螢光壽命表觀遺傳學測定的製作方法

2023-06-20 12:12:11 1

螢光壽命表觀遺傳學測定的製作方法
【專利摘要】本發明涉及基於測量螢光壽命(FLT)來測定酶活性的方法。特別地，本發明涉及對能夠修飾肽底物結構之酶的測定，所述酶包括例如催化肽底物之甲基化、脫甲基化、乙醯化、脫乙醯化或脫亞氨化的酶。
【專利說明】螢光壽命表觀遺傳學測定
【技術領域】
[0001]本發明涉及基於測量突光壽命(flurescence lifetime, FLT)來測定酶活性的方法。特別地，本發明涉及對能夠修飾肽底物結構之酶的測定，所述酶包括例如催化肽底物之甲基化、脫甲基化、乙醯化、脫乙醯化或脫亞氨化(deimination)的酶。
【背景技術】
[0002]催化其他生物分子之結構修飾的酶是藥物發現的重要靶標。例如，催化蛋白質之翻譯後修飾的酶(特別是修飾組蛋白結構的酶)，由於其與人類疾病(例如神經變性和癌症)相關而成為有前景的藥物靶標。
[0003]構成組蛋白之胺基酸的翻譯後修飾在「表觀遺傳學(epigenetics) 」領域中特別重要，「表觀遺傳學」是由除基本DNA序列改變之外的機制引起的表型(外觀)或基因表達之可遺傳性改變的研究。遺傳物質需要保護、包裝以及用於調節過程(例如轉錄、複製和修復)的方法。在真核生物中，這些作用在很大程度上通過將基因組DNA裝配成核小體的組蛋白來實施。核小體與許多相關蛋白質包裝在一起以形成染色質纖維。每個核小體由幾乎纏繞圓柱形蛋白質核心兩次的DNA組成，所述蛋白質核心含有每種組蛋白(H2A、H2B、H3和H4)的兩個拷貝。組蛋白的N端尾區從其中存在結構性球狀結構域的核小體核心中伸出。
[0004]為了使組蛋白能夠調節多種過程，通過多種翻譯後修飾來改變組蛋白。雖然組蛋白修飾在整個序列中均發生，但是組蛋白的非結構性N端(組蛋白尾區)被特別高度地修飾。這些修飾包括乙醯化、甲基化、脫亞氨化、泛素化、磷酸化和蘇素化(sumoylation)。乙醯化是這些修飾中研究得最深入的。例如，通過組蛋白乙醯轉移酶(histoneacetyltransferase,HAT)乙醯化組蛋白H3尾區的K14和K9賴氨酸通常與轉錄能力相關。
[0005]組蛋白乙醯化調節多個細胞過程，並且特定的乙醯化模式產生不同的結果，例如，新合成的組蛋白上的乙醯化模式對於其通過組蛋白分子伴侶裝配成核小體來說是非常重要的。另外，染色質壓縮和摺疊的程度可受組蛋白H4第16位賴氨酸之乙醯化的調節。最後，組蛋白乙醯化對於基因轉錄來說是至關重要的。組蛋白的賴氨酸乙醯化通常涉及以較高的轉錄速率打開染色質結構。
[0006]組蛋白乙醯化受組蛋白乙醯轉移酶(HAT)活性和脫乙醯酶活性的調節，這對於多種組蛋白以及對於單個組蛋白上的特定位點具有不同偏好(參見Shahbazian和Grunstein (2007)Annual review of Biochemistry,第 76 卷:75-100)。
[0007]除乙醯化之外，組蛋白(特別是H3和H4)的甲基化對於染色質功能(例如基因表達、DNA複製和染色體分離)的調節也很重要。組蛋白H3的甲基化通常與染色質凝聚相關，從而導致轉錄抑制。
[0008]組蛋白僅在精氨酸和賴氨酸殘基上被甲基化。精氨酸可以被單甲基化或二甲基化，其中後者為對稱或不對稱構型。催化該過程的酶分為兩種類型，其中I型酶催化Ne-單甲基精氨酸殘基和不對稱Ne，Ne-二甲基精氨酸殘基的形成，而II型酶催化Ne-單甲基精氨酸殘基和對稱Ne，Ne-二甲基精氨酸殘基的形成。與精氨酸甲基化類似，ε-氮上的賴氨酸甲基化也可作為單甲基化、二甲基化或三甲基化形式而發生。
[0009]組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(PKMT)負責組蛋白H3和H4的甲基化並且利用稱為SET(Supressor of variegation,Enhancer of zeste,Trithorax)結構域的催化活性位點。SET結構域是參與調苄基因活性的130個胺基酸的序列。已證明該結構域與組蛋白尾區結合併引起組蛋白的甲基化。也可通過使用組蛋白賴氨酸脫甲基酶(PKDM)脫甲基化來操縱組蛋白H3和H4。這種最近鑑定的酶類中的一個家族具有稱為Jumonji結構域(JmjC)的催化活性位點。當JmjC利用多個輔因子使甲基水解時，發生脫甲基化，從而移除甲基。JmjC能夠使單甲基化、二甲基化和三甲基化底物脫甲基化。
[0010]有越來越多的證據將組蛋白甲基轉移酶(histone methyltransferase,HMT)和乙醯轉移酶(HAT)與不同病理狀況(從惡性腫瘤到神經病)聯繫起來。因此，鑑定這些酶的抑制劑可提供藥物發現的出發點。
[0011]肽基精氨酸脫亞氨酶(peptidyl arginine deiminase, PAD)是將底物蛋白質上的精氨酸殘基在翻譯後轉化為非標準胺基酸瓜氨酸的鈣依賴性酶的家族。PAD催化的瓜氨酸化(伴隨有帶正電亞氨基的喪失)將強鹼性精氨酸殘基轉化為中性胺基酸。認為由瓜氨酸化引起的鹼性電荷喪失破壞了底物蛋白質內的電荷分布並改變了所述蛋白質與其他分子相互作用的能力。通過PAD類酶使組蛋白H2A、H3和H4脫亞氨化抵消了精氨酸甲基化。特別地，PAD4同工型能夠催化組蛋白H2A、H3和H4上精氨酸殘基的瓜氨酸化(Thompson，P.R.和 Fast, ff.，ACS Chem Biol.2006，1，433-441)。因此，PAD 組的酶可在「組蛋白密碼(histone code) 」的修飾中發揮關鍵作用並因而影響基因轉錄。
[0012]PAD酶和瓜氨酸化蛋白質還與多種人類疾病(包括類風溼性關節炎、多發性硬化、阿爾茲海默病)相關並且(更最近地)與癌症相關(Vossaar, E.R.等，Citrullinationof synovial proteins in mouse models of rheumatoid arthritis(2003).ArthritisRheum,第 48 卷:2489-2500 ;Musse, A.A.等，Peptidyl arginine deiminase2(PAD2)over expression in transgenic mice leads to myelin loss in the centralnervous system(2008), Dis Model Mech.第 I 卷:229-240 ；Ishigami, A.等，Abnormalaccumulation of citrullinated proteins catalysed by peptidyl arginine deiminasein hippocampal extracts from patients with Alzheimer' s disease(2005)J NeurosciRes.第 80 卷；120-128 和 Chang X.等.Expression of peptidyl arginine deiminasetype4(PAD4)in various tumours(2006)Mol Carinog.第 45 卷:183-196)。
[0013]因此，持續需要用於修飾其他生物分子之結構的這類酶(特別是以上所總結的催化組蛋白修飾的酶類)的穩健(robust)且靈敏的測定。特別地，持續需要用於此類酶的穩健、靈敏的測定，其可容易地應用於高通量篩選形式，能夠高效地篩選酶抑制劑。
[0014]已報導了用於鑑定調節組蛋白修飾酶之活性的化合物的多種基於放射性的酶測定。例如，已開發了用於通過測量甲基從常規標記的輔因子S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)向組蛋白衍生肽底物上賴氨酸之ε-氨基殘基的轉移來監測組蛋白甲基轉移酶之活性的測定。然而，因為組蛋白甲基轉移酶可進行賴氨酸的單、二或三甲基化，所以測量放射性甲基的併入不提供最終反應產物之性質的信息。關於使用放射性測定和後續的放射性核素處理也具有重大危害。
[0015]已採用了質譜(MS)來研究組蛋白甲基轉移酶和組蛋白乙醯轉移酶的活性。使用、MS允許同時表徵由某些組蛋白甲基轉移酶產生的不同甲基-賴氨酸形式，即單、二或三甲基化賴氨酸。然而，該技術不適合於高通量篩選應用。
[0016]基於組蛋白H3衍生底物的體外酶修飾已開發了用於組蛋白乙醯化或甲基化的非放射性測定。在這樣的測定中，使用標記抗體進行甲基化反應產物的檢測。此類測定的實例是由 Perkin Elmer? 開發的 Lance Ultra? 測定和 AlphaLISA? 測定。
[0017]W02007/076302描述了用於肽基精氨酸脫亞氨酶活性的調節劑的高通量篩選。所述測定基於突光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)。
[0018]發明概述
[0019]本發明提供了基於測量螢光壽命(FLT)的酶(特別是能夠修飾肽底物結構的酶)活性測定，所述酶包括例如催化肽底物甲基化、脫甲基化、乙醯化、脫乙醯化或脫亞氨化的酶。
[0020]在本發明的第一方面中，提供了測定受試樣品中修飾酶(modifying enzyme)之活性的方法，其包括:
[0021](a)使受試樣品與突光受調節之酶底物(fluorescent-modulated enzymesubstrate)相接觸，所述酶底物包含與螢光部分和配置成調節螢光部分之螢光壽命的螢光壽命調節劑部分相綴合的接頭分子，其中底物通過修飾酶的作用來修飾以形成經修飾底物，由於修飾而使得所述經修飾底物的接頭分子對第二種酶的切割敏感或者保護其免於被第二種酶切割，其中通過第二種酶切割底物或經修飾底物將含有螢光壽命調節劑部分之底物的一部分與含有螢光部分之底物的一部分分開；以及
[0022](b)通過檢測由 第二種酶作用於經修飾底物和/或底物上引起的螢光部分之螢光壽命的變化來檢測經修飾底物的形成，其中經修飾底物的形成為修飾酶的活性提供了指
/Jn ο
[0023]在一些具體的實施方案中，所述方法可用於測定選自以下的修飾酶的活性:蛋白質甲基轉移酶、蛋白質乙醯轉移酶、脫亞氨酶、蛋白質脫甲基酶和蛋白質脫乙醯酶。更特別地，提供了用於以下酶類中每一種的測定:組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶(PKMT)、組蛋白-精氨酸N-甲基轉移酶(PRMT)、組蛋白乙醯轉移酶(HAT)、組蛋白脫甲基酶(特別是組蛋白-賴氨酸脫甲基酶(KDM)和組蛋白-精氨酸脫甲基酶)、組蛋白脫乙醯酶(HDAC)和肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)。
[0024]在本發明的第二方面中，提供了篩選修飾酶之抑制劑的方法，所述方法包括在受試化合物存在下使用根據本發明第一方面的方法測定所述修飾酶的活性，其中在受試化合物存在下酶活性的降低將受試化合物鑑定為所述修飾酶的抑制劑。
[0025]在一些具體實施方案中，所述方法可用於篩選選自以下的修飾酶的抑制劑:蛋白質甲基轉移酶、蛋白質乙醯轉移酶、脫亞氨酶、蛋白質脫甲基酶和蛋白質脫乙醯酶。更特別地，本文中提供了用於篩選以下酶類的抑制劑的方法:組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶(PKMT)、組蛋白-精氨酸N-甲基轉移酶(PRMT)、組蛋白乙醯轉移酶(HAT)、組蛋白脫甲基酶(特別是組蛋白-賴氨酸脫甲基酶(KDM)和組蛋白-精氨酸脫甲基酶)、組蛋白脫乙醯酶(HDAC)和肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)。
[0026]在本發明的第三方面中，提供了螢光受調節之酶底物，其包含與螢光部分和配置成調節螢光部分之螢光壽命的螢光壽命調節劑部分相綴合的接頭分子，其中所述底物通過修飾酶的作用來修飾以形成經修飾底物，由於修飾使得所述經修飾底物的接頭分子對第二種酶的切割敏感或者保護其免於被第二種酶切割，其中通過第二種酶切割底物或經修飾底物將含有螢光壽命調節劑部分之底物的一部分與含有螢光部分之底物的一部分分開。
[0027]在本發明的第四方面中，提供了這樣的試劑盒，其包含根據本發明第三方面的螢光受調節之酶底物和蛋白酶，所述蛋白酶能夠切割螢光受調節之酶底物或通過修飾酶作用於底物而形成的底物之經修飾形式，其中切割底物或經修飾底物將含有螢光壽命調節劑部分之底物的一部分與含有螢光部分之底物的一部分分開。
[0028]附圖簡述
[0029]圖1.示意性地舉例說明了用於測定脫亞氨酶類之酶的螢光壽命方法的一個實例。所述方法的這個具體實例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分並且使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。
[0030]圖2.示出為了測定PAD4脫亞氨酶活性而合成的螢光受調節之肽底物。
[0031]圖3.示出在PAD4測定緩衝液中肽I~3隨時間的螢光壽命測量數據。
[0032]圖4.舉例說明了肽I~3及其瓜氨酸化類似物的胰蛋白酶切割。將每種肽與不同濃度的胰蛋白酶(圖例中示出)一起孵育並隨時間監測螢光壽命:(A)肽I ; (B)肽2 ; (C)肽3。(D)在與5nM胰蛋白酶孵育後瓜氨酸化形式的肽I~3的螢光壽命。瓜氨酸化類似物包括以瓜氨酸替換精氨酸的肽序列I~3。
[0033]圖5.測定緩衝液中PAD4肽底物與相應瓜氨酸化產物的1:1混合物的RP-HPLC譜:(A)肽I ;⑶肽2 ; (C)肽3。注意:Arg =包含精氨酸的肽；Cit =包含瓜氨酸的肽。
[0034]圖6.以規律的間隔從包含肽I作為底物的PAD4測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘； (B) t = 30 分鐘；(C) t = 60 分鐘。
[0035]圖7.以規律的間隔從包含肽2作為底物的PAD4測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 30 分鐘；(C) t = 60 分鐘。
[0036]圖8.以規律的間隔從包含肽3作為底物的PAD4測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 30 分鐘；(C) t = 60 分鐘。
[0037]圖9.肽I作為底物之PAD4測定的RP-HPLC分析中的9AA標記肽主峰的電噴霧質譜。(A) t = O 分鐘，tE = 14.3 分鐘；(B) t = 60 分鐘，tE = 14.6 分鐘。
[0038]圖10.肽3作為底物之PAD4測定的RP-HPLC分析中的9AA標記肽主峰的電噴霧質譜。(A) t = O 分鐘，tK = 13.8 分鐘；(B) t = 60 分鐘，tK = 13.9 分鐘。
[0039]圖11.在與胰蛋白酶孵育之前和之後PAD4測定混合物螢光壽命的比較。包括無酶對照(減去PAD4)用於比較。
[0040]圖12.肽I作為底物的PAD4測定時間過程。㈧添加IOnM胰蛋白酶之前的螢光壽命；(B)與IOnM胰蛋白酶在室溫下孵育10分鐘之後的螢光壽命。
[0041]圖13.示意性地舉例說明了用於測定蛋白質賴氨酸甲基轉移酶(PKMT)和蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMT)的螢光壽命方法的實例。所述方法的這些實例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分並且使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。
[0042]圖14.示出為了測定G9a甲基轉移酶活性所合成的螢光受調節之肽底物。
[0043]圖15.評價了基於G9a螢光壽命的蛋白酶保護測定中作為底物的肽4~9。
[0044]圖16.肽4和9作為底物的G9a螢光壽命(FLT)蛋白酶保護測定。㈧在添加Endo-LysC蛋白酶之前作為G9a濃度之函數的FLT。(B)在與Endo-LysC孵育10分鐘後作為G9a濃度之函數的FLT。(C)在與Endo-LysC孵育60分鐘後作為G9a濃度之函數的FLT。(D)和(E)如同(B)和(C)，但是為了清楚起見擴展X軸並且包括未切割肽對照以證明蛋白酶保護的程度。
[0045]圖17.在以下間隔從包含肽4作為底物的G9a測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 6 小時。
[0046]圖18.在以下間隔從包含肽9作為底物的G9a測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 6 小時。
[0047]圖19.肽4作為底物之G9a測定的RP-HPLC分析中的9AA標記肽峰的電噴霧質譜。(A) t = O 分鐘，tE = 21.4 分鐘；(B) t = 6 小時，tE = 24.3 分鐘。
[0048]圖20.肽9作為底物之G9a測定的RP-HPLC分析中的9AA標記肽峰的電噴霧質譜。(A) t = O 分鐘，tE = 19.6 分鐘；(B) t = 6 小時，tE = 19.5 分鐘。
[0049]圖21.使用作為底物之肽4和不同濃度之G9a的測定時間過程。㈧在用2nMEndo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之後。
[0050]圖22.使用作為底物之肽9和不同濃度之G9a的測定時間過程。㈧在用2nMEndo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之後。
[0051]圖23.對於使用肽4和9作為底物進行的FLT G9a蛋白酶保護測定的作為SAM濃度之函數的平均壽命。
[0052]圖24.對於使用肽4和9作為底物進行的FLT G9a蛋白酶保護測定的作為抑制劑濃度之函數的平均壽命。
[0053]圖25.示意性地舉例說明了用於測定蛋白質賴氨酸脫甲基酶(PKDM)和蛋白質精氨酸脫甲基酶(PRDM)的螢光壽命方法的實例。所述方法的這些具體實例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分並且使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。
[0054]圖26.示出了用於測定作用於賴氨酸-36的JHDMlA賴氨酸脫甲基酶的基於H3N端尾區序列的螢光壽命底物。
[0055]圖27.示意性地舉例說明了用於測定組蛋白乙醯轉移酶的螢光壽命方法的實例。所述方法的這一具體實例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分並且使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。
[0056]圖28.示出了用於測定使賴氨酸-14乙醯化之HAT酶的基於H3N端尾區序列的建議的螢光受調節之肽底物。
[0057]圖29.示意性地舉例說明了用於測定組蛋白脫乙醯酶的螢光壽命方法的實例。所述方法的這一具體實例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分並且使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。
[0058]圖30.不出了用於通過FLT 蛋白酶保護法(FLT protease protection approach)測定HDAC的所建議的螢光受調節之肽底物。Xaa =任意胺基酸。
[0059]圖31.以規律的間隔從包含肽I作為底物的PAD2測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜:(A) t = O 分鐘；(B) t = 30 分鐘；(C) t = 120 分鐘。
[0060]圖32.肽I作為底物之PAD2測定的RP-HPLC分析中的9AA標記肽主峰的電噴霧質譜。(A) t = O 分鐘，tE = 14.4 分鐘；(B) t = 120 分鐘，tE = 14.7 分鐘。[0061]圖33.在與胰蛋白酶孵育之後PAD2測定混合物的螢光壽命測量。包括僅有肽的對照用於比較。
[0062]圖34.肽I作為底物的PAD2測定時間過程。
[0063]圖35.在與Endo-LysC孵育後肽10作為底物的JHDMlA測定混合物的螢光壽命測量。包括僅有肽的對照用於比較。
[0064]圖36.以規律的間隔從包含肽12作為底物之Set7/9測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC譜的疊加。(a) t = O小時；(b) t = 2小時；(c) t = 6小時。
[0065]圖37.肽12作為底物之Set7/9測定的RP-HPLC分析中的9AA標記肽主峰的電噴霧質譜。(A)t = O小時，tK = 18.3分鐘；(B)t = 6小時，tK = 18.4分鐘。
[0066]圖38.在與Endo-LysC孵育後Set7/9測定混合物的螢光壽命測量。包括僅有肽的對照用於比較。
[0067]圖39.使用作為底物之肽12和不同濃度之Set7/9的測定時間過程。㈧在用2nMEndo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之後。
[0068]圖40.使用作為底物之肽13和不同濃度之Set7/9的測定時間過程。㈧在用2nMEndo-LysC切割之前；(B)在用2nM Endo-LysC切割之後。
[0069]圖41.對於使用肽13作為底物進行的FLT Set7/9蛋白酶保護測定的作為SAM濃度之函數的平均壽命。
[0070]圖42.對於使用肽13作為底物進行的FLT Set7/9蛋白酶保護測定的作為SAH抑制劑濃度之函數的平均壽命。
[0071]圖43.對於使用肽13作為底物進行的FLT Set7/9蛋白酶保護測定的V -因子。
[0072]圖44.示出了為了測定Set7/9甲基轉移酶活性所合成的螢光受調節之肽底物。
[0073]圖45.通過不同濃度的Endo-ArgC切割肽15的相對於時間的平均壽命。
[0074]圖46.以規律的間隔從包含肽15作為底物之PRMT5測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC 譜的疊加。(a) t = O 小時；(b) t = 3.5 小時；(c) t = 17.5 小時。
[0075]圖47.包含肽15作為底物之PRMT5測定的RP-HPLC分析中的9AA標記肽主峰的電噴霧質譜。(A) t = O小時，tE = 20.0分鐘；(B) t = 17.5小時，tE = 20.3分鐘。
[0076]圖48.在與Endo-ArgC孵育後PRMT5測定混合物的螢光壽命測量。包括僅有肽的對照用於比較。
[0077]圖49.使用作為底物之肽15和不同濃度之PRMT5的測定時間過程。㈧在用
1.25nM Endo-ArgC 切割之前；(B)在用 1.25nM Endo-ArgC 切割之後。
[0078]圖50.示出了為了測定PRMT5甲基轉移酶活性所合成的螢光受調節之肽底物。
[0079]圖51.對於使用肽15作為底物進行的PRMT5FLT蛋白酶保護測定的作為西奈芬淨(sinefungin)抑制劑濃度之函數的平均壽命。
[0080]圖52.用Endo-LysC切割肽16的相對於時間的平均壽命。
[0081]圖53.示出了為了測定PCAF乙醯轉移酶活性所合成的螢光受調節之肽底物。
[0082]圖54.用Endo-LysC切割肽17的相對於時間的平均壽命。
[0083]圖55.在(A) O分鐘、(B) 30分鐘、(C) 60分鐘、(D) 90分鐘間隔從包含肽17作為底物的PCAF測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC譜。
[0084]圖56.肽17作為底物之pCAF測定的RP-HPLC分析中的峰的電噴霧質譜。(A) tE=16.1 分鐘；(B) tE = 16.7 分鐘。
[0085]圖57.使用作為底物之肽17和不同濃度之PCAF的測定時間過程。㈧在用25nMEndo-LysC切割之前；(B)在用25nM Endo-LysC切割之後。
[0086]圖58.測定用於使用肽17作為底物的PCAF FLT蛋白酶保護測定的AcCoA的Km (app)。
[0087]圖59.示出了為了測定HDACl脫乙醯酶活性所合成的螢光受調節之肽底物。
[0088]圖60.脫乙醯化的產物肽。
[0089]圖61.用不同濃度的胰蛋白酶切割肽18⑷和肽19⑶的相對於時間的平均壽
命O
[0090]圖62.以規律的間隔從包含肽18作為底物之HDACl測定混合物中取出的樣品的RP-HPLC譜的疊加。
[0091]圖63.在室溫下孵育2小時後肽18之HDACl測定的RP-HPLC分析中的峰的電噴霧質譜。㈧tK = 19.1分鐘；⑶tK = 21.2分鐘。
[0092]圖64.使用作為底物之肽18和不同濃度之HDACl的測定時間過程。㈧在用IOnM胰蛋白酶切割之前；(B)在用IOnM胰蛋白酶切割之後。
[0093]圖65.確定使用肽18作為底物的HDAC1FLT蛋白酶保護測定的底物KM。
[0094]圖66.使用肽18作為 底物進行的HDAC1FLT蛋白酶保護測定的作為TSA抑制劑濃度之函數的平均壽命。
[0095]圖67.對於使用肽18作為底物進行的HDAC1FLT蛋白酶保護測定的V -因子。
[0096]圖68.示出了為了測定EZH2甲基轉移酶活性所合成的螢光受調節之肽底物。
[0097]圖69.用不同濃度的Endo-LysC切割肽20的相對於時間的平均壽命。
[0098]圖70.使用作為底物之肽20和不同濃度之EZH2複合體的測定時間過程。
[0099]圖71.確定用於使用肽20作為底物的EZH2FLT蛋白酶保護測定的SAM的KM(app)。
[0100]圖72.使用肽20作為底物進行的EZH2FLT蛋白酶保護測定的作為SAH抑制劑濃度之函數的平均壽命。
[0101]圖73.確定PAD4FLT蛋白酶保護測定中肽I的底物KM。
[0102]圖74.對於使用肽I作為底物進行的PAD4FLT蛋白酶保護測定的V -因子。
[0103]圖75.對於使用肽9作為底物進行的G9a FLT蛋白酶保護測定的V -因子。
[0104]發明詳述
[0105]本文中提供了用於測定酶(本文中是指修飾酶)活性的方法，其基於檢測與修飾酶底物相連接之螢光部分的螢光壽命的變化。
[0106]所述方法包括:首先使已知包含或懷疑包含修飾酶的受試樣品與底物相接觸，所述底物通過修飾酶的作用來修飾以形成經修飾底物。底物和通過修飾酶作用於底物而形成的經修飾底物的結構不同，使得底物和經修飾底物的一種或另一種(但不是兩種)在位於螢光部分與壽命調節劑部分之間的切割位點上可被第二種酶切割，而另一種在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間的任何位置處都被保護而免於被第二種酶切割。因此可通過測定第二種酶對經修飾底物和/或形成經修飾底物之底物的作用來確定通過修飾酶作用於底物而形成經修飾底物形成。
[0107]本文使用的術語「受試樣品」簡單地指待測試修飾酶之活性的任何樣品。這可以例如是合適液體介質中酶的純樣品或半純樣品，例如酶緩衝液；或者它可以指待測試酶活性的生物樣品，例如，患者材料的臨床樣品。
[0108]使底物和通過修飾酶作用於底物而形成的經修飾底物與螢光部分和配置成調節螢光部分之螢光壽命的螢光壽命調節劑部分相綴合。在螢光部分連接位點與螢光壽命調節劑部分連接位點之間的切割位點上通過第二種酶切割底物或經修飾底物將底物分成至少兩部分；包括包含螢光部分的第一部分和包含螢光壽命調節劑部分的第二部分，使得調節劑部分不再調節螢光部分的螢光壽命。因此，測定的最終示值讀數(read out)是基於測量螢光部分的螢光壽命，其為第二種酶對經修飾底物(或底物)的作用提供了指示，進而為通過修飾酶作用於底物而形成經修飾底物提供指示。
[0109]術語「修飾酶」指能夠修飾底物以形成經修飾底物的任何酶，所述經修飾底物的結構不同使得底物和經修飾底物的一種或另一種(但不是兩種)在位於螢光部分與壽命調節劑部分之間的切割位點上可通過第二種酶的作用而被切割，而另一種在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間的任何位置處都被保護而免於被第二種酶切割。修飾酶通常是能夠修飾肽或蛋白質結構的酶，例如催化蛋白質或肽翻譯後修飾的酶。在本文中詳細描述的一些具體實施方案中，修飾酶可選自蛋白質甲基轉移酶、蛋白質乙醯轉移酶、脫亞氨酶、蛋白質脫甲基酶和蛋白質脫乙醯酶。更具體地，本文中所述的測定方法在一般情況下可用於測定催化組蛋白翻譯後修飾之酶的活性，這樣的酶是表觀遺傳學領域中的重要靶標。因此，在一些具體實施方案中，修飾酶可屬於以下酶類之一:組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶(PKMT)、組蛋白-精氨酸N-甲基轉移酶(PRMT)、組蛋白乙醯轉移酶(HAT)、組蛋白脫甲基酶(特別是組蛋白-賴氨酸脫甲基酶(KDM)和組蛋白-精氨酸脫甲基酶)、組蛋白脫乙醯酶(HDAC)和肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)。
[0110]底物包含與螢光部分和螢光壽命調節劑部分二者綴合的接頭分子。配置螢光部分和螢光壽命調節劑部分使得螢光壽命調節劑部分可調節螢光部分的螢光壽命。因此，底物在本文中可稱為「螢光受調節之底物」或「螢光受調節之酶底物」，這些術語可互換使用。
[0111]本文使用的術語「螢光部分」是指與螢光受調節之酶底物綴合的螢光標記。
[0112]因為本文中所述的測定使用基於螢光部分之螢光壽命變化的示值讀數，所以為了提高測定的動態範圍，選擇表現出長螢光壽命(在不存在任何壽命調節的情況下)的螢光部分可以是有利的，所述長螢光壽命通常大於IOns並且優選在IOns至25ns的範圍內。在本文的上下文中，「螢光壽命」定義為螢光團從激發態衰減至基態所耗費的平均時間。但是，使用表現出較短螢光壽命的螢光部分也明確地涵蓋在本發明的範圍之內。
[0113]優選的螢光部分包括但不限於:9_氨基吖啶及其衍生物，如W02007/049057所述(通過引用併入本文)；吖啶酮衍生物和喹吖啶酮衍生物，包括吖啶酮和喹吖啶酮化合物；以及使有技能的讀者導向的US7，727，739B2、W002/099432和W003/089663 (通過引用併入本文)中所述的另一些突光部分；B丫唳和B丫聢織| (acridinium)部分；得自於AssayMetricsLimited的Puretime?系列染料；如W002/081509 (通過引用併入本文)所述的p惡嗪(例如MR121、JA242、JA243)和羅丹明衍生物(例如JA165、JA167、JA169)。另一些實例(如W002/056670 所述)包括但不限於 Cy5、Cy5.5 和 Cy7 (Amersham) ；IRD41 和 IRD700 (Licor)；NIR-1 和 IC5_0Su(Dojindo) ；Alexa fluor660&Alexa fluor680(Molecular Probes)；LaJolla Blue (Diatron) ;FAR_Blue、FAR-Green One&FAR-Green Two (Innosense)；ADS790-NS 和 ADS821-NS (American Dye Source);親青綠(indocyanine green) (ICG)及其類似物(美國專利N0.5, 968, 479)；卩引哚三碳菁(indotricarbocyanine) (ITC,W098/47538);螢光量子點(硫化鋅包裹的硒化鎘納米晶體-QuantumDot Corp.)和螯合鑭系化合物(螢光鑭系金屬包括銪和鋱)。該列表旨在舉例說明而不是限制。
[0114]本文使用的術語「螢光壽命調節劑」意指當與螢光部分一起存在於螢光受調節之酶底物中時能夠改變螢光部分之螢光壽命的化合物、綴合物或部分。這種螢光調節的機制可以是但不限於:能量轉移、電子轉移或分子相互作用或其組合。優選的螢光壽命調節劑包括但不限於:吲哚基部分及其衍生物，包括胺基酸色氨酸側鏈中存在的吲哚基部分；酚部分及其衍生物，包括胺基酸酪氨酸側鏈中存在的酚部分；咪唑部分及其衍生物，包括胺基酸組氨酸側鏈中存在的咪唑部分；苄基部分及其衍生物，包括胺基酸苯丙氨酸的苄基側鏈；苯氧基部分；萘基部分及其衍生物；萘基丙氨酸部分；咔唑部分和吩噻嗪部分。該列表旨在舉例說明而不是限制。
[0115]選擇螢光部分和螢光壽命調節部分使得與螢光壽命調節劑不存在時相比，在螢光壽命調節劑存在下螢光部分的螢光壽命降低。與螢光壽命調節劑不存在時相比，優選在螢光壽命調節劑存在下螢光部分的螢光壽命改變，並且更優選降低至少0.1ns，至少0.5ns,更優選至少2ns,更更優選至少5ns,或至少10ns。調節作用取決於突光受調節之酶底物中螢光部分與調節劑的鄰近和空間定向。沒有明確需要螢光壽命調節劑的吸收光譜與螢光部分的發射光譜重疊。相比之下，螢光共振能量轉移(FRET)過程不僅需要供體部分與受體部分之間鄰近，還需要受體部分的吸收光譜與供體部分的發射光譜之間的光譜重疊。
[0116]顯著的調節作用(例如，螢光部分的螢光壽命改變5ns或更大)是酶測定動態範圍的重要決定因素。在這一點上，調節程度(即當調節劑存在時螢光部分螢光壽命改變的幅度)可比螢光部分螢光壽命的絕對長度更為重要。因此，如果選擇螢光部分/調節劑的組合使得調節劑部分使螢光部分的螢光壽命縮短非常大的程度，(例如，由於調節而產生至少2ns的差異)，則螢光部分之螢光壽命的絕對長度可能不是至關重要的。因此，如果當調節不存在下表現出相對「短的」突光壽命的螢光部分(例如，小於10ns，或小於5ns)和調節劑二者均與接頭綴合時所選擇的調節劑引起螢光壽命顯著降低(例如，2ns或更多)，則所述螢光部分仍然可被用於熒 光受調節之底物。
[0117]但是，因為由螢光化合物文庫、自發螢光或內濾效應產生的螢光測定中的背景幹擾通常具有約5ns或更小的短壽命，所以使用螢光壽命長(> IOns)的螢光團可具有優點。的確，與基於突光強度的方法(例如但不限於FRET和突光偏振)相比,基於突光部分之壽命來區分這種背景幹擾與化合物幹擾的能力在該領域中可看作是該技術的一個關鍵優點。與通常不可能區分的螢光壽命短的螢光團相比，螢光壽命長的螢光團有助於背景螢光與化合物幹擾的這種區分。
[0118]選擇用於包含在螢光受調節之底物中的螢光部分與螢光壽命調節部分的合適組合使得螢光部分的螢光壽命在螢光壽命調節劑存在下降低。當選擇適當組合時，強調對於螢光壽命調節劑的吸收光譜與螢光部分的發射光譜重疊沒有明確需要。如果對於具體的酶測定合適，則螢光受調節之底物可包含多於一種的螢光部分和/或多於一種的螢光壽命調節劑部分。
[0119]用於包含在螢光受調節之酶底物中的螢光部分與螢光壽命調節劑部分的優選組合包括但不限於:螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)和調節劑部分吲哚基部分(特別是色氨酸殘基的吲哚基側鏈)、螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)和調節劑部分萘基丙氨酸或其衍生物、螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)和調節劑部分咔唑部分或其衍生物、以及螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)和調節劑部分吩噻嗪或其衍生物。另一些合適的組合包括螢光部分吖啶酮或其衍生物和調節劑部分吲哚基部分(特別是色氨酸殘基的吲哚基側鏈)，並且還包括螢光部分喹吖啶酮或其衍生物和調節劑部分吲哚基部分(特別是色氨酸殘基的吲哚基側鏈)。已表明基於吖啶酮的螢光團的螢光壽命受色氨酸殘基之吲哚基側鏈的調節(W003/089663 ；Hassiepien,U 等.Screening.第 4 卷，2009,11 ;Doering，K.等.J Biomol.Screen.,2009,14，I)。所列組合中的任何一種可包含在本文中所述的螢光受調節之酶底物(包括以下定義的基於結構的特定底物)中的任何一種中。為了避免疑問，明確地指出前述章節中所述的螢光部分/調節劑部分的組合可對應於下文中使用的結構定義中的部分Fl和M。
[0120]螢光受調節之酶底物的接頭分子組分用來使螢光部分和螢光壽命調節劑部分以適當構造定位以實現螢光部分之螢光壽命的有效調節。接頭分子也可以是修飾酶修飾螢光受調節之酶底物以形成經修飾底物的位點。
[0121]在一些優選實施方案中，底物的接頭分子組分是可通過修飾酶作用進行修飾以形成經修飾肽的肽接頭。在其中底物的接頭分子組分是肽接頭的一些實施方案中，由修飾酶作用產生的經修飾形式可稱為「經修飾肽接頭」。肽接頭可包含通過修飾酶之作用而修飾的至少一個胺基酸殘基。如以下詳細描述的，可通過修飾酶催化的肽修飾類型包括但不限於甲基化、脫甲基化、乙醯化、脫乙醯化和脫亞氨化。
[0122]通過修飾酶之作用而修飾的肽接頭內的胺基酸殘基一般存在於形成第二種酶(通常是蛋白酶)之識別位點的胺基酸序列環境中。定位第二種酶的識別位點使得切割發生在螢光部分和肽接頭之連接位點與螢光壽命調節劑部分和肽接頭之連接位點之間，使得在(底物或經修飾底物中的)切割位點處肽接頭的切割將螢光受調節之酶底物(或經修飾底物)分成包含螢光部分的第一部分和包含螢光壽命調節劑部分的第二部分。該分離的結果是，螢光壽命調節劑部分不再調節螢光部分的螢光壽命，從而可觀察到螢光部分的螢光壽命提聞。
[0123]包含肽接頭的螢光受調節之酶底物通常符合以下一般結構:
[0124]Fl-Xnl-N-Xn2-M 或結構 M-Xnl-N-Xn2-Fl，其中 Fl 和 M 的定向相反。
[0125]其中Xnl表示一個或更多個第一胺基酸序列，Fl表示與Xnl (或與Xn2,如果Fl和M的定向相反)綴合的螢光部分，N表示通過修飾酶之作用而修飾的胺基酸殘基，Xn2表示一個或更多個第二胺基酸序列，並且M表示與Xn2 (或與Xnl，如果Fl和M的定向相反)綴合的螢光壽命調節劑。在用修飾酶處理之後，底物被轉化為由以下一般結構表示的經修飾底物:
[0126]Fl-Xnl-Nmod-Xn2-M 或 M-Xnl-Nnwd-Xn2-Fl
[0127]其中Nnwd表示殘基N的經修飾衍生物。
[0128]螢光部分Fl與Xnl 「綴合」，同時螢光壽命調節劑部分M與Xn2 「綴合」，或者如果Fl與M相對於殘基N的位置相反則反之亦然。基本要求是Fl和M在底物切割後被分開。因此，術語「綴合」意指Fl可在由Xnl表示的胺基酸序列的任何部分內與底物的肽接頭相連接，並且M可在由Xn2表示的胺基酸序列的任何部分內與底物的肽接頭相連接，或者反之亦然。雖然包括這樣的結構，但是並不旨在將底物結構限制於其中Fl和M與肽接頭的C端和N端、殘基相連接的實施方案。Fl和M也可與Xnl或Xn2內的內部胺基酸殘基相連接。也可通過Xn2(當位置相反時為Xnl)中的胺基酸殘基側鏈提供螢光壽命調節劑M，其可以是肽接頭的內部殘基或C端殘基或N端殘基。例如，可通過合併到Xnl或Xn2中的色氨酸、酪氨酸、組氨酸或苯丙氨酸殘基的吲哚基、酚、咪唑和苄基側鏈來提供M。這種Fl和M定位的定義/解釋應適用於以下詳細描述的底物的所有具體實施方案。
[0129]選擇Xnl和Xn2使得最終結構Xnl-N-Xn2為修飾酶修飾殘基N提供適當的序列環境。如果修飾酶的活性具有高度序列依賴性，則其可適用於Xnl-N-Xn2的整個胺基酸序列，從而模擬修飾酶之天然底物的一部分的胺基酸序列。例如，如果修飾酶的天然底物是組蛋白，則Xnl-N-Xn2可模擬通過修飾酶之作用而修飾的胺基酸殘基周圍的組蛋白的短肽片段的序列。
[0130]另外，重要的是，序列Xnl-N-Xn2或經修飾形式Xnl-Nnwd-Xn2 (但不是二者)形成底物以在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間被第二種酶切割。在基於使用肽接頭的一些實施方案中，所述第二種酶通常是蛋白酶。本領域中可使用底物特異性不同的多種蛋白酶。因此，可選擇蛋白酶以匹配修飾酶催化的修飾的性質。對於正確操作測定至關重要的是，接頭由不被第二種酶切割的形式轉化為被第二種酶切割的形式(或反之亦然)僅取決於修飾酶的活性。因此，必須確保接頭在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間不包含允許第二種酶以不依賴於對殘基N之修飾的方式切割接頭的任何位點，以確保Fl與M通過接頭切割的分開關鍵取決於殘基N的修飾。不排除第二種酶可在底物或經修飾底物中其他地方的第二切割位點切割，其中在第二位點處的底物切割不依賴於底物的修飾。如果該第二位點處的切害I]王導致螢光部分與螢光壽命調節劑部分分開，則可允許在不依賴於底物修飾的第二位點處切割。例如，圖2所示的底物在位於發揮螢光壽命調節劑部分作用的色氨酸殘基(色氨酸的吲哚基側鏈)與肽C端之間的賴氨酸殘基處對胰蛋白酶的切割敏感。
[0131]由Xnl-N-Xn2表示的胺基酸殘基一起構成底物的肽接頭組分。肽接頭首先可由通過常規肽鍵連接的胺基酸殘基形成。胺基酸殘基自身可以是天然胺基酸殘基或非天然胺基酸殘基或其混合物。顯而易見地，要求是由N表示的胺基酸殘基可通過修飾酶的作用而修飾，但是也允許另一些胺基酸殘基的修飾，前提是底物仍然對殘基N處的修飾敏感。還可允許包含一個或更多個非肽鍵，前提是底物或經修飾底物中的肽接頭仍然可被第二種酶(例如，蛋白酶)切割。
[0132]另一個重要的要求是，在螢光受調節之酶底物的整體結構中使螢光部分Fl和螢光壽命調節劑部分M維持為適當的空間構型以實現部分M對部分Fl之螢光壽命的有效調節。通常，Fl和M 二者通過直接共價連接與肽接頭(Xnl-N-Xn2)相連接。W02007/049057 (通過引用併入本文)中描述了用於使突光部分與肽直接共價連接的合適方法。BioconjugateTechniques, G.T.Hermanson, Academic Press (1996)(其通過引用併入本文)中描述了將螢光部分與蛋白質和肽相連接的另一些方法。
[0133]在其中通過合併到Xnl或Xn2中的色氨酸、酪氨酸、組氨酸或苯丙氨酸殘基的吲哚基、酚、咪唑和苄基側鏈提供螢光壽命調節劑M的實施方案中，發揮充當調節劑M之側鏈作用的胺基酸殘基自身可形成由Xn2 (或Xnl，在其中Fl與M的位置相反的實施方案中)表示的胺基酸序列的一部分。因此充當螢光壽命調節劑M的胺基酸殘基可通過共價肽鍵與肽接頭的其餘部分相連接。
[0134]本文中所述測定平臺的具體優點在於，由Xnl-N-Xn2表示的肽接頭的胺基酸序列可適合於多種不同的目的修飾酶，而基於FLT檢測之測定的一般原則仍然為所有測定所共用。
[0135]可採用常規檢測方法來測量螢光壽命和螢光強度。這些方法包括使用光電倍增管(photomultiplier tube)作為檢測裝置的儀器。使用這些方法可以有數種途徑；例如:
[0136]i)基於時間相關單光子計數的方法(參見Principles of FluorescenceSpectroscopy,(第 4章)J R Lakowicz 編，第二版，1999, Kluwer/Academic Press)；
[0137]ii)基於頻域/相位調製的方法(參見Principles of FluorescenceSpectroscopy,(第 5 章)J R Lakowicz 編，第二版，1999, Kluwer/Academic Press);以及
[0138]iii)基於時閘(time gating)的方法(參見 Sanders 等,(1995)AnalyticalBiochemistry,227(2)，302-308)。
[0139]用於測量突光壽命的合適裝置是Edinburgh Instruments FLS920突光計和採用時間相關單光子計數法的Edinburgh Instruments NanoTaurus?突光壽命讀板器(Edinburgh Instruments, UK),以及還有利用時閘的 IOM Nanoscan。
[0140]可通過電荷稱合裝置(charge coupled device,CO))成像儀(例如掃描成像儀或面積型成像儀)進行螢光密度/螢光壽命的測量，以使多孔板中的所有孔成像。
[0141]通過螢光部分螢光壽命的變化來報導測定方法的示值讀數。在某些實施方案中，測定可基於測量平均螢光壽命，它是存在的所有螢光物質(即螢光受調節之底物，和通過修飾酶作用於底物而形成的經修飾底物，加上當螢光受調節之底物或經修飾底物被第二種酶(例如，蛋白酶)切割後所產生的螢光產物)的螢光壽命的組合。
[0142]應理解，經修飾底物(通過螢光受調節之底物的修飾酶作用形成)中螢光部分的螢光壽命長度與衍生其的螢光受調節之底物中螢光部分的螢光壽命長度基本上相同，原因是由修飾酶催化的修飾(例如，甲基化、乙醯化、脫甲基化、脫乙醯化、脫亞氨化)一般不顯著改變螢光部分和螢光壽命調節劑部分的定向，並因此不顯著改變螢光壽命調節的程度。在螢光受調節之底物和經修飾底物二者中的螢光部分的螢光壽命都受調節。僅當螢光受調節之底物或經修飾底物發生切割，使與螢光部分綴合的底物部分與與螢光壽命調節劑綴合的底物部分分開，破壞調節後，才可檢測到螢光壽命的變化。與螢光部分綴合的底物的切割部分表現出的螢光壽命比螢光受調節之底物更長。
[0143]因此，平均螢光壽命測量根據由於調節而表現出「縮短」螢光壽命的螢光物質(螢光受調節之底物加上經修飾底物)與表現出較長(未經調節)螢光壽命的螢光物質(與螢光部分綴合的被切割的底物部分)的相對比例改變而改變。用第二種酶處理後存在的「短」與「長」壽命螢光物質的相對比例與添加第二種酶時存在的「可切割的」螢光受調節之底物(或經修飾底物)直接相關。因此，它也與修飾酶的活性直接相關。當提及螢光壽命測量時，術語「長」和「短」是相對術語，指在不調節時和在螢光壽命調節劑存在下受調節時相同螢光部分的螢光壽命，並且不表示具體的絕對值。
[0144]在時間過程測定中，可觀察到與未經修飾底物相比，平均螢光壽命對應於100%未經修飾底物的t = O測量值隨時間提高或降低，這取決於經修飾底物對第二種酶(例如，蛋白酶)的切割敏感還是受到保護而免於被其切割。在終點測定中，與未經修飾底物相比，終點的平均壽命測量值可高於或低於對應於100%未經修飾底物的基線測量值，這取決於經修飾底物對第二種酶(例如，蛋白酶)的切割敏感還是受到保護而免於被其切割。[0145]作為測量平均壽命的替代方法，測定也可基於對特定組分之特徵性螢光壽命的測量。例如，可選擇僅測量存在的「長」螢光壽命組分的量。因為長螢光壽命是其中螢光部分與螢光壽命調節劑部分分開之切割產物的特徵，所以該測量可以與存在的經切割底物的量(以濃度為單位)直接相關。在時間過程測定中，可觀察到存在的長壽命特徵性組分(即與螢光部分綴合的切割產物)的絕對量相對於100%未經修飾底物的t = O測量值隨時間提高或降低，這取決於經修飾底物對第二種酶(例如，蛋白酶)的切割敏感還是受到保護而免於被其切割。在終點測定中，存在的長壽命特徵性組分(即與螢光部分綴合的切割產物)的絕對量可高於或低於對應於100%未經修飾底物的基線測量值，這取決於與未經修飾底物相比經修飾底物對第二種酶(例如，蛋白酶)的切割敏感還是受到保護而免於被其切割。
[0146]螢光壽命測量提供了超越僅基於定量螢光強度之常規螢光技術的顯著優勢。螢光壽命由相同光譜解析的強度信號確定，但是也另外地在時間域(temporal domain)中解析。該固有的螢光性質不取決於探針濃度和體積，並且不受自發螢光、光散射和內濾效應以及光漂白所影響。因此，該方法的固有性質應導致靈敏度更好的、更穩健的測定並且使來自螢光化合物庫的背景幹擾能夠儘可能小，導致藥物篩選應用中的假陽性更少。
[0147]現在經更詳細地描述測定的一些非限制性實施方案:
[0148](A)基於蛋白酶保護的測定
[0149]測定的第一組實施方案基於使用這樣的底物，其包含與螢光部分和配置成調節螢光部分之螢光壽命的螢光壽命調節劑部分相綴合的肽接頭分子，所述肽通過修飾酶的作用而修飾形成經修飾肽，其中_中的肽能夠被第二種酶(即，蛋白酶)切割，並且修飾酶對肽的修飾保護經修飾肽在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間免於被第二種酶(例如，蛋白酶)切割。在這樣的實施方案中，底逾在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間對第二種酶(蛋白酶)的切割敏感，底物的切割使得螢光部分的螢光壽命提高，但是通過修飾酶作用於底物而形成的經修飾底物在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間免於被第二種酶(蛋白酶)切割。因此，與未經修飾肽相比，蛋白酶處理後螢光部分之螢光壽命的時間依賴性降低表明形成了經修飾 肽(通過修飾酶作用於底物而形成)。
[0150]該測定的一些非限制性實施方案如下:
[0151](I)甲基轉移酶測定
[0152]在一個實施方案中，本文中所述測定方法可適用於測定甲基轉移酶的活性。
[0153]用於甲基轉移酶測定的底物包含肽接頭，並且可具有一般結構:
[0154]F1-X1-N1-X2-M (I)
[0155]其中Xl表示第一胺基酸序列，Fl表示與Xl綴合的螢光部分，NI表示通過甲基轉移酶之作用而甲基化的胺基酸殘基，X2表示第二胺基酸序列並且M表示與X2綴合的螢光壽命調節劑。在用甲基轉移酶處理之後，底物轉化為由以下一般結構表示的經修飾(甲基化)底物:
[0156]Fl-Xl-Nl (Me)-X2-M (II)
[0157]其中NI (Me)表示殘基N上的甲基化。
[0158]應理解,Fl和M實際上可以以任一定向存在。殘基NI通常是賴氨酸(在用於賴氨酸甲基轉移酶的測定的情況下)或精氨酸(在用於精氨酸甲基轉移酶的測定的情況下)。
[0159]選擇胺基酸序列Xl和X2 二者以將殘基NI放置在甲基化的適當序列環境中，並且為蛋白酶切割提供識別位點(未甲基化結構(I)中)，而且還提供螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)的最佳定向以實現Fl突光壽命的有效調節。Xl和X2的序列可基於用於待測定甲基轉移酶之天然底物的序列。
[0160]應理解，雖然為了有效調節螢光壽命，需要將螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)以適當間隔定位，但是沒有必要使螢光部分(Fl)或螢光壽命調節劑(M)存在於肽接頭的末端(N端或C端)。因此，Fl可與Xl中的胺基酸殘基相連接並且M可與X2中的胺基酸殘基相連接，或反之亦然。如果螢光壽命調節劑M自身由胺基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側鏈提供，則充當調節劑M的胺基酸殘基自身可形成由X2表示的胺基酸序列的一部分。胺基酸序列Xl和X2可包含天然或非天然胺基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。
[0161]在基於精氨酸甲基化之測定的情況下，由N表示的精氨酸殘基根據所討論精氨酸甲基轉移酶的活性可被單甲基化或二甲基化，後者為對稱構型或不對稱構型。甲基化的精確程度和二甲基化形式的構型對於測定的性能並不重要，因此在精氨酸甲基化的情況下，殘基N(Me)可代表單甲基化、二甲基化形式中的任何一種。
[0162]在基於賴氨酸甲基化之測定的情況下，由N表示的賴氨酸殘基根據所討論賴氨酸甲基轉移酶的活性可被單、二或三甲基化。甲基化的精確程度和二甲基化或三甲基化形式的構型對於測定的性能並不重要，因此在賴氨酸甲基化的情況下，殘基N(Me)可代表單、二或三甲基化形式中的任何一種。
[0163]在結構⑴的底物中，螢光部分Fl (其優選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的螢光部分)的螢光壽命受底物中螢光壽命調節劑M(M優選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。用在鄰近殘基NI (例如，賴氨酸或精氨酸)處切割的蛋白酶處理結構(I)的底物將引起蛋白質水解並且移除調節劑M對螢光壽命的調節。殘基NI (例如，賴氨酸或精氨酸)被適當的甲基轉移酶甲基化後，用蛋白酶處理結構(II)的經修飾肽不引起殘基NI後的切割並且螢光部分(Fl)的壽命仍受調節。在底物(I)持續轉化為經修飾底物(II)的情況下，如在時間過程測定中，螢光部分(Fl)的螢光壽命將作為時間(以及甲基轉移酶的濃度)的函數而降低。螢光壽命相對於100%未經修飾底物(I)的基線測量值的變化(降低)表明發生了底物(I)向經修飾底物(II)的一些轉化。該變化的幅度可因此用於評價由甲基轉移酶之作用引起的底物(I)向經修飾底物
(II)的轉化。
[0164]因此，本文中提供了一種測定蛋白質甲基轉移酶之活性的方法，其包括:
[0165](a)在允許螢光受調節之酶底物酶促轉化為通式(II)的經修飾底物的條件下使受試樣品與通式(I)的螢光受調節之酶底物相接觸
[0166]F1-X1-N1-X2-M (I)
[0167]其中Xl表示第一胺基酸序列，Fl表示與Xl綴合的螢光部分，NI表示通過甲基轉移酶之作用而甲基化的胺基酸殘基，X2表示第二胺基酸序列，並且M表示與X2綴合的螢光壽命調節劑
[0168]F1-X1-N1 (Me)-X2-M (II)
[0169]其中N(Me)表示通過蛋白質甲基轉移酶之作用而對殘基N的甲基化；
[0170](b)使步驟(a)的產物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基NI處切割通式(I)的螢光受調節之酶底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(II)的經修飾底物；以及
[0171](c)檢測螢光部分Fl之螢光壽命的變化，從而測定蛋白質甲基轉移酶的活性。
[0172]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用於篩選蛋白質甲基轉移酶的抑制劑。
[0173]附圖13中示意性地示出了通過螢光壽命蛋白質保護途徑測定蛋白質甲基轉移酶(PMT)的方法的一個具體實施例，所述蛋白質甲基轉移酶將一個或更多個甲基轉移至肽/蛋白質底物中的賴氨酸或精氨酸殘基。該實施例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分並且使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。然而，應理解，這些具體的螢光部分和螢光壽命調節劑部分僅通過示例示出，並且可替換為本文中所述的替代性螢光部分和螢光壽命調節劑部分。
[0174]上述的一般方法可適用於任何目的甲基轉移酶，包括在賴氨酸上甲基化的甲基轉移酶(統稱為PKMT)和在精氨酸上甲基化的甲基轉移酶(統稱為PRMT) 二者。在一些具體的實施方案中，測定可用於確定在賴氨酸或精氨酸上甲基化組蛋白之組蛋白甲基轉移酶的活性。所述方法可用於任何組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶，包括屬於酶類EC2.1.1.43的所有組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶。可使用該方法進行測定的具體PKMT酶包括例如G9a、Set7/9、GLP 和 EZH2。
[0175]蛋白質精氨酸甲基轉移酶(PRMT)催化S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)中的甲基轉移到精氨酸殘基的胍基氮。PRMT基於它們催化對稱二甲基化還是非對稱二甲基化可劃分為兩種類型。H3特異性精氨酸甲基轉移酶CARM1/PRMT4屬於I型蛋白質N-甲基轉移酶家族。合適的PRMT酶還包括例如PRMT1、PRMT3和PRMT5。所述測定方法可用於確定任何組蛋白-精氨酸N-甲基轉移酶(包括屬於酶類EC2.1.1.125的任何組蛋白-精氨酸N-甲基轉移酶)的活性。
[0176]基於使用9-氨基吖啶(9AA)作為螢光部分和色氨酸(W)作為螢光壽命調節劑部分的用於代表性PKMT酶G9a的示例性底物包括以下:
[0177]肽4:9AA-TARK9STGff-C0NH2
[0178]肽5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
[0179]肽6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
[0180]肽7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
[0181]肽8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2
[0182]肽9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2。
[0183]K9表示PKMT酶G9a作用的甲基化位點賴氨酸殘基並且模擬組蛋白H3內發生賴氨酸甲基化形成G9a之天然底物的序列環境。
[0184]基於使用9-氨基吖啶(9AA)作為螢光部分和色氨酸(W)作為螢光壽命調節劑部分的用於代表性PKMT酶Set7/9的示例性底物包括以下:
[οι 85]肽 12:wartk4qtark (9AA) stggkaprkqlak-conh2
[0186]肽13:wrtk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0187]K4表示PKMT酶Set7/9作用之甲基化位點的賴氨酸殘基並且模擬組蛋白H3內發生賴氨酸甲基化形成Set7/9之天然底物的序列環境。
[0188]基於使用9-氨基吖啶(9AA)作為螢光部分和色氨酸(W)作為螢光壽命調節劑部分的用於代表性PRMT酶PRMT5的示例性底物包括以下:
[0189]肽14:WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2
[0190]肽15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2
[0191]R3表示PRMT酶PRMT5作用之甲基化位點的精氨酸殘基並且模擬組蛋白H4內發生精氨酸甲基化形成PRMT5之天然底物的序列環境。肽15是在N端被乙醯化(Ac)。
[0192]基於使用9-氨基吖啶(9AA)作為螢光部分和色氨酸(W)作為螢光壽命調節劑部分的用於代表性PRMT酶EZH2的示例性底物包括以下:
[0193]肽20:PRKQLATK (9AA) AARK27SAPATGGff-CONH2
[0194]K27表示PRMT酶EZH2作用之甲基化位點的賴氨酸殘基並且模擬組蛋白H3內發生賴氨酸甲基化形成EZH2之天然底物的序列環境。
[0195]可根據所附實施例舉例說明的一般原則製備適用於測定其他PKMT和PRMT酶的肽底物。
[0196]適用於上述一般方法的蛋白酶包括但不限於在賴氨酸之後切割的Endo-LysC(用於基於賴氨酸甲基化的測定)和在精氨酸 之後切割的Endo-ArgC(用於基於精氨酸甲基化的測定)。
_7] (2)乙醯轉移酶測定
[0198]在一個實施方案中，本文中所述測定方法可適用於測定乙醯轉移酶的活性。
[0199]用於該測定的底物包含肽接頭，並且具有一般結構(III):
[0200]F1-X3-N2-X4-M (III)
[0201]其中X3表示第一胺基酸序列，Fl表示與X3綴合的螢光部分，N2表示通過乙醯轉移酶之作用而乙醯化的胺基酸殘基，X4表示第二胺基酸序列並且M表示與X4綴合的螢光壽命調節劑。在用乙醯轉移酶處理之後，底物轉化為由以下一般結構表示的經修飾(乙醯化)底物:
[0202]Fl-X3-N2(Ac)-X4_M (IV)
[0203]其中N2 (Ac)表示殘基N2的乙醯化。
[0204]應理解，Fl和M實際上可以以任一定向存在。殘基N2通常是賴氨酸(在用於賴氨酸乙醯化酶之測定的情況下)。
[0205]選擇胺基酸序列X3和X4 二者以使殘基N2放置在乙醯化的適當序列環境中，並且通過蛋白酶進行切割(未乙醯化的結構(III))，而且還提供螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)的最佳定向以實現Fl突光壽命的有效調節。X3和X4的序列可基於待測定乙酸轉移酶的天然底物的序列。應理解，雖然為了有效調節螢光壽命，需要將螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)以適當間隔定位，但是沒有必要使螢光部分(Fl)或螢光壽命調節劑(M)存在於肽接頭的末端(N端或C端)。因此，Fl可與X3中的胺基酸殘基相連接並且M可與X4中的胺基酸殘基相連接，或者反之亦然。如果螢光壽命調節劑M自身由胺基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側鏈提供，則充當調節劑M的胺基酸殘基自身可形成由X4表示的胺基酸序列的一部分。胺基酸序列X3和X4可包含天然或非天然胺基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。
[0206]在結構(III)的底物中，螢光部分Fl (優選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的螢光部分)的螢光壽命受底物中螢光壽命調節劑M(M優選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。用在殘基N2(例如，賴氨酸)之後切割的蛋白酶處理結構(III)的底物將引起蛋白質水解並且移除調節劑M對螢光壽命的調節。殘基N2(例如，賴氨酸)被適當的乙醯轉移酶乙醯化後，用蛋白酶處理結構(IV)的經修飾肽不引起殘基N2之後的切割並且螢光部分(Fl)的壽命仍受調節。在底物(III)持續轉化為經修飾底物(IV)的情況下，如在時間過程測定中，螢光部分(Fl)的螢光壽命將作為時間(以及乙醯轉移酶的濃度)的函數而降低。螢光壽命相對於100%未經修飾底物(III)的基線測量值的變化(降低)表明發生了底物(III)向經修飾底物(IV)的一些轉化。該變化的幅度可因此用於評價由乙醯轉移酶之作用而引起的底物(III)向經修飾底物(IV)的轉化。
[0207]因此，本文中提供了一種測定蛋白質乙醯轉移酶之活性的方法，其包括:
[0208](a)在允許螢光受調節之酶底物酶促轉化為通式(IV)的經修飾底物的條件下使受試樣品與通式(III)的螢光受調節之酶底物相接觸，
[0209]F1-X3-N2-X4-M (III)
[0210]其中X3表不第一胺基酸序列，Fl表不與X3綴合的突光部分，N2表
[0211]示通過乙醯轉移酶之作用而乙醯化的胺基酸殘基，X4表示第二胺基酸
[0212]序列並且M表示與X4綴合的螢光壽命調節劑
[0213]Fl-X3-N2(Ac)-X4_M (IV)
[0214]其中N2(Ac)表示通過蛋白質乙醯轉移酶之作用而對殘基N2的乙醯化；
[0215](b)使步驟(a)的產物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基N2處切割通式(III)的螢光受調節之酶底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(IV)的經修飾底物；以及
[0216](c)檢測螢光部分Fl螢光壽命的變化，從而測定蛋白質乙醯轉移酶的活性。
[0217]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用於篩選蛋白質乙醯轉移酶的抑制劑。
[0218]附圖27中示意性地示出了通過FLT蛋白酶保護法測定組蛋白乙醯轉移酶(HAT)的方法的一個具體實施例，所述組蛋白乙醯轉移酶使肽/蛋白質底物中的賴氨酸殘基乙醯化。該實施例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分並且使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。然而，應理解，這些具體的螢光部分和螢光壽命調節劑部分僅通過示例示出，並且可替換為本文中所述的替代性螢光部分和螢光壽命調節劑部分。
[0219]上述的一般方法可用於確定任何目的乙醯轉移酶(包括但不限於任何已知的組蛋白乙醯轉移酶，包括屬於酶類EC2.3.1.48的任何組蛋白乙醯轉移酶)的活性。特別地，所述測定方法可用於組蛋白乙醯轉移酶Gcn5、PCAF、Hatl和p300 (作為非限制性實例而給出)。
[0220]基於在賴氨酸殘基(特定HAT之乙醯化的位點)側翼併入螢光團(Fl)和調節劑部分(M)的組蛋白N端序列的肽底物可形成該類酶FLT蛋白酶保護測定的基礎。在以下以及圖28和53中示出了這種底物的序列，其基於使用9-氨基吖啶(9-AA)作為螢光部分並且使用色氨酸(W)作為螢光壽命調節劑部分，以及使用具有HAT (例如，PCAF)乙醯化位點K14的組蛋白H3序列。
[0221 ]肽 16 =WQTARK (Me) STGGK14APRK (9AA) QLATK_C0NH2[0222]肽17: 9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2[0223]可根據所附實施例說明的一般原則製備適用於測定其他乙醯轉移酶的肽底物。[0224]適用於上述一般方法的蛋白酶包括但不限於在賴氨酸之後切割的Endo-LysC(用於基於賴氨酸乙醯化的測定)。[0225](3)脫亞氨酶測定[0226]在一個實施方案中，本文中所述測定方法可適用於測定脫亞氨酶的活性。[0227]用於該測定的底物包含肽接頭，並且具有一般結構:[0228]F1-X5-R-X6-M (V)[0229]其中X5表示第一胺基酸序列，Fl表示與X5綴合的螢光部分，R表示通過脫亞氨酶之作用而轉化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二胺基酸序列並且M表示與X6綴合的螢光壽命調節劑。在用脫亞氨酶處理之後，底物轉化為由以下一般結構表示的修飾(脫亞氨化)底物:[0230]F1-X5-R (Cit)-X6-M (VI)[0231]其中R(Cit)表示殘基R通過脫亞氨化轉化為瓜氨酸。[0232]應理解，Fl和M實際上可以以任一定向存在。選擇胺基酸序列X5和X6 二者以使殘基R放置在脫亞氨化為瓜氨酸的適當序列環境中，並且通過蛋白酶進行切割(在結構(V)中)，而且還提供螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)的最佳定向以實現有效調節。X5和X6的序列可基於待測定脫亞氨酶之天然底物的序列。應理解，雖然為了有效調節螢光壽命，需要將螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)以適當間隔定位，但是沒有必要使螢光部分(Fl)或螢光壽命調節劑(M)存在於肽接頭的末端(N端或C端)。因此，Fl可與X5中的胺基酸殘基相連接並且M可與X6中的胺基酸殘基相連接，或者反之亦然。如果螢光壽命調節劑M自身由胺基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側鏈提供，則充當調節劑M的胺基酸殘基自身可形成由X6表示的胺基酸序列的一部分。胺基酸序列X5和X6可包含天然或非天然胺基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。[0233]在結構(V)的底物中，螢光部分Fl (優選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的螢光部分)的螢光壽命受底物中螢光壽命調節劑M(M優選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。用在殘基R之後切割的蛋白酶處理結構(V)的底物將引起蛋白質水解並且移除調節劑M對螢光壽命的調節。在殘基R通過適當的脫亞氨酶轉化為瓜氨酸後，用蛋白酶處理結構(VI)的經修飾肽不引起殘基R之後的切割並且螢光部分(Fl)的壽命仍受調節。在底物(V)持續轉化為經修飾底物(VI)的情況下，如在時間過程測定中，螢光部分(Fl)的螢光壽命將作為時間(以及脫亞氨酶的濃度)的函數而降低。螢光壽命相對於100%未經修飾底物(V)的基線測量值的變化(降低)表明發生了底物(V)向經修飾底物(VI)的一些轉化。該變化的幅度可因此用於評價由脫亞氨酶之作用引起的底物(V)向經修飾底物(VI)的轉化。[0234]因此，本文中提供了一種測定蛋白質脫亞氨酶之活性的方法，其包括:[0235](a)在允許螢光受調節之酶底物酶促轉化為通式(VI)的經修飾底物的條件下使受試樣品與通式(V)的螢光受調節之酶底物相接觸[0236]F1-X5-R-X6-M (V)[0237]其中X5表不第一胺基酸序列,Fl表不與X5綴合的突光部分,R表不通過脫亞氨酶之作用而轉化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二胺基酸序列並且M表示與X6綴合的螢光壽命調節劑
[0238]F1-X5-R (Cit)-X6-M (VI)
[0239]其中R(Cit)表示通過脫亞氨酶之作用而形成的瓜氨酸；
[0240](b)使步驟(a)的產物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基R處切割通式(V)的螢光受調節之酶底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(VI)的經修飾底物；以及
[0241](c)檢測螢光部分Fl螢光壽命的變化，從而測定蛋白質脫亞氨酶的活性。
[0242]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用於篩選蛋白質脫亞氨酶的抑制劑。
[0243]圖1中示意性地示出了通過FLT蛋白酶保護法測定脫亞氨酶類酶(具體是將肽/蛋白質底物中的精氨酸殘基轉化為瓜氨酸的肽基精氨酸脫亞氨酶)的方法的一個具體實例。該實例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分和使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。然而，應理解，這些具體的螢光部分和螢光壽命調節劑部分僅通過示例示出，並且可替換為本文中所述的替代性螢光部分和螢光壽命調節劑部分。
[0244]上述的一般方法可適用於任何目的脫亞氨酶，包括但不限於肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)，例如PAD1、PAD2、PAD3、PAD4和PAD6。特別地，所述方法可用於屬於酶類EC3.5.1.15的任何肽基精氨酸脫亞氨酶(PAD)。PAD酶可被替代性地稱為蛋白質-精氨酸脫亞氨酶。
[0245]以下示出了用於測定PAD2或PAD4活性的合適底物的實例，其基於使用9_氨基吖啶(9-AA)作為螢光部分和色氨酸(W)作為螢光壽命調節劑部分:
[0246]肽1:9AA-QSTRGS GHWKK-C0NH2
[0247]肽3:K (9ΑΑ)-HQSTRGSGHWKK_CONH2
[0248]可根據以上所述和所附實施例說明的一般原則製備適用於測定其他脫亞氨酶(特別是其他肽基精氨酸脫亞氨酶)的肽底物。
[0249]適用於上述一般方法的蛋白酶包括但不限於胰蛋白酶和在精氨酸之後切割的Endo-ArgC0
[0250](B)基於移除蛋白酶保護之修飾的測定
[0251]測定的第二組實施方案基於使用這樣的底物，其包含與螢光部分和配置成調節螢光部分之螢光壽命的螢光壽命調節劑部分相綴合的肽接頭分子，所述肽通過修飾酶之作用而修飾形成經修飾肽，其中底物中的肽在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間玉能被第二種酶(即，蛋白酶)切割，並且修飾酶對肽的修飾將肽轉化為經修飾肽，所述經修飾肽在焚光部分與螢光壽命調節劑部分之間被第二種酶(即，蛋白酶)切割。在這樣的一些實施方案中，底金在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間對第二種酶(蛋白酶)的切割不敏感，但是通過修飾酶作用於底物形成的經修飾底物在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間被第二種酶(即，蛋白酶)切割，從而使得螢光部分的螢光壽命提高。因此，與未經修飾肽相比，蛋白酶處理後螢光部分的螢光壽命的時間依賴性提高表明形成了經修飾肽(通過修飾酶作用於底物而形成)。
[0252]該測定的一些非限制性實施方案如下:
[0253](4)脫甲基酶測定
[0254]在一個實施方案中，本文中所述測定方法可適用於測定脫甲基酶的活性。[0255]用於該測定的底物包含肽接頭，並且具有一般結構(VII):
[0256]Fl-X7-N3(Me)-X8_M (VII)
[0257]其中X7表不第一胺基酸序列，Fl表不與X7綴合的突光部分，N3 (Me)表不通過脫甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化胺基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二胺基酸序列並且M表示與X8綴合的螢光壽命調節劑。在用脫甲基酶處理之後，底物轉化為由以下一般結構表示的經修飾(脫甲基化)底物:
[0258]F1-X7-N3-X8-M (VIII)
[0259]其中N3表示脫甲基化胺基酸(例如賴氨酸或精氨酸)。
[0260]應理解，Fl和M實際上可以以任一定向存在。選擇胺基酸序列X7和X8 二者以使殘基N3(Me)放置在甲基化的適當序列環境中並且被蛋白酶切割(在結構(VIII)的經修飾底物中)，而且還提供螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)的最佳定向以實現Fl螢光壽命的有效調節。X7和X8的序列可基於待測定脫甲基酶之天然底物的序列。應理解，雖然為了有效調節螢光壽命，需要將螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)以適當間隔定位，但是沒有必要使螢光部分(Fl)或螢光壽命調節劑(M)存在於肽接頭的末端(N端或C端)。因此，Fl可與X7中的胺基酸殘基相連接並且M可與X8中的胺基酸殘基相連接，或者反之亦然。如果螢光壽命調節劑M自身由胺基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側鏈提供，則充當調節劑M的胺基酸殘基自身可形成由X8表示的胺基酸序列的一部分。胺基酸序列X7和X8可包含天然或非天然胺基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。
[0261]在基於精氨酸脫甲基化之測定的情況下，由N(Me)表示的精氨酸殘基根據待測定其活性的脫甲基酶的底物特異性可以被單甲基化或二甲基化，後者為對稱構型或不對稱構型。初始底物甲基化的精確程度和二甲基化形式的構型對於測定的性能並不重要，前提是待測定脫甲基酶能夠使底物脫甲基化為可被蛋白酶切割的完全脫甲基化形式。因此，在精氨酸甲基化的情況下，殘基N(Me)視測定的環境可代表單甲基化或二甲基化形式中的任何一種。
[0262]在基於賴氨酸脫甲基化之測定的情況下，由N(Me)表示的賴氨酸殘基根據待測定其活性的脫甲基酶的底物特異性可以被單、二或三甲基化。初始底物甲基化的精確程度和二甲基化形式的構型對於測定的性能並不重要，前提是待測定脫甲基酶能夠使底物脫甲基化為可被蛋白酶切割的完全脫甲基化形式。因此，在賴氨酸甲基化的情況下，殘基N(Me)視測定的環境可代表單、二或三甲基化形式中的任何一種。
[0263]在結構(VII)的底物中，螢光部分Fl (優選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的螢光部分)的螢光壽命受底物中螢光壽命調節劑M(M優選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。在不存在任何脫甲基酶的情況下，用在殘基N3(例如，賴氨酸或精氨酸)之後切割的蛋白酶處理結構(VII)的底物在Fl與M之間丕引起蛋白質水解，原因是結構(VII)的底物包含N3的甲基化形式並因此對蛋白質水解具有抗性。因此保留螢光壽命調節劑M(例如，色氨酸)對螢光部分Fl(例如，9AA)的螢光壽命調節。在脫甲基酶存在下，殘基N3 (Me)脫甲基化形成結構(VIII)的經修飾底物中的殘基N3。用蛋白酶處理結構(VIII)的經修飾底物引起殘基N3(例如，賴氨酸或精氨酸)之後的切割並且螢光團(例如，9AA)的螢光壽命不再受調節。在底物(VII)持續轉化為經修、飾底物(VIII)的情況下，如在時間過程測定中，螢光部分(Fl)的螢光壽命將作為時間(以及脫甲基酶的濃度)的函數而提高，原因是形成了更多的經修飾底物並且其通過蛋白酶的作用而被切割。螢光壽命相對於100%未經修飾底物(VII)的基線測量值的變化(提高)表明發生了底物(VII)向經修飾底物(VIII)的一些轉化。該變化的幅度可因此用於評價由脫甲基酶引起的底物(VII)向經修飾底物(VIII)的轉化。
[0264]因此，本文中提供了測定蛋白質脫甲基酶之活性的方法，其包括:
[0265](a)在允許螢光受調節之酶底物酶促轉化為通式(VIII)的經修飾底物的條件下使受試樣品與通式(VII)的螢光受調節之酶底物相接觸
[0266]Fl-X7-N3(Me)-X8_M (VII)
[0267]其中X7表不第一胺基酸序列，Fl表不與X7綴合的突光部分，N3 (Me)表不通過脫甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化胺基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二胺基酸序列並且M表示與X8綴合的螢光壽命調節劑
[0268]F1-X7-N3-X8-M (VIII)
[0269]其中N3表示通過脫甲基酶之作用的脫甲基化胺基酸；
[0270](b)使步驟(a)的產物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基N3處切割通式(VIII)的經修飾底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(VII)的螢光受調節之酶底物；以及
[0271](c)檢測螢光部分Fl螢光壽命的變化，從而測定蛋白質脫甲基酶的活性。
[0272]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用於篩選蛋白質脫甲基酶的抑制劑 。
[0273]圖25中示意性地示出了通過FLT蛋白酶保護法測定蛋白質脫甲基酶(PDM)之方法的一個具體實施例，所述蛋白質脫甲基酶將肽/蛋白質底物中賴氨酸或精氨酸殘基的一個或更多個甲基移除。該實施例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分並且使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。然而，應理解，這些具體的螢光部分和螢光壽命調節劑部分僅通過示例示出，並且可替換為本文中所述的替代性螢光部分和螢光壽命調節劑部分。
[0274]上述的一般方法可適用於任何目的脫甲基酶。特別優選的是使在賴氨酸上甲基化的肽底物脫甲基化的PKDM酶。特別地，所述測定方法可用於組蛋白-賴氨酸脫甲基酶。組蛋白-賴氨酸脫甲基酶可根據底物特異性進行分類。使賴氨酸殘基組蛋白H3脫甲基化的組蛋白-賴氨酸脫甲基酶可使賴氨酸4 (稱為[組蛋白-H3]-賴氨酸-4脫甲基酶；EC1.14.11.B2)、賴氨酸9 (稱為[組蛋白-H3]-賴氨酸-9脫甲基酶；EC1.14.11.BI)、賴氨酸36(稱為[組蛋白-H3]-賴氨酸-36脫甲基酶；EC1.14.11.27)或賴氨酸27 (稱為[組蛋白_H3]_賴氨酸-27脫甲基酶)脫甲基化。使組氨酸H4中賴氨酸殘基脫甲基化的組蛋白-賴氨酸脫甲基酶可使賴氨酸20脫甲基化。上述測定方法可用於屬於組蛋白-賴氨酸脫甲基酶這些類中的任何一種，其包括但不限於 LSD1、JHDM1A、JMJD1A、JMJD2A、JMJD2B、JMJD2C、JMJD3 (KDM6)、FBXL (KDM2)和KDM5，僅通過示例給出)。
[0275]所述測定還可用於使在精氨酸上甲基化的肽底物脫甲基化的精氨酸脫甲基酶(PRDM 酶)，例如 JMJD6。
[0276]以下示出了用於代表性PKDM酶JHDMlA的FLT測定的合適底物。JHDMlA優先使組蛋白H3的賴氨酸36脫甲基化，將其由二甲基化或單甲基化狀態轉化為天然的未甲基化殘基。因此，所述底物基於適當序列環境中的殘基賴氨酸36。
[0277]肽10:9AA-ATGGVK36 (Me) K (Me) PHRYff-CONH2
[0278]在該不例性底物中，突光部分9AA (或其他合適的突光部分)的突光壽命受在C端附近併入的色氨酸氨基(或其他合適的螢光壽命調節劑)之存在的調節。JHDMlA對賴氨酸-36的脫甲基化允許在該殘基處的蛋白酶誘導切割，從而減輕調節並導致9AA的螢光壽命提高。相比之下，JHDMlA抑制劑的存在將阻止賴氨酸脫甲基化，從而使肽在賴氨酸-36處保留對蛋白酶誘導切割的抗性。因此，9AA的螢光壽命仍受調節並且調節程度與脫甲基化的程度相關。用於該測定的合適蛋白酶是不切割甲基化賴氨酸(賴氨酸-37作為單甲基衍生物而被保護以防止在該殘基處發生非特異性切割)的Endo-LysC。
[0279]以下示出了用於代表性PKDM酶JHDMlA之FLT測定的第二種合適底物。
[0280]肽11: 9AA-ATGGVK36 (Me) KPHW-C0NH2
[0281]在該示例性底物中，螢光部分9AA (或其他合適的螢光部分)的螢光壽命受在C端附近併入的色氨酸氨基殘基(或其他合適的螢光壽命調節劑)之存在的調節。JHDMlA對賴氨酸-36的脫甲基化允許在該殘基處的蛋白酶誘導切割，從而減輕調節並導致9AA的螢光壽命提高。相比之下，JHDMlA抑制劑的存在將阻止賴氨酸脫甲基化，從而使肽在賴氨酸-36處保留對蛋白酶誘導切割的抗性。因此，9AA的螢光壽命將仍受調節並且調節程度與脫甲基化的程度相關。用於該測定的合適蛋白酶是報導為不切割相鄰C端殘基是脯氨酸之賴氨酸的胰蛋白酶(例如，Keil, B .Specificity of Proteolyis)或切割活性嚴重受損的胰蛋白酶(Rodriguez, J.,等，J.Prot.Research, 2008, 7, 300-305),從而確保防止賴氨酸-37 處的非特異性切割，或使其降低至很小的水平。
[0282]可根據上述的一般原則製備適用於測定其他脫甲基酶的肽底物。
[0283](5)脫乙醯酶測定
[0284]在一個實施方案中，本文中所述測定方法可適用於測定脫乙醯酶的活性。
[0285]用於該測定的底物包含肽接頭，並且具有以下一般結構:
[0286]F1-X9-N4(Ac)-X10-M (IX)
[0287]其中X9表示第一胺基酸序列，Fl表示與X9綴合的螢光部分，M(Ac)表示通過脫乙醯酶之作用脫而乙醯化的乙醯化胺基酸殘基(例如，乙醯化賴氨酸)，XlO表示第二胺基酸序列並且M表示與XlO綴合的螢光壽命調節劑。在用脫乙醯酶處理之後，底物轉化為由以下一般結構表示的經修飾(脫乙醯化)底物:
[0288]F1-X9-N4-X10-M (X)
[0289]其中N4表示脫乙醯化胺基酸，例如賴氨酸。
[0290]應理解，Fl和M實際上可以以任一定向存在。選擇胺基酸序列X9和XlO 二者以使殘基M(Ac)放置在脫乙醯化的適當序列環境中並且被蛋白酶切割(在結構⑴的經修飾底物中)，而且還提供螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)的最佳定向以實現有效調節。X9和XlO的序列可基於待測定脫乙醯酶之天然底物的序列。應理解，雖然為了有效調節螢光壽命，需要將螢光部分(Fl)和螢光壽命調節劑(M)以適當間隔定位，但是沒有必要使螢光部分(Fl)或螢光壽命調節劑(M)存在於肽接頭的末端(N端或C端)。因此，Fl可與X9中的胺基酸殘基相連接並且M可與XlO中的胺基酸殘基相連接，或者反之亦然。如果螢光壽命調節劑M自身由胺基酸殘基(例如，色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、萘基丙氨酸或組氨酸或其衍生物)的側鏈提供，則充當調節劑M的胺基酸殘基自身可形成由XlO表示的胺基酸序列的一部分。胺基酸序列X9和XlO可包含天然或非天然胺基酸殘基，以及其他修飾(例如非肽鍵)。
[0291]在結構(IX)的底物中，螢光部分Fl (優選是9-氨基吖啶(9AA)，但是可以是任何其他合適的螢光部分)的螢光壽命受底物中螢光壽命調節劑M(M優選是色氨酸，但是可以是任何其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。在不存在任何脫乙醯酶的情況下，用在殘基N4(例如，賴氨酸)之後切割的蛋白酶處理玉引起結構(IX)之底物在Fl與M之間的蛋白質水解，原因是結構(IX)的底物包含N4的乙醯化形式並因此對蛋白質水解具有抗性。因此使螢光壽命調節劑M (例如，色氨酸)對螢光部分Fl (例如，9AA)的螢光壽命調節保持未受損。在脫乙醯酶存在下，殘基M(Ac)脫乙醯化以形成結構(X)之經修飾底物中的殘基N4。用蛋白酶處理結構(X)的經修飾底物引起殘基N4 (例如，賴氨酸)之後的切割並且螢光團(例如，9AA)的螢光壽命不再受調節。
[0292]在底物(IX)持續轉化為經修飾底物⑴的情況下，如在時間過程測定中，螢光部分(Fl)的螢光壽命將作為時間(以及脫乙醯酶的濃度)的函數而提高，原因是形成了更多的經修飾底物並且其通過蛋白酶的作用而被切割。螢光壽命相對於100%未經修飾底物(IX)的基線測量值的變化(提高)表明發生了底物(IX)向經修飾底物⑴的一些轉化。該變化的幅度可因此用於評價由脫乙醯酶引起的底物(IX)向經修飾底物(X)的轉化。
[0293]因此，本文中提供了測定蛋白質脫乙醯酶之活性的方法，其包括:
[0294](a)在允許螢光受調節之酶底物酶促轉化為通式(X)之經修飾底物的條件下使受試樣品與通式(IX)的螢光受調節之酶底物相接觸
[0295]F1-X9-N4(Ac)-XlO-M (IX)
[0296]其中X9表示第一胺基酸序列，Fl表示與X9綴合的螢光部分，M(Ac)表示通過脫乙醯酶之作用脫而乙醯化的乙醯化胺基酸殘基(例如，乙醯化賴氨酸)，XlO表示第二胺基酸序列並且M表示與XlO綴合的螢光壽命調節劑，
[0297]F1-X9-N4-X10-M (X)
[0298]其中N4表示通過脫乙醯酶之作用的脫乙醯化胺基酸；
[0299](b)使步驟(a)的產物與蛋白酶相接觸，所述蛋白酶能夠在鄰近殘基N4處切割通式(X)的經修飾底物，但是不能在Fl與M之間切割通式(IX)的螢光受調節之酶底物；以及
[0300](c)檢測螢光部分Fl之螢光壽命的變化，從而測定蛋白質脫乙醯酶的活性。
[0301]通過在步驟(a)中添加待測試抑制劑活性的候選化合物，該方法可容易地用於篩選蛋白質脫乙醯酶的抑制劑。
[0302]圖29中示意性地示出了通過FLT蛋白酶保護法測定蛋白質脫乙醯酶(例如組蛋白脫乙醯酶(HDAC))之方法的一個具體實施例，所述脫乙醯酶從肽/蛋白質底物的賴氨酸殘基中移除一個或更多個乙醯基。該實施例基於使用9-氨基吖啶作為螢光部分並且使用色氨酸殘基的吲哚基側鏈作為螢光壽命調節劑。然而，應理解，這些具體的螢光部分和螢光壽命調節劑部分僅通過示例示出，並且可替換為本文中所述的替代性螢光部分和螢光壽命調節劑部分。
[0303]上述的一般方法可適用於任何目的脫乙醯酶。特別優選的是組蛋白脫乙醯酶(HDAC)酶，包括但不限於HDACl-1l和SIRT1-5。特別地，上述測定方法可用於酶類EC3.5.1.98中的任何屬於組蛋白脫乙醯酶，其包括屬於HDAC1、HDAC2和HDAC3三種亞類之
一的酶。
[0304]以下說明了一種示例性HDAC底物:
[0305]Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)
[0306]Xaa =任意胺基酸。
[0307]以下說明了一種示例性HDACI底物:
[0308]肽18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2
[0309]在這些底物中，螢光部分(9AA或其他合適的螢光部分)在鄰近脫乙醯化賴氨酸的C端併入，並且色氨酸(或其他合適的螢光壽命調節劑)位於上述賴氨酸N端側。HDACl催化脫乙醯化後的蛋白酶誘導切割導致螢光壽命提高，原因是9AA與色氨酸殘基被分開。因此，螢光壽命的提高與HDAC的活性可直接相關。當然，考慮可根據所討論HDAC的序列特異性設計其他類似地設計的底物。
[0310]測定的實踐應用
[0311]本文中所述測定方法都可以以高通量篩選測定形式進行，其增強了用於篩選和鑑定修飾酶抑制劑之測定的效用。
[0312]當將本文中所述測定用於篩選環境時，上述測定在待測定抑制劑活性的化合物存在下進行。這樣的高通量篩選測定的一般形式為本領域技術普通人員所熟知。通常，化合物與合適的測定對照(例如 ，無抑制劑、無修飾酶、高濃度的已知抑制劑)進行平行測試。化合物可在數個不同濃度下進行平行測試。如通過測定的螢光壽命示值讀數的變化所表明的，在受試化合物存在下修飾酶活性的降低將所述受試化合物鑑定為所述修飾酶的抑制劑。
[0313]本發明的測定通常可在多孔板的板中進行，例如具有24孔、96孔、384孔或更高密度的孔(例如864孔或1536孔)的微滴定板。
[0314]用於鑑定酶抑制劑的高通量篩選測定通常利用高純形式的修飾酶，例如重組酶。將支持修飾酶活性之合適酶反應緩衝液中的修飾酶和相應的螢光受調節之底物與受試化合物(可能的酶抑制劑)一起添加到多孔板的孔中。考慮到測試的酶的動力學，通常在合適的濃度範圍(例如，IOnM至10 μ M)中在連續稀釋下測試化合物。添加到孔中的修飾酶的量和底物的量維持不變(除了不包含酶的對照孔之外)。還可以製備包含高濃度已知酶抑制劑的對照孔以及不包含化合物的孔。然後將所製備的包含酶、螢光受調節之酶底物和受試化合物的板以及適當的對照在不存在任何抑制劑時修飾酶具有活性的條件下孵育。在該孵育期間發生通過修飾酶作用的底物向經修飾底物的轉化。如果受試化合物是修飾酶的抑制劑，則通過酶的螢光受調節之底物向經修飾底物的轉化將被抑制，抑制程度取決於抑制劑的濃度及其作為抑制劑的效力。當然，除了作為修飾酶活性的結果，不發生底物轉化為經修飾底物對於測定性能來說是至關重要的。
[0315]可對添加到測定中的修飾酶量和允許底物轉化為修飾酶的孵育時長進行選擇以優化測定的動態範圍。例如，可選擇添加的酶量和孵育時間以實現在不存在任何抑制劑的情況下底物向經修飾底物的轉化小於100%。
[0316]酶、底物和抑制劑的孵育完成後，就添加第二種酶(例如，蛋白酶)並使用適當儀器(例如，NanoTaurus?讀板器)監測螢光壽命。如本文其他地方所解釋的，所述測定可基於測量平均螢光壽命，或者基於測量對應於底物或產物的具有特異性壽命的具體螢光物質的量，即特異性測量表現出「長」螢光壽命(調節不存在)的切割底物/經修飾底物或特異性測量未切割底物/經修飾底物(調節仍存在)。在任一情況下，對於所使用的每一種濃度的受試化合物，螢光壽命測量都為受試化合物存在下修飾酶的活性提供了指示。可由相對於受試化合物濃度的％剩餘修飾酶活性的作圖來確定受試化合物的IC5tl值。
[0317]肽底物
[0318]本發明的另一方面提供了用於實施本文中所述酶測定的肽底物。特別地，提供了以下底物:
[0319](I)用於甲基轉移酶測定的底物
[0320]F1-X1-N1-X2-M (I)，或
[0321]M-X1-N1-X2-F1 (I，)
[0322]其中Xl表示第一胺基酸序列，Fl表示與Xl (或在I』中與X2)綴合的螢光部分，NI表示通過甲基轉移酶之作用而甲基化的胺基酸殘基，X2表示第二胺基酸序列並且M表示與X2(或在I』中與XI)綴合的螢光壽命調節劑。
[0323]在一些非限制性實施方案中，所述底物可以是以下螢光受調節之肽中的一種:
[0324]肽4:9AA-TARK9STGff-C0NH2
[0325]肽5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
[0326]肽6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
[0327]肽7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
[0328]肽8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2
[0329]肽9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2
[0330]肽I2:WARTK4QTARK (9AA) STGGKAPRKQLAK_CONH2
[0331 ]肽 13: wrtk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0332]肽14: WsGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK-CONH2
[0333]肽15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2
[0334]肽20:PRKQLATK (9AA) AARK27SAPATGGff-CONH2
[0335](2)用於乙醯轉移酶測定的底物
[0336]F1-X3-N2-X4-M (III)，或
[0337]M-X3-N2-X4-F1 (III，)
[0338]其中X3表示第一胺基酸序列，Fl表示與X3(或在III』中與X4)綴合的螢光部分，N2表示通過乙醯轉移酶之作用而乙醯化的胺基酸殘基，X4表示第二胺基酸序列並且M表示與X4(或在III』中與X3)綴合的螢光壽命調節劑。
[0339]在一些非限制性實施方案中，所述底物可以是以下螢光受調節之肽中的一種:
[0340]肽16 =WQTARK (Me) STGGK14APRK (9AA) QLATK_C0NH2[0341 ]肽 17: 9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2
[0342](3)用於脫亞氨酶測定的底物
[0343]F1-X5-R-X6-M (V)，或
[0344]M-X5-R-X6-F1 (V，)
[0345]其中X5表示第一胺基酸序列，Fl表示與X5(或在V』中與X6)綴合的螢光部分，R、表示通過脫亞氨酶作用轉化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二胺基酸序列並且M表示與X6(或在V』中與X5)綴合的螢光壽命調節劑。
[0346]在一些非限制性實施方案中，所述底物可以是以下螢光受調節之肽中的一種:
[0347]肽1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2
[0348]肽3:K (9ΑΑ)-HQSTRGSGHWKK_CONH2
[0349](4)用於脫甲基酶的底物
[0350]F1-X7-N3(Me)-X8-M (VII)，或
[0351]M-X7-N3(Me)-X8-F1 (VII，)
[0352]其中X7表示第一胺基酸序列，Fl表示與X7(或在VII』中與X8)綴合的螢光部分，N3(Me)表示通過脫甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化胺基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二胺基酸序列並且M表示與X8 (或在VII』中與X7)綴合的螢光壽命調節劑。
[0353]在一些非限制性實施方案中，所述底物可以是以下螢光受調節之肽中的一種:
[0354]肽10:9AA-ATGGVK36 (Me) K (Me) PHRYff-CONH2 或
[0355]肽11: 9AA-ATGGVK36 (Me) KPHW-C0NH2
[0356](5)用於脫乙醯酶的底物
[0357]F1-X9-N4 (Ac )-XlO-M (IX)，或
[0358]M-X9-N4(Ac)-XlO-Fl (IX，)
[0359]其中X9表示第一胺基酸序列，Fl表示與X9(或在IX』中與X10)綴合的螢光部分，M(Ac)表示通過脫乙醯酶之作用而脫乙醯化的乙醯化胺基酸殘基(例如，乙醯化賴氨酸)，XlO表示第二胺基酸序列並且M表示與XlO (或在IX』中與X9)綴合的螢光壽命調節劑。
[0360]在一個非限制性實施方案中，所述底物可以是以下螢光受調節之肽:
[0361 ] Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)
[0362]Xaa =任意胺基酸
[0363]或肽，例如
[0364]肽18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2
[0365]在上述螢光受調節之底物中，部分Fl與M可形成以下非限制性組合之一:
[0366]螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調節劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲噪基側鏈；
[0367]螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調節劑部分萘基丙氨酸或其衍生物；
[0368]螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調節劑部分咔唑部分或其衍生物；
[0369]螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調節劑部分吩噻嗪或其衍生物；
[0370]螢光部分吖啶酮或其衍生物與調節劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲哚基側鏈；
[0371]螢光部分喹吖啶酮或其衍生物與調節劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲噪基側鏈。
[0372]試劑盒
[0373]本發明的另一方面涉及用於實施本文中所述測定方法的試劑盒。所述試劑盒通常包含如本文定義的酶底物和第二種酶(例如，蛋白酶)供應，所述第二種酶在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間切割底物或通過修飾酶作用於底物而形成的底物的經修飾形式，從而將與螢光部分綴合之底物的一部分與與螢光壽命調節劑部分相綴合之底物的一部分分開。所述試劑盒還可包含對於修飾酶與底物之反應和蛋白酶與底物(或底物的經修飾形式)之反應二者都合適的酶反應緩衝液等。
[0374]特別地，提供了以下試劑盒:
[0375](I)用於甲基轉移酶測定的試劑盒
[0376]所述試劑盒包含具有以下一般結構的螢光受調節之底物和蛋白酶:
[0377]F1-X1-N1-X2-M (I)，或
[0378]M-X1-N1-X2-F1 (I，)
[0379]其中Xl表示第一胺基酸序列，Fl表示與Xl (或在I』中與X2)綴合的螢光部分，NI表示通過甲基轉移酶之作用而甲基化的胺基酸殘基，X2表示第二胺基酸序列，並且M表示與X2 (或在I』中與X2)綴 合的螢光壽命調節劑；並且所述蛋白酶能夠將所述底物至少切割成包含螢光部分Fl的第一部分和包含螢光壽命調節劑M的第二部分。
[0380]在一些非限制性實施方案中，所述試劑盒可包含以下螢光受調節之肽之一和蛋白酶 Endo-LysC 或 Endo-ArgC 的供應:
[0381 ]肽 4: 9AA-TARK9STGff-C0NH2
[0382]肽5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
[0383]肽6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
[0384]肽7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
[0385]肽8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2
[0386]肽9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2
[0387]肽12:wartk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0388]肽13: wrtk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0389]肽14:WsGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK-CONH2
[0390]肽15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2[0391 ]肽 20:PRKQLATK (9AA) AARK27SAPATGGff-CONH2。
[0392](2)用於乙醯轉移酶測定的試劑盒
[0393]所述試劑盒包含具有以下一般結構的螢光受調節之底物和蛋白酶:
[0394]F1-X3-N2-X4-M (III)，或
[0395]M-X3-N2-X4-F1 (III，)
[0396]其中X3表示第一胺基酸序列，Fl表示與X3(或在III』中與X4)綴合的螢光部分，N2表示通過乙醯轉移酶之作用而乙醯化的胺基酸殘基，X4表示第二胺基酸序列，並且M表示與X4(或在III』中與X3)綴合的螢光壽命調節劑；並且所述蛋白酶能夠將所述底物至少切割成包含螢光部分Fl的第一部分和包含螢光壽命調節劑M的第二部分。
[0397]在一個非限制性實施方案中，所述試劑盒可包含以下螢光受調節之肽底物之一和蛋白酶Endo-LysC的供應:
[0398]肽16 =WQTARK (Me) STGGK14APRK (9AA) QLATK_C0NH2
[0399]肽17:9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2。
[0400](3)用於脫亞氨酶測定的試劑盒[0401]所述試劑盒包含具有以下一般結構的螢光受調節之底物和蛋白酶:
[0402]F1-X5-R-X6-M (V)，或
[0403]M-X5-R-X6-F1 (V，)
[0404]其中X5表示第一胺基酸序列，Fl表示與X5(或在V』中與X6)綴合的螢光部分，R表示通過脫亞氨酶作用轉化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二胺基酸序列，並且M表示與X6(或在V』中與X5)綴合的螢光壽命調節劑；並且所述蛋白酶能夠將所述底物至少切割成包含螢光部分Fl的第一部分和包含螢光壽命調節劑M的第二部分。
[0405]在一些非限制性實施方案中，所述試劑盒可包含以下螢光受調節之肽底物之一和蛋白酶胰蛋白酶的供應:
[0406]肽1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2
[0407]肽3:K(9ΑΑ)-HQSTRGSGHWKK_CONH2。
[0408](4)用於脫甲基酶的試劑盒
[0409]所述試劑盒包含具有以下一般結構的螢光受調節之底物和蛋白酶:
[0410]Fl-X7-N3(Me)-X8_M (VII)，或
[0411]M-X7-N3(Me)-X8-F1 (VII，)
[0412]其中X7表示第一胺基酸序列，Fl表示與X7(或在VII』中與X8)綴合的螢光部分，N3(Me)表示通過脫 甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化胺基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二胺基酸序列，並且M表示與X8(或在VII』中與X7)綴合的螢光壽命調節劑；並且所述蛋白酶能夠將所述底物的經修飾形式至少切割成包含螢光部分Fl的第一部分和包含螢光壽命調節劑M的第二部分。
[0413]在一個非限制性實施方案中，所述試劑盒可包含以下螢光受調節之肽底物之一和蛋白酶Endo-LysC的供應:
[0414]肽10:9AA-ATGGVK36 (Me) K (Me) PHRYff-CONH2。
[0415]在另一個非限制性實施方案中，所述試劑盒可包含以下螢光受調節之肽底物之一和蛋白酶胰蛋白酶的供應:
[0416]肽11: 9AA-ATGGVK36 (Me) KPHW-C0NH2。
[0417](5)用於脫乙醯酶的試劑盒
[0418]所述試劑盒包含具有以下一般結構的螢光受調節之底物和蛋白酶:
[0419]F1-X9-N4 (Ac)-XlO-M (IX)，或
[0420]M-X9-N4(Ac)-XlO-Fl (IX，)
[0421]其中X9表示第一胺基酸序列，Fl表示與X9(或在IX』中與X10)綴合的螢光部分，M(Ac)表示通過脫乙醯酶之作用脫而乙醯化的乙醯化胺基酸殘基(例如，乙醯化賴氨酸)，XlO表示第二胺基酸序列，並且M表示與XlO (或在IX』中與X9)綴合的螢光壽命調節劑；並且所述蛋白酶能夠將所述底物的經修飾形式至少切割成包含螢光部分Fl的第一部分和包含螢光壽命調節劑M的第二部分。
[0422]在一個非限制性實施方案中，所述試劑盒可包含以下螢光受調節之肽底物之一和胰蛋白酶的供應:
[0423]Ac-Trp-Xaa-Lys(Ac)-Lys(9AA)
[0424]Xaa =任意胺基酸[0425]或肽，例如
[0426]肽18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2。
[0427]在上述試劑盒中，螢光受調節之底物中的部分Fl與M可形成以下非限制性組合之
[0428]螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調節劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲噪基側鏈；
[0429]螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調節劑部分萘基丙氨酸或其衍生物；
[0430]螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調節劑部分咔唑部分或其衍生物；
[0431]螢光部分9-氨基吖啶(9-AA)與調節劑部分吩噻嗪或其衍生物；
[0432]螢光部分吖啶酮或其衍生物與調節劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲哚基側鏈；
[0433]螢光部分喹吖啶酮或其衍生物與調節劑部分吲哚基部分，特別是色氨酸殘基的吲噪基側鏈。
實施例
[0434]參照以下實驗性實施例進一步理解本發明。
[0435]實施例1-用於脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護測定
[0436]圖1示出了通過FLT蛋白酶保護法測定脫亞氨酶類酶的方法，所述脫亞氨酶類酶將肽/蛋白質底物中的精氨酸殘基轉化為瓜氨酸。在這裡，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合適的報導分子)的底物壽命受序列中色氨酸殘基(或其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。用在精氨酸之之後切割的蛋白酶處理底物將引起蛋白質水解並移除色氨酸殘基對螢光壽命的調節。在通過適當的脫亞氨酶將 精氨酸轉化為瓜氨酸後，然後用蛋白酶處理產物肽不引起精氨酸之後的切割並且螢光團(9AA)的壽命仍受調節。
[0437](A) PAD4 I既念驗iiH (Proof-of-Concept) FLT 蛋白酶保護泖I 定
[0438]重組人PAD4酶可商購自供應商例如origene、abnova或modiquest research。
[0439]為了實現用於脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護法，必須滿足多個條件:
[0440]I)設計適當的肽底物，其包含脫亞氨酶的識別位點、合適地併入的色氨酸殘基(或其他FLT調節劑)和長壽命螢光團(例如，9-氨基吖啶)。
[0441]2)正確布置調節劑和螢光團，使得後者的FLT在完整肽中充分降低。調節劑和螢光團在蛋白酶切割後必須位於相反的片段上，從而導致螢光團FLT的切割依賴性提高。
[0442]3)使用選擇性地切割肽(瓜氨酸化)精氨酸殘基C端的合適蛋白酶。所述蛋白酶必須不能切割瓜氨酸化產物。
[0443]為了滿足要求I~3，設計併合成了圖2所示肽序列用於通過FLT蛋白酶保護法測定脫亞氨酶PAD4。
[0444]肽1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2
[0445]肽2:K (9ΑΑ)-QSTRGSGHWKK_C0NH2
[0446]肽3:K (9ΑΑ)-HQSTRGSGHWKK_C0NH2
[0447]為了提高得到合適FLT調節的可能性同時維持針對PAD4的活性，合成了三種變體。[0448]如實驗章節所述通過標準Fmoc固相肽合成(solid phase peptide synthesis,SPPS)合成所述肽。肽2和3在N端包含Boc-Lys (Fmoc) -0H,從而能夠得到正交的側鏈脫保護。使用HOCt/DIC活化在樹脂上用3-(9-氨基吖啶-2-基)_丙酸標記肽，然後使用標準TFA切割混合物(cocktail)進行切割。通過反相HPLC對肽進行純化並參照9AA的摩爾消光係數進行等分(在1:1MeCN/水中在405nm處為8735M_1cm_1)。[0449]狀I~3的FLT測量
[0450]在384孔黑色微孔板中將肽I~3以I μ M的濃度溶解於PAD4測定緩衝液(20mMTris pH8.0, 200 μ M CaCl2, 5mM DTT,0.01% CHAPS)中(20 μ L/孔)。如實驗章節所述使用NanoTaurus突光壽命讀板器(Edinburgh Instruments Ltd.)測量FLT。一式三份地進行測量並在7小時時間段中進行分析。
[0451]初始穩定後，肽I和3的FLT隨時間保持穩定(圖3)。相比之下，肽2的FLT穩定地升高3小時後開始變平。相比於肽I和2，肽3初始壽命的降低反映鄰近9AA連接位點處存在組氨酸殘基。與色氨酸一樣，已知組氨酸殘基調節突光團的FLT(Marme,N.,Knemeyer,J-P., Sauer, Μ.和 Wo If rum, J., Bioconjugate Chem.,2003,14,1133-1139)。
[0452]肽I~3的蛋白酶切割
[0453]胰蛋白酶是切割肽和蛋白質中精氨酸或賴氨酸殘基C端的常用蛋白酶。所設計的肽I~3(圖2)在C端具有一個精氨酸殘基和兩個賴氨酸殘基。預計精氨酸處的切割將由於其與調節色氨酸殘基的分開而導致9AA FLT提高。相比之下，並且對於測定的效用來說重要的是，賴氨酸處的切割不導致染料和調節劑分開，因此應對前者的FLT無影響。
[0454]為了測試蛋白酶切割對肽I~3之FLT的影響，在384孔黑色微孔板中將每種肽以I μ M的濃度溶解於PAD4測定緩衝液(20 μ L)中。向每個孔中添加10 μ L分別包含5ηΜ、
2.5nM、1.25ηΜ或0.625ηΜ酶的胰蛋白酶溶液。在45分鐘內以規律的間隔使用NanoTaurus讀板器測量FLT。作為對照，以類似方法測試包含瓜氨酸(替代精氨酸)的相應肽。
[0455]所有的三種肽的FLT作為胰蛋白酶濃度的函數而提高，這與9ΑΑ與調節色氨酸殘基的分開相一致(圖4Α~C)。FLT提高是肽依賴性的，使得肽I (6ns) >肽2 (4.8ns) >肽3(2.6ns)。應注意，對於肽2，無胰蛋白酶對照中有一些漂移，這與該肽單獨在緩衝液中所觀察到的作用相一致(圖3)。肽3的降低的FLT範圍可通過切割後鄰近9AA的調節組氨酸殘基的持續存在來部分地解釋。
[0456]與在胰蛋白酶處理之後對於肽I~3所觀察到的FLT顯著提高相比，對於瓜氨酸化類似物沒有觀察到FLT提高，甚至在孵育45分鐘後也是如此(圖4D)。該發現與預計的胰蛋白酶不能在鄰近瓜氨酸殘基處切割相一致。
[0457]根據經驗證測定的蛋白酶保護方面，將注意力轉向確定肽I~3是否是PAD4的可行底物。
[0458]俥用狀I~3講行PAD4測定
[0459]為了確定肽I~3是否被PAD4瓜氨酸化，開發了反相HPLC法以監測底物的消耗和產物的形成。作為第一步，在PAD4測定緩衝液中以15 μ M的濃度製備每種肽與其瓜氨酸化等價物的1:1混合物，並使用Luna C18柱和O~73% MeCN+0.1 % TFA梯度通過RP-HPLC監測30分鐘。使用該梯度可將對應於底物和產物肽的峰分開，這二者的保留時間均比來自緩衝液組分的峰晚，從而簡化了分析(圖5)。[0460]通過可使用的合適HPLC方法，為每種肽底物建立PAD4測定，以規律的時間間隔取出等量份並且通過RP-HPLC監測產物形成。每個測定均在包含測定緩衝液(300 μ L)中的15 μ M肽和30nM PAD4 (Origene)的微型離心管中進行。測定在室溫下進行並且在O分鐘、30分鐘和60分鐘的時間間隔取樣。
[0461]通過圖6~8中的HPLC譜示出了在I小時的時程內每個測定的進展。對於使用肽1(圖6)和肽3(圖8)作為底物的測定，譜清楚地示出在30分鐘後形成了新峰，其保留時間比底物晚，並且明顯地，I小時後底物幾乎完全消失。為了確定新形成的物質與瓜氨酸化產物相對應，收集峰並通過ES1-MS分析。該方法確定了在每種情況下質量都比初始肽大IRmu,與精氨酸轉化為瓜氨酸相一致(圖9和圖10)。
[0462]與使用肽I和3的成功相比，如通過在測定時間過程中HPLC譜中出現多個峰的所證明的(圖7)，使用肽2作為底物的測定導致了肽的分解。對於分解的峰不能得到可辨別的質量，所以不可能確定瓜氨酸化是否發生。該肽作為底物的明顯失敗與FLT研究(圖3)期間和蛋白酶切割分析(圖4B)期間所觀察到的穩定性缺乏相一致。不進行使用肽2的進一步研究，而將注意力集中到在PAD4測定中已表現出活性的肽I和3上。
[0463]為了測試PAD4對肽I和3的瓜氨酸化是否賦予了針對胰蛋白酶的保護，將這些肽的測定混合物(上述)用測定緩衝液稀釋至I μ M的濃度，並且將20 μ L各自添加到384孔黑色微孔板的三個孔中。如前所述使用NanoTaurus讀板器測量FLT。然後將10 μ L胰蛋白酶(終濃度為IOnM)添加到每個孔中，並將板在室溫下孵育10分鐘，然後再次測量FLT。包括僅包含相同濃度肽的對照用於比較。
[0464]在PAD4不存在下，在與IOnM胰蛋白酶孵育後，肽I和3的FLT分別提高6.1ns和
3.3ns(圖11)。相比之下，對於在與胰蛋白酶孵育之前暴露於PAD4的那些肽沒有觀察到FLT提高。這些發現與PAD4催化的底物瓜氨酸化提供對蛋白酶處理的保護相一致。
[0465]總之，可得出以下結論:
[0466]I)肽I和3是PAD4的可行底物。
[0467]2)在用合適的蛋白酶(即，胰蛋白酶)處理後可實現多至6ns的FLT提高(在肽I的情況下)，從而得到優良的測定動態範圍。
[0468]3)如缺乏FLT提高所反映的，PAD4對肽I和3的瓜氨酸化賦予了免於蛋白酶誘導切割的保護。
[0469]用於PAD4的FLT蛋白酶保護測定
[0470]由於與肽3相比，肽I表現出的FLT顯著更大的變化，所以選擇該肽作為微孔板測定的底物。測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進行並且包含測定緩衝液中的肽
I(I μ Μ)和PAD4酶(500ρΜ、250ρΜ或125ρΜ)。以規律的間隔通過添加10 μ L胰蛋白酶(IOnM)終止反應。在添加胰蛋白酶之前立即測量FLT，並且在室溫下孵育10分鐘後再次測量。所有測量使用NanoTaurus讀板器一式三份地進行。
[0471]在添加胰蛋白酶之前，所有測定孔的FLT都類似(~10ns)，並且對於不同測定時間點或PAD4濃度觀察到沒有顯著變化(圖12A)。相比之下，與胰蛋白酶孵育後測量的FLT表現出時間和PAD4濃度依賴性降低(圖12B)，原因是進行性瓜氨酸化賦予了蛋白質保護，導致了固有的色氨酸殘基對肽I之FLT的持續調節。
[0472]底物滴定[0473]研究了 PAD4測定對肽底物濃度的依賴性。測定使用250pM PAD4在測定緩衝液(20yL)中在室溫下在384孔微孔板中進行I小時。肽I的濃度在2.5μ M至0.04 μ M之間變化。反應完成後，將胰蛋白酶(IOnM)添加到每個孔中並在10分鐘的孵育期後測量FLT。參照標準曲線將數據轉化為產物形成的速率，然後在GraphPad Prism中使用Michaelis-Menten模型進行擬合以確定底物ΚΜ。由圖73可以看出，底物I的Km被確定為180ηΜ。
[0474]V -閔子
[0475]為了證明PAD4FLT 測定與高通量篩選(high-throughput screening, HTS)兼容，確定了 Z』-因子的值。Z』_因子是特定測定之穩健性(robustness)的度量，值>0.7被認為是優良的(Zhang, J.H.；Chung, T.D.；01denburg, K.R.J.Biomol.Screen.1999,4,67-73)。
[0476]在384孔微孔板中建立測定，其中半個板包含測定緩衝液中的PAD4(125pM)和肽
1(200nM)，而另外半個板包含不含CaCl2的測定緩衝液中的PAD4(125pM)和肽I (200nM)。最終測定體積為20μ L，將板在室溫下孵育I小時，此時將測定緩衝液(10μ L)中的胰蛋白酶(IOnM終濃度)添加到每個孔中。在室溫下再孵育10分鐘後，測量FLT並計算Ζ』因子為 0.70 (圖 74)。
[0477]這些結果證明用於脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護測定可轉為微孔板形式，這有助於其用於藥物篩選和HTS應用。
[0478]總之，已展示了採用PAD4作為代表性實例的用於脫亞氨酶類酶的FLT蛋白酶保護測定。設計併入PAD4識別序列、9-氨基吖啶螢光團和調節色氨酸序列的肽底物。FLT研究確定9ΑΑ的壽命降低而肽序列未受損，但是在用蛋白酶胰蛋白酶處理後，FLT由於肽切割引起染料從調節劑中釋放而提高。肽中的兩種表明使體外測定中PAD4的底物，其中序列中單個精氨酸殘基的瓜氨酸化導致了免於蛋白酶誘導切割的保護。通過與不包含酶的對照相比暴露於PAD4的那些肽的FLT降低來對該保護進行定量。
[0479]考慮通過採用適當設計的底物可將該測定技術轉用於其他脫亞氨酶。
[0480](B)用於PAD2脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護測定
[0481]在測定脫亞氨酶的FLT蛋白酶保護法的另一個示例中，肽基精氨酸脫亞氨酶
2(PAD2)被驗證為合適的靶標。
[0482]PAD2的調節異常與自身免疫病多發性硬化和類風溼性關節炎以及神經變性疾病(例如阿爾茲海默病和克雅氏症(creutzfeldt-Jakob disease))相關(Jang, B.等，ActaNeuropathologica,2010,119,199 至 210)。
[0483]重組人PAD2可商購自供應商例如Modiquest Research。
[0484]在使用PAD2的測定中測試先前被確定為PAD4底物的肽1(圖1)，並且通過RP-HPLC和ES1-MS監測向瓜氨酸化產物的轉化。
[0485]肽1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2
[0486]因此，將肽I (15 μ Μ)與PAD2 (30ηΜ)在測定緩衝液(20mM Tris pH8, 200 μ M CaCl2,5mM DTT，0.01% CHAPS) (300 μ L)中孵育，以規律的時間間隔取出等量份並通過RP-HPLC分析。測定在室溫下進行並且在O分鐘、30分鐘和120分鐘時間間隔取樣。
[0487]通過圖31中的HPLC譜示出2小時時間過程中的測定進展。在t = O時，存在對應於肽底物的唯一峰(tK = 14.4分鐘)。30分鐘後在405nm吸光度下存在新峰(tK = 14.7分鐘)，在2小時後該峰增長為主要的並且僅可檢測到很小的底物峰。為了確定新峰對應於瓜氨酸化產物，收集所述產物並通過ES1-MS進行分析。發現質量(m/zl518.7)比底物質量大lamu，這與精氨酸殘基的胍基轉化為尿素相一致(圖32)。
[0488]為了測試PAD2對肽I的瓜氨酸化是否賦予了針對胰蛋白酶的保護，用測定緩衝液將測定混合物稀釋至I μ M的濃度，並且將20 μ L添加到384孔黑色微孔板的三個孔中。將IOy L胰蛋白酶(終濃度為IOnM)添加到每個孔中，將板在室溫下孵育10分鐘後，如實驗章節中所述使用NanoTaurus讀板器測量螢光壽命(FLT)。包括僅包含相同濃度肽的對照用於比較。
[0489]在PAD2不存在下，在與IOnM胰蛋白酶孵育後肽I的FLT提高6.9ns (圖33)。相比之下，對於在與胰蛋白酶孵育之前暴露於PAD2的肽I沒有觀察到FLT提高。這些發現與PAD2催化的肽I瓜氨酸化提供對蛋白酶處理的保護相一致。
[0490]總之，肽I是測定PAD2的有效底物，其通過由瓜氨酸化賦予對蛋白酶誘導切割之保護導致的FLT降低來監測活性。
[0491]用於PAD2的FLT蛋白酶保護測定
[0492]接著，以微孔板形式證明了用於PAD2的FLT蛋白酶保護測定。測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進行並且包含測定緩衝液中的肽I (I μ Μ)和PAD2酶(23.5ηΜ、11.8ηΜ、5.9ηΜ、2.9ηΜ或1.5ηΜ)。以規律的間隔通過添加10 μ L胰蛋白酶(IOnM)終止反應。在室溫下與胰蛋白酶孵育10分鐘後測量FLT。所有的測量使用NanoTaurus讀板器一式三份地進行。
[0493]與胰蛋白酶孵育後測量的FLT表現出時間和PAD2濃度依賴性降低(圖34)，原因是進行的瓜氨酸化提供了蛋白酶保護，導致固有色氨酸殘基對肽I之FLT的持續調節。因此通過測定的所測量螢光壽命降低報導瓜氨酸化。
[0494]這些結果證明用於PAD2的FLT蛋白酶保護測定可轉為微孔板形式，從而有助於其用於藥物篩選和HTS應用。
[0495]實施例2-用於蛋白質甲基轉移酶的FLT蛋白酶保護測定
[0496]圖13示出通過FLT蛋白酶保護法測定蛋白質甲基轉移酶(PMT)的方法，所述甲基轉移酶將一個或更多個甲基轉移到肽/蛋白質底物中的賴氨酸或精氨酸殘基上。在這裡，9-氨基吖啶(9ΑΑ)(或其他合適的報導分子)的底物壽命受序列中色氨酸殘基(或其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。用在賴氨酸或精氨酸之後切割的蛋白酶處理底物將引起蛋白質水解並移除色氨酸殘基對螢光壽命的調節。通過適當的PMT酶進行賴氨酸或精氨酸甲基化後，用蛋白酶處理產物肽不引起賴氨酸或精氨酸後的切割並且螢光團(9ΑΑ)的壽命仍受調節。
[0497]重組PKMT(例如 G9a、Set7/9、GLP、EZH2)和 PRMT(PRMTU PRMT3、PRMT4/CARMUPRMT5)酶可商購自供應商例如 BPS Bioscience、Millipore、New England Biolabs 或Sigma-Aldricho
[0498]對於圖13所列途徑合適的蛋白酶為Endo-LysC (用於測定PKMT)和Endo-ArgC (用於測定PRMT)。
[0499](A) G9a概念駘證件FLT蛋白酶保護測定
[0500]選擇PKMT G9a作為概念驗證性研究一個代表性實例，因為它是已被很好表徵的酶(Chin, H.G., Pradhan, Μ., Esteve, Ρ_0., Patnaik, D., Evans Jr., Τ.C 和 Pradhan, S.,Biochemistry,2005,44,12998-13006)(Patnaik, D., Chin, H.G., Esteve, Ρ_0., Benner,J.，Jacobsen, S.Ε.和 Pradhan, S.，J.Biol.Chem.，2004，279，53247-53258)。不同長度的組蛋白妝被報導為底物(Rathert, P.，Dhayalan, A.，Murakami, Μ.，Zhang, X.，Tamas, R.，Jurkowska, R., Komatsu, Y., Shinkai, Y., Cheng, X., and Jeltsch, A., Nat.Chem.Biol.,2008，4，344-346)，並且其可商購自多個供應商。G9a首先將甲基轉移到組蛋白H3之N端尾區的殘基上。延長暴露於G9a可導致賴氨酸-9變為二甲基化或三甲基化。最近報導了使用Caliper微流體轉移技術(Caliper' s microfluidic shift technology)的用於G9a的蛋白酶保護測定(Wigle, T.J.，Provencher, L.Μ.，Norris, J.L, Jin, J.，Brown, P.J.，Frye,S.V.，Janzen，ff.P.，Chem.Biol.,2010,17，695-704)。
[0501]在第一種情況下，基於組蛋白H3N端序列合成了一系列肽作為G9a的可能底物(圖14)。如對於脫亞氨酶類酶所舉例說明的，基於FLT的蛋白酶保護法的可行性需要併入長壽命螢光團(例如，9AA)並且在靶殘基(在這種情況下為賴氨酸-9)的對側上併入調節殘基(例如，色氨酸)。這些部分的併入必須對G9a的識別沒有不利影響，但是，它們必須合適地進行布置使得螢光團的FLT對於工作測定範圍來說是足夠的。
[0502]肽4:9AA-TARK9STGff-C0NH2
[0503]肽5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
[0504]肽6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
[0505]肽7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
[0506]肽8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2 [0507]肽9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2
[0508]如實驗章節所述通過標準Fmoc固相肽合成(SPPS)合成肽。在染料連接位點處肽5和9包含Boc-Lys (Fmoc) -0H,而肽6~8包含Fmoc-Lys (ivDde) -0H,從而能夠得到正交的側鏈脫保護。使用HOCt/DIC活化在樹脂上用3-(9-氨基吖啶-2-基)-丙酸標記肽，然後使用標準TFA切割混合物進行切割。經反相HPLC純化肽並參照9AA的摩爾消光係數進行等分(在 1:1MeCN/ 水中在 405nm 處為 8735M_1cm_1)。
[0509]選擇Endo-LysC作為蛋白酶,原因是已知它切割賴氨酸殘基的C端,但是當這樣的殘基被甲基化時不切割。
[0510]在384孔黑色微孔板(Greiner)中建立測定，其中每個孔包含20 μ L測定緩衝液(20mM Tris.HCl pH8.0,25mM NaCl, ImM DTT，0.025%吐溫-20)中的肽底物(I μ M)、S-腺苷甲硫氨酸(SAM) (100 μ Μ)和G9a(Millipore，500nM)。測定在室溫下進行2小時，然後使用 NanoTaurus 讀板器(Edinburgh Instruments Ltd.)測量 FLT。然後用 2nM 蛋白酶(Endo-LysC) (IOyL)處理每個孔並且將板在室溫下孵育60分鐘。然後再次測量FLT。包括不包含G9a或不包含蛋白酶的對照。測定的結果示於圖15中。
[0511]在不存在G9a處理的情況下，對於肽4觀察到FLT最大的蛋白酶依賴性提高(5.8ns)，發現肽9提高最小(2.4ns)。該觀察不出乎意料，原因是9AA與色氨酸之間的分隔距離在肽4中最小並且在肽9中最大。比較用G9a與不用G9a處理的孔在蛋白酶處理後FLT的提高，明顯看出對於所有的肽，暴露於G9a的那些提高較小，表明了蛋白酶保護的程度。肽9在似乎提供完全蛋白酶保護從而指明高度賴氨酸甲基化的方面是獨一無二的(SP，蛋白酶處理後的FLT與肽對照保持相同)。該肽具有預甲基化的賴氨酸-4以防止在該殘基處被切割並且它可以是在該位點的小修飾，對G9a比殘基缺失或替換更耐受。比較通過另外五種肽底物提供的蛋白酶保護，似乎它們中的每一種之間差異很小(圖15)。因此，決定推動使用肽4和9，原因是前者提供了最大的動態範圍，而後者似乎是G9a的更好底物。
[0512]G9a 滴定
[0513]在384孔黑色微孔板(Greiner)中將肽4和9與20 μ L測定緩衝液中的SAM(IOOyM)和不同濃度的G9a(Abcam) —起孵育。測定在室溫下進行2小時，之後如先前所述測量FLT。然後添加2nM Endo-LysC(10 μ L/孔)並在與蛋白酶孵育10分鐘和60分鐘後再次測量FLT。
[0514]由圖16Α所示數據看出，直至添加蛋白酶後為止任一種肽的FLT都沒有明顯變化，即賴氨酸甲基化不直接引起FLT的變化。因此，蛋白酶切割後，與對照孔相比的測定孔的FLT差異是G9a活性的直接結果。
[0515]50nM G9a足以為肽4和9賦予完全的蛋白酶保護(圖16B~E)。該濃度比用於使用來自Millipore的G9a產生類似數據的濃度(圖15)小十倍,強調了 Abcam酶更大的活性。數據還示出肽9是比肽4更活潑的底物，如通過該肽在較低G9a濃度下發生蛋白酶保護所證明(圖16B~E)。該發現與肽9相比於肽4的較長序列提供G9a更大程度的選擇
性相一致。
[0516]比較圖16B與16C和16D與16E，清楚地看出延長與Endo-LysC的孵育(60分鐘對10分鐘)不引起FLT的可評估變化，表明在10分鐘後發生了完全切割。因此，在所有的後續實驗中在與Endo-LysC孵育10分鐘後收集數據。
[0517]甲某化的證據
[0518]為了確定底物甲基化確實在G9a存在下發生，在微型離心管中使用肽4和9進行測定，以規律的時間間隔取樣並通過RP-HPLC和ES1-MS進行分析。測定條件如下:測定緩衝液(150 μ L)中的肽底物(15 μ Μ)、G9a (IOOnM)、SAM (100 μ M)。使用 Luna C18 柱和 O ~50% MeCN+0.1% TFA的梯度進行30分鐘的分析。相關譜示於圖17和18中。
[0519]對於使用肽4作用底物的測定，在與G9a延長孵育後出現了保留時間比底物晚的第二峰(圖17B)。當使用肽9時，沒有看到這樣的第二峰，但是這可能是因為使用當前的梯度方法不足以分離。收集相關峰並通過ES1-MS分析以證明甲基化(圖19~20)。
[0520]保留時間比肽4晚之峰的ES1-MS分析表明它對應於甲基化產物，並且清晰可見單甲基化(m/zll66)和二甲基化(m/zll80)物質的正確質量(圖19B)。因為對於使用肽9的測定沒有清晰可見的確定的第二峰，所以收集包含405nm吸光度的整個峰並通過ES1-MS進行分析。不出乎意料地，在t = O時，該峰僅包含底物的質量(m/zl936)(圖20A)。但是，在與G9a孵育6小時後，雖然一些證據表明有底物殘餘，但是現已有單甲基化(m/zl950)和二甲基化(m/zl964)產物的清晰信號(圖20B)。因此，這些結果為肽4和9在暴露於甲基轉移酶G9a後轉化為其甲基化等價物提供了直接證據。
[0521]G9a測定時間討稈
[0522]測定在不同G9a濃度下使用肽4和9 (I μ Μ)在384孔微孔板中進行，反應用SAM(IOOyM)開始並且以規律的間隔通過添加Endo-LysC(2ηΜ)終止。孵育10分鐘後，測量FLT以證明通過G9a催化賴氨酸甲基化引起的蛋白酶保護。、[0523]如由圖21~22可看出的，在添加Endo-LysC之前任一種肽的FLT都沒有變化。但是，在添加蛋白酶並與其孵育後，FLT調節的程度作為G9a濃度和測定時間的函數而改變，這與賦予蛋白酶保護的賴氨酸甲基化相一致。在t = O時,用Endo-LysC處理導致FLT由
11.2ns提高至17.0ns (對於肽4)以及由13.5ns提高至16.5ns (對於肽9),這與無調節和蛋白酶對底物的完全切割相一致。反應的線性對於多個時間過程是明顯的。
[0524]對SAM的依賴件
[0525]使用肽4和9 二者作為底物研究了 G9a測定對SAM的依賴性。測定在384孔微孔板中使用測定緩衝液(20 μ L)中的25ηΜ或IOnM G9a和I μ M底物進行。SAM濃度在200 μ M至0.4μ M之間變化並且測定在室溫下孵育2小時。完成後，將Endo-LysC(2ηΜ)添加到每個孔中並在10分鐘孵育期後測量FLT。圖23中示出的數據確定了 G9a活性對SAM濃度的依賴性，Km (app) = 3 ~11 μ M。
[0526]抑制劑滴定
[0527]為了證明用於G9a的FLT蛋白酶保護測定適用於抑制劑篩選，購買了已知的非SAM競爭性G9a抑制劑BIX-01294 (Merck Chemicals Ltd.)並在測定中進行測試。條件如下:測定緩衝液(20 μ L)中的81父-01294(20(^]?-2011]\0、69&(2511]\1或1011]\0、3八釐(1(^]\0 和肽底物(I μ Μ)。反應在384孔微孔板中在室溫下進行2小時並通過添加Endo-LysC (2ηΜ)終止。
[0528]將肽9作為底物，對於ΒΙΧ-01294測定IC5tl = 1.6 μ Μ，與1.9 μ M的文獻值相一致(Chang, Y., Zhang, X., Horton, J.R., Upadhyay, A.Κ., Spannhoff, A., Liu, J., Snyder,J.P., Bedford, Μ.T.和 Cheng, X.,Nat.Struct.Biol.,2009,16，312-317)。相比之下，使用肽4的測定恢復為IC5tl ^ 28nM(在較低抑制劑濃度下不能變平)(圖24)。值的差異可能是因為抑制的機制不同， 因為已知BIX-01294是組蛋白H3競爭性抑制劑並且肽4和9的序列不同可影響抑制劑結合。
[0529]V -閔子
[0530]為了證明G9a FLT測定與高通量篩選(HTS)兼容，確定了 V -因子的值。
[0531]在384孔微孔板中建立測定，其中半個板包含G9a(BPS Bioscience) (625pM)、肽9(1μΜ)和SAM(lOOyM)，而另外半個板包含G9a(625pM)、肽9(1μΜ)並且不含SAM。最終測定體積為20yL，將板在室溫下孵育I小時，此時將測定緩衝液(ΙΟμ?中的Endo-LysC (2ηΜ終濃度)添加到每個孔中。在室溫下再孵育10分鐘後，測量FLT並計算Ζ』因子為0.71，證明了測定對於HTS篩選的適用性(圖75)。
[0532]總之，設計了用於FLT蛋白酶保護測定的賴氨酸甲基轉移酶G9a的新型肽底物，其併入了長壽命螢光團(9AA)和芳族調節劑殘基(色氨酸)。已證明兩種肽在與G9a孵育後的甲基化並且已表明該過程賦予了蛋白酶保護，正如通過添加蛋白酶Endo-LysC後持續的FLT調節所確定的。通過進行酶、SAM和抑制劑滴定驗證了測定性能，並且測定所確定的V -因子0.71適用於HTS應用。
[0533]考慮這樣的途徑不限於G9a，而是使用適當設計的肽底物可轉用於其他蛋白質甲基轉移酶。也可採用另一些長壽命螢光團和/或調節劑。
[0534](B)用於Set7/9賴氨酸甲基轉移酶的FLT蛋白酶保護測定
[0535]在測定蛋白質甲基轉移酶的FLT蛋白酶保護法的另一個實例中，Set7/9(賴氨酸甲基轉移酶)被驗證為合適的靶標。
[0536]Set7/9在另一些蛋白質靶標中使組蛋白H3的Lys4甲基化(Wilson等，Cell2002，
111,105-115) O重組Set7/9可商購自供應商例如BPS Bioscience。
[0537]合成肽12作為Set7/9的底物，所述肽12由組蛋白H3N端序列組成並且在N端併入色氨酸殘基並且併入與賴氨酸-9殘基相連接的9-氨基吖啶螢光團。
[0538]肽I2:WARTK4QTARK (9AA) STGGKAPRKQLAK_CONH2
[0539]甲某化的證據
[0540]將肽12(15μΜ)與測定緩衝液(20mM Tris pH8,25mM NaCl, ImM DTT，0.025%吐溫-20) (200 μ L)中的Set7/9(172nM)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM) (100 μ M)孵育，以規律的時間間隔取出等量份並通過RP-HPLC和ES1-MS進行分析以確定Set7/9對肽底物的甲基化程度。測定在室溫下進行並分別在O小時、2小時和6小時的時間間隔取樣。
[0541 ] 通過圖36中的HPLC譜示出6小時時間過程中的測定進展。6小時後，保留時間由tE = 18.3分鐘(在O小時)清楚地變化為tK = 18.4分鐘。通過ES1-MS分析峰確定質量變化為14amu，這與添加一個甲基相一致(圖37)。6小時後，檢測到非常少的底物質量(m/Z2814)，並且對應於單甲基化肽的m/z2828作為主要物質存在。還觀察到對應於二甲基化肽的小峰(m/z2842)(圖37)。
[0542]為了測試Set7/9對肽12的甲基化是否提供了針對Endo-LysC催化切割的保護，用測定緩衝液將測定混合物稀釋至I μ M的濃度並將20 μ L所得溶液添加到384孔黑色微孔板的三個孔中。將10 μ L Endo-LysC (終濃度2ηΜ)添加到每個孔中並將板在室溫下孵育15分鐘後使用NanoTaurus讀板器測量FLT。包括僅有相同濃度肽的對照用於比較。
[0543]在Set7/9不存在下，在與2nM Endo-LysC孵育後肽12的FLT提高2.4ns (圖38)。相比之下，對於在與Endo-LysC孵育之前暴露於Set7/9的肽12觀察到FLT沒有顯著提高。這些發現與Set7/9催化的肽12甲基化提供了對於蛋白酶誘導切割的保護相一致。
[0544]Set7/9測定時間討稈
[0545]測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進行並且包含在測定緩衝液中的肽12(1μΜ)和Set7/9酶(100nM、50nM、25nM或12.5nM)中。以規律的間隔通過添加10 μ LEndo-LysC (終濃度2ηΜ)終止反應。在室溫下與Endo-LysC孵育15分鐘後測量FLT。使用NanoTaurus讀板器將所有測量一式兩份地進行。
[0546]由圖39Α可以看出，在添加Endo-LysC之前肽12的FLT變化很小。然後在添加蛋白酶並與其孵育後，FLT調節的程度作為Set7/9濃度和測定時間的函數而改變，這與賴氨酸甲基化賦予蛋白酶保護相一致(圖39B)。底物與產物之間的總壽命變化為約2.4ns。總之，通過測定的所測量螢光壽命降低來報導通過Set7/9的甲基化。
[0547]為了提高測定的總動態範圍，合成了肽13。該肽由於缺失鄰近N端的丙氨酸殘基而比肽12短一個胺基酸。預計該改變通過使色氨酸更接近9AA螢光團使對底物FLT的調節提高。肽13所測量的FLT為13ns，比肽12的短約1.5ns,因此肽13提供了提高Set7/9測定動態範圍的機會。然而，為了實現這樣的提高，肽13必須被Set7/9成功甲基化。因此，為了確定Set7/9測定中肽13的活性，使用用於肽12的相同條件重複上述時間過程。
[0548]肽13: wrtk4qtark (θαα) stggkaprkqlak-conh2
[0549]肽13的FLT變化直至添加蛋白酶Endo-LysC之前都不明顯(圖40A)。然而，在與Endo-LysC在室溫下孵育15分鐘後，測定孔的FLT作為Set7/9濃度和測定時間的函數而改變，這與肽13的甲基化提供蛋白酶保護相一致(圖40B)。重要地，測定的最大範圍現已提高至4ns，從而使靈敏度提高。因此，使用肽13作為底物進行了 Set7/9FLT測定的進一步驗證。
[0550]S-腺苷甲硫氨酸(SAM)滴定
[0551]使用肽13作為底物研究了 Set7/9測定對SAM輔因子的依賴性。測定使用25nMSet7/9和I μ M底物在測定緩衝液(20 μ L)中在室溫下在384孔微孔板中進行2小時。SAM濃度在100 μ M至1.7ηΜ之間變化。完成後，向每個孔中添加Endo-LysC (2ηΜ)並且在20分鐘孵育期後測量FLT。圖41所示數據確定了 Set7/9活性對SAM濃度的依賴性，Km (app)=500nM。
[0552]S-腺苷高半胱氨酸抑制劑滴定
[0553]為了證明用於Set7/9的FLT蛋白酶保護測定適合於抑制劑篩選，購買了已知的SAM競爭性抑制劑S-腺苷高半胱氨酸(S-adenosylhomocysteine，SAH) (Sigma)並在測定中進行測試。條件如下:測定緩衝液(20 μ L)中的5六!1(11111至1.3 4釐)、56七7/9(501^)、SAM(500nM)和肽13(1μΜ)。反應在384孔微孔板中在室溫下進行2小時並且通過添加Endo-LysC (2ηΜ)終止。
[0554]對於SAH，確定了 IC5tl = 37 μ M(圖42)，這比得上所報導的使用較低濃度SAM得到的 16 μ M 的 IC50 (Gauthier, N.；Caron, M.；Pedro, L.；Arcand, M.；Blouin, J.；Labonte, A.；Normand, C ；Paquet, V.；Rodenbrock, A.；Roy, M.；Rouleau, N.；Beaudet, L.；Padr □ s, J.；Rodriguez-Suarez, R.J.Biomol.Screen.,2012,17,49-58)。
[0555]V -閔子
[0556]為了證明Set7/9FLT測定與高通量篩選(HTS)法兼容，確定了 V -因子的值。
[0557]在384孔微孔板中建立測定，其中半個板包含Set7/9(25nM)、肽13(1μΜ)和SAM(100 μ Μ)，而另外半個板包含Set7/9 (25nM)、肽13 (I μ Μ)，但是將SAM替換為測定緩衝液。最終測定體積為20 μ L，將板在室溫下孵育2小時，此時將測定緩衝液(10 μ L)中的Endo-LysC (2ηΜ終濃度)添加到每個孔中。在室溫下再孵育15分鐘後，測量FLT並計算V因子為0.81(圖43)。
[0558]總之，兩種新型肽(肽12和13)已被驗證為用於FLT蛋白酶保護測定中賴氨酸甲基轉移酶Set7/9的底物。測定的基礎是使用9AA標記肽底物，其併入了在通過在鄰近賴氨酸殘基處特異性切割的蛋白酶Endo-LysC之作用而將調節劑與螢光團分開之前調節9AA之FLT的芳族部分(例如色氨酸)。通過Set7/9進行的賴氨酸甲基化賦予了免於Endo-LysC切割的保護，從而維持肽FLT的調節。因此，通過測定的所測量FLT降低來報導賴氨酸甲基化。
[0559]通過進行酶、SAM和抑制劑滴定驗證了 FLT Set7/9測定的性能,並且測定所確定的0.81的Z』 -因子適合於HTS應用。
[0560]該研究為用於蛋白質賴氨酸甲基轉移酶的FLT蛋白酶保護測定提供了另外的示例，並且將該方法延伸到賴氨酸-4組蛋白甲基轉移酶Set7/9。
[0561](OPRMT5概念駘證FLT蛋白酶保護測定
[0562]PRMT5是PRMT的概念驗證FLT蛋白酶保護測定的合適候選物。該酶可商購自BPS Bioscience並且優先對稱地甲基化組蛋白H4上的精氨酸3和組蛋白H3上的精氨酸8 (Branscombe 等，J Biol.Chem2001，276，32971-32976)。以下示出用於 FLT 測定的合適底物:
[0563]肽15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK_CONH2
[0564]肽15基於組蛋白H4的N端序列，含有通過賴氨酸側鏈連接的9AA和在N端併入以調節未受損肽中9AA之FLT的色氨酸殘基。預計用Endo-ArgC處理在精氨酸_3處切割肽(由鄰近N端的絲氨酸殘基開始計數)，從而將9AA與色氨酸分開，導致FLT提高。PRMT5對精氨酸-3的甲基化可防止通過Endo-ArgC的切割，從而維持9AA之FLT的調節。相比之下，PRMT5抑制劑的存在會防止精氨酸甲基化，從而使肽在精氨酸-3處對蛋白酶誘導的切割敏感。由此，9AA的FLT會提高並且提高的程度可與抑制程度相關。
[0565]Endo-ArgC 切割
[0566]為了檢查肽15的蛋白酶切割，在包含測定緩衝液(20mM Tris pH8,25mM NaCl,lmMDTT，0.025% 吐溫-20) (30 μ L)中的肽 15(1μΜ)和不同濃度 Endo-ArgC (Merck ChemicalsLtd.) (IOnM至1.25nM)的384孔微孔板中製備測定。在I小時中以規律的間隔測量FLT，並且測量在NanoTaurus讀板器上一式三份地進行。
[0567]經Endo-ArgC成功切割的肽15導致FLT由9.4ns提高至17.2ns (圖45)。FLT的這種大的改變提供了 PRMT5之靈敏測定的可能性。
[0568]甲某化的證據
[0569]將肽15(15μΜ)與測定緩衝液(20mM Tris pH8,25mM NaCl, ImM DTT，0.025%吐溫-20) (200 μ L)中的PRMT5 (150nM)和S-腺苷甲硫氨酸(SAM) (100 μ Μ)孵育，以規律的時間間隔取出等量份並通過RP-HPLC和ES1-MS進行分析以確定PRMT5對肽底物的甲基化程度。測定在室溫下進行並分別在O小時、3.5小時和17.5小時時間間隔取樣。
[0570]通過圖46中的HPLC譜示出17.5小時時間過程中的測定進展。17.5小時後，保留時間由tK = 20.0分鐘(在O小時)清楚地改變為tK = 20.3分鐘。通過ES1-MS分析峰確定了由底物(m/z2466)向單甲基化產物(m/z2480)的質量變化(圖47)。此外，還觀察到對應於二甲基化肽的小峰(m/z2494)(圖47)。
[0571 ] 雖然由RP-HPLC看出反應仍然沒有 完成，但是通過以下過程來測試用蛋白酶處理後對FLT的影響:用測定緩衝液將測定混合物稀釋15倍並且將20 μ L所得溶液添加到384孔微孔板的三個孔中。將10 μ LEndo-ArgC (終濃度為IOnM)添加到每個孔中，並且將板在室溫下孵育60分鐘後測量FLT。包括僅有相同濃度肽的對照用於比較。注意，這裡使用的Endo-ArgC來自於不同供應商(Sigma)並且證明活性小於用於產生圖45中數據的批次。因此，使用更高濃度和更長時間。
[0572]在PRMT5不存在下，在與IOnM Endo-ArgC孵育後，肽15的FLT提高了 6.9ns (圖48)。相比之下，對於在與Endo-ArgC孵育之前暴露於PRMT5的肽15，FLT提高了 4.7ns。該提高可歸因於測定混合物中存在的剩餘底物，並且由於PRMT5催化的甲基化提供了蛋白酶保護而沒有實現完全提高。
[0573]PRMT5測定時間討稈
[0574]在384孔黑色微孔板中以20μ L體積進行測定並且在測定緩衝液中包含肽15 (I μ Μ)和 PRMT5 酶(100ηΜ、50ηΜ、25ηΜ 或 12.5ηΜ)。以規律的間隔通過添加 10 μ LEndo-ArgC (終濃度1.25nM)終止反應。在室溫下與Endo-ArgC孵育15分鐘後測量FLT。使用NanoTaurus讀板器將所有測量一式三份地進行。
[0575]由圖49可以看出，在添加Endo-ArgC之前肽15的FLT沒有變化。但是，在添加蛋白酶並與其孵育後，FLT調節的程度作為PRMT5濃度和測定時間的函數而改變，這與精氨酸甲基化賦予蛋白酶保護相一致。因此，通過測定的所測量螢光壽命降低來報導通過PRMT5的精氨酸甲基化。
[0576]西奈芬淨抑制劑滴定
[0577]為了證明用於PRMT5的FLT蛋白酶保護測定適合於抑制劑篩選，購買了已知的通用SAM競爭性抑制劑西奈芬淨(Sigma)並在測定中進行測試。條件如下:測定緩衝液(20 μ L)中的西奈芬淨(2mM 至 0.lyM)、PRMT5(50nM)、SAM(10yM)和肽 15 (I μ Μ)。反應在室溫下在384孔微孔板中一式三份地進行3小時，並且通過添加Endo-ArgC(InM)終止。對於西奈芬淨測定IC5tl為13 μ M(圖51)。該抑制劑針對PRMT5的IC5tl值先前在同行評審的文獻中未有報導。
[0578]總之，該工作為使用Endo-ArgC作為特異性蛋白酶的蛋白質精氨酸甲基轉移酶提供了 FLT蛋白保護測定的示例。同時，使用PRMT5進行舉例說明，使用適當設計的肽底物可將這樣的方法延伸至其他PRMT。
[0579](D)用於ΕΖΗ2賴氨酸甲基轉移酶的FLT蛋白酶保護測定
[0580]在測定蛋白質甲基轉移酶的FLT蛋白酶保護法的另一個示例中，ΕΖΗ2( —種賴氨酸甲基轉移酶)被驗證為合適的靶標。
[0581]ΕΖΗ2使組蛋白Η3上的賴氨酸-27甲基化並且在與四種其他蛋白質(EED、SUZ12、RbAp48和ΑΕΒΡ2)複合時具有活性。人重組五元複合體可得自於BPS Bioscience。EZH2酶的突變與非霍奇金淋巴瘤之某些形式的惡性腫瘤的風險提高相關(Morin，R.D.Johnson,N.A.；Severson, T.M.；Mungall, A.J.；An, J.；Goya, R.；Paul, J.E.；Boyle, M.；Woolcock,B.W.;Kuchenbauer，F.;Yap，D.;Humphries，R.K.;Griffith，0.L ；Shah, S.;Zhu，H.；Kimbara, M.；Shashkin, P.；Chariot, J.F.；Tcherpakov, M.;Corbett，R.；Tam, A.;Varhol，R.;Smailus，D.;Moksa，M.;Zhao，Y.;Delaney，A.;Qian，H.;Birol，1.;Schein，J.；Moore, R.；Holt, R.；Horsman, D.E.；Connors, J.M.；Jones, S.；Aparicio, S.；Hirst, M.；Gascoyne, R.D.；Marra, M.A.Nat.Genet.2010，42，181-185)。因此，藥物發現小組努力探索有助於尋找EHZ2的小分子抑制劑的測定。
[0582]基於H3K27序列的肽是EZH2酶複合體的合適底物，並且這樣的肽被修飾成包含9AA發光團和色氨酸殘基，從而能夠開發用於該酶的FLT蛋白酶保護測定(圖68)。
[0583]肽20:PRKQLATK (9AA) AARK27SAPATGGff-CONH2
[0584]將肽20暴露於賴氨酸特異性蛋白酶(例如Endo-LysC)將在鄰近賴氨酸_27處切害I]，導致9AA與色氨酸殘基的調節作用分開，導致FLT提高。相比之下，當賴氨酸-27通過EZH2的作用而被甲基化時，通過Endo-LysC在該殘基處的切割不再可能，從而維持了對9AA之FLT的調節。因此，通過測定的所測量FLT降低來報導EZH2甲基化。
[0585]妝20的Endo-LysC切害
[0586]通過在測定緩衝液(20mMBicine pH7.6,50mM NaCl，0.002% 吐溫-20，0.005%BSA, ImM DTT) (20 μ L)中不同濃度的Endo-LysC (4~OnM)存在下在包含肽20 (I μ M)的384孔h1-base微孔板中研究肽20的蛋白酶切割。I小時中以規律的間隔測量FLT，並且測量在NanoTaurus讀板器上一式三份地進行。
[0587]通過Endo-LysC切割肽20導致FLT的時間和濃度依賴性提高，原因是賴氨酸_27處的切割導致9AA與色氨酸的調節作用分開(圖69)。FLT由12ns提高至16ns，為測定提供了良好的動態範圍。
[0588]EZH2測定時間討稈
[0589]測定在384孔h1-base黑色微孔板中以10 μ L體積進行並且包含緩衝液(20mMBicine pH7.6,50mM NaCl，0.002 % 吐溫-20，0.005 % BSA，ImM DTT)中的肽 20 (I μ Μ)、SAM (3 μ Μ)和ΕΖΗ2複合體(200ng/孔至75ng/孔)。以規律的間隔通過添加10 μ LEndo-LysC (終濃度4ηΜ)終止反應。在室溫下與Endo-LysC孵育35分鐘後測量FLT。所有測量使用NanoTaurus讀板器一式兩份地進行。
[0590]由圖70可以看出，在與蛋白酶孵育後，所測量的FLT作為ΕΖΗ2濃度和測定時間的函數而降低，這與賴氨酸-27的甲基化賦予針對蛋白酶誘導切割的保護相一致。關於75和IOOng/孔ΕΖΗ2，響應都是線性的，選擇後一濃度用於後續的實驗。注意，由於ΕΖΗ2複合體的周轉率較低，所以使測定運行較長的一段時間。總之，通過測定的所測量螢光壽命降低來報導通過ΕΖΗ2的甲基化。
[0591]S-腺苷甲硫氨酸(SAM)滴定
[0592]使用肽20作為底物研究了 ΕΖΗ2測定對SAM輔因子的依賴性。測定使用IOOng/孔ΕΖΗ2複合體和I μ M底物在測定緩衝液(10 μ L)中在室溫下在384孔h1-base微孔板中進行5小時。SAM濃度在100 μ M至0.05 μ M之間變化。完成後，向每個孔中添加Endo-LysC (4ηΜ)並且在15分鐘孵育期後測量FLT。將數據在GraphPad Prism中擬合至可變斜率劑量響應模型(variable slope dose-response model)以確定 SAM 的 Km(app)。
[0593]由圖71看出，在EZH2測定中SAM的KM(app)測定為0.71μΜ。該值與放射性計量測定形式中確定的文獻值 0.21 至 0.30 μ M(Sneeringer, C.J.；Scott, M.P.；Kuntz,K.W.；Knutson, S.K.;Pollock，R.M.;Richon，V.M.；Copeland, R.A.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A2010，107，20980-20985)非常吻合。
[0594]S-腺苷高半胱氨酸(SAH)抑制劑滴定
[0595]為了證明用於EZH2的FLT蛋白酶保護測定適合於抑制劑篩選，購買了已知的通用SAM競爭性抑制劑SAH(Sigma)並在測定中進行測試。條件如下:測定緩衝液(IOyL)中的SAHdmM ~0.05 μ Μ)、ΕΖΗ2 複合體(lOOng/ 孔),SAM (3 μ Μ)和肽 20 (I μ Μ)。反應在 384 孔h1-base微孔板中在室溫下進行5小時(重複三次)並通過添加Endo-LysC(4nM)終止。
[0596]對於SAH,確定IC50為9.7 μ M (圖72)。針對ΕΖΗ2的該抑制劑的IC50值先前在同行評審的文獻中未有報導。
[0597]總之，肽20已被驗證為用於FLT蛋白酶保護測定中賴氨酸甲基轉移酶ΕΖΗ2的底物。測定的基礎是使用9ΑΑ標記肽底物，其併入了在調節劑與螢光團被在鄰近賴氨酸殘基處特異性切割的蛋白酶Endo-LysC之作用而分開之前調節9ΑΑ之FLT的芳族部分(例如，色氨酸)，從而維持對肽FLT的調節。因此，通過測定的所測量FLT降低來報導賴氨酸甲基化。
[0598]通過進行酶、SAM和抑制劑滴定證明FLT ΕΖΗ2測定性能。[0599]該研究為蛋白質賴氨酸甲基轉移酶提供了 FLT蛋白酶保護測定的另一個示例，並且將該方法延伸至賴氨酸-27組蛋白甲基轉移酶EZH2。
[0600]實施例3-用於蛋白質脫甲基酶的FLT保護測定
[0601]圖25示出了通過FLT蛋白酶保護法測定蛋白質脫甲基酶(PDM)的方法，所述脫甲基酶將一個或更多個甲基從肽/蛋白質底物的賴氨酸或精氨酸殘基中移除。在這裡，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合適的報導分子)的底物壽命受序列中色氨酸殘基(或其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。用在賴氨酸或精氨酸之後切割的蛋白酶處理底物不引起蛋白質水解並且保留了通過色氨酸的壽命調節。通過適當PDM酶進行賴氨酸或精氨酸脫甲基化後，然後用蛋白酶處理產物肽引起賴氨酸或精氨酸後的切割並且螢光團(9AA)的壽命不再受調節。
[0602]重組PKDM(例如，LSDl，Jumonji結構域類)酶可商購自供應商例如BPS
Bioscience、Millipore 或 Enzo-Life Sciences。迄今為止鑑定的唯--種 PRDM 為
JMJD6 (Cheng, B.，Chen, Y.，Zhao, Y.，Bruick, R.K.，Science，2007，318，444-447)，但是最近的研究反駁其聲稱的脫甲基酶活性，認為其主要作用是催化賴氨酸殘基的水解(Webby，C.J.，Wolf, A.，Gromak, N.，Dregerj Μ.，Kramer, H.，Kessler, B.，Neilsen，M.L，Schmitz,C，Butler, D.S.，Yates III，J.R.，Delahunty, C.M.，Hahn, P.，Lengeling，A.，Mann, M.，Proudfoot, N.J.，Schofield, C.J.和Bottger, A.，Science，2009，325，90-93)。
[0603]JHDMlA是用於PKDM之概念驗證FLT蛋白酶保護測定的合適候選物。該酶可商購自BPS Bioscience並且優先使組蛋白H3上的賴氨酸-36脫甲基化，將其由二甲基化或單甲基化狀態轉化為天然的未甲基化殘基(Tsukada，U.等，Nature，2006，439，811-826)。用於FLT測定的合適底物是圖26所示的肽10。
[0604]在圖26所示的這個實施例中，9AA的FLT受在C端附近合併的色氨酸殘基之存在的調節。JHDMlA對賴氨酸-36的脫甲基化允許該殘基處的蛋白酶誘導切割，從而減輕調節並導致9AA的FLT提高。相比之下，JHDMlA抑制劑的存在可防止賴氨酸脫甲基化，從而使肽在賴氨酸-36處保留對蛋白酶誘導切割的抗性。因此，9AA的FLT仍受調節並且調節程度可與脫甲基化的程度相關。對於該目的合適的蛋白酶是Endo-LysC，其不切割甲基化賴氨酸(賴氨酸-37作為單甲基衍生物被保護以防止該殘基的非特異性切割)。Endo-LysC可商購自供應商例如Thermo-Fisher。
[0605]THDMlA 測定
[0606]測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進行並且包含測定緩衝液(50mM Tris,pH7.4，100 μ M抗壞血酸鈉，10 μ M硫酸亞鐵銨，100 μ Ma-酮戊二酸鹽，0.01%吐溫-20)中的肽10(1 μ Μ)和JHDMlA酶(150ηΜ)。還包括僅包含肽的對照孔。在室溫下孵育5小時後，將IOyL Endo-LysC(30nM)添加到孔中並在室溫下將板孵育直至120分鐘。然後在NanoTaurus讀板器上一式三份地測量FLT。
[0607]肽10對照的FLT在與蛋白酶孵育後不提高，這與甲基化賴氨酸賦予蛋白酶保護導致固有色氨酸殘基對9AA之FLT的持續調節相一致(圖35)。相比之下，在與JHDMlA反應後，肽10的FLT在蛋白酶處理後提高超過Ins。該結果與JHDMlA對賴氨酸-36的脫甲基化使得肽對Endo-LysC切割敏感相一致(圖35)。因此，通過測量的螢光壽命提高來報導脫甲基酶對底物的脫甲基化，並因此報導脫甲基酶活性。[0608]這些結果證明FLT蛋白酶保護策略可延伸至測定蛋白質脫甲基酶靶標類。
[0609]實施例4-用於組蛋白乙醯轉移酶的FLT蛋白酶保護測定
[0610]圖27示出了通過FLT蛋白酶保護法測定組蛋白乙醯轉移酶(HAT)的方法，所述乙醯轉移酶使肽/蛋白質底物中的賴氨酸殘基乙醯化。在這裡，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合適的報導分子)的底物壽命受序列中色氨酸(或其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。用在賴氨酸之後切割的蛋白酶處理底物將引起蛋白酶水解並移除色氨酸殘基對螢光壽命的調節。通過適當的HAT酶使賴氨酸乙醯化後，然後用蛋白酶處理產物肽不引起賴氨酸後的切割並且螢光團(9AA)的壽命仍受調節。
[0611]重組HAT酶(例如，Gcn5、PCAF、Hatl、p300)可商購自供應商例如abnova或millipore。
[0612]基於在具體HAT乙醯化位點的賴氨酸殘基對側併入螢光團和調節殘基的組蛋白N端序列的肽底物可形成該類酶FLT蛋白酶保護測定的基礎。肽16是基於具有PCAT乙醯化位點K14的組蛋白H3序列(圖28)。
[0613]肽16 =WQTARK (Me) STGGK14APRK (9AA) QLATK_C0NH2
[0614]妝 16 的 Endo-LysC 切割
[0615]通過在Endo-LysC (25nM)存在或不存在下，在包含測定緩衝液(50mM Tris pH8，0.1mM EDTA, ImM DTT, 0.05% BSA) (30 μ L)中的肽16 (I μ Μ)的384孔微孔板中進行測定研究了肽16的蛋白酶切割。I小時中以規律的間隔測量FLT，並且測量在NanoTaurus讀板器上一式三份地進行。
[0616]當與Endo-LysC孵育I小時後，肽16的FLT由13.9ns提高至15.7ns (圖52)。相比之下，在Endo-LysC不存在下,FLT在該時間段中保持不變。這些結果與Endo-LysC在賴氨酸-14處的切割導致9AA螢光團與色氨酸殘基的調節作用分開，導致9AA之FLT提高相一致。還設計了第二種底物，其中9AA與色氨酸更接近(圖53)。用肽17重複如上詳述的通過Endo-LysC的切割反應,結果示於圖54中。
[0617]肽17: 9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2
[0618]對於肽17,在暴露於Endo-LysC後FLT由10.2ns提高至15.0ns,提供了 4.8ns的測定範圍，這與肽16觀察到的1.8ns範圍相比有顯著提高。此外，曲線在I小時後沒有變平，提供了通過延長切割反應再進一步提高測定範圍的選擇。
[0619] 乙醯化的證據
[0620]將肽17 (30 μ L)與測定緩衝液(50mM Tris ρΗ8，0.ImM EDTA, ImM DTT, 0.05% BSA)(250 μ L)中的PCAF(IOOnM)和乙醯輔酶A(AcCoA) (50 μ Μ)孵育，以規律的時間間隔取出等量份並通過RP-HPLC和ES1-MS進行分析以確定pCAF對肽底物的乙醯化程度。測定在室溫下進行並且分別在O分鐘、30分鐘、60分鐘和90分鐘時間間隔取樣。
[0621]通過圖55中的HPLC譜示出了 90分鐘時間過程中的測定進展。30分鐘後明顯有一個與底物峰(tK = 16.1分鐘)分開的新峰(tK = 16.7分鐘)出現。通過ES1-MS分析該峰確定tK = 16.7分鐘的新峰的質量比底物高42amu，這與添加一個乙醯基相一致(圖56)。到90分鐘時，底物峰可以忽略，被替換為乙醯化產物的峰。因此，該實驗確定肽17是用於PCAF的良好底物。
[0622]PCAF測定時間討稈[0623]測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進行並且包含測定緩衝液中的肽17(I μ Μ)、AcCoA (50 μ Μ)和PCAF酶(250nM至3InM)。以規律的間隔通過添加10 μ LEndo-LysC (終濃度25ηΜ)終止反應。在室溫下與Endo-LysC孵育90分鐘後測量FLT。所有的測量在NanoTaurus讀板器上一式兩份地進行。
[0624]由圖57A可以看出，在添加Endo-LysC之前肽17的FLT變化可以忽略。但是，在添加蛋白酶並與其孵育後，FLT作為PCAF濃度和測定時間的函數而降低，這與賴氨酸乙醯化賦予了針對蛋白酶誘導切割的保護相一致(圖57B)。總之，通過測定的所測量螢光壽命降低來報導通過PCAF的乙醯化。
[0625]AcCoA 滴定
[0626]研究了 PCAF測定對AcCoA濃度的依賴性。測定使用125nM PCAF和I μ M肽17在測定緩衝液(20 μ L)中在室溫下在384孔微孔板中進行2小時。AcCoA的濃度在25 μ M至0.02 μ M之間變化。反應完成後，向每個孔中添加Endo-LysC (25ηΜ)並在90分鐘孵育期後測量FLT。將數據在GraphPad Prism中擬合至可變斜率劑量響應模型以確定AcCoA的表觀Km。
[0627]由圖58看出，在PCAF測定中AcCoA的KM(app)測定為1.2 μ Μ。該值與報導的KmL 6 μ M(Poux, A.N ；Cebrat, M.；Kim, C.Μ.；Cole, P.A.；Marmorstein, R.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2002，99，14065-14070)相一致。
[0628]總之，肽17已被驗證為用於FLT蛋白酶保護測定中組蛋白乙醯轉移酶PCAF的底物。測定的基礎是使用9AA標記的肽底物，其併入了在調節劑與螢光團被在鄰近賴氨酸殘基處特異性切割的蛋白酶Endo-LysC之作用而分開之前調節9AA之FLT的芳族部分(例如色氨酸)。通過PCAF使賴氨酸乙醯化賦予了對於Endo-LysC切割的保護，從而維持了肽FLT的調節。因此，通過測定的所測量FLT降低來報導賴氨酸乙醯化。
[0629]通過進行酶和SAM滴定驗證FLT PCAF測定性能。
[0630]該研究使用PCAF作為代表性實例為組蛋白乙醯轉移酶的FLT蛋白酶保護測定提供了示例。
[0631]實施例5-用於組蛋白脫乙醯酶的FLT蛋白酶保護測定
[0632]圖29示出了通過FLT蛋白酶保護法測定組蛋白脫乙醯酶(HDAC)的方法，所述脫乙醯酶使肽/蛋白質底物的賴氨酸殘基脫乙醯化。在這裡，9-氨基吖啶(9AA)(或其他合適的報導分子)的底物壽命受序列中色氨酸殘基(或其他已知的螢光壽命調節劑)之存在的調節。底物由於賴氨酸殘基的乙醯化性質而被保護免於被賴氨酸特異性蛋白酶切割，從而維持螢光團的FLT調節。通過適當HDAC的脫乙醯化使得肽在賴氨酸處對蛋白酶誘導切割敏感，導致螢光團與調節序列分開並且FLT隨之提高。重組HDAC酶(例如，HDACl-1K SIRT1-5)可商購自供應商例如 Millipore, Signalchem, Sigma-Aldrich, EnzoLife Sciences 或 BPS Bioscience。
[0633]如圖30所示的底物可適用於基於FLT的蛋白酶保護測定。在這裡，在鄰近脫乙醯化的賴氨酸的C端併入了螢光團(9AA)，並且色氨酸(或其他合適的調節殘基)布置在前述賴氨酸的N端側上。在HDAC催化脫乙醯化後的蛋白酶誘導切割導致FLT提高，原因是9AA與色氨酸殘基被分開。因此，FLT的提高可與HDAC活性直接相關。當然，考慮根據所討論HDAC的序列特異性可採用其他類似地設計的底物。[0634]HDACl是用於組蛋白脫乙醯酶之概念驗證FLT蛋白酶保護測定的合適候選物，原因是它是可商購自供應商例如BPS Bioscience的被很好表徵的酶。雖然已報導HDACl使組蛋白H3上的賴氨酸-27脫乙醯化，但是文獻的證據表明HDACl和其他成員可識別包含圖30所示類型的乙醯化賴氨酸殘基的短肽底物(Riester, D.；Hildmann, C ；Griinewald, S.；Beckers, T.；Schwienhorst, A.Biochem.Biophys.Res.Commun.2007, 357,439-445)。因此，用於HDAC1FLT蛋白酶保護測定的合適底物是以下和圖59示出的肽18
[0635]肽18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2
[0636]肽19 =Ac-1ffKK (9AA) -CONH2
[0637]在肽18的乙醯化賴氨酸殘基的N端側是色氨酸殘基，並且在C端側有其側鏈標記有9AA螢光團的賴氨酸殘基。在未受損的底物中，9AA的FLT受位於附近的色氨酸殘基調節。通過HDACl使賴氨酸殘基脫乙醯化以形成肽19 (圖60)使得肽對適當酶(例如胰蛋白酶)在該位點的切割敏感，導致9AA與色氨酸分開，導致FLT提高。將底物18暴露於胰蛋白酶玉引起切割，原因是所述蛋白酶不識別乙醯化賴氨酸。此外，HDACl抑制劑的存在將阻止賴氨酸脫乙醯化，從而保留肽對蛋白酶誘導切割的抗性。因此，9AA的FLT仍受調節並且調節程度可與抑制程度相關。
[0638]肽18和19的胰蛋白酶切割
[0639]為了檢查肽18和19的蛋白酶切割，在包含測定緩衝液(25mM Tris pH8,137mMNaCl,2.7mM KCl, ImM MgCl2,0.01% BSA) (30 μ L)中的肽 18 (I μ M)或 19 (I μ Μ)和不同濃度胰蛋白酶(625ρΜ至OpM)的384孔微孔板中製備測定。I小時中以規律的間隔測量FLT，並且測量在NanoTaurus讀板器上一式三份地進行。
[0640]當將肽18暴露於不同 濃度的胰蛋白酶時沒有觀察到FLT提高，這與該蛋白酶不能在乙醯化賴氨酸附近切割相一致(圖61A)。相比之下，當將對應的脫乙醯化肽19與胰蛋白酶孵育時，FLT具有時間和濃度依賴性提高，原因是賴氨酸處的切割導致9AA與色氨酸的調節作用分開(圖61B)。FLT由5.5ns提高至16ns，提供了 10.5ns的優良測定範圍。
[0641]脫乙醯化的證據
[0642]將肽18 (15 μ M)與測定緩衝液(25mM Tris pH8,137mM NaCl,2.7mM KCl, ImMMgCl2,0.01% BSA) (200 μ L)中的HDACl (200nM)孵育，以規律的時間間隔取出等量份並通過RP-HPLC和ES1-MS進行分析以確定HDACl對肽底物的脫乙醯化程度。測定在室溫下進行並且分別在O小時、2小時、4小時和6小時時間間隔取樣。
[0643]通過圖62中的HPLC譜示出了 6小時時間過程中的測定進展。2小時後，明顯有一個與底物峰(tK = 21.2分鐘)分開的新峰(tK = 19.1分鐘)出現。通過ES1-MS分析峰確定了 tK = 16.7分鐘的新峰的質量比底物小42amu，這與失去一個乙醯基相一致(圖63)。但是正如通過tK = 21.2分鐘的底物峰的持續存在所證明的，反應在6小時後似乎沒有達到完成，其原因可能是試劑隨時間降解。該實驗確定了肽18是用於HDACl的底物。
[0644]HDACl測定時間討稈
[0645]測定在384孔黑色微孔板中以20 μ L體積進行並且包含測定緩衝液中的肽
18(I μ Μ)和HDACl酶(200ηΜ至25ηΜ)。以規律的間隔通過添加10 μ L胰蛋白酶(終濃度IOnM)終止反應。在室溫下與Endo-LysC孵育10分鐘後測量FLT。所有的測量在NanoTaurus讀板器上一式兩份地進行。[0646]由圖64A可以看出，在添加胰蛋白酶之前FLT的改變可以忽略。但是，在添加蛋白酶並與其孵育後，FLT作為HDACl濃度和測定時間的函數而提高，這與賴氨酸脫乙醯化使得肽對蛋白酶誘導切割敏感相一致(圖64B)。使用200nM HDACl在2小時後導致完全脫乙醯化，正如通過FLT值的平臺所表明的；而25恤HDACl導致信號隨時間線性提高。總之，通過測定的所測量螢光壽命提高來報導通過HDACl的乙醯化。
[0647]底物滴定
[0648]研究了 HDACl測定對肽底物濃度的依賴性。測定使用25nM HDACl在測定緩衝液(20 μ L)中在室溫下在384孔微孔板中進行I小時。肽18的濃度在40 μ M至0.3 μ M之間變化。反應完成後，向每個孔中添加胰蛋白酶(IOnM)並在10分鐘孵育期後測量FLT。參照標準曲線將數據轉化為產物形成速率並且在GraphPad Prism中擬合到Michaelis-Menten模型以確定底物ΚΜ。
[0649]由圖65看出，在HDACl測定中底物18的Km確定為22.5 μ Μ。該值與HDAC測定中採用的其他短妝底物(Riester, D.；Hildmann, C ；Griinewald, S.；Beckers, T.；Schwienhorst,A.Biochem.Biophys.Res.Commun.2007, 357,439-445)相一致。
[0650]曲古抑菌素A抑制劑滴定
[0651]為了證明用於HDACl的FLT蛋白酶保護測定適合於抑制劑篩選，購買了已知的通用型HDAC抑制劑曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)並在測定中進行測試。條件如下:測定緩衝液(20 μ L)中的TSA (I μ M至5.6nM) ,H DACl (25ηΜ)和肽18 (10 μ Μ)。反應在室溫下在384孔微孔板中一式三份地進行1.5小時，並且通過添加胰蛋白酶(IOnM)終止。
[0652]TSA 的 IC50 測定為 0.89ηΜ(圖 66)，這與文獻報導的 1.3ηΜ 的 IC50(Hailey, F.；Reinshagen, J.；Ellinger, B.；ffolf, Μ.；Niles ；Α.Μ.；Evans, N.J.；Kirkland, Τ.A.；Wagner, J.M.；Jung, M.；Gribbon, P.;Gul, S.J.Biomol.Screen.2011,16,1227-1235)相一致。
[0653]V -閔子
[0654]為了證明HDAC1FLT測定與高通量篩選(HTS)兼容，確定了 V -因子的值。
[0655]在384孔微孔板中建立測定，其中板的一半包含HDACl (25nM)和肽18 (10 μ M)，而另一半包含HDACl (25ηΜ)、肽18 (10 μ Μ)和TSA抑制劑(I μ Μ)。最終測定體積為20 μ L並且將板在室溫下孵育1.5小時，此時向每個孔中添加測定緩衝液(10 μ L)中的胰蛋白酶(IOnM終濃度)。在室溫下再孵育15分鐘後，測量FLT並計算V-因子為0.85(圖67)，證明測定適合於HTS篩選。
[0656]總之，肽18已被驗證為FLT蛋白酶保護測定中組蛋白脫乙醯酶HDACl的底物。測定的基礎是使用9ΑΑ標記的肽底物，其併入了在調節劑與螢光團被在鄰近賴氨酸(或精氨酸)殘基處特異性切割的蛋白酶胰蛋白酶之作用而分開之前調節9ΑΑ之FLT的芳族部分(例如，色氨酸)。HDACl的賴氨酸脫乙醯化使得肽對胰蛋白酶的切割敏感，由於9ΑΑ螢光團與調節劑被分開而導致FLT提高。因此，通過測定的所測量FLT提高來報導賴氨酸脫乙醯化。
[0657]通過進行酶、底物和抑制劑滴定證明了 FLT HDACl測定性能，並且0.85的Ζ』 -因子確定測定適合於HTS應用。
[0658]該研究使用HDACl作為代表性實例為組蛋白脫乙醯酶的FLT蛋白酶保護測定提供了示例。
[0659]實驗-材料和方法
[0660]以下章節提供了用於實施例1至5的實驗方案、材料和方法的另一些細節。
[0661]概沭
[0662]除非另有說明，否則試劑和溶劑購買自Sigma-Aldrich、Merck Chemicals、NewEngland Biolabs、Thermo_Fisher或Rathburn並且以供應原樣使用。人重組PAD4酶通過Insight Biotechnology 購買自 Origene。人重組 G9a 酶購買自 Millipore、Abcam 或 BPSBioscience (通過 AMSBio, UK)。人重組 PAD2 酶購買自 Modiquest Research、Ni jmegen、TheNetherlands。人重組 JHDMlA、Set7/9、PRMT5、HDACl 和 EZH2/EED/SUZ12/RbAp48/AEBP2 複合體通過 AMSBio，UK 購買自 BPS Bioscience 並且人重組 PCAF 購買自 Enzo Life Sciences。3-(9-氨基Π丫唳-2-基)-丙酸由Almac Sciences, Craigavon, NI製備並且以供應原樣使用ο 384孔微孔板購買自Greiner (#781076或784076)。
[0663]質譜得自於Bruker microTOF電噴霧MS。分析型RP-HPLC使用AgilentllOO或1200系列HPLC系統進行，所述系統使用Phenomenex Luna C18柱(250X4.6mm)和包含0.1% TFA的水/乙腈梯度，流速為Iml/分鐘。製備型RP-HPLC使用Gilson HPLC系統進行，所述系統由Gilson305泵、Gilson811C動態混合器和ABI783A UV檢測器組成，並且使用Phenomenex Luna C18 柱(250 X 21.2mm)和包含 0.1% TFA 的水 / 乙臆梯度，流速為 9ml/分鐘。
[0664]突光壽命在NanoTaurus突光壽命讀板器(Edinburgh Instruments Ltd.)上採用時間相關單光子計數(time-correlated single photo counting,TCSPC)進行測量。激發源是405nm的半導體雷射，其以5MHz的重複頻率產生皮秒光脈衝。通過帶寬20nm的438nm帶通濾波器(Semrock)收集發射。在峰通道中收集3000次計數的數據並使用雙指數衰減模型(biexponential decay model)計算平均壽命。
[0665]肽合成
[0666]使用標準的Fmoc/tBu SPPS化學，在具有0.20~0.25mMol Rink醯胺樹脂的ABI433肽合成器上進行自動化固相肽合成，每個偶聯循環使用lmmol Fmoc-胺基酸和HOCt (1-羥基-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸乙酯)或Oxyma Pure (2-氰基-2-(羥基亞胺基)乙酸乙酯)/DIC (N，N' - 二異丙基碳二亞胺)偶聯劑。通過用0.5M乙酸酐的DMF溶液處理來封閉未反應的氨基。通過用20% v/v哌啶的DMF溶液處理20分鐘進行Fmoc移除。當螢光團標記是通過賴氨酸殘基進行時，根據染料連接位點在肽序列N端還是肽序列內，使用Boc-Lys (Fmoc)-OH或Fmoc-Lys (ivDde)-OH構件有助於正交脫保護。通過用3%肼的DMF溶液處理從樹脂上移除ivDde基團。
[0667]通過以下過程進行3_(9_氨基B丫唳_2_基)_丙酸對妝的手動標記:將染料(相對於樹脂為2當量)溶解於最小體積的DMF中，以及用0.5M HOCt (1-羥基-1H-1，2，3-三唑-4-羧酸乙酯)(3當量)和0.5M DIC(2當量)的DMF溶液通過超聲活化30分鐘。然後將活化的染料添加到樹脂中，在DMF中預膨脹，並且在室溫下將反應混合物超聲攪拌5小時後使其在室溫下靜置過夜。過濾樹脂，用DMF和DCM徹底清洗並在真空中下乾燥過夜。
[0668]在伴有側鏈脫保護的情況下，通過用92.5% TFA v/v,5% H2O v/v,2.5% TIS v/v處理4小時將肽從固相中切割下來。通過過濾移除樹脂，粗製肽從冰冷的醚中沉澱出來並、且通過以4000rpm離心5分鐘進行收集。然後將粗製肽溶解於MeCN/H20(50: 50)中並凍幹，然後通過製備型HPLC純化至>95%的純度。基於87351^(?^的9AA摩爾消光係數(在I: IMeCN/水中405nm處)將標記的肽等分，並且在Varian Cary50UV紫外分光光度計上進行測量。
[0669]緩衝備件
[0670]PAD4 和 PAD2 緩衝液由 pH8.0 的 20mM Tris/HCl, 200 μ M CaCl2, 5mM DTT 和 0.01 %CHAPS構成。
[0671]G9a、Set7/9 和 PRMT5 緩衝液由 ρΗ8.0 的 20mM Tris/HCl, 25mM NaCl，ImM DTT 和
0.025%吐溫-20構成。
[0672]JHDMlA緩衝液由pH7.4的50mM Tris/HCl, 100 μ M抗壞血酸鈉，10 μ M硫酸亞鐵銨，100 μ Ma-酮戊二酸鹽和0.01 %吐溫-20構成。
[0673]HDACl 緩衝液由 ρΗ8.0 的 25mM Tris/HCl, 137mM NaCl，2.7mM KCl，ImM MgCl2,0.01% BSA 構成。
[0674]pCAF 緩衝液由 ρΗ8.0 的 50mM Tris/HCl,0.1mM EDTA，0.05% BSA, ImM DTT 構成。
[0675]EZH2 緩衝液由 ρΗ7.6 的 20mM Bicine, 50mM NaCl，0.002% 吐溫-20，0.005% BSA，ImM DTT 構成。
[0676]切害1丨測丨定
[0677]將相關測定緩衝液(10 μ L)中的Endo-LysC或胰蛋白酶添加到384孔微孔板的孔中。還可包括其中將蛋白酶替換為測定緩衝液的對照。通過添加測定緩衝液(IOyL)中的肽底物開始反應並且以 規律的間隔測量FLT。所有的測量一式三份地進行。
[0678]PAD4 測定
[0679]為了 HPLC監測，測定在微型離心管中在室溫下進行，總測定體積為300 μ L。通過將肽添加到包含重組PAD4酶的溶液中開始反應。測定中PAD4的終濃度為30ηΜ並且肽的終濃度為15 μ M0在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):0分鐘、30分鐘和60分鐘，然後添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統中，收集相關峰並稀釋於MS緩衝液(包含0.1%甲酸的I: IMeCN/水)中用於分析。
[0680]當確證了肽底物的瓜氨酸化後，用測定緩衝液將測定混合物稀釋15倍，轉移到384孔微孔板中(20 μ L/孔)並測量FLT。然後將胰蛋白酶(測定緩衝液中IOyL)添加到每個孔中並且在室溫下將板孵育10分鐘。然後再次測量FLT。所有的測量一式三份地進行，並且孔中胰蛋白酶的終濃度為ΙΟηΜ。
[0681]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩衝液(IOyL)中的重組PAD4酶的孔中添加測定緩衝液(IOyL)中的肽I。振搖板，然後用蓋玻片密封。測定中PAD4的終濃度在125至500ρΜ之間變化，同時肽I的濃度維持在I μ M不變。測定在不同時間開始並且90分鐘後通過添加胰蛋白酶(測定緩衝液中的10 μ L ;終濃度IOnM) —起終止。在室溫下孵育10分鐘後，以500rpm將微孔板離心I分鐘並測量FLT。
[0682]對於底物滴定，向包含測定緩衝液(10 μ L)中不同濃度的肽I的孔中添加測定緩衝液(IOyL)中的PAD4。將板在室溫下孵育I小時，然後將10 μ L測定緩衝液中的胰蛋白酶添加到每個孔中。在室溫下再孵育10分鐘後測量FLT。所有的測量一式三份地進行。[0683]對於V-因子確定，384孔微孔板的一半裝有10 μ L測定緩衝液中的PAD4和肽I。其餘的孔裝有10 μ L不包含CaCl2的測定緩衝液中的PAD4和肽I。將板密封並在室溫下孵育I小時。然後將10 μ L測定緩衝液中的胰蛋白酶添加到每個孔中，在室溫下孵育10分鐘後測量FLT。試劑的終濃度為:PAD4(125pM);肽I (200nM);胰蛋白酶(IOnM)。
[0684]PAD2 測定
[0685]為了 HPLC監測，測定在微型離心管中在室溫下進行，總測定體積為300 μ L。通過將肽I添加到包含重組PAD2酶的溶液中開始反應。測定中PAD2的終濃度為30ηΜ並且肽的終濃度為15 μ Μ。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):0分鐘、30分鐘和120分鐘，然後添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統中，收集相關峰並稀釋於MS緩衝液(包含0.1%甲酸的I: IMeCN/水)中用於分析。
[0686]當確證了肽底物的瓜氨酸化後，用測定緩衝液將測定混合物稀釋15倍，轉移到384孔微孔板中(20 μ L/孔)並測量FLT。然後將胰蛋白酶(測定緩衝液中IOyL)添加到每個孔中並且在室溫下將板孵育10分鐘。然後再次測量FLT。所有的測量一式三份地進行，並且孔中胰蛋白酶的終濃度為ΙΟηΜ。
[0687]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩衝液(IOyL)中的重組PAD2酶的孔中添加測定緩衝液(IOyL)中的肽I。還包括僅含肽或瓜氨酸化肽的對照。振搖板，然後用蓋玻片密封。測定中PAD2的終濃度在23.5至1.5ηΜ之間變化，同時肽I的濃度維持在I μ M不變。測定在不同時間開始並且60分鐘後通過添加胰蛋白酶(測定緩衝液中的10 μ L ;終濃度IOnM) —起終止。在室溫下孵育10分鐘後，以500rpm將微孔板離心I分 鍾並測量FLT。所有的測量一式三份地進行。
[0688]G9a 測定
[0689]為了 HPLC監測，測定在微型離心管中在室溫下進行，總測定體積為150yL。通過將SAM(100 μ Μ)添加到包含重組G9a酶的溶液中開始反應。測定中G9a的終濃度為100 μ M並且肽的終濃度為15 μ M0在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):0分鐘、2小時和6小時，然後添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統中，收集相關峰並稀釋於MS緩衝液(包含0.1%甲酸的1:1MeCN/水)中用於分析。
[0690]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩衝液(5yL)中的重組G9a酶的孔中添加測定緩衝液(IOyL)的肽。通過添加SAM(5yL)開始反應。振搖板，然後用蓋玻片密封。G9a濃度在200nM與1.5nM之間變化並且SAM濃度在200與0.4 μ M之間變化。肽的濃度維持在I μ M不變。測定在不同時間開始並且在2小時後通過添加Endo-LysC (測定緩衝液中的10 μ L ;終濃度2ηΜ) —起終止。在室溫下孵育10分鐘後，以500rpm將微孔板離心I分鐘並測量FLT。
[0691]對於抑制劑滴定，將化合物(5 μ L)與G9a(5 μ L)在室溫下預孵育30分鐘後添加肽5 (5 μ L)和SAM (5 μ L)。包括不包含SAM或抑制劑的對照。
[0692]對於V -因子確定，384孔微孔板的一半裝有10 μ L測定緩衝液中的G9a、肽9和SAM。其餘的孔裝有10 μ L G9a和肽9並且不存在SAM。將板密封並在室溫下孵育I小時。然後將10 μ L測定緩衝液中的Endo-LysC添加到每個孔中，在室溫下孵育10分鐘後測量FLT。試劑的終濃度為:G9a(625pM)』?9(1μΜ) ;Endo_LysC(2ηΜ)。
[0693]Set7/9 測定
[0694]為了 HPLC監測，測定在微型離心管中在室溫下進行，總測定體積為200 μ L。通過將SAM添加到包含重組Set7/9酶和肽12的溶液中開始反應。測定中試劑的終濃度為172nM(Set7/9) UOO μ M(SAM)和15 μ M(肽12)。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):O小時、2小時和6小時，然後添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(CrawfordScientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統中，收集相關峰並稀釋於MS緩衝液(包含0.1%甲酸的1:1MeCN/水)中用於分析。
[0695]當確證了肽底物的甲基化後，用測定緩衝液將測定混合物稀釋15倍，轉移到384孔微孔板中(20 μ L/孔)並測量FLT。然後將Endo-LysC (測定緩衝液中10 μ L)添加到每個孔中並且在室溫下將板孵育15分鐘。然後再測量FLT。所有的測量一式三份地進行，並且孔中Endo-LysC的終濃度為2ηΜ。
[0696]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩衝液(10 μ L)中的重組Set7/9酶和肽12或13的孔中添加測定緩衝液的SAM(10 μ L)。還包括僅包含肽的對照。振搖板，然後用蓋玻片密封。測定中Set7/9的終濃度在IOOnM與
12.5nM之間變化，同時肽和SAM的濃度分別維持在I μ M和100 μ M不變。測定在不同時間開始並且在120分鐘後通過添加Endo-LysC (測定緩衝液中的10 μ L ;終濃度2ηΜ) —起終止。在室溫下孵育15分鐘後，以500rpm將微孔板離心I分鐘並測量FLT。所有的測量一式兩份地進行。
[0697]對於抑制劑滴定，將化合物(5 μ L)與Set7/9 (5 μ L)和肽13 (5 μ L)在室溫下預孵育10分鐘後添加SAM(10 μ L) 。包括不包含SAM或不包含抑制劑的對照。
[0698]對於V -因子確定，將10 μ L包含測定緩衝液中的Set7/9和肽13的溶液添加到384孔微孔板的每個孔中。向板的一半中添加10μ L測定緩衝液，同時向另一半中添加測定緩衝液(IOyL)中的SAM以使反應開始。將板密封並在室溫下孵育2小時。然後將測定緩衝液(IOyL)中的Endo-LysC添加到每個孔中，在室溫下孵育15分鐘後測量FLT。試劑的終濃度為:Set7/9(25nM) ；SAM(100yM)』--3(1μΜ) ;Endo_LysC(2ηΜ)。
[0699]PRMT5 測定
[0700]為了 HPLC監測，測定在微型離心管中在室溫下進行，總測定體積為200 μ L。通過將SAM添加到包含重組PRMT5酶和肽15的溶液中開始反應。測定中試劑的終濃度為150nM(PRMT5)、100 μ M(SAM)和15 μ M(肽15)。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):O小時、3.5小時和17.5小時，然後添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統中，收集相關峰並稀釋於MS緩衝液(包含0.1 %甲酸的1:1MeCN/水)中用於分析。
[0701]當確證了肽底物的甲基化後，用測定緩衝液將測定混合物稀釋15倍，轉移到384孔微孔板中(20 μ L/孔)並測量FLT。然後將Endo-ArgC (測定緩衝液中10 μ L)添加到每個孔中並且在室溫下將板孵育15分鐘。然後再測量FLT。所有的測量一式三份地進行，並且孔中Endo-ArgC的終濃度為ΙΟηΜ。
[0702]或者，測定在室溫下在384孔微孔板中進行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩衝液(?ο μ L)中的重組PRMT5酶和肽15的孔中添加測定緩衝液中的SAM (10 μ L)。還包括僅包含肽的對照。振搖板，然後用蓋玻片密封。測定中PRMT5的終濃度在IOOnM與12.5nM之間變化，同時肽15和SAM的濃度分別維持在I μ M和100 μ M不變。測定在不同時間開始並且在120分鐘後通過添加Endo-ArgC (測定緩衝液中的10 μ L ;終濃度1.25ηΜ) 一起終止。在室溫下孵育15分鐘後，以500rpm將微孔板離心I分鐘並測量FLT。所有的測量一式兩份地進行。
[0703]對於抑制劑滴定，將化合物(5 μ L)與PRMT5/肽15 (5 μ L)在室溫下預孵育30分鐘後添加SAM (5 μ L)。測定在室溫下運行3小時並通過添加10 μ L Endo-ArgC終止。在室溫下孵育I小時後測量FLT。還包括不包含PRMT5或不包含抑制劑的對照。所有的測量一式三份地進行。
[0704]ΕΖΗ2 測丨定
[0705]酶滴定在室溫下在384孔h1-base微孔板中進行,測定體積為10 μ L/孔。向包含測定緩衝液(5 μ L)中的重組ΕΖΗ2複合體的孔中添加測定緩衝液(5 μ L)中的肽20/SAM混合物。還包括不含ΕΖΗ2的對照。振搖板，然後用蓋玻片密封。測定中ΕΖΗ2的終濃度在IOOng/孔與75ng/孔之間變化，同時肽20和SAM的濃度分別維持在I μ M和3 μ M不變。測定在不同時間開始並且在6小時後通過添加Endo-LysC(測定緩衝液中的10 μ L ;終濃度4ηΜ) 一起終止。在室溫下孵育35分鐘後，以500rpm將微孔板離心I分鐘並測量FLT。所有的測量一式兩份地進行。
[0706]對於SAM滴定，向包含測定緩衝液(2.5 μ L)中的不同濃度SAM的孔中添加測定緩衝液(2.5 μ L)中的ΕΖΗ2複合體。通過添加測定緩衝液(5 μ L)中的肽20而開始反應。在室溫下將板孵育5小時，然後將10 μ L測定緩衝液中的Endo-LysC添加到每個孔中。在室溫下再孵育15分鐘後，測量FLT。所有的測量一式三份地進行。
[0707]對於抑制劑滴定，將化合物(2.5 μ L)與ΕΖΗ2複合體(2.5 μ L)在室溫下預孵育20分鐘後添加測定緩衝液(5yL)中的肽20/SAM混合物。測定在室溫下運行5小時並通過添加10 μ L Endo-LysC終止。在室溫下孵育I小時後測量FLT。包括不包含ΕΖΗ2或抑制劑的對照。所有的測量一式三份地進行。
[0708]THDMlA 測定
[0709]測定在室溫下在384孔微孔板中進行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩衝液(IOyL)中的重組JHDMlA酶的孔中添加測定緩衝液(IOyL)中的肽10。包括兩組僅含肽10的對照孔。振搖板，然後用蓋玻片密封。測定中JHDMlA的終濃度為150ηΜ，肽10的終濃度為I μ Μ。在室溫下孵育5小時後，將Endo-LysC (測定緩衝液中10 μ L ;終濃度IOnM)添加到測定孔和一組對照孔中。向另一組對照孔中添加10 μ L測定緩衝液。在室溫下孵育120分鐘後，以500rpm將微孔板離心I分鐘並測量FLT。所有的測量一式三份地進行。
[0710] PCAF 測丨定
[0711]為了 HPLC監測，測定在微型離心管中在室溫下進行，總測定體積為250yL。通過將AcCoA添加到包含重組PCAF酶和肽17的溶液中開始反應。測定中試劑的終濃度為IOOnM(PCAF)、50 μ M(AcCoA)和30 μ M(肽17)。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):
O分鐘、30分鐘、60分鐘和90分鐘，然後添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統中，收集相關峰並稀釋於MS緩衝液(包含0.1%甲酸的1:1MeCN/水)中用於分析。[0712]酶滴定在室溫下在384孔微孔板中進行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩衝液(IOyL)中的重組PCAF酶的孔中添加測定緩衝液(IOyL)中的肽17/AcCoA混合物。還包括不包含PCAF的對照。振搖板，然後用蓋玻片密封。測定中PCAF的終濃度在250nM與31.3nM之間變化，同時肽17和AcCoA的濃度分別維持在I μ M和50 μ M不變。測定在不同時間開始並且在120分鐘後通過添加Endo-LysC (測定緩衝液中的10 μ L ;終濃度25ηΜ) —起終止。在室溫下孵育90分鐘後，以500rpm將微孔板離心I分鐘並測量FLT。所有的測量一式兩份地進行。
[0713]對於AcCoA滴定，向包含不同濃度AcCoA(測定緩衝液中5 μ L)中添加5 μ L測定緩衝液中的肽17然後添加IOyL測定緩衝液中的PCAF。將板在室溫下孵育2小時，然後將10 μ L測定緩衝液中的Endo-LysC添加到每個孔中。在室溫下再孵育90分鐘後，測量FLT。所有的測量一式三份地進行。
[0714]HDACl 測定
[0715]為了 HPLC監測，測定在微型離心管中在室溫下進行，總測定體積為200 μ L。通過將肽18添加到包含重組HDACl酶的溶液中開始反應。測定中試劑的終濃度為200nM(HDACl)和15 μ M(肽18)。在以下間隔從測定混合物中取樣(50 μ L):0小時、2小時、4小時和6小時，然後添加到包含50 μ L水和0.1 % TFA的玻璃HPLC小瓶(Crawford Scientific)中。將全部的100 μ L樣品注射到HPLC系統中，收集相關峰並稀釋於MS緩衝液(包含0.1%甲酸的1:1MeCN/水)中用於分析。
[0716]酶滴定在室溫下在384孔微孔板中進行，測定體積為20 μ L/孔。向包含測定緩衝液(10 μ L)中的重組HDACl酶的孔中添加測定緩衝液(10 μ L)中的肽18。還包括僅包含肽的對照。振搖板，然後用蓋玻片密封。測定中HDACl的終濃度在200ηΜ與25ηΜ之間變化，同時肽18的濃度維持在I μ M不變。測定在不同時間開始並且在2小時後通過添加胰蛋白酶(測定緩衝液中10 μ L ;終濃度IOnM) —起終止。在室溫下孵育10分鐘後，以500rpm將微孔板離心I分鐘並測量FLT。所有的測量一式兩份地進行。
[0717]對於底物滴定，向包含測定緩衝液(10 μ L)中的不同濃度肽18的孔中添加測定緩衝液(?ο μ L)中的HDAC1。將板在室溫下孵育I小時，然後將10 μ L測定緩衝液中的胰蛋白酶添加到每個孔中。在室溫下再孵育10分鐘後測量FLT。所有的測量一式三份地進行。
[0718]對於抑制劑滴定，將化合物(5 μ L)與HDACl (5 μ L)在室溫下預孵育30分鐘後添加測定緩衝液(10 μ L)中的肽18。測定在室溫下運行1.5小時並通過添加10 μ L胰蛋白酶終止。在室溫下孵育10分鐘後測量FLT。包括不包含HDACl或不包含抑制劑的對照。所有的測量一式三份地進行。
[0719]對於Ζ』-因子確定，384孔微孔板的一半裝有5 μ L測定緩衝液和5 μ L測定緩衝液中的HDACl。其餘的孔裝有測定緩衝液中的5μ L TSA抑制劑和5μ L HDACl。在室溫下預孵育30分鐘後，將10 μ L測定緩衝液中的肽18添加到每個孔中。密封板並在室溫下孵育
1.5小時。然後將10 μ L測定緩衝液中的胰蛋白酶添加到每個孔中並在室溫下孵育15分鐘後測量FLT。試劑的終濃度為:HDACl(25nM) JSA(IyM)JilS(IOyM);胰蛋白酶(ΙΟηΜ)。
[0720]本文引用的所有專利公開和科學參考文獻通過引用整體併入本文。
【權利要求】
1.測定受試樣品中修飾酶之活性的方法，其包括: (a)使所述受試樣品與螢光受調節之酶底物相接觸，所述底物包含與螢光部分和配置成調節所述螢光部分之螢光壽命的螢光壽命調節劑部分相綴合的接頭分子，其中所述底物通過所述修飾酶的作用來修飾以形成經修飾底物，由於所述修飾而使得所述經修飾底物之所述接頭分子在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間對第二種酶的切割敏感或者保護所述經修飾底物之所述接頭分子在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間免於被第二種酶切割，其中通過所述第二種酶切割所述底物或所述經修飾底物將含有所述螢光壽命調節劑部分之所述底物的一部分與含有所述螢光部分之所述底物的一部分分開；以及 (b)通過檢測由所述第二種酶對所述經修飾底物和/或所述底物之作用而引起的所述螢光部分之所述螢光壽命的變化來檢測所述經修飾底物的形成，其中所述經修飾底物的形成為所述修飾酶的活性提供指示。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述螢光受調節之酶底物的所述接頭分子是肽接頭，並且所述第二種酶是這樣的蛋白酶:其切割所述肽接頭或通過所述修飾酶對所述肽接頭之作用而形成的經修飾肽接頭，以將含有所述螢光壽命調節劑部分之所述底物的一部分與含有所述螢光部分之所述底物的一部分分開。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述肽接頭能夠被所述蛋白酶切割，其中所述切割將含有所述螢光壽命調節劑部分之所述底物的一部分與含有所述螢光部分之所述底物的一部分分開，並且所述修飾酶對所述肽接頭的修飾保護所述經修飾肽接頭在所述螢光部分與所述螢光壽命調節 劑部分之間免於被所述蛋白酶切割，與未經修飾的肽接頭相比，蛋白酶處理之後所述螢光部分之所述螢光壽命的時間依賴性降低表明所述經修飾肽接頭的形成。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述經修飾肽接頭通過所述肽接頭中胺基酸殘基的甲基化來形成。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述修飾酶是蛋白質甲基轉移酶。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述蛋白質甲基轉移酶是組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(PKMT)，例如 G9a、Set7/9、GLP 或 EZH2。
7.根據權利要求5所述的方法，其中所述蛋白質甲基轉移酶是組蛋白精氨酸甲基轉移酶(PRMT)，例如 PRMT1、PRMT3、PRMT4/CARM1 或 PRMT5。
8.根據權利要求3所述的方法，其中所述經修飾肽接頭通過所述肽接頭中胺基酸殘基的乙醯化來形成。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述修飾酶是乙醯轉移酶。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述乙醯轉移酶是組蛋白乙醯轉移酶，例如Gcn5、PCAF、Hatl 或 p300。
11.根據權利要求3所述的方法，其中所述經修飾肽接頭通過所述肽接頭中胺基酸殘基的脫亞氨化來形成。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述修飾酶是脫亞氨酶。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述脫亞氨酶是肽基精氨酸脫亞氨酶，例如PAD 1、PAD2、PAD3、PAD4 或 PAD6。
14.根據權利要求2所述的方法，其中所述肽接頭在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間不能被所述蛋白酶切割，並且所述修飾酶對所述肽接頭的修飾使得所述經修飾肽接頭在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間對所述蛋白酶的切割敏感，與未經修飾的肽相比，蛋白酶處理之後所述螢光部分之所述螢光壽命的時間依賴性提高表明所述經修飾肽接頭的形成。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述經修飾肽接頭通過所述肽接頭中甲基化胺基酸殘基的脫甲基化來形成。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述修飾酶是脫甲基酶。
17.根據權利要求16所述的方法，其中所述脫甲基酶是組蛋白脫甲基酶，例如LSD1、JHDMlA 或 JMJD6。
18.根據權利要求14所述的方法，其中所述經修飾肽接頭通過所述肽接頭中乙醯化胺基酸殘基的脫乙醯化來形成。
19.根據權利要求18所述的方法，其中所述修飾酶是脫乙醯酶。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述脫乙醯酶是組蛋白脫乙醯酶，例如HDACl-1l 或 SIRT1-5。
21.根據權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述螢光部分選自9-氨基吖啶及其衍生物、吖啶酮衍生物、吖啶、喹吖啶和吖啶鑛.部分。
22.根據權利要求1至21中任一項所述的方法，其中所述螢光壽命調節劑部分選自:吲哚基部分，包括胺基酸色氨酸側鏈中存在的吲哚基部分；酚部分，包括胺基酸酪氨酸側鏈中存在的酚部分；咪唑部分，包括胺基酸組氨酸側鏈中存在的咪唑部分；和苄基部分，包括胺基酸苯丙氨酸的苄基側 鏈；苯氧基部分；萘基丙氨酸部分；咔唑部分和吩噻嗪部分。
23.篩選酶抑制劑的方法，所述方法包括在受試化合物存在下使用權利要求1至22中任一項所述的方法測定所述酶的活性，其中在所述受試化合物存在下酶活性的降低將所述受試化合物鑑定為所述酶的抑制劑。
24.螢光受調節之酶底物，其包含與螢光部分和配置成調節所述螢光部分之螢光壽命的螢光壽命調節劑部分相綴合的接頭分子，其中所述底物通過修飾酶的作用來修飾以形成經修飾底物，由於所述修飾而使得所述經修飾底物之所述接頭分子在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間對第二種酶的切割敏感或者保護所述經修飾底物之所述接頭分子在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間免於被第二種酶切割，其中通過所述第二種酶切割所述底物或所述經修飾底物將含有所述螢光壽命調節劑部分之所述底物的一部分與含有所述螢光部分之所述底物的一部分分開。
25.根據權利要求24所述的螢光受調節之酶底物，其中所述螢光受調節之酶底物的所述接頭分子是肽接頭，並且所述第二種酶是這樣的蛋白酶:其切割所述肽接頭或通過所述修飾酶對所述肽接頭之作用而形成的經修飾肽接頭，以將含有所述螢光壽命調節劑部分之所述底物的一部分與含有所述螢光部分之所述底物的一部分分開。
26.根據權利要求25所述的螢光受調節之酶底物，其中所述肽接頭在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間能夠被所述蛋白酶切割，並且通過所述修飾酶對所述肽接頭的修飾保護所述經修飾肽接頭在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間免於被所述蛋白酶切割。
27.根據權利要求26所述的螢光受調節之酶底物，其用於測定甲基轉移酶的活性，其中所述螢光受調節之酶底物具有式(I)或(I』)所示結構
F1-X1-N1-X2-M (I) M-X1-N1-X2-F1 (I，) 其中Xl表示第一胺基酸序列，Fl表示與Xl (或在I』中與X2)綴合的所述螢光部分，NI表示通過所述甲基轉移酶之作用而甲基化的胺基酸殘基，X2表示第二胺基酸序列並且M表示與X2(或在I』中與XI)綴合的所述螢光壽命調節劑。
28.根據權利要求27所述的螢光受調節之酶底物，其選自:
肽 4:9AA-TARK9STGff-C0NH2
肽 5:K (9ΑΑ) QTARK9STGff-CONH2
肽 6:ARTK (9ΑΑ) QTARK9STGGff-CONH2
肽 7 =ARTffQTARK9STGGK (9ΑΑ) -CONH2
肽 8:WQTARK9STGGK (9AA) -CONH2
肽 9:K (9ΑΑ) ARTK (Me) QTARK9STGGff-CONH2
肽 12: wartk4qtark (9AA) stggkaprkqlak-conh2
肽 13: wrtk4qtark(9AA)stggkaprkqlak-conh2
肽 14: WsGR3GKGGK(9AA)GLGKGGAKRHRK-CONH2
肽 15:Ac-WSGR3GKGGK (9AA) GLGKGGAKRHRK-CONH2
肽 20:PRKQLATK(9 AA)AARK27SAPATGGW-C0NH2。
29.根據權利要求26所述的螢光受調節之酶底物，其用於測定乙醯轉移酶的活性，其中所述螢光受調節之酶底物具有式(III)或(III』 )所示結構
F1-X3-N2-X4-M (III) M-X3-N2-X4-F1 (III，) 其中X3表示第一胺基酸序列，Fl表示與X3 (或在III』中與X4)綴合的所述螢光部分，N2表示通過所述乙醯轉移酶之作用而乙醯化的胺基酸殘基，X4表示第二胺基酸序列並且M表示與X4(或在III』中與X3)綴合的所述螢光壽命調節劑。
30.根據權利要求29所述的螢光受調節之酶底物，其選自:
肽 16:wqtark (Me) Stggk14Aprk (9AA) Qlatk-COnh2
肽 17:9AA-STGGK14APRWQLATK-C0NH2。
31.根據權利要求26所述的螢光受調節之酶底物，其用於測定脫亞氨酶的活性，其中所述螢光受調節之酶底物具有式(V)或(V』)所示結構
F1-X5-R-X6-M (V) M-X5-R-X6-F1 (V，) 其中X5表示第一胺基酸序列，Fl表示X5(或在V』中X6)的所述螢光部分，R表示通過所述脫亞氨酶之作用而轉化為瓜氨酸的精氨酸殘基，X6表示第二胺基酸序列並且M表示與X6 (或在V』中與X5)綴合的所述螢光壽命調節劑。
32.根據權利要求31所述的螢光受調節之酶底物，其是:
肽 1:9AA-QSTRGSGHWKK-C0NH2，或
肽 3:K(9AA)-HQSTRGSGHWKK-C0NH2。
33.根據權利要求25所述的螢光受調節之酶底物，其中所述肽接頭在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間不能被所述蛋白酶切割，並且所述修飾酶對所述肽接頭的修飾使得所述經修飾肽接頭在所述螢光部分與所述螢光壽命調節劑部分之間對所述蛋白酶的切割敏感。
34.根據權利要求33所述的螢光受調節之酶底物，其用於測定脫甲基酶的活性，其中所述螢光受調節之酶底物具有式(VII)或(VII』)所示結構
F1-X7-N3(Me)-X8-M (VII)
M-X7-N3(Me)-X8-F1 (VII，) 其中X7表示第一胺基酸序列，Fl表示與X7 (或在VII』中與X8)綴合的所述螢光部分，N3(Me)表示通過所述脫甲基酶之作用而脫甲基化的甲基化胺基酸殘基(例如，甲基化賴氨酸或甲基化精氨酸)，X8表示第二胺基酸序列並且M表示與X8 (或在VII』中與X7)綴合的所述螢光壽命調節劑。
35.根據權利要求34所述的螢光受調節之酶底物，其是:
肽 10:9AA-ATGGVK36 (Me) K (Me) PHRYff-CONH2 或
肽 11:9AA-ATGGVK36 (Me) KPHw-CONH2。
36.根據權利要求33所述的螢光受調節之酶底物，其用於測定脫乙醯酶的活性，其中所述螢光受調節之酶底物具有式(IX)或(IX』)所示結構
F1-X9-N4(Ac)-XlO-M (IX)
M-X9-N4 (Ac)-XlO-Fl (IX，) 其中X9表示第一胺基酸序列，Fl表示與X9 (或在IX』中與X10)綴合的所述螢光部分，M(Ac)表示通過所述脫乙醯酶之作用而脫乙醯化的乙醯化胺基酸殘基(例如，乙醯化賴氨酸或)，XlO表示第二胺基酸序列並且M表示與XlO (或在IX』中與X9)綴合的所述螢光壽命調節劑。
37.根據權利要求36所述的螢光受調節之酶底物，其是Ac-Trp-Xaa-Lys (Ac) -Lys (9AA)或肽 18 =Ac-1ffK (Ac) K (9AA) -CONH2。
38.用於測定甲基轉移酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據權利要求27或權利要求28所述的螢光受調節之酶底物和在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間切割所述螢光受調節之酶底物的蛋白酶。
39.用於測定乙醯轉移酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據權利要求29或權利要求30所述的螢光受調節之酶底物和在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間切割所述螢光受調節之酶底物的蛋白酶。
40.用於測定脫亞氨酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據權利要求31或權利要求32所述的螢光受調節之酶底物和在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間切割所述螢光受調節之酶底物的蛋白酶。
41.用於測定脫甲基酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據權利要求34或權利要求35所述的螢光受調節之酶底物和蛋白酶，所述蛋白酶在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間切割在殘基N3處脫甲基化的所述螢光受調節之酶底物的經修飾形式。
42.用於測定脫乙醯酶之活性的試劑盒，所述試劑盒包含根據權利要求36或權利要求37所述的螢光受調節之酶底物和蛋白酶，所述蛋白酶在螢光部分與螢光壽命調節劑部分之間切割在殘基N4處脫乙醯化的所述螢光受調節之酶底物的經修飾形式。
43.根據權利要求24至27、29、31、33、34或36中任一項所述的螢光受調節之酶底物，或根據權利要求38至42中任一項所述的試劑盒，其中所述螢光壽命調節劑部分選自:吲哚基部分，包括胺基酸色氨酸側鏈中存在的吲哚基部分；酚部分，包括胺基酸酪氨酸側鏈中存在的酚部分；咪唑部分，包括胺基酸組氨酸側鏈中存在的咪唑部分；和苄基部分，包括胺基酸苯丙氨酸的苄基側鏈；苯氧基部分；萘基丙氨酸部分；咔唑部分和吩噻嗪部分。
44.根據權利要求24至27、29、31、33、34或36中任一項所述的螢光受調節之酶底物，或根據權利要求38至42中任一項所述的試劑盒，其中所述螢光部分選自9-氨基吖啶及其衍生物、吖啶酮衍生物、 吖啶、喹吖啶和吖啶'輪部分。
【文檔編號】C12Q1/00GK103476944SQ201280014940
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2012年3月26日 優先權日:2011年3月25日
【發明者】格雷厄姆·科頓, 科林·鄧斯莫爾 申請人:艾爾瑪可科學（蘇格蘭）有限公司