作為診斷、預後和治療肝細胞癌(hcc)的目標的顆粒體蛋白－內皮素前體(gep)超表達的製作方法

2023-05-29 00:00:11 2

專利名稱：：作為診斷、預後和治療肝細胞癌(hcc)的目標的顆粒體蛋白－內皮素前體(gep)超表達的製作方法貫穿該申請，參考了特定的出版物。這些出版物的全部引用，以及另外的參考文獻，就在權利要求之前可以找到。為了更全面地描述在此所述和所要求的本發明申請時為止的技術狀況，在此將這些出版物的公開內容引入該申請中作為參考。
背景技術：
：肝細胞癌(HCC)是世界上第五大最常見的癌症，每年約有五十萬新病例和幾乎同樣多的死亡1-3。更好地理解發病因素和疾病的分子基礎是疾病預防和控制的關鍵。流行病學研究已經表明B肝和C肝病毒感染，乙醇誘導的肝損傷和食用黃麴黴毒素與HCC密切相關。然而，關於肝癌產生和進展的分子基礎知道得很少。認為p53腫瘤抑制基因作為「細胞看門人」起著主要作用，而β-連鎖蛋白致癌基因反常最近已經證明了腫瘤轉變潛能2-4。然而，肝致癌作用中的主要生長因子基本上是未知的。最近已經鑑定了HCC和鄰接HCC肝組織之間不同表達的基因5。顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)是HCC中高度表達基因之一，具有17q21.32的基因座。GEP蛋白是能夠刺激細胞增殖的分泌蛋白6，且其降低的表達與致瘤潛能的抑制相關7，8。在30-60％的肝癌中檢測到17q的染色體增大9.10，強烈表明該染色體臂上生長因子/原-致癌基因的存在。沒有研究報導過HCC中的GEP表達模式及其生物作用。該研究中，測定了HCC，鄰接HCC的肝組織，和正常肝組織中的RNA水平和蛋白質中的GEP定位。發明概述本發明提供了測定試劑是否導致細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白表達降低的方法，包括步驟(a)在試劑不存時容許GEP蛋白表達的條件下，將細胞接觸試劑；(b)合適的時間段後，測定細胞中GEP蛋白的表達量；和(c)將步驟(b)中測定的表達量和試劑不存在下產生的表達量相比較，藉此試劑存在下降低的表達量表明試劑導致GEP蛋白表達的降低。本發明進一步提供了測定試劑是否導致細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)活性降低的方法，包括步驟(a)在試劑不存時容許GEP蛋白活性的條件下，將細胞接觸試劑；(b)測定細胞中GEP蛋白的活性量；和(c)將步驟(b)中測定的活性量和試劑不存在下產生的活性量相比較，藉此試劑存在下降低的活性量表明試劑導致GEP蛋白活性的降低。本發明還提供了降低細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)表達的方法，包括將特異性幹擾細胞中GEP蛋白表達的試劑引入細胞中。本發明還提供了測定個體是否受到肝細胞癌(HCC)折磨的方法，包括步驟(a)測定個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白的表達水平；(b)測定個體正常肝細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白的表達水平；和(c)將步驟(a)中測定的表達水平和步驟(b)中測定的表達水平相比較，其中步驟(a)中較高的表達水平表明個體受到HCC的折磨。本發明還提供了測定個體是否受到肝細胞癌(HCC)折磨的方法，包括步驟(a)測定個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白的表達水平；和(b)將步驟(a)中測定的表達水平與健康者正常肝細胞中的GEP蛋白表達水平相比較，其中步驟(a)中較高的表達水平表明個體受到HCC的折磨。本發明還提供了測定個體是否受到肝細胞癌(HCC)折磨的方法，包括以下步驟(a)測定個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)編碼mRNA的量；(b)測定個體正常肝細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)編碼mRNA的量；和(c)將步驟(a)中測定的mRNA量和步驟(b)中測定的mRNA量相比較，其中步驟(a)中較高的量表明個體受到HCC的折磨。本發明還提供了測定個體是否受到肝細胞癌(HCC)的折磨，包括步驟(a)測定個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)編碼mRNA的量；和(b)將步驟(a)中測定的mRNA量和健康者正常肝細胞中發現的GEP編碼mRNA的量，其中步驟(a)中較大的mRNA量表明個體受到HCC的折磨。本發明進一步提供了治療受肝細胞癌(HCC)折磨的個體的方法，包括將治療有效量的特異性幹擾個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白表達的試劑給藥於個體。附圖簡述圖1A-D人肝臟樣品中的GEP表達。(A)通過實時RT-PCR的RNA定量。框頂部和底部的水平線各自表示第25個和第75個百分位。框內的線表示中值。頂部和底部水平條表示內四分位數範圍1.5倍內的數據。(B-D)GEP的免疫組織化學染色。具有蛋白質信號值3的HCC(B)，具有蛋白質分值0的鄰接於HCC的肝臟(C)，和具有蛋白質分值0的正常肝組織(D)。圖2A-DHCC中GEP和p53蛋白質的定位。(A)GEP蛋白染色。由箭頭表示(×40放大倍數)具有強烈GEP表達的腫瘤部位。(B)p53蛋白染色。由箭頭來表示具有p53核表達的腫瘤部位(×40)。(C)框內部分擴大放大倍數的GEP蛋白染色(×200)。(D)框內部分擴大放大倍數的p53蛋白染色(×200)。將蛋白信號染成棕色，用蘇木精將剖面反染色。圖3A-C降低的GEP水平降低了細胞增殖速率和細胞活性。在含有血清或血清限制的條件下檢測Hep3B和Huh7細胞的轉染子△載體對照(V)，π反義(AS)，■全長(FL)，□正義對照(S)，和◆親本細胞系。(A)GEP蛋白水平。(B)細胞生長曲線。(C)通過MTT測試的細胞活性。圖4A-C降低的GEP水平降低了腫瘤的入侵能力，集落形成能力和致瘤潛力。(A)通過Matrigel入侵室來測定細胞的入侵能力。(B)軟瓊脂上的集落形成能力。(C)在無胸腺裸鼠中的致瘤潛力。發明詳述定義如本申請中所用的，除了在此另外明確地規定，以下每個術語具有以下所示的意思。如在此所用的，可以使用本領域那些技術人員已知的各種方法和傳送系統中的任一種來實現或進行「給藥」試劑。例如可以靜脈內，通過腦脊髓液，口服，通過鼻，通過植入，經黏膜，經皮，肌內和皮下來進行給藥。如在此所用的，「試劑」意思是任何化學物質，包括而無限制，蛋白質，抗體，核酸，小分子及其任意的混合物。如在此所用的，「抗體」包括，例如，天然產生的和非天然產生的抗體。特別地，該術語包括多克隆和單克隆抗體，及其抗原結合片段。此外，該術語包括嵌合抗體(例如人化抗體)和完全合成的抗體，及其抗原結合片段。如在此所用的，「反義分子」意思是任何核酸，將該核酸引入細胞時(直接或通過另一直接引入細胞的核酸的表達)，特異性地與細胞中編碼表達受到抑制的蛋白質(即目標蛋白)的mRNA的至少一部分雜交，因此抑制目標蛋白的表達。如在此所用的，「DNA酶(DNAzyme)」意思是其是DNA或其催化部分是DNA的催化核酸，其特異性地識別並分裂特殊的目標核酸序列，其可以是DNA或RNA。每個DNA酶具有催化部分(也稱為「催化結構域」)和由兩個結合結構域構成的目標序列結合部分，催化結構域的每個側面上一個。如在此所用的，「藥物學上可接受的載體」意思是本領域那些技術人員已知的各種載體中的任一種。以下的傳送系統，其使用各種常用的藥物載體，只是預想的用於給藥本發明組合物的許多實施方案的表示。可注射的藥物傳送系統包括溶液，懸浮液，凝膠，微球體和聚合的可注射物，並可以包括賦形劑，如改變溶解度的試劑(例如乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如聚辛基丙酮和PLGA’s)。可植入系統包括棒和盤，並可以含有賦形劑，如PLGA和聚辛基丙酮。口服傳送系統包括片劑和膠囊。這些可以含有賦形劑，如粘合劑(例如，羥丙基甲基纖維素，聚丙烯吡咯烷酮，其他纖維素物質和澱粉)，稀釋劑(例如，乳糖和其他糖，澱粉，磷酸氫鈣和纖維素物質)，崩解劑(例如，澱粉聚合物和纖維素物質)和潤滑劑(例如硬脂酸鹽和滑石)。經黏膜的傳送系統包括藥膏，片劑，栓劑，陰道栓，凝膠和霜劑，並可以含有賦形劑，如增溶劑和促進劑(例如，聚丙二醇，膽汁鹽和胺基酸)，和其他載體(例如，聚乙二醇，脂肪酸酯和衍生物，以及親水性聚合物，如羥丙基甲基纖維素和透明質酸)。皮膚傳送系統包括，例如，水和非水凝膠，霜劑，多重乳濁液，微乳濁液，脂質體，膏劑，水和非水溶液，洗劑，氣溶膠，烴基和粉末，並可以含有賦形劑，如穩定劑，滲透增強劑(例如，脂肪酸，脂肪酸酯，脂肪醇和胺基酸)，和親水性聚合物(例如聚卡波糖和聚乙烯吡咯烷酮)。一實施方案中，藥物學上可接受的載體是脂質體或透皮增強劑。用於重建傳送系統的溶液，懸浮液和粉末包括載體，如懸浮劑(例如，樹膠，zanthan，纖維素和糖)，溼潤劑(例如，山梨糖醇)，穩定劑(例如，乙醇，水，PEG和聚丙二醇)，表面活性劑(例如，十二烷基磺酸鈉，司盤，吐溫和十六烷基吡啶)，防腐劑和抗氧化劑(例如，對羥基苯甲酸酯，維生素E和C，以及抗壞血酸)，抗結塊劑，塗層劑和螯合劑(例如，EDTA)。如在此所用的，「核酸」意思是任何核酸分子，包括但不限於，DNA，RNA及其雜交體。形成核酸分子的核酸鹼基可以是鹼基A，C，G，T和U，及其衍生物。這些鹼基的衍生物是本領域公知的並在PCRSystems，ReagentsandConsumables(PCR系統，反應物和消耗品)(PerkinElmerCatalogue1996-1997，RocheMolecularSystems，Inc，Branchburg，NewJersey，USA)中有舉例說明。如在此所用的，「核酶(ribozyme)」意思是其是RNA或其催化部分是RNA的催化核酸分子，其特異性地識別和分裂特殊的目標核酸序列，其可以是DNA或RNA。每個核酶具有催化部分(也稱為「催化結構域」)和由兩個結合結構域構成的目標序列結合部分，催化結構域的每個側面上一個。如在此所用的，「小的幹擾RNA」(也稱為siRNA或RNAi)包括但無限制，與目標基因(或其片段)相同或同源的多核苷酸序列，該目標基因(或其片段)直接或間接地連接與目標基因(或其片段)序列互補的多核苷酸序列。siRNA任意地包括足夠長度的多核苷酸連接物序列以允許兩個多核苷酸序列摺疊並相互雜交。設計連接物序列來分隔siRNA的反義和正義鏈，足以限制位阻的影響並允許dsRNA分子的形成，不與dsRNA分子雜交部分內的序列雜交。例如，在U.S.專利No.6,544,783中論述了siRNA。如在此所用的，「個體」意思是任何動物，如人，非人靈長類，小鼠，大鼠，豚鼠或兔子。如在此所用的，「合適的時間段」意思是對於本方法，足以允許試劑效果的時間量。如在此所用的，「治療有效量」意思是足以治療受肝細胞癌(HCC)折磨個體的量。如在此所用的，「治療」肝細胞癌(HCC)意思是減緩，停止或逆轉疾病的進程。發明的實施方案本發明提供了測定試劑是否導致細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白表達降低的方法，包括步驟(a)在試劑不存時容許GEP蛋白表達的條件下，將細胞接觸試劑；(b)合適的時間段後，測定細胞中GEP蛋白的表達量；和(c)將步驟(b)中測定的表達量和試劑不存在下產生的表達量相比較，藉此試劑存在下降低的表達量表明試劑導致GEP蛋白表達的降低。一實施方案中，細胞存在於細胞培養物中。另一實施方案中，細胞是腫瘤細胞。再一實施方案中，通過測定細胞中GEP蛋白編碼mRNA的量來進行表達量的測定。另一實施方案中，通過測定細胞中的GEP蛋白量來測定表達量。使用GEP蛋白特異性抗體來進行細胞中GEP蛋白量的測定。本發明進一步提供了測定試劑是否導致細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白活性降低的方法，包括步驟(a)在試劑不存時容許GEP蛋白活性的條件下，將細胞接觸試劑；(b)測定細胞中GEP蛋白的活性量；和(c)將步驟(b)中測定的活性量與試劑不存在下產生的活性量相比較，藉此試劑存在下降低的活性量表明該試劑導致GEP蛋白的活性降低。一實施方案中，細胞存在於細胞培養物中。另一實施方案中，細胞是腫瘤細胞。本發明還提供了降低細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白表達的方法，包括將特異性幹預細胞中GEP蛋白表達的試劑引入細胞中。一實施方案中，細胞存在於細胞培養物中或是腫瘤細胞。另一實施方案中，試劑是核酸。核酸可以是，但不限於，小的幹擾RNA，核酶，DNA酶或反義分子。反義分子可以包括如SEQIDNO5中所示的核酸序列GAAGGGGCAGCAACTGGAAGTCCCTGAGACGGTAAAGATGCAGGAGTGGCCGGCAGAGCAGTGGGCATCAACCTGGCAGGGGCCACCCAGATGCCTGCTCAGTGTTGTGGGCCATTTGTCCAGAAGGGGACGGCAGCAGCTGTAGCTGGCTCCTCCGGGGTCCAGGCAGCAGGCCACAGGGCAGAACTGACCATCTGGGCACCGCGTTCCAGCCACCAGCCCTGCTGTTAAGGCCACCCAGCTCACCAGGGTCCACATGGTCTGCCTGCGTCCGACTCCGCGGTCCTTG。本發明還提供了測定個體是否受到肝細胞癌(HCC)折磨的方法，包括步驟(a)測定個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白的表達水平；(b)測定個體正常肝細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白的表達水平；和(c)將步驟(a)中測定的表達水平與步驟(b)中測定的表達水平相比較，其中步驟(a)中較高的表達水平表明個體受到HCC的折磨。一實施方案中，通過免疫組織化學來測定GEP蛋白的表達水平。另一實施方案中，通過蛋白質印跡分析來測定GEP蛋白的表達水平。本發明還提供了測定個體是否受到肝細胞癌(HCC)折磨的方法，包括步驟(a)測定個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白的表達水平；和(b)將步驟(a)中測定的表達水平與健康者正常肝細胞中GEP蛋白的表達水平相比較，其中步驟(a)中的較高表達水平表明個體受到HCC的折磨。一實施方案中，通過免疫組織化學來測定GEP蛋白的表達水平。另一實施方案中，通過蛋白質印跡分析來測定GEP蛋白的表達水平。本發明還提供了測定個體是否受到肝細胞癌(HCC)折磨的方法，包括以下步驟(a)測定個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)編碼mRNA的量；(b)測定個體正常肝細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)編碼mRNA的量；(c)將步驟(a)中測定的mRNA量和步驟(b)中測定的mRNA量相比較，其中步驟(a)中較高的mRNA量表明個體受到HCC的折磨。一實施方案中，使用正向引物，反向引物和探針通過定量實時聚合酶鏈式反應來測定mRNA的量。正向引物包括，但不限於，SEQIDNO2中所示的核酸序列5』-CAAATGGCCCACAACACTGA-3』。反向引物包括，但不限於，SEQIDNO3中所示的核酸序列5』-CCCTGAGACGGTAAAGATGCA-3』。探針包括，但不限於，SEQIDNO4中所示的序列5』-6FAMCCACTGCTCTGCCGGCCACTCMGBNFQ-3』。本發明還提供了測定個體是否受到肝細胞癌(HCC)折磨的方法，包括步驟(a)測定個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)編碼mRNA的量；(b)將步驟(a)中測定的mRNA量與健康者正常肝細胞中發現的GEP編碼mRNA的量相比較，其中(a)中較高的mRNA量表明個體受到HCC的折磨。一實施方案中，使用正向引物，反向引物和探針通過定量實時聚合酶鏈式反應來測定mRNA的量。正向引物包括，但不限於，SEQIDNO2中所示的核酸序列5』-CAAATGGCCCACAACACTGA-3』。反向引物包括，但不限於，SEQIDNO3中所示的核酸序列5』-CCCTGAGACGGTAAAGATGCA-3』。探針包括，但不限於，SEQIDNO4中所示的序列5』-6FAMCCACTGCTCTGCCGGCCACTCMGBNFQ-3』。本發明進一步提供了治療受肝細胞癌(HCC)折磨的個體的方法，包括將治療有效量的特異性幹預個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)蛋白表達的試劑給藥於個體。一實施方案中，試劑是核酸。核酸可以是，但不限於，小的幹預RNA，核酶，DNA酶或反義分子。反義分子可以包括SEQIDNO5所示的核酸序列GAAGGGGCAGCAACTGGAAGTCCCTGAGACGGTAAAGATGCAGGAGTGGCCGGCAGAGCAGTGGGCATCAACCTGGCAGGGGCCACCCAGATGCCTGCTCAGTGTTGTGGGCCATTTGTCCAGAAGGGGACGGCAGCAGCTGTAGCTGGCTCCTCCGGGGTCCAGGCAGCAGGCCACAGGGCAGAACTGACCATCTGGGCACCGCGTTCCAGCCACCAGCCCTGCTGTTAAGGCCACCCAGCTCACCAGGGTCCACATGGTCTGCCTGCGTCCGACTCCGCGGTCCTTG。優選的實施方案中，個體是人。以下的實驗詳述部分具體說明了本發明。提出該部分是為了幫助理解本發明但不是用來，也不應當解釋為以任何方式來限制此後權利要求中所示的本發明。實驗詳述與HCC個體正常肝組織周圍以及健康個體的正常肝組織相比較，顆粒體蛋白-內皮素前體(GEP)在肝細胞癌(HCC)中大量而普遍地表達。兩個不同的HCC細胞系(Hep3B和Huh7)中的功能研究證明了GEP下調導致降低的增殖，腫瘤入侵性，和集落形成能力。使用Balb/c無胸腺小鼠的體內實驗證明GEP下調導致降低的增殖，和降低的致瘤性。110對HCC和鄰近正常肝組織的檢測表明HCC中的RNA水平顯著高於鄰近正常肝中的(圖1A)。使用完全正常的肝組織用於標準化，還表明了致瘤組織中GEPRNA的高水平是GEP超表達的結果(圖1A)。HCC組織中的GEPRNA的高水平與通過定量實時PCR和顯象密度計掃描的半定量蛋白質印跡所顯示的GEP蛋白表達水平正相關(圖1)。大多數HCC組織顯示出強至中等的GEP蛋白表達水平，而大部分鄰近的肝組織和完全正常的肝組織顯示出弱至零的GEP蛋白表達水平。表1.人肝臟樣品中的GEP蛋白表達縮寫GEP，顆粒體蛋白-內皮素前體；HCC，肝細胞癌根據臨床病理學顯著性來進一步分析HCC中的GEP超表達。通過免疫組織化學來評價GEP蛋白的表達水平，並分成「弱表達(分值≤中值)」和「強表達(分值＞中值)」的類別。本發明者證明強GEP蛋白表達與大的腫瘤(＞5cm)，靜脈滲透以及頭一年的肝內復發顯著相關(表2)。相反，GEP表達水平與血清α-胎蛋白(AEP)水平，腫瘤被膜，腫瘤結節的數量，微衛星結節，性別，個體年齡，HBV相關性(通過血清HBsAg來測定)，或pTNM階段沒有顯著相關性。表2.關於GEP表達的HCC臨床病理學特徵縮寫HCC，肝細胞癌；GEP，顆粒體蛋白-內皮素前體；AFP，α-胎蛋白；HBsAgB肝表面抗原。GEP互補的反義寡核苷酸的效果使用親本Hep3B和Huh7HCC細胞系作為體外模型，通過定量RT-PCR來顯示GEP表達的高水平。用不同構建體來轉染細胞系用於測定GEP表達抑制。證明了通過轉染的反義片段降低了GEP表達和蛋白質水平(圖3)。此外，還檢測了含血清和血清限制條件下的細胞增殖率。反義轉染子顯示出細胞增殖的顯著降低。表3.HCC轉染子中GEP水平*和細胞增殖#的相關性GEP，顆粒體蛋白-內皮素前體；HCC，肝細胞癌*涉及親本細胞相對倍數差異的轉染子GEP水平*在第3至第5天中測定的細胞倍增時間，因為該階段是細胞增殖的對數期。將通過測量線粒體活性的MTT測試用於測定細胞活性。反義轉染子證明了在含血清和血清限制條件下細胞活性的顯著降低，而全長轉染子證明了兩種條件下與各自親本細胞系相似的細胞活性。在兩種HCC細胞系中使用Matrigel細胞入侵室來研究細胞入侵能力。進行48小時的孵育時間段，使50,000個細胞遷移並從無血清培養基侵入由BDMatrigel基底膜基質(BDBiosciences)隔開的含血清培養基中。在Hep3B中，反義轉染子表明與空載體對照相比較，細胞遷移降低5.2倍。相似地，反義Huh7轉染子表明與空載體對照相比較(圖4A)，細胞遷移降低2.2倍。這些發現清楚地證明了GEP表達的抑制將導致細胞遷移降低，並隨後導致HCC細胞入侵性的降低。在非貼壁依賴性條件下測定轉染子的集落形成能力，其中使50,000個轉染的細胞在4周內克隆。使用顯微鏡，計數至少三個重複兩次進行的獨立實驗中所形成集落中的細胞數。與空載體對照相比較。Hep3B和Huh7反義轉染子集落的總細胞量各自顯著降低2.2和1.3倍(圖4B)。該發現清楚地證明了GEP對於腫瘤集落形成的功能效果。在4周齡的Balb/c無胸腺小鼠中測定轉染子的致瘤潛力。進行動物背部軀幹部分5百萬個細胞的皮下接種。每周進行腫瘤大小和體重的兩項測量來觀察腫瘤的發展。Hep3B反義轉染子在所檢測5隻小鼠中的3隻中產生了腫瘤，而空載體轉染子在全部5隻小鼠中產生了較大的腫瘤。所有實驗動物在第60天終止，外科手術取出腫瘤用於淨重測定。與載體對照組相比較。反義組的腫瘤重顯著降低7.7倍。這些研究證明GEP正向調節了細胞增殖速率，細胞活性，細胞入侵，集落形成，以及致瘤潛力。功能數據進一步證實了強GEP表達通常與大的HCC大小和靜脈滲透的存在相關的臨床研究。因此證明了GEP在致肝癌中起主要作用，引起不同的腫瘤階段，從增殖至隨後的入侵和轉移。個體和樣品收集在手術過程中獲得肝腫瘤，鄰近腫瘤的非腫瘤肝組織，非癌個體的肝硬化肝臟和正常肝臟的組織樣品。表1中列出了pTNM階段的分布和其他臨床病理學參數。在移植手術中收集正常的肝樣本。器官捐獻者沒有基礎的肝病且對於B肝血清學是陰性的。將每個組織樣本，0.5-1cm3，分成3等份。將一部分福馬林固定和石蠟包埋，用於組織學或免疫組織化學研究。將兩個部分在液氮中急凍並存儲在-70℃直至使用。從腫瘤樣品中提取RNA根據製造商的實驗方案使用TRIZOL試劑(Invitrogen，USA)來提取總RNA。簡而言之，將冷凍組織樣品放入10mlTRIZOL試劑中並立即均質。將均質過的樣品通過注射器來剪切基因組DNA並使其在室溫放置5分鐘。然後，將勻漿在4000rpm4℃離心30分鐘。將澄清的勻漿溶液轉移至乾淨的管子中並加入2ml氯仿。充分混合後，將混合物在4500rpm4℃離心30分鐘來分離含有RNA的水相。將水相轉移至乾淨的管子中並加入5ml異丙醇從樣品中沉澱出RNA。通過離心來收集沉澱的RNA並用75％乙醇洗滌兩次。在程序結束時，將RNA溶解於DEPC-水中用於隨後的實驗。第一鏈cDNA合成根據製造商的說明使用高容量cDNA獲得(HighCapacitycDNAAchive)試劑盒(AppliedBiosystems，USA)從0.5μg的樣品總RNA來合成第一鏈cDNA。首先用1單位的DNA酶I在室溫將總RNA樣品處理15分鐘。然後通過加入EDTA溶液並在70℃加熱10分鐘來停止反應。將DNA酶I處理過的總RNA樣品加入含有1×RT緩衝液，4mMdNTP混合物，1×隨機引物，125單位MultiScribeRT的逆轉錄反應混合物中。將混合物在25℃孵育10分鐘，並在37℃孵育2小時來合成第一鏈cDNA。免疫組織化學染色按照製造商的說明使用DakoEnvisionPlus系統(Dako，Carpinteria，CA)並進行改進來進行免疫組織化學。簡而言之，用浸在檸檬酸鹽緩衝液中的部分通過微波來進行抗原恢復。內源過氧化物酶阻斷後，使用第一抗體。通過辣根過氧化物酶綴合的第二抗體來檢測信號並使用二氨基聯苯胺作為色原來產生顏色。然後用蘇木精將組織部分反染色。對於GEP，使用2μg/ml的多克隆抗體GEP(AGI，Sunnyvale，CA)。對於α-胎蛋白(AFP)，使用1∶50稀釋度的多克隆抗體(Dako)。對於p53檢測，使用1∶50稀釋度的單克隆抗體DO-7(Dako)。蛋白質印跡分析在10％的SDS-PAGE凝膠中分離30μg的總蛋白並轉移至聚乙二烯二氟化物膜上(Millipore，Bedford，MA)。用10％無脂奶粉阻斷斑點，探測對抗多克隆GEP抗體，接著綴合辣根過氧化物酶的抗兔IgG(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。根據製造商的說明使用增強的化學螢光蛋白質印跡檢測試劑盒(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)來觀察條帶，並暴露於HyperfilmTM(AmershamBiosciences)。通過所暴露膜的密度掃描來定量蛋白質的相對水平，使用凝膠成像系統和UVPGelWorksIDIntermediate版本3.01(UltraVioletProductsLtd.，Cambridge，UK)。定量實時PCR使用ABIPRISM7700測序系統(AppliedBiosystems，USA)來進行實時定量多重RT-PCR。GEP基因表達的測試中使用五微升1∶60倍稀釋的第一聯cDNA。來自Pre-DevelopedTaqManAssayReagents的18srRNA的引物和探針用作所有PCR中所有樣品的內源對照。每25μlPCR反應中，含有1×PCR緩衝液II，5.5mMMgCl2，0.2mMdATP，dCTP，dGTP，0.4mMdUTP，0.625單位AmpliTaqGold。目標基因的最佳引物和探針濃度和基因表達測試的最佳18srRNA對照稀釋度如下SEQIDNO11GTAGTCTGAGCGCTACCCGGTTGCTGCTGCCCAAGGACCGCGGAGTCGGACGCAGGCAGA61CCATGTGGACCCTGGTGAGCTGGGTGGCCTTAACAGCAGGGCTGGTGGCTGGAACGCGGT121GCCCAGATGGTCAGTTCTGCCCTGTGGCCTGCTGCCTGGACCCCGGAGGAGCCAGCTACA181GCTGCTGCCGTCCCCTTGTGGACAAATGGCCCACAACACTGAGCAGGGATCTGGGTGGCC241CCTGCCAGGTTGATGCCCACTGCTCTGCCGGCCACTCCTGCATCTTTACCGTCTGAGGGA301CTTCGAGTTGCTGCCCCTTCCCAGAGGCCGTGGCATGCGGGGATGGCCATCACTGCTGCC361CACGGGGGTTCCACTGCAGTGCAGACGGGCGATCCTGCTTCCAAAGATCAGGTAAGAACT421CCGTGGGTGCCATCCAGTGCCCTGATAGTCAGTTCGAATGCCCGGACTTCTCCACGTGCT481GTGTTATGGTCGATGGCTCCTGGGGGTGCTGCCCCATGCCCCAGGCTTCCTGCTGTGAAG541ACAGGGTGCACTGCTGTCCGCACGGTGCCTTCTGCGACCTGGTTCACACCCGCTGCATCA601CACCCACGGGCACCCACCCCCTGGVAAAGAAGCTCCCTGCCCAGAGGACTAACAGGGCAG661TGGCCTTGTCCAGCTCGGTCATGTGTCCGGACGCACGGTCCCGGTGCCCTGATGGTTCTA721CCTGCTGTGAGCTGCCCAGTGGGAAGTATGGCTGCTGCCCAATGCCCAACGCCACCTGCT781GCTCCGATCACCTGCACTGCTGCCCCCAAGACACTGTGTGTGACCTGATCCAGAGTAAGT841GCCTCTCCAAGGAGAACGCTACCACGGACCTCCTCACTAAGCTGCCTGCGCACACAGTGG901GGGATGTGAAATGTGACATGGAGGTGAGCTGCCCAGATGGCTATACCTGCTGCCGTCTAC961AGTCGGGGGCCTGGGGCTGCTGCCCTTTTACCCAGGCTGTGTGCTGTGAGGACCACATAC1021ACTGCTGTCCCGTGGGGTTTACGTGTGACACGCAGAAGGGTACCTGTGAACAGGGGCCCC1081ACCAGGTGCCCTGGATGGAGAAGGCCCCAGCTCACCTCAGCCTGCCAGACCCACAAGCCT1141TGAAGAGAGATGTCCCCTGTGATAATGTGAGCAGCTGTCCCTCCTCCGATACCTGCTGCC1201AACTCACGTCTGGGGAGTGGGGCTGCTGTCCAATCCCAGAGGCTGTCTGCTGCTCGGACC1261ACCAGCACTGCTGCCCCCAGGGCTACACGTGTGTAGCTGAGGGGCAGTGTCAGCGAGGAA1321GCGAGATCGTGGCTGGACTGGAGAAGATGCCTGCCCGCCGGGCTTCCTTATCCCACCCCA1381GAGACATCGGCTGTGACCAGCACACCAGCTGCCCGGTGGGGCAGACCTGCTGCCCGAGCC1441TGGGTGGGAGCTGGGCGTGCTGCCAGTTGCCCCATGCTGTGTGCTGCGAGGATCGCCAGC1501ACTGCTGCCCGGCTGGCTACACCTGCAACGTGAAGGCTCGATCCTGCGAGAACGAAGTGG1561TCTCTGCCCAGCCTGCCACCTTCCTGGCCCGTAGCCCTCACGTGGGTGTGAAGGACGTGG1621AGTGTGGGGAAGGACACTTCTGCCATGTTAACCAGACCTGCTGCCGAGACAACCGACAGG1681GCTGGGCCTGCTGTCCCTACCGCCAGGGCGTCTGTTGTGCTGATCGGCGCCACTGCTGTC1741CTGCTGGCTTCCGCTGCGCAGCCAGGGGTACCAAGTGTTTGCGCAGGGAGGCCCCGCGCT1801GGGACGCCCCTTTGAGGGACCCAGCCTTGAGACAGCTGCTGTGAGGGACAGTACTGAAGA1861CTCTGCAGCCCTCGGGACCCCACTCGGAGGGTGCCCTCTGCTCAGGCCTCCCTAGCACCT1921CCCCCTAACCAAATTCTCCCTGGACCCCATTCTGAGCTCCCCATCACCATGGGAGGTGGG1981GCCTCAATCTAAGGCCTTCCCTGTCAGAAGGGGGTTGTGGCAAAAGCCACATTACAAGCT2041GCCATCCCCTCCCCGTTTCAGTGGACCCTGTGGCCAGGTGCTTTTCCCTATCCACAGGGG2101TGTTTGTGTGTGTGCGCGTGTGCGTTTCAATAAGTTTGTACACACTTTCSEQIDNO1的備註446的多態性T或C1922的多態性T或CSEQIDNO25′-CAAATGGCCCACAACACTGA-3′(0.2μM)SEQIDNO35′-CCCTGAGACGGTAAAGATGCA-3′(0.2μM)SEQIDNO45′-6FAMCCACTGCTCTGCCGGCCACTCMGBNFQ-3′(0.2μM)18s對照1×定量實時PCR的條件如下95℃10分鐘，95℃15秒和60℃1分鐘的40個循環。將通過軟體[AppliedBiosystems]產生的PCR反應的擴增曲線用於測定極限循環(CT)。CT值表示在其可以首先檢測到報告螢光超過基礎信號增加的PCR循環。細胞培養和反義GEPcDNA的轉染將pCMV6-XL5(OriGeneTechnolgisInc.，Rockville，MD)中克隆的全長GEPcDNA用作模板，用於將不同的GEP構建體裝配至pcDNA3.1(+)中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。使用Not1和XbalI限制位點來亞克隆全長GEP。通過聚合酶鏈式反應來產生N-端片段(290bp大小，對應於位置-31至258bp)7，8，在反義和正義方向亞克隆來產生各自的構建體。使用兩種人HCC細胞系，Hep3B(AmericanTissueCultureCollection，Rockville，MD)和Huh7(HealthScienceResearchResourcesBank，Osaka，Japan)。Hep3B是p53-缺陷的，而Huh7含有p53蛋白超表達的突變p53。將這兩種細胞系用於測試是否GEP功能是p53依賴性的。使用含血清的DMEM(補充10％FBS，50U/ml青黴素G和50μg/ml鏈黴素)在標準培養條件下培養細胞。根據製造商的說明用LipofectAMINE(Invitrogen)來轉染細胞1，反義片段用於降低GEP水平；2，全長用於GEP的超表達；3，正義片段作為反義實驗的對照，4，空載體作為所有轉染實驗的對照。通過G418來選擇穩定的克隆。在含血清(10％)，血清限制(對於Hep3B，0％血清，對於Huh7，2％血清，因為0％血清中的細胞增殖是可忽略的)條件下測定GEP蛋白水平和增殖。SEQIDNO5GAAGGGGCAGCAACTGGAAGTCCCTGAGACGGTAAAGATGCAGGAGTGGCCGGCAGAGCAGTGGGCATCAACCTGGCAGGGGCCACCCAGATGCCTGCTCAGTGTTGTGGGCCATTTGTCCAGAAGGGGACGGCAGCAGCTGTAGCTGGCTCCTCCGGGGTCCAGGCAGCAGGCCACAGGGCAGAACTGACCATCTGGGCACCGCGTTCCAGCCACCAGCCCTGCTGTTAAGGCCACCCAGCTCACCAGGGTCCACATGGTCTGCCTGCGTCCGACTCCGCGGTCCTTGGEP轉染的HCC細胞的體外功能分析通過將五萬個細胞接種於6-孔平板中來測定細胞增殖。連續5天每天收集細胞，並通過錐蟲藍排除來計數存活的細胞。通過MTT測試進行的線粒體脫氫酶活性來測量細胞活性18，19，其中將五千個細胞接種於96-孔平板中，並連續5天測試。使用BioCoatMatrigel入侵室(BDBiosciences，Bedford，MA)來測定細胞入侵能力，其中室膜濾器(8μm孔徑)塗覆BDMatrigelTM基底膜基質(BDBiosciences)。上部室裝載2ml無血清培養基中的五萬個細胞，而下部室裝滿2ml含血清的培養基。標準孵育48小時後，用棉籤除去膜上表面上的非入侵細胞。將膜下表面的入侵細胞洗入PBS中，固定於Carnoy’s溶液中，並用蘇木精和曙紅染色。在顯微鏡下計數每個膜濾器10個隨機選擇區域的入侵細胞(×100放大倍數)。通過軟瓊脂上的集落形成能力來測定非貼壁依賴性生長20。通過混合等量的1.6％低熔點瓊脂(USB)和補充20％FBS的2×DMEM來形成6-孔平板中的1.5ml瓊脂基。將五千個細胞懸浮於1.5ml軟瓊脂中(含有補充20％FBS的2×DMEM，和0.8％低熔點瓊脂的混合物)並覆蓋於瓊脂基上。4周後，在顯微鏡下計數每孔10個區域中超過15個細胞的集落。體外實驗的每個數據點表示至少三個重複兩次進行的獨立實驗的結果。GEP-轉染的HCC細胞的體內功能分析將4周大的Balb/c無胸腺裸鼠用於測試轉染子的體內致瘤潛力21。研究實驗方案得到香港大學教學和研究活動物使用協會的批准。在每隻動物的背部軀幹部分接種五百萬個細胞。每周兩次測量腫瘤大小和體重。在第60天終止小鼠，收集腫瘤用於進一步的測定。每個實驗組包括5隻小鼠。參考文獻1.PisaniP，ParkinDM，BrayF，FerlayJ.Estimatesoftheworldwidemortalityfrom25cancersin1990.(1990年25種癌症的全世界死亡率評估)IntJCancer1999；8318-29.2.StaibF，HussainSP，HofsethLJ，WangXW，HarrisCC.TP53andlivercarcinogenesis.(TP53和致癌作用)HumMutat2003；21201-216.3.ThorgeirssonSS，GrishamJW.Molecularpathogenesisofhumanhepatocellularcarcinoma.(人肝細胞癌的分子致病機理)NatGenet2002；31339-346.4.BuendiaMA.Geneticsofhepatocellularcarc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受肝細胞癌(HCC)折磨的個體的方法，包括將治療有效量的特異性幹擾個體腫瘤細胞中顆粒體蛋白－內皮素前體(GEP)蛋白表達的試劑給藥於個體。文檔編號G01N33/574GK1950521SQ200580013799公開日2007年4月18日申請日期2005年4月20日優先權日2004年4月29日發明者張兆恬,範上達申請人:香港大學