本發明的任何幹細胞，細胞轉基因可以進一步包括選擇標記或由LoxP或FRT序列側接。本發明的幹細胞還可以包括重組酶(例如，Cre或FLP重組酶)，優選瞬時表達的重組酶。本發明的任何幹細胞還可以進一步包括第2種轉基因，或如果需要另外的轉基因。
在另一個方面，本發明的特徵在於分離的小RNA分子，所述小RNA分子包含的核酸序列基本上與轉基因的至少15個核苷酸相同或互補，所述轉基因選自Xic轉基因、Tsix轉基因、Xite轉基因、Tsix/Xite轉基因、Xist轉基因或其任何片段。小RNA分子可以是雙鏈RNA或siRNA分子，且長度為至少15個核苷酸，優選地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個核苷酸，且長度甚至最高達50或100個核苷酸(包括在中間的所有整數)。在一個實施方案中，小RNA分子是長度為15-32個核苷酸的siRNA。
在一個相關方面，本發明的特徵在於配製用於促進小RNA進入細胞內的、包括上文所述的小RNA分子的組合物。在另一個方面，上文所述的分離的小RNA分子在藥物組合物中。藥物組合物可以進一步包括藥學可接受的載體。本發明的特徵還在於包括小RNA分子的載體，其中所述小RNA分子與一種或多種轉錄調節序列可操作地連接。
對於與小RNAs有關的任一上述方面，RNA分子基本上與優選的Xic轉基因相同或互補，所述優選的Xic轉基因包括基本上等同於SEQ IDNOs1、2、3、39或其任何片段的任何核酸序列。優選的Tsix轉基因包含基本上等同於SEQ ID NOs5、6、9、10、12、13、14、21、22、23、28、29、30、31、32、36、40或其任何片段的任何核酸序列。特別優選的Tsix轉基因包括SEQ ID NOs9、10、12、21、22和28-32中所示的核酸序列。優選的Xite轉基因包括基本上等同於SEQ ID NOs15、16、17、24、25、26、27、38或其任何片段的任何核酸序列。優選的Tsix/Xite轉基因包括基本上等同於SEQ ID NOs4、11、19、37或其任何片段的任何核酸序列。優選的Xist轉基因包括基本上與SEQ ID NOs7、8、20和35相同或互補的任何核酸序列。
「幹細胞」意指具有自我更新和在合適條件下分化成專門的祖細胞(progenitor cell)或特定細胞或組織潛能的任何細胞。幹細胞可以是多潛能或多能的。幹細胞包括但不限於胚胎幹細胞、胚胎生殖幹細胞、來自滋養核的克隆幹細胞、成體幹細胞和臍帶血細胞。
「成體幹細胞」或「體細胞幹細胞」意指在分化組織中發現的未分化細胞，所述未分化細胞可以自我更新和(具有一定限制)分化，以產生其所來源的組織的所有特化細胞類型。成體幹細胞是多能的。成體幹細胞的非限制性例子包括造血幹細胞、骨髓衍生幹細胞、和神經幹細胞(NSC)、以及來源於上皮和脂肪組織和臍帶血(UCB)的多能幹細胞。
「胚胎幹細胞」意指來源於胚泡期胚胎，或在細胞基本上分化成3個胚層之前的細胞，所述細胞可以自我更新且顯示未分化細胞的形態學特徵，從而使它們與胚胎或成體來源的分化細胞區分開。示例性形態學特徵包括高核/質比和在顯微鏡下顯著的核仁。在技術人員已知的合適條件下，胚胎幹細胞可以分化成細胞或組織，所述細胞或組織是3個胚層中每一個的衍生物內胚層、中胚層和外胚層。用於鑑定胚胎幹細胞的測定包括在合適的宿主中形成畸胎瘤、或對於未分化細胞的標記例如Oct-4染色的能力。
「分化」意指由此非特化的早期胚胎細胞獲得特化細胞特徵的過程，所述特化細胞例如心臟、肝、骨、神經或肌細胞。分化還可以指細胞自我更新潛能的限制，且一般與細胞功能能力中的變化有關。術語「未分化的」、或「延遲」或「阻斷」分化在本發明背景中廣泛使用，且不僅包括分化的阻止而且包括細胞分化過程的改變或減緩。技術人員將理解未分化細胞的集落通常可以由分化的鄰近細胞環繞；然而，當群體在合適條件下進行培養或傳代時，未分化的集落將持續，且個別的未分化細胞將構成相當大部分(例如至少5％、10％、20％、40％、60％、80％、90％或更多)的細胞群體。幹細胞分化可以通過本領域眾所周知的方法來測定，且這些包括分析與確定分化狀態的細胞相關的細胞標記或形態學特徵。此類標記和特徵的例子包括測量糖蛋白、鹼性磷酸酶和癌胚抗原表達，其中這些蛋白質中任何一種的增加是分化的指示。另外的例子在本文中得到描述。在優選實施方案中，如果在培養確定天數(例如2、3、4、5、6或7天或更多)後，群體中少於10％、5％、4％、3％、2％或1％的細胞表達分化的標記或形態學特徵，那麼細胞是未分化的。分化還可以通過測定X染色體失活來確定。此類測定的例子在本文中得到描述，且包括通過螢光原位雜交(FISH)或RT-PCR測量Xist表達，或通過FISH(X-X配對)測量染色體間的距離。在一個例子中，如果培養確定天數(例如2、3、4、5、6或7天或更多)後，群體中少於20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的細胞如通過FISH或RT-PCR測量的顯示Xist表達增加，或如通過FISH測量的顯示X-X配對，那麼細胞是未分化的。
「片段」意指核酸分子的部分，其包含參考核酸分子全長的至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在本發明中，片段包括X失活中心(Xic)的任何片段，所述片段包括至少10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、68、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、3700、4000、5000、10,000、15,000、19,500、20,000個，或更多核苷酸，直至Xic的全長(約100KB)。優選片段在本文中得到描述，且顯示於表1和2以及

圖1、2、3A、3B和30B中。一個優選片段是小RNA核酸序列，通常稱為siRNA，它可以充當RNA幹擾(RNAi)途徑中的特異性決定子。
「RNAi」在本領域中也稱為「基因沉默」和/或「靶沉默」，例如「靶mRNA沉默」)，指RNA的選擇性細胞內降解。RNAi在細胞中天然發生以去除外來RNAs(例如，病毒RNAs)。天然RNAi經由從游離dsRNA切割的片段來進行，所述片段將降解機制指向其他類似RNA序列。可替代地，RNAi可以通過人為處理開始，例如，以沉默靶基因的表達。RNA沉默現象的統一特徵是長度為至少15nt，優選15-32nt，最優選長度為17-26nt的小RNAs的產生，所述小RNAs充當用於下調基因表達的特異性決定子，和Argonaute蛋白質家族(或PPD蛋白質，因為其特徵性PAZ和Piwi結構域而命名)的一個或多個成員的需要。近來已注意到較大的siRNA分子，例如25nt、30nt、50nt、或甚至100nt或更多，也可以用於起始RNAi。(參見例如，Girard等人，Nature 2006年6月4日，印刷前的電子出版物，Aravin等人，Nature 2006年6月4日，印刷前的電子出版物，Grivna等人，Genes Dev.2006年6月9日，印刷前的電子出版物，和Lau等人，Science 2006年6月15日，印刷前的電子出版物。) 術語「小RNA」在本申請自始至終使用且指任何RNA分子，單鏈或雙鏈」，長度為至少15個核苷酸，優選地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個核苷酸，且長度甚至最高達50或100個核苷酸(包括在中間的所有整數)。優選地，小RNA能夠介導RNAi。如本文使用的，短語「介導RNAi」指(指示)區分將通過RNAi機器或過程降解哪種RNAs的能力。包括在術語小RNA內的是「小幹擾RNAs」和「微小RNA」。一般而言，微小RNAs(miRNAs)是通過切酶(Dicer)由約70個核苷酸的髮夾前體RNAs加工的小型(例如，17-26個核苷酸)、單鏈非編碼RNAs。小幹擾RNAs(siRNAs)具有類似尺寸且也是非編碼的，然而siRNAs由長dsRNAs加工且通常是雙鏈的(例如，內源siRNAs)。siRNAs還可以包括短髮夾RNAs，其中siRNA雙鏈體的2條鏈包括在單個RNA分子內。小RNAs可以用於描述2種類型的RNA。這些術語包括雙鏈RNA、單鏈RNA、分離的RNA(部分純化的RNA，基本純的RNA、合成RNA、重組產生的RNA)，以及改變的RNA，所述改變的RNA通過一個或多個核苷酸的添加、缺失、置換和/或改變而不同於天然存在的RNA。此類改變可以包括，例如向小RNA的一個或多個末端或內部(在RNA的一個或多個核苷酸處)添加非核苷酸材料。本發明RNA分子中的核苷酸還可以包含非標準核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脫氧核糖核苷酸。本發明的小RNAs只需要足夠類似於天然RNA，從而其具有介導RNAi的能力。
「遺傳修飾」或「遺傳改變」過程意指將外源基因或外來基因引入哺乳動物細胞內。該術語包括但不限於轉導(宿主DNA從宿主或供體到受體的病毒介導的轉移，體內或體外)、轉染、脂質體介導的轉移、電穿孔、磷酸鈣轉染或共沉澱。轉導方法包括直接共培養細胞與生產細胞，或培養細胞與單獨的病毒上清液，含或不含合適的生長因子和聚陽離子。
術語「同一性」在本文中用於描述特定核酸分子序列與參考核酸分子序列的關係。例如，如果和它與之比對的參考分子相比較，核酸分子在給定位置上具有相同的核苷酸殘基，那麼可以說成在那個位置上具有「同一性」。核酸分子與參考核酸分子的序列同一性水平一般使用序列分析軟體來測量，用其中指定的預設參數，例如引入缺口以達到最佳比對(例如，Genetics Computer Group的Sequence Analysis SoftwarePackage，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 UniversityAvenue，Madison，Wis.53705，BLAST或PILEUP/PRETTYBOX程序)。這些軟體程序通過將同一性程度分配給各種置換、缺失或其他修飾來匹配相同或相似序列。
如果核酸分子在其全長上顯示與參考分子序列至少51％，優選至少55％、60％或65％，且最優選75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或甚至100％的同一性，那麼它可以說成「基本上等同於」參考分子。對於核酸分子，比較序列的長度為至少10、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、40、50、60、68、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、3700、4000、5000、10,000、15,000、19,500、20,000，或更多核苷酸，直至且包括Xic的全長(對於小鼠Xic為約100kB)。
應當指出儘管同源的蛋白質編碼基因一般共有顯著的同源性水平(一般大於70％)，但關於非編碼基因和順式調節元件，例如本發明中包括的區域的總體同源性水平，一般小於60％。例如，來自不同小鼠品系的相同Xic具有約1個核苷酸變化/100個核苷酸的序列變異。在另一個例子中，對於DxPas 34重複，重複長度從品繫到品系不同，從15-40個核苷酸不等。在另外一個例子中，特別是在Xite內，品系之間的序列變異可以包括鹼基對插入、缺失、和單核苷酸多態性。此外，關於非編碼基因和順式調節元件的同源性通常限於較小的結構域(例如，長度為30-100nt)。因此，更靈敏的方法例如PipMaker分析和Bayesian塊分析(block analysis)可以用於測量特定非編碼基因區域或順式調節元件的同源性或同一性(Schwartz等人，Genome Research 10577-586(2000))。
「滅活轉基因」意指減少或消除轉基因阻斷分化或XCI的能力。在一個例子中，轉基因的滅活可以通過去除轉基因(例如，使用位點特異性重組酶和轉基因側翼的DNA識別序列)來完成。在另一個例子中，如果使用病毒載體將轉基因引入細胞內，那麼去除複製起點(例如，使用位點特異性重組酶和複製起點側翼的DNA識別序列)可以導致在繁殖後病毒序列包括轉基因丟失。轉基因的滅活可以使用如本文所述關於分化、XCI、或染色體間配對的成核現象的測定進行測量。
「分離的」意指當通過重組技術產生時基本上不含其他細胞材料或培養基，或當化學合成時基本上不含化學前體或其他化學試劑。
「核酸分子」意指核苷酸或核酸模擬物的任何鏈。包括在這個定義中的是天然和非天然，修飾和未修飾的寡核苷酸。
「藥學可接受的載體」意指對於被治療的哺乳動物是生理學可接受的，同時保留它與之一起施用的化合物的治療特性的載體。一種示例性藥學可接受的載體物質是生理鹽水。其他生理學可接受的載體及其配製是本領域技術人員已知的，且在例如Remington’s PharmaceuticalSciences，(第20版)，ed.A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams &Wilkins，Philadelphia，PA中描述。
「增殖」意指通過單個細胞連續分裂成2個相同子細胞的細胞群體增殖。
「純化的」意指與天然伴隨其的其他組分分開。一般地，當它至少50重量％不含它與之天然結合的蛋白質、抗體和天然存在的有機分子時，化合物(例如，核酸)是基本上純的。優選地，化合物是至少75重量％，更優選地至少90重量％，且最優選地至少99重量％純的。基本上純的化合物可以通過下述方法來獲得化學合成、使因子與天然來源分開、或在不天然生產化合物的重組宿主細胞中生產化合物。核酸分子可以通過本領域技術人員使用標準技術來純化，所述標準技術例如由Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，New York，2000)描述的那些。如使用聚丙烯醯胺凝膠電泳、柱層析、光密度、HPLC分析、或蛋白質印跡分析測量的，與原材料比較核酸分子優選是至少2、5或10倍純的。
「重組酶」意指一組酶的任何成員，所述酶可以促進限定位點之間的位點特異性重組，其中所述位點在單個DNA分子上物理地分開，或其中所述位點位於分開的DNA分子上。限定重組位點的DNA序列不必是相同的。存在幾個亞家族，包括「整合酶」(包括，例如Cre和λ整合酶)和「解離酶/轉化酶」(包括，例如ψC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶)。2種優選的重組酶及其DNA識別序列是Cre(重組酶)-lox(識別序列)或翻轉酶(FLP)(重組酶)-Frt(識別序列)。(參見Fukushige等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897905-7909(1992)；O′Gorman，等人，Science 2511351-1335(1991)；Sauer等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855166-70(1988)；Sauer等人，Nuc.Acids Res.17147-161(1989)；Sauer等人，New Biol.2441-49(1990)；和Sauer，Curr.Opin.Biotechnol.5521-7(1994))。理想地，在細胞中的重組酶表達是「瞬時的」。「瞬時表達」意指在相對短暫的時間間隔內減少的表達。瞬時表達可以通過例如使用脂質體、包被顆粒或顯微注射，引入作為純化多肽的重組酶來完成。瞬時表達還可以通過引入編碼重組酶的核酸序列來完成，所述核酸序列與表達載體中的啟動子可操作地連接，所述表達載體隨後引入細胞內。重組酶的表達還可以以其他方式進行調節，例如，通過將重組酶的表達置於可調節的啟動子(即，其表達可以被選擇性誘導或阻抑的啟動子)的控制下。重組酶只存在從細胞去除轉基因序列所必需的時間一般是優選的。
「重組酶識別序列」指由特異性重組酶蛋白質識別的任何DNA序列。例子包括loxP位點和由FLP重組酶識別的34-bp FRT位點，所述loxP位點由8-bp非回文核心區側翼的2個13-bp反轉重複組成，且由Cre重組酶識別。野生型識別序列的變體包括在本文中。如下文所述，變體可以通過其被合適的重組酶識別的能力進行鑑定。
「同線的」意指在不同物種的染色體上以相同順序存在的相應基因或染色體區域。同線基因或染色體區域不必是高度同源的，特別是當保守元件是非編碼的時。例如，小鼠X失活中心的同線部分在人Xq13上發現。
「畸胎瘤」意指由來自3種胚胎胚層的組織組成的腫瘤，通常在卵巢和睪丸中發現。畸胎瘤一般通過注射多潛能幹細胞在動物中實驗地產生，且用於測定幹細胞分化成各種類型的組織的能力。
「Tsix轉基因」意指通過人工手段引入細胞內的、基本上等同於哺乳動物Tsix序列或其任何片段的核酸片段。轉基因可以整合或不整合到細胞染色體內，且可以表達或不表達。轉基因可以是附加型的或不是附加型的。優選的Tsix轉基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同於全長小鼠Tsix基因(圖5，SEQ ID NO6)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同於下述小鼠Tsix基因片段的核酸例如pCC3(SEQ IDNO9)、p3.7(SEQ ID NO10)、DxPas34(SEQ ID NO12)、DxPas34的34bp重複(SEQ ID NO13)、DxPas34的68bp重複(SEQID NO14)、ns25(SEQ ID NO21)、ns41(SEQ ID NO22)、ns82(SEQ ID NO23)、小鼠重複A1(SEQ ID NO28)、小鼠重複A2(SEQ ID NO29)、小鼠重複B(SEQ ID NO30)、大鼠重複A(SEQ ID NO31)、和大鼠重複B(SEQ ID NO32)。另一種優選的Tsix轉基因序列包括34bp或68bp DxPas34重複(分別為SEQ ID NOs13或14)的至少2個拷貝，以及至少3個拷貝、至少4個拷貝、和至少5個拷貝或更多。這些優選片段在圖1、2和3A中圖示，且序列在圖3B、4、5和30B中提供。優選的Tsix轉基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同於全長人Tsix基因(SEQ ID NO35)、人重複A(SEQ ID NO40)或其任何片段的核酸序列，和基本上等同於小鼠Tsix序列(SEQ IDNO6)或其片段的任何哺乳動物(例如，人、靈長類動物、牛、綿羊、貓和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物種變體、或同線變體的核酸序列。物種變異包括發生在小鼠品系之間的Xite和Tsix中的多態性，所述小鼠品系包括但不限於C57BL/6、129和CAST/Ei小鼠。如上文關於SEQ ID NOs13和14所述，應當指出對於任何片段，特別是較小的片段例如SEQ ID NOs28、29、30、31、32和40，轉基因可以包括序列的多個拷貝，例如以串聯繫列(例如，至少2個拷貝、至少3個拷貝、至少4個拷貝、和至少5個拷貝或更多)。
「Xite轉基因」意指通過人工手段引入細胞內的、基本上等同於哺乳動物Xite序列或其任何片段的核酸片段。轉基因可以整合或不整合到細胞染色體內，且可以表達或不表達。轉基因可以是附加型的或不是附加型的。優選的Xite轉基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同於全長小鼠Xite基因(圖7，SEQ ID NO15)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同於下述小鼠Xite基因片段的核酸例如pXite(SEQ IDNO16)、Xite增強子(SEQ ID NO17)、ns130(SEQ ID NO24)、ns135(SEQ ID NO25)、ns 155(SEQ ID NO26)、ns132(SEQ IDNO27)。這些優選片段在圖1、2和3A中圖示，且序列在圖3B、4和7中提供。優選的Xite轉基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同於人Xite基因(SEQ ID NO38)或其片段的核酸序列，和基本上等同於小鼠Xite序列(SEQ ID NO15)或其片段的任何哺乳動物(例如，人、靈長類動物、牛、綿羊、貓和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物種變體、或同線變體的核酸序列。物種變異包括發生在小鼠品系之間的Xite和Tsix中的多態性，所述小鼠品系包括但不限於C57BL/6、129和CAST/Ei小鼠。
「Tsix/Xite轉基因」意指通過人工手段引入細胞內的、基本上等同於哺乳動物Tsix、Xite、或組合或間插的Tsix/Xite序列、或其任何片段的核酸。轉基因可以整合或不整合到細胞染色體內，且可以表達或不表達。轉基因可以是附加型的或不是附加型的。包括跨越2種基因全部或部分的區域或2種基因之間的間插區域的序列被稱為Tsix/Xite轉基因，且也可以在本發明方法中使用。優選的Tsix/Xite轉基因的非限制性例子包括基本上等同於跨越小鼠中的2種基因的關鍵區域，例如pSxn(SEQ IDNO4)、pCC4(SEQ ID NO11)、和二分增強子(bipartite enhancer)(SEQ ID NO19)的核酸序列。這些優選片段在圖1和3A中圖示，且序列在圖3B和4中提供。優選的Tsix/Xite轉基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同於跨越人染色體中的2種基因的關鍵區域，例如pSxn人(SEQ ID NO37)，或其片段的核酸序列，和基本上等同於小鼠中跨越Tsix和Xite基因的關鍵區域或其片段的任何哺乳動物(例如，人、靈長類動物、牛、綿羊、貓和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物種變體、或同線變體的核酸序列。物種變異包括發生在小鼠品系之間的Xite和Tsix中的多態性，所述小鼠品系包括但不限於C57BL/6、129和CAST/Ei小鼠。
「Xic轉基因」意指通過人工手段引入細胞內的、基本上等同於哺乳動物Xic區域的核酸分子。轉基因可以整合或不整合到細胞染色體內，且可以表達或不表達。轉基因可以是附加型的或不是附加型的。優選的Xic轉基因包括全長小鼠Xic(SEQ ID NO1)，GenBank登記號AJ421479(SEQ ID NO33)的核苷酸80,000-180,000。本文所述的每種小鼠轉基因在AJ421749的這個100kB片段內發現。例如，小鼠Xist在nt 106,296到nt 129,140中發現，小鼠Tsix/Xite序列在nt 157,186到nt 104,000內發現，且小鼠Tsx序列在nt 174,041到nt 163,932中發現。小鼠Xic內的另一種片段是Jpx/Enox，在AJ421479的nt 95,894到nt86,564中發現。優選的Xic片段包括πJL2(SEQ ID NO2)和πJL3(SEQID NO3)。優選的Xic轉基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同於人Xic基因(SEQ ID NO39)或其片段的核酸序列，和基本上等同於小鼠Xic(SEQ ID NO1)或其片段的任何哺乳動物(例如，人、靈長類動物、牛、綿羊、貓和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物種變體、或同線變體的核酸序列。
「Xist轉基因」意指通過人工手段引入細胞內的、基本上等同於哺乳動物哺乳動物Xist序列，或其任何片段的核酸。轉基因可以整合或不整合到細胞染色體內，且可以表達或不表達。轉基因可以是附加型的或不是附加型的。優選的Xist轉基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同於全長小鼠Xist基因(圖6，SEQ ID NO20)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同於下述小鼠Xist基因片段的核酸例如pXist 3』(SEQ ID NO7)和pXist 5』(SEQ ID NO8)。這些優選片段在圖1中圖示，且序列在圖6中提供。優選的Xist轉基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同於人Xist基因(SEQ ID NO35)或其片段的核酸序列，和基本上等同於小鼠Xist序列(SEQ ID NO20)或其片段的任何哺乳動物(例如，人、靈長類動物、牛、綿羊、貓和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物種變體、或同線變體的核酸序列。物種變異包括發生在小鼠品系之間的Xist中的多態性，所述小鼠品系包括但不限於C57BL/6、129和CAST/Ei小鼠。
幹細胞分化是不可逆過程，且定向至分化途徑阻止或極大地減少臨床醫生或研究人員以治療有用的方式修飾幹細胞的能力。幹細胞的巨大治療潛能依賴於控制幹細胞分化的能力。因此，需要以可逆方式阻斷或延遲幹細胞分化的有效方法。本發明提供了用於控制幹細胞分化的此類新型方法，且允許以受控方式抑制和誘導幹細胞分化。本發明基於下述發現通過過量的Xic、Tsix和Xite或Xic、Tsix和Xite的缺失中斷XCI過程可以阻斷分化。在本方法中，XCI過程的中斷通過使用來源於Xic、Tsix或Xite序列或其片段的轉基因或小RNAs來完成，將所述轉基因或小RNAs引入幹細胞內且阻止幹細胞經歷X染色體失活和阻止培養中的分化。用於處理幹細胞分化的這些新型方法允許臨床醫生或研究人員使幹細胞維持於未分化狀態，其時間足以根據需要修飾細胞(例如，通過引入治療基因)以用於治療或研究目的，而沒有細胞或細胞產品汙染的限制或分化的無效抑制。該方法還允許臨床醫生再次以有效方式且無汙染問題地容易地去除對分化的阻斷，從而使得細胞可以給受試者施用。本發明的特徵還在於通過控制或延遲分化的方法產生的細胞，所述細胞在培養中可以無限地自我更新，且對於治療目的例如再生醫學和基因療法有用。
由於下述詳細描述、附圖和權利要求，本發明的其他特徵和優點將是顯而易見的。
附圖簡述 圖1是Xic區域的圖示，顯示了用於阻斷幹細胞分化的一組優選轉基因。
圖2是Xic區域亞型的圖示，更詳細地顯示了Tsix/Xite接頭。指出了另外的優選轉基因。
圖3A-3B是pSxN轉基因的圖示和相應核酸序列。圖3A是pSxN6(也稱為pSxN)轉基因的圖示，顯示了用於阻斷幹細胞分化的一組優選轉基因。這個區域包括Tsix和Xite的5』端，且包含對於X’s的計數(計數器)、細胞分化、印記、選擇和互斥效應關鍵的元件。圖3B是pSxN轉基因(SEQ ID NO4)的註解序列圖。序列圖進行註解以顯示圖3A中鑑定的每種轉基因的限制位點和特異性位置。
圖4是註解的核酸序列，其顯示了DxPas34轉基因(SEQ ID NO12)的34和68個鹼基對的重複(分別為SEQ ID NO13和14)。每行序列表示34個鹼基對的重複。這些重複位於SEQ ID NO4的nt 5074-6630(圖3B)。注意34和68bp重複不是精確的重複但從一個到下一個略微不同。
圖5的核酸序列顯示了小鼠Tsix RNA序列(未剪接形式；SEQ IDNO6)。
圖6的核酸序列顯示了全長小鼠Xist RNA(未剪接形式；SEQ IDNO20)。
圖7的核酸序列顯示了小鼠Xite區域(SEQ ID NO15)。這個序列以與pSxn的註解序列(圖3)相同的方向定向。Xite在2簇起始位點內的多個位置中開始。第1個簇在nt 6995-5773(其中存在1.2kb增強子)周圍。第2個簇在nt 13000-12500周圍。注意所有轉錄物以反義方向(例如，從nt 6995到nt 1)進行。還應當注意Xite不「結束」。當它達到Tsix時，它正好減少。還應當注意2個起始簇中的第2個在pSxn關鍵區域外面但仍是Xite的部分。
圖8A-8E顯示計數缺陷，候選計數區域，以及XΔXΔ、XΔO和XΔY ES細胞分離的表現。圖8A的圖示顯示了正常和異常計數模式。實心黑圈，xi。空圈，Xa。圖8B是Xic的圖示，顯示了被認為影響或不損害計數的現有缺失。水平虛線描繪了每個敲除的程度。關於計數元件的假定區域以橙色顯示。圖8C是選擇新分離的XΔXΔ、XΔO和XΔY ES系的DNA印跡分析。圖8D的顯微照片顯示了使用來自Xite基因座(pDNT 1)的X連鎖探針，對Δf5細胞的DNA FISH結果，從而證明了突變系中的2個Xs。圖8E是鑑定Δf4作為XΔY克隆的Y染色體塗染的顯微照片。染色體塗染如製造商(Cambio，UK)建議的進行。
圖9A-9F顯示了異常分化和XΔXΔ而不是XΔO或XΔY克隆中的XCI。圖9A是在相同放大率下獲取的突變EB的一系列相差圖像。XΔXΔEB(Δf5顯示)顯示d2至d6(d，天)的差的分化，但某些EB最後在不遲於d9顯示稀少的長出(outgrowth)。XΔO(Δf32顯示)、XΔX(BA9，未顯示)和XΔY(Δf4，未顯示)自始至終顯示正常分化。圖9B的圖顯示了細胞死亡的定量。第0天在所有細胞系中顯示了＜＜1％的死亡。顯示的數據表示了3次實驗的平均值。如通過斯氏t檢驗計算的，統計學顯著性(P)在下表中指出。每種細胞系針對WT對照進行測試。圖9C的一系列圖像顯示了使用對於Xist RNA(FITC標記的，綠色)和Xite DNA(Cy3標記的，紅色)的探針以標記X染色體的RNA/DNA FISH。圖9D的圖示顯示了在分化d3時的XCI模式。對於來自2次實驗的每種樣品計數＞200個核。n.a.，不可用。圖9E的圖像顯示了在第6天時生長差的Δf25EB(XΔXΔ)的RNA/DNA FISH，顯示了具有2個Xi的眾多核。Xist RNA，綠色。Xite DNA，紅色。圖9F的圖像顯示了在隨後的分化天數時的RNA/DNA FISH，其中大多數存活的XΔXΔ細胞(Δf41顯示)只顯示單個Xi。Xist RNA，綠色。Xite DNA，紅色。
圖10A-10E顯示了攜帶Xic的雌性轉基因ES系的生成。圖10A的Xic和P1轉基因圖覆蓋Xic的各個區域。轉基因序列是πJL2，包含Xist以及30kb上遊和下遊序列的80kb P1質粒(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)，同上)；πJL3，包含Xist和60kb下遊序列的80kb P1質粒(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)，同上)；和pSx7，πJL1的BssHII-NotI片段。如先前所述(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)，同上)通過電穿孔引入轉基因，連同摩爾比為0.1的Neo選擇標記(pGKRN)。本文使用的所有轉基因系具有常染色體插入。圖10B是轉基因細胞系的DNA印跡分析。拷貝數分析如先前所述進行(Lee等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1999)，同上)。Xist拷貝數對Dnmt1進行標準化。圖10C是分化5天的WT和轉基因EB的一系列相差圖像。所有圖像為相同的放大率。圖10D的一系列圖像顯示用於檢測Xist RNA(綠色)和X染色體(Xite DNA，紅色)的RNA/DNA FISH。細胞來自第4天。X，X染色體；T，轉基因常染色體。紅色箭標指向在高拷貝克隆中可見的稀少的Xist RNA聚集體。圖10E的表顯示了與轉基因拷貝數反相關的Xist表達的頻率(如通過RNA/DNA FISH測定的)。
圖11A-11E顯示的較精細的轉基因作圖揭示Tsix和Xite具有計數元件。圖11A是Xic和較精細轉基因的圖。由每種轉基因攜帶的序列是pSxn，πJL1的19.5kb RsrII-NotI片段(SEQ ID NO4)；p3.7，從TsixΔCpG中缺失的3.7kb MluI-SacI序列(SEQ ID NO10；Lee等人，Cell(1999)同上)；pCC3，Tsix啟動子下遊的4.3kb BamHI片段(SEQ ID NO9)；pCC4，Tsix啟動子上遊且包括Tsix啟動子的5.9kb BamHI片段(SEQ IDNO11)；pXite，跨越Xite的DHS1-4的5.6kb片段(Ogawa等人，同上)；pXist5』，來自Xist啟動子的4.8kb XbaI-XhoI片段(SEQ ID NO8)；pXist3』，來自Xist外顯子7的4.9kb PstI片段(SEQ ID NO7)；和pTsx，來自Tsx基因座的Genbank X99946的bp 41,347-52,236(SEQ IDNO18)。除了pXist3』外，將Neo選擇標記工程改造到每種質粒內用於在ES細胞中選擇。本文表徵的所有系都具有常染色體插入。實心紫色條，具有最強計數性質的元件；虛線紫色條，也具有計數性質的元件，雖然比前者弱。圖11B的圖顯示了通過錐蟲藍測定對選擇的轉基因細胞系的細胞死亡分析。數據表示3次實驗的平均值。如通過斯氏t檢驗計算的，統計學顯著性(P)在鄰近表中指出。每種細胞系針對對照WTneo進行測試。圖11C是在相同放大率下獲取的轉基因EB和對照的一系列相差圖像。對於克隆3.7-11和Xite-11，注意到d5時大尺寸的EB和不遲於d8的大量退化。圖11D的圖顯示了d3時轉基因和對照細胞系中的XCI模式。對於來自2次實驗的每種樣品計數至少200個核。在Tsix和Xite轉基因中，檢查載玻片上＞50,000個細胞以得出結論為0％顯示Xist表達。n.a.，不可用。圖11E的一系列圖像顯示了Tsix和Xite雌性轉基因系而不是Xist或Tsx系中的XCI阻抑。RNA/DNA FISH使用p3.7、pXite或pTsx質粒作為探針(紅色)檢測Xist RNA(綠色)和轉基因染色體。X，X染色體；T，轉基因常染色體。
圖12A-12D顯示了用於計數的二重性模型(duality model)。圖12A的圖顯示單一模型(singularity model)。計數表示X因子(綠色圈)和A因子(紫羅蘭色圈)的滴定。A因子可以來源於多個不同常染色體。A至X因子的偶聯形成『阻斷因子』(BF)。任何未滴定的X因子被降解。選擇由BF與1個Xic的結合產生，這隨後阻抑XCI的開始。Xi通過預設形成。X，X染色體；A，常染色體。圖12B的圖顯示二重性模型。正如在單一模型中，A和X因子的複合形成BF。然而，未滴定的一種或多種X因子導致稱為(dubbed)『感受態因子』(CF)的第2種複合物形成。選擇步驟表示BF和CF與Xic的結合。BF結合阻斷未來Xa上的XCI，而CF與剩餘X的結合誘導未來Xi上的XCI。二重性模型暗示BF和CF以互相排斥的方式結合。BF和CF最可能與Tsix和Xite的5』區域結合。圖12C的圖顯示了XΔXΔ突變體中的異常計數和混亂選擇。描述的是在細胞分化期間4種同樣可能的結果。頂端的2種結果達到劑量補償作用且導致產生存活細胞。假定這些細胞是圖9A中第9天存活的EB細胞和圖9F中的劑量補償的細胞。它們引起偶然的XΔXΔ小鼠出生(Lee，Nature Genet.(2002)，同上)。底部的2種結果導致2個Xi’s或2個Xa’s(由於互相排斥的喪失和隨之發生的『混亂』)——不存活的狀態。Tsix缺失由X中的缺口表示。圖12D的圖顯示常染色體上出現多個Tsix或Xite序列壓制來自內源Xic的阻斷和感受態因子，從而導致轉基因細胞中組成型活性的X’s。黑色框是完整或部分的Xic序列。ATg，轉基因常染色體。
圖13的一系列相差圖像顯示XΔXΔ克隆中的異常細胞分化。指出了分化天數(d)時在相同放大率下的突變EB的相差圖像。為了產生EZB，在d)時ES集落被胰蛋白酶消化成脫附的細胞簇，在懸浮培養中在不含LIF的DME/15％FBS中生長4天，其後與凝膠化的板附著以獲得長出。注儘管不遲於d*時許多XΔXΔEB退化，但相當大部分EB的確長出(顯示了例子)，但長出的程度一般不如WT或XΔO強壯。
圖14的一系列相差圖像顯示了包含Tsix/Xite的轉基因系中的異常細胞分化。顯示了在指定分化日時在相同放大率下的突變體和野生型EB的相差圖像。所有包含Tsix/Xite的XX轉基因導致在第5天時EB長出差且不遲於第8天時大量死亡。如通過錐蟲藍攝取測定的，＞99％的非附著細胞是死亡的。包含相同轉基因的XY系和包含Xist、Tsx的XX系，以及載體轉基因不顯示這種表型。在Tsix/Xite轉基因中，p3.7和pXite轉基因顯示非常高的放射狀生長(顯示了各2種克隆)。與較大的轉基因比較，pCC3、pCC4和pSxN轉基因的確也是這樣，但程度較少和更可變。πJL2、πJL3和pSx7同樣具有升高的細胞死亡率，但它們的EB集落不是非常大。
圖15A-D顯示了關於X-X同源結合的證據。圖15A的一系列圖像和圖顯示了野生型雌性ES核從分化第0天到第6天以及MEFs的DNA FISH和X-X分布特徵。2種探針組合Xic DNA綠色(pSxn-FITC)+Tsx DNA紅色(pTsx-Cy3)。DAPI(4』，6』-二脒基-2-苯基吲哚)，藍色。每個圖像是0.2μz切片的3D圖像棧(image stack)層的2維(2D)表示。分布顯示標準化的距離，ND＝X-X距離/d，其中d＝2x(核面積/π)0.5。ND為0-1。平均距離，空心三角。圖15B的一系列圖顯示了ND 0.0-0.2時關於X-X對的累積頻率曲線。P(KS檢驗)在逐對比較中針對第0天進行計算。關於每次實驗的樣本大小(n)＝174-231。圖15C的圖顯示X-X距離＜0.05ND。距離用來自3次獨立實驗的標準差(SD)進行圖示。圖15D是Xic的圖和顯示對Xic特異的鄰近配對的圖。關於X連鎖基因座的X-X分布特徵顯示於圖中。KS檢驗(P)比較Xic對側翼基因座。n＝166-188。
圖16A-D顯示在XCI開始期發生的同源結合。圖16A的一系列圖像和圖顯示關於第2天野生型XX細胞的RNA-DNA FISH。Xic DNA，綠色(pSxn-FITC)；Xist RNA，紅色(鏈特異性核糖核酸探針(riboprobes)-Cy3)。圖16B-16D的一系列圖顯示關於第2天野生型XX細胞的累積分布，從而比較Xist+(n＝74)對Xist-(n＝180)細胞(圖16B)；Ezh2+(n＝33)對Ezh2-細胞(n＝178)(圖16C)；和H3-3meK27+(n＝48)對H3-3meK27-(n＝188)細胞(圖16D)。
圖17A-F顯示Tsix和Xite對於X-X配對是必需和充分的。圖17A是Xic、TsixΔCpG和XiteΔL以及各種轉基因的圖。圖17B的一系列圖顯示了從第0天到第6天關於Tsix和Xite突變體的X-X分布。n＝181-223。KS檢驗比較了每條曲線與第0天的曲線。圖17C的圖表顯示了用於3C分析的Tsix等位基因和引物(紅色)。BamHI位點，藍色箭標。圖17D顯示了XΔTsix(neo+)X細胞和p3.7雌性的逐對相互作用的3C分析。引物對在凝膠右側指出。C，陽性對照連接。所有負-交聯(N)和負-連接對照都是陰性的。圖17E的圖顯示使用顯示的等式，使第n天(dn)時的相對配對頻率(X)對β珠蛋白(βg)和第0天的值進行標準化。S，通過光密度測定法定量的信號強度。來自3次獨立實驗的平均值和SD。圖17F關於轉基因ES細胞的DNA FISH和X-A分布曲線。轉基因被Neo探針標記為紅色，且X被pSx7探針(對於p3.7、pXite、pXist5』和pTsx細胞)或pTsx探針(對於pSx7細胞)標記為綠色。pSx7與p3.7和pXite轉基因部分重疊，但小重疊使信號暗淡且可與X區分。對於πJL1.4.1，轉基因標記為綠色(pSx9 Xist片段)且X標記為紅色(pTsx探針)。KS檢驗比較來自第0天對第4天的數據集。n＝170-234。
圖18A-D顯示從頭X-A配對抑制X-X配對。圖18A的一系列圖顯示雌性轉基因細胞中的X-X配對的破壞。n＝177-221。圖18B顯示的KS檢驗比較來自第0天對第2天以及來自第0天對第4天的數據集。圖18C的圖顯示了來自3次實驗的X-X配對的平均頻率與標準差。圖18D的模型顯示了X-X配對是計數/選擇所需的。等位基因交擾導致不對稱的染色體標記(黃色圈，阻斷的Xic；紅色圈，誘導的Xic)以及Xa和Xi的互相排斥的指示。藍線，Xist RNA。異位Tsix/Xite轉基因(Tg-Xic)通過滴定消除X-X相互作用來抑制XCI。Tsix XΔXΔ配對的喪失引起異常計數/選擇。
圖19的一系列圖和圖像顯示，X-X鄰近配對代表XX細胞中的X染色體雙聯體而不是XO細胞中單個X的姐妹染色單體。WT雌性ES細胞的Xic標記(Tsix探針，紅色)和X塗染(FITC，綠色)顯示，X-X鄰近配對代表XX細胞中的2個不同Xs而不是XO細胞中單個X的姐妹染色單體。配對的Xs顯示佔據單個Xs 2倍核面積的X塗染信號。在右側顯示了X-X分布特徵，其中KS檢驗(P)比較d4對d0。
圖20的一系列圖顯示鄰近配對是對X染色體特異的。在ES細胞分化期間Chr.1著絲粒(1C)和Chr.2 Abca2基因的分布特徵。
圖21A-C顯示鄰近配對是對Xic特異的。圖21A的一系列圖像顯示XC和Tsix的DNA FISH，其中Tsix信號是分開(左側)或配對的(右側)。圖21B的一系列圖顯示在d4時側翼X連鎖探針的分布特徵。圖21C的一系列圖顯示d0至d6的X連鎖探針的累積頻率曲線。KS檢驗，P＝針對d0測試時的差異顯著性。
圖22A-B的一系列圖像和圖顯示，使用Ezh2(圖22A)和H3-3meK27(圖22B)作為標記的鄰近配對的時間圖解。ImmunoFISH使用與Ezh2或H3-3meK27抗體(紅色)組合的Xic探針(綠色)。X-X分布特徵在右側顯示。
圖23的一系列圖顯示在d0天到d6天時突變Tsix和Xite ES細胞的X-X分布特徵。這些圖顯示Tsix和Xite介導配對。
圖24是β珠蛋白基因座圖，其中3C引物通過箭頭顯示且BamHI位點通過箭標顯示。
圖25的一系列圖顯示從d0到d4所示轉基因雌性ES細胞的X-X分布特徵。
圖26的一系列圖像顯示雌性轉基因ES細胞在分化條件下甚至在第5天時仍維持未分化形態學。ns11(載體)和ns82(Tsix啟動子)用作陰性對照。
圖27的一系列圖像顯示雄性轉基因ES細胞在分化條件下沒有顯示對於雌性ES細胞可見的相同未分化形態學。
圖28的一系列圖顯示細胞中的Tsix和Xite的所有亞片段之間的配對，除了ES ns82(只有Tsix啟動子)之外。異位X-A配對抑制內源X-X配對。
圖29A-I顯示Tsix啟動子的雜合缺失對選擇沒有明顯作用。圖29A是關於Tsix啟動子刪除的靶向方案的示意圖。RVEcoRV，BBamHI。探針1和2的位置由編號的灰色矩形指出。實心和空心三角分別表示FRT和LoxP位點。圖29B顯示來自雌性克隆的基因組DNAs的DNA印跡分析，所述基因組DNA用EcoRV消化和用探針1探測。圖29C顯示來自小家鼠(M.musculus)(129)或M.castaneus(cast)肝的基因組DNAs、和來自野生型或靶向的雌性ES細胞的DNA的DNA印跡分析，所述DNA用BamHI消化和用探針2探測。圖29D顯示來自雄性克隆的基因組DNAs的DNA印跡分析，所述基因組DNA用EcoRV消化和用探針1探測。圖29E顯示基於ScrFI和MnlI SNPs在2個位置上的Tsix表達的等位基因特異性分析。圖29F的一系列圖顯示雄性細胞中的Tsix表達的實時RT-PCR定量。所有樣品對內部對照Rpo2進行標準化。誤差條指示1個標準差。圖29G顯示關於雌性細胞系中的Xist(頂端)或Mecp2(底部)的等位基因特異性RT-PCR。分化天數如所示的。圖29H顯示在圖29G中所示實驗中來自129等位基因的Tsix RNA級分。圖29I的一系列圖像顯示在第8天時雌性ΔPneo細胞的RNA/DNA FISH。Xist RNA，綠色；Neo DNA，紅色。每種XCI模式的百分比在小圖右側指出(括號中是取樣的核數目)。n＝138。
圖30A-E顯示DXPas34是保守的，且具有與轉座元件(TEs)的相似性。圖30A是在DXPas34上小鼠(x軸，AJ421479的138,745-141,000)對大鼠(y軸，N_W048043的51,001-53,300)序列的點圖。顯示了不同重複簇的位置。圖30B顯示如對於每個物種測定的共有重複序列。人重複A，SEQ ID NO40；小鼠重複A1，SEQ ID NO28；小鼠重複A2，SEQ ID NO29；小鼠重複B，SEQ ID NO30；大鼠重複A，SEQ ID NO31；大鼠重複B，SEQ ID NO32。圖30C顯示小鼠(x軸，AJ421479的bp134,001-141,000)對人(y軸，NT_011669的bp 11,328,000-11,352,000)的點圖分析。區域2和3如所標記的(Lee等人，Cell 9947-57(1999))。在y軸上標出人序列中的14kb插入，連同包含A重複(灰色框)的區域。圖30D顯示了人A重複區域的示意圖，顯示ERV/LTRs和SINEs(亮和暗灰色框)以及A重複單位(黑色三角)的位置。顯示了代表性的ERV/LTR序列(NT_011669的bp 11345000-11348700；SEQ ID NO43)，其中A重複用框圈出。圖30E顯示人重複A(SEQ ID NO40)完全匹配人HERVL重複(SEQ ID NO44)的相應區域。小鼠DXPas34(A1基序)(SEQ ID NO28)同樣顯示與人HERVL(27bp中的4個錯配)和小鼠MERVL/RatERVL(5個錯配)(SEQID NO45)的極佳比對。
圖31A-E顯示DXPas34展示雙向啟動子活性。圖31A是Tsix 5』區域的示意圖，顯示了DXPas34、對於鏈特異性RT-PCR使用的引物對的位置(星號數字)、和相關限制位點(AAge I，SSalI，MMluI)。顯示了螢光素酶測定中使用的DXPas34片段。螢光素酶活性對β半乳糖苷酶且隨後對Tsix啟動子螢光素酶構建體進行標準化。誤差條指示1個標準差。圖31B顯示如圖31A中所示的Rrm2或Tsix 5』區域的鏈特異性RT-PCR結果。有義(s)和反義(as)鏈在每個柱的上方指出。圖31C顯示檢測Dxpas-r的5』RACE的結果。M標記，5』5』RACE擴增產物。具有主要和次要起始位點的代表性DXPas34區組序列由重和輕箭標指出(SEQ ID NO46)。有下劃線的是包含起始位點的重複A1單位。圖31D顯示用tagetin(T)處理8小時或α鵝膏毒環肽處理4或8小時(分別為α4和α8)的ES細胞的RT-PCR結果。Tsix和Dxpas-r在位置2上檢測到。18S RNA(PolI轉錄物)作為裝載對照進行平行擴增。圖31E顯示在位置2上擴增來自指示樣品的RNAs的RT-PCR結果。
圖32A-F顯示的DXPas34的靶向缺失使Tsix轉錄減少。圖32A的圖顯示關於DXPas34缺失的靶向方案。這個基因座的前3個等位基因在上方以灰色顯示(Debrand等人，Mol.Cell Biol.198513-8525(1999)；Lee等人，Cell 9947-57(1999)；Sado等人，Development 128 1275-1286(2001))。相關限制位點是SStuI，BBamHI，RVEcoRV。探針由灰色框指出。圖32B顯示用StuI消化和用探針1檢測的來自雌性和雄性克隆的基因組DNAs。圖32C顯示用EcoRV消化和用探針2檢測的基因組DNAs。圖32D顯示用BamHI消化和用探針2探測的雌性基因組DNAs，以測定哪個等位基因被靶向。圖32F的放射自顯影圖顯示在未分化的雄性細胞中在位置A和B上的定量實時RT-PCR分析(如圖29E中所示)。圖32的一系列圖顯示如圖31B-E中所述，對指示基因型的雄性細胞的鏈特異性RT-PCR分析的結果。位置2在ΔDXPas34缺失區域內且因此從分析中省略。
圖33A-C顯示DXPas34缺失導致非隨機XCI模式。圖33A的一系列圖像顯示在第12天時雌性ΔDXPas34細胞的RNA/DNA FISH。Xist RNA，綠色；DXPas34 DNA，紅色。每種XCI模式的百分比在小圖右側指出(括號中的核數目)。n＝48。圖33B-33C顯示如圖29G中所述關於Xist(圖33B)或Mecp2(圖33C)的等位基因特異性RT-PCR分析。注ΔDXPas34實驗對圖29G中呈現的細胞系平行進行；因此，對照放射自顯影圖是相同的。圖表指出在第12天時對於多分化實驗來自129染色體的轉錄百分比。空心圈表示個別實驗；實心圈表示平均值，其中1個標準差由誤差條指示。如所示的樣品的逐對比較通過斯氏t檢驗來進行(底部)。
圖34A和B顯示分化後期DXPas34缺失使Tsix去阻抑。圖34A顯示在分化期間野生型和ΔDXPas34雌性的ScrFI多態性上的等位基因特異性Tsix RT-PCR。圖34B的一系列圖顯示在細胞分化期間來自129(左側小圖)或castaneus(右側小圖)的Tsix RNA的等位基因級分。誤差條指示1個標準差。
圖35A的示意圖顯示在細胞分化期間DXPas34如何調節Tsix表達的3步驟模型，其中DXPas34的2個增強子和2個功能在序列中發揮作用以控制Tsix動力學的不同方面。這個模型提出二分增強子在前XCI細胞中發揮作用以完成雙等位基因(biallelic)Tsix表達。Xite增強子在這個期間可能也發揮作用，但它直到XCI開始時才是絕對需要的，這時它的作用使得Tsix表達能夠在未來Xa上持續。XCI確立後，Tsix的穩定表達需要DXPas34的晚期的陰性功能。在這個模型中，Dxpas-r的反平行轉錄導致Tsix的阻抑，可能通過類似的反義機制。圖35B的示意圖顯示Tsix如何指派反轉錄轉座元件用於其調節的模型。約8千萬-2億年前，反轉錄轉座子(rTE)偶然插入原始Tsix基因5』端附近的Xic內。每個TE是包含啟動子、增強子和隔離子的自給自足型基因表達模塊，插入引入指派調節Tsix的調節元件譜(repertoire)(例如CTCF位點、Tsix增強子、和可變啟動子(Chao等人，Science 295345-347(2002)；Stavropoulos等人，Mol.Cell Biol.252757-2769(2005))。隨著時間過去，rTE可能喪失幾乎所有其原始序列，除了保留用於調節Tsix的那些。保留的元件在這個過程期間重複加倍以產生現在的DXPas34。
圖36顯示關於在Xite內存在小RNAs的RNA印跡分析，如示意圖中所示，左側的1個用let7探針探測，且右側的1個用Xite探針探測。Xite內的小RNAs用箭標指出。let7b印跡是顯示已知miRNA(let7b)可以被檢測的陽性對照。注意對於Xite小圖，小RNAs可以使用指出小RNAs是雙鏈的有義和反義探針進行檢測。顯示的細胞系是來自Lee，Science(2005)同上、和Xu等人Science(2006)同上、以及Ogawa和Lee Mol.Cell.(2003)同上的那些。簡言之，J1，野生型雄性ES；16.7，野生型雌性ES；J1-ΔCpG是Tsix-缺失的雄性ES；16.7Δ/Δ是Tsix-/-雌性ES；ΔL(Xite)是Xite的12.5kb缺失；雌性-Tsix3.7是具有在Tsix等位基因中缺失的3.7kb Tsix序列的轉基因雌性ES；雌性-Xite是具有5.6Xite轉基因的轉基因雌性ES。泳道0、4、10指關於每種細胞系的細胞分化天數。
詳述 由於其無限自我更新和分化成大量細胞和組織類型的能力，幹細胞具有巨大的臨床潛能。它們在再生療法和基因療法中的潛在用途幾乎是無限的，但取決於控制以其他方式不可逆的分化過程的能力。
本發明的特徵在於用於控制此類分化的方法，其通過引入Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite轉基因或其片段，或來源於Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite的小RNA以抑制分化來實現。這允許有足夠時間根據需要處理幹細胞以用於治療或研究用途。轉基因的後續去除允許誘導幹細胞分化成所需細胞或組織類型，且給患者施用。
轉基因 本發明基於下述發現將具有Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite序列或其片段的轉基因引入幹細胞內抑制分化。在本發明中有用的轉基因可以包括任何Xic、Tsix或Xite核酸序列，或具有Tsix和Xite序列的部分或全部的Tsix/Xite核酸序列。
Tsix和Xite是在稱為X失活中心(Xic)的主調節區中發現的非編碼順式作用基因。這個區域包含許多罕見的非編碼基因，包括Xist、Tsix和Xite，所述非編碼基因一起發揮作用以確保XCI只在XX雌性中、只在1條染色體上、且以發育特異性方式發生。這些基因各自產生RNA而不是蛋白質。Xist只由將來失活的X產生，且產生「包被」失活X的20kbRNA，從而開始基因沉默過程。Tsix是Xist的反義調節物，且通過阻止Xist RNA沿著X染色體擴展來發揮作用。因此，Tsix指定未來的活性X。Xite連同Tsix一起發揮作用以確保X的活性狀態。Xite產生一系列基因間RNAs且呈現特別的染色質構象。它的作用增強了反義Tsix的表達，從而與Tsix協同指定未來的活性X。此外，Tsix和Xite通過如本文所述的X-X配對一起發揮作用，以調節XCI的計數和選擇方面。
具有Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite序列或其片段或組合的轉基因在本發明的方法中對於延遲或控制分化是有用的。應當指出儘管確定了Xic、Tsix、Xite或Tsix/Xite序列內的優選片段，但這個區域內的任何核酸序列在本發明的方法中都是有用的。本文呈現的數據鑑定這個區域關於阻斷X-X配對、計數和細胞分化的功能豐餘性，支持來自這個區域的任何片段的使用。例如，來自這個區域的可以抑制X-X配對的任何序列(例如，通過誘導從頭X轉基因配對)都可以用於阻斷分化。
優選的Xic轉基因序列的非限制性例子包括小鼠Xic(SEQ ID NO1)或人同線等價物(SEQ ID NO39)、πJL2(SEQ ID NO2)和πJL3(SEQ ID NO3)。
優選的Tsix轉基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同於全長小鼠Tsix基因(SEQ ID NO6)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同於下述小鼠Tsix基因片段的核酸例如高度保守區域(SEQ IDNO5)、pCC3(SEQ ID NO9)、p3.7(SEQ ID NO10)、DxPas34(SEQ ID NO12)、DxPas34的34bp重複(SEQ ID NO13)、DxPas34的68bp重複(SEQ ID NO14)、ns25(SEQ ID NO21)、ns41(SEQID NO22)、ns82(SEQ ID NO23)、小鼠重複A1(SEQ ID NO28)、小鼠重複A2(SEQ ID NO29)、小鼠重複B(SEQ ID NO30)、大鼠重複A(SEQ ID NO31)和大鼠重複B(SEQ ID NO32)。另一種優選的Tsix轉基因序列包括34bp或68bp DxPas34重複(分別為SEQ ID NOs13或14)的至少2個拷貝，以及至少3個拷貝、至少4個拷貝、和至少5個拷貝或更多。另外優選的Tsix轉基因序列包括至少基本上等同於以下人同線等價物的核酸序列全長人Tsix基因(SEQ ID NO36)、人重複A(SEQ ID NO40)，或其任何片段，和基本上等同於小鼠Tsix序列(SEQ ID NO6)或其片段的任何哺乳動物(例如，人、靈長類動物、牛、綿羊、貓和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物種變體、或同線變體的核酸序列。
如上文關於SEQ ID NOs13和14所述，應當指出對於任何片段，特別是較小的片段例如SEQ ID NOs28、29、30、31、32和40，轉基因可以包括序列的多個拷貝，例如以串聯繫列(例如，至少2個拷貝、至少3個拷貝、至少4個拷貝、和至少5個拷貝或更多)。小鼠重複A1(SEQ ID NO28)、小鼠重複A2(SEQ ID NO29)、小鼠重複B(SEQID NO30)、大鼠重複A(SEQ ID NO31)、大鼠重複B(SEQ ID NO32)和人重複A(SEQ ID NO40)都是DXPas34區域的部分，且包括結合轉錄因子CTCF所需的正規序列。圖30B中提供的這些DxPas小重複單位和任何ERV衍生的正規序列多聚體，因此被包括作為在本發明方法中有用的優選Tsix轉基因序列。
優選的Xite轉基因序列的非限制性例子包括至少基本上等同於全長小鼠Xite基因(SEQ ID NO15)或其片段的核酸序列，以及至少基本上等同於下述小鼠Xite基因片段的核酸例如pXite(SEQ ID NO16)、Xite增強子(SEQ ID NO17)、ns130(SEQ ID NO24)、ns135(SEQID NO25)、ns155(SEQ ID NO26)、ns132(SEQ ID NO27)。優選的Xite轉基因序列的另外非限制性例子包括基本上等同於人Xite基因(SEQ ID NO38)或其片段的核酸序列，和基本上等同於小鼠Xite序列(SEQ ID NO15)或其片段的任何哺乳動物(例如，人、靈長類動物、牛、綿羊、貓和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物種變體、或同線變體的核酸序列。
包括跨越2種基因全部或部分的區域或2種基因之間的間插區域的序列被稱為Tsix/Xite轉基因，且也可以在本發明方法中用作轉基因。非限制性例子包括具有跨越小鼠染色體的2種基因的整個關鍵區域的核酸，pSxn(SEQ ID NO4)、pCC4(SEQ ID NO11)、和二分增強子(SEQ ID NO19)。另外優選的Tsix/Xite轉基因序列包括基本上等同於Tsix(SEQ ID NO36)和Xite(SEQ ID NO38)的人同線等價物之間的間插區域的核酸序列。人Tsix/Xite轉基因序列的一個例子是pSxN人(SEQ ID NO37)。
優選片段顯示於下表1和2中。應當指出因為片段是非編碼區，所以序列的確切起始和結束並不重要。因此，對於所有片段，大小和核苷酸序列是近似值，且可以有1、2、5、10、20、30、40、50、100、150、200、250、500、750、1000或更多核苷酸的改變。還應當指出所有序列以5』至3』的方向呈現。
表1.小鼠和大鼠序列。
「N」指任何核苷酸 「Y」指任一嘧啶 「R」指任一嘌呤 *應當指出如圖5中所示的序列和GenBank登記號AJ421479在Zeste重複區域中具有3kB缺失。這個區域不能進行測序。這些坐標基於提供的序列且在序列中不包括3kB缺口。
表2.人序列 對於任何Xic、Tsix、Xite或組合Tsix/Xite轉基因序列，將理解還包括哺乳動物(例如，人、小鼠、靈長類動物、牛、綿羊、貓和犬)同源物、直向同源物、旁系同源物、物種變體、或同線變體。例如，人同線區域包括X染色體上鄰接人序列的約15兆鹼基(GenBank登記號NT_011669，SEQ ID NO34)。這些15兆鹼基序列包括人Xic區域以及Xic區域2個末端上的另外序列。Xist的同線等價物在GenBank登記號NT_011669的約核苷酸11,390,576-11,358,483(SEQ ID NO35)處發現。包括人序列中的Tsix和Xite的關鍵區域預測來自GenBank登記號NT_011669的約核苷酸11,358,483-核苷酸11,300,000(pSxN，人，SEQID NO37)。Tsix(SEQ ID NO36)的同線等價物在NT_011699的約核苷酸11,329,000-11,393,000處發現，且Xite(SEQ ID NO38)的同線等價物在NT_011669的約核苷酸11,320,000-11,333,000處發現。在本發明方法中有用的轉基因可以使用關於轉基因阻斷X染色失活或分化能力的測定進行鑑定。此類測定是本領域已知的且例子在本文中描述。
RNA幹擾(RNAi) 本發明基於XCI過程破壞可以阻斷分化的發現。用於幹擾XCI的一種方法包括針對Xic、Tsix、Xite或Xist的小RNA分子例如siRNA的使用，將所述小RNA分子引入幹細胞內且阻止幹細胞經歷X染色失活和在培養中分化。此類小RNA分子的使用避免了去除轉基因的需要，因為小RNA分子具有有限的半衰期且將自然降解。
RNAi是通過引入雙鏈RNA(dsRNA)開始的轉錄後基因沉默形式。一般稱為「siRNAs」、「小RNAs」或「微小RNAs(microRNAs)」的15-32個核苷酸的短雙鏈RNAs，在線蟲(Zamore等人，Cell 10125-33)和哺乳動物組織培養細胞系(Elbashir等人，Nature 411494-498，2001，在此引入作為參考)中有效下調基因表達。這種方法在哺乳動物中的進一步治療效力通過McCaffrey等人(Nature 41838-39.2002)在體內證實。小RNA長度為至少15個核苷酸，優選地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35個核苷酸，且長度甚至最高達50或100個核苷酸(包括在中間的所有整數)。基於下述發現Tsix、Xite以及Xist元件被轉錄和這些區域的部分顯示雙向轉錄，因而具有形成隨後可以經歷RNAi途徑的雙鏈RNAs的潛能，基本上等同於Xic、Tsix、Xite或Xist的任何區域，或與Xic、Tsix、Xite或Xist的任何區域互補的此類小RNAs，包括在本發明中。事實上，對應於Xite區域、大小小於25nt-約100nt的小非編碼RNAs(ncRNAs)已由有義和反義鏈鑑定(參見圖36)。此外，Xic、Tsix Xite、或Tsix/Xite、或兩者的轉錄或ncRNA產物已顯示是XCI期間配對所需的。
因此，本發明包括任何小RNA，其基本上等同於Xic、Tsix、Xite或Xist的任何區域，優選本文所述以及表1和2中所示區域的長度上至少15個核苷酸，優選地，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個核苷酸，及長度上甚至最高達50或100個核苷酸(包括在中間的所有整數)。本發明還包括此類小RNA分子阻斷分化的用途。應當指出，如下所述，可以使用被加工成此類小RNAs的較長dsRNA片段。有用的小RNAs可以使用本文所述方法，通過其阻斷分化、阻斷配對、或阻斷XCI的能力來鑑定。小RNAs還可以包括短髮夾RNAs，其中siRNA雙鏈體的2條鏈都包括在單個RNA分子內。
小RNA的具體需要和修飾是本領域已知的，且例如在PCT
發明者J·T·李 申請人:綜合醫院公司