淋巴細胞的製備方法

2023-06-18 17:17:26 2

專利名稱：：淋巴細胞的製備方法
技術領域：
：本發明涉及獲取在醫療領域中有用的淋巴細胞的方法。技術背景一個活的生物體主要通過免疫應答來保護機體免受異物的侵襲。免疫系統是由各種各樣的細胞及其產生的可溶性因子構成。其中，白細胞，特別是淋巴細胞，起著關鍵作用。淋巴細胞分為B淋巴細胞(以下，稱作B細胞)和T淋巴細胞(以下，稱作T細胞)兩種主要類型，這兩種細胞都特異性識別抗原並作用於此，從而保護有機體。T細胞的亞類分為有CD(ClusterofDifferentiation)4標誌，主要參與輔助抗體產生和誘導各種免疫應答的輔助性T細胞(以下，有時記做TH)和有CD8標誌，主要顯示細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞(Tc，細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxicTlymphocyte)。別名KillerT糹田月包，以下，有時記做CTL)。對識別、破壞、去除肺瘤細胞和病毒感染細胞等起最重要作用的CTL,它不象B細胞那樣產生針對抗原特異反應的抗體，而是直接識別與存在於靶細胞細胞膜表面的主要組織相容性複合體[MHC:也稱作人白細胞抗原(HLA)]I類分子結合的耙細胞來源的抗原(抗原肽)。此時，CTL膜表面的T細胞受體(以下，稱作TCR)特異性識別前述的抗原肽及MHCI類分子，判斷抗原肽是自身來源的還是非自身來源的。CTL能破壞、去除判斷為非自身來源的靶細胞。近年來，人們開始重新審視藥物療法和放射線療法等給患者造成沉重身體負擔的治療方法，而增加了對給患者較輕身體負擔的免疫療法的關注。特別是關注過繼性免疫療法的有效性，即從人源的淋巴細胞先體外後體內(exvivo)誘導成針對目的抗原產生特異反應的CTL等淋巴細胞後，或者不進行誘導，將該淋巴細胞進行擴大培養後，移入患者體內。例如，動物模型中提示過繼性免疫療法對病毒感染和腫瘤是有效的治療方法(例如，非專利文獻1和2)。這種治療方法中，重要的是在維持或增強CTL的抗原特異性殺傷活性的狀態下，維持或增加其細胞數。上述過繼性免疫療法中，為了獲得治療效果，施用一定量以上細胞數的細胞殺傷性淋巴細胞是必要的。也就是說，先體外後體內活體外短時間內獲得這樣的細胞數是最大的問題。為了維持或增強CTL的抗原特異性殺傷活性，誘導CTL的抗原特異性應答時，一般的方法是用目的抗原進行反覆刺激。但是，通常，這種方法中最終獲得的CTL數減少，得不到足夠的細胞數。接下來與抗原特異性的CTL的製備有關，報導了應用自身的CMV感染纖維原細胞與IL—2(例如，非專利文獻6),或者應用抗CD3單克隆抗體(抗CD3mAb)與IL-2分別分離及大量培養CMV特異的CTL克隆的方法(例如，非專利文獻7)。jt匕夕卜，專利文獻1中乂>開了REM法(rapidexpansionmethod)。REM法是一種短時間內增殖(Expand)包括抗原特異性CTL和TH的初級T細胞團的方法。換句話說，其特徵在於，該方法可以通過增殖單獨的T細胞克隆，提供大量的T細胞；通過應用抗CD3抗體、IL-2、以及經過放射線照射而失去增殖性的PBMC(peripheralbloodmononuclearcell,末梢血單核細胞)和EB病毒(Epstein-Barrvirus,以下略作EBV)感染細胞來增加抗原特異性CTL數。此外，專利文獻2中公開了改良的REM法。該方法是，區別於PBMC，使用表達T細胞刺激成分的不分裂的哺乳動物細胞株作為飼養細胞，減少了PBMC的使用量的方法。對疾病的治療有效的淋巴細胞除CTL以外，已知有，例如淋巴因子活化細胞(例如，非專利文獻3)，應用高濃度的白細胞介素2(IL-2)誘導的胂瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)(例如，非專利文獻4和5)。淋巴因子活化細胞是一群具有細胞殺傷活性功能的細胞團，是通過向含有淋巴細胞的末梢血(末梢血白細胞)和臍帶血、組織液等中加入IL-2，在試管內培養數日而獲得的。在淋巴因子活化細胞的培養過程中，通過加入抗CD3抗體進一步加速淋巴因子活化細胞的增殖。此外，已知在培養過程中，不僅加入抗CD3抗體，加入抗CD28抗體進行共刺激還可進一步加速細胞的增殖率(例如，非專利文獻8)。所得淋巴因子活化細胞對各種癌細胞和其它靶細胞有非特異性殺傷活性。纖連蛋白是一種分子量25萬的巨大的糖蛋白，存在於動物的血液中、培養細胞表面、組織的細胞外基質中，具有多種多樣的功能。其功能域結構分為7個(參照下面圖1)部分，其胺基酸序列中包含3種類似的序列，這些序列反覆出現，構成了整個分子。3種類似的序列叫做I型、II型、III型，其中，III型是由71~96個胺基酸殘基構成，這些胺基酸殘基的一致率是17~40%。纖連蛋白中存在14個III型的序列，其中，第8、9、IO個(以下，分別稱作III-8、III-9、III-IO)含有細胞結合功能域，第12、13、14個(以下，分別稱作111-12、111-13、III-14)含有肝素結合功能域。另外，III-10中包含VLA(verylateactivationantigen)-5結合功能域，其核心序列是RGDS。此外，肝素結合功能域的C末端存在叫做IIICS的區域。IIICS中存在由25個胺基酸構成的具有VLA-4結合活性的叫做CS-1的區域(例如，非專利文獻9~11)。淋巴因子活化細胞和細胞毒性淋巴細胞的製備過程中，通過使用纖連蛋白及其片段而提高細胞增殖率的作用、維持細胞殺傷活性的作用，已經經本發明者們進行了研究(例如，專利文獻3、4及5)。但是，考慮到過繼性免疫療法的實用性時，上述文獻的方法根本不能令人滿意，還要求進一步提高細胞增殖率的淋巴細胞的擴大培養方法。非專利文獻1:GreenbergP.D.著，1992年發行，AdvancesinImmunology非專利文獻2:ReusserP.它3名，Blood，1991年，Vol.78,No.5,P13731380非專利文獻3:RiddellS.A.及另外4人，J.Immunol.,1991年，Vol.146:No.8,P27952804非專利文獻4:GreenbergP.D.及另外1人，J.Immunol.Methods,1990年，Vol.128,No.2,P189201非專利文獻5:RosenbergS.A.等，N.Engl.J.Med.,1987年，Vol.316,No.l5,P889897非專利文獻6:RosenbergS.A.等，N.Engl.J.Med.,1988年，Vol.319,No.25,P16761680非專利文獻7:HoM.及另夕卜9人，Blood,1993年,Vol.81,No.8,P20932101非專利文獻8:KoberdaJ.及另夕卜2人，J.CancerRes.Clin.Oncol.,1993年,Vol.119,No.3,P131136非專利文獻9:DeaneF.Momer著，1988年發行,F舊RONECTIN,ACADEMICPRESSINC.,Pl8非專利文獻10:KimizukaF.,其它8名，J.Biochem.,1991年，Vol.110No.2,p284-291非專利文獻11;HanenbergH.其它5名，HumanGeneTherapy,1997年，Vol.8,No.l8,p2193-2206專利文獻1:國際公開第96/06929號公報專利文獻2:國際公開第97/32970號公報專利文獻3:國際公開第03/016511號公報專利文獻4:國際公開笫03/080817號公報專利文獻5:國際公開第2005/019450號公報發明的公開發明預解決的課題本發明的目的是提供適於醫療使用的、有效的淋巴細胞的製備方法。解決課題的手段本發明的第一方面涉及一種淋巴細胞的製備方法，其特徵在於，它包括在(a)纖連蛋白，其片段或其混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體存在的條件下進行擴大培養的步驟。本發明的第一方面中，CD3配體的示例是抗CD3抗體，CD28配體的示例是抗CD28抗體。此外，作為纖連蛋白片段的示例，它是包含至少一個序列表序列號1~8中所示胺基酸序列的多肽(m)，或者是包含至少一個在上述任一胺基酸序列中至少1或數個胺基酸發生置換、缺失、插入或者附加所得的胺基酸序列的、並與上述多肽(m)具有同等功能的多肽(n)。另外，作為纖連蛋白片段的示例，它具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性。另外，作為纖連蛋白片段的示例，是選自具有序列表中序列號9~21所示任一胺基酸序列的多肽中的至少一種的多肽。此外，本發明的第一方面中，淋巴細胞的示例是淋巴因子活化的細胞。此外，本發明的第一方面還提供還包含向淋巴細胞中導入外源基因步驟的淋巴細胞的製備方法。導入外源基因的方法有應用逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或者猿病毒導入的方法。本發明的第二方面涉及本發明的第一方面中獲得的淋巴細胞。此外，本發明的第三方面涉及含有以本發明的第二方面作有效成分的藥物。本發明的第四方面涉及固化了選自抗CD3抗體、抗CD28抗體、纖連蛋白及其片段中的至少一種物質的固相的製備方法，其特徵在於，在酸性條件下，將選自抗CD3抗體、抗CD28抗體、纖連蛋白及其片段中的至少一種物質與固相接觸。本發明的第四方面中，固相的示例有細胞培養用載體。本發明的第五方面涉及固化了(a)纖連蛋白，其片段或其混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體的固相。本發明的第五方面中，固相的示例有細胞培養板、培養皿、培養瓶、袋、珠子、膜或者載玻片等。發明的效果依照本發明，可提供有效的淋巴細胞的製備方法。該製備方法具有高的細胞增殖率，是極其有用的方法。因此，依照本發明而獲得的淋巴細胞適於，例如，過繼性免疫療法，因此期待能在醫療領域中有很大的貢獻。實施發明的最佳狀態本發明通過包括在(a)纖連蛋白，其片段或其混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體，存在的條件下進行淋巴細胞擴大培養的步驟，發現細胞增殖率極高，由此完成了本發明。本說明書中淋巴細胞的製備是指包括擴大培養細胞步驟的程序。另以下，對本發明進行具體說明。(1)本發明中使用的纖連蛋白、及其片段本說明書中描述的纖連蛋白、及其片段既可是天然獲得的，也可是人為合成的。例如，按照RuoslahtiE.,etal.，J.Biol.Chem.,第256巻，第14號，第7277~7281頁(1981)公開的纖連蛋白、及其片段可以從天然來源的物質製備成基本上純品的形式。這裡，本說明書中描述的基本上純品的纖連蛋白或者纖連蛋白片段是指基本上不包含與纖連蛋白一起天然存在的其它蛋白質。上述纖連蛋白及其片段可分別在本發明中單獨或者多種混合使用。已知，纖連蛋白存在很多的剪接變體，本發明中使用的纖連蛋白，只要其能表現出本發明所預期的效果，可使用任何一種可變體。例如，應用血漿來源的纖連蛋白時，已知缺失存在於細胞結合功能域上遊的叫做ED-B的區域和存在於細胞結合功能域與肝素結合功能域之間的叫做ED-A的區域，這樣的血漿來源的纖連蛋白可在本發明中使用。可在本發明中使用的纖連蛋白片段以及與該片段的製備有關的有用的信息可從KimizukaF.,etal.,J.Biochem.,第110巻，284-291頁，(1991);KombrihttA.R.,etal.，EMBOJ.,第4巻，第7號，1755~1759(1985);SekiguchiK.,etal.,Biochemistry,第25巻，第17號，4936~4941(1986)等獲得。另外，編碼纖連蛋白的核酸序列或片段的胺基酸序列公開於GenbankAccessionNo.NM—002026、NP—002017中。本發明中，纖連蛋白片段的示例有，例如，包含至少一種構成III-8(序列表序列號1中表示的胺基酸序列)、III-9(序列表序列號2中表示的胺基酸序列)、m-IO(序列表序列號3中表示的胺基酸序列)、m-ll(序列表序列號4中表示的胺基酸序列)、III-12(序列表序列號5中表示的胺基酸序列)、III-13(序列表序列號6中表示的胺基酸序列)、III-14(序列表序列號7中表示的胺基酸序列)、及CS-I(序列表序列號8中表示的胺基酸序列)任一區域的胺基酸序列的多肽(m)(參照圖1)，和包含至少一個在上述任一胺基酸序列中至少1或複數個胺基酸發生置換、缺失、插入或者附加所得的胺基酸序列、並與上述多肽(m)具有同等功能的多肽(n)。多肽的長度，例如，胺基酸數優選201000個，更優選100800個。本說明書中，複數個是包含數個的概念，優選212個，更優選210個，還優選28個，以下同樣。此外，作為片段，具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性的片段更適於應用。細胞黏附活性可通過公知方法分析判斷本發明中使用的片段(其細胞結合功能域)與細胞的結合。例如，這樣的方法包含WilliamsD.A.,etal.,Nature,第352巻，第438~441頁(1991)。該方法是測定細胞對固化到培養板上的片段的結合的方法。另外，肝素結合活性可通過公知方法分析判斷本發明中使用的片段(其肝素結合功能域)與細胞的結合。例如，上述WilliamsD.A.等的方法中，將細胞換成肝素，例如，通過使用標記的肝素，用同樣的方法評價片段與肝素的結合。另外，作為纖連蛋白片段的示例，是選自C-274(序列表序列號9中表示的胺基酸序列)、H-271(序列表序列號10中表示的胺基酸序列)、H-296(序列表序列號11中表示的胺基酸序列)、CH-271(序列表序列號12中表示的胺基酸序列)、CH-296(序列表序列號13中表示的胺基酸序列)、C-CS1(序列表序列號14中表示的胺基酸序列)、及CH-296Na(序列表序列號21中表示的胺基酸序列)的多肽。上述CH—271、CH-296、CH—296Na、C-274、C—CS1的各片段是具有有VLA-5結合活性的細胞結合功能域的多肽。另外，C-CS1、H-296、CH-296、CH—296Na是具有有VLA-4結合活性的CS_1的多肽。H-271、H-296、CH-271、CH-296、CH-296Na是具肝素結合功能域的多肽。CH-296是包含血漿來源的纖連蛋白中從細胞結合功能域到CS—1的多肽。本發明中也可使用上述各功能域經過修飾的片段。纖連蛋白的肝素結合功能域由3個III型(III-12、III-13、III-14)序列構成。包含上述III型序列中一個或兩個缺失了的肝素結合功能域的片段也可在本發明中使用。例如，纖連蛋白的細胞結合部位(VLA-5結合區域、Prol239Ser1515)與1個III型序列結合的片段CHV-89(序列表序列號15中表示的胺基酸序列)、CHV-90(序列表序列號16中表示的胺基酸序列)、CHV-92(序列表序列號17中表示的胺基酸序列)，或者與2個III型序列結合的片段CHV-179(序列表序列號18中表示的胺基酸序列)、CHV-181(序列表序列號19中表示的胺基酸序列)。CHV-89、CHV-90、CHV-92分別包含111-13、111-14、III-12,CHV-179包含III-13和111-14,CHV-181包含III-12和m-13。另外，上述各片段中附加了胺基酸的片段也可在本發明中使用。這樣的片段的製備可通過，例如通過向上述各片段中添加所需的胺基酸而進行製備。例如，H-275-Cys(序列表序列號20中表示的胺基酸序列),是具有纖連蛋白的肝素結合功能域，並且C末端具有半胱氨酸殘基的片段。另外，本發明中使用的片段，可以是那些與包含上述示例的天然纖連蛋白胺基酸序列的至少一部分的片段具有同等功能，具有在構成該片段的多肽的胺基酸序列中，1或複數個胺基酸發生置換、缺失、插入或者附加所得的胺基酸序列的多肽，只要能獲得本發明預期的效果即可。胺基酸的置換等優選，在能夠維持原來多肽功能的範圍內改變多肽的理化性狀等。例如，胺基酸的置換等，優選在基本上不改變原有多肽持有的性狀(例如，疏水性、親水性、電荷、pK等)的範圍內，是保守的。例如，胺基酸的置換在l.甘氨酸、丙氨酸，2.纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸，3.天冬氨酸、穀氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺，4.絲氨酸、蘇氨酸，5.賴氨酸、精氨酸，6.苯丙氨酸、酪氨酸各組內進行置換，胺基酸的缺失、附加、插入優選在基本上不改變對象部位周邊性質的範圍內，用具有與多肽中對象部位周邊性質類似性質的胺基酸進行缺失、附加、插入。通過基因工程學手段獲得本發明中使用的片段時，例如，以大腸桿菌等作為宿主進行製備時，由於大腸桿菌來源的甲硫氨酸肽酶等的影響，所以有時缺失N末端的曱硫氨酸，這樣的多肽也可在本發明中使用。也就是說，序列表序列號20及21中描述的多肽的N末端的甲硫氨酸缺失了的多肽也適於在本發明中應用。胺基酸的置換等，可以是因種間和個體差異而天然產生的，或可是經人工誘導的。人工誘導可按照公知的方法進行，無特殊限定，例如，按照公知的方法，在編碼天然來源的纖連蛋白的上述區域和特定片段的核酸中，製備其中的1或複數個鹼基發生置換、缺失、插入或者附加所得的特定核酸，使用該核酸，可製備出具有與天然纖連蛋白來源的上述區域和特定片段同等功能、包含構成該片段等的多肽的胺基酸序列中有置換等的胺基酸序列的多肽。另外，本說明書中"具有同等功能"是指，作為比較對照的多肽，照後述的實施例1中描述的方法進行適當確iL作為具有胺基酸置;灸等的多肽的片段，優選具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性的。細胞黏附活性和肝素結合活性可按照前面的活性須'J定方法進行評價。作為具有胺基酸置換等的多肽的片段，例如，2個不同功能域間插入1個以上胺基酸作為連接體的片段也可在本發明中使用。作為纖連蛋白，與上述片段同樣，其多肽具有其胺基酸序列中有1或複數個胺基酸序列的置換、缺失、插入或者附加的胺基酸序列，具有提高淋巴細胞擴大培養率的作用的多肽，也可在本發明中使用。另外，本發明中使用的纖連蛋白或其片段，只要能達到本發明預期的效果，可使用與上面示例的天然纖連蛋白和至少包含其胺基酸序列的一部分的片段具有同等功能、與構成該纖連蛋白或其片段的多肽的胺基酸序列有50%以上同源性的多肽，優選具有70%以上同源性的多肽，更優選具有90%以上同源性的多肽，更優選具有95%以上同源性的肽。同源性的計算，例如可以應用DNASISProVer.2.6(TAKARABIOINC.)。本說明書中描述的纖連蛋白片段，例如，可以在美國專利第5198423號說明書中描述的基礎上由基因重組體製備重組的纖連蛋白片段。例如，上述H-271(序列號10)、H-296(序列號11)、CH-271(序列號12)、CH-296(序列號13)的各片段以及獲得它們的方法在該專利說明書中均有詳細的描述。另外，CH-296Na(序列號21)及其製備方法記載於國際公開第2005/019450號公報。上述C-274(序列號9)片段可根據美國專利第5102988號說明書中描述的方法獲得。C-CS1(序列號14)片段可根據日本專利第3104178號說明書中描述的方法獲得。上面CHV-89(序列號15)、CHV-90(序列號16)、CHV-179(序列號18)的各片段可根據日本專利第2729712號說明書中描述的方法獲得。CHV-181(序列號19)片段可根據國際公開第97/18318號公報中描述的方法獲得。CHV-92(序列號17)的片段可參照日本專利第2729712號說明書及國際公開第97/18318號公報中，以這些文獻中的質粒為基礎構建特定的質粒，用該質粒，通過基因工程學手段獲得。305-8566日本國茨城縣筑波東1丁目1番地1中央第6獨立行政法人產業技術綜合研究所特許生物寄託中心，具有以下受理號的微生物進行製備，或者通過按照公知的方法改變各微生物所保持的質粒進行製備。1、EscherichiacoliHB101/pHD101FERMBP—2264(具有編碼H-271的質粒的大腸桿菌，保藏日1989年1月30曰)2、EscherichiacoliHB101/pCH102FERMBP—2800(具有編碼CH-296的質粒的大腸桿菌，保藏日1989年5月12日)3、EscherichiacoliHBlOl/pCHlOlFERMBP—2799(具有編碼CH-271的質粒的大腸桿菌，保藏日1989年5月12日)4、EscherichiacoliHB101/pHD102FERMBP—7420(具有編碼H-296的質粒的大腸桿菌，保藏日1989年5月12日)5、EscherichiacoliJM109/pTF7221FERMBP—1915(具有編石馬C-274的質粒的大腸桿菌，保藏日1988年6月17日)6、EscherichiacoliHB101/pCS25FERMBP—5723(具有編碼C-CS1的質粒的大腸桿菌，保藏日1990年3月5日)7、pColdl4—CH296NaFERMBF—10073(具有編碼CH-296Na的質粒，保藏日2004年7月2日)8、EscherichiacoliHB101/pCHV89FERMP-12182(具有編碼CHV-89的質粒的大腸桿菌，保藏日1991年4月8日)9、EscherichiacoliHB101/pCHV179FERMF—12183(具有編碼CHV-179的質粒的大腸桿菌，保藏日1991年4月8日)。由於纖連蛋白是一種巨大的糖蛋白，所以製備、使用天然起源的蛋白質在產業上及醫藥品製造上必然不容易。另外，纖連蛋白是一種多功引發的不利取決)其^用狀況。'因此:本發明中從獲得、i易;作、4全性等方面考慮，優選纖連蛋白片段，更優選如上所得的重組纖連蛋白片段。另外，本發明中使用的纖連蛋白片段的分子量無特殊限定，但優選l200kD，更優選5190kD,更優選10180kD。該分子量，例如，可通過SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳進行測定。構成本發明的纖連蛋白片段的多肽的胺基酸序列中，構成天然來源的纖連蛋白片段的多肽的胺基酸序列以外的胺基酸序列部分，沒有特殊限定，只要不阻礙本發明的預期效果的表現即可。(2)淋巴細胞的製備方法以下，對本發明的淋巴細胞的製備方法進行詳細說明。本發明的方法是一種以包含(a)前述纖連蛋白，其片段或其混合物，(b)CD3配體，的淋巴細胞的製備方法。以下，將上述(a)前述的^連蛋白,其片段或其混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體稱作本發明的有效成分。本說明書中的淋巴細胞是指包含淋巴細胞的細胞群。本發明的淋巴細胞的製備方法中，通過適當調整該方法所提供的細胞的種類、培養條件等，例如可在先體外後體內進行淋巴細胞的擴大培養。含淋巴因子活化的細胞、細胞毒性T細胞(CTL)、腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)、NK細胞、稚細胞、記憶細胞等細胞中的至少一種細胞的細胞團。本說明書中的淋巴因子活化的細胞是指向含有淋巴細胞的末梢血(末梢血白細胞)和臍帶血、組織液等中加入IL-2,在試管內培養數日而得的具有細胞殺傷活性功能的細胞團。通常，上述細胞團稱作淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK細胞)，但由於該細胞團中也含有沒有殺傷胞(PBMC)、NK細胞、naive糹田月包、記憶細胞、造血幹細胞、臍帶血單核細胞等。另外，只要是血細胞均可在本發明中使用。可使用從活體末梢血、臍帶血等血液、從血液中除去紅細胞和血漿等成分、骨髓液等。再者，應用本發明的製備方法製備CTL時，既可使用給上述細胞進行抗原刺激誘導產生的CTL,也可使用活體來源的CTL。本發明的淋巴細胞的製備方法是一種包含在本發明的有效成分的細胞培養的全過禾i中進行:或是在其間的任和一段時間進行,也就是說，淋巴細胞的製備過程的部分過程中若包含上述步驟也包含在本發明內。本發明中，作為CD3配體無特殊限定，只要是具有CD3結合活性的物質即可，例如抗CD3抗體，優選抗CD3單克隆抗體，特別優選okt3。CD3配體在培養液中的濃度無特殊限定，例如，在使用抗CD3單克隆抗體時，例如，優選0.001100Mg/ml，更優選0.01100jug/m1.另外，本發明中作為CD28配體無特殊限定，只要是具有CD28結合活性的物質即可，例如抗CD28抗體、B7-1、B7-2、CD80,特別優選抗CD28單克隆抗體。CD28配體在培養液中的濃度無特殊限定，例如，在使用抗CD28單克隆抗體時，例如，優選0.001100iug/m1,更優選0.01100jug/m1.本發明中，纖連蛋白、其片段、或它們的混合物在培養液中的濃度無特殊限定，例如，優選0.001500jig/ml，更優選0,01500jug/m1.本發明的淋巴細胞的製備方法中使用的培養基無特殊限定，可使用混合了淋巴細胞擴大培養所必需成分的公知的培養基，例如可適當選擇商品化的培養基。這些培養基除含有其原本的構成成分外，還可含有適當的蛋白質、細胞因子、其它成分。優選在本發明中使用含IL-2的培養基。IL-2在培養基中的濃度無特殊限定，例如，優選0.011x105U/mL，更優選0.11xlo4U/mL。另外，還可添加其它，如凝集素等淋巴細胞刺激因子。該成分在培養基中的濃度無特殊限定，只要能獲得預期的效果即可。此外，在淋巴細胞的擴大培養過程中還可向培養基中添加血清和血漿。它們向培養基中的添加量無特殊限定，可以是0%~20%(體積百分比)。本發明者們發現，按照國際公開第2005/019450號公報中描述的進行淋巴細胞製備時，通過在纖連蛋白、其片段或者它們混合物的存在下進行淋巴細胞的製備，即使培養基中血清和血漿的總濃度在0%以上但小於5%(體積百分比)的低濃度，也可維持高的擴大培養率。也就是說，本發明中也同樣，從安全性和減輕患者負擔方面考慮，培養基中血清和血漿的總濃度優選在0%以上但小於5%(體積百分比)，但本發明中無限定。血清或血漿的來源既可是自己的(指來源與培養的淋巴細胞相同)也可是非己(指來源與培養的淋巴細胞不同)的，但從安全性觀點考慮優選使用自己來源的。這裡，血清和/或血漿的總濃度為0%是指不向培養基中添加血清和血漿。本發明的方法中，淋巴細胞的製備，也就是說淋巴細胞的擴大培養，通常在本發明的上述有效成分的存在下在含有特定成分的培養基中進行。本發明中使用的培養開始時的細胞數無特殊限定，例如，lcell/mL1x108cell/mL,優選lcell/mL5xio7cell/mL，更優選lcell/mL2x107cell/mL。另外，對培養條件無特殊限定，可使用常規的細胞培養中使用的條件。例如，可在37°C、5%C〇2等條件下進行培養。另外，可在適當的時間間隔內或向細胞培養液中添加新鮮的培養基進行稀釋，或換培養基，或換細胞培養用器材。例如，可使用細胞培養板、培養皿、培養瓶、培養袋、大型培養槽、生物反應堆等。這裡，作為培養袋可使用細胞培養用C02氣體透過性袋。另外，工業上製備大量的淋巴細胞時可使用大型培養槽。另外，培養既可在開放系統內進行也可在封閉系統內進行，但從所得淋巴細胞安全性的觀點考慮優選在封閉系統內進行培養。本發明中使用的(a)前述纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體除可溶解到培養基中共存外，還可固化到適當的固相載體上使用，例如細胞培養板、培養皿、培養瓶、培養袋等細胞培養器材(包含開放系統和封閉系統任一種)，或者珠子、膜、載玻片等細胞培養用載體上。這些固相的材質無特殊限定只要是可以在細胞培養中使用即可。將該成分，例如，固化到上述器材上時，將培養基裝入該器材時，按與該成分溶解到培養基中用時預期的濃度同樣的比例，針對裝入器材內的培養基量固化一定量的各成分。各成分的固化量無特殊限定，只要能獲得預期效果即可。上述載體，可在細胞培養時浸到細胞培養用器材中的培養液中使用。將上述成分固化到上述載體上時，將載體加入到培養基中時，優選按與該成分溶解到培養基中用時預期的濃度同樣的比例，針對裝入器材內的培養基量固化一定量的各成分。各成分的固化量無特殊限定，只要能獲得預期效果即可。另外，本發明的其它實施方案提供固化了(a)前述纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體的固相。該固相是指上述固相，優選細胞培養板、培養皿、培養瓶、培養袋、珠子、膜、載玻片等。上述(a)(c)固化到固相上的固化量無特殊限定，只要在本發明的淋巴細胞的製備方法中使用該固相時能獲得預期的效果即可，量，根據預期的結果進行適當決定。另外:上^(a)'(c)的固化方法，從提高固化率考慮優選在後述的酸性條件下進行固化。使用抗CD3抗體和抗CD28抗體作為CD3配體和CD28配體時，將這些抗體、纖連蛋白、其片段固化到固相上的方法無特殊限定，例如，在適當的緩沖液中通過讓這些抗體、纖連蛋白、其片段與固相接觸進行固化。特別優選，按照後面的實施例2和3中描述的，在酸性條件下進行固化，可更有效的進行這些抗體、纖連蛋白、其片段的固化。需要指出的是，在酸性條件下進行這些抗體、纖連蛋白、其片段的固化是本發明中首次闡明的。也就是說，本發明的其它實施方案提供固化了選自抗CD3抗體、抗CD28抗體、纖連蛋白及其片段中至少一種的製備方法，其特徵在於，在酸性條件下，將選自抗CD3抗體、抗CD28抗體、纖連蛋白及其片段中的至少一種與固相接觸。該酸性條件優選pH16.5，更優選46.5。另外，作為固相，優選前述細胞培養用載體等，不管材質和表面有無處理可使用這些載體。另外，關於纖連蛋白的片段向固相的固化，可按照國際公開第97/18318號公報及國際公開第00/09168號公報中記載的方法實施固化。一旦上述各種成分、本發明的有效成分固化到固相，按本發明的方法獲得淋巴細胞後，僅通過分離淋巴細胞與固相即可將有效成分等與淋巴細胞容易地分離，防止有效成分等混入淋巴細胞中。再者，還可將上述成分與選自國際公開第02/14481號公報中記載的、在具有抗原特異性細胞殺傷活性的細胞毒性T細胞的培養中有效的酸性多糖、酸性寡糖、酸性單糖及其鹽的化合物，和國際公開第03/016511號公報中記載的選自下面(A)~(D)的物質共用。(A)具有CD44結合活性的物質(B)能調控CD44配體與CD44結合而誘發的信號的物質(C)能抑制生長因子與生長因子受體結合的物質(D)能調控生長因子與生長因子受體結合而誘發的信號的物質作為具有CD44結合活性的物質的示例如CD44配體和/或抗CD44抗體。作為能調控CD44配體與CD44結合而誘發的信號的物質的示例如各種磷酸化酶和脫磷酸化酶的抑制劑或活化劑。作為能抑制生長因子與生長因子受體結合的物質的示例如具有與生長因子結合的活性、通過與生長因子形成複合體而抑制生長因子與生長因子受體結合的物質，或者具有與生長因子受體結合的活性、抑制生長因子與生長因子受體結合的物質。作為能調控生長因子與生長因子受體結合而誘發的信號的物質，其示例有，例如各種磷酸化酶和脫磷酸化酶的抑制劑或活化劑。這些成分在培養基中的濃度無特殊限定，只要能獲得預期的效果即可。另外，除了將這些成分溶解到培養基中共存之外，還可如前面所述的那樣將之固化到適當的固相上使用。上述各種物質既可單獨使用，也可2種以上混合使用。本發明中，國際公開第02/14481號公報和國際公開第03/016511號公報中記載的上述成分，在進行淋巴細胞的擴大培養時，對其存在狀態無特殊限定，只要在能發揮其功能的狀態下存在即可。例如，可將有效成分溶解到使用的培養基中，或固化到適當的固相上使用。培養液中上述成分的含有量無特殊限定，只要能獲得預期的效果即可，例如優選0.00(H10000Mg/ml，更優選0.00110000jug/ml，還更優選0.005~5000Mg/ml，還更優選0.011000jug/ml。穩定的淋巴細胞進行維持。另外，應用按本發明的方法獲得的淋巴細胞，還可按照本發明的方法和公知的方法，再進行擴大培養，獲得淋巴細胞。按本發明的方法獲得的淋巴細胞團含有具有細胞殺傷活性的淋巴細胞，該淋巴細胞具有識別預期的靶細胞的能力，例如可通過其細胞殺傷活性而破壞成為耙標的細胞。該細胞殺傷活性淋巴細胞的細胞殺傷活性可按照公知的方法進行評價。例如，細胞殺傷活性淋巴細胞對用放射性物質、螢光物質等標記的靶細胞的細胞殺傷活性，可通過細胞毒性淋巴細胞破壞的耙細胞釋放的放射活性和螢光強度進行評價。另外，可通過測定從細胞毒性'淋巴細胞和靶細胞特異性釋放的GM-CSF、IFN-Y等細胞因子量進行檢測。也可使用其它螢光素等標記的抗原-MHC複合體進行直接確認。該情況下，例如，讓細胞毒性淋巴細胞接觸與細胞毒性淋巴細胞特異性抗原偶聯的第1螢光標記物，然後，接觸與第2焚光標記物偶聯的抗原肽-MHC複合體，通過用流式細胞儀分析雙重標記細胞的存在來評價細胞毒性淋巴細胞的細胞殺傷活性。再者，正如在國際公開第03/080817號公報中描述的，本發明者們發現在纖連蛋白、其片段或它們的混合物存在的條件下進行淋巴細胞的製備，可以從低細胞數開始培養。也就是說，本發明的製備方法中，即使從少量的細胞開始也可進行高擴大培養率的培養，而與培養用的器材的大小無關。按照本發明的方法，應用一種細胞培養用器材的培養，換言之，用l個培養體系，可進行充分的淋巴細胞的擴大培養。因此，依照本發明的方法，可實現不需要稀釋細胞培養液的步驟的淋巴細胞的製備方法。例如，在細胞培養用器材中從低細胞數開始本發明的淋巴細胞的擴大培養時，可使用開始培養時滿足選自下面(X)和(Y)的條件的低濃度或低密度的細胞量。(X)使用的細胞培養用器材中細胞量與培養面積的比率為，優選lcellZcm25x103cells/cm2、更優選10cells/cm2~1x105cells/cm2、還更優選1x102cells/cm2~5x104cells/cm2。(Y)培養基中細胞的濃度為,優選lcell/mL~5xio5cells/mL、更優選10cells/mL~1xio5cells/mL、還更優選1x102cells/mL~5x104cells/mL。這裡，細胞量是指培養中使用的細胞的個數。另外，本發明的方法中示例了一種不需要對細胞培養液進行稀釋操作的步驟，在1個培養體系中進行淋巴細胞的擴大培養的方法。另外，由於本發明的方法適於從少量的淋巴細胞開始進行擴大培養，所以對CTL的克隆也有用。也就是說，即使是擴增選擇少量細胞數的CTL也可優選使用本發明的方法。再者，正如國際公開第2005/019450號公報中描述的，本發明者們發現在纖連蛋白、其片段或它們的混合物存在的條件下進行淋巴細胞的製備，可在高細胞數下進行培養。也就是說，在細胞培養用器材中進行淋巴細胞製備的方法，培養過程中包含至少一次用新鮮的培養基將細胞培養液進行稀釋的步驟、換培養基的步驟、或換細胞培養用器材的步驟時，即使這些步驟之後細胞培養液中細胞濃度達到高濃度(例如，細胞培養液中細胞的濃度為2x105cells/mL~1x108cells/mL、優選2x105cells/mL~5x107cells/mL、更優選2x105cells/mL~2x107cells/mL)，或者細胞培養液中細胞數與細胞培養用器材的培養面積的比率達比率為1xl。5cells/cm2~1x108cells/cm2、優選1x105cells/cm2~5x107cells/cm2、更優選1x105cells/cm2~2x107cells/cm2)時，也可實現良好的擴大培養率。本發明的在高細胞數下進行培養是指，培養過程中設定細胞濃度和細胞密度時，細胞培養液中細胞的濃度設定為2x105cells/mL~1x108cells/mL，或者細胞培養液中細胞數與細胞培養用器材的培養面積的比率設定為1x105cells/cm2~1x108cells/cm2這樣的高濃度或高密度條件下的淋巴細胞的製備。這裡所講的用新鮮培養基將細胞培養液進行稀釋的步驟之後、換培養基的步驟之後、或換細胞培養用器材之後不包含培養開始時。另夕卜，本發明的方法中特別是CTL的擴大培養中，可與適當的飼養細胞共培養。當將淋巴細胞與飼養細胞共培養時，希望用適於淋巴細胞、飼養細胞二者維持、生長的培養基。作為這樣的培養基，可使用商品化的培養基。本發明的方法中使用的飼養細胞無特殊限定，只要能與抗CD3抗體、抗CD28抗體共同刺激淋巴細胞、活化T細胞受體即可。本發明中，例如，可使用PBMC和EB病毒轉化的B細胞(EBV-B細胞)。通常，可用放射線照射等手段剝奪銅養細胞的增殖能力。飼養細胞在培養基中的含有量可按照公知的方法進行確定，例如，優選1xlo5cells/mL~lx10'cells/mL。特別優選的病毒實施方案中，作為飼養細胞可使用非感染細胞，例如，EBV-B細胞以外的細胞。這樣就能排除擴大培養的淋巴細胞中混有EBV-B細胞的可能性，從而使提高過繼性免疫療法這樣的利用細胞毒性淋巴細胞的醫療安全性成為可能。纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體的存在下，與IL-2—起，與末梢血單核細胞(PBMC)、NK細胞、臍帶血單核細胞、造血幹細胞或含有這些細胞的血液成分等共孵育而進行。另外，培養淋巴因子活化的細胞的一般條件，除使用上述培養基之外，可按照公知的條件(例如參照，細胞工學，VoU4，No.2,p223227(1995);細胞培養，17(6),pl92195(1991);THELANCET,Vol.356,p802807(2000》CurrentProtocolsinImmunology,supplement17,UNIT7.7)。對培養條件無特殊限定，可使用常規的細胞培養中使用的培養條件，例如，在37。C、5%C02等條件下進行培養。該培養通常實施215天。另外，在適當的時間間隔內可進行稀釋細胞培養液的步驟、換培養基的步驟、或換細胞培養用器材的步驟。與上述淋巴因子活化的細胞的擴大培養同樣，通過(a)纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體存在下的培養，對CTL、TIL的擴大培養也可實現高擴大培養率。本發明中，這些細胞的擴大培養中除在(a)纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配可使用適於上述細胞培養的培養基進行實施^(a)纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體的使用量，添加方法等，按照前面所講的方法進行適當的選擇。如實施例3中記載的，依照本發明的製備方法而獲得的淋巴細胞具有IL-2的產量非常高的特徵。如ZhouX.Y.etThejournalofimmunology,Vol.168,3847-3854(2002)中描述的，已知從淋巴細胞產生IL-2可作為淋巴細胞活化的指標，例如在淋巴細胞的擴大培養中，已知與僅用抗CD3抗體進行刺激相此，進行抗CD3抗體及抗CD28抗體共刺激時，其IL-2的產生量高。也就是說，由於按本發明的製備方法而獲得的淋巴細胞其IL-2產量極高，所以可以說是一種活化的淋巴細胞，是適用於過繼性免疫療法的淋巴細胞。定，例如包括癌、惡性腫瘤、肝炎和流感、HIV等病毒、細菌、真菌等為病原的感染性疾病，例如結核、MRSA、VRE、深在性黴菌病等。另外，如後面所述，當導入外源基因時，可期待對各種基因性疾病起效。放射線照射後的感染為目的的供體淋巴細胞輸注等。本發明的其它實施方案提供淋巴細胞培養用培養基，它含有以(a)纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體作為有效成分。該培養基還含有其它任意的成分，例如，公知的細胞培養中應用的培養基成分、蛋白質、細胞因子(優選IL-2)、所需的其它成分。該培養基中本發明的有效成分的含有量無特殊限定，只要能達到預期的效果即可。例如，參照本發明的方法中使用的上述培養基中的有效成分等的含有量，根據預期的效果進行適當確定。本發明的培養基的一實施方案，提供包含固化了(a)纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體的細胞培養用載體的培養基，以及封入到固化了(a)纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體的細胞培養用器材中的培養基。巴細胞。另外，本發;提供含有以該淋巴細胞作為有效成分的藥:(治療劑)。特別是，含有該淋巴細胞的治療劑適用於過繼性免疫療法。過繼性免疫療法中，適於患者治療的淋巴細胞，例如可通過靜脈內施用而施用給患者。該治療劑在對上述疾病和作為供體淋巴細胞輸注的使用中非常有用。該治療劑可按照製藥領域公知的方法進行製備，例如，以按照本發明的方法製備的淋巴細胞為有效成分與例如，公知的適於非經口途徑施用的有機或無機的載體、賦形劑、穩定劑等進行混合。治療劑中本發明的淋巴細胞的含有量、治療劑的施用量、與該治療劑有關的諸條件可按照過繼性免疫療法進行適當確定。本發明的淋巴細胞的製備方法中還包含向淋巴細胞中導入外源基因的步驟。也就是說，作為一實施方案，本發明提供還包含向淋巴細胞中導入外源基因步驟的淋巴細胞的製備方法。這裡"外源"是指針對基因導入對象淋巴細胞而言是外來的。通過實施本發明的淋巴細胞的擴大培養方法，可增強培養的淋巴細胞的增殖能力。因此，期待通過本發明的淋巴細胞的製備方法與基因導入工程的聯合應用，能提高基因的導入效率。對外源基因的導入手段無特殊限定，可根據公知的基因導入方法選擇適當的方法使用。基因導入工程可在淋巴細胞製備過程中的任意時間點進行。例如，從導入效率的觀點來看，優選在上述淋巴細胞的擴大培養的同時，或者在該步驟之後實施。作為基因導入的方法，使用病毒載體的方法、不使用該載體的方法均可在本發明中使用。關於這些方法分詳細描述已在許多文獻中發表。對上述病毒載體無特殊限定，通常可使用基因導入方法中使用的公知的病毒載體，例如，逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、猿病毒載體、牛痘病毒載體或仙臺病毒載體等。作為表達載體，特別優選，逆轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、慢病毒載體或猿病毒載體。上述病毒載體，優選那些在感染細胞中不能自我複製的缺失複製功能的。逆轉錄病毒載體以及慢病毒載體，能將插入到該載體中的外源基因穩定整合到導入了該載體的細胞的染色體DNA中，可在基因治療等目的中使用。由於該載體對分裂、增殖中的細胞的感染效率高，所以優選在本發明的擴大培養過程中進行基因導入。作為不使用病毒載體的基因導入方法在本發明中沒有限定，例如，可使用使用脂質體、配體-多聚賴氨酸等載體的方法、磷酸釣法、電穿孔法、粒子槍法等。這些情況下，可將外源基因導入質粒DNA和線性DNA中。本發明中對導入到淋巴細胞中的外源基因無特殊限定，可選擇任意希望導入到上述細胞中的基因。作為上述基因，例如，除可使用編碼蛋白質(例如，酶、細胞因子類、受體類等)的基因之外，也可使用編碼反義核酸和siRNA(smallinterferingRNA)、核糖酶的基因。另外，可同時導入可對導入了基因的細胞進行選擇的適當的標記基因。上述外源基因，例如，可插入到適當的啟動子調控表達的載體和質粒等中使用。另外，為了實現高效的基因轉錄，載體內可存在與啟動子和轉錄起始位點協同作用的其它調節元件，例如，增強子序列和終止子序列。另外，為了通過同源重組而將外源基因插入到導入對象淋巴細胞的染色體內，例如，可在由與染色體中該基因預期的插入部位兩側的鹼基序列有相應的同源性的鹼基序列構成的側翼序列間配置外源基因。導入的外源基因可以是天然的，也可是人工製備的，或者是起源不同的DNA分子通過連接等公知的手段進行結合而形成的。此外，也可是含有根據本發明的方法。例如，可將編碼與癌等患者的治療中使用的藥劑的耐藥相關的酶的基因導入淋巴細胞而賦予淋巴細胞耐藥性。若應用這樣的淋巴細胞，可聯合應用過繼性免疫療法和藥劑療法，因而，使進一步獲得高的治療效果成為可能。作為耐藥基因的示例如多藥耐藥基因(multidrugresistancegene)。另一方面，與上述實施方案相反，將能賦予對特定藥劑敏感性的基因導入淋巴細胞，可賦予對該藥劑的敏感性。該情況下，通過將該藥劑施用給活體移植後的淋巴細胞可被去除。作為賦予藥劑敏感性的基因的示例有例如，胸腺嘧啶脫氧核苦激酶基因。實施例以下，列舉實施例對本發明進行更具體的說明，但本發明並不限定於此。實施例1通過CH-296及抗人CD3抗體、抗人CD28抗體共刺激而進行的淋巴細胞的擴大培養中擴大培養率的測定(1)PBMC的分離和保存從獲得知情同意權的健康捐贈人實施成分採血，然後，用磷酸鹽緩沖生理鹽水2倍稀釋所採血液，覆蓋於Ficol-paque(AmershamBiosciences)上，500xg離心20分鐘。回收中間層的末梢血單核細胞(PBMC)團，洗滌。將採集的PBMC懸浮到包括90%FBS(Cambrex)/10。/oDMSO(SIGMA)的保存液中，液氮中保存。進行淋巴細胞擴大培養時，將這些凍存的PBMC於37。C水浴中快速溶解，用含10jug/mlDNase(Calbiochem)的RPMI1640培養基(SIGMA)洗滌後，用臺盼蘭法算出活細胞數供各實驗使用。(2)將抗人CD3抗體、抗人CD28抗體及CH-2%固化到培養板向12孔細胞培養板(BectonDickinson)中添加含終濃度為5|ug/ml的抗人CD3抗體(Janssen-Kyowa)的醋酸緩沖水溶液，1.9mL/孔。醋酸緩沖水溶液的配製是，0.2M醋酸(從00212-43配製，NACALAITESQUE)和0.2M醋酸鈉水溶液(從311-19配製，NACALAITESQUE)以1:4的比例(體積比)混合，pH5.3。此時，在用抗人CD28抗體進行刺激的組中，添加終濃度為5jug/ml的抗人CD28抗體(DakoCytomation,RB342)。用CH-296進行刺激的組中，添加終濃度為25)ag/ml的CH-296。將這些板室溫孵育5小時後，吸去含抗體、CH-296的醋酸緩衝水溶液，用磷酸緩沖生理鹽水洗滌各孔2次，用RPMI培養基洗滌1次，供各實驗使用。(3)淋巴細胞的擴大培養將實施例1-(1)中製備的PBMC懸浮到含3%人AB血清(Cambrex)的AIM-V(Invitrogen,以下略作3%AIM-V)中，使其濃度調整為0.5x106cells/mL,然後向實施例1-(2)中製備的固化了抗體及CH-296的板中添加3%AIM-V,2mL/孔，向其中添加調配了的細胞液，lmL/孔。其後，向用抗人CD3抗體單一刺激的組中及用抗人CD3抗體和CH-296共刺激的組中添加終濃度為1000U/mL的IL-2(鹽野義製藥社制)(也就是說，用抗人CD28抗體進行刺激的組中不添力口IL-2),5%C02、37。C下培養這些培養板(培養第0天)。各組中，在培養開始後第4天、第7天、第11天，按以下的方法進行傳代培養。回收部分細胞培養液，用臺盼蘭染色法計算活細胞數後，用含1%人AB血清的AIM-V將培養液稀釋到適宜的濃度，轉移到什麼都沒固化的新的12.5cm2的培養瓶(BectonDickinson,353107)中，添加終濃度為500U/mL的IL-2,傳代培養(培養開始後第4天以後所有的組中都添加IL-2)。進行傳代培養後細胞的濃度分別稀釋成培養開始第4天0.05x106cells/mL，第7天0J5x106cells/mL,第11天0.2x106cells/mL。培養開始後第15天，用臺盼蘭染色法計算活細胞數，與培養開始時的細胞數進行比較，計算出擴大培養率。其結果示於表l中。表1中分別顯示了僅用抗人CD3抗體進行刺激、用抗人CD3抗體與CH-296、抗人CD3抗體與抗人CD28抗體、抗人CD3抗體與抗人CD28抗體與CH-2%進行刺激時細胞群的增殖率。[表l]tableseeoriginaldocumentpage24一般情況下，已知用抗人CD3抗體與抗人CD28抗體進行同時刺激可促進淋巴細胞的增殖。如表1所示，抗人CD3抗體與CH-296的共刺激組顯示更高的擴大培養率。4艮明顯，向抗人CD3抗體與抗人CD28抗體共刺激中再添加CH-296刺激，擴大培養率更進一步提高。實施例2各種pH下，抗人CD3抗體、抗人CD28抗體、CH-296固化到培養板的固化率製備緩衝液從Dulbecco，s的PBS粉末(日水製藥社制)製備成pH7.4的磷酸緩沖生理鹽水；將0.2M磷酸二氫鈉水溶液(NACALAITESQUE,由317-20製備)與0.2M磷酸氬二鈉水溶液(NACALAITESQUE,由318-10製備)以8.15:1.85的比率(體積比)混合，製備成pH6.2的磷酸鈉緩衝水溶液；將0.2M醋酸與0.2M醋酸鈉水溶液以l:4(體積比)的比率混合，製備成5.3的醋酸緩衝水溶液。將用這些緩沖液將其終濃度調整為5iag/ml的抗人CD28抗體的各溶液，添加到％孔細胞培養板(BectonDickinson,353072)中，100jlU/孑U然後室溫孵育5小時，進行固化。另外，同樣，將終濃度調整為5|ug/ml的抗人CD3抗體的各溶液，或者將終濃度調整為25)lig/ml的CH-2%的各溶液添加到各孔，160yl/孔，然後同樣室溫固化5小時。固化結束後，去除含抗體或者CH-296的緩沖液，添加用磷酸緩衝生理鹽水4倍稀釋的BlockAce(大日本製藥社制,UK-B25)，300)nl/孔，室溫放置l小時，進行封閉。其後，除去溶液，添加與固化液等量的溶解於用磷酸緩衝生理鹽水10倍稀釋的BlockAce中的檢測用抗體。作為檢測用抗體，使用HRP-rabbitAnti-MouseIgG(ZYMED，61-6520)檢測抗人CD3抗體和抗人CD28抗體，使用HRP標記的Anti-HumanFibronectin(CloneFNH3-8,TAKARABIOINC.,M115)檢測CH-296。反應l小時後，再度除去溶液，添加與固化液等量的ABTS溶液(SIGMA,由A1888-2G製備)，反應10分鐘後，添加ABTS半量的150mM草酸溶液(NACALAITESQUE,由25806-74製備)終止反應。除去各溶液時，用磷酸緩沖生理鹽水洗滌3次。反應終止後，用吸光酶標儀(MicroReader4,Hyperion)測定405nm的吸光度。其結果示於表2中。表2是用吸光度的值比較抗人CD3抗體、抗人CD28抗體、CH-296在pH7.4，6.2,5.3三種條件下的固化率的結果。[表2]表2tableseeoriginaldocumentpage25如表2所示，抗人CD3抗體、抗人CD28抗體、CH-296均是pH越低固化率越高，這表明在pH5.3的條件下進行固化時，其固化率最高。實施例3用各種pH條件下固化的培養板進行淋巴細胞的擴大培養時，比較其IL-2的產量用與實施例1同樣的方法進行淋巴細胞的擴大培養。只是將抗人CD3抗體、抗人CD28抗體、CH-296固化到12孔細胞培養板上時，使用pH7.4的磷酸緩沖生理鹽水和pH6.2的磷酸鈉緩衝水溶液作為緩沖液，而不使用pH5.3的醋酸緩沖液。兩種緩沖液的配製與實施例2相同。另外，培養開始時接種的細胞數是1x10、ells/孔。到培養開始後第4天，大約每24小時回收培養上清一次，供ELISA分析，測定上清中的IL-2濃度。ELISA分析使用ELISADevelopmentKithumanIL-2(Genzyme/Techne,4904)進行。其結果如表3所示。表3比較了用pH7.4的磷酸緩衝生理鹽水和pH6.2的磷酸鈉緩衝水溶液進行固化時，用抗人CD3抗體、抗人CD28抗體、CH-296刺激細胞時的IL-2產量。[表3]表3tableseeoriginaldocumentpage26如表3所示，與pH7.4相比，用pH6.2進行固化時其IL-2產量增加。另夕卜，同樣比較用pH6.2的磷酸鈉緩沖水溶液與pH5.3的醋酸緩衝水溶液進行固化時IL-2的產量。用與實施例1同樣的方法進行淋巴細胞的擴大培養。只是將抗人CD3抗體、抗人CD28抗體、CH-296固化到12孔細胞培養板上時，除pH5.3的醋酸緩沖水溶液作為緩沖液之外，還設定應用pH6.2的磷酸鈉緩沖水溶液組。到培養開始後第4天，大約每24小時回收培養上清一次，供ELISA分析，同樣測定上清中的IL-2濃度。其結果如表4所示。表4比較了用pH6.2的磷酸鈉緩沖水溶液與pH5.3的醋酸緩沖水溶液進行固化時，用抗人CD3抗體、抗人CD28抗體、CH-296刺激細胞時的IL-2產量。[表4]表4tableseeoriginaldocumentpage26如表4所示，與pH6.2相比，用pH5.3進行固化時其IL-2產量增加。另外提示，與用抗人CD3抗體和抗人CD28抗體進行刺激所得的細胞相比，用抗人CD3抗體、抗人CD28抗體和CH-296進行刺激所得的細胞其IL-2產生能力高。—般情況下，已知用抗人CD3抗體與抗人CD28抗體進行共刺激誘導IL-2的產生。表3和表4表明，再加上CH-296的刺激，IL-2的產量增加，發現了CH-2%的新的有效性。另外表明，在pH5.3的條件下將抗人CD3抗體、抗人CD28抗體和CH-296固化到培養板時其固化率最高，IL-2的產量最多。也就是說，這表明通過在pH5.3的條件下進行固化，抗體和CH-296給細胞的刺激更強，因而更加活化了淋巴細胞的增殖和細胞因子的產生等，並且發現了應用CH-296進行淋巴細胞擴大培養的高效性。考慮表3和表4中，pH6.2的固化條件下培養第4天的細胞IL-2產生量的差異是由於培養開始時細胞數的不同而產生的影響。實施例4應用固化了抗人CD3抗體、抗人CD28抗體的珠子和固化了CH-296的珠子進行淋巴細胞的擴大培養(1)對照珠子和CH-296珠子的製備應用DynabeadsM-450Epoxy(DYNAL,140-01)製備固化了CH-296的珠子(以下稱作CH-296珠子)，和沒有固化任何抗體和蛋白質僅進行了封閉的珠子(以下，稱作對照珠子)。按照產品的說明書進行製備。向終濃度為200yg/mL的CH—296溶液中懸浮4x108beads/mL，5。C孵育18小時，進行固化。應用人血清白蛋白(Buminate25%，Baxter,7783)進行封閉。(2)應用珠子的淋巴細胞的擴大培養按照附屬的說明書將DynabeadsCD3/CD28TCellExpander(DYNAL,l11-31,以下略作TCellExpander)洗滌後，將其懸浮到含1。/q人血清的AIM—V(以下略作1%AIM-V)中，使其達3x16beads/mL,加到12孔細胞培養板中lmL/孔。將實施例4一(1)中製備的對照珠子和CH-296珠子與TCellExpander同樣洗滌後懸浮到1%AIM-V中，1.9x106beads/mL。將對照珠子的懸浮液添加到抗人CD3抗體和抗人CD28抗體共刺激的組中，將CH-296珠子的懸浮液加到抗人CD3抗體、抗人CD28抗體和CH-296共刺激的組中，以加入到TCellExpander懸浮液中的形式添加到12孔細胞培養板中，lmL/孔。將實施例1-(1)中製備的PBMC懸浮到1%AIM—V中，1x106cells/mL並添加到添加了珠子懸浮液的12孔細胞培養板中，lmL/孔(共3mL/孔)。其後，向各孔添加終濃度200U/mL的IL-2,5%C02、37。C的培養箱內培養培養板(培養第0天)。培養開始後第4天、7天、10天，按以下方法進行傳代培養。回收部分細胞培養液，用臺盼蘭染色法計算活細胞數，用1。/。AIM—V將培養液稀釋到適宜的濃度，轉移到12.5cn^的培養瓶中，添加終濃度200U/mL的IL-2。培養液的稀釋要達到傳代後細胞的濃度分別為，第4天0.05x106cells/mL、第7天0.1xl06cells/mL、第10天0.15xI06cells/m。培養開始後第14天計算活細胞數，與培養開始時的細胞數進行比較算出擴大培養率。結果如表5所示。表5中顯示了用TCellExpander和對照珠子、或者CH-296珠子刺激的細胞群進行14天的擴大培養後的增殖率。[表5]表5tableseeoriginaldocumentpage28如表5中所示，與對照珠子添加組相比，CH-296珠子添加組顯示更高的擴大培養率。這表明除固化了抗人CD3抗體、抗人CD28抗體的珠子外，同時添加固化了CH-296的珠子，可更進一步促進淋巴細胞的增殖。實施例5應用固化了抗人CD3抗體、抗人CD28抗體和CH-296的珠子進行淋巴細胞的擴大培養(1)固化了抗人CD3抗體、抗人CD28抗體和CH-296的珠子的製備用與實施例4-(l)同樣的方法進行。只是固化時應用混合了終濃度為125|ug/mL的抗人CD3抗體、50jug/mL的抗人CD28抗體、125jug/mL的CH-296的緩沖液。(2)應用珠子進行淋巴細胞的擴大培養用與實施例4-(2)同樣的方法進行。只是培養開始時，使用實施例5-(1)中製備的珠子作為刺激細胞的珠子，使用含有0.5%人AB血清和0.2%人血清白蛋白的GT-T503培養基(TAKARABIOINC.，以下略作0.5%GT-T503)，細胞數為0.5xi06cellsAL，培養液量是1.5mL/孔。珠子的添加量設為0.5x1。6beads/孔和5x16beads/孔兩組。另外，關於傳代培養，在培養開始後第4天、第8天、第11天進行傳代，傳代後細胞的濃度分別為，第4天0.02x106cells/mL、第8天0.15x106cells/mL、第11天0.3x106cells/m。培養基使用0.5%GT-T503。培養開始後第14天計算活細胞數，與培養開始時的細胞數進行比較算出擴大培養率。結果如表6所示。關於用固化了抗人CD3抗體、抗人CD28抗體和CH-296的珠子刺激細胞，表6中顯示了用0.5x106beads和5x106beads刺激的細胞群進行14天的擴大培養後的增殖率。[表6]表6tableseeoriginaldocumentpage29如表6所示，應用同時固化了抗人CD3抗體、抗人CD28抗體和CH-296的珠子可進行淋巴細胞的擴大培養。產業上利用的可能性本發明提供一種淋巴細胞的製備方法。該方法的細胞增殖率高，依照本發明獲得的淋巴細胞適用於，例如，過繼性免疫療法。因此，期待本發明的方法能在醫療領域做出重大貢獻。附圖簡述[圖1]是纖連蛋白功能域結構的模式圖序列表文本SEQIDNO.l,命名為III--8的纖連蛋白的部分區域。SEQIDNO.2,命名為m--9的纖連蛋白的部分區域。SEQIDN0.3,命名為m--10的纖連蛋白的部分區域。SEQIDN0.4,命名為m--11的纖連蛋白的部分區域。SEQIDN0.5,命名為iii--12的纖連蛋白的部分區域。SEQIDN0.6,命名為m--13的纖連蛋白的部分區域。SEQIDNO.7,命名為iii--14的纖連蛋白的部分區域。SEQIDNO.8,命名為cs-1的纖連蛋白的部分區域。SEQIDNO.9,命名為c-274的纖連蛋白片段。SEQIDNO.10,命名為H-271的纖連蛋白片段。SEQIDNO.ll,命名為H-296的纖連蛋白片段。SEQIDNO.12,命名為CH-271的纖連蛋白片段。SEQIDNO.13,命名為CH-296的纖連蛋白片段。SEQIDN0.14,命名為C-CS1的纖連蛋白片段。SEQIDN0.15,命名為CHV-89的纖連蛋白片段。SEQIDN0.16,命名為CHV-90的纖連蛋白片段。SEQIDN0.17,命名為CHV-92的纖連蛋白片段。SEQIDN0.18,命名為CHV-179的纖連蛋白片段。SEQIDN0.19,命名為CHV-181的纖連蛋白片段。SEQIDNO.20,命名為H-275-Cys的纖連蛋白片段。SEQIDN0.21,命名為CH-296Na的纖連蛋白片段。權利要求1.一種淋巴細胞的製備方法，其特徵在於，它包括在(a)纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體存在的條件下進行擴大培養的步驟。2.權利要求1的製備方法，其中CD3配體是抗CD3抗體。3.權利要求1的製備方法，其中CD28配體是抗CD28抗體。4.權利要求1的製備方法，其中纖連蛋白片段是包含至少一個序列表序列號1~8中所示胺基酸序列的多肽(m),或者是包含至少一個在上述任一胺基酸序列中至少1或數個胺基酸發生置換、缺失、插入或者附加所得的胺基酸序列、並與上述多肽(m)具有同等功能的多肽(n)。5.權利要求4的製備方法，其中纖連蛋白的片段，具有細胞黏附活性和/或肝素結合活性。6.權利要求5的製備方法，其中纖連蛋白的片段是選自具有序列表中序列號9~21所示任一胺基酸序列的多肽中的至少一種多肽。7.權利要求l的製備方法，其中淋巴細胞是淋巴因子活化的細胞。8.權利要求1的製備方法，它還包含向淋巴細胞中導入外源基因的步驟。9.權利要求8的製備方法，它應用逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒或者猿病毒導入外源基因。10.按照權利要求19任一項所述的方法而獲得的淋巴細胞。11.一種藥物，它包含以按照權利要求1~9任一項中描述的方法而獲得的淋巴細胞作為有效成分。12.—種固化了選自抗CD3抗體、抗CD28抗體、纖連蛋白及其片段的至少一種物質的固相的製備方法，其特徵在於，在酸性條件下，將選自抗CD3抗體、抗CD28抗體、纖連蛋白及其片段的至少一種物質與固相接觸。13.權利要求12的製備方法，其中固相是細胞培養用載體。14.一種固相，它固化了(a)纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體。15.權利要求14的固相，其中固相是細胞培養板、培養皿、培養瓶、袋、珠子、膜或載玻片等。全文摘要一種淋巴細胞的製備方法，其特徵在於，它包括在(a)纖連蛋白，其片段或它們的混合物，(b)CD3配體，及(c)CD28配體，存在的條件下進行擴大培養的步驟。文檔編號C07K14/435GK101243187SQ20068003005公開日2008年8月13日申請日期2006年8月10日優先權日2005年8月17日發明者佐川裕章,円居隆宏,加藤彰子,加藤鬱之進,村木信子,榎龍嗣,長嶺衣子申請人:寶生物工程株式會社