食物致敏原，檢測食物過敏原的方法和檢測誘導食物過敏原的食物的方法

2023-06-19 00:26:31

專利名稱：食物致敏原，檢測食物過敏原的方法和檢測誘導食物過敏原的食物的方法
食物致敏原，檢測食物過敏原的方法和檢測誘導食物過敏原的食物的方法本發明申請是PCT專利申請PCT/JP02/09066，申請日為2002年9月5日發明名稱為「食物致敏原，檢測食物過敏原的方法和檢測誘導食物過敏原的食物的方法」的發明專利申請的分案申請，母案進入中國的申請號為02822093. 5。
背景技術：
本發明涉及一種包含食物過敏性病人體內IgE抗體能夠識別的多種天然和/或變性過敏原的混合物、通過使用該混合物免疫動物製備的抗體、利用所述抗體檢測食物過敏·原和誘導過敏反應的食物的方法。本發明給對食物過敏的病人提供了安全性，這是因為本發明有助於理解食物過敏反應的發生機制，開發和檢驗低過敏原性的食物，檢測食物、食物原料和諸如食物製作機器及過程之類的食物製作環境中的過敏原。食物過敏反應是易感個體攝取的食物中誘導過敏反應的物質(以下稱為食物過敏原)所導致的有害免疫反應。食物過敏反應能夠導致皮炎、哮喘、消化道障礙、過敏反應性休克等。根據疾病發生的機制將過敏反應分為I型至IV型。食物過敏反應主要是I型過敏反應,其中IgE抗體和攝入體內的食物過敏原發生反應。近年來，食物過敏病人的數目一直在上升。這種現象導致了醫學和食品工業領域中的嚴重問題。為了預防這種危害，有必要通過標籤給消費者提供有關信息。FA0/WH0聯合食品標準委員會(食品法規聯合委員會(Codex Alimentarius Commision))已經認識到食品標籤上註明包含已知為食物過敏原的八種原料中任何一種的必要性，並建議各成員國實施該標籤系統(1999年6月)。考慮到食物過敏原的嚴重性和經常性，日本已頒布了 24條標籤法規(2002年4月生效)。應該注意的是這些規定不是要求註明過敏原性物質或食物過敏原本身，而是要求註明包含過敏原性物質和食物過敏原的食物，即誘導過敏反應的食物。誘導過敏反應的食物包括蛋、奶、肉、魚、甲殼動物和軟體動物、穀類、豆類和堅果、水果、蔬菜、啤酒酵母或明膠。類似地，卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶、酪蛋白、￠-乳球蛋白、a-乳清蛋白、麵筋、a-澱粉酶抑制劑等都是誘導過敏反應的食物。另外，(I)不考慮現有的知識，必然還有許多其他食物和成分(食物過敏原)能夠導致食物過敏反應；(2)誘導過敏反應的食物和成分(食物過敏原)是多樣的，對這些過敏原的反應根據不同的食物過敏性病人而異；和(3)如後面的實施例中所述，在誘導過敏反應的單一食物中存在有多種已知和未知的過敏原。然而，使用傳統的方法不易於檢測如此眾多的誘導過敏反應的食物或食物過敏原。食物通過加熱、冷凍、乾燥、鹽化、發酵、酶處理等方法(以下稱為食物加工方法)製作，以改善和穩定它們的可消化性、保存期限、口感、物理特性等。雖然食物加工方法影響蛋白質，改變它們的分子結構(如使蛋白質變性)，但是很少論及這些食物加工方法是否能夠導致食物過敏原的形成。本發明闡明了以下一些事實(1)一些加熱過的食物成分表現出變應原性；(2)取決於該食物加熱與否，誘導過敏反應的單一食物中誘導過敏反應的組分或表位可能發生改變。即，製備了 a)未加熱過的蛋類抗原，b)通過對a)中的抗原加熱製作的加熱過的蛋類抗原，C)通過將從多個食物過敏性病人匯集(pooled)的血清(稱為匯集的病人血清)和a)(去除了(cbpleted)未加熱過的蛋類抗原的血清)相混合製備的血清，和d)通過將匯集的病人血清和b)(去除了加熱過的蛋類抗原的血清)相混合製備的血清。a)和c)或a)和d)之間，和b)和c)或b)和d)之間反應的結果表明，去除了未加熱過的蛋類抗原的血清不能和未加熱過的蛋類抗原發生免疫反應，但能夠和加熱過的蛋類抗原發生反應；類似地，去除了加熱過的蛋類抗原的血清不能和加熱過的蛋類抗原發生免疫反應，但能夠和未加熱過的蛋類抗原發生反應。總之，食物過敏性病人攜帶有對加工和未加工食物都特異的IgE抗體，導致食物過敏反應。但是目前為止，還沒有簡單的方法能夠檢測加工後食物中的過敏原或其成分。篩選雞蛋、花生、酪蛋白、￠-乳球蛋白、麵筋中食物過敏原的方法能夠由商業途徑獲得(食品與開發，Vol.35，pl0_ll)。但是，所有這些方法或其中的一些具有以下一種或多種缺陷(1)這些方法不能總是檢測到食物過敏性病人對之敏感的抗原。也就是說，它們不能夠總是檢測到病人IgE抗體所能識別的物質；(2)這些方法能夠檢測已知抗原，且每種方法僅能檢測到一種過敏原(單一的抗原)；(3)這些利用檢測單一抗原的抗體的方法不適用 於含抑制性物質的食物；(4)如下面的實施例中所示，這些利用檢測單一抗原的抗體的方法不能對誘導過敏反應的食物進行精確的定量；(5)這些利用檢測單一抗原的抗體的方法不適用於檢查不含抗原的誘導過敏反應的食物(如利用通過和卵白中的卵清蛋白相接觸製備的單一抗體的方法不適用於檢查蛋黃、蛋黃醬等。而已知食物過敏反應由蛋黃所致);(6)這些利用檢測單一抗原的抗體的方法不適用於檢查加工過的食物，這是因為它們不能夠檢測變性或分子修飾過的過敏原；和(7)抗天然和變性￠-乳球蛋白、卵清蛋白和a-酪蛋白的單克隆抗體已有報導(Allergy，Vol. 50，p309)。但如果食物加工方法去除或改變了其表位，則這些方法的用途就會減小，這是因為單克隆抗體僅能檢測食物過敏原分子中的單一表位。雖然利用從對大米(日本專利公開2000-65820)、蛋和奶(日本肉類科學，vol. 39, pl66-169)過敏的病人體內獲得的血清篩選食物過敏原的方法已有報導，並在醫院裡得以應用，但是不適用於檢查團體，也不適用於食品加工廠，這是因為這些方法需要從病人體內獲得大量血清。雖然依賴於過敏反應的食物抗原檢測法已有報導(FFIJ.，No. 180，p77-82)，但是複雜的方法學和實驗室動物飼養使得該方法在多數食品加工廠裡不適用。雖然已經建立了利用流式系統和酶標抗體和利用微電極的過敏原感受器的方法(日本食品工業，Vol. 42，p53-56)，在這些方法投入實際應用之前有許多問題尚待解決。

發明內容
本發明的完成是為了解決上述傳統方法中的問題。本發明的目的是提供(I)包含食物敏感性病人的IgE抗體能夠識別的多種已知和/或未知以及天然和/或變性食物過敏原的混合物(為方便起見，稱為本發明的第一項發明)，(2)通過用混合物免疫動物而製備的抗體(稱為本發明的第二項發明)，和(3)利用所述抗體檢測食物過敏原和誘導過敏反應的食物的方法(稱為本發明的第三項發明)。附圖簡述

圖1所示為標準抗原和病人IgE抗體之間的反應，以及標準抗原和本發明中的抗標準抗原抗體的抗體之間的反應。圖2所示為攜帶有對天然和變性蛋類蛋白特異的IgE抗體的病人血清。實施本發明的最佳方式本發明的第一項發明可以這樣完成(l_i)從食物過敏性病人匯集的血清中分離IgE抗體，和(1-1i)利用親和層析和免疫沉澱之類的免疫學方法，從經過或不經過食物製作方法處理的食物或其成分(下面總稱為食物)中分離上述IgE抗體能夠識別的多種物質(換句話說，食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種食物過敏原)。本發明的第一項發明也可以這樣完成 (2-1)按常規方法對食物成分進行SDS-PAGE，並轉移到膜上，(2-1i)利用膜、匯集的病人血清、抗人IgE的偶聯抗體和顯色試劑進行Western印跡分析(換句話說，製作食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種食物過敏原的圖譜)，(2-1ii)類似地，利用膜、按常規方法將食物成分免疫動物製備的動物血清、偶聯的抗動物IgG的抗體和顯色試劑進行Western印跡分析,然後(2-1v)比較二者的Western印跡分析圖譜，測定前者中不存在而後者中存在的條帶(換句話說，就是食物過敏性病人的IgE不能夠識別的多種物質)的分子大小，並(2-v)根據上述結果，通過凝膠過濾層析之類的傳統方法從食物成分中分離食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種食物過敏原。本發明的第二項發明是抗食物過敏原的動物抗體(被稱為識別多種抗原的抗體)，該抗體通過將多種食物過敏原(包括加工和/或未加工的食物過敏原)免疫動物而製備，其中的食物過敏原通過上述的第一項發明製備，且能夠被食物過敏性病人的IgE抗體所識別。本發明的第三項發明是檢測食物過敏原和誘導過敏反應的食物的方法，該方法的特徵在於利用識別多種抗原的抗體。上述的食品製作方法中熱處理的溫度範圍和食品加工方法的溫度範圍相同，優選在40和250攝氏度之間，更優選在60和120攝氏度之間。通過將原料抗原和在兩個至六個不同的溫度下加熱過的抗原相混合，製備抗原。食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的食物過敏原組分根據本發明的第一項發明從混合物製備，並用其接種動物。如果檢測的目標僅限於加熱過的食物，則食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的食物過敏原組分用本發明的第一項發明從加熱過的食物製備，並用其接種動物。舉例來說，接種的動物可以是兔、山羊、綿羊、大鼠、小鼠、豚鼠、馬、豬、雞等。在免疫期間，需要部分採血，測定抗食物過敏原抗體的滴度。本發明的抗體可以是單克隆抗體，也可以是多克隆抗體。如下面所述的實施例所示，即使在一種食物過敏反應誘導性食物中也存在食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種已知和未知食物過敏原。通過使用多種食物過敏原免動物，易於製備識別多種食物過敏原的多價抗體，即識別多種抗原的抗體。作為針對食物過敏性病人IgE抗體能夠識別的食物過敏原的動物抗體，動物的抗血清可以直接使用。對於含食物過敏性病人IgE抗體不能識別的組分，進行吸收處理及傳統的IgG純化後使用抗血清。本發明中檢測食物過敏原和誘導食物過敏反應的食物的方法無限制地適用於包含過敏原的食物。舉例來說，誘導過敏反應的食物的例子是蛋、奶、肉、魚、甲殼動物和軟體動物、穀類、豆類和堅果、水果、蔬菜、啤酒酵母和明膠。更具體地說，蛋的蛋白和蛋黃、奶及其奶酪、肉類的豬肉、牛肉、雞肉和羊肉，魚類的鯖魚、日本花鯖、沙丁魚、金槍魚、鮭魚、鱈魚、平魚和鮭魚魚子醬，甲殼動物和軟體動物類的蟹、小蝦、貽貝、魷魚、章魚、龍蝦和鮑魚，穀類的小麥、米、蕎麥、黑麥、大麥、燕麥、玉米、黍、穀子和稗，豆類和堅果類的大豆、花生、可可豆、豌豆、腰果、榛子、巴西堅果、杏仁、椰子果和核桃，水果類的蘋果、香蕉、橘、桃、獼猴桃、草莓、瓜、鱷梨、葡萄、芒果、梨、芝麻和芥菜，蔬菜類的西紅柿、蘿蔔、土豆、菠菜、洋蔥、大蒜、竹筍、南瓜、地瓜、芹菜、歐芹、山藥、松蘑，含有它們的食物及其成分(如卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶、酪蛋白、￠-乳球蛋白、a-乳清蛋白、麵筋、a-澱粉酶抑制劑)。這些食物可以通過加熱、冷凍、乾燥、鹽化、發酵、酶加工等進行處理。一般說來，食物過敏性病人的IgE抗體的識別可能性為50%或更大的過敏原被稱作主要過敏原,否則稱作次要過敏原。有些病人對主要過敏原不敏感,而對次要過敏原敏感。因此，篩選食物過敏原的方法應該既檢測主要過敏原，又檢測次要過敏原。本發明的篩選方法能夠檢測食物過敏性病人能夠識別的天然和變性的多種過敏原。
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為了製備符合這種要求的抗體，本發明作了研究並有以下發現。即，按常規方法對食物成分進行SDS-PAGE分析，並將凝膠轉移到膜上(i)利用膜、匯集的病人血清、抗人IgE的偶聯抗體和顯色試劑進行Western印跡分析；(ii)類似地，利用膜、通過常規地將食物成分免疫動物製備的動物血清、偶聯的抗動物IgG的抗體和顯色試劑進行Western印跡分析；(iii)比較二者的Western印跡分析圖譜，有以下發現(I)存在有在兩塊膜上都得以染色的條帶，(2)存在有在前者未得以染色，而在後者得以染色的條帶(換句話說，就是食物過敏性病人的IgE能夠識別的多種非過敏原性物質)，和(3)和前者染色條帶相比，僅後者染色條帶分布在更大和/或更小分子量位置上；(iv)根據上述結果，通過凝膠過濾層析方法從食物成分中分離食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別的多種食物過敏性組分，並用之接種動物，製備抗多種食物過敏原的抗體。可以對兔、山羊、綿羊、大鼠、小鼠、豚鼠、馬、豬和雞等恆溫動物進行接種。可以採用本技術領域的熟練人員所掌握的任何一種接種方法。如上所述製備的抗體可在本發明的食物過敏原檢測方法中使用。抗體可以固定在微量滴定板、PVDF膜、硝酸纖維素膜、層析條、試管、小珠、尼龍膜等上面，應用在酶免分析、免疫印跡分析、點印跡分析、免疫層析和抗體晶片等免疫學方法中。如上所述，本發明的食物過敏原檢測方法旨在檢測食物和食品製作機器和加工過程之類的環境中的多種食物過敏原。優選使用從食物獲得的液體提取物進行分析。雖然提取介質通常是水、磷酸緩衝液、Tris-HCl緩衝液、酒精等，但並不局限於這些，只要過敏原能夠得以提取即可。為了提高過敏原從食物中的提取效率，可以根據需要加入蛋白質變性劑(如SDS或脲)、含有SH的抗氧化劑(如2-巰基乙醇)等。可以通過擦拭(用拭子等拭抹)環境獲取的液體和用洗瓶捕獲的氣體進行測定，確定在機器或加工過程等食品製作環境中存在的多種過敏原。只要本發明中食物過敏原檢測方法的原理是酶免分析、免疫印跡分析和螢光多免疫珠法等免疫學方法即可，並不局限於一種特定的方法。舉例來說，三明治ELISA、競爭法、直接法等都是酶免分析方法。如果對抗體加以標記，可以使用酶(如過氧化物酶、鹼性磷酸酶和3 -半乳糖苷酶)、螢光物質(如異硫氰酸螢光素)、生物發光物質(如螢光素-螢光素酶)、化學發光物質(如發光氨，吖啶衍生物和金剛烷衍生物)、生物素、抗生物素蛋白、膠體金、放射活性物質(如32P)等。下面列舉本發明檢測方法的實例，說明三明治ELISA、競爭法和直接法程序的要點。為了實施三明治ELISA，製備 本發明中識別多種過敏原的標記抗體(識別多種抗原的抗體)。通過吸附或化學結合將識別本發明中多種抗體的非標記抗體固定在ELISA板上。然後，使用不幹擾反應體系的蛋白質如明膠和兔血清白蛋白封閉板上未固定有抗體的區域。將從食物、食物成分或食物製作環境中獲得的提取物(此後稱為樣品)或標準抗原加到板上，進行第一次抗原-抗體反應。反應結束後，洗板。為了進行第二次抗原-抗體反應，往板上加入上述的標記抗體，固定在板上的抗體能夠捕捉過敏原。洗板，去除過量的標記抗體，加入檢測試劑(如過氧化物酶的情況下加入1，2_苯二胺和H2O2，鹼性磷酸酶的情況下加入對-硝基苯磷酸鹽)。通過檢測標記物和檢測試劑之間反應物的量對過敏原進行檢測或定量。改變往ELISA板上加入的標準抗原或誘導食物過敏反應的食物(如蛋和奶)的量來繪製標準曲線。利用標準曲線對食物過敏原或誘導食物過敏反應的食物進行定量。如果定量的值是Ippm或更多，則樣品可能是誘導過敏反應的食物。由於利用檢測單一抗原的抗體的方法必須將通過檢測單一抗原的抗體得到的值轉化為誘導過敏反應的食物的含量，這樣會產生定量誤差。單一抗原以類卵粘蛋白和卵清蛋白為例，整個蛋中類卵粘蛋白和卵清蛋白的濃度分別約為4%和2%。然而，蛋黃既不含類卵粘蛋白，也不含卵清蛋白。相應地，(I)僅檢測類卵粘蛋白或卵清蛋白的方法不適用於檢測蛋黃蛋白質；(2)如果通過整蛋繪製的標準曲線用於檢測蛋白，則進行兩次或更多次定量，而非一次；和(3)如果實際值超出了定量範圍，則確定為極高的定量值。類似地，由於酪蛋白和￠-乳球蛋白在全部奶類蛋白中的含量分別約為80%和10%，因此存在一個問題，就是識別單一抗原的抗體不能對利用酪蛋白鈉、乳清蛋白等進行強化加工的奶類進行精確定量，本發明中識別多種抗原的抗體就不存在或較少存在這種問題。對於競爭法，將定量的標準抗原直接固定在用非反應性蛋白封閉的固相上。然後，將識別過敏原的酶聯抗體和樣品同時加到板上。將板靜置一定時間，然後洗板，去除未結合的物質。往板上加入顯色底物，隨後終止反應。對固定的過敏原和經樣品預處理的酶聯抗體之間的反應進行檢測。對於直接法，使樣品直接吸附在用非反應性蛋白封閉的固相上，使樣品和識別過敏原的酶聯抗體反應。隨後，應用上述的同樣步驟檢測樣品中的過敏原。對於上述的三明治ELISA、競爭法和直接法中的任何一種方法，都可以使用螢光、生物發光和化學發光底物進行顯色。根據該測定的目的、樣品性質、原理等，本技術領域熟練的技術人員可以對本發明方法的其他條件作相應變動。
本發明中檢測食物過敏原的方法能夠靈敏地檢測食物和食物原料的提取物中0.1或1. Ong/ml或更多的過敏原。工業適用性包含食物過敏性病人IgE抗體能夠識別的多種天然和/或變性過敏原和本發明抗體的混合物有助於理解食物過敏反應發生的機制，開發降低食物過敏原變應原性的技術。本發明中檢測食物過敏原的方法有助於驗證低過敏反應性技術的實用性，檢測食物中的食物過敏原、誘導食物過敏反應的食物和諸如食物製作機器和方法之類的食物製作環境。相應地，本發明有助於為保障食物過敏性病人的安全性，解決最近食物過敏性病人的增加引發的醫療和工業問題。
實施例下面的實施例更具體地解釋了本發明，但對本發明的範圍不作限制。本說明書中的縮略詞是本技術領域中常用的。 實施例1 (製備各種食物的標準抗原)(I)雞蛋、鵪鶉蛋和鴨蛋Ikg雞蛋去殼,勻楽；,凍幹,研細，製備標準雞蛋抗原。10-g抗原懸於10倍體積的pH7. O磷酸鹽緩衝液(以下縮寫為PBS)後，分在5個試管中，不加熱或分別在60、80、100、120攝氏度加熱30分鐘。然後，混合在一起，混勻製備樣品。以類似方法製備鵪鶉蛋和鴨蛋的樣品。(2)牛奶IL奶在低溫下攪拌，使之固化，沉積奶類脂肪，並通過能吸收的棉花將之過濾。該程序重複3次，將濾液凍幹，研細，製備標準牛奶抗原。類似地，如(I)中所述製備樣品。(3)小壽和大米室溫下，Ikg小麥粉用5倍量的加有4M尿素的0.1M Tris-HCl緩衝液(pH8. 6)提取2小時，並同時加以攪拌，然後離心。對上清液進行透析，凍幹，然後研細，製備標準小麥抗原。類似地，如(I)中所述製備樣品。類似地，從大米粉中製備樣品。(4)養麥室溫下，Ikg蕎麥粉用5倍量的加有l%NaCl的0.1M Tris-HCl緩衝液(pH8. 4)提取2小時，並同時加以攪拌，然後離心。對上清液進行透析，凍幹，然後研細，製備標準蕎麥抗原。類似地，如(I)中所述製備樣品。(5)花牛Ikg花生研細，用5倍量的正己烷脫脂2小時，並同時加以攪拌。將該程序重複3次後，去除正己烷，室溫下將製備物用5倍量的加有l%NaCl的0.1M Tris-HCl緩衝液(pH8. 4)提取2小時，並同時加以攪拌，然後離心。對上清液進行透析，凍幹，然後研細，製備標準花生抗原。類似地，如(I)中所述製備樣品。(6)大豆如(5)中所述製備大豆標準抗原。類似地，如(I)中所述製備樣品。實施例2 (各種純化的食物過敏原)(I)純化的雞蛋過敏原
將雞蛋中的主要過敏原之一——卵清蛋白懸於10倍體積的pH7. 0磷酸鹽緩衝液(以下縮寫為PBS)後，分在5個試管中，不加熱或分別在60、80、100、120攝氏度加熱30分鐘。然後，混合在一起，混勻製備樣品。以類似方法製備類卵粘蛋白樣品。已知卵清蛋白和類卵粘蛋白是位於蛋清中的蛋白質。(2)鈍化的牛奶討敏原如實施例2(1)所述類似方法製備酪蛋白、￠-乳球蛋白和a-乳清蛋白樣品。已知乳球蛋白和a-乳清蛋白是位於奶類乳清蛋白中的蛋白質。實施例3 (抗體的製備)( I)抗各種標準食物抗原的兔抗體的製備實施例1中製備的各種樣品用弗氏完全佐劑(用於第一次接種)和非完全佐劑(用
於第二次及其後的接種)進行乳化，接種日本白兔4至6次。在接種期間，部分採血，確定針對抗原的抗體的產生，然後採集全部血液。這樣，抗體即得以製備。(2)抗各種純化食物抗原的抗體的製備類似地，如上所述製備抗各種純化食物抗原的抗體。實施例4 (用免疫印跡法檢測各種食物過敏原)( I)匯集的病人血■清和兔抗體將20例RAST (放射變應原吸附試驗)評分為2或以上(特異性IgE抗體>0. 7UA/ml)的病人體內獲得的、抗蛋、奶或小麥的血清等量相混合，製備匯集的血清。抗蛋、奶和小麥的兔抗體是實施例3 (I)中製備的。(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯釀胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上述的標準蛋抗原、奶抗原和小麥抗原和2-巰基乙醇一起加熱3分鐘，在濃度為10%的微型平板膠上進行電泳。凝膠電轉移至PVDF (聚偏二氟乙烯)膜上。使用膠體金染色試劑盒(BioRad)檢測部分膜上的蛋白質。(3)免疫染色用1%人血清白蛋白(HSA)對上述的PVDF膜進行封閉。然後，將膜用包含0. 05%吐溫20的PBS (PBST)洗，和匯集的病人血清(100倍稀釋液)或兔抗體(1000倍稀釋液)於室溫下反應2小時。洗膜，和二級抗體，即鹼性磷酸酶偶聯的抗人IgE-e鏈山羊抗體(2500倍稀釋)或鹼性磷酸酶偶聯的抗兔IgG抗體(4000倍稀釋液)於室溫下反應I小時。用PBST洗膜，和化學發光底物4-甲基-4 (3-憐酸苯基)螺[I，2-二氧環燒-3，2-金剛燒]鈉鹽於室溫下反應30分鐘，使之在感光片上曝光，檢測鹼性磷酸酶的去磷酸化反應產生的光子。結果如圖1所示。如圖1所示，匯集的病人血清產生了多條帶(圖1的泳道1、4和7)和存在於各食物中病人IgE能夠識別的多種過敏原。然而，兔抗體檢測到了病人IgE能夠識別的食物過敏原(圖1的泳道2、5和8)。兩種血清都能夠識別的物質如下蛋中的卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶和卵轉鐵蛋白；奶中的酪蛋白、P -乳球蛋白和a-乳清蛋白；小麥中的glyadine和a -澱粉酶抑制劑；蕎麥的 132-kDa、84-kDa、27-kDa 和 ll_kDa 物質；花生的 107-kDa、72_kDa、35_kDa 和28-kDa 物質。另外，兔抗體不能檢測病人IgE不能識別的非食物性過敏原。
(4)過敏原的濃縮和分離不能識別過敏原之外物質的抗體如以下方法製備將用匯集的病人血清染色的條帶分子量分布和用動物抗體染色的條帶分子量分布相比較，發現與前者相比後者中有些條帶分布在更高或更低分子量位置(圖1 )。通過凝膠過濾層析，從標準抗原中收集和食物過敏性病人IgE能夠識別的食物過敏原分子量相當的組分(以下稱為過敏原組分)。樣品如實施例1所述製備，並將之免疫動物，製備抗過敏原組分的抗體。利用抗體如上所述進行Western印跡分析，結果發現抗體通常識別收集的病人血清能夠識別的食物抗原(圖1的泳道3、6和9)。通過免疫沉澱、利用病人IgE抗體的親和層析和離子交換層析，完成這些過敏原的濃縮和分離。實施例5 (點印跡法檢測主要過敏原和其加熱過的製備物)在PBS中浸泡的PVDF膜置於點印跡裝置後，使純化的主要過敏原(卵清蛋白、類 卵粘蛋白、卵轉鐵蛋白、溶菌酶、酪蛋白、￠-乳球蛋白、a-乳清蛋白、a-澱粉酶抑制劑和glyadine)和其加熱過的製備物吸附在膜上，用添加有3%RSA的TBS封閉，並用TBST洗膜。抗蛋-過敏原組分、奶過敏原組分和小麥過敏原組分的抗體(稀釋2000倍)加到膜上，室溫下反應I小時。然後，將生物素偶聯的抗兔IgG綿羊抗體和HRP偶聯的抗生物素蛋白(4000倍)加到膜上，洗膜，將膜和化學發光試劑反應，並通過感光片檢測產生的光子。上述的抗體檢測到了卵清蛋白、類卵粘蛋白、卵轉鐵蛋白、溶菌酶、酪蛋白、￠-乳球蛋白、a -乳清蛋白、a -澱粉酶抑制劑和glyadine等主要過敏原。這些抗體還檢測到了上述純化敏原的加熱製備物。實施例6 (通過三明治ELISA檢測蛋、奶和小麥過敏原)( I)抗體下面實驗程序使用實施例4 (4)中製備的抗蛋、奶和小麥中過敏原組分的抗體，和根據傳統方法製備的偶聯有生物素的抗體。(2)包被和封閉微孔板上的抗體IOOu I上述抗體(IOii g/ml)分別加到ELISA板(Nunc)的各孔中，4攝氏度靜置過夜，洗板(添加有150mM-NaCl和0. 05%吐溫20的20mM Tris-HCl緩衝液，pH7. 4)，25攝氏度下用0. 1%RSA (Sigma)封閉I小時。(3)蛋、奶及小麥過敏原的檢測去除孔中的封閉溶液，每孔各加95iU稀釋液(添加有0. l%RSA、150mM NaCl和0. 05%吐溫20的20mM Tris-HCl緩衝液，pH7. 4)和5 U I各食物的PBS提取物，25攝氏度下靜置2小時。類似地，每孔各加實施例1中所述的5 u I蛋、奶和小麥標準抗原的懸液，25攝氏度下靜置2小時。用300ia洗液洗5次後，每孔各加IOOiU生物素偶聯的抗體(10000倍稀釋液)，25攝氏度下靜置lh。然後每孔各加IOOiU過氧化物酶偶聯的抗生物素蛋白(2500倍稀釋液)，25攝氏度下靜置30分鐘。洗板後，每孔各加IOOiU 3，3，，5，5，-四聯苯胺溶液，25攝氏度下避光反應30分鐘。通過微孔板讀數儀讀取各孔的光密度值(檢測波長450nm,參照波長630nm)。結果如表I所示。表I表明各種食物提取物中的蛋、奶和小麥過敏原能夠得以檢測。
表1.檢測各種食物中的蛋、奶和小麥過敏原

權利要求
1.包含多克隆動物血清的抗體混合物，其包含識別食物過敏性病人的IgE抗體能夠識別並且通過攝取導致食物過敏反應的下述天然的和加熱變性的食物過敏原的抗體，其中食物過敏性病人具有2或更高的RAST評分(1)蛋中的卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶和卵轉鐵蛋白；(2)奶中的酪蛋白、乳球蛋白和α-乳清蛋白；(3)小麥中的gliadin和α-澱粉酶抑制劑；(4)蕎麥的132-kDa、84-kDa、27-kDa 和 11-kDa 物質；或(5)花生的107-kDa、72-kDa、35-kDa 和 28_kDa 物質。
2.利用權利要求1的抗體混合物檢測食物過敏原的方法。
3.權利要求2的方法，其中所述食物過敏原是蛋中的卵清蛋白、類卵粘蛋白、溶菌酶和卵轉鐵蛋白。
4.權利要求2的方法，其中所述食物過敏原是奶中的酪蛋白、β-乳球蛋白和α-乳清蛋白。
5.權利要求2的方法，其中所述食物過敏原是小麥中的gliadin和α-澱粉酶抑制劑。
6.權利要求2的方法，其中所述食物過敏原是蕎麥的132-kDa、84-kDa、27-kDa和 11-kDa 物質。
7.權利要求2的方法，其中所述食物過敏原是花生的107-kDa、72-kDa、35-kDa和 28-kDa 物質。
8.利用權利要求1的抗體混合物檢測誘導食物過敏反應的食物的方法。
9.權利要求8的方法，其中所述誘導食物過敏反應的食物是蛋、奶、小麥、蕎麥或花生或包含其中一項或多項的食物。
全文摘要
本發明涉及食物致敏原，檢測食物過敏原的方法和檢測誘導食物過敏原的食物的方法。本發明提供一種檢測食物過敏原的方法、抗體和用於製備該抗體的抗原。本發明的抗原是包含食物過敏性病人的IgE能夠識別的多種未變性和/或變性的食物過敏原的混合物。本發明的抗體通過利用上述的抗原接種動物製備。本發明中檢測食物過敏原的方法涉及到上述抗體。該方法能夠對食物過敏原和誘導食物過敏反應的食物進行檢測，因此有助於確保食物過敏性病人的安全性。
文檔編號G01N33/02GK102993299SQ201210311198
公開日2013年3月27日 申請日期2002年9月5日 優先權日2001年9月5日
發明者森松文毅, 高畑能久, 松本貴之, 宮澤伊都美, 清水宗茂 申請人:日本肉類批發商株式會社