修飾的vonWillebrand因子的製作方法

2023-05-29 11:05:16

本發明涉及多肽，尤其是表現出對因子VIII改進的結合親和力的修飾的vonWillebrand因子。本發明還涉及包含所述多肽和FVIII的複合物，涉及編碼本發明的多肽的多核苷酸和產生所述多肽的方法。進一步地，本發明涉及本發明的多肽或複合物用於治療出血障礙的治療性或預防性用途。發明背景存在由凝血因子的缺乏導致的多種出血障礙。最常見的障礙是血友病A和B，分別由凝血因子VIII和IX的缺乏導致。另一種已知的出血障礙是vonWillebrand病。在血漿中，FVIII主要以與VWF的非共價複合物存在，並在膜結合的活化的因子X生成複合物中作為用於活化的因子IX的輔因子起作用。已經進行了若干嘗試以延長未活化的FVIII的半衰期，通過減少其與細胞受體的相互作用(WO03/093313A2、WO02/060951A2)，通過共價地附連聚合物於FVIII(WO94/15625、WO97/11957和US4970300)，通過包封FVIII(WO99/55306)，通過引入新的金屬結合位點(WO97/03193)，通過由肽鍵(WO97/40145和WO03/087355)或二硫鍵(WO02/103024A2)共價地附連A2結構域於A3結構域，或通共價地附連A1結構域於A2結構域(WO2006/108590)。增強FVIII或VWF的功能半衰期的另一方法是通過FVIII的PEG化(WO2007/126808、WO2006/053299、WO2004/075923)。VWF的PEG化(WO2006/071801)也已被嘗試以試圖間接增強血漿中存在的FVIII的半衰期。還已描述了FVIII的融合蛋白(WO2004/101740、WO2008/077616和WO2009/156137)。在不同形式的vonWillebrand病(VWD)中丟失、功能上缺陷或僅以減少的量可得的VWF是在血漿中存在的多聚粘附糖蛋白，其具有多種生理功能。在原發性止血期間，VWF作為血小板表面上的特定受體與細胞外基質的組分諸如膠原之間的介體起作用。而且，VWF作為促凝血的FVIII的載體和穩定蛋白起作用。VWF在內皮細胞和巨核細胞中作為2813個胺基酸的前體分子合成。野生型VWF的胺基酸序列和cDNA序列在Collins等1987,ProcNatl.Acad.Sci.USA84:4393–4397中公開。前體多肽前-原-VWF(pre-pro-VWF)由22-殘基信號肽、741-殘基原肽(pro-peptide)和血漿中發現的2050-殘基多肽組成(Fischer等,FEBSLett.351:345-348,1994)。在內質網中裂解信號肽之後，在VWF的兩個單體之間形成C-末端二硫鍵橋。在經由分泌途徑的進一步轉運期間，加入12N-連接的和10O-連接的糖類側鏈。重要地，VWF二聚體經N-末端二硫鍵橋被多聚化，且741個胺基酸的原肽在晚期高爾基器中被酶PACE/弗林蛋白酶裂解掉。原肽以及VWF的高分子量多聚體(VWF-HMWM)儲存在內皮細胞的Weibel-Pallade小體中或在血小板的α-顆粒體中。在被分泌到血漿中後，蛋白酶ADAMTS13在VWF的A1結構域內裂解VWF。血漿VWF由一個範圍的多聚體組成，範圍從500kDa的單個二聚體到分子量超過10,000kDa的由多於20個二聚體組成的多聚體。通常VWF高分子量多聚體(VWF-HMWM)具有最強的止血活性，其可以以瑞斯託菌素輔因子活性(VWF:RCo)測量。VWF:RCo/VWF抗原的比例越高，高分子量多聚體的相對量越高。VWF中的缺陷是vonWillebrand病(VWD)的原因，vonWillebrand病(VWD)的特徵為或多或少明顯的出血表型。VWD3型是最嚴重的形式，其中VWF完全丟失，VWD1型涉及VWF的量的損失且其表型可以是非常輕微的。VWD2型涉及VWF的量的缺陷且可以與VWD3型一樣嚴重。VWD2型具有許多亞型，其中一些與高分子量多聚體的損失或減少相關。VonVWD2a型的特徵為中等和大的多聚體的損失。VWD2B型的特徵為最高分子量的多聚體的損失。VWD是人類中最常見的遺傳性出血障礙，並可用包含血漿或重組來源的VWF的濃縮物的替代療法治療。VWF可從人類血漿製備，如例如在EP05503991中描述的。EP0784632描述了用於產生和分離重組VWF的方法。在血漿中，FVIII以高親和力結合VWF，這保護其免於過早分解代謝並因此除了其在原發性止血中的作用以外，在調節FVIII的血漿水平中起重要作用，因此也是次級止血的調控中的重要因子。結合於VWF的未活化的FVIII在血漿中的半衰期是約12至14小時。在其中無或幾乎無VWF存在的vonWillebrand病3型中，FVIII的半衰期是僅約6小時，導致此類患者中輕度至中度血友病A的症狀(由於FVIII的濃度減少)。VWF對FVIII的穩定效應也已被用來幫助FVIII在CHO細胞中的重組表達(Kaufman等1989,MolCellBiol)。發明概述在第一方面，本發明提供了一種結合因子VIII的修飾的多肽，其中所述修飾的多肽包含如SEQIDNO:3中所示的序列，其中該序列包括在位置1或3處的至少一個修飾，使得修飾的多肽以比包含未修飾的SEQIDNO:3的參考多肽低至少5倍的解離速率結合因子VIII。在第二方面，本發明提供了一種結合因子VIII的修飾的多肽，其中所述修飾的多肽包含如SEQIDNO:3中所示的序列，其中該序列包括在至少位置3處的修飾，使得修飾的多肽以比包含未修飾的SEQIDNO:3的參考多肽低的解離速率結合因子VIII。在第三方面，本發明提供了一種結合因子VIII的修飾的多肽，其中所述修飾的多肽包含如SEQIDNO:3中所示的序列，其中該序列包括在至少位置1處的修飾，使得修飾的多肽以比包含未修飾的SEQIDNO:3的參考多肽低的解離速率結合因子VIII，其中在位置1處的殘基選自由G、P、E、Y、A和L組成的組。本發明還提供了包含因子VIII分子和本發明的修飾的多肽的複合物和編碼所述修飾的多肽的多核苷酸。本發明還提供了增加VWF的因子VIII結合親和力的方法，所述方法包括向VWF胺基酸序列的D'結構域引入至少兩個突變，使得在SEQIDNO:3的位置1和3或位置3和9或位置3和43的殘基被改變。詳細描述VWF如本文使用的術語「vonWillebrand因子」或「VWF」是指具有野生型VWF的生物活性，特別是結合因子VIII的能力的任何多肽。編碼野生型VWF的基因被轉錄為9kbmRNA，該9kbmRNA被翻譯為2813個胺基酸的前-原多肽，估計分子量為310,000Da。前-原多肽包含22個胺基酸的信號肽、741個胺基酸的原-多肽和成熟亞基。741個胺基酸的原多肽從N-末端裂解產生由2050個胺基酸組成的成熟VWF。VWF前-原多肽的胺基酸序列示於SEQIDNO:2中。除非另外指出，否則本申請中VWF殘基中的胺基酸編號是指SEQIDNO:2，儘管VWF分子不必包含SEQIDNO:2的所有殘基。成熟VWF的胺基酸序列示於SEQIDNO:4中。除非另外指出，否則如本文使用的術語「VWF」是指VWF的成熟形式。野生型VWF的原多肽包含多個結構域，其以以下順序排列：D1-D2-D'-D3-A1-A2-A3-D4-B1-B2-B3-C1-C2-CKD1和D2結構域代表原肽，其被裂解掉以產生成熟VWF。D'結構域涵蓋SEQIDNO:2的胺基酸764至865。野生型VWF的D'結構域的胺基酸序列示於SEQIDNO:3中。羧基末端90個殘基構成「CK」結構域，其與蛋白的「半胱氨酸結(cysteineknot)」超家族同源。這些家族成員具有經由二硫鍵二聚化的趨勢。優選地，野生型VWF包含成熟VWF的胺基酸序列，如SEQIDNO:4中所示的。還涵蓋了VWF的添加、插入、N-末端、C-末端或內部缺失，只要VWF的生物活性、特別是結合FVIII的能力被保留。如果具有缺失的VWF保留野生型VWF的生物活性的至少10％、優選地至少25％、更優選地至少50％、最優選地至少75％，在本發明的意義上，生物活性被保留。野生型VWF的生物活性可由技術人員利用以下方法確定：瑞斯託菌素輔因子活性(FedericiAB等2004.Haematologica89:77-85)，VWF對血小板糖蛋白複合物Ib-V-IX的GPIb的結合(Sucker等2006.ClinApplThrombHemost.12:305-310)，或膠原結合測定(Kallas&Talpsep.2001.AnnalsofHematology80:466-471)。當VWF的生物活性是結合FVIII的能力時，這可以多種方式測量，然而，優選地如本文實施例1中描述的測量。因子VIII術語「凝血因子VIII」、「因子VIII」和「FVIII」在本文可互換地使用。「凝血因子VIII」包括野生型凝血FVIII以及具有野生型凝血FVIII的促凝血活性的野生型凝血FVIII衍生物。與野生型FVIII的胺基酸序列相比，衍生物可具有缺失、插入和/或添加。術語FVIII包括FVIII的蛋白水解加工形式，例如活化前的形式，其包括重鏈和輕鏈。術語「FVIII」包括具有野生型因子VIII的生物活性的至少25％、更優選地至少50％、最優選地至少75％的任何FVIII變體或突變體。作為非限制性實例，FVIII分子包括阻止或減少APC裂解的FVIII突變體(Amano1998.Thromb.Haemost.79:557-563)、進一步穩定A2結構域的FVIII突變體(WO97/40145)、具有增加的表達的FVIII突變體(Swaroop等1997.JBC272:24121-24124)、具有減少的免疫原性的FVIII突變體(Lollar1999.Thromb.Haemost.82:505-508)、從不同地表達的重鏈和輕鏈重構的FVIII(Oh等1999.Exp.Mol.Med.31:95-100)、具有對受體的結合減少，導致FVIII的分解代謝如HSPG(硫酸乙醯肝素蛋白聚糖)和/或LRP(低密度脂蛋白受體相關蛋白)的FVIII突變體(Ananyev等2001.TCM,11:251-257)、二硫鍵穩定的FVIII變體(Gale等,2006.J.Thromb.Hemost.4:1315-1322)、具有改進的分泌特性的FVIII突變體(Miao等,2004.Blood103:3412-3419)、具有增加的輔因子特異性活性的FVIII突變體(Wakabayashi等,2005.Biochemistry44:10298-304)、具有改進的生物合成和分泌、減少的ER陪伴分子相互作用、改進的ER-高爾基體轉運、增加的活化或對失活的抗性和改進的半衰期的FVIII突變體(由Pipe2004.Sem.Thromb.Hemost.30:227-237概括)。另一個特別優選的實例是FVIII的重組形式，如在Zollner等2013,ThrombosisResearch,132:280-287中描述的。所有這些FVIII突變體和變體通過引用全文併入本文。優選地，FVIII包括如SEQIDNO:13中所示的FVIII的全長序列。還涵蓋了FVIII的添加、插入、取代、N-末端、C-末端或內部缺失，只要FVIII的生物活性被保留。如果具有修飾的FVIII保留野生型FVIII的生物活性的至少10％、優選地至少25％、更優選地至少50％、最優選地至少75％，在本發明的意義上，生物活性被保留。FVIII的生物活性可由技術人員如以下描述的確定。確定FVIII的生物活性的合適的測試是例如一階段式或二階段式凝血測定(Rizza等1982.CoagulationassayofFVIII:CandFIXainBloomed.TheHemophilias.NYChurchchillLivingston1992)或發色底物FVIII:C測定(S.Rosen,1984.ScandJHaematol33:139-145,suppl.)。這些參考文獻的內容通過引用併入本文。人類凝血FVIII的成熟野生型形式的胺基酸序列示於SEQIDNO:13中。對特定序列的胺基酸位置的提及是指FVIII野生型蛋白中所述胺基酸的位置，且不排除所提及的序列中存在其他位置處的突變例如缺失、插入和/或取代。例如，提及SEQIDNO:13的「Glu2004」中的突變不排除，在修飾的同系物中，在SEQIDNO:13的位置1至2332的一個或更多個胺基酸丟失。以上定義中的「FVIII」和/或「VWF」還包括天然等位基因變異，其可在一個個體與另一個之間存在並出現。以上定義中的「FVIII」和/或「VWF」還包括FVIII和/或VWF的變體。此類變體的一個或更多個胺基酸殘基不同於野生型序列。此類差異的實例可包括保守胺基酸取代，即具有相似特徵的胺基酸組內的取代，例如(1)小的胺基酸、(2)酸性胺基酸、(3)極性胺基酸、(4)鹼性胺基酸、(5)疏水胺基酸、和(6)芳香族胺基酸。此類保守取代的實例在表1中示出。表1(1)丙氨酸甘氨酸(2)天冬氨酸穀氨酸(3)天冬醯胺穀氨醯胺絲氨酸蘇氨酸(4)精氨酸組氨酸賴氨酸(5)異亮氨酸亮氨酸甲硫氨酸纈氨酸(6)苯丙氨酸酪氨酸色氨酸修飾的VWF本發明的修飾的VWF具有不同於野生型VWF的胺基酸序列。根據本發明，與如SEQIDNO:3中所示的野生型VWF的D'結構域的胺基酸序列相比，修飾的VWF在其D'結構域中具有至少一個胺基酸取代。修飾的VWF的D'結構域的胺基酸序列可具有相對於SEQIDNO:3的一個或更多個胺基酸取代。修飾的VWF的D'結構域的胺基酸序列優選地具有相對於SEQIDNO:3的一個或2個胺基酸取代。優選地，在SEQIDNO:3的位置1處的S被選自由以下組成的組的胺基酸取代：G、P、V、E、Y、A和L。優選地，在SEQIDNO:3的位置3處的S被選自由以下組成的組的胺基酸取代：Y、I、M、V、F、H、R和W。優選的取代組合包括S764G/S766Y、S764P/S766I、S764P/S766M、S764V/S766Y、S764E/S766Y、S764Y/S766Y、S764L/S766Y、S764P/S766W、S766W/S806A、S766Y/P769K,S766Y/P769N、S766Y/P769R和S764P/S766L。根據本發明的一個方面，本發明的多肽對FVIII的結合親和力比參考多肽高，所述參考多肽除了SEQIDNO:3中的修飾以外，具有相同的胺基酸序列。VWF分子對因子VIII分子的結合親和力可由本領域中使用的結合測定確定。例如，可將VWF分子固定在固體支持物上，施加遞增濃度的因子VIII，孵育某一時間段，和在洗滌後，用發色測定確定結合的VIII。然後親和力常數或解離常數可通過Scatchard分析或另一合適的方法確定。確定人類因子VIII對vonWillebrand因子的結合親和力的方法在Vlot等(1995),Blood,Volume85,Number11,3150-3157中描述。然而，優選地，VWF對因子VIII的親和力如本申請實施例1中描述的確定。本文對親和力的任何提及，包括解離常數，優選地是指本發明的修飾的VWF或本發明的多肽對FVIII的結合。FVIII的單鏈的胺基酸序列示於SEQIDNO:14中。由於VWF與FVIII的相互作用通常具有高的結合速率(on-rate)，解離常數的變化很大地依賴於解離速率(off-rate)的變化。因此，增加VWF與FVIII的締合的主要焦點包括降低FVIII與VWF之間的解離速率。優選地，與野生型VWF與FVIII的解離速率相比，修飾的VWF與FVIII的解離速率低至少二倍、更優選地低至少5倍、優選地低至少10倍和更優選地低至少20倍。由VWF和FVIII組成的複合物的解離常數優選地是0.2nmol/L或更少，更優選地0.175nmol/L或更少，更優選地0.15nmol/L或更少，更優選地0.125nmol/L或更少，更優選地0.1nmol/L或更少，更優選地0.05nmol/L或更少，最優選地0.01nmol/L或更少。本發明的多肽與SEQIDNO:13的因子VIII的複合物的解離常數KD通常是參考多肽(例如SEQIDNO:4的多肽)與SEQIDNO:13的因子VIII的複合物的解離常數KD的小於90％。本發明的多肽與SEQIDNO:13的因子VIII的複合物的解離常數KD優選地是參考多肽(例如SEQIDNO:4的多肽)與SEQIDNO:13的因子VIII的複合物的解離常數KD的小於75％、更優選地小於50％、更優選地小於25％、更優選地小於10％、更優選地小於5％。參考多肽是這樣的多肽：除了VWF的D'結構域內的突變以外，其胺基酸序列與本發明的多肽的相同。即，參考多肽優選地具有與本發明的多肽相同的胺基酸序列，條件是，參考多肽中的D'結構域由如SEQIDNO:3中所示的胺基酸序列組成。換言之，本發明的多肽與參考多肽之間序列的僅有差異在於D'結構域的胺基酸序列。優選地，參考多肽在與本發明的多肽相同的條件下製備。本發明的多肽可由修飾的VWF組成。在另一實施方案中，本發明的多肽包括另一胺基酸序列、優選地異源胺基酸序列。該異源胺基酸序列通常天然地不與VWF融合。本發明在其中使用具有改進的半衰期的VWF變體的情形中特別有用。這可例如通過融合VWF於人類血清白蛋白來實現。此類融合體的詳細討論在US8,575,104中提供，其公開內容通過引用併入本文。在一個實施方案中，本發明的多肽包括修飾的VWF和半衰期增強蛋白(HLEP)。優選地，HLEP是白蛋白。一種或更多種HLEP可融合到VWF的C-末端部分，優選地以使得不幹擾VWF例如對FVIII、血小板、肝素或膠原的結合能力。在一個實施方案中，修飾的VWF具有以下結構：N–VWF–C–L1-H,[式1]其中N是VWF的N-末端部分，L1是化學鍵或接頭序列H是HLEP，且C是VWF的C-末端部分L1可以是化學鍵或由一個或更多個胺基酸例如1至50、1至30、1至20、1至15、1至10、1至5或1至3(例如1、2或3)個胺基酸組成的接頭序列，且其可彼此相同或不同。通常，接頭序列在野生型凝血因子的相應位置不存在。L1中存在的合適的胺基酸包括Gly和Ser。優選的HLEP序列在以下描述。本發明類似地涵蓋對各自HLEP的準確「N-末端胺基酸」的融合體、或對各自HLEP的包括HLEP的一個或更多個胺基酸的N-末端缺失的「N-末端部分」的融合體。修飾的VWF或FVIII與本發明的修飾的VWF的複合物可包括多於一種HLEP序列，例如兩種或三種HLEP序列。這些多個HLEP序列可成串地例如作為連續的重複段融合於VWF的C-末端部分。接頭序列根據本發明，治療性多肽部分可通過肽接頭偶聯到HLEP部分。接頭應該是非免疫原性的並可以是不可裂解的或可裂解的接頭。不可裂解的接頭可包括交替的甘氨酸和絲氨酸殘基，如在WO2007/090584中示例的。在本發明的另一實施方案中，VWF部分與白蛋白部分之間的肽接頭由用作人類蛋白中的天然結構域間接頭的肽序列組成。優選地，此類肽序列在其天然環境中位於接近蛋白表面且對免疫系統可接近，使得人們可假定針對這一序列的天然耐受。實例在WO2007/090584中給出。可裂解的接頭應足夠柔性以允許被蛋白酶裂解。在優選的實施方案中，如果融合蛋白是修飾的FVIII，接頭的裂解與融合蛋白內的FVIII的活化同等快地進行。優選地，可裂解的接頭包括源自以下的序列(a)待施用的治療性多肽本身，如果其包含在治療性多肽的活化期間被蛋白水解裂解的蛋白水解裂解位點，(b)被蛋白酶裂解的底物多肽，所述蛋白酶通過治療性多肽的參與被活化或形成，或(c)參與凝血或纖維蛋白溶解的多肽。在更優選的實施方案中，接頭區域包括VWF的序列，其應導致表達的融合蛋白的新抗原(neoantigenic)性質的風險降低。優選地，接頭肽可由凝血系統的蛋白酶例如FIIa、FIXa、FXa、FXIa、FXIIa和FVIIa裂解。治療性多肽、可裂解的接頭和HLEP的示例性組合包括WO2007/090584(例如在表2和圖4中)和WO2007/144173(例如在表3a和3b)中所列的構建體，但不限於這些。半衰期增強多肽(HLEP)如本文使用的「半衰期增強多肽」選自由以下組成的組：白蛋白、白蛋白家族的成員、免疫球蛋白G的恆定區及其片段、在生理條件下能夠結合白蛋白、結合白蛋白家族的成員以及結合免疫球蛋白恆定區的部分的區域和多肽。其可以是本文描述的全長半衰期增強蛋白(例如白蛋白、白蛋白家族的成員或免疫球蛋白G的恆定區段)或能夠穩定或延長凝血因子的治療活性或生物活性的其一種或更多種片段。此類片段的長度可以是10個或更多個胺基酸，或可包括來自HLEP序列的至少約15、至少約20、至少約25、至少約30、至少約50、至少約100、或更多個連續胺基酸，或可包括各自HLEP的特定結構域的部分或全部，只要HLEP片段提供與野生型VWF相比至少25％的功能半衰期延長。本發明的提議的凝血因子插入構建體的HLEP部分可以是正常HLEP的變體。術語「變體」包括插入、缺失和取代(保守或非保守的)，其中此類變化大致上不改變賦予修飾的VWF的生物活性的活性位點或活性結構域。特別地，本發明的提議的VWFHLEP融合構建體可包括HLEP的天然存在的多態變體和HLEP的片段。HLEP可來源於任何脊椎動物，尤其是任何哺乳動物，例如人類、猴、牛(cow)、綿羊或豬。非哺乳動物HLEP包括但不限於母雞(hen)和鮭魚。作為HLEP的白蛋白朮語「人類血清白蛋白」(HSA)和「人類白蛋白」(HA)和「白蛋白」(ALB)在本申請中可互換地使用。術語「白蛋白」和「血清白蛋白」更寬，並涵蓋人類血清白蛋白(和其片段和變體)以及來自其他物種的白蛋白(和其片段和變體)。如本文使用的，「白蛋白」共同地指白蛋白多肽或胺基酸序列或具有白蛋白的一種或更多種功能活性(例如生物活性)的白蛋白片段或變體。特別地，「白蛋白」是指人類白蛋白或其片段，尤其是如本文SEQIDNO:15中所示的人類白蛋白的成熟形式，或來自其他脊椎動物的白蛋白或其片段，或這些分子的類似物或變體或其片段。特別地，本發明的提議的VWF融合構建體可包括人類白蛋白的天然存在的多態變體和人類白蛋白的片段。一般來說，白蛋白片段或變體將長至少10個、優選地至少40個、最優選地多於70個胺基酸。白蛋白變體可優先地由以下組成或可選地包括以下：白蛋白的至少一個完整結構域或所述結構域的片段，例如結構域1(SEQIDNO:15的胺基酸1-194)、2(SEQIDNO:15的胺基酸195-387)、3(SEQIDNO:15的胺基酸388-585)、1+2(SEQIDNO:15的1-387)、2+3(SEQIDNO:15的195-585)或1+3(SEQIDNO:15的胺基酸1-194+SEQIDNO:15的胺基酸388-585)。每個結構域本身由兩個同源子結構域，即1-105、120-194、195-291、316-387、388-491和512-585，以及柔性子結構域-間接頭區域構成，柔性子結構域-間接頭區域包括殘基Lys106至Glu119、Glu292至Val315和Glu492至Ala511。本發明的提議的VWF融合構建體的白蛋白部分可包括HA的至少一個子結構域或結構域或其保守修飾。在優選的實施方案中，白蛋白的N-末端融合到修飾的VWF的胺基酸序列的C-末端。即，本發明的多肽可具有以下結構：N-mVWF-C-L1-A，其中N是VWF的N-末端部分，mVWF是如本文以上定義的修飾的VWF，C是VWF的C-末端部分，L1是化學鍵或接頭序列且A是如本文以上定義的白蛋白。作為HLEP的免疫球蛋白本領域中已知免疫球蛋白G(IgG)恆定區(Fc)增加治療性蛋白的半衰期(DumontJA等2006.BioDrugs20:151-160)。重鏈的IgG恆定區由3個結構域(CH1–CH3)和鉸鏈區組成。免疫球蛋白序列可來源於任何哺乳動物，或分別來自亞類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。無抗原結合結構域的IgG和IgG片段也可被用作HLEP。治療性多肽部分優選地經由抗體的鉸鏈區或肽接頭(其甚至可以是可裂解的)連接於IgG或IgG片段。數種專利和專利申請描述治療性蛋白對免疫球蛋白恆定區的融合以增強治療性蛋白的體內半衰期。US2004/0087778和WO2005/001025描述Fc結構域或免疫球蛋白恆定區的至少部分與生物活性肽的融合蛋白，其增加該肽的半衰期，否則該肽將在體內快速被消除。描述了Fc-IFN-β融合蛋白，其實現了增強的生物活性、延長的循環半衰期和更大的溶解度(WO2006/000448)。公開了具有延長的血清半衰期和增加的體內功效的Fc-EPO蛋白(WO2005/063808)以及與G-CSF(WO2003/076567)、胰高血糖素-樣肽-1(WO2005/000892)、凝固因子(clottingfactor)(WO2004/101740)和白介素-10(US6,403,077)的Fc融合物，它們都具有半衰期增強特性。在另一實施方案中，相比於野生型VWF的功能半衰期或與野生型VWF或與如以上定義的參考多肽複合的FVIII的功能半衰期，本發明的多肽或與本發明的多肽複合的FVIII的功能半衰期延長。該增加可以是多於15％，例如至少20％或至少50％。再次地，此類功能半衰期值可在血液樣品中體外測量，所述血液樣品在施用修飾的VWF或FVIII與修飾的VWF的複合物後在不同時間間隔從所述哺乳動物獲取。在另一實施方案中，相比於野生型VWF或與野生型VWF或與如以上定義的參考多肽複合的FVIII，本發明的多肽或與本發明的多肽複合的FVIII表現出改進的體內回收。體內回收可體內確定，例如在正常動物中或在血友病A的動物模型如FVIII敲除小鼠中，其中人們將預期與對應的野生型VWF或以上定義的參考多肽相比，在i.v.施用後短時間(5至10min.)在循環中通過抗原或活性測定發現FVIII的百分比增加。與與野生型VWF複合的或與如以上定義的參考多肽複合的FVIII相比，體內回收優選地增加至少10％，更優選地至少20％，和甚至更優選地至少40％。在本發明的又另一實施方案中，免疫球蛋白恆定區或其部分用作HLEP。優選地，使用包括IgG、更優選地IgG1或其片段或變體的CH2和CH3結構域和鉸鏈區的Fc區，變體包括增強對新生兒Fc受體(FcRn)的結合的突變。多核苷酸本發明還涉及編碼如本申請中描述的修飾的VWF或包含所述修飾的VWF的多肽的多核苷酸。術語「多核苷酸」一般是指任何多聚核糖核苷酸或多聚脫氧核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。多核苷酸可以是單鏈或雙鏈DNA、單鏈或雙鏈RNA。如本文使用的術語「多核苷酸」還包括包含一個或更多個修飾的鹼基和/或不常見鹼基諸如肌苷的DNA或RNA。應理解的是，可對DNA和RNA進行用於本領域技術人員已知的許多有用目的的多種修飾。如本文採用的術語「多核苷酸」包含多核苷酸的此類化學、酶促或代謝修飾形式，以及病毒和細胞(包括例如簡單細胞和複雜細胞)特有的DNA和RNA的化學形式。本領域技術人員將理解，由於遺傳密碼的簡併性，給定的多肽可由不同的多核苷酸編碼。這些「變體」被本發明涵蓋。優選地，本發明的多核苷酸是分離的多核苷酸。術語「分離的」多核苷酸是指大致上不含其他核酸序列(諸如但不限於其他染色體和染色體外DNA和RNA)的多核苷酸。分離的多核苷酸可從宿主細胞純化。本領域技術人員已知的常規核酸純化方法可用於獲得分離的多核苷酸。該術語還包括重組的多核苷酸和化學合成的多核苷酸。本發明還涉及一組多核苷酸，其一起編碼本發明的修飾的VWF、或包含修飾的VWF的本發明的多肽。該組中的第一多核苷酸可編碼修飾的VWF的N-末端部分，且第二多核苷酸可編碼修飾的VWF的C-末端部分。本發明的又另一方面是包含根據本發明的多核苷酸的質粒或載體。優選地，該質粒或載體是表達載體。在特定實施方案中，該載體是用於人類基因療法中的轉移載體。本發明還涉及一組質粒或載體，其包含以上組的多核苷酸。第一質粒或載體可包含所述第一多核苷酸，且第二質粒或載體可包含所述第二多核苷酸。可選地，將兩種編碼序列克隆到一個表達載體中，利用兩種單獨的啟動子序列或一種啟動子和內部核糖體進入位點(IRES)元件，所述內部核糖體進入位點(IRES)元件可用於例如指導表達弗林蛋白酶以增強成熟VWF的生成。本發明的又另一方面是包含本發明的多核苷酸、質粒或載體、或如本文描述的一組多核苷酸或一組質粒或載體的宿主細胞。本發明的宿主細胞可被用在產生修飾的VWF或包含所述修飾的VWF的多肽的方法中，所述方法是本發明的一部分。該方法包括：(a)在使得期望的修飾的蛋白被表達的條件下培養本發明的宿主細胞；和(b)任選地從該宿主細胞或從培養基回收期望的修飾的蛋白。優選地，純化本發明的修飾的VWF或包含該修飾的VWF的多肽至≥80％純度、更優選地≥95％純度，且特別優選的是藥學純的狀態，其對於汙染性大分子尤其是其他蛋白和核酸是大於99.9％純的，且不含傳染性和致熱性因子。優選地，本發明的分離的或純化的修飾的VWF或本發明的多肽大致上不含其他、無關的多肽。本發明的各種產物可作為藥物有用。因此，本發明涉及包含修飾的VWF或如本文描述的包含所述修飾的VWF的多肽、本發明的多核苷酸、或本發明的質粒或載體的藥物組合物。本發明還涉及治療患有凝血障礙諸如血友病A或B或VWD的個體的方法。該方法包括向所述個體施用有效量的以下：(i)FVIII和修飾的VWF或包含修飾的VWF的多肽或(ii)FVIII與修飾的VWF的複合物或(iii)FVIII與如本文所述地包含修飾的VWF的多肽的複合物。在另一實施方案中，該方法包括向所述個體施用有效量的本發明的多核苷酸或本發明的質粒或載體。可選地，該方法可包括向所述個體施用有效量的本文描述的本發明的宿主細胞。提議的突變體的表達重組的突變體蛋白以高水平在合適的宿主細胞中的產生要求將上述的修飾的cDNA與合適的調節元件一起組裝為重組表達載體中的有效的轉錄單元，該重組表達載體可根據本領域技術人員已知的方法在各種表達系統中繁殖。有效的轉錄調節元件可來源於以動物細胞作為其天然宿主的病毒或來源於動物細胞的染色體DNA。優選地，可使用來源於猿猴病毒40、腺病毒、BK多瘤病毒、人類巨細胞病毒、或Rous肉瘤病毒的長末端重複的啟動子-增強子組合、或包括動物細胞中強組成型轉錄基因如β-肌動蛋白或GRP78的啟動子-增強子組合。為了實現從cDNA轉錄的mRNA的穩定高水平，轉錄單元應在其3』-近端部分包含編碼轉錄終止-多腺苷酸化序列的DNA區域。優選地，該序列來源於猿猴病毒40早期轉錄區域、兔β-珠蛋白基因、或人類組織纖溶酶原激活物基因。然後將cDNA整合到合適的宿主細胞系的基因組中用於修飾的FVIII和/或VWF蛋白的表達。優選地，該細胞系應是脊椎動物來源的動物細胞系，以確保正確摺疊、二硫鍵形成、天冬醯胺-連接的糖基化和其他翻譯後修飾以及分泌進入培養基。其他翻譯後修飾的實例是酪氨酸O-硫酸化和新生多肽鏈的蛋白水解加工。可以使用的細胞系的實例是猴COS-細胞、小鼠L-細胞、小鼠C127-細胞、倉鼠BHK-21細胞、人類胚胎腎293細胞和倉鼠CHO-細胞。編碼相應的cDNA的重組表達載體可以數種不同方式被引入到動物細胞系中。例如，重組表達載體可從基於不同動物病毒的載體產生。這些的實例是基於杆狀病毒、牛痘病毒、腺病毒、和優選地牛乳頭狀瘤病毒的載體。編碼相應的DNA的轉錄單元也可與另一重組基因一起被引入動物細胞，所述另一重組基因可在這些細胞中作為顯性選擇標誌起作用，以幫助分離在其基因組中已整合了重組DNA的特定細胞克隆。這一類型的顯性選擇標誌基因的實例是賦予對慶大黴素(G418)抗性的Tn5氨基糖苷磷酸轉移酶、賦予對潮黴素抗性的潮黴素磷酸轉移酶和賦予對嘌呤黴素抗性的嘌呤黴素乙醯轉移酶。編碼此類選擇標誌的重組表達載體可與編碼期望蛋白的cDNA的重組表達載體駐留在同一載體上，或其可被在單獨載體上編碼，該單獨載體被同時引入和整合到宿主細胞基因組，經常導致不同轉錄單元之間的緊密物理連接。可與期望蛋白的cDNA一起使用的選擇標誌基因的其他類型是基於編碼二氫葉酸還原酶(dhfr)的各種轉錄單元。將這一類型的基因引入缺乏內源dhfr活性的細胞(優先地CHO-細胞(DUKX-B11、DG-44))，其將使得這些能夠生長在缺少核苷的培養基中。此類培養基的一個實例是無次黃嘌呤、胸苷和甘氨酸的Ham’sF12。這些dhfr-基因可與FVIIIcDNA轉錄單元一起引入到以上類型的CHO-細胞中，它們被連接在同一載體上或在不同的載體上，從而創建產生重組蛋白的dhfr-陽性細胞系。如果將以上細胞系在細胞毒性dhfr-抑制劑氨甲喋呤的存在下生長，將出現對氨甲喋呤抗性的新細胞系。由於擴增量的連接的dhfr和期望蛋白的轉錄單元，這些細胞系可以增加的比率產生重組蛋白。當在遞增濃度的氨甲喋呤(1-10000nM)中繁殖這些細胞系時，可獲得以非常高的速率產生期望蛋白的新細胞系。產生期望蛋白的以上細胞系可以以懸浮培養物或在各種固體支持物上大規模生長。這些支持物的實例是基於葡聚糖或膠原基質的微載體、或呈中空纖維或各種陶瓷材料形式的固體支持物。當在細胞懸浮培養中或在微載體上生長時，以上細胞系的培養可作為浴式培養或作為灌注培養進行，並經長時間的持續產生條件培養基。因此，根據本發明，以上細胞系充分適合於用於產生期望的重組突變體蛋白工業方法的開發。純化和配製在以上類型的分泌細胞的培養基中累積的重組修飾的VWF蛋白，可由多種生化和色譜方法濃縮和純化，所述方法包括利用期望蛋白與細胞培養基中的其他物質之間在尺寸、電荷、疏水性、溶解度、比親和性等方面的差異的方法。此類純化的一個實例是將重組突變體蛋白吸附到被固定於固體支持物上的單克隆抗體，所述抗體是針對例如HLEP、優選地人類白蛋白，或針對各自的凝血因子。在將修飾的VWF吸附到支持物、洗滌和解吸後，蛋白可基於以上性質由多種色譜技術進一步純化。根據例如步驟的能力和選擇性、支持物的穩定性或其他方面，選擇純化步驟的順序。優選的純化步驟包括但不限於離子交換色譜步驟、免疫親和色譜步驟、親和色譜步驟、疏水作用色譜步驟、染料色譜步驟、羥基磷灰石色譜步驟、多峰色譜步驟、和尺寸排阻色譜步驟。為了使病毒汙染的理論風險最小化，可在方法中包括允許有效滅活或消除病毒的另外的步驟。此類步驟例如是以液態或固態的熱處理，用溶劑和/或去垢劑處理，以可見光譜或UV光譜放射，γ-放射或納米過濾。本發明的修飾的多核苷酸(例如DNA)還可被整合到轉移載體中，用於在人類基因療法中使用。本文描述的各種實施方案可彼此組合。本發明將在以下其實施例中更詳細地進一步描述。本發明的具體實施方案的這一描述將聯合附圖進行。如本發明描述的修飾的VWF可被配製成用於治療用途的藥物製品。可將純化的蛋白溶解在常規的生理相容的含水緩衝溶液中，任選地可向其加入藥物賦形劑以提供藥物製品。此類藥物載體和賦形劑以及合適的藥物製劑是本領域公知的(參見例如「PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins」,Frokjaer等,Taylor&Francis(2000)或「HandbookofPharmaceuticalExcipients」,3rdedition,Kibbe等,PharmaceuticalPress(2000))。標準的藥物配製技術是本領域技術人員公知的(參見例如，2005Physicians』DeskThomsonHealthcare:Montvale,NJ,2004；Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thed.,Gennaro等,Eds.LippincottWilliams&Wilkins:Philadelphia,PA,2000)。特別地，包含本發明的多肽變體的藥物組合物可配製為凍幹或穩定的液體形式。多肽變體可由本領域已知的多種程序凍幹。凍幹的製劑在使用前通過加入一種或更多種藥學上可接受的稀釋劑諸如無菌的注射用水或無菌的生理鹽水溶液來重構。組合物的製劑通過任何藥學上合適的施用方式遞送至個體。各種遞送系統是已知的並可用於通過任何方便的途徑施用組合物。優先地，本發明的組合物系統地施用。對於系統使用，將本發明的蛋白配製成根據常規方法腸胃外(例如靜脈內、皮下、肌內、腹膜內、腦內、肺內、鼻內或經皮)或腸內(例如口、陰道或直腸)遞送。最優先的施用途徑是靜脈內和皮下施用。製劑可通過輸注或通過彈丸注射連續施用。一些製劑包含緩釋系統。本發明的蛋白以治療有效劑量施用至患者，治療有效劑量是指這樣的劑量：足以產生期望的效應、阻止或減輕被治療的狀況或適應症的嚴重度或擴散，而不達到產生不可忍受的不利副作用的劑量。準確劑量依賴於許多因素如例如適應症、製劑和施用方式，並必須在臨床前和臨床試驗中對每種各自的適應症確定。本發明的藥物組合物可單獨或與其他治療劑聯合施用。這些劑可被摻入作為同一藥物的一部分。此類劑的一個實例是修飾的VWF和FVIII的組合。在本文提到的序列的概述在表2中列出。表2SEQIDNO:描述1編碼SEQIDNO:2的DNA的核苷酸序列2人類VWF前-原多肽的胺基酸序列3人類VWF的D'結構域的胺基酸序列4成熟人類VWF的胺基酸序列5S764G/S766Y6S764P/S766I7S764P/S766M8S764V/S766Y9S764E/S766Y10S764Y/S766Y11S764L/S766Y12S764P/S766W13S766W/S806A14S766Y/P769K15S766Y/P769N16S766Y/P769R17S764P/S766L18人類因子VIII的胺基酸序列19成熟單鏈因子VIII的胺基酸序列20人類血清白蛋白的胺基酸序列實施例實施例1具有改進的FVIII結合的vWF點突變體背景如以上討論的，循環FVIII的大部分與VWF複合。在人類中，在VWF的不存在和存在下，FVIII分別以大約2hr和16hr的t1/2從血液清除。儘管VWF給予FVIII半衰期的增加，其還對t1/2設置了由其自身的半衰期規定的上限。US8,575,104公開了VWF-白蛋白融合蛋白。這一融合蛋白在齧齒動物模型中具有比野生型VWF長五倍的半衰期。這一融合蛋白與FVIII之間的穩定複合物可為FVIII賦予另外的半衰期益處。儘管FVIII/vWF相互作用的平衡結合常數是高的，結合動力學是快速的且與VWF-白蛋白融合蛋白複合的任何FVIII將在輸注後快速地被內源vWF更換。因此，如果FVIII與VWF-白蛋白融合物的解離速率大致上等同於FVIII與天然VWF的解離速率，則VWF-白蛋白融合物的使用將不提供FVIII的半衰期方面的任何實質增加。因此，為了利用VWF-白蛋白融合物的較長半衰期來延長FVIII的半衰期，降低FVIII與VWF-白蛋白融合物的解離速率是必需的。從利用在2N型vonWillebrand病患者(其中VWF的水平正常但VWF與FVIII締合的能力嚴重減小)中進行測量的建模研究，已經估計，需要解離速率的至少五倍減少以提供FVIII的臨床相關改進。FVIIIVWF-白蛋白融合物解離速率的減少與FVIII半衰期的增加之間的假定關係在表3中列出。表3在減少FVIIIVWF-白蛋白融合物解離速率的試圖中，進行了實驗以評估突變的VWF-白蛋白融合蛋白是否可提供顯著減慢的FVIII解離速率，從而提供經由與VWF-白蛋白融合蛋白的穩定締合，延長FVIII的半衰期的可行選項。在vWF的大約胺基酸位置764、765、766、768、769、773、806和809構建了一系列突變體，意圖是減慢結合的FVIII的解離速率。在這些實驗中，使用了FVIII的重組形式。這一FVIII描述在Zollner等2013,ThrombosisResearch,132:280-287中。最初，對vWF構建體測量FVIII結合，所述vWF構建體有以上提到的殘基之一被突變為所有遺傳編碼的胺基酸(半胱氨酸除外)。鑑定改進的結合物之後，產生包括突變的組合的變體的另外的組。此外，由於由白蛋白融合物提供的半衰期延長依賴於FcRn介導的再循環，還在pH5.5測試了許多突變體。各種突變的結果在表4至19中示出。方法編碼人類vonWillebrand因子的D'和D3結構域(vWF；胺基酸(aa)764-1270；基於GenBank登錄號NP_000543和由Zhou等2012Blood120:449-458闡述的結構域邊界)的合成的、密碼子優化的cDNA從GeneARTAG(Regensberg,Germany)獲得。其在5'末端被修飾以編碼其自身的信號肽(aa1-22)且在3'末端被修飾以編碼C-末端8xHis-標籤。將該構建體(Hu-vWF[764-1270]-8His)定向地克隆到pcDNA3.1哺乳動物表達載體(Invitrogen,USA)中，該載體具有在起始甲硫氨酸的上遊的Kozak共有序列(GCCACC)和在開放閱讀框的3'端的雙終止密碼子(TGA)，並通過自動測序證實質粒序列。然後將這一表達質粒用作模板，利用標準PCR技術製造在Ser764、Leu765、Ser766或Lys773處的單殘基、雙殘基或三殘基改變，將構建體克隆到pcDNA3.1並如以上所述地測序。還合成了編碼Hu-vWF的D1和D2結構域(aa1-762)、具有C-末端FLAG標籤(DYKDDDDK)的第二密碼子優化的cDNA並從GeneArt獲得；將其如以上地克隆到pcDNA3.1中並測序。對於瞬時哺乳動物表達，將FreestyleTM293懸浮細胞(Invitrogen)在5mlFreestyle表達培養基(Invitrogen)中生長至1.1x106細胞/ml。將7μL293Fectin(Invitrogen)轉染試劑與167μLOpti-MEMI培養基(Invitrogen)預孵育5分鐘,然後加入到2.5μg編碼野生-型/突變體u-vWF[764-1270]-8His的質粒DNA加2.5μg編碼Hu-vWF[1-762]-FLAG的質粒DNA中，並將混合物孵育另外20分鐘。將DNA-293Fectin複合物加入到細胞，將其在37℃,8％CO2在以250rpm搖動的培養箱中培養6天。通過在2000rpm離心5分鐘收穫培養上清液並在4℃儲存用於分析。通過在37℃使用Biacore4000生物傳感器通過表面等離子體共振研究結合動力學。每種突變體被從細胞培養基捕獲到固定有抗His抗體(14,000RU)的CM-5傳感器晶片上至40-150RU的密度。在初始篩選研究中，將FVIII以1nM注入到被捕獲的突變體上持續5分鐘，並監測解離5分鐘。然後對相對於野生型顯示kd減少的突變體，用FVIII以1、0.5和0.25nM注入持續5分鐘來再次檢查，並監測解離30分鐘。所有傳感圖通過從參考點(僅包含固定的抗His抗體)和從空白注入減去信號來雙重參考。通過將雙重參考的傳感圖擬合於1:1動力學模型來確定結合動力學。結果絲氨酸764向脯氨酸的誘變生成了具有解離速率的大約3.5倍減少和親和力的4.4倍增加的vWF變體。在位置765處的突變不產生相對於野生型vWF任何更好的結合物。在位置766處的許多突變生成具有改進的解離速率特徵和比野生型vWF更高的親和力的變體vWF分子(His、Arg、Val、Tyr、Trp、Thr、Phe、Ile、Gln、Gly&Asn)。考慮到，在位置764處的脯氨酸對解離速率賦予顯著改進，且在位置766處的許多突變積極地影響結合，生成了由S764P和在位置766處除了半胱氨酸以外的所有其他遺傳編碼胺基酸組成的一系列突變體。產生了包含S764P和在位置765處除了半胱氨酸以外的所有其他遺傳編碼胺基酸的類似突變。這些雙重突變體的許多具有相對於野生型vWF顯著減緩的解離速率和更高的親和力。特別是，S764P與S766I組合生成了具有大約22倍減的少解離速率和30倍增加的親和力的vWF變體。實施例2具有點突變的人類血清白蛋白vWF融合物和FVIII結合利用標準NHS/EDC偶聯化學反應將小鼠抗-HSA抗體固定在CM5晶片上。通常，固定水平在10,000至12,000RU之間。將每批vWF-HSA(單體和二聚體)以範圍從0.1-1μg/ml的不同濃度捕獲在每個流通池中的單個點上持續2分鐘。捕獲水平範圍從40-150RU。其中使用固定了抗-vWF，但未無捕獲的vWF-HSA的相鄰點用作參考。捕獲每周期進行，隨後FVIII結合分析。依賴於相互作用的親和力和分析的pH，FVIII隨機地和以一式兩份對所有流通池中的所有點以不同濃度注入。對FVIII的締合和解離監測持續最適合發生相互作用的不同時間框。解離階段後，通過30秒鐘注入25mM甘氨酸pH2.6來再生表面。期間的運行緩衝液為10mMHEPES、150mMNaCl、10mM檸檬酸Na、2.5mMCaCl2、0.1％BSA,pH7.3和pH5，而流速為30μl/min。在37℃測量每種相互作用4次(n＝4)。將對參考點結合的響應從vWF-HSA捕獲點的那些響應減去。然後將來自空白注入的響應從所有其他樣品的那些響應減去以產生雙重參考的傳感圖。將雙重參考的傳感圖擬合於1:1動力學模型，包括用於質量傳遞限制(masstransportlimitation)的項。將締合和解離速率全局地擬合且Rmax局部地擬合。獲得的結果在表20和表21中列出。表4表5N/D：弱的結合、差的擬合、快的解離速率表6N/D：弱的結合、差的擬合、快的解離速率表7突變體Ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)WT-K773T1.42E+076.97E-044.92E-11WT-K773A5.81E+068.83E-041.52E-10WT-K773L1.88E+071.10E-035.86E-11WT-K773R1.45E+071.23E-038.46E-11WT-K773Q8.60E+061.45E-031.68E-10WT-K773M1.57E+072.35E-031.50E-10WT-K773S1.35E+073.23E-032.40E-10WT-K773P9.58E+063.33E-033.48E-10WT-K773I7.66E+074.09E-035.35E-11WT-K773V5.39E+075.23E-039.70E-11WT-K773H1.19E+091.57E-011.32E-10WT-K773N3.61E+098.36E-012.32E-10WT-K773WN/DWT-K773EN/DWT-K773DN/DWT-K773GN/DWT-K773FN/DWT-K773YN/DWT7.33E+061.15E-031.57E-10N/D：存在結合，但不能確定準確的動力學參數表8N/D：弱的結合、差的擬合、快的解離速率表9N/D：弱的結合、差的擬合、快的解離速率表10突變體ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)S764P-K773R6.39E+067.42E-051.16E-11S764P-K773T4.68E+067.50E-051.60E-11S764P-K773Q4.44E+061.28E-042.88E-11S764P-K773V1.55E+071.57E-041.01E-11S764P-K773I1.79E+071.69E-049.43E-12S764P-K773M1.58E+071.70E-041.08E-11S764P-K773A6.37E+061.89E-042.97E-11S764P-K773S2.16E+073.06E-041.42E-11S764P-K773N5.50E+063.47E-046.31E-11S764P-K773P2.26E+075.01E-042.22E-11S764P-K773L4.60E+055.72E-041.24E-09S764P-K773H1.65E+076.36E-043.86E-11S764P-K773G1.75E+077.62E-044.36E-11S764P-K773F1.02E+071.23E-031.21E-10S764P-K773Y1.63E+071.36E-038.35E-11S764P-K773D1.77E+072.40E-031.36E-10S764P-K773W1.25E+073.21E-032.57E-10S764P-K773E6.73E+075.15E-037.65E-11WT7.33E+061.15E-031.57E-10表11突變體ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)S766Y-K773T1.20E+072.69E-042.24E-11S766Y-K773L1.79E+073.45E-041.92E-11S766Y-K773R1.40E+074.69E-043.35E-11S766Y-K773I8.02E+065.69E-047.10E-11S766Y-K773M1.97E+076.59E-043.35E-11S766Y-K773V1.74E+078.61E-044.94E-11S766Y-K773Q2.39E+079.39E-043.93E-11S766Y-K773A1.88E+071.22E-036.51E-11S766Y-K773S1.75E+071.38E-037.85E-11S766Y-K773G6.02E+071.97E-033.27E-11S766Y-K773P2.16E+072.43E-031.12E-10S766Y-K773F2.05E+073.24E-031.58E-10S766Y-K773W2.93E+073.93E-031.34E-10S766Y-K773Y2.24E+074.04E-031.80E-10S766Y-K773E1.84E+074.81E-032.61E-10S766Y-K773N5.15E+075.07E-039.84E-11S766Y-K773H5.47E+076.20E-031.14E-10S766Y-K773D1.25E+084.27E-023.43E-10WT7.33E+061.15E-031.57E-10表12突變體ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)S764G/S766Y1.37E+072.69E-051.96E-12S764V/S766Y2.99E+076.41E-052.15E-12S764A/S766Y2.98E+077.21E-052.42E-12S764E/S766Y1.97E+077.64E-053.87E-12S764P-S766Y1.08E+077.71E-057.16E-12S764Y/S766Y3.19E+077.88E-052.47E-12S764L/S766Y3.52E+077.99E-052.27E-12S764N/S766Y1.28E+078.88E-056.92E-12S764R/S766Y3.23E+079.20E-052.85E-12S764F/S766Y7.68E+069.36E-051.22E-11S764I/S766Y1.03E+079.52E-059.23E-12S764W/S766Y8.88E+069.67E-051.09E-11S764M/S766Y7.15E+061.03E-041.44E-11S764Q/S766Y1.19E+071.09E-049.18E-12S764D/S766Y3.78E+071.18E-043.12E-12S764T/S766Y2.58E+071.36E-045.27E-12S764H/S766Y4.56E+072.92E-046.39E-12S764K/S766Y1.89E+078.22E-044.35E-11WT7.33E+061.15E-031.57E-10表13突變體ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)S764P-L765H-S766I1.56E+066.60E-054.24E-11S764P-L765V-S766I5.62E+071.16E-042.07E-12S764P-L765M-S766I5.69E+071.37E-042.41E-12S764P-L765W-S766I1.11E+061.46E-041.32E-10S764P-L765Q-S766I1.15E+062.86E-042.48E-10S764P-L765K-S766I6.88E+071.50E-032.18E-11S764P-L765Y-S766I5.17E+071.90E-033.67E-11S764P-L765T-S766I1.15E+083.31E-032.87E-11S764P-L765I-S766I6.34E+061.03E-021.62E-09S764P-L765G-S766I5.04E+071.22E-022.41E-10S764P-L765R-S766I7.96E+071.73E-022.18E-10S764P-L765E-S766I1.03E+065.50E-025.36E-08S764P-L765F-S766IN/DS764P-L765N-S766IN/DS764P-L765D-S766IN/DS764P-L765P-S766IN/DS764P-L765S-S766IN/DS764P-L765A-S766IN/DN/D：存在結合，但不能確定準確的動力學參數表14突變體ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)dupS764/S764P/S766I6.23E+061.59E-032.55E-10dupS764/S764P/S766I1.25E+072.50E-031.99E-10dS764-dL765-S766IdS764-dL765-S766YN/DdelS764-S766Y6.20E+062.07E-043.34E-11delS764-S766W6.60E+063.15E-044.78E-11delS764-S766L6.21E+065.85E-049.42E-11delS764-S766M7.25E+067.26E-041.00E-10delS764-S766I7.09E+068.27E-041.17E-10delS764-S766S7.30E+068.46E-041.16E-10N/D：存在結合，但不能確定準確的動力學參數表15N/D：存在結合，但不能確定準確的動力學參數表16表17N/D：存在結合，但不能確定準確的動力學參數表18表19表20表21序列表傑特有限公司修飾的VonWillebrand因子A18718442DNA智人（Homosapiens）1atgattcctgccagatttgccggggtgctgcttgctctggccctcattttgccagggacc60ctttgtgcagaaggaactcgcggcaggtcatccacggcccgatgcagccttttcggaagt120gacttcgtcaacacctttgatgggagcatgtacagctttgcgggatactgcagttacctc180ctggcagggggctgccagaaacgctccttctcgattattggggacttccagaatggcaag240agagtgagcctctccgtgtatcttggggaattttttgacatccatttgtttgtcaatggt300accgtgacacagggggaccaaagagtctccatgccctatgcctccaaagggctgtatcta360gaaactgaggctgggtactacaagctgtccggtgaggcctatggctttgtggccaggatc420gatggcagcggcaactttcaagtcctgctgtcagacagatacttcaacaagacctgcggg480ctgtgtggcaactttaacatctttgctgaagatgactttatgacccaagaagggaccttg540acctcggacccttatgactttgccaactcatgggctctgagcagtggagaacagtggtgt600gaacgggcatctcctcccagcagctcatgcaacatctcctctggggaaatgcagaagggc660ctgtgggagcagtgccagcttctgaagagcacctcggtgtttgcccgctgccaccctctg720gtggaccccgagccttttgtggccctgtgtgagaagactttgtgtgagtgtgctgggggg780ctggagtgcgcctgccctgccctcctggagtacgcccggacctgtgcccaggagggaatg840gtgctgtacggctggaccgaccacagcgcgtgcagcccagtgtgccctgctggtatggag900tataggcagtgtgtgtccccttgcgccaggacctgccagagcctgcacatcaatgaaatg960tgtcaggagcgatgcgtggatggctgcagctgccctgagggacagctcctggatgaaggc1020ctctgcgtggagagcaccgagtgtccctgcgtgcattccggaaagcgctaccctcccggc1080acctccctctctcgagactgcaacacctgcatttgccgaaacagccagtggatctgcagc1140aatgaagaatgtccaggggagtgccttgtcacaggtcaatcacacttcaagagctttgac1200aacagatacttcaccttcagtgggatctgccagtacctgctggcccgggattgccaggac1260cactccttctccattgtcattgagactgtccagtgtgctgatgaccgcgacgctgtgtgc1320acccgctccgtcaccgtccggctgcctggcctgcacaacagccttgtgaaactgaagcat1380ggggcaggagttgccatggatggccaggacgtccagctccccctcctgaaaggtgacctc1440cgcatccagcatacagtgacggcctccgtgcgcctcagctacggggaggacctgcagatg1500gactgggatggccgcgggaggctgctggtgaagctgtcccccgtctatgccgggaagacc1560tgcggcctgtgtgggaattacaatggcaaccagggcgacgacttccttaccccctctggg1620ctggcggagccccgggtggaggacttcgggaacgcctggaagctgcacggggactgccag1680gacctgcagaagcagcacagcgatccctgcgccctcaacccgcgcatgaccaggttctcc1740gaggaggcgtgcgcggtcctgacgtcccccacattcgaggcctgccatcgtgccgtcagc1800ccgctgccctacctgcggaactgccgctacgacgtgtgctcctgctcggacggccgcgag1860tgcctgtgcggcgccctggccagctatgccgcggcctgcgcggggagaggcgtgcgcgtc1920gcgtggcgcgagccaggccgctgtgagctgaactgcccgaaaggccaggtgtacctgcag1980tgcgggaccccctgcaacctgacctgccgct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