肽化合物的製作方法

2023-05-28 23:11:51

專利名稱：肽化合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及對細胞增殖具有抑制作用的肽的用途以及具有特異性和/或一般性細胞抑制作用的肽。
哺乳動物體中具有結構和功能非常不同的細胞，其分化和進化的機理已是許多研究的焦點。眾所周知，對於具有連續循環的細胞體系，其機理通常包括一多能幹細胞貯主，幹細胞分裂並不斷地向該體系中提供新的細胞。幹細胞起初是同質的，但由「貯主」提供的幹細胞很快就變成另外的形狀並進化成所需功能的細胞。
這類幹細胞體系的例子有骨髓中的紅細胞生成體系以及上皮和表皮體系。
幹細胞分裂的操縱或控制在醫療上是很有可能的，許多研究一直集中在解釋所涉及的機理及可靠的化學信息。迄今通過激發或抑制步驟，一些生物分子已被確認為對細胞生成和分化具有作用。在這方面，骨髓組織生成已被特別很好地研究過，在其控制中所涉及的分子包括促菌落因子(Colony-Stimulating Factors)(CSF)，如粒細胞促菌落因子(G-CSF)、巨噬細胞促菌落因子(M-CSF)、粒細胞-巨噬細胞促菌落因子(GM-CSF)、多譜系促菌落因子(multi-CSF;IL-3)[見Metcalf，Science 22916(1985)]、白細胞介素11(IL-11)[見Paul et al Proc Natl Acad Sci USA 877521(1990)]、乳鐵蛋白[見Broxmeyer et al Blood Cells11429(1986)]、prostoglandins[見Pelus et al J.Immunol 140479(1988)]、酸性(H-亞基)鐵蛋白[見Broxmeyer et al Blood 681257(1986)]、幹擾素(α、β和γ)[見Pelus et al supra.和Broxmeyer et al J.Immunol 1311300(1983)]、腫瘤壞死因子(α和β)[見Broxmeyer et al J.Immunol 1364487(1986)]、轉化生長因子-β[見Ottman et al J.Immunol 1402661(1988)]以及苯丙酸諾龍和抑制素[見Broxmeyer et al Proc Natl Acad Sci USA 86779(1989)]。
人們還發現，血調節五肽(PEEDCK)可選擇性地抑制骨髓組織生成細胞的增殖[見Paukovits et al Z.Naturforsch 371297(1982)]，以及對應於很窄範圍的通式的其它肽被發現在紅細胞生成中也存在著類似的抑制作用[見EP-A-112656和WO90/02753]。肽單體的氧化形成了由半胱氨酸橋連的二聚分子，這些二聚分子被發現能促進骨髓組織生成[見Laerum et al.Exp.Hematol 16274(1988)]。(PEEDCK)2二聚物及其它類似化合物公開在WO-A-88/03535中。其它的二聚肽化合物公開在EP-A-408371中，其中的二硫鍵已被連接選擇的肽鏈的碳或碳/硫橋所取代。因此該橋對水解相當穩定，而其本身非常惰性，不能參與受體-二聚物的相互作用。
儘管我們不想受限於理論研究，但已經有人認為這種肽化合物在體內與基質細胞發生作用，而且這種基質細胞通過其它可溶因子促進或抑制細胞分裂。因此二聚物被認為可誘發或促進激發細胞調節因子的基質生成，而單聚肽可以抑制此過程或者造成預防或阻止細胞分裂的因子的生成。這樣，根據目前的考慮，基質細胞可以分別擴大二聚肽和單聚肽的促進作用或抑制作用。
因此一直尋求能在體內有效地抑制細胞增殖的肽化合物。在這一方面，人們應當注意到不同的抑制程度更應與一定的臨床狀況相適應，特別地，各個細胞類型的選擇性抑制是重要的。
本發明提供了一種肽衍生物，該衍生物包括單鏈血調節肽，如抑制紅細胞生成的肽，其中非末端胺基酸的Cα原子被基團-A取代，天然α-側鏈不在所述Cα原子的位置上，其中A基團為-CRARA′-Z，這裡的每個RA分別為氫原子或基團-RA″、-ORA″、-SRA″、-NRA″RA″、CONRA″RA″或-COORA″;
RA′為氫原子或基團RA″;
RA″為烷基、環烷基、烷醯基、羥烷基、anidine、或碳環或雜環基團;
Z為基團-ORB、-NRCRC、-CRDRERF、或除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的、碳環或雜環基團;
其中每個RB為直鏈或支鏈，飽和或不飽和的烴基團，如烷基、芳烷基或芳基基團，所說的烴基團可被一個或多個RA基團取代或不被取代，其中RA如上所定，以及可被一個或多個-N-、-O-或-S-雜原子間斷或不被間斷;
RC為氫原子或基團RB;
RD為氫原子或基團RF;
RE為氫原子或基團RF，或與基團RD一起形成
C＝0;以及RF為基團-RB、-ORB、-NRCRC或-SRB，或羥基、羧基、氨基羰基或烷氧基，或者為與連在Cα原子上的氮原子相接的亞甲基，或者為與RD一起形成的亞烷基，或者在RA、RA′、RD和RE中的一個基團不是氫原子的條件下，RF為氫原子。
這裡的RA或RB中任意基團是與C相連的有機基團，其中含1至10個碳原子為優選，特別優選含1至6個碳原子。烷基可以是直鏈或支鏈的，可以被具有6-10個碳原子的芳基(即形成芳烷基)、烷氧基、羥基、醯氧基、氨基、疊氮基、醯氨基、氨基羰基或羧基取代。芳基包括含有選自O、N或S的一個或多個雜原子的5元或6元雜環芳基，如呋喃基、咪唑基、吡咯基、吡啶基和噻吩基。可以存在於芳基上的取代基包括C1-6烷基、羥基和羧基。實例包括甲基、乙基、丙基、叔丁基、戊基、羧乙基和苯甲基。
在一種實施方式中，Z代表除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的碳環或雜環基團。
特別優選的Z基團包括苯甲基、吲哚基、羥苯基、咪唑基、萘基、噻吩基、吡啶基、呋喃基、異噁唑基、3，5-二甲基異噁唑基或環己基。
在另一種實施方式中，Z代表基團-ORB(其中RB如上所定義)或-CHRDRF(其中RD代表氫原子或基團-CH3;RF代表可被羥基、氨基或疊氮基取代了的或未取代的烷基;或者RD和RF共同形成亞烷基基團)。
優選地，RA和RA′均代表氫原子，這樣，-A就是基團-CH2-Z。
根據本發明，任何具有血調節作用的單鏈肽都適合於作為本發明被取代的肽。
換一種方式表達，根據本發明，本發明提供了一些化合物，其中所述血調節肽鏈包括這些結構式
其中Ra代表
Re代表
Rf代表
或-NH-CH-COR10其中n和m各自代表0或1;
p、q和r各自代表1或2;
s代表3或4;
R1和R2均為氫原子或一起代表橋氧基;
R3和R4均為氫原子或一起代表碳-碳鍵;
R5為氫原子或醯基;
每個R6和R7各自代表羥基或氨基，但羥基為優選;
R8代表氫原子;C2-6烷基;C7-20芳烷基，該芳烷基可以含有一個或多個羥基、氨基或甲氧基取代基;或者易代謝的S-保護基;
R9代表氫原子或甲基;以及R9代表羥基或取代或未取代氨基、胺基酸穀氨醯胺的殘基或含N-末端穀氨醯胺單元的肽及其鹽。
所有所述的胺基酸殘基可為D型或L型。但是，L型胺基酸為優選。
在N-末端保護基團R5存在時，正如上面所指明的，它可以是含1-20個碳原子的醯基，例如象乙醯基之類的含1-5個碳原子的低級烷醯基，或者是含7-20個碳原子的芳醯基或芳烷醯基，如苯甲醯基或苯乙醯基。
R5也可以是由胺基酸或肽鏈衍生的醯基。更具體地說，R5可以是由絲氨酸或任何肽衍生的醯基，該肽是由通過N-末端胺基酸的連續分離而從下列胺基酸序列衍生的
所有具有結構式(Ⅰ)的肽的末端氨基最好被保護起來，例如由烷醯基、芳烷醯基或芳醯基的醯化作用來保護。
這裡的R8為C2-6烷基，例如，它可以是乙基、丁基或己基。當R8為芳烷基時，它可為芳甲基，如苯甲基、二苯甲基或三苯甲基。當R8為易代謝基團時，它可為含5-10個碳原子的芳硫基，如吡啶硫基，或者為如上所定義的醯基。
本發明優選的化合物為王肽，也就是n優選為0。
Ra基團中的環基優選為5元環，也就是m優選為0。
儘管結構式(Ⅰ)所定義的肽的血調節活性很低或可忽略，但是，在抑制細胞增殖方面，在本發明的肽化合物衍生物中，它們仍然是有效的。
在由結構式(Ⅰ)中描述的肽鏈形成的肽化合物衍生物中，Rd處的鏈取代是需要的。
根據本發明，特別優選的肽化合物衍生物具有結構式Ⅱ
其中Ra、Rb、Rc、Re、Rf、A和n均為上述所定義的，基團-NH-CH-CO-為Rd的衍生形式，Rd與基團-A相連，按此連接方式，天然側鏈不再存在。本發明還包括結構式Ⅱ的化合物，其中A與相鄰的基團-N-CH-CO-一起形成了脯氨酸殘基。
一種結構式Ⅱ中特別優選的肽化合物為
其中基團-A為上面討論過的基團。
本發明肽衍生物抑制除了或者甚至不包括造血體系的很寬範圍的細胞增殖的能力在醫學上即不論是在細胞過渡增殖需要治療方面如在牛皮癬中，或者是在癌症治療很可能損傷特定的細胞群方面很有價值。許多種類的細胞對胞毒藥物或對抗癌治療中所用的射線是非常敏感的，一個已知的技術就是在抗癌治療時利用藥物來抑制如造血體系中的那些細胞的增殖，接著，當藥物抑制作用消失時，再恢復正常的增殖。本發明的肽對所說的治療好象具有合適的短的生物半衰期。類似地，對癌症治療敏感的選擇性細胞群的增殖可以與癌細胞本身一起被抑制，因此僅當癌細胞達到增殖的敏感態而正常細胞處於較不敏感態時，才開始抗癌治療。
當如骨髓細胞、吞噬細胞或粒性白細胞之類的細胞在治療期間被CSF藥物激發時，一種細胞的增殖才發生。細胞生長的抑制可以使這種細胞恢復到正常的生長速率。
在許多自身免疫性疾病中，患者會產生對其組織有活性的白細胞。這種自身免疫的反應可通過抑制白細胞功能而相應地減少至少一段時間。
另一個臨床應用是將相應的二聚物或有關的骨髓組織生成促進劑共同使用(如WO-A-88/03535中公開的)，從而誘發骨髓細胞中高活性和低活性的交替峰值，這樣可以提高紅細胞生成的自然二十四小時節律。通過這種方式，可在骨髓低活性期間給予抑制細胞生長這樣的治療，由此降低了骨髓損傷的危險性，而且通過後續活性峰值能促進再生。
一般地說，為了達到抑制作用，病人可口服本發明的肽或注射入病人體中，其劑量為每70Kg體重每天0.001-100mg，例如，1-5mg。如果是靜脈內或皮下給藥，其劑量可以在每70Kg體重每天1-10mg，如約6mg，可給藥達10天。當然，通過鼻、局部(透皮吸收)或直腸給藥也是可行的。原則上說，使病人的胞外液產生10-13M至10-5M的肽濃度是需要的。
根據本發明的另一特徵，提供了藥物組合物，該組合物含有如上文定義的一種或多種肽化合物衍生物或其生理相容的鹽活性成分，它們與藥物載體或賦形劑相結合。根據本發明，此組合物可以以適合於通過口、鼻、腸胃外或直腸給藥的形式存在。
這裡使用的術語「藥物」包括本發明在獸醫上的應用。
根據本發明，該化合物可以以常規的藥物給藥形式存在，如片劑、包衣片劑、鼻噴霧劑、溶液、乳劑、粉劑、膠囊劑或緩釋劑。常規的藥物賦形劑及其通常的生產方法可被用來製備這些藥劑形式。例如，片劑是通過將活性成分與公知的賦形劑如稀釋劑、崩解劑、粘合劑、潤滑劑和/或緩釋試劑混合而生產出來的。所述稀釋劑有碳酸鈣、磷酸鈣或乳酸鈣，崩解劑有玉米澱粉或藻酸，粘合劑有澱粉或明膠，潤滑劑有硬脂酸鎂或滑石，緩釋試劑有羧基聚亞甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素或聚乙酸乙烯酯。
如果需要的話，片劑可有若干層。包衣片劑可通過包覆心層而製得，該心層是由類似生產片劑的方法得到的，常用於片劑包衣的試劑有聚乙烯吡咯烷酮或紫膠片、阿拉伯樹膠、滑石、二氧化鈦或糖。為了獲得緩釋效果或避免不相容，心層也可以由幾層組成。同樣為了獲得緩釋效果，片劑包衣也可由幾層組成，其中可使用上述片劑的賦形劑。
也可使用特定器官的載體體系。
例如，注射劑可由常規的方法生產，如通過加入對羥基苯甲酸酯之類的防腐劑或如EDTA一樣的穩定劑而生產注射劑。然後再裝入注射小瓶或安瓿中去。
鼻噴霧劑可由與水溶液劑相似的方法製成，裝入噴霧容器中，該容器裝有氣溶膠推進劑或提供有手動壓縮裝置。含一種或多種活性成分的膠囊劑可通過如將活性成分與惰性載體混合、再將該混合物裝入膠囊中去的方法製得，所述惰性載體如乳糖或山梨糖。
例如合適的栓劑可以通過將活性成分或活性成分組合物與為本目的設想的常規載體混合而製得，所述載體有天然脂肪或聚乙二醇或其衍生物。
優選地，含本發明化合物的劑量單位為含結構式(Ⅰ)的肽或其鹽0.1-10mg，如1-5mg。
本發明提供了用於抑制細胞分裂、特別是骨髓組織生成和骨髓再生的如上所述的肽化合物和組合物。根據本發明，肽化合物在製備抑制細胞分裂如骨髓組織生成和骨髓再生的藥物方面的用途也構成了本發明的另一方面。
根據本發明的又一特徵，本發明提供了一種抑制細胞分裂、特別是骨髓組織生成的方法，該方法包括給予有效劑量的如上文所定義的化合物或藥物組合物。
然而，新的肽化合物衍生物的主要用途是在生產用於免疫分析技術的材料方面。肽可再與合適的高分子載體共價相連，從而注射到產生抗體的動物(如兔、豚鼠或山羊)體中，所述高分子載體有白蛋白、聚賴氨酸或聚脯氨酸。在體外，也可使用免疫技術。通過公知的吸收技術，採用高分子載體可得到高專一性的抗血清。將放射性(3H、125I、14C、35S)引入到肽分子中，可設計出放射免疫分析，此分析可用於確定不同生物體液如血清(血漿)、尿或腦脊髓液中的肽。
本發明的肽可用任何便利的方法合成。生成胺基酸單元的合適的方法公開在如Robert M.Williams的「Synthesis of Optically Active α-Amino Acids」(Pergamon Press，1989)中。一般地說，活性側鏈基團(氨基、硫羥基和/或羧基)在整個合成的偶聯反應中將受到保護，但在整個合成過程中使某些側鏈基團不受保護也是可能的，這些基團包括羥基、咪唑基、伯醯胺基、如pyroGlu一樣的環胺基酸中的醯胺基。
因此，最後的步驟是將具有通式Ⅰ的肽的完全或部分受保護的衍生物去保護，此過程構成了本發明的進一步方面。
Schoellkopf等人已經描述了通過雙內醯亞胺醚的金屬取代、再烷基取代而製備各種胺基酸的方法[見，如Tetrahedron 392085(1983)和Topics Curr Chem 10965(1983)]。該方法的應用證明其在製備形成本發明基礎的取代胺基酸過程中是特別有用的。具體地說，由纈氨酸-甘氨酸二肽衍生的雙內醯亞胺醚形成了取代反應的有用的起始化合物，該取代反應可總結如下
(其中X為一離去基團，如溴原子)。
如果D-纈氨酸起初用來生成雙內醯亞胺醚，那麼(S)α-胺基酸衍生物可由這種方法製備。相同地，(R)-α-胺基酸衍生物可通過L-纈氨酸製備。
因此，根據本發明，本發明也提供了生產肽化合物的方法，該方法包括部分或完全受保護的衍生物的去保護。
根據本發明，本發明提供了一種生產肽化合物的方法，該方法包括a)將雙內醯亞胺醚金屬取代、再烷基取代，從而生成雙內醯亞胺二肽醚;
b)水解步驟(a)的雙內醯亞胺二肽醚，從而生成具有NH2-CH(A)-COOH結構的胺基酸，其中A如上文所定義;
c)引入肽鏈中的剩餘胺基酸;以及d)任何被保護基的去保護。
由該方法生成的取代雙內醯亞胺二肽醚和取代α-胺基酸構成了本發明的進一步方面。
另外，本發明還包括了本發明的氨基保護、羥基保護、硫羥基保護和/或羧基保護的肽衍生物。
取代的α-胺基酸一旦生成，即可採用常規方法將肽鏈中的剩餘胺基酸引入。
在形成肽鏈時，原則上可從C-末端或N-末端開始，但通常採用從C-末端開始的方法，因為這樣的酸序列是完整的。
因此，人們可通過將第一個胺基酸適當保護的衍生物與第二個胺基酸適當保護的衍生物反應而從C-末端開始。第一胺基酸衍生物將具有一自由α-氨基基團，而其它反應物將具有一自由或活性羧基和被護氨基。偶聯之後，中間產物可通過例如色譜法進行純化，然後有選擇地去掉N-保護。從而允許進一步引入N-被保護及自由或活性的胺基酸殘基。此過程不斷地進行，直到所需的胺基酸序列形成。
例如，可採用的羧酸活化取代基包括對稱或混合酐、或活性酯如對硝基苯酯、2，4，5-三氯苯酯、N-羥基苯並三唑酯(OBt)、N-羥基琥珀醯亞胺酯(OSu)或五氟苯酯(OPFP)。
例如，自由氨基和羧基的偶聯可採用二環己基碳二亞胺(DCC)來完成。可採用的另一種偶聯劑如N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氫喹啉(EEDQ)。
一般地說，在低溫如-20℃至室溫下，在適當的溶劑體系如四氫呋喃、二噁烷、二甲基甲醯胺、二氯甲烷或這些溶劑的混合物中，可便利地實現偶聯反應。
在固相樹脂載體上可便利地完成合成。氯甲基化聚苯乙烯(利用1%丁二烯苯交聯)是一有用的載體類型;在這種情況下，例如合成將通過N-被保護的賴氨酸與載體偶聯而從C-末端開始合成。
大量合適的固相方法在下列文獻中公開了，Eric Atherton，Christopher J.Logan和Robert C.Sheppard，J.Chem.Soc.Perkin I，538-46(1981);James P.Tam，Foe S.Tjoeng和R.B，Merrifield J.Am.Chem.Soc.102，6117-27(1980);James P.Tam，Richard D.Dimarchi和R.B.Merrifield Int.J.Peptide Protein Res 16412-25(1980);Manfred Mutter和Dieter Bellof，Helvetica Chimica Acta 67 2009-16(1984)。
在溶液中進行偶聯反應也是可能的。
在很寬範圍內選擇胺基酸的保護基是公知的，在下列文獻中有實例Schroeder，E.和Lübke，K.，The Peptides，Vols.1和2，Academic Press，New York和London，1965和1966;Pettit，G.R.，Synthetic Peptides，Vols.1-4，Van，Nostrand，Reinhold，New York 1970，1971，1975和1976;Houben-Weyl，Methoden der Organischen Chemie，Synthese von Peptiden，Band 15，Georg Thieme Verlag Stuttgart，NY，1983;The Peptides，Analysis，synthesis，biology 1-7，EdErhard Gross，Johannes Meienhofer，Academic Press，NY，San Fransisco，London;Solid phase peptide synthesis Znded.，John M.Stewart，Janis D.Young，Pierce Chemical Company。
因此，例如可採用的胺保護基包括如下例舉的保護基苄酯基(Z-)、叔丁氧基羰基(Boc-)、4-甲氧基-2，3，6-三甲基苯磺醯基(Mtr-)以及9-芴基甲氧羰基(Fmoc-)。可以理解，當肽由C-末端生成時，胺保護基將出現在每個新加入的殘基的α-氨基上，並需在下步偶聯反應之前有選擇地除去。
在固相體系中，對這類臨時胺保護的一個特別有用的基團是Fmoc基團，它可在有機溶劑中利用呱啶進行有選擇性的脫除。對於在溶液中合成，Boc-為一優選的保護基團，它可用常規方法引入和脫除。
胺基酸或肽經常需要在保護前進行甲矽烷基化反應，例如可通過在有機溶劑中加入Fmoc而完成，這樣可提高其在有機溶劑中的溶解性。甲矽烷基化和Fmoc保護反應可總結如下
例如，可採用的羧基保護基團包括易裂解酯基，如苄基(-OBZL)、對硝基苄基(-ONB)或叔丁基(-TOBu)，以及在固體載體上的偶聯基團，如連接在聚苯乙烯上的甲基。
硫羥基保護基團包括對甲氧苄基(Mob)、三苯甲基(Trt)及乙醯氨基甲基(Acm)。
正如上述文獻中所詳細描述，存在著很多其它這類基團，在上文描述的方法中使用這類基團應屬本發明範疇。
有許多方法可除去胺和羧基保護基團。然而必須與所用的合成步驟相一致。側鏈保護基團在下步偶聯前所採用的脫除臨時α-氨基保護基的條件下必須是穩定的。
胺保持基團如Boc和羧基保護基團如tOBu可通過酸處理同時被除去，例如，通過三氟乙酸處理。硫羥保護基團如Trt可利用如碘之類的氧化劑有選擇地被除去。
含半胱氨酸的肽可由本文描述的方法合成而得;作為合成最後的步驟，除去包括硫羥保持基在內的所有保護基團。
下面給出的實施例僅僅是為了舉例說明本發明。
實施例1(S)-2-(9-芴基甲氧羰基氨基)-5-苯基-4-(E)-戊烯-1-酸(S)-2-氨基-5-苯基-4-(E)-戊烯-1-酸是由(R)-(一)-2，5-二氫-3，6-二甲氧基-2-異丙基吡嗪和肉桂醯溴通過類似於U.Schollkopf，U.Groth和C.Deng在Angew.Chem93(1981)793中描述的方法製備而成的。這樣，將得到的胺基酸(4.0mmol)加入到六甲基二矽氮烷(15ml)和三甲基氯矽烷(2.0ml)的混合物中，將混合物在100℃下加熱並在N2中攪拌一夜。然後將多餘的甲矽烷基化試劑蒸餾掉，殘餘物溶解在CH2Cl2(10ml)中，加入在無水CH2Cl2(5ml)中的9-芴基甲氧羰基氯(4.1mmol)，在N2中將混合物在室溫條件下攪拌3小時，將CH2Cl2蒸發掉，殘餘物溶解在THF(9ml)和水(1ml)中，攪拌溶液30分鐘並蒸發，殘餘物溶解在EtOAc中，並將其乾燥(MgSO4)、蒸發以得到用於下步肽合成的標題化合物。
實施例2(2S，4R，5R)-N-9-芴基甲氧羰基-N′-苄氧羰基-4，5-二羥基-4，5-0，0-異亞丙基賴氨酸a)(2R，3R)-1-溴-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]-2，3-二羥基-2，3-0，0-異亞丙基-丁烷將(2R)-2，5-二氫-3，6-二甲氧基-2-異丙基吡嗪(3.24g，17.36mmol)溶解在60ml無水THF中，溶液冷卻至-78℃。加入BuLi的己烷(10.85ml，17.36mmol)溶液，攪拌溶液30分鐘。在加入7.8ml1，3-二甲基-2-咪唑酮後，再持續攪拌15分鐘。滴入(2R，3R)-1，4-二嗅-2，3-二羥基-2，3-0，0-異亞丙基丁烷(5.0g，17.36mmol)的10ml THF溶液，所得溶液在一夜中達到室溫。利用磷酸鹽緩衝劑(pH＝7)水解之後，用EtOEt將反應混合液萃取幾次，再將有機溶液乾燥(MgSO4)、濃縮，通過快速色譜法將殘餘物純化(己烷/乙酸乙酯9/1)。
產率3.00g(44.1%)。
1H NMR(CDCl3)δ0.7(d，3H)，1.04(d，3H)，1.40(s，3H)，1.41(s，3H)，1.95-2.30(m，3H)，3.40-3.58(m，2H)，3.68(s，3H)，3.70(s，3H)，3.97(dd，1H)，4.03-4.20(m，3H)13CNMR(CDCl3)δ16.74，19.03，27.29，27.46，31.88，32.66，37.83，52.40，52.42，52.55，60.76，79.80，109.22，163.21，164.00
FAB-MS signal at m/z391.2(72)，141.1(100)。
b)(2R，3R)-1-疊氮-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]-2，3-二羥基-2，3-0，0-異亞丙基-丁烷將(2R，3R)-1-溴-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]-2，3-二羥基-2，3-異亞丙基丁烷(5.51g，14.11mmol)溶解在50ml DMF中，並加入2.93g NaN3(45mmol)和0.1g NBu4I。溶液保持在70-80℃之間過夜，再用50ml水稀釋。利用氯仿萃取之後，收集有機層並乾燥(MgSO4)。通過快速色譜法將殘餘物純化(己烷/乙酸乙酯7/3)。
產率4.06g(81.5%)。
1H NMR(CDCl3)δ0.68(d，3H)，1.03(d，3H)，1.40(s，3H)，1.42(s，3H)1.95-2.30(m，3H)，3.20-3.80(m，2H)，3.65(s，3H)，3.68(s，3H)，3.95(dd，1H)，4.00-4.15(m，3H)13CNMR(CDCl3)δ16.72，19.02，26.92，27.27，31.85，37.52，52.10，52.36，52.41，60.70，75.09，79.64，109.13，163.17，164.00FAB-MS signal at m/z 354.3(100)，141.1(75)。
c)(2R，3R)-1-苄氧羰基氨基-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪]-2，3-二羥基-2，3-0，0-異亞丙基-丁烷將(2R，3R)-1-疊氮-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪]-2，3-二羥基-2，3-0，0-異亞丙基丁烷(3.57g，10.12mmol)溶解在60mlEtOH中並加入1.3g Pd/c。利用氬氣吹掃溶液。將氫氣吹入溶液中，溶液在氫氣中放置過夜，再用硅藻土過濾。殘餘物在真空中乾燥並溶解在30ml二噁烷中。加入15ml 1M NaHCO3溶液(15mmol)並在0℃下加入1.84mlCbzCl(13mmol)。溶液在此溫度下攪拌1小時，用水稀釋，用氯仿萃取。通過快速色譜法將殘餘物純化(己烷/乙酸乙酯8/2)。
產率2.20g(44.1%)HNMR(CDCl3)δ0.67(d，3H)，1.03(d，3H)，1.35(s，3H)，1.38(s，3H)，1.90-2.05(m，1H)，2.10-2.30(m，2H)，3.30-3.55(m，2H)，3.64(s，3H)，3.68(s，3H)，3.92-4.15(m，4H)，5.09(s，2H)，5.45(m，1H)，7.26-7.38(m，5H)13CNMR(CDCl3)δ16.70，19.05，27.17，31.83，37.69，42.94，52.26，52.41，52.52，60.65，66.72，75.69，79.41，108.61，128.02，128.07，128.47，136.54，156.40，163.24，164.11FAB-MS signal at m/z 462.3(56)，141.1(47)，91.0(100)C24H35N3O6(461.6)計算C，62.45;H，7.64;N，9.10實驗C，62.99;H，7.67;N，8.77d)(2S，4R，5R)-N′-苄氧羰基-4，5-二羥基-4，5-0，0-異亞丙基-賴氨酸甲酯將(2R，3R)-1-苄氧羰基氨基-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]-2，3-二羥基-2，3-0，0-異亞丙基丁烷(0.5g，1.08mmol)溶解在5ml二噁烷中，滴入4.20ml 0.5MHCl(2.10mmol)，在室溫下，將溶液置於氬氣中攪拌5小時。加入氨溶液，直至pH達到9，用氯仿萃取溶液並乾燥(MgSO4)。通過球-球(bulb-to-bulb)蒸餾(0.05Torr，25℃)將纈氨酸甲酯(VaLOMe)分離出去。
產率0.40g(100%)1H NMR(CDCl3)δ1.35(s，6H)，1.70-2.20(m，4H)，3.20-3.60(m，3H)，3.70(s，3H)，3.73-3.90(m，2H)，5.09(s，2H)，5.32(m，1H)，7.26-7.40(m，5H)13CNMR(CDCl3)δ27.01，27.05，37.56，42.11，51.99，52.38，66.79，75.79，79.82，108.99，128.00，128.44，136.39，156.46，175.30(2S，4R，5R)-N′-苄氧羰基-4，5-二羥基-4，5-0，0-異亞丙基-賴氨酸將(2S，4R，5R)-N′-苄氧羰基-4，5-二羥基-4，5-0，0-異亞丙基賴氨酸甲酯(0.40g，1.08mmol)溶解在3.5ml水和4ml二噁烷中，並冷卻至0℃。加入0.54ml 2N LiOH溶液(1.08mmol)，將溶液置於氬氣中攪拌過夜。TLC對照顯示出了(2S，4R，5R)-N′-苄氧羰基-4，5-二羥基-4，5-異亞丙基賴氨酸的定量生成。將此粗溶液直接用於下步反應。
(2S，4R，5R)-N-9-芴基甲氧羰基-N′-苄氧羰基-4，5-二羥基-4，5-0，0-異亞丙基-賴氨酸將2.5ml 1M NaOH溶液(2.5mmol)和0.518g 9-芴氧羰基氯(2.00mmol)的3ml二噁烷溶液加入到(2S，4R，5R)-N′-苄氧羰基-4，5-二羥基-4，5-異亞丙基賴基酸的粗溶液中，攪拌此混合物一夜。通過加入KHSO4溶液將上述溶液酸化至pH為2，用乙酸乙酯萃取、乾燥(MgSO4)。通過快速色譜法純化殘餘物(氯仿/MeOH8/2)。
產率310mg(50.0%)
1H NMR(DMSO/D2O)δ1.19(s，3H)，1.22(s，3H)，1.60-2.10(m，2H)，2.90-3.30(m，2H)，3.50-4.00(m，3H)，4.00-4.40(m，3H)，4.95(s，2H)，7.20-8.00(m，13H)13CNMR(DMSO/D2O)δ27.59，27.81，37.14，43.15，53.94，65.92，66.01，76.98，80.16，108.40，120.61，125.67，125.79，127.66，128.16，128.22，128.32，128.89，137.55，141.18，144.36，156.14，156.87，176.09FAB-MS signal at m/z 497.1(3)，429.1(4)，179.1(31)，91.0(64)C32H34N2O8(574.6)實驗C，66.89;H，5.96;N，4.88計算C，62.53;H，5.60;N，5.03實施例3(S)-2-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-6-疊氮基己酸a)1-溴-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]-丁烷將(2R)-2，5-二氫-3，6-二甲氧基-2-異丙基吡嗪(3.76g，20.43mmol)溶解在60ml無水THF中，溶液冷卻至-78℃加入nBuLi的己烷(20.43mmol，12.77ml)溶液，溶液攪拌30分鐘。滴入1，4-二溴丁烷(4.41g，20.43mmol)的10ml THF溶液，溶液溫度在一夜間達到室溫。在利用磷酸鹽緩衝液(pH＝7)水解之後，利用EtOEt萃取反應混合液幾次，有機溶劑被乾燥(MgSO4)。通過快速色譜法純化殘餘物(己烷/乙酸乙酯9/1)。
產率3.88g(59.6%)。
1H NMR(CDCl3)δ0.68(d，3H)，1.04(d，3H)，1.23-1.47(m，2H)，1.63-1.91(m，4H)，2.25(m，1H)，3.38(t，2H)，3.67(s，3H)，3.68(s，3H)，3.90-4.05(m，2H);13CNMR(CDCl3)δ16.58，19.03，23.29，31.75，32.63，33.13，33.58，52.33，55.13，60.78，163.60。
b)1-疊氮基-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]-丁烷將1-溴-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]-丁烷(3.81g，11.95mmol)溶解在40ml DMF，加入NaN3(50mmol)和0.1g NBu4I。溶液保持在70-80℃之間過夜，用50ml水稀釋。在用氯仿萃取之後，收集並乾燥(MgSO4)有機層。通過快速色譜法純化殘餘物(己烷/乙酸乙酯9/1)。
產率2.17g(64.6%)。
1HNMR(CDCl3)δ0.68(d，3H)，1.04(d，3H)，1.20-1.50(m，2H)，1.53-1.91(m，4H)，2.26(m，1H)，3.25(t，2H)，3.68(s，3H)，3.69(s，3H)，3.90-4.07(m，2H)13CNMR(CDCl3)δ16.58，19.05，21.83，28.72，31.76，33.56，51.32，52.35，55.16，60.79，163.63。
c)(S)-2-氨基-6-疊氮己酸甲酯將1-疊氮基-4-[(2R，5S)-3，6-二甲氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]丁烷(2.17g，7.72mmol)溶解在30ml二噁烷中，滴入1.28ml濃HCl的30ml水溶液(15.45mmol)，在室溫下將此混合液置於氬氣中攪拌一夜。加入氨溶液，直至pH達到9。用氯仿萃取溶液並乾燥(MgSO4)，通過球-球蒸餾(0.05Torr，25℃)將纈氨酸甲酯(VaLOMe)分離出去。
產率1.44g(100%)。
1H NMR(CDCl3)δ1.40-1.87(m，8H)，3.28(t，2H)，3.43(dd，1H)，3.73(s，3H)13CNMR(CDCl3)δ22.93，28.63，34.36，51.22，51.98，54.26，176.37。
d)(S)-2-氨基-6-疊氮己酸將(S)-2-氨基-6-疊氮己酸甲酯(1.44g，7.73mmol)溶解在4ml二噁烷中，冷卻至0℃。加入3.87ml 2N LiOH溶液(7.74mmol)，將溶液置於氬氣中攪拌一夜。TLC對照顯示出了(S)-2-氨基-6-疊氮己酸的定量生成。此粗溶液被用於下步反應中。
e)(S)-2-(9-芴基甲氧基羰基氨基)-6-疊氮己酸將11.6ml 1N NaHCO3溶液(11.6mmol)和3.00g 9-芴氧基羰基氯(11.6mmol)的12ml二噁烷溶液加入到上述(S)-2-氨基-6-疊氮己酸(7.73mmol)粗溶液中，在氬氣中繼續攪拌一夜。通過加入KHSO4溶液將其酸化至pH為2，用乙酸乙酯萃取並乾燥(MgSO4)，通過快速色譜法將殘餘物純化(己烷/乙酸乙酯/乙酸/7/3/0.5)。
產率2.00g(65.6%)1H NMR(DMSO)δ1.20-1.80(m，2H)，3.31(t，2H)，3.94(m，1H)，4.27(m，3H)，7.20-8.00(m，8H)13CNMR(DMSO)δ23.32，28.26，30.73，47.10，50.94，54.09，66.01，120.48，125.65，127.44，128.02，141.11，144.19，144.25，156.54，174.22。
實施例4(S)-N-(9-芴基甲氧羰基)-O-甲基-絲氨酸
a)(2R，5S)-3，6-二甲氧基-5-(甲氧基甲基)-2-異丙基-2，5-二氫吡嗪將1.6Mn-BuLi的己烷(10.85ml，17.36mmol)溶液在-78℃下加入到(R)-2，5-二氫-3，6-二甲氧基-2-異丙基-吡嗪(5.53g，30mmol)的無水THF溶液中。30分鐘後，將溴甲基甲醚(4.5g，36mmol)的THF(20ml)溶液滴入到上述溶液中。反應混合液被允許在一夜中變成20℃並通過加入1M磷酸鹽緩衝劑(pH7，80mmol)。將溶液驟冷。攪拌此混濁混合物10分鐘，用水(250ml)和二乙醚(180ml)稀釋。液層被分開，用二乙醚(2×150ml)萃取水相。乾燥並濃縮(Na2SO4)合併的有機層，通過快速色譜法純化殘餘物(矽膠;乙烷二乙醚為51)，產量為5.61g。為了分離除去其它非對映體雜質，將材料在-30℃溫度下從乙腈中結晶出來，並將冷的沉澱物再溶解在CH2Cl2、乾燥(Na2SO4)和濃縮。
產率4.24g(18.6mmol，62%)。
1NMR(CDCl3)δ4.05(q，1H，J 3.5Hz)，3.99(t，1H，J 3.5Hz)，3.80-3.64(m，8H)，3.34(s，3H)，2.29(dsept，1H，J 3.5，7.0Hz)，1.05(d，3H)，0.68(d，3H)。13C NMR(CDCl3)δ164.79，161.58，74.13，60.76，59.51，56.82，52.42。
FAB-MS signal at m/z 229[M++1]。
C11H20N2O3(228.29)。
b)(S)-2-(9-芴基甲氧羰基氨基)-3-甲氧基丙酸甲酯將1M HCl(18.4ml，18.4mmol)加入到(2R，5S)-3，6-二甲氧基-5-(甲氧甲基)-2-異丙基)-2，5-二氫吡嗪(2.1g，9.2mmol)的二噁烷(18ml)溶液中，混合液在室溫下攪拌一夜。將揮發性成分蒸發，殘餘物再溶解在二噁烷中並再次蒸發。殘餘物粗品溶解在二噁烷中並加入FmocCl(5.71g，2.-21mmol)。2分鐘後，加入1M NaHCO3(44.2ml，44.2mmol)。15分鐘後用水(50ml)和CHCl3(100ml)稀釋混合物。分離層相，用CHCl3(2×75ml)萃取其中水相。合併的有機層被乾燥(Na2SO4)、濃縮，並通過快速色譜法純化(矽膠;己烷乙酸乙酯2∶1)。
產率2.68g(7.54mmol，82%)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ7.78(d，2H，J 7Hz)，7.63(t，2H，J 7Hz)，7.41(t，2H，7 Hz)，4.56-4.35(m，3H)，4.25(t，1H，J 3.0，9.3Hz)，3.84(dd，1H，J 3.0，9.3Hz)3.70(s，3H)，3.65(dd，1H，J 3.6，9.3Hz)，3.36(s，3H)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ170.77，156.01，143.88，143.75，141.25，127.66，127.02，125.12，125.07，119.92，72.27，67.11，59.23，54.37，53.44，52.54，47.12。
c)(S)-(9-芴基甲氧羰基氨基)-3-甲氧基丙酸將6M HCl(31ml，184mmol)加入到(S)-(9-芴基甲氧羰基氨基)-3-甲氧基丙酸甲酯(2.18g，6.13mmol)的二噁烷(31ml)溶液中。使混合液冷卻並濃縮。通過快速色譜法純化殘餘物(矽膠;己烷∶乙酸乙酯∶乙酸10∶10∶1)。
產率1.91g(5.60mol，91%)(冷凍乾燥後)。
1H NMR(DMSO-d6)δ7.87(d，2H，J 7.5Hz)，7.74(d，2H，J 7.5Hz)，7.41(dt，2H，J 0.6Hz，7.5Hz)，7.31(dt，2H，J 0.6Hz，7.5Hz)，4.29-4.19(m，4H)，3.65-3.54(m，2H)，3.24(s，3H)，13C NMR(DMSO-d6)δ172.07，156.46，144.23，144.21，141.11，128.03，127.46，125.73，120.48，71.80，66.19，5860，54.47，47.05。
實施例5(S)-6-(苄氧羰基氨基)-2-(9-芴基甲氧羰基氨基)-己炔-4-酸a)1-氯-4-[(2R，5S)-3，6-二乙氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]丁-2-炔將1.6M n-BuLi(62.5ml，100mmol)在-78℃下滴入到(R)-2，5-二氫-3，6-二乙氧基-2-異丙基吡嗪(21.23g，100mmol)的THF(200ml)溶液中。30分鐘後，在-78℃溫度下將此溶液轉移至1，4-二氯丁-2-炔(49.2g，400mmol)的THF(400ml)溶液中。該混合液在一夜間變成20℃。通過加入1M磷酸鹽緩衝溶液(250ml)將上述反應聚冷。用二乙醚(300ml)和水(300ml)將混合液稀釋。水層被分離並用二乙醚(2×300ml)萃取。合併的有機層被乾燥(Na2SO4)、過濾、濃縮並通過快速色譜法純化(矽膠;己烷∶二乙醚10∶1)。
產率24.8g(83mmol，83%)。
1H NMR(CDCl3)δ4.39-4.00(m，8H)，2.78(m，AA′X，2H)，2.30(dsept，1H，J 3.5，9.5Hz)，1.38-1.20(m，6H)，1.05(d，3H，7Hz)，0.70(d，3H，7Hz)。13C NMR(CDCl3)δ161.03，159.25，83.76，60.90，54.21，31.68，30.95，25.48，20.62，19.03，15.85，14.21。
b)1-疊氮基-4-[(2R，5S)-3，6-二乙氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]丁-2-炔將1-氯-4-[(2R，5S)-3，6-二乙氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]丁-2-炔(19.4g，65mmol)和碘化四丁銨(2g)的無水DMF(200ml)溶液在20℃溫度下攪拌一夜。大部分DMF在減壓(0.01torr)條件下被分離除去。在二乙醚(250ml)和水(250ml)之間分配殘餘物。用乙醚(2×250ml)萃取水層。合併的有機層被乾燥(Na2SO4)、濃縮並通過快速色譜法純化殘餘物(矽膠;己烷∶二乙醚8∶1)。
產率18.06g(59mmol，91%)。
1H NMR(CDCl3)δ4.25-3.99(m，4H)，3.84(m，6H)，3.84(m，2H)，2.83-2.77(m，AA′X，2H)，2.33-2.26(m，1H)，1.35-1.27(m，6H)，1.05(d，3H，J 7.2Hz)，0.71(d，3H，J 7.2Hz)。13C NMR(CDCl3)δ164.24，161.16，84.54，73.50，61.00，60.74，54.31，40.20，31.84，25.31，19.03，16.62，14.27，14.21。
c)1-苄氧羰基氨基-4-[(2R，5S)-3，6-二乙氧基-2，5-二氫-2-異丙基-5-吡嗪基]丁-2-炔將三苯膦(3.7g，14.16mmol)和水(680ml，37.8mmol)在20℃溫度下加入到1-疊氮基-4-[(2R，5S)-3，6-二乙氧基-2-異丙基-2，5-二氫-5-吡嗪基]丁-2-炔中。立即觀察到了N2-演變。將反應混合物攪拌2小時，然後再濃縮。0℃溫度下向殘餘物的二噁烷(29ml)溶液中加入1M NaHCO3(14.2ml，14.2mmol)和Cbz-氯(2.42g，14.2mmol)。混合液在此溫度下保持1小時，然後用二乙醚(3×50ml)萃取。合併的有機層被乾燥(Na2SO4)、過濾、濃縮並通過快速色譜法純化(矽膠;己烷∶乙酸乙酯4∶1)。
產率4.1g(9.92mmol，84%)。
1H NMR(CDCl3)δ7.37-7.33(m，5H)，5.10(s，2H)，4.24-4.03(m，6H)，3.97-3.90(m，4H)，2.70-2.67(m，AA′X，2H)，2.32-2.25(m，1H)，1.27(t，4H，J 7Hz)，1.04(d，3H，J 7Hz)，0.69(d，3H，J 7Hz)。13C NMR(CDCl3)δ164.11，161.35，136.31，128.46，128.42，128.05，127.53，126.89，80.41，66.85，65.25，60.85，60.69，60.65，54.43，31.66，25.32，19.054，16.53，14.29，14.21。
d)(S)-2-氨基-6-(苄氧羰基氨基)-2-己炔酸乙酯將1M HCl(38.7ml，38.7mmol)加入到1-苄氧羰基氨基-4-[(2R，5S)-3，6-二乙氧基-2，5-二氫-2-異丙基-5-吡嗪基]丁-2-炔(4g，9.67mmol)的二惡烷(38ml)溶液中。在室溫下攪拌此混合液一夜。大部分二惡烷在減壓條件下被分離除去，用水將含水殘餘物稀釋至100ml。用乙醚(100ml)萃取此混合液。通過加入能形成白油的濃縮NH3，將溶液的pH值調整至9。用CHCl3(3×50ml)萃取該混合液，合併的CHCl3層被乾燥(MgSO4)、過濾和濃縮。將殘餘物在50℃(0.1torr)條件下進行Kugelrohr蒸餾，從而分離出纈氮酸乙酯。剩下的材料為純產品。
產率2.57g(8.44mmol，87.3%)1H NMR(CDCl3)δ7.34(s，5H)，5.11(s，2H)，4.18(q，2H，J 7Hz)，3.96(m，2H)，3.57(t，1H，J 6Hz)，2.60(AA′X，2H)，1.27(t，3H，J 7Hz)。13C NMR(CDCl3)δ173.73，160.3，136.24，128.44，128.10，128.05，79.02，78.66，66.93，61.19，53.22，31.15，25.10，14.15。
e)(S)-6-(苄氧羰基氨基)-2-9-芴基)-甲氧羰基氨基)-4-己炔酸將1M NaHCO3(2.05ml，2.05mmol)和水(3ml)加入到(S)-2-氨基-6-(苄基羰基氨基)-4-己炔酸乙酯(520mg，1.71mmol)的二噁烷(5ml)溶液中。5小時後，加入FmocCl(530mg，2.05mmol)的二噁烷(5ml)溶液。幾乎是立即就形成沉澱。通過加入1M HCl酸化該混合液，用CHCl3(3×30ml)萃取。有機層被濃縮並通過快速色譜法純化(矽膠;己烷∶乙酸乙酯∶乙酸10∶10∶1)。
產率720mg(1.44mmol，84.5%)。
1H NMR(300MH，DMSO-d6)δ7.87，(d，2H，J7.5Hz)，7.71(d，2H，J 7.5Hz)，7.42-7.28(m，9H)，5.00(s，2H)，4.30-4.20(m，3H)，4.10(m，1H)，3.77(m，2H)，2.58(m，2H)。13C NMR(300MHz，DMSO-d6)δ172.41，156.28，144.20，141.10，137.35，128.73，128.21，128.03，127.48，125.68，120.49，100.09，79.37，79.03，66.21，65.93，53.49，47.04，30.63，21.78。
實施例6(S)-2-氨基-3-(2-呋喃基)丙酸a)(2R，5S)-2，5-二氨-3，6-二甲氧基-2-異丙基-5-糠基吡嗪用注射器在-78℃溫度下將1.55M丁基鋰(6.45ml，10mmol)的己烷溶液加入到(2R)-2，5-二氫-3，6-二乙氧基-2-異丙基吡嗪(1.84g，10mmol)的THF(50ml)的攪拌溶液中，將溶液在-78℃溫度下攪拌1小時。慢慢地加入2-氯甲基呋喃(1.3g，11mmol)的THF(10ml)溶液，繼續攪拌一夜。在減壓條件下分離除去溶液，殘餘物溶解在乙酸乙酯(50ml)中，用磷酸鹽緩衝劑(pH7)萃取。水相用乙酸乙酯(2×20ml)萃取兩次。有機層被乾燥(MgSO4)，溶劑在減壓條件下蒸發，通過快速色譜法純化殘餘物(二乙醚/己烷15/1，矽膠)。
產率2.0g(76%)，無色粘性液體。
1H NMR(CDCl3)δ0.65(d，3H，J 6.7Hz)，1.00(d，3H，J 6.7Hz)，2.20(m，1H)，3.11(d，2H，J 5Hz)，3.62(t，1H，J 3.5Hz)，3.65(d，3H，J 0.9Hz)，3.70(d，3H，J 0.9Hz)，4.26(dd，1H，J5，J8.5Hz)，5.96(d，1H，J3.1Hz)，6.23(dd，1H，J 1.8，J 3.1Hz)，7.26(dd，1H，J 1.0，J 0.8Hz)。2.20(m，1H)，3.11(d，2H，J 5Hz)，3.62(t，1H，J3.5Hz)，13C NMR(CDCl3)δ16.54，19.07，31.43，33.03，52.33，52.41，54.95，60.48，107.10，110.24，141.28，152.27，162.53，164.10。
b)(S)-2-氨基-3-(2-呋喃基)丙酸甲酯在室溫條件下，在N2中將(2R，5S)-2，5-二氫-3，6-二甲氧基-2-異丙基-5-糠基吡嗪(2g，7.6mmol)、1M HCl(7.6ml，7.6mmol)和二噁烷(7.6ml)的混合溶液攪拌一夜。在減壓條件下分離除去二噁烷，用二乙醚(20ml)萃取水相。向水相中加入氨水，直至pH為9，用CHCl3(3×30ml)萃取、乾燥(MgSO4)，在減壓條件下分離除去溶劑。在40-50℃(0.05mbar)條件下利用球-球蒸餾分離出纈氨酸甲酯。在不進行進一步純化條件下，採用未蒸餾的標題化合物。
產率1.0g(86%)。
1H NMR(CDCl3)δ1.5(s，2H)，2.92(dd，1H，J 15，J 7.2Hz)，3.04(dd，1H，J 15，J 5Hz)，3.68(d，3H，J 0.5Hz)，3.73(dd，1H)J 7.2，J 5.1Hz)，6.06(dd，1H，J 0.7，J3.2Hz)，6.24(dd，1H，J2.9，J 2Hz)，7.28(dd，1H，J 0.7，J1.9Hz)。13C NMR(CDCl3)δ33.45，52.00，53.67，107.44，110.20，141.83，151.32，174.97。
c)(S)-2-(9-芴基甲氧羰基氨基)-3-(2-呋喃基)丙酸將(S)-2-氨基-3-(2-呋喃基)丙酸甲酯(1g，6.5mmol)與2M LiOH(3.27ml，6.5mmol)和二噁烷(3.27ml)在0℃溫度下混合，並在N2中攪拌一夜。第二天，反應混合物的TLC對照(CHCl3/MeOH/NH3為1/1/0.1)顯示出不含酯。將溶解在二噁烷(10ml)中的1M NaHCO3(9.75ml，9.75mmol)和9-芴基甲氧羰基氯(2.5g，9.75mmol)加入到上述溶液中，再繼續攪拌1小時。在減壓條件下分離除去二噁烷，用10%KHSO4溶液將水溶液酸化成pH為2。用CHCl3(3×20ml)萃取溶液，乾燥(MgSO4)、蒸發，通過快速色譜法純化(己烷/乙酸乙酯/乙酸10/10/1)。
產率1.3g(53%)，白色晶體。
1H NMR(CDCl3)δ2.95(dd，1H，J 9.9，J 15.2Hz)，3.08(dd，1H，J4.4，J15.2Hz)，3.6(br.s，1H)，4.16-4.26(m，4H)，6.12(d，1H，J2.9Hz)，6.33(t，1H，J2.3Hz)，7.29(t，2H，J7.32Hz)，7.39(t，2H，J7.48Hz)，7.49(br.s，1H)，7.64(dd，2H，J7.17，J2.14Hz)，7.85(d，2H，J7.48Hz)。13CNMR(CDCl3)δ29.8，46.98，66.04，107.45，110.85，120.48，125.57，125.63，127.50，128.07，141.06，142.21，144.09，151.84，156.26，160.35。
實施例7(S)-2-氨基-3-(3，5-二甲基-4-異噁唑基)丙酸a)(2R，5S)-2，5-二氫-3，6-二甲氧基-2-異丙基-5-(3，5-二甲基-4-異噁唑基甲基)吡嗪在-78℃溫度下用注射器將1.55M丁基鋰(10ml，15.5mmol)的二噁烷溶液加入到(2R)-2，5-二氫-3，6-二甲氧基-2-異丙基吡嗪(2.85g，15.5mmol)的THF(50ml)的攪拌溶液中，並在-78℃下攪拌溶液1小時。慢慢地加入4-氯甲基-3，5-二甲基異噁唑(2.34g，16mmol)的THF(10ml)溶液，繼續攪拌一夜。在減壓下分離除去溶劑，殘餘物溶解在乙酸乙酯(50ml)中，用磷酸緩衝劑(pH7)萃取。用乙酸乙酯(2×20ml)萃取水相兩次。有機層被乾燥(MgSO4)，在減壓下蒸發溶劑，通過快速色譜法純化殘餘物(二乙醚/己烷4/1，矽膠)。
產率3g(64%)，無色粘性液體。
1H NMR(CDCl3)δ0.60(d，3H，J 6.7Hz)，0.97(d，3H，J 6.7Hz)，2.17(s，3H)，2.26(s，3H)，2.73(dd，1H，J 5.9，J 14.6Hz)，2.86(dd，1H，J 4.4，J 14.7Hz)3.59(t，1H，J 3.4Hz)，3.63(d，3H，J 0.3Hz)，3.68(d，3H，J 0.3Hz)，4.11(m，1H)。13C NMR(CDCl3)δ10.21，11.16，16.41，18.99，26.99，31.29，52.26，52.33，55.93，60.46，109.82，160.18，162.33，164.24，166.34。
b)(S)-2-氨基-3-(3，5-二甲基-4-異噁唑基)-丙酸甲酯在室溫條件下，在N2中攪拌(2R，5S)-2，5-二氫-3，6-二甲氧基-2-異丙基-5-(3，5-二甲基-4-異噁唑基甲基)吡嗪(2g，6.8mmol)、1.0M HCl(13.6ml，13.6mmol)和二噁烷(13.6ml)的混合溶液一夜。在減壓下分離出二噁烷並用二乙醚(20ml)萃取水相。向水相中加入氨水，直至pH值為9，用CHCl3(3×30ml)萃取、乾燥(MgSO4)，並在減壓下分離除去溶劑。在40℃-50℃(0.05mbar)條件下，通過球-球蒸餾分離出纈氨酸甲酯。在不進行進一步純化的條件下，使用未蒸餾的標題化合物。
產率1.3g。
1H NMR(CDCl3)δ1.52(br.s，2H)，2.21(s，3H)，2.31(s，3H)，2.56(dd，1H，J 7.5，J 14.6Hz)，2.74(dd，1H，J 6.2，J 14.6Hz)，3.55(t，1H，J 6.7Hz)，3.69(s，3H)。13C NMR(CDCl3)δ0.18，11.06，27.94，52.06，54.45，109.45，159.63，166.31，175.18。
c)(S)-2-(9-芴基甲氧羰基氨基)-3-(3，5-二甲基-4-異噁唑基)丙酸在0℃溫度下，將(S)-2-氨基-3-(3，5-二甲基-4-異噁唑基)-丙酸甲酯(1.3g，6.6mmol)與2M LiOH(3.3ml，6.6mmol)和二噁烷(3.3ml)混合併在N2中攪拌一夜。第二天，反應混合物的TLC對照(CH3/MeOH/NH3為1/1/0.1)顯示出不含酯。將溶解在二噁烷(10ml)中的1M NaHCO3(10ml，10mmol)和9-芴基甲氧基羰基氯(2.6g，10mmol)加入到上述溶液中，再繼續攪拌1小時。在減壓條件下分離出二噁烷，用10%KHSO4溶液將水溶液酸化成pH為2。用CHCl3(3×20ml)萃取溶液、乾燥(MgSO4)、蒸發，通過快速色譜法純化(己烷/乙酸乙酯/乙酸10/10/1)。
產率1.6g(59%)，白色晶體。
1H NMR(CDCl3)δ2.10(s，3H)，2.19(s，3H)，2.65(dd，1H，J 9.46，J 14.65Hz)，2.76(dd，1H，J 5.4，J14.65)。
肽的固相合成固相肽合成實質上是根據芴基甲氧羰基(Fmoc)-聚醯胺合成方法進行的(Atherton Sheppard，Solid phase peptide Synthesisa practical approach OxfordIRL Press at Oxford University Press，1989)。使用了商業上可購買到的合成樹脂;對於批量合成，不論是人工的還是使半自動儀器(Labortec肽合成器5P 650)，它們是具有酸性不穩定(Wang，J.Am.Chem.Soc.，95，1328-1333，1973)或酸性超不穩定交聯劑(Merger等人，Tetra-hedron Letters 29，4005-4008，1988)的聚苯乙烯。另一方面，肽是通過使用LKB Biolynx 4170自動肽合成器在全自動流動樹脂模中組合而成的(Atherton等人，J.Chem.Soc.，Chem.-Commun.，1151-2，1981)。銷售的合成樹脂已經含有受保護的所需C-末端Fmoc-胺基酸殘基。通過使用二環己基碳化二亞胺(DCC)/1-羥基苯並三唑(HOBt)(Koenig Geiger，Chem.Ber.，103，2034-2040，1970)活化或者使用偶聯劑PyBOP(Coste等人，Tetrahedron Lett.，31 205-208，1990)，可獲得各種具有側鏈被保護Fmoc-胺基酸五氟苯基酯(Kisfaludy Schoen，Synthesis，325-327，1983)的鏈長。賴氨酸側鏈氨基由叔丁氧羰基官能團保護，穀氨酸和天冬氨酸的側鏈羧基被保護成叔丁基酯。
在所需序列的固相組合完成之後，利用已添加了適當化學清除劑(King等人，Int.J.Peptide Protein Res.，36，255-268，1990)的三氯乙酸，可由含附隨物質側鏈去保護的合成樹脂裂解出肽。在蒸發後，用二乙醚沉澱將肽離析出來並乾燥。由製備反相高性能液相色譜法完成純化。
表1具有一般結構Pyr-Glu-Asp-Xaa-Lys-OH的單體肽的分析數據HPLC方法b純度cFAB-MSXaaa(保留時間,分) (%) [M+H]+纈氨酸 0-30-20(17) 100 601.4正亮氨酸 0-30-20(23) 99 615.4亮氨酸 0-30-20(22) 98 615.4色氨酸 20-50-20(14) 96 688.3酪氨酸 0-30-20(13) 98賴氨酸 0-30-20(10) 100 630.4穀氨酸 0-30-20(10) 99 631.6穀氨醯胺 0-30-20(12) 100 630.3組氨酸 0-30-20(13) 99 639.4脯氨酸 0-30-20(15) 99 599.31-萘基丙氨酸 30-90-20(15) 99 699噻吩-2-基丙氨酸 0-30-20(20) 100 655.3吡啶-2-基丙氨酸 0-30-20(12) 95呋喃-2-基丙氨酸3,5-二甲基異噁唑-4-基丙氨酸環己基丙氨酸 10-40-20(23) 98 655.4烯丙基甘氨酸0-甲基絲氨酸2-氨基-6-疊氮基己酸
Glu 2.09(2) 2.01(2) 2.11(2) 2.11(2) 2.33(2)Asp 1.00(1) 1.00(1) 1.00(1) 1.00(1) 0.68(1)a在酸分解過程中，色氨酸部分地被破壞。
HOBt＝羥基苯並三唑Pfp＝五氟苯基Fmoc＝9-芴基甲氧羰基Boc＝叔丁氧基羰基DCC＝二環己基碳化二亞胺Cin＝(S)-2-氨基-5-苯基-4-(E)-戊烯-1-酸BuLi＝正丁基鋰THF＝四氫呋喃DMF＝二甲基甲醯胺pGLu-Glu-Asp-[Cin]-Lys利用Labortec肽合成器合成肽。將Fmoc-Lys(Boc)-Sasrin聚合物(1.0g，0.6mmol;Bachem A.G.;取代物0.6mmol/g)裝入-100ml反應燒瓶中。將(S)-2-(9-芴基甲氧羰基氨基)-5-苯基-4-(E)-戊烯-1-酸(578mg，1.4mmol)，DCC(290mg，1.4mmol)和HOBt(211mg，14mmol)的DMF(20ml)溶液加入到聚合物中去，反應進行9小時。然後用CH2Cl2、30%MgOH的CH2Cl2溶液及DMF(kaiser陰性試驗)清洗聚合物。
合成的剩下部分是用Fmoc-Asp(OtBu)-Opfp(0.89g，1.5mmol)、Fmoc-Glu(OtBu)-Opfp(0.90g，1.5mmol)和pGlu-五氯苯基酯(0.57g，1.5mmol)通過標準方法進行的。將HOBt(0.23mg，1.5mmol)加入到允許進行1小時的各個偶聯步驟中去。通過Kaiser陰性試驗來確定偶聯反應的完成情況。在與Fmoc-胺基酸偶聯反應之後，用DMF清洗聚合物，由20%呱啶的DMF溶液裂解保護基團，再用DMF清洗聚合物。在最後偶聯反應之後，用MeOH/CH2Cl2和CH2Cl2清洗聚合物並乾燥。通過TFA∶CHCl21∶1將肽從聚合物中裂解出來，溶液被冷凍乾燥，將殘餘物溶解在水中、過濾(0.45μ)，濾液被冷凍乾燥。為了進一步純化，將粗肽溶解在水中，在Beckman超球ODS上進行製備HPLC，A為0.1%TFA的水溶解，B為0.1%TFA的MeCN∶H2O＝40∶60溶液。在冷凍乾燥後收集到的含同質肽的餾分之後就可獲得純肽(＞95%)。
權利要求
1.一種肽化合物衍生物，該衍生物含有一種單鏈血調節肽，其中非末端胺基酸的Cα原子被基團-A取代且天然α側鏈不在所述的Cα原子的位置，其中-A為基團-CRARA′-Z，這裡的每個RA分別為氫原子或基團-RA″、-ORA″、-SRA″、-NRA″RA″、CONRA″RA″、-COORA″；RA′為氫原子或基團RA″；RA″為烷基、環烷基、烷醯基、羥烷基、anidine或碳環或雜環基團；Z為基團-ORB、-NRCRC、-CRDRERF或除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的碳環或雜環基團；其中每個RB為如烷基、芳烷基或芳基基團之類的直鏈或支鏈、飽和或不飽和烴的基團，也還可以被一個或多個RA基團取代，其中RA如上所定義，以及還可以被一個或多個-N-、-O-或-S-雜原子間斷；RC為氫原子或基團RB；RD為氫原子或基團RF；RE為氫原子或基團RF，或與基團RD一起形成
基團；以及RF為基團-RB、-ORB、-NRCRC或-SRB，或羥基、羧基、氨基羰基或烷氧基，或者為與連在Cα原子上的氮原子相接的亞甲基，或者為與RD一起形成的亞烷基，或者在RA、RA′、RD和RE中的一個基團不是氫原子的條件下，RF為氫原子。
2.根據權利要求1的肽化合物，其中Z代表除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的碳環或雜環基團。
3.根據權利要求2的肽化合物，其中-A為-CH2-Z其中Z代表除未取代的苯基之外的取代或未取代的芳族或非芳族的碳環或雜環基團。
4.根據權利要求3的肽化合物，其Z代表苯甲基、吲哚基、羥基苯基、咪唑基、萘基、噻吩基、吡啶基、呋喃基、異噁唑基、3，5-二甲基異噁唑基或環己基。
5.根據權利要求1的肽化合物，其中-A為-CH2-Z其中Z為基團-ORB(這裡的RB如權利要求1所定義)或-CHRDRF;RD表示氫原子或基團-CH3;RF代表被羥基、氨基或疊氮基取代的烷基或未取代的烷基，或者RD和RF一起形成亞烷基基團。
6.根據權利要求1-5之一的一種肽化合物，其中所述單鏈血調節肽具有結構式Ⅰ其中Ra表示
其中n和m分別為0或1;p、q和r分別為1或2;s代表3或4;R1和R2均為氫原子或合為一橋氧基;R3和R4均為氫原子或組成一碳-碳鍵;R5為氫原子或醯基;每個R6和R7分別為羥基或氨基，但羥基為優選;R8代表氫原子;C2-6烷基;C7-20芳烷基，該芳烷基可以含有一個或多個羥基、氨基或甲氧基取代基;或者易代謝的S-保護基;R9代表氫或甲基;R10代表羥基或氨基、胺基酸穀氨醯胺的殘基或含N-末端穀氨醯胺單元的肽。
7.根據權利要求6的肽化合物，其中在結構式Ⅰ的肽鏈中，n代表0。
8.根據權利要求6或7的肽化合物，其中在結構式Ⅰ的肽鏈中，m代表0。
9.根據權利要求6至8之一的一種肽化合物，其中所述基團-A與結構式Ⅰ中胺基酸Rd的Cα原子相連。
10.根據權利要求6至9之一的一種肽化合物，具有結構式Ⅱ
其中-A與權利要求1至5之一中定義的相同，Ra、Rb、Rc、Re、、Rf和n為權利要求6中所定義的。
11.根據權利要求1至10之一的一種肽化合物，具有結構式
其中-A與權利要求1至5之一中定義的相同。
12.根據權利要求1至11之一的化合物的氨基保護、羥基保護、硫羥保護和/或羧基保護衍生物。
13.一種藥物組合物，該組合物包含根據權利要求1至11之一的一種肽化合物以及藥物載體或賦形劑。
14.權利要求1至11之一的肽化合物用於抑制細胞分裂。
15.權利要求1至11之一的肽化合物用於抑制骨髓的組織生成或再生。
16.權利要求1至11之一的肽化合物的用途，該化合物用於製造抑制細胞分裂的藥物。
17.根據權利要求15的用途，該化合物用於製造抑制骨髓的組織生成或再生的藥物。
18.權利要求1至11之一的肽化合物的用途，該化合物用於抑制細胞分裂。
19.根據權利要求18的用途，該化合物用於抑制骨髓的組織生成或再生。
20.一種抑制患者體內細胞分裂的方法，所述方法包含給予患者有效劑量的權利要求1至11之一的一種化合物。
21.根據權利要求20的方法，其中骨髓組織生成細胞或者骨髓細胞的分裂被抑制。
22.生產權利要求1至11之一中的一種肽化合物的方法，該方法包括部分或完全被保護衍生物的去保護。
23.生產權利要求1至11之一中的一種肽化合物的方法，所述方法包括a)將雙內醯亞胺醚金屬取代、再烷基取代，從而生成雙內醯亞胺二肽醚;b)水解步驟(a)的雙內醯亞胺二肽醚，從而生成具有NH2-CH(A)-COOH結構的胺基酸，其中A如上文所定義;c)將其餘胺基酸引入肽鏈中;以及d)任何被保護基的去保護。
24.一種胺基酸衍生物，具有結構式
其中-A與權利要求1至5之一所定義的相同。
25.內醯亞胺二肽醚具有結構式
其中-A與權利要求1至5之一所定義的相同。
全文摘要
本發明公開了單鏈肽化合物，其中在非末端胺基酸的Cα原子位置上被權利要求1所定義的基團-A所取代。基團-A所鍵合的Cα原子上的天然α側鏈不存在。本發明的肽衍生物對抑制細胞增殖非常有用，特別對抑制骨髓組織生成和骨髓細胞有用。
文檔編號A61P7/00GK1085912SQ9310840
公開日1994年4月27日 申請日期1993年6月2日 優先權日1992年6月2日
發明者K·安德海姆 申請人:哈夫恩倫·尼卡姆德公司