生產流感疫苗組合物的方法
2023-05-29 01:56:36 5
專利名稱：生產流感疫苗組合物的方法
生產流感疫苗組合物的方法發明背景
無論從社會健康的立場還是商業立場上看，抗流感的各種病毒株和演變病 毒株的疫苗都是至關重要的，因為每年有許多個體感染不同病毒株和不同類型的流 感病毒。嬰兒、老年人、那些衛生保健不足和免疫受損的人尤其面臨因這種感染而 死亡的風險。流感感染問題因新型流感病毒株易於演變而愈加複雜，因此需要不斷 製造新型疫苗。
過去50年間生產了許多對不同流感病毒能產生特異性免疫保護應答的疫 苗，包括，例如全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和減毒活病毒疫苗。然 而，儘管任何這些疫苗類型的合適製劑能產生全身性免疫應答，但減毒活病毒疫苗 具有能刺激呼吸道局部黏膜免疫力的優點。含減毒活病毒的疫苗還具有製備快速而 經濟、易於儲存和運輸的優點，因此是十分適宜的疫苗。同樣理想的是提高這種病 毒的產量，從而提高這種病毒疫苗產量，尤其是已被證實用傳統方法難以製造和/或 大規模商業生產的病毒株的疫苗的產量的方法。
迄今為止，在美國可商業購得的所有流感疫苗是在含胚雞蛋中增殖。雖然 流感病毒株在雞蛋中生長良好，但疫苗的產量取決於這種雞蛋的可利用量。因為必 須組織這種雞蛋的供應，並在下一流感爆發季前數月選擇可用於疫苗生產的病毒株， 所以此方法的靈活性有限，並且常導致生產和銷售滯後和短缺。同時， 一些流感病 毒株在蛋中的生長不及其它流感病毒毒株(例如，不以高效價產生)。因此急需找到提 高產量，例如這種病毒所需毒株的產量以及疫苗產量的方法。
近年來也開發了在細胞培養物中製備流感疫苗的系統(參見，例如 Furminger，"疫苗生產"(Vaccine Production),刊於Nicholson等編，《流感教材》 (Textbook of Influenza),第324-332頁；Merten等，(1996)，"在用於疫苗製備的細胞 培養物中生產流感疫苗"(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation),刊於Cohen和Shafferman編，《疫苗設計和生產的新方案》(Novel Strategies in Design and Production of Vaccines),第141-151頁)。然而，這些系統也可 能遇到蛋中生產或放大的問題，並因此也可能遇到生產能力問題，尤其是涉及特定
毒株時。因此，任何提高這些系統中的病毒/疫苗產量的方法也是急需的。
本發明的發明人及其同事在生產用於疫苗製備的流感病毒方面作了大量的工作，參見，例如，PCT申請WO 03/091401、 WO 05/014862以及2005年5月20 日提交的PCT專利申請PCT/US05/017734和2005年10月4日提交的 PCT/US05/035614。本發明提供了提高用於疫苗組合物生產的流感病毒和病毒組合物 產量方法。本發明的一些方面適用於傳統的用雞蛋製備疫苗的模式和包括在雞蛋中 病毒生長步驟的新的細胞培養物疫苗產生模式(以及組合系統)，並包括許多其它益 處，這些益處通過以下描述是顯而易見的。發明概述
本發明包括生產流感病毒顆粒的方法，該方法包括將眾多含有或編碼流 感病毒基因組或部分基因組的載體(例如，質粒、病毒等，見下文)引入一個或多個宿 主蛋或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero)，並在低於33"C的溫度下孵育所述宿主 蛋或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero);並從所述宿主蛋或其它宿主細胞(例如， MDCK和Vero)回收所述流感病毒顆粒。本發明還包括提高流感病毒顆粒產量的方法，所述方法包括在低於33x:的溫度(例如，3rc)下孵育所述宿主細胞(例如，MDCK或Vero細胞的連續細胞培養物)或含胚蛋中的所述病毒顆粒。在某些實施方案中，在 低於33 'C的溫度下生產的病毒顆粒的log1Q TCID5/mL滴度大於在33°C生產的相同病 毒顆粒的滴度。在其它實施方案中，本發明的方法包括將流感病毒(例如，重配病毒) 引入一個或多個能夠支持流感病毒複製的含胚蛋，從而感染所述含胚蛋。再在其它 實施方案中，本發明的方法包括將流感病毒(例如，重配病毒)引入能夠支持流感病毒 複製的宿主細胞(例如，MDCK和Vero)從而感染所述宿主細胞。所產生的病毒可以 是乙型流感病毒株的病毒、減毒的流感病毒、冷適應流感病毒、溫敏流感病毒、減 毒的冷適應溫敏流感病毒或其任意組合。 一些實施方案中，所述病毒包含PR8骨架， 而在其它實施方案中，所述病毒包含Ann Arbor B株流感病毒骨架、 B/Leningrad/14/17/55骨架、B/14/5/l、 B/USSR/60/69骨架、B/Leningrad/179/86骨架、 B/Leningrad/14/55骨架或B/England/2608/76骨架。 一些實施方案中，所述病毒是ca B/Jilin/20/03。某些實施方案中，所述蛋是SPF雞蛋。 一些實施方案中，所述宿主細 胞是MDCK細胞。同時，某些實施方案中，在低於33。C孵育包括在29-33t:之間、 或在31-33'C之間、或在31-32"C之間、或在3rC孵育所述蛋或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero)。
本發明的其它方面包括通過上述方法生產的流感病毒以及含有這種病毒 的組合物和含有這種病毒的流感疫苗(例如，液態的減毒鼻內活疫苗)。這種可通過本 發明生產的病毒可任選包括，例如，CAIV(冷適應流感病毒，例如，在三價製劑中)、 諸如PCT公開WO 05/014862中描述的那些病毒、諸如在例如PCT公開WO 01/183794、 WO 00/60050、 USPN 6,544,785及USPN 6,649,372中描述的那些病毒、 以及其它類似的或有關的病毒和病毒類型。
通過閱讀下面的詳細描述並結合附圖和權利要求就可以更全面地理解本 發明的這些目的和特徵以及其他目的和特徵。
圖1展示的表顯示了作為二次(secondary)孵育溫度函數的caB毒株的病毒 產量(TCID5o/mL)。
圖2顯示了作為二次孵育溫度函數的caB毒株的產量(TCID5o/mL)的圖。
圖3展示的表顯示了作為二次孵育溫度函數的caB/Jilin/20/03的病毒產量 (TCID50/mL)。
圖4展示的表顯示了當在29-33'C之間的溫度下孵育的蛋中生長時，表達 特徵性^和to表型的各種ca乙型流感病毒株的表型。
圖5展示的表顯示了在不同溫度下孵育並在感染72小時後收穫的感染的 蛋尿囊液的HA滴度。
圖6展示的表顯示了在不同溫度下孵育的感染的蛋尿囊液的HA病毒 RNA量。
圖7展示的表顯示了通過將拷貝數減去感染性顆粒數量(logK) TCIDso)測定 的基因組拷貝與感染性病毒的比例。
圖8展示的表顯示了當在31'C和33'C生長時ca B/Jilin/20/03和ca B/Ann Arbor/1/94感染性顆粒的百分數。
圖9展示的表顯示了在33。C生長的ca B/Jilin/20/03(1批)和在31。C生長的 ca B/Jilin/20/03(2批)的核酸序列與相應的MVS的比較。
圖10展示的表將在兩個溫度下生長的病毒對用wt B/Jilin/20/03生產的抗 血清的HAI滴度進行了比較。
圖11展示的圖顯示了用生長於31°C或33 °C的cfl B/Jilin/20/03病毒鼻內接 種後病毒在雪貂中的複製。
圖12展示的表比較了用生長於31°〇或33°(3的ca B/Jilin/20/03免疫雪貂 14天後血清的HAI滴度。
圖13展示的圖顯示了不同二次孵育溫度下在31°〇和33r生長的ca B/Jilin/20/03在SPF蛋中的二次傳代。發明詳述
本發明包括提高病毒產量的方法，更具體說是提高適合生產疫苗(包括但 不限於？111^ 51@)的冷適應乙型流感病毒株產量的方法。所包括的方法是，例如，在 接種後在蛋(例如，在蛋中二次孵育)或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero)中孵育過 程中使病毒株在較低溫度下生長。其它特徵如文中更詳細的描述。
精通本領域的技術人員應該了解，這裡的典型實施方案也包括本領域已知 的步驟/方法/組合物，例如對蛋的透光檢驗、用病毒接種蛋等。因此，精通本領域 的技術人員能夠確定這種已知的生產合適的病毒、病毒溶液、組合物的步驟的適當 條件、子步驟、步驟細節等等。下面將更加詳細地描述各個步驟。
精通本領域的技術人員還應了解，這裡所述的製造病毒/疫苗的各個步驟 在相同的製造過程中不要求都要被執行或存在。因此，儘管在一些實施方案中執行 或存在這裡描述或提到的所有的步驟和/或組合物，在其它實施方案中， 一個或多個 步驟可任選地例如被省略、改變(範圍、順序、位置等)等等。生產冷適應乙型流感病毒株
當按照目前認可的製造條件在33'C二次孵育生長時，在疫苗劑型中使用 的某些冷適應(c力乙型流感病毒株，如B/Jilin/20/03毒株的總產量有時不足以提供所 需數量流感疫苗劑量的足夠產量。本發明包括在低於33'C的溫度下，如3TC(或任選 約29-32。C之間的任何溫度)而非33。C孵育蛋或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero) 的方法，該方法提高了這種毒株的產量並因此能夠提高用來製造疫苗的病毒的產量。 這種蛋或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero)的孵育在這裡可任選描述成"二次" 孵育，以區別於在37'C時進行的對蛋的一次孵育， 一次孵育用來使蛋或宿主細胞的 胚胎在較高溫度下發育以在感染前增殖細胞。這裡的實施例比較了在3rC和33'C生
長的B/Jilin/20/03毒株和其它cfl乙型流感病毒株的特徵，並顯示，在3TC生長的病 毒與在33'C生長的病毒共有不能區別的生物學特徵。
這裡的實施例中的數據證明，在低於33'C的溫度下(例如3KC)ca B/Jilin/20/03的更高產量不是B/Jilin/20/03毒株特有的。測試的所有其它ca乙型流感 病毒株在低於33r的溫度下都更加有效地複製，其中包括在疫苗的中試中已顯示出 可證明的功效的caB/Ann Arbor/1/94。此外，這裡的實施例顯示了從在31。C和33°C 生長的病毒得到的ca B/Jilin/20/03疫苗的詳細特徵，這些特徵強調，兩種疫苗在所 檢測的特徵上相互是相同的。實際上，在低於33'C，例如3rC生長的ca乙型病毒 疫苗毒株的物理和生物特徵與已經用於人類或在人類中測試的在33'C生長的其它a7 乙型流感病毒株的物理和生物特徵相同。見下文。
這裡的實施例中描述的可比性結果和特徵顯示，當在低於33'C的溫度下 (最佳溫度通常為29-32。C)生長時，ca B/Jilin/20/03和7種其它ca乙型流感病毒株在 蛋中的生長曲線都產生較高病毒滴度。同時，在較低溫度生長不會不利地改變疫苗 的標誌性生物性狀。因此，無論最初在29'C、 31'C或33'C生長，包括caB/Jilin/20/03在內的不同Cfl乙型流感疫苗毒株都表達特徵性Cfl和溫敏O)表型。此外，包括CflB/Jilin/20/03在內的不同毒株中總顆粒與感染性顆粒的整體比例在3TC和33'C之間 是相等的。總顆粒的量通過用定量RT-PCR測定基因組拷貝數檢測。此外，還通過透 射電子顯微術測量了 ca B/Jilin/20/03的總顆粒。這裡的實施例還顯示，通過測序， 在3rC或33。C生長的B/Jilin/20/03的基因組相互相同，並與主病毒種子(MVS)相 同，且血凝抑制試驗(HAI)顯示，在3rC或33'C生長的caB/Jilin/20/03的抗原性基本 上相同。這裡的實施例還證明，就時間和最佳溫度而言，在31'C或33'C生長的ca B/Jilin/20/03在蛋中的複製相等，且在31。C或33。C生長的ca B/Jilin/20/03在雪貂鼻咽 中的複製也相等。這裡的實施例還顯示，無論在3TC或33'C生長，ca B/Jilin/20/03 的免疫原性相等。例如，用這兩種製品免疫兩組雪貂並在免疫14天後測定動物的 HAI滴度。這兩組動物的平均血清HA1滴度相等。
這種組合的數據證明，無論在低於33t:(如3rC)或在33。C生長病毒，ca B/Jilin/20/03的生物特徵是可比的。所述疫苗毒株具有相同的生物物理學特徵(例如， 抗原性、總顆粒與感染性顆粒之比以及序列)及體外和體內生物學性質。此外，ca B/Jilin/20/03在低於33'C的溫度下(例如，3rC)生長得更好，這對於其它ca乙型流感 病毒株也適用。因此，本發明包括在低於33。C的溫度下(例如，3FC)生長這種病毒
株，例如ca B/Jilin/20/03毒株，或其它ca乙型流感病毒株，以用於製造FluMist 等 疫苗。
因此，某些實施方案中，本發明包括一種生產流感病毒顆粒的方法，該方 法包括將至少一種含有流感病毒基因組或部分基因組(例如，含有l、 2、 3、 4、 5、 6 或7個(即少於所有vRNA區段數)vRNA區段)的載體(例如，B株流感病毒如6:2重 配病毒，其中可任選含有PR8、 Ann Arbor B株流感病毒、B/Leningrad/14/17/55、 B/14/5/l、 B/USSR/60/69、 B/Leningrad/179/86、 B/Leningrad/14/55、 B/England/2608/76 或B/Jilin/20/03，或者一個或多個質粒)引入至少一個能夠支持流感病毒複製的宿 主蛋或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero);在低於33'C的溫度下孵育所述宿主蛋 或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero);和從所述宿主蛋或其它宿主細胞(例如， MDCK和Vero)回收所述流感病毒顆粒。在其它實施方案中，本發明提供了提高流感病毒顆粒產量的方法，所述方法包括在低於33T:的溫度下(例如，3rc)孵育所述病毒顆粒。在一具體實施方案中，本發明包括一種提高流感病毒顆粒產量的方法，該 方法包括將至少一種含有流感病毒基因組或部分基因組的載體引入至少一個宿主蛋 或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero);在低於33'C的溫度下孵育所述宿主蛋或其 它宿主細胞；其中，在低於33'C的溫度下生產的流感病毒顆粒的產量大於在33'C生 產的相同病毒顆粒的產量。在某些實施方案中，在低於33。C的溫度下生產的病毒顆 粒的logu)TCID5o/mL滴度大於在33t;製造的相同病毒顆粒的效價。某些實施方案中， 在低於33'C的溫度下製造的病毒的log1TaD5o/mL滴度為至少約7.0、或至少約7.2、 或至少約7.4、或至少約7.6、或至少約7.8、或至少約8.0、或至少約8.2、或至少約 8.4、或至少約8.6、或至少約8.8、或至少約9.0、或至少約9.2、或至少約9.4、或至 少約9.6、或至少約9.8。在其它實施方案中，本發明的方法包括將流感病毒(例如， 重配病毒)引入一個或多個能夠支持流感病毒複製的含胚蛋從而感染所述含胚蛋。再 在其它實施方案中，本發明的方法包括將流感病毒(例如，重配病毒)引入能夠支持流 感病毒複製的宿主細胞(例如，MDCK和Vero)從而感染所述宿主細胞。所述病毒可 任選包括減毒的流感病毒、冷適應流感病毒、溫敏流感病毒、減毒的冷適應溫敏 流感病毒或其任意組合。還考慮過所述病毒是6:2重配病毒。在一個實施方案中，所 述病毒是6:2重配的B毒株流感病毒。可用於本發明方法的B毒株流感病毒包括但 不限於PR8、 AnnArborB株流感病毒(例如，B/Ann Arbor/1/94、 B/Ann Arbor/1/66)、 B/Leningrad/14/17/55 、B/14/5/1 、B/USSR/60/69 、B/Leningrad/179/86 、 B/Leningrad/14/55、 B/England/2608〃6或ca B/Jilin/20/03。另一實施方案中，所述病 毒含有Ann Arbor B株流感病毒或選自下組的乙型病毒的至少一個區段 B/Leningrad/14/17/55 、B/14/5/1 、B/USSR/60/69 、B/Leningrad/179/86 、 B/Leningrad/14/55、 B/England/2608/76和ca B/Jilin/20/03 。
在某些方面，所述宿主蛋是SPF含胚雞蛋。在某些其它方面，所述宿主 細胞是動物細胞。用於生產流感病毒的動物細胞是本領域已知的，其中包括但不限 於MDCK細胞(參見，例如，美國專利4,500,413和6,455,298)、 Vero細胞(參見， 例如，6,146,873)和PerC6細胞(參見，例如，PCT公開WO 01/38362和WO 02/40665)。 一個實施方案中，所述宿主細胞是MDCK細胞。同時，在某些方面，所述孵育在約 29-33'C之間、約31-33'C之間、或約31-32'C之間、或在3TC發生。在其它方面，所 述孵育在29-33。C之間、或31-33。C之間、或31-32。C之間、或在31。C發生。本發明 還包括用這裡所述方法生產的流感病毒以及含有這種病毒的組合物與疫苗(例如，液 態的減毒鼻內活疫苗，如FluMist)。
在具體的方面，這裡所述方法包括的實施方案中，從在低於33'C孵育的 蛋或其它宿主細胞(例如，MDCK和Vero)得到的滴度(logio TCIDso/mL)大於或等於在 33'C或更高溫度孵育相同病毒顆粒(g卩，相同的病毒類型/毒株等)得到的滴度。這種比較可任選在3rc孵育和33'c孵育之間進行。在各種實施方案中，在3rc孵育得到的logK) TCIDs/mL滴度比在33。C孵育得到的log1 TCIDs/mL滴度高至少約1.01-1.10 倍、高至少約1.025-1.05、或高至少約1.03-1.04倍。在其它實施方案中，在31。C孵 育得到的log,o TCID50/mL滴度比在33r孵育得到的log1 TCID5/mL滴度高至少 1.01-1.10倍、高至少1.025-1.05倍、或高至少1.03-1.04倍。
再在其它方面，這裡所述方法包括的實施方案中，當在低於33t:(例如， 3rC)或在33'C或以上(例如，在33t:)孵育病毒時，病毒顆粒的c^和/或G表型實質 上是類似的。同時，在具體方面中，這裡所述方法包括的實施方案中，在低於33'C(例 如，3rC)孵育得到的病毒顆粒的病毒產量大於或等於在33'C(例如，在33'C)或更高 溫度孵育的相同病毒顆粒的病毒產量。在這些方面，病毒產量可任選通過採用測量 用33°C以下孵育的病毒顆粒感染的宿主蛋尿囊液中感染性病毒體的半數組織培養物 感染劑量(TCID5o)試驗和測量用33'C或以上孵育的病毒顆粒感染的宿主蛋尿囊液中 感染性病毒體的半數組織培養物感染劑量(TCIDM))試驗來量化。或者，病毒產量可任 選通過採用被33°C以下孵育的病毒顆粒感染的宿主蛋尿囊液的血凝滴度和被33'C或 以上孵育的病毒顆粒感染的宿主蛋尿囊液的血凝滴度來量化。病毒產量還可任選通過比較被33"C以下孵育的病毒顆粒感染的宿主蛋尿囊液中病毒RNA的量和被33°C 或以上孵育的病毒顆粒感染的宿主蛋尿囊液中病毒RNA的量來量化。病毒產量還可 任選通過比較被33。C以下孵育的病毒顆粒感染的宿主蛋尿囊液中感染性顆粒的百分 比和被33'C或以上孵育的病毒顆粒感染的宿主蛋尿囊液中感染性顆粒的百分比來量 化。病毒產量可任選通過採用測量被33'C以下孵育的病毒顆粒感染的宿主細胞上清 液尿囊液中感染性病毒體的半數組織培養物感染劑量(TCID^試驗和測量被33'C或 以上孵育的病毒顆粒感染的宿主細胞上清液中感染性病毒體的半數組織培養物感染 劑量(TCID5o)試驗來量化。或者，病毒產量可任選通過採用被33'C以下孵育的病毒顆 粒感染的宿主細胞上清液的血凝滴度和被33。C或以上孵育的病毒顆粒感染的宿主細 胞上清液的血凝滴度來量化。病毒產量還可任選通過比較被33r以下孵育的病毒顆 粒感染的宿主細胞上清液中病毒RNA的量和被33'C或以上孵育的病毒顆粒感染的 宿主細胞上清液中病毒RNA的量來量化。病毒產量還可任選通過比較被33'C以下孵 育的病毒顆粒感染的宿主細胞上清液中感染性顆粒的百分比和被33'C或以上孵育的 病毒顆粒感染的宿主細胞上清液中感染性顆粒的百分比來量化。
在某些其它方面，本發明的方法包括，在33'C以下孵育的感染性病毒顆 粒的核酸序列與在33'C或以上孵育的感染性病毒顆粒的核酸序列相同。在某些其它 方面，本發明的方法包括，在33'C以下孵育的病毒顆粒的抗原性與在33'C或以上孵 育的相同病毒顆粒(即，相同的病毒類型等)的抗原性充分相同。這種抗原性可任選通 過HAI試驗測量。在某些其它方面，本發明的方法包括，病毒顆粒在對象(例如，雪 貂、人、非人靈長類、哺乳動物)中激發的免疫應答與通過在33'C或以上孵育產生的 相同類型病毒顆粒在相同對象(或對象類型)中激發的免疫應答實質上相同或類似。實施例在3TC和33'C生長的B/JILIN/20/03和其它乙型病毒的定性/比較 cflB/Jilin/20/03和其它ca乙型流感病毒株的生長曲線
從該實施例可見，在30-32"C孵育無特異性病原體(SPF)的含胚雞蛋後，ca 乙型流感病毒株的最佳產量最高。用各種不同ca乙型流感病毒株以約2.1 1ogK)TCIDso/蛋接種SPF含胚蛋，並在28-35。C之間的不同溫度下孵育60-72小時。孵 育後收穫被感染的蛋的尿囊液並測定滴度。如圖1中的表和圖2中的圖所示，最佳 孵育溫度低於33°C，且通常為31-32°C。可以看出，所有測試毒株有類似的溫度曲線， 其中包括對wt乙型流感有顯著臨床功效的cflB/AnnArbor/l/94(參見，例如，Bdshe 等，屍M. 7 纖凡Soc.5， 2001， 356:1947-1951，和Belshe等，屍e&aWoy， 2001， 108:24+)和對於最近的流感季特別重要的毒株caB/Jilin/20/03。見圖2和3。
通過對經各毒株的數據點的最佳適配多項式曲線(best-fit polynomial line) 的插值處理確定了各毒株的最佳孵育溫度。在不同溫度孵育7種ca乙型流感病毒株， 其中包括Yamagata系(B/Ann Arbor/1/94、 B/Victoria/504/2000和B/Johannesburg/5/99) 和Victoria系(B/Yamanashi/166/98， B/Brisbane/32/2002和B/Beijing/243/97)的代表毒 株，並在感染60-72小時後收穫。最佳溫度為低於33'C，且通常為31-32"C。見圖2。 圖3顯示了 ca B/Jilin/20/03溫度曲線的3次獨立重複結果。由圖可見，B/Jilin/20/03的最佳孵育溫度約為3rc。冷適應(^)和溫敏Oy)表型試驗一25t:、33'C和37'C下對原代雞腎細胞的病毒滴度
已知在29-33。C之間在SPF含胚蛋中生長的冷適應乙型流感病毒株表達特 徵性Cfl和&表型。為證實孵育條件應對所得疫苗的生物學特徵沒有影響，評價在不 同溫度生長的材料是否具有特徵性M和&表型。所有毒株具有這些特徵性性狀，因 此說明蛋的孵育溫度應對疫苗毒株沒有影響。見圖4。通過血凝(HA)滴度、病毒RNA的量和感染性顆粒的百分比測量病毒產量
病毒產量的其它測量結果與感染性病毒的產量一致。測定在不同溫度收穫 的病毒樣品的HA活性並通過定量反轉錄PCR(QRT-PCR)量化病毒RNA的量。圖5 和6所示的結果與TCIDso結果一致。在曾在3rC孵育的蛋中觀察到最高HA活性和 vRNA量。
圖6提供了在不同溫度孵育並在感染72小時後收穫的感染的蛋的尿囊液 中HA基因區段病毒RNA的量。
在這裡的實施例中還評價了通過基因組拷貝數或透射電子顯微術(TEM) 測得的總顆粒與感染性顆粒的比率。拷貝數與TCIDso的比率(圖7)顯示，在31'C或 33'C孵育的樣品之間，基因拷貝數與TCID5o有恆定比率。
在該實施例中，TEM被用來評價所選擇樣品的病毒顆粒與TCID5o之比。 與基因組:TCID5o之比類似，該分析證實，在3rC生長的B/Jilin/20/03總顆粒的約3.3% 具有感染性。見圖8。在3rC生長的B/Jilin/20/03的感染性顆粒的百分比與在33°C 所獲得的值具有可比性，並類似於對在3TC或33'C生長的B/AnnArbor/01/94所獲得 的值。這些比值也在之前報導的其它c"乙型流感疫苗毒株的那些值的範圍之內。
在3rC或33'C生長的B/Jilin/20/03病毒的基因組序列分析
如這裡的實施例所述，從在3廠C和33t:生長的病毒中提取病毒 RNA(vRNA)並測序。在不同溫度生長的這些病毒的基因組序列相互之間相同，並與 MVS相同。見圖9。在3rC或33。C生長的a B/Jilin/20/03通過HAI所顯示的抗原性
對所述實施例中的病毒進行檢測以確定它們的抗原性特徵是否具有可比 性。相對參照B/Jilin/20/03抗血清對在31'C和33'C生長的ca B/Jilin/20/03的HAI滴 度進行了評價。其相互之間的HAI滴度相差2倍之內，說明它們的抗原性是相同的。 見圖10。在3rC或33'C生長的病毒的體內特徵
為評價在這兩種溫度下生長的疫苗的性能，用7.0 1ogn)TCID5o的在31°C 或33'C生長的病毒鼻內接種每組5隻雪貂(血清陰性)。通過測量免疫後不同時間點 鼻洗液標本中的病毒滴度確定疫苗在這些動物鼻咽內的複製。兩組之間的疫苗的病 毒複製量和持續時間都相同。見圖ll。此外，免疫14天後採集動物血液並通過HAI 確定血清中針對wtB/Jilin/20/03的抗體滴度。這兩組動物間對免疫的抗體應答相同， 因此證明在3rC或33t:生長的疫苗有相同的免疫原性。見圖11。
為證明m B/JUin/20/03在3rC生長對其在類似於人鼻咽的溫度下的生長 能力沒有影響，將在3FC和33'C生長的疫苗接種到SPF蛋中並在30-33'C之間孵育。如圖13所示，兩種疫苗以相同的溫度曲線複製並在約3rc時產生最高滴度(預計該溫度是人上呼吸道的溫度)。
這裡的實施例中的數據證明，在3rC或33。C生長的ca B/Jilin/20/03的生 物學和生物物理學特徵是可比的。在這兩種溫度下生長的疫苗毒株有相同的生物物 理學特徵(抗原性、總顆粒與感染性顆粒之比以及序列)和相同的體外和體內生物學特 性，其中包括c"和"表型的表達、在動物中的複製和免疫原性、以及不同溫度下在蛋中的複製。然而，與33。C生長的病毒不同，在3rc生長的病毒顯示出更高的病毒 產量。此外，這裡也顯示c。B/Jilin/20/03在3rC生長得較好，對於測試的其它ca乙 型流感病毒株也是如此。因此，這裡的實施例支持了本發明的權利要求，在低於33 'C的溫度下，例如3rC(或者約29-約32t:之間的任意溫度)，而非33'C，在蛋或其 它宿主細胞(例如，MDCK和Vero)中生長ca B/Jilin/20/03毒株(及其它ra乙型流感病 毒株)，例如，以用於製造諸如FluMist⑧的疫苗或其它疫苗。
實施例材料和方法 表型測定一ca和G
在從3天大的雞製備的原代雞腎(PCK)細胞上進行表型測定。測定樣品的 ca及"表型。簡言之，用無血清培養基(PAM)洗滌PCK細胞並用於滴定樣品。用適 量病毒接種經過洗滌的細胞層並在所示溫度下孵育。然後檢測細胞層以了解由於病 毒複製導致細胞死亡而造成的對細胞的細胞病變效應。表型表示為33t:和25 'C之間的TCIDso平均滴度差異為2 log或更少；和to - 37'C或39'C與33'C之間的 TCID5o平均滴度差異為2 log或更多。在25X:、 33'C和37°C—式兩份檢測樣品。將 平板孵育6天(&表型)或10天(c。表型)並在孵育結束時讀取CPE讀數。該實施例中 報導的滴度為平均TCID50/mL±SD。HA和HAI試驗
用在PBS中製備的0.5%的雞RBC進行血凝(HA)試驗。以50(iL的體積在 96孔板中將樣品連續對倍稀釋。在連續稀釋的樣品中加入50liL0.5n/。的雞RBC並混 合，孵育平板至少30分鐘，然後讀取HA活性。各樣品一式兩份測試，報導的HA 滴度為兩份的平均值。
在HAI試驗中，對血清樣品進行處理並以25 )nL的體積從1:4稀釋開始連 續對倍稀釋。加入25微升病毒(相當於4HA單位)並混合，將樣品在室溫下孵育半小 時。在孵育結束時加入50^iL0.5y。的雞RBC並混合，將平板孵育至少30分鐘，然後 讀取HAI活性。在雪貂中的複製和免疫原性
獲得雪貂(7周齡)並在受控裝置中檢疫2周。通過用IxSPG將流感病毒原 液稀釋成最終劑量為7.05 log1 TCIDso新鮮製備一定體積的足以給予5隻雪貂每隻 lmL的接種物。
採集動物血液以獲得免疫前血清樣品，然後用lmL(每個鼻孔0.5ml)已經 在3rC或33。C生長的caB/Jilin/20/03鼻內免疫。接種之後，在免疫後8-168小時內 以規定的間隔用lmL無菌的磷酸緩衝鹽水洗滌鼻道從而收集各雪貂的鼻樣品。回收 的鼻洗液樣品被立即冷凍並儲存於-8(TC直到用於病毒滴定。在第0、 14、 21和28 天收集血清以確定HAI應答。
為測量鼻洗液樣品中病毒的滴度，將MDCK細胞接種到96孔平底組織培
養平板並在37匸和5。/。C02下生長至100%融合。在測定鼻洗液樣品之前才除去各孔中的細胞生長培養基，細胞用不含TPCK-胰蛋白酶的不完全病毒生長培養基(VGM) 洗滌2次，然後用完全VGM(0.18mL)洗滌，在每孔中加入TPCK-胰蛋白酶。同時將 鼻洗液樣品解凍並用完全VGM連續稀釋。然後將試樣量(0.02 mL)的稀釋病毒或僅培 養基(陰性對照)加到三復板的8個孔中。平板在33。C和5。/。C02下放置6天，然後通 過顯微鏡對每孔中病毒的細胞病變效應(CPE)的存在情況評分。用Karber法將每板中 CPE-陽性孔的數目轉化為半數感染劑量(TCID5o/mL)的值。 在蛋中複製
為生產含有不同07B毒株病毒的尿囊液，收到後將無特異性病原體(SPF) 的蛋在14士2。C儲存7天以下，並在37.5士rC和70±10%相對溼度下孵育264±12小時。 孵育之後將蛋取出進行透光檢驗，用約2.1 1og,。TCLDso/蛋的病毒接種可接受的蛋並 在28-35'C孵育48、 60、 72或84小時。然後對蛋進行透光檢驗並在5±3匸冷卻12-24 小時，然後收穫。通過噴灑70。/。v/v乙醇對蛋表面進行衛生處理，轉移到生物安全室 (BSC)並空氣乾燥。用蛋穿孔器刺穿蛋的頂部以準備對BSC中的蛋進行收穫。用無 菌不鏽鋼刮剷除去穿孔的蛋殼，隨後用10 mL移液管收穫尿囊液。收集在各收穫時 間點收穫的尿囊液，並將樣品分成試樣量並在滴定前於-6(TC或-6(rC以下保存。TCID!試驗
TCID5o試驗按照以下方法進行。當然應該知道也可採用其它類似的試驗。 該試驗採用培養了 4天並100%融合的MadinDarby狗腎(MDCK)細胞的96孔平板。 使用SkatronTM細胞清洗器用病毒生長培養基(VGM)將細胞培養平板洗滌2次。在各 平板的每孔中加入180 pl含胰蛋白酶的完全VGM並將平板置於33t:和5MC02下直 到接種。同時將測試病毒和對照病毒樣品解凍，並在96孔預稀釋塊(block)中用含胰 蛋白酶的VGM預稀釋。用SerialMate移液站(pipetting station)將樣品連續10倍稀釋 至10'3到10'4。然後將病毒樣品從預稀釋塊轉移到新鮮製備的稀釋塊的含VGM(含胰 蛋白酶)的第1列和第12列中。用SerialMate移液站將樣品進一步連續稀釋至l(T5 到IO'1、從培養箱中取出含VGM(含胰蛋白酶)的MDCK細胞培養平板並通過 SerialMate移液站用稀釋的病毒樣品接種。將平板在33'C和5% C02下放置6天。在 組織培養平板中加入甲基噻唑四唑鹽(MTT)染料以檢測細胞病變效應(CPE)。然後用 分光光度計閱讀平板以確定組織培養平板中CPE斑的數目。基於CPE斑的總數計算 祥品的TCIDm)滴度。
序列分析
通過測序分析三種病毒材料。使兩種病毒擴展物(expansion)， Z0015 PD 04-04-16， DQNB 773和ZOO 15 PD 04-04-16， DQNB 773，分別在33。C和31。C生長。 本研究還包括生長於3rC的製造商批號為600054C的材料。使用批號為0141900073 的B/Jilin/20/03 MVS作為參比。
為進行測序，用QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen， Venlo，荷蘭)分離 病毒RNA，並作為模板通過RT-PCR擴增cDNA。按照製造商的說明，用一組特異 性序列引物和各擴增的cDNA模板通過ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)進行湖tl序。用 ABI Genetic Analyzer 3730 (Applied Biosystems, Foster City， CA)通過毛細管電泳純 化並分析序列延伸產物。用DNA序列分析儀(Applied Biosystems)和測序儀(Gene Codes Corp.)分析測序結果。用O RT-PCR確定基因組拷貝數
為確定基因組拷貝數，用Qiagen QIAamp Viral RNA迷你試劑盒一式兩份 或一式三份提取RNA。用High Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA)—式兩份反轉錄RNA。在ABI Prism 7700 S叫uence Detection System(AppIied Biosystems)上採用TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems)用乙型流感病毒 HA基因的特異性引物和探針通過Q-PCR逐個分析cDNA。用Sequence Detection Software, Version 1.9 (Applied Biosystems)分析結果並在Microsoft Excel中將值轉化 成每毫升的拷貝數。
用連續稀釋含B/YamanashiHA基因的質粒產生的標準曲線確定病毒RNA 的量。將質粒從10皮克(pg)稀釋到1法克(fg)每次反應。將每次反應HARNA的法 克數乘以4,000,000(提取前時以1:10稀釋病毒，RT步驟中以1:10稀釋RNA，分析 的5pL cDNA中每法克HA質粒大約含有200個病毒RNA分子)，從而將每次反應的 量轉化成每毫升的病毒數。這些計算假設所有步驟的效率為100%且不存在額外的病 毒RNA。用透射電子顯微術進行總顆粒計數
通過透射電子顯微術確定總顆粒數由Advanced Biotechnologies, Inc.(Columbia， MD)進行。渦漩攪拌每份製品並充分重懸。在各個微離心試管中將 18微升各樣品與等體積的含有乳膠球的標準溶液混合(直徑110 nM的乳膠球；每毫
升1.5X1W個顆粒；Structure Probe Inc.， West Chester, PA)。在各個微離心試管中 用超純水按l:10稀釋病毒顆粒/乳膠球混合物，渦漩振蕩並充分重懸。為準備網格， 緊緊夾住塗有聚乙烯醇縮甲醛和碳的300目銅網並用鑷子固定。各網格用0.01%牛血 清白蛋白衝洗，用濾紙吸乾過量溶液。用超純水以1:3到1:15的不同稀釋度稀釋各 樣品。將2.5微升試樣量的各稀釋樣品置於單獨的網格上並空氣乾燥約5分鐘。5分 鍾後用濾紙吸乾網格上的任何過量材料。各網格完全空氣乾燥後將樣品固定，在各 網格上加上20微升2.0%的磷鎢酸水溶液並孵育30秒鐘以將樣品染色。用濾紙除去 任何過量的染色劑。用Hitachi HU-12A電子透射顯微鏡檢測各樣品的強度並計數總 的病毒顆粒。疫苗製備中通用步驟的描述
為便於討論和描述， 一般認為疫苗組合物生產的各步驟包括或屬於四個大 組。第一組包括諸如共感染、重配、重配體選擇和重配體克隆等方面。第二組包括 諸如重配體的純化和擴展等方面。第三組包括在蛋或其它宿主細胞(例如，MDCK和 Vero)中進一步擴展重配體、以及收集和純化這種收集的病毒溶液。第四組包括所收 集病毒溶液的穩定化，以及病毒溶液的效力/無菌性試驗。然而，應該知道將本發明 各方面分為上述四個通用類別只是出於說明/組織目的，而不能作出這些步驟相互依 賴等等的推論。也應該知道使用本發明的方法可以任選使用其它步驟(相似和不同的)(例如，如在3rc二次蛋孵育的孵育方法)。
如上所述，為便於討論和描述，可認為疫苗生產中各步驟包括四個大組。 第一組包括諸如共感染、重配、重配體選擇和重配體克隆等方面。 組1
在本文概括歸類為屬於組1的疫苗組合物生產的各方面包括與以下有關 的方法和組合物細胞系共感染的優化，例如用一種主供體病毒(master donor virus) 和一種或多種野生型病毒共感染以特異性產生所需的重配病毒；選擇合適的重配病 毒；克隆所選擇的重配病毒。流感病毒毒株的重配是精通本領域的技術人員所熟知 的。在細胞培養中和蛋中已使用甲型流感病毒和乙型流感病毒的重配以產生重配的 病毒毒株。參見，例如Tannock等，(f象^M/Le"/"gro^7^//7/57錄伴瘋毒橫遊減毒 冷適應遊伊教緣i毒重^W激吝/膽^F鑑定JY屍甲ra"o"朋d c/z匿欣^"o" o/必朋r ， Vaccine， (2002)， 20: 2082-2090。利用質粒構建物也顯示了流感病毒 毒株的重配。參見，例如，上述PCT公開WO 03/091401。
簡言之，重配通常包括混合(例如，在蛋或細胞培養物中)不同病毒的基因 區段。例如，乙型流感病毒毒株的典型8個區段可以在例如含有感興趣表位的野生 型病毒株和"供體"病毒株(如包含冷適應的病毒株)之間混合。除了其他結果，這兩 種病毒類型間重配可以產生含有野生型病毒株表位的一個區段和冷適應病毒株的其 他區段的病毒。不幸的是，為產生所需重配體，有時需要進行大量重配。重配後也 可以選擇病毒(例如，以發現所需重配體)。然後可克隆所需的重配體(例如，擴展其 數量)。
—般通過將病毒毒株共感染入細胞培養物(例如，CEK細胞)，然後用合適 的抗體(例如針對親代病毒之一成分的抗體)選擇(通常在蛋中進行)，克隆或擴展病毒 等(通常在細胞培養物中進行)進行乙型流感病毒所需重配體的常規優化、選擇和克 隆。然而，這種常規重配的缺陷在於需要數千次重配來產生所需的區段混合。當進 行這種重配時，真正的隨機重配(truly random reassortment)明顯不是最終結果。換言 之，該系統中存在導致該過程偏向的壓力。然而對於甲型流感病毒株，這個過程沒 有表現出具有這樣的偏向性。對於甲型病毒株，病毒株共感染(通常感染入細胞培養 物，例如CEK細胞)後通常在細胞培養物中同時進行選擇和克隆。重配的優化
採用組1各步驟的各種實施方案可優化重配過程以減少所需的重配次數 (從而提高疫苗生產過程的產量/穩定性)等。採用這種優化技術的步驟一般實施方案 為乙型流感病毒毒株重配，所述步驟通常在細胞培養物(例如，CEK細胞)中進行。 參見，例如，PCT公開WO 05/014862。
流感病毒重配的其它方法可任選混合主供體病毒(MDV)和野生型病毒的 稀釋液，例如各自的1:5稀釋液，而不論各溶液的濃度，然後將混合液在25'C和33 'C培育24和48小時。儘管對於甲型流感病毒毒株這種方法通常可接受，但採用這 種方法乙型流感病毒毒株通常不能得到陽性結果。例如，為實現正確的6:2配比(即， MDV的6種基因與野生型病毒的NA和HA 二種基因)通常必須進行數千次重配。重配的選擇和克隆
組1的步驟也包括選擇重配的流感病毒。可在細胞培養物(例如，CEK細 胞)或蛋中選擇重配的甲型流感病毒毒株。然而，當在細胞培養物(例如，當在CEK 細胞中選擇時)中重配時，重配的乙型流感病毒毒株存在問題。據認為，CEK細胞可
幹擾乙型流感病毒毒株的M基因，從而降低總產量。疫苗組合物生產的各種方法(參見，例如PCT公開WO05/014862)採用不同的病毒重配步驟(例如選擇等等)，可任選 採用各種這樣的步驟來產生用於如這裡所述的疫苗組合物等的病毒。 重配的特徵鑑定
病毒/疫苗生產的其它方法還應用高通量單鏈構象多態性/毛細管電泳 (SSCP/CE)試驗來測定本文所用流感病毒的基因格局(gene constellation)。流感病毒含 有8個基因區段，如上所述，用兩種不同流感病毒毒株共感染一個細胞可產生具有 不同於任一親代的新型基因構象的重配體病毒。因此， 一些方法可採用SSCP/CE試 驗來快速測定大量流感病毒樣品中的基因區段格局。可利用這8個區段各自的特異 性螢光標記引物通過RT-PCR任選擴增流感病毒的基因區段。也可參見Arvin等， (2000)， J. Clin. Micro., 38(2): 839-845。防止細菌汙染
病毒/疫苗生產的一些方法可包括檢測和/或防止/檢測用於生產流感病毒 的蛋或其它宿主細胞的微生物汙染步驟。本發明的微生物檢測方法可用於快速/高通 量的微生物檢測，因此與許多其它步驟一樣可用於提高通量和病毒/疫苗生產中的產 量的提高。
本發明任選可採用的許多目前流感疫苗生產方法將在無特定病原體的含 胚雞蛋中擴增流感病毒的常規方法作為組成部分。在雞蛋中生產病毒的幾個時點上 可能發生微生物汙染。不幸的是，雞蛋殼外可能有一些微生物組成它們天然菌群的 一部分。在雞胚胎發育期間，蛋殼內也可能含有微生物。受精的雞蛋於37'C在高溼 度中孵育以使胚胎發育，這也構成了許多類型微生物汙染物的最佳培育條件。刺穿 蛋殼以接種雞蛋是發生微生物汙染另一可能的時間。即使在病毒接種前經常用酒精 噴灑雞蛋，微生物也仍可能進入雞蛋。
病毒在雞蛋中擴增2-3天後，通常除去蛋殼頂部以手工收穫雞蛋中含有病 毒的尿囊液。參見上文。這一收穫是可能引起微生物汙染的另一時點。不幸的是， 含有這種汙染性生物負載(bioburden)的雞蛋可能逃過檢測，而必須合併成多瓶以盡可 能降低因MPA檢驗失敗而棄去整批的可能性。由於疫苗生產中通常使用3種流感病 毒毒株，對於最終的散裝液需要混合這3種病毒株。應在例如用於混合和充填之前 的病毒收集過程中進行在線MPA(微生物純度試驗)檢驗以確保產品不含微生物。
孵育後，採用"常規"透光檢驗方法來鑑定未受精和因天然原因或微生物
汙染而死亡的死蛋(即，病毒的感染性和/或微生物擴增可能引發死蛋，對這兩種情況 均需檢測並除去這種蛋)。透光檢驗包括，例如在暗室中將雞蛋握持在光源前從而能 目測觀察胚胎發育的方法。排除死蛋不進行病毒接種。
此外，微生物汙染可發生於在細胞培養物中生產病毒的若干點上，例如，在開始培養宿主細胞之前原料宿主細胞可被微生物感染。主細胞庫(MCB)的製備是在 用於疫苗材料的病毒的生產中使用的基礎。MCB被充分檢測以確保沒有微生物痕跡， 可任選檢測MCB的致腫瘤性和/或致瘤性。或者，在需要打開用來培養宿主細胞的 生長容器(例如發酵罐)的任何步驟中都可能引入微生物。可能需要打開生長容器的步 驟包括，例如，任何向培養物中加入蛋白酶或其它添加物過程中以及用病毒感染宿 主細胞的過程中。使用無菌培養基和設備以及開發使打開生長容器的機率最小化的 工藝是使汙染的風險最小化的基礎。
從上述時間點可以看出，流感疫苗生產期間有多個步驟需要檢測微生物汙 染。需要消除或減少禽類和環境微生物，需要消除或減少引入的環境和人類的微生 物。目前檢測微生物汙染的方法包括，例如藥典規定的(compendial)方法(MPA和生 物負載)。目前的方法可以包括，例如接種前/後雞蛋透光檢驗(通常以約500枚蛋/小 時/人的速度手工進行)；MPA和生物負載檢驗，通常手工進行，對於MPA需要約14 天，對於生物負載需要約3天(在MCB製備和病毒收集期間進行)；支原體檢驗，通 常手工進行，需要約28天(在病毒收集期間進行)；和分枝桿菌檢驗，通常手工進行， 需要約56天(在病毒收集期間進行)。對於本發明能採用的各種技術的描述也可參見 例如PCT公開WO 05/014862。組2
屬於組2的病毒/疫苗生產的方面包括進一步的純化和病毒擴增等。經 正確的重配和重配體(例如6:2病毒)克隆過程後，進一步純化含胚雞蛋中的這種 重配病毒顆粒，並大量擴增正確的克隆(還是通過在雞蛋中培養)以產生主病毒毒 株(MVS)或主病毒種子，其進一步擴增以產生主工作病毒毒株(MWVS)或生產商 的工作病毒種子。從雞蛋純化病毒顆粒和利用這種純化的病毒來接種更多雞蛋以 擴增大量病毒顆粒的許多方面是精通本領域的技術人員所熟知的。許多這些技術 是目前病毒顆粒生產中常用的，已至少使用了 40年。參見，例如Reimer等，f來H錄眾魔,諒毒》 (7"/7Mewza Wmy戸r訴ca"o" w"/z f/ze zo"fl/ w/^zcewn/wge. Science, 1966， 152: 1379-81。純化方法可包括，例如蔗糖梯度 超離心(例如，10-40%蔗糖)等。如本文所述，組2中也可任選包括其它組所列工 藝等，例如防止微生物汙染等。 組3
屬於組3的病毒/疫苗生產方面包括，例如確定孵育含胚蛋或其它宿主細 胞的條件(如，涉及孵育病毒感染的含胚蛋或其它宿主細胞的特定處理和環境條件) 和從雞蛋尿囊液或宿主細胞培養上清中收集並淨化流感病毒。
例如，確定條件、洗滌、透光檢驗和孵育含有用於疫苗的重配病毒的蛋； 接種、密封這種蛋等；透光檢驗這種蛋；收集蛋中的病毒溶液(如，尿囊液)；培養和 接種宿主細胞；收集宿主細胞中的病毒溶液(如細胞培養物上清液)；和淨化病毒溶液 均屬於這種範疇。也應注意適用於組2步驟的幾種技術同樣適用於組3的步驟(例如， 透光檢驗)。包括組3的病毒/疫苗生產的幾個方面是精通本領域的技術人員所熟知的。 病毒生產中透光驗蛋以及用病毒接種蛋和這種蛋的洗滌、孵育等各方面是用蛋生產 病毒/疫苗的熟知技術。當然，應該知道這種熟知技術可與本發明獨特且創新的方面 聯用。PCT公開WO 05/014862中給出的也可與本發明方法和組合物聯用的其它步驟， 如擺動(rocking)等。其它類似的步驟可包括組合物的特殊過濾和升溫步驟，也參見 PCT公開WO 05/014862。過濾和升溫
此外，PCT公開WO 05/014862中還給出了可任選與本發明方法和組合物 聯用的其它過濾和升溫步驟。如(本文)所述，FluMistTM生產方法可利用含胚雞蛋來 產生主病毒種子(MVS)、生產商工作病毒種子(MWVS)和病毒收穫物(VH)。這些種子 和病毒收穫物可能含有生物負載(通常是細菌汙染)，可能導致疫苗生產過程中棄去該 種子或散裝病毒產品批次。當然，應該知道，除非另有明確表述，不應將所用具體 產品的類型、大小等的具體列表或描述認為是對本發明的限制。組4
疫苗生產的組4的方面包括，例如主要與穩定化有關的步驟(例如，通過 加入組分，改變緩衝液/NAF比值等)和含病毒溶液的效力/無菌性試驗。在一些實施
方案中，本發明的最終病毒溶液/疫苗可以含有在液體形式中穩定足夠時間從而能在 整個流感疫苗季節(例如，在北半球通常大概從9月到3月)"現場"儲存(例如，在2-8°C、 4'C、 5r;等冷藏時銷售和商品化)的活病毒。因此，需要這種病毒/疫苗組合物在儲存期間保持其效力或其喪失效力的速度可以接受。在其它實施方案中，液體形式的這種溶液/疫苗在約2-8匸(例如冷藏溫度)下穩定。因此，經本發明和本發明的 方法生產的病毒/疫苗可以通過這樣的步驟和/或與這樣的步驟聯用加以生產。同樣 可見PCT公開WO 05/014862。 病毒收穫物的濃縮/滲濾
在疫苗組合物生產的一些方法中，使用合適的柱任選濃縮病毒收穫物。參 見PCT公開WO 05/014862。穩定劑/緩衝液
疫苗組合物生產也可任選包括含有感興趣病毒和諸如蔗糖、精氨酸、明膠、 EDTA等混合物的NAF(通常是未分餾的NAF)的各種稀釋液。不同疫苗劑型中可能 的各種組合物的例子可參見，例如PCT公開WO 05/014862。在某些實施方案中，這 種方法和組合物在所需溫度(例如，通常在4。C、 5°C、 8°C，約2-8。C之間或高於2T: 等)下、在所選擇的時期(通常至少6個月、至少9個月、至少12個月、至少15個月、 至少18個月、至少24個月等)內穩定(即不顯示不可接受的效力喪失)。
在一些劑型中，組合物可含有與明膠或明膠相關和/或衍生產品(例如明膠 水解物)相混合或替代其的穩定劑，例如精氨酸(pH約7.0-約7.2)。同樣可參見PCT 公開WO 05/014862。許多病毒溶液/疫苗溶液中任選採用SPG基礎溶液(蔗糖、磷酸 鉀和穀氨酸單鈉)。
同樣，PCT公開WO 05/014862給出了穩定病毒/疫苗組合物的其它方法， 例如操控NAF水平等。定義
除非另有定義，所有科技術語應理解為具有和其所屬領域常規使用相同的 意義。出於本發明的目的，下文定義了以下術語。
術語"核酸"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"和"核酸序列"指單鏈或雙 鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，或其嵌合物或類似物。本文所用的該術語
任選包括具有天然核苷酸基本性質的天然產生的核苷酸類似物的聚合物，其中它們 以類似於天然產生的核苷酸的方式與單鏈核酸雜交(例如，肽核酸)。除非另有指明， 除了明確指出的序列以外，具體核酸序列任選含有互補的序列。
術語"基因"廣泛用於指與生物學功能相關的任何核酸。因此，基因包含 它們表達所需的編碼序列和/或調節序列。術語"基因"適用於特定的基因組序列以及該基因組序列所編碼的cDNA或mRNA。
基因也包含不表達的核酸區段，例如所述區段形成其它蛋白質的識別序 列。不表達的調節序列包括能與諸如轉錄因子的調節蛋白結合從而導致毗連或毗鄰 序列轉錄的"啟動子"和"增強子"。"組織特異性"啟動子或增強子是能在一種或 多種特定組織類型或細胞類型中調節轉錄的啟動子或增強子。
術語"載體"指能在生物、細胞或細胞組分之間擴增和/或轉運核酸的工 具。載體包括能自主複製或能整合入宿主細胞染色體中的質粒、病毒、噬菌體、原 病毒、噬菌粒、轉座子和人工染色體等。載體也可是不能自主複製的裸RNA多核苷 酸、裸DNA多核苷酸、在同一鏈中由DNA和RNA構成的多核苷酸、聚-賴氨酸-偶聯的DNA或RNA、肽-偶聯的DNA或RNA、脂質體-偶聯的DNA等。
"表達載體"是能促進摻入其中的核酸表達以及複製的載體，如質粒。待 表達的核酸通常"操作性連接於"啟動子和/或增強子，並受啟動子和/或增強子的轉 錄調節控制。
"雙向表達載體"的特徵是兩個交替的啟動子(altemativepromoter)的朝向 相對於它們之間的核酸呈相反方向，從而可以兩個方向啟動表達，進而導致，例如 同時轉錄正(+)鏈或正義鏈和負鏈(-)或反義鏈RNA。
在本文中，術語"分離的"指基本上不含在其天然產生環境中通常與其正 常相伴或相互作用的成分的生物材料，例如核酸或蛋白質。分離的材料任選含有在 其天然環境(例如細胞)中未發現的與其相伴的物質。例如，如果該材料處於其天 然環境，例如細胞中，則該材料在細胞中被置於該環境中所發現的材料的非天然位 置上(例如，基因組或遺傳元件)。例如，如果通過非天然方式將天然產生的核酸(例 如，編碼序列、啟動子、增強子等)引入對該核酸是非天然的基因組位點中(例如，載 體，如質粒或病毒載體或擴增子)，則該核酸成為分離的。這種核酸也稱為"異源" 核酸。
術語"重組體"表示經人工或合成(非天然)方法改變的物質(例如，核酸或 蛋白質)。可對處於其天然環境或狀態中，或對從其天然環境或狀態中除去的物質進 行改變。具體地說，當指病毒(例如流感病毒)時，當其通過重組核酸的表達產生 時，所述病毒是重組體。
當術語"重配體"指病毒時，其表示該病毒包含衍生自多個親代病毒毒株 或來源的遺傳成分和/或多肽成分。例如，7:1重配體包含衍生自第一個親代病毒的7 個病毒基因組區段(或基因區段)和衍生自第二個親代病毒的一個單一互補病毒基因 組區段，例如編碼血凝素或神經氨酸酶的基因組區段。6:2重配體包含來自第一個親 代病毒的6個基因組區段(最常見是6個內部基因)和來自另一個不同的親代病毒的兩 個互補區段，例如(編碼)血凝素或神經氨酸酶的區段。
當術語"引入"指異源或分離的核酸時，其指將某核酸摻入真核或原核細 胞中，其中該核酸可以摻入細胞的基因組(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA) 中，轉變為自主複製子或瞬時表達(例如，轉染的mRNA)。該術語包括諸如"感染"、 "轉染"、"轉化"和"轉導"等方法。在本發明內容中，可採用各種方法將核酸引 入原核細胞中，包括電穿孔、磷酸鈣沉澱、脂質介導的轉染(脂轉染)等。
術語"宿主細胞"表示含有異源核酸(例如載體)並能支持該核酸複製和/ 或表達的細胞。宿主細胞可以是原核細胞，例如大腸桿菌，或真核細胞，例如酵母、 昆蟲(細胞)、兩棲類(細胞)、禽類(細胞)或包括人細胞在內的哺乳動物細胞。本發明 內容中的示範性宿主細胞包括Vero (非洲綠猴腎)細胞、BHK(幼倉鼠腎)細胞、原代 雛雞腎(PCK)細胞、Madin-Darby犬腎(MDCK)細胞、Madin-Darby牛腎(MDBK) 細胞、293細胞(例如，293T細胞)和COS細胞(例如，C0S1、 COS7細胞)。流感病毒
本文的組合物和方法主要涉及用於疫苗的流感病毒的生產。流感病毒由含 有分節段的單鏈RNA基因組的內部核糖核蛋白核心及具有基質蛋白襯裡的脂蛋白外 包膜構成。甲型流感病毒和乙型流感病毒各自含有8個區段的單鏈負鏈RNA。甲型 流感病毒基因組編碼11種多肽。區段1-3編碼構成RNA依賴性RNA聚合酶的3種 多肽。區段1編碼聚合酶複合物蛋白PB2。其餘的聚合酶蛋白PB1和PA分別由區段 2和區段3編碼。此外， 一些流感病毒毒株的區段1編碼由PB1編碼區內選擇性讀 框產生的小蛋白PB1-F2。區段4編碼參與感染期間細胞黏附和進入的血凝素(HA)表 面糖蛋白。區段5編碼核衣殼核蛋白(NP)多肽，這是與病毒RNA結合的主要結構組 分。區段6編碼神經氨酸酶(NA)包膜糖蛋白。區段7編碼由不同剪接方式的mRNA 翻譯的兩種基質蛋白，稱為M1和M2。區段8編碼由不同剪接方式的mRNA翻譯 的兩種非結構蛋白NS1和NS2。
乙型流感病毒的8個基因組區段編碼11種蛋白質。3個最大的基因編碼 RNA聚合酶的組分PB1、 PB2和PA。區段4編碼HA蛋白。區段5編碼NP。區段 6編碼NA蛋白和NB蛋白。蛋白NB和NA均由雙順反子mRNA的重疊讀框翻譯。 乙型流感病毒的區段7也編碼兩種蛋白質Ml和M2。最小的區段編碼兩種蛋白質 由全長RNA翻譯的NS1和由mRNA剪接體翻譯的NS2。流感病毒疫苗
歷史上，主要利用根據相關病毒株的經驗性預測選出的病毒毒株在含胚雞 蛋中生產流感病毒疫苗。近年來，將選擇的血凝素和神經氨酸酶抗原摻入已批准的 減毒的溫度敏感主病毒株中製備了重配體病毒。通過在雞蛋中傳代多次培養病毒後， 回收流感病毒並任選滅活，例如用甲醛和/或0丙內酯滅活(或者用於減毒活疫苗)。
然而，以此方式生產流感疫苗有幾個明顯的問題。例如，雞蛋中殘留的汙 染物可以是高度抗原性和/或熱源性的，並在給藥後常可導致明顯的副作用。因此， 另一方法包括用不含動物(成分)的培養基替換一定百分比的雞蛋組分。更重要的是， 通常必須在下一次流感季節前數月選擇和分發為疫苗生產所指定的病毒毒株，從而 有時間生產和滅活流感疫苗。因此在儲存期間的穩定性和/或在更方便的溫度(例如， 約2-8'C的冷藏溫度)下儲存方面的任何提高也是非常需要的。
批准用於疫苗生產的一些病毒株在標準細胞培養條件下不能充分生長阻 礙了在細胞培養物中生產重組和重配疫苗的嘗試。因此，本發明人及同事先前的工 作提供了在培養物中生產重組和重配病毒的載體系統和方法，從而能快速生產對應 於一種或多種選擇的抗原性病毒株的疫苗。參見，例如上述PCT公開WO 03/091401 。 當然，任選在雞蛋中進一步擴增這樣的重配(體)。通常在受控的溼度和C02條件下， 利用溫度調節器，例如恆溫箱以確保溫度不超過35'C的恆定溫度下將培養物維持在 諸如細胞培養箱的系統中。通過全部或部分利用本發明可進一步優化這種前驅性工 作以及其它疫苗生產工作。
通過引入對應於主流感病毒基因組區段的載體亞組聯同衍生自感興趣病 毒株(例如，感興趣的抗原性變體)的互補區段不難獲得重配流感病毒。通常根據與疫 苗給予相關的所需特性來選擇主病毒株。例如，為疫苗生產，如為生產減毒的活疫 苗，可選擇減毒表型、冷適應和/或溫度敏感的主供體病毒毒株。FluMist
如上所述，流感疫苗有許多實例和類型。示範性流感疫苗FluMist是一種 保護兒童和成年人免患流感疾病的減毒活疫苗(Belshe等，(1998)， (f減毒遊、冷^^應 遊、三份、潷/^魔滅薪毒話瘦勞,乂乙著^遊資力》(T/ze e^cac;; o/ //ve加e"z^e《 coW-ada/7fe" fn'va/e"f， ！'"fra"osa/ 一wenza v/rws vacc/we〖w c/w臉—，N. Engl. J. Med.， 338:1405-12; Nichol等，(1999)， (f減毒遊,/^魔滅諒毒薪資欲在變^^r伊成義護遊 褒力 一艱腐教il/厲試澄j1 f^fec"ve"es5 o/ //ve, /"fra"oyfl/ /"/2W"z" vzVusvacc/"e /" Aefl/鄉wwA:/"g a^/to: o raw/ow/zed cowfro〃ed Wa/,， IAMA， 282: 137-44)。 在典型的實施方案中，本發明方法和組合物宜適用於生產FluMist疫苗或與之聯用。 然而，精通本領域的技術人員應知道本文的步驟/組合物也適用於生產相似，或者甚 至不同的病毒疫苗及其組合物。
FluMist 疫苗病毒株含有，例如衍生自該疫苗所屬野生型病毒株的HA和 NA基因區段聯同常規主供體病毒(MDV)的6個基因區段，PB1、 PB2、 PA、 NP、 M 和NS。通過在連續降溫條件下在原代雛雞腎組織培養物中連續傳代野生型A/Ann Arbor/6/60 (A/AA/6/60)病毒株製備了 FluMist的甲型流感病毒毒株的MDV (MDV-A) (Maassab， (1967)， (f25 r好魔^"瘋毒遊適應絲^7主長獰絲》0^pto"o" graw^ c/zaracfeWWos o//",e"za v/ms a"5 c/egrees C」，Nature, 213:612-4)。 MDV-A在25 。C有效複製(c山冷適應的)，但其生長在38和39'C受限(te，溫度敏感的)。此外，該 病毒在受感染雪貂的肺中不能複製(a"，減毒的)。據信，G表型可通過限制疫苗在除 最冷區域以外的所有呼吸道中複製從而導致其在人中減毒。動物模型和臨床研究證 明了此特性的穩定性。與通過化學誘變產生的流感病毒毒株的"表型不同，經受感 染的倉鼠或在兒童的蛻皮分離物中傳代後MDV-A的此te特性不回復(最近的綜述可 參見Murphy和Coelingh， (2002)， (f減毒遊冷適應伊碧嚴感諒毒浙Z智魔減瘋毒活度coW扁acfa/7fe(i /w,e"za J aw(i 5 vaccZ"es」，Viral Immunol. ， 15: 295-323)。
在20,000以上的成人和兒童中進行的涉及12種不同6:2重配病毒株的臨 床研究顯示這些疫苗是減毒、安全而有效的(Bdshe等，(1998)， (f減毒遊、冷適應效、 三份、淳/t魔jT瘋毒活度度^7乙蓳^遊資力》(T/ze e^cacy o///ve fltewwafe《 coW-acto,4 Wwz/e賦/ awma/ /"/7wewza vz>iw vacc/"e Zw c/n粉e"」，N. Engl. J. Med.， 338:1405-12; Boyce等，(2000)， (f葬/^繪f變康成乂遊^7^^/浙求^7乾^/f卓泣魔 減資度遊安全絲浙扇資嚴絲》(S^Z^ /mmw"ogem'c//^ o/ —'wv""&rfwm—wvaw&c/ sw6聽Y /"/7we^za vacc/"es ad附/"Z他red /"加wawa〃y to /zea欣;y a血/to」， Vaccine, 19:217-26; Edwards等，(1994)， (f帝f豫銀伊麥魔減^";^遊冷適i^界ir薪 ,i遊嚴教浙,街試邀J1 (S4 ra"cto附/ze(i co"fw〃ed fr/a/ o/ coW acto/ fed /"ac"w ed vacc/wej1 ybr Ae ^eve油.ow o//^/7we"za j tfoeose」，J. Infect. Dis.， 169: 68-76; Nichol 等，(1999)，《減毒遊,力蔬感瘋毒薪i^勞泫燈康伊成乂^遊資力.'一艱蘑教歡街試 麥iY^^"/vewe^ o/7/ve, We"""^/ /"frwzasa/ v/rz vacc/"e /" /zea/鄉uwh'"gawW&: ara/^ow/zedco^ro〃eafWa"， JAMA， 282: 137-44)。攜帶MDV-A的6個內部 基因和野生型病毒的兩個HA和NA基因區段的重配體(即，6:2重配體)始終保留了 c。、"和加表型(Maassab等，(1982)， (f泫穿教^伊仿瓶蘊羞資流感癰毒疫度》 (Eva/w加'o;7 o/a coW-recom6/"a"f /w/7we"za v/rw5 vacc/we ， J. Infect. Dis.， 146:780-900)。然而，利用乙型流感病毒毒株製備這種重配病毒更困難。
近年來的工作公開了用於完全由克隆的cPNA製備乙型流感病毒的一種8 質粒系統，以及適用於疫苗劑型(例如用於鼻內給予的活病毒疫苗劑型)的減毒活甲型 流感病毒和乙型流感病毒的製備方法(參見例如上述PCT公開WO 03/091401)。本發 明還提供了生產乙型毒株的改進方法。
上述系統和方法可用於快速生產重組和重配甲型流感病毒和乙型流感病 毒，包括適合用作疫苗的病毒，包括減毒活疫苗(例如適用於鼻內給予的疫苗，如 FluMist②)的病毒。本發明方法任選與先前涉及例如用於疫苗生產的重配流感病毒的 工作聯用或組合從而以更穩定、均一和多產的方式生產用於疫苗的病毒。細胞培養中的病毒複製
如上所述，流感病毒可任選在細胞培養物中生長。 一般在常規培養宿主細 胞的培養基組合物中實現病毒增殖。用於流感病毒複製的合適宿主細胞包括，例如 Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞和COS細胞，包括293T細胞、COS7
細胞。通常利用例如1:1比例的包括兩種上述細胞系，例如MDCK細胞和293T或 COS細胞的共同培養物來提高複製效率。細胞一般在適合於維持緩衝液中性pH(例 如，介於7.0-7.2間的pH)的受控溼度和C02下，在標準商品化培養基，例如補加血 清(例如，0.5-10%胎牛血清)的Dulbecco改進Eagle培養基、或不含血清的培養基(例 如Iscove's培養基、ultra CHO培養基(BioWhittaker)， EX-CELL (JRH Biosciences))、或不含 動物蛋白的培養基(例如PF-CHO (JRHBiosciences))中培養。培養基任選含有防止 細菌生長的抗生素(例如青黴素、鏈黴素等)和/或其它營養素(例如L-穀氨醯胺、 丙酮酸鈉、非必需胺基酸)、促進有利的生長特徵的其它補充物質(例如胰蛋白酶、 (3-巰基乙醇等)。
在培養基中維持哺乳動物細胞的方法已有大量報導且為精通本領域的技 術人員所熟知。通用方法可見，例如Freshney， (1983)，《動物細胞培養基礎技術 手冊》(Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique), AlanR.Liss,紐約；Paul, H975)，《細胞和組織培養》(Cell and Tissue Culture),第五版，Livingston編，愛丁堡； Adams, (1980〗，《生物化學和分子生物學中的實驗室技術-針對生物化學家的細胞培 養》(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biologv-Cell Culture for Biochemists), Work和Burdon編，Elsevier,阿姆斯特丹。關於流感病毒體外生產中 特別感興趣的組織培養方法的其它細節描述包括，例如Merten等，(1996)， "^"一^^ 潛泰激^"產帝fiS"度煮條遊魔減瘋毒"f7W雄'ow o/ Z"y we腿W， & ce〃 cw/她s /or vacc/we ; r印ara"o"」，刊於Cohen和Shafferman編，《疫苗設計和生產的新方法》 (Novel Strategies in Design and Production of Vaccines)。此夕卜，通過常規實驗不難確定 適應於本發明的這些方法中的改變，這樣的改變對於精通本領域的技術人員應是熟 悉的。
可在含有血清或不含血清或不含動物蛋白的培養基中培養用於生產流感 病毒的細胞。在一些情況中，例如為製備純化的病毒，通常需要在不含血清或不含 動物蛋白的條件下培養宿主細胞。可以以基質(例如微載體)上的貼壁細胞的形式 或不黏附於任何基質的細胞懸液的形式培養細胞。可以小規模(例如在少於25 ml 培養基中)、在培養試管或培養瓶中、或在帶攪拌的大瓶中、搖瓶中、或在燒瓶、瓶 或反應器培養液中的微載體珠上(例如，DEAE-Dextran微載體珠，如Dormacell,Pfeifer & Langen; Superbead， Flow Laboratories;苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，例如Hillex，
SoIoHill， Ann Arbor)培養細胞。微載體是為每份細胞培養液體積的黏附細胞生長提 供大表面積的小球體(直徑為100-200微米)。例如，1升培養基可含有兩千萬以上的 微載體珠，這些微載體珠能提供8000平方釐米以上的生長表面。對於病毒的商品化 生產，例如對於疫苗生產，往往需要在生物反應器或發酵罐中培養細胞。可用的生 物反應器的容積從1升以下到100升以上，例如Cyto3生物反應器(Osmonics， Minnetonka, MN); NBS生物反應器(New Brunswick Scientific, Edison，新澤西)； B. Braun Biotech International的實驗室和工業化規模的生物反應器(B. Braun Biotech, Melsungen，德國)。
無論培養液的體積，在許多希望的方面，重要的是將培養液維持在合適溫 度從而通過使用溫度依賴性多質粒系統(參見，例如，上述PCT公開WO 03/091401)、 用於過濾的病毒溶液加熱等確保病毒複製和/或重組和/或重配流感病毒的回收。通 常利用調節器(例如恆溫箱或感測和維持細胞培養系統和/或其它溶液溫度的其它裝 置)來確保合適時期(例如，病毒複製期等)內的溫度處於正確水平。
在一些方法中(例如，其中要從載體上的區段製備重配病毒)，根據本領域 熟知的將異源核酸引入真核細胞的方法將含有流感(病毒)基因組區段的載體引入(轉 染)宿主細胞，所述方法包括，例如磷酸鈣共沉澱、電穿孔、顯微注射、脂轉染和利 用聚胺轉染試劑轉染。例如，可根據生產商的使用說明書利用聚胺轉染試劑 TransIT-LTl (Minis)將載體(如質粒)轉染入宿主細胞，例如COS細胞、293T細胞或 COS或293T細胞和MDCK細胞的混合物中，從而產生重配病毒等。待引入宿主細 胞群的約1 ng各載體與約2 ^ TransIT-LTl用160 pl培養基(優選不含血清的培養基) 稀釋，終體積200 W。 DNA:轉染試劑混合物在室溫培育45分鐘，然後加入800 pl 培養基。向宿主細胞中加入此轉染混合物，如上所述或通過精通本領域的技術人員 所熟知的其它方法培養細胞。因此，為在細胞培養物中製備重組或重配病毒，將摻 有8個基因組各個區段(PB2、 PB1、 PA、 NP、 M、 NS、 HA和NA)的載體與約20 pl TransIT-LTl混合，轉染入宿主細胞中。轉染前任選用不含血清的培養基，例如 Opti-MEM I替換含血清的培養基，並培育4-6小時。
或者，可採用電穿孔將摻有流感(病毒)基因組區段的這種載體引入宿主細 胞中。參見PCT公開WO 05/062820。例如，優選根據以下方法用電穿孔將摻有甲型 流感病毒或乙型流感病毒的質粒載體引入Vero細胞中。簡言之，例如將生長在補加10。/。胎牛血清(FBS)的改進Eagle培養基(MEM)中的約5X 106個Vero細胞重懸於0.4 ml OptiMEM中，置於電穿孔小杯中。向該小杯細胞中加入體積為25 pl以下的20 微克DNA，然後輕扣混合。根據生產商的使用說明書(例如，與Capacitance Extender Plus相連的BioRad Gene Pulser II)以300伏、950微法和28-33毫秒的時間常數進行 電穿孔。輕扣重新混合細胞，電穿孔後約1-2分鐘直接在小杯中加入0.7 ml含10%FBS 的MEM。然後將細胞轉入含有2mlMEM， 10%FBS的標準6孔組織培養皿的兩個 孔中。洗滌小杯以回收任何剩餘的細胞，洗滌懸液分入所述兩個孔中。終體積約3.5 mL。然後在允許病毒生長的條件下(例如對於冷適應病毒株約33'C)培育細胞。
在一些方法中(例如，其中用宿主細胞來製造病毒以生產疫苗的方法)，按 照本領域熟知的方法培養宿主細胞並用病毒感染。例如，優選當細胞已經達到最佳 細胞密度(例如，取決於所採用的培養條件，每毫升約5><106個細胞)時進行 所培養細胞的感染。以約0.001-10的感染複數(m.o丄)(優選的m.o.i.約為0.002-0.5)感 染宿主細胞。通常，病毒在動物細胞內的有效複製需要加入蛋白酶(例如，絲氨酸蛋 白酶，如胰蛋白酶)，可任選在感染前一會兒、感染時或感染後一會兒在培養物中加 入蛋白酶。根據本發明，在病毒感染後繼續培養被感染的細胞以在低於33'C的溫度 下如3rC(或任選在約29'C和約32'C之間)複製病毒，通常要培養到可檢測到(例如， TCID5o試驗和QRT-PCR試驗)最大細胞病變效應或最大病毒量。任選地，將感染的 細胞培養約2-10天。用來生產含有病毒的細胞上清液的具體方法是本領域已知的(參 見，例如，美國專利4,500513、 6,656,720、 6,455,298和6,146,873)。應了解，其它步 驟(類似步驟或不同步驟)可任選與本發明的方法一起使用。試劑盒
為便於本發明方法和組合物的使用，可將任何疫苗組分和/或組合物(例 如各種劑型的病毒等)和出於實驗或治療性疫苗目的可用於包裝和流感病毒感染的 其它組分(如緩衝液、細胞、培養基)包裝成試劑盒形式。除了上述組分外，試劑 盒通常含有其它材料，可以包括，例如執行本發明方法的使用說明書、包裝材料和 容器。
儘管出於清晰和理解的目的描述了上述發明的一些細節，但精通本領域的 技術人員閱讀本文內容後應明白可對形式和細節作出各種改變而不脫離本發明的真 正範圍。例如，上述所有技術和裝置可以各種組合使用。本申請書中引用的所有出 版物、專利、專利申請或其它文件通過參考出於所有目的完整地納入本申請書中， 其程度相當於單獨每份出版物、專利、專利申請或其它文件單獨地說明出於所有目的通過參考納入本文。此外，出於所有目的，2004年12月8日提交的美國臨時申請 60/634,690通過引用完整地納入本文。
權利要求
1.一種生產至少一種流感病毒顆粒的方法，所述方法包括a.將至少一種含有流感病毒基因組或部分基因組的載體引入至少一個宿主蛋；b.在低於33℃的溫度下孵育所述宿主蛋；和c.從所述宿主蛋回收所述流感病毒顆粒。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述病毒包括乙型流感病毒株的病毒。
3. 如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述基因組或部分基因組來自減毒的流感病毒、冷適應流感病毒、溫敏流感病毒、減毒的冷適應流感病毒、或減毒的溫 敏流感病毒、或冷適應溫敏流感病毒、或減毒的冷適應溫敏流感病毒。
4. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述基因組或部分基因組來自Ca B/Jilin/20/03 、 PR8 、 ca B/Ann Arbor/1/94 、 B/Leningrad/14/17/55 、 B/14/5/1 、 B/USSR/60/69、 B/Leningrad/179/86、 B/Leningrad/14/55或B/England/2608〃6流感病毒株。
5. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述宿主蛋包括SPF含胚雞蛋。
6. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在31-33T:之間孵育所述宿主蛋。
7. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在31-32'C之間孵育所述宿主蛋。
8.如權利要求i所述的方法，其特徵在於，在3rc孵育所述宿主蛋。
9. 一種用權利要求1所述方法生產的流感病毒。
10. —種含有權利要求9所述病毒的冷藏穩定的組合物。
11. 一種含有權利要求9所述病毒的流感疫苗。
12. 如權利要求11所述的疫苗，其特徵在於，所述疫苗含有液態的減毒鼻內活疫苗。
13. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，在33'C以下孵育得到的回收的病毒 顆粒的產量大於或等於相同病毒顆粒在33'C或更高溫度下孵育所得到的產量。
14. 如權利要求13所述的方法，其特徵在於，所述在33"C以下孵育是在3rC孵 育，所述在33'C或更高溫度下孵育是在33'C孵育。
15. 如權利要求14所述的方法，其特徵在於，所述產量通過測定用33。C以下孵 育的病毒顆粒所感染的宿主蛋的尿囊液的1ogK)TCIDso/mL滴度及通過測定用33。C孵 育的病毒顆粒所感染的宿主蛋的尿囊液的logl。 TCID5Q/mL滴度進行量化。
16. 如權利要求15所述的方法，其特徵在於，所述得自31"C孵育的log" TCID5/mL滴度比33。C的log1Q TCID50/mL滴度高至少約1.01-1.10倍、至少約 1.025-1.05倍、或至少約1.03-1.04倍。
17. 如權利要求l所述的方法，其特徵在於，所述病毒顆粒在對象中引起免疫應 答，該應答實質上類似於經33'C或以上孵育產生的病毒顆粒在對象中所引起的免疫 應答。
18. 如權利要求17所述的方法，其特徵在於，所述對象是雪貂。
19. 如權利要求18所述的方法，其特徵在於，所述對象是人。
20. —種提高流感病毒顆粒產量的方法，所述方法包括在低於33'C的溫度下孵育 宿主內的所述流感病毒。
21. 如權利要求20所述的方法，其特徵在於，宿主內的所述流感病毒在31-32"C 孵育。
22. 如權利要求21所述的方法，其特徵在於，宿主內的所述流感病毒在約31°C 孵育。
23. 如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述流感病毒是冷適應溫敏減毒的 流感病毒。
24. 如權利要求21所述的方法，其特徵在於，所述流感病毒含有至少一個Ann Arbor B株流感病毒的vRNA基因組區段。
全文摘要
提供了用於在蛋和宿主細胞中優化和生產適合作為流感疫苗的流感病毒，例如ca乙型流感病毒株的方法和組合物。
文檔編號C12P7/02GK101128598SQ200580047731
公開日2008年2月20日 申請日期2005年12月7日 優先權日2004年12月8日
發明者Q·黨, R·施瓦茨 申請人:米迪繆尼疫苗股份有限公司