禽霍亂外膜蛋白a基因疫苗的製備方法

2023-06-19 02:53:26 2

專利名稱：禽霍亂外膜蛋白a基因疫苗的製備方法
技術領域：
本發明涉及一種細菌疾病疫苗的製備方法，具體的說是禽霍亂外膜蛋白A基因疫 苗的製備方法。
背景技術：
禽霍亂也稱為禽多殺性巴氏桿菌病，是由禽霍亂菌(又稱為禽多殺性巴氏桿菌)弓丨 起的一種家禽的接觸性傳染病，在我國是常見的多發性傳染病，而且在世界各國均有分布， 幾乎所有的家禽都能感染該病，其傳染流行嚴重影響家禽業的健康發展，給家禽業帶來了 巨大的經濟損失。目前我國對於禽霍亂的控制主要採用抗生素藥物治療，但藥物治療存在一定的缺 點，停藥後容易復發，長期應用可能會對禽體產生明顯的毒害作用，引起產蛋雞的產蛋率下 降，而且長期或者反覆用藥容易導致禽霍亂菌產生耐藥性。目前對於禽霍亂的預防措施主要採用的是疫苗注射，常用的疫苗包括弱毒活疫苗 和滅活疫苗兩種，但兩種疫苗的免疫效果並不是特別理想，弱毒活疫苗的免疫持續期不夠 長，免疫保護力不夠高，而且給家禽注射後具有一定的副作用，甚至可能會造成一些死亡。 滅活疫苗存在保護率低和免疫期短的問題，比弱毒活疫苗更為嚴重，因此滅活疫苗的免疫 效果尚不及弱毒活疫苗。外膜蛋白A基因是禽霍亂菌主要的保護性抗原之一，進入機體後可誘導機體的免 疫系統產生一定的免疫應答，為機體提供抗禽霍亂感染的保護力，因此，用禽霍亂菌外膜蛋 白A基因可製備相應的疫苗用以預防禽霍亂。

發明內容
本發明針對上述問題，提供了一種可用於預防禽霍亂的禽霍亂外膜蛋白A基因 疫苗的製備方法，通過該方法製備出的疫苗，具有製備簡單，操作方便的優點，製得的產品 能有效的防止禽霍亂對雞的傷害。本發明為解決上述問題，提供的技術方案為 步驟一、引物設計
根據禽霍亂菌基因組序列設計用於擴增禽霍亂菌外膜蛋白A基因的兩條引物Pl和
P2
Pl 5' -GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3'； P2 :5』 -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3』 ； 步驟二、禽霍亂菌外膜蛋白A基因的PCR擴增及純化
1)在0. 2ml的PCR反應管中加入引物Pl和引物P2各 μ ，再依次加入DNA聚合酶 0. 5μ1、聚合酶緩衝液2. 5μ1、四種雙脫氧核糖核苷酸混合物3μ1、禽巴氏桿菌的基因組 μ 和水16μ1，再將含有上述試劑的PCR反應管放入PCR擴增儀中，進行PCR反應，PCR反應程 序首先進行94°C預變性，時間為5分鐘，預變性結束後進入循環過程，每個循環的程序為94° C變性，時間為1分鐘，57° C復性，時間為45秒鐘，72° C延伸，時間為1分鐘，將上述循環 程序重複30次，30次循環結束後，72°C再次延伸，時間10分鐘，得到PCR擴增的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產物，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物，在凝膠成像系統中觀察 到目的基因後，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作取1.5ml的離心管a並稱其重量，然後 在紫外燈下將凝膠上含有的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物切下來，將切下來的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產物放在已稱重的1. 5ml的離心管a中，稱取離心管a的總重並計算出 從凝膠上切下來的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物的重量，然後將離心管a中的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產物搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管a放置在50°C水 浴中加熱至離心管a中的物質完全融解止，將融解後的溶液加入到DNA純化柱a上，DNA純 化柱a位於收集管a中，在21°C條件下放置1分鐘，後將收集管a放在離心機中，轉速為 12000轉/分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內的液體，再向收集管a內的DNA純化柱a 中加入700μ1的溶液II，在21° C條件下放置1分鐘，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘， 取出倒掉收集管a內的液體，後向DNA純化柱a上加入500μ1的溶液II，轉速為12000轉/ 分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內的液體，將收集管a在轉速為13000轉/分鐘，離心 1分鐘，取出DNA純化柱a置於1. 5ml的離心管b中，在DNA純化柱a上加入40μ1溶液III， 將離心管b在21° C條件下放置1分鐘，將離心管b在轉速為13000轉/分鐘，離心1分鐘， 棄去DNA純化柱a得到離心管b中的40μ1液體，該液體就是純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A 基因；
步驟三、真核表達載體pcDNA3. I+的酶切及純化
1)酶切體系的配製在1.5ml的離心管c中加入真核表達載體pcDNA3. I+ 10μ1、限制 性內切酶Kpn I 3μ1、限制性內切酶EcoR I 3μ1、限制性內切酶緩衝液5μ1和水^μ ，混合 均勻止，得到的混合物Α，將上述混合物A放入37° C的水浴鍋中反應8小時，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物A進行檢測
利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物Α，在凝膠成像系統中進行觀察，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作取1.5ml的離心管d並稱其重量，在紫 外燈下將凝膠上的混合物A切下來，將切下來的混合物A放在已稱重的1. 5ml的離心管d 中，稱取離心管d的總重並計算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，然後將離心管d中的 混合物A搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管d放置在50° C水浴中加熱至混 合物A完全融解，將融解後的溶液加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位於收集管b中， 收集管b在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離 心後倒掉收集管b內的液體，向DNA純化柱b上加入700μ1的溶液II，收集管b在21°C條件 下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心後倒掉收集管b內 的液體，向DNA純化柱b上加入500μ1的溶液II，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離 心1分鐘，離心後倒掉收集管b內的液體，倒掉收集管b中的液體後將放入離心機內，轉速 13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置於1. 5ml的離心管e中，後在DNA純化 柱b上加入40μ1溶液III，將離心管e在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機內轉速13000 轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b得到離心管中e中的液體，該液體就是酶切並純化後的真核表達載體PCDNA3. 1+，備用；
步驟四、禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗的製備
1)在1.5ml的離心管f中依次加入純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A基因15μ1、限制性內 切酶Kpn I 3μ1、限制性內切酶EcoR I 3μ1、限制性內切酶緩衝液5μ1和水Μμ ，混合均勻 止，得到的混合物B，將上述混合物B放入37°C的水浴鍋中反應5小時，取出備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物B，在凝膠成像系統中進行觀察，備用；
3.按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作取1. 5ml的離心管g並稱其重量，在紫 外燈下將凝膠的混合物B切下來，將切下來的混合物B放在已稱重的1. 5ml的離心管g中， 稱取離心管g的總重並計算出從凝膠上切下的混合物B的重量，然後將離心管g中的混合 物B搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管g放置在50° C水浴中加熱至混合物 B完全融解，將融解後的溶液加入到DNA純化柱c上，DNA純化柱c位於收集管c中，收集管 c在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心後倒 掉收集管c內的液體，離心後倒掉收集管c內的液體，向DNA純化柱c上加入700μ1的溶液 II，收集管C在21°C條件下將放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分 鍾，離心後倒掉收集管c內的液體，向DNA純化柱c上加入500μ1的溶液II，放入離心機中， 轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心後倒掉收集管c內的液體，倒掉收集管c中的液 體後將放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c並放置於1. 5ml 的離心管h中，後在DNA純化柱c上加入40μ1溶液III，將離心管h在21°C條件下放置1分 鍾，放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c得到離心管中h中 的40μ1液體，該液體就是酶切並純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A基因，備用；
4)在1.5ml的離心管i中，依次加入酶切並純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A基因10μ1、 酶切並純化後的真核表達載體pcDNA3. 1+2μ1、DNA連接酶 μ 、DNA連接酶緩衝液2μ1和水 5μ1，混合均勻止，將離心管i放入16° C的水浴鍋中，反應12小時，備用；
5)待反應結束後，在離心管i中加入200μ1的大腸桿菌JM83，先將離心管i置於0°C 的冰水混合物中，時間30分鐘，取出置於42° C條件下，放置90秒，再取出，將離心管i置於 O0C的冰水混合物中，放置3分鐘，後向離心管i中加入0. 5ml的LB液體培養基，形成含有 LB液體培養基的混合液，備用；
6)將離心管i置於37°C的搖床中振蕩培養，轉速200轉/分鐘，時間為1.5小時，結 束後，取ΙΟΟμΙ含LB液體培養基的混合液塗布於含濃度為5(^g/ml氨苄青黴素的LB培養 固體培養基上，將塗布後的LB培養固體培養基置於37°C的培養箱內，倒置培養16小時，備 用；
7)挑取培養後的LB培養固體培養基上的1個菌落，將菌落放入5ml含氨苄青黴素的 的LB液體培養基中，其氨苄青黴素的濃度為50μβ/πι1，後將含氨苄青黴素的LB液體培養基 置於37° C恆溫搖床內，在轉速為200轉/分鐘，振蕩培養16小時；
8)待振蕩培養結束後，取Iml含有菌落的LB液體培養液加到1.5ml的離心管j中，將 離心管j放入離心機內離心，轉速12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄去離心管j中的上層澄 清液體，加入ΙΟΟμΙ的預先冷卻至4° C的溶液IV，均勻混合後，加入200μ1的溶液V，混合均 勻止，後將離心管j置於0°C的冰水混合物中，放置3分鐘，後向離心管j中加入150μ1的 預先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，後將離心管j放於0° C的冰水混合物中，靜置5分鐘，取出放入冷凍離心機內，在轉速為12000轉/分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，後取出，備 用；
9)取離心管j中的上層澄清液體400μ1，將其加到1.5ml的離心管k中，向離心管k中 加入苯酚200μ1和氯仿200μ1，振蕩混勻後，放入冷凍離心機內，在轉速為12000轉/分鐘， 4° C條件下離心10分鐘，待離心結束後取上層液體400μ1移入到1. 5ml的離心管m中，加入 800μ1的無水乙醇，將離心管m於-20° C條件下，放置20分鐘，後取出放入冷凍離心機內，轉 速13000轉/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，棄去離心管m中的上層澄清液體；
10)在離心管m中加入濃度為70%的乙醇0.5ml，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/ 分鐘，4°C條件下離心5分鐘，棄去上層澄清液體，得到沉澱物I，該沉澱物I為pCA質粒，待 PCA質粒乾燥後，加入30μ1超純水進行溶解，得到的溶液為pCA質粒溶液；
11)在1.5ml的離心管η中，加入2μ1的pCA質粒溶液，後依次向離心管η中加入 μ 的限制性內切酶Kpn I、 μ1的限制性內切酶EcoR I、 μ 的限制性內切酶緩衝液和水5μ1， 混合均勻後，置於37° C條件下，反應2小時，形成酶切液；
12)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測pCA質粒酶，在凝膠成像系統中進行觀察，觀察到1050bp 大小的條帶，PCA質粒是本發明製備的禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗；
步驟五、禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA質粒的大量製備
1)挑取步驟四中含有PCA質粒的大腸桿菌JM83；
2)挑取培養後LB培養固體培養基上的1個菌落，將菌落放入25ml含氨苄青黴素的的 LB液體培養基中，其氨苄青黴素的濃度為5(^g/ml，後將LB液體培養基，置於37°C恆溫搖 床內振蕩培養，轉速200轉/分鐘，至液體在600納米處的吸光度，OD600值為0. 6止，將振 蕩培養後的液體轉至500ml含有氨苄青黴素的LB液體培養基中，其氨苄青黴素的濃度為 5(^g/ml，置於37°C恆溫搖床內振蕩培養，轉速200轉/分鐘，培養15小時；
3)待振蕩培養結束後，將含有菌落的500mlLB液體培養基放入IOOOml的離心管中， 將IOOOml的離心管放入冷凍離心機內，轉速6000轉/分鐘，4°C條件下離心時間15分鐘， 棄去上層澄清液體得到沉澱物II，向離心管中加入18ml的預先冷卻至4°C的溶液IV，將沉 澱物II懸浮，再加入2ml濃度為10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液V， 混合均勻止，將IOOOml的離心管置於20° C條件下，放置5分鐘，後向IOOOml的離心管中加 入20ml預先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，將其放於0° C的冰水混合物中，靜置10分鐘， 取出放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4° C條件下離心20分鐘，取上層澄清液體，備 用；
4)在200ml的離心管中，加入步驟3中的上層澄清液體80ml，再加入32ml的異丙醇， 振蕩混勻後在20° C條件下放置10分鐘，後放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4° C的 條件下離心20分鐘，待離心結束後倒掉上層澄清液體，得到200ml的離心管中的沉澱物III， 再向200ml的離心管中加入50ml的70%的乙醇，將200ml的離心管放入冷凍離心機內，轉 速12000轉/分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，棄去澄清液體，待沉澱物III乾燥後備用；
5)在含有沉澱物III的200ml離心管中加入:3ml的pH值為8.O的三羥甲基氨基甲烷-乙 二胺四乙酸，TE溶液，使沉澱物III溶解，將溶解後的溶液轉移至15ml的離心管中，在0°C的 冰水混合物中，放置10分鐘，後向15ml的離心管中加入3ml的濃度為5mol/l的氯化鋰溶 液，放入冷凍離心機內，轉速10000轉/分鐘，離心時間10分鐘，取上層澄清液體，備用；6)在IOml的離心管中加入步驟5中的上層澄清液體和等體積的異丙醇，混合均勻止放 於20° C條件下，放置10分鐘，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4° C條件下離心10 分鐘，棄去上層澄清液體，加入5ml濃度為70%的乙醇，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/ 分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉澱物IV，乾燥，備用；
7)向含有沉澱物IV的IOml的離心管中加入0.5ml含有濃度為100mg/ml的RNA酶A的 三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，將沉澱物IV溶解，後向溶液中加入0. 25ml的 苯酚和0. 25ml的氯仿，至混合均勻止，將IOml的離心管放入冷凍離心機內，轉速12000轉/ 分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，取0. 5ml的上層澄清液體轉至5ml的離心管內，加入Iml 的無水乙醇，置於-20° C條件下，放置20分鐘，放入冷凍離心機內，轉速13000轉/分鐘， 4°C條件下離心10分鐘，棄去上清液棄掉，得到沉澱物V，乾燥備用；
8)向含有沉澱物V的5ml離心管中加入Iml超純水，使沉澱物V溶解，加入0.5ml的 聚乙二醇-氯化鎂，PEG-MgCl2溶液，置於20° C條件下，放置30分鐘，放入離心機內，轉速 13000轉/分鐘，離心20分鐘，棄去上層澄清液體，加入0. 5ml濃度為70%的乙醇，放入離心 機內，轉速13000轉/分鐘，離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉澱物VI，該沉澱物就是 大量製備的PCA質粒即大量製備的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗；
9)向含有沉澱物VI的5ml離心管中加入Iml濃度為0.01摩爾/升的磷酸鹽緩衝液，使 沉澱物VI溶解，溶解後的溶液為大量製備的PCA質粒溶液，後用分光光度計測定溶液中所 含的PCA質粒的濃度，備用；
10)對禽霍亂菌的外膜蛋白A基因進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束後在凝膠成像系統 中觀察到條帶為1050bp時，證明禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗製備成功。本發明涉及到以下菌種和試劑
禽霍亂菌Uria/ PasteMrella)購買自中國獸醫藥品監察所，見生物材料保
藏證明附件1、附件2、附件4;
大腸桿菌(Escherichia, coli /AK )購買自華美生物工程有限公司，見生物材料 保藏證明附件3;
DNA凝膠回收試劑盒由碧雲天生物技術研究所提供，該試劑盒中自配有成品的溶液I、 溶液II和溶液III。有益效果
本發明提供了一種禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗的製備方法，該方法製備簡單，容易操作。本發明所用的真核載體為PCDNA3. 1(+)，該載體具有合適的多克隆位點，有高效能 穩定和瞬時轉染哺乳動物及人類細胞的能力，具有高效率CMV立即早期啟動子和增強子、 T7啟動子、BGH多腺苷酸信號、SV40早期啟動子等，有利於外源基因的表達，同時該載體含 有氨苄青黴素抗性基因(AmpD，可用作篩選標記，該基因中還含有免疫增強CpG DNA序列， 可增強疫苗的免疫效果。
具體實施例方式步驟一、引物設計
根據禽霍亂菌基因組序列設計用於擴增禽霍亂菌外膜蛋白A基因的兩條引物Pl和P2
Pl 5' -GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3'；
P2 :5』 -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3』 ；
步驟二、禽霍亂菌外膜蛋白A基因的PCR擴增及純化
1)在0.2ml的PCR反應管中加入引物Pl和引物P2各 μ ，再依次加入DNA聚合酶 0. 5μ1、聚合酶緩衝液2. 5μ1、四種雙脫氧核糖核苷酸混合物3μ1、禽巴氏桿菌的基因組 μ 和水16μ1，再將含有上述試劑的PCR反應管放入PCR擴增儀中，進行PCR反應，PCR反應程 序首先進行94°C預變性，時間為5分鐘，預變性結束後進入循環過程，每個循環的程序為 94° C變性，時間為1分鐘，57° C復性，時間為45秒鐘，72° C延伸，時間為1分鐘，將上述循環 程序重複30次，30次循環結束後，72°C再次延伸，時間10分鐘，得到PCR擴增的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產物，備用；
2)稱取1.0克瓊脂糖粉末加入到IOOml的1倍電泳緩衝液中並在微波爐內煮沸使瓊脂 糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，後倒入制膠板中，插入制膠梳， 凝固後的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現一排點樣孔；將凝膠放入1倍電泳緩衝 液中，將禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物加入到凝膠的點樣孔中，打開電泳儀開關，在電泳 儀電壓為120伏特時開始電泳，電泳20分鐘後關閉電泳儀，在凝膠成像系統中觀察到目的 基因後，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作取1.5ml的離心管a並稱其重量，然後 在紫外燈下將凝膠上含有的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物切下來，將切下來的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產物放在已稱重的1. 5ml的離心管a中，稱取離心管a的總重並計算出 從凝膠上切下來的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物的重量，然後將離心管a中的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產物搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管a放置在50°C水 浴中加熱至離心管a中的物質完全融解止，將融解後的溶液加入到DNA純化柱a上，DNA純 化柱a位於收集管a中，在21°C條件下放置1分鐘，後將收集管a放在離心機中，轉速為 12000轉/分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內的液體，再向收集管a內的DNA純化柱a 中加入700μ1的溶液II，在21° C條件下放置1分鐘，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘， 取出倒掉收集管a內的液體，後向DNA純化柱a上加入500μ1的溶液II，轉速為12000轉/ 分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內的液體，將收集管a在轉速為13000轉/分鐘，離心 1分鐘，取出DNA純化柱a置於1. 5ml的離心管b中，在DNA純化柱a上加入40μ1溶液III， 將離心管b在21° C條件下放置1分鐘，將離心管b在轉速為13000轉/分鐘，離心1分鐘， 棄去DNA純化柱a得到離心管b中的40μ1液體，該液體就是純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A 基因；
步驟三、真核表達載體pcDNA3. 1(+)的酶切及純化
1)酶切體系的配製在1.5ml的離心管c中加入真核表達載體pcDNA3. 1 (+) 10μ1、限 制性內切酶Kpn I 3μ1、限制性內切酶EcoR I 3μ1、限制性內切酶緩衝液5μ1和水29μ1，混 合均勻止，得到的混合物Α，將上述混合物A放入37° C的水浴鍋中反應8小時，備用；
2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物A進行檢測
稱取1. 0克瓊脂糖粉末加入到IOOml的1倍電泳緩衝液中並在微波爐內煮沸使瓊脂糖 粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，後倒入制膠板中，插入制膠梳，凝固後的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現一排點樣孔；將凝膠放入1倍電泳緩衝液 中，將混合物A加入到凝膠的點樣孔中，打開電泳儀開關，在電泳儀電壓為120伏特時開始 電泳，電泳20分鐘後關閉電泳儀，在凝膠成像系統中進行觀察，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作取1. 5ml的離心管d並稱其重量，在紫 外燈下將凝膠上的混合物A切下來，將切下來的混合物A放在已稱重的1. 5ml的離心管d 中，稱取離心管d的總重並計算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，然後將離心管d中的 混合物A搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管d放置在50° C水浴中加熱至混 合物A完全融解，將融解後的溶液加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位於收集管b中， 收集管b在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離 心後倒掉收集管b內的液體，向DNA純化柱b上加入700μ1的溶液II，收集管b在21°C條件 下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心後倒掉收集管b內 的液體，向DNA純化柱b上加入500μ1的溶液II，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離 心1分鐘，離心後倒掉收集管b內的液體，倒掉收集管b中的液體後將放入離心機內，轉速 13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置於1. 5ml的離心管e中，後在DNA純化 柱b上加入40μ1溶液III，將離心管e在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機內轉速13000 轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b得到離心管中e中的液體，該液體就是酶切並純 化後的真核表達載體pcDNA3. 1 (+)，備用；
步驟四、禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗的製備
1)在1.5ml的離心管f中依次加入純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A基因15μ1、限制性內 切酶Kpn I 3μ1、限制性內切酶EcoR I 3μ1、限制性內切酶緩衝液5μ1和水24μ1，混合均勻 止，得到的混合物B，將上述混合物B放入37°C的水浴鍋中反應5小時，取出備用；
2)稱取1.0克瓊脂糖粉末加入到IOOml的1倍電泳緩衝液中並在微波爐內煮沸使瓊脂 糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，後倒入制膠板中，插入制膠梳， 凝固後的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現一排點樣孔；將凝膠放入1倍電泳緩衝 液中，將混合物B加入到凝膠的點樣孔中，打開電泳儀開關，在電泳儀電壓為120伏特時開 始電泳，電泳20分鐘後關閉電泳儀，在凝膠成像系統中進行觀察，備用；
3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作取1.5ml的離心管g並稱其重量，在紫 外燈下將凝膠的混合物B切下來，將切下來的混合物B放在已稱重的1. 5ml的離心管g中， 稱取離心管g的總重並計算出從凝膠上切下的混合物B的重量，然後將離心管g中的混合 物B搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管g放置在50° C水浴中加熱至混合物 B完全融解，將融解後的溶液加入到DNA純化柱c上，DNA純化柱c位於收集管c中，收集管 c在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心後倒 掉收集管c內的液體，離心後倒掉收集管c內的液體，向DNA純化柱c上加入700μ1的溶液 II，收集管C在21°C條件下將放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分 鍾，離心後倒掉收集管c內的液體，向DNA純化柱c上加入500μ1的溶液II，放入離心機中， 轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心後倒掉收集管c內的液體，倒掉收集管c中的液 體後將放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c並放置於1. 5ml 的離心管h中，後在DNA純化柱c上加入40μ1溶液III，將離心管h在21°C條件下放置1分 鍾，放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c得到離心管中h中的40μ1液體，該液體就是酶切並純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A基因，備用；
4)在1.5ml的離心管i中，依次加入酶切並純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A基因10μ1、 酶切並純化後的真核表達載體pcDNA3. 1 (+) 2μ1、 ΝΑ連接酶 μ1、 ΝΑ連接酶緩衝液2μ1和 水5μ1，混合均勻止，將離心管i放入16° C的水浴鍋中，反應12小時，備用；
5)待反應結束後，在離心管i中加入200μ1的大腸桿菌JM83，先將離心管i置於0°C 的冰水混合物中，時間30分鐘，取出置於42° C條件下，放置90秒，再取出，將離心管i置於 O0C的冰水混合物中，放置3分鐘，後向離心管i中加入0. 5ml的LB液體培養基，形成含有 LB液體培養基的混合液，備用；
6)將離心管i置於37°C的搖床中振蕩培養，轉速200轉/分鐘，時間為1.5小時，結 束後，取ΙΟΟμΙ含LB液體培養基的混合液塗布於含濃度為5(^g/ml氨苄青黴素的LB培養 固體培養基上，將塗布後的LB培養固體培養基置於37° C的培養箱內，倒置培養16小時，備 用；
7)挑取培養後的LB培養固體培養基上的1個菌落，將菌落放入5ml含氨苄青黴素的 的LB液體培養基中，其氨苄青黴素的濃度為50μβ/πι1，後將含氨苄青黴素的LB液體培養基 置於37° C恆溫搖床內，在轉速為200轉/分鐘，振蕩培養16小時；
8)待振蕩培養結束後，取Iml含有菌落的LB液體培養液加到1.5ml的離心管j中，將 離心管j放入離心機內離心，轉速12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄去離心管j中的上層澄 清液體，加入ΙΟΟμΙ的預先冷卻至4° C的溶液IV，均勻混合後，加入200μ1的溶液V，混合均 勻止，後將離心管j置於0°C的冰水混合物中，放置3分鐘，後向離心管j中加入150μ1的 預先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，後將離心管j放於0° C的冰水混合物中，靜置5分鐘， 取出放入冷凍離心機內，在轉速為12000轉/分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，後取出，備 用；
9)取離心管j中的上層澄清液體400μ1，將其加到1.5ml的離心管k中，向離心管k中 加入苯酚200μ1和氯仿200μ1，振蕩混勻後，放入冷凍離心機內，在轉速為12000轉/分鐘， 4° C條件下離心10分鐘，待離心結束後取上層液體400μ1移入到1. 5ml的離心管m中，加入 800μ1的無水乙醇，將離心管m於-20° C條件下，放置20分鐘，後取出放入冷凍離心機內，轉 速13000轉/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，棄去離心管m中的上層澄清液體；
10)在離心管m中加入濃度為70%的乙醇0.5ml，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/ 分鐘，4°C條件下離心5分鐘，棄去上層澄清液體，得到沉澱物I，該沉澱物I為pCA質粒，待 PCA質粒乾燥後，加入30μ1超純水進行溶解，得到的溶液為pCA質粒溶液；
11)在1.5ml的離心管η中，加入2μ1的pCA質粒溶液，後依次向離心管η中加入 μ 的限制性內切酶Kpn I、 μ1的限制性內切酶EcoR I、 μ 的限制性內切酶緩衝液和水5μ1， 混合均勻後，置於37° C條件下，反應2小時，形成酶切液；
12)稱取1.0克瓊脂糖粉末加入到100ml的1倍電泳緩衝液中並在微波爐內煮沸使 瓊脂糖粉末充分溶解，加入5μ1的溴化乙錠溶液，至混合均勻止，後倒入制膠板中，插入制 膠梳，凝固後的固體稱為凝膠，拔去制膠梳，在凝膠上出現一排點樣孔；將凝膠放入1倍電 泳緩衝液中，將PCA質粒酶切液加入到凝膠的點樣孔中，打開電泳儀開關，在電泳儀電壓 為120伏特時開始電泳，電泳20分鐘後關閉電泳儀，在凝膠成像系統中進行觀察，觀察到 1050bp大小的條帶，證明該pCA質粒是本發明製備的禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗；步驟五、禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA質粒的大量製備
1)挑取步驟四中含有PCA質粒的大腸桿菌JM83；
2)挑取培養後LB培養固體培養基上的1個菌落，將菌落放入25ml含氨苄青黴素的的 LB液體培養基中，其氨苄青黴素的濃度為5(^g/ml，後將LB液體培養基，置於37°C恆溫搖 床內振蕩培養，轉速200轉/分鐘，至液體在600納米處的吸光度(0D_值)為0. 6止，將振 蕩培養後的液體轉至500ml含有氨苄青黴素的LB液體培養基中，其氨苄青黴素的濃度為 5(^g/ml，置於37°C恆溫搖床內振蕩培養，轉速200轉/分鐘，培養15小時；
3)待振蕩培養結束後，將含有菌落的500mlLB液體培養基放入IOOOml的離心管中， 將IOOOml的離心管放入冷凍離心機內，轉速6000轉/分鐘，4°C條件下離心時間15分鐘， 棄去上層澄清液體得到沉澱物II，向離心管中加入18ml的預先冷卻至4°C的溶液IV，將沉 澱物II懸浮，再加入2ml濃度為10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液V， 混合均勻止，將IOOOml的離心管置於20° C條件下，放置5分鐘，後向IOOOml的離心管中加 入20ml預先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，將其放於0° C的冰水混合物中，靜置10分鐘， 取出放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4° C條件下離心20分鐘，取上層澄清液體，備 用；
4)在200ml的離心管中，加入步驟3中的上層澄清液體80ml，再加入32ml的異丙醇， 振蕩混勻後在20° C條件下放置10分鐘，後放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4° C的 條件下離心20分鐘，待離心結束後倒掉上層澄清液體，得到200ml的離心管中的沉澱物III， 再向200ml的離心管中加入50ml的70%的乙醇，將200ml的離心管放入冷凍離心機內，轉 速12000轉/分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，棄去澄清液體，待沉澱物III乾燥後備用；
5)在含有沉澱物III的200ml離心管中加入:3ml的pH值為8.O的三羥甲基氨基甲烷-乙 二胺四乙酸(TE)溶液，使沉澱物III溶解，將溶解後的溶液轉移至15ml的離心管中，在0° C的 冰水混合物中，放置10分鐘，後向15ml的離心管中加入3ml的濃度為5mol/l的氯化鋰溶 液，放入冷凍離心機內，轉速10000轉/分鐘，離心時間10分鐘，取上層澄清液體，備用；
6)在IOml的離心管中加入步驟5中的上層澄清液體和等體積的異丙醇，混合均勻止放 於20° C條件下，放置10分鐘，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4° C條件下離心10 分鐘，棄去上層澄清液體，加入5ml濃度為70%的乙醇，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/ 分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉澱物IV，乾燥，備用；
7)向含有沉澱物IV的IOml的離心管中加入0.5ml含有濃度為100mg/ml的RNA酶A的 三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(TE)溶液，將沉澱物IV溶解，後向溶液中加入0. 25ml的 苯酚和0. 25ml的氯仿，至混合均勻止，將IOml的離心管放入冷凍離心機內，轉速12000轉/ 分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，取0. 5ml的上層澄清液體轉至5ml的離心管內，加入Iml 的無水乙醇，置於-20°C條件下，放置20分鐘，放入冷凍離心機內，轉速13000轉/分鐘， 4° C條件下離心10分鐘，棄去上清液棄掉，得到沉澱物V，乾燥備用；
8)向含有沉澱物V的5ml離心管中加入Iml超純水，使沉澱物V溶解，加入0.5ml的 聚乙二醇-氯化鎂(PEG-MgCl2)溶液，置於20°C條件下，放置30分鐘，放入離心機內，轉速 13000轉/分鐘，離心20分鐘，棄去上層澄清液體，加入0. 5ml濃度為70%的乙醇，放入離心 機內，轉速13000轉/分鐘，離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉澱物VI，該沉澱物就是 大量製備的PCA質粒即大量製備的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗；9)向含有沉澱物VI的5ml離心管中加入Iml濃度為0.01摩爾/升的磷酸鹽緩衝液，使 沉澱物VI溶解，溶解後的溶液為大量製備的PCA質粒溶液，後用分光光度計測定溶液中所 含的PCA質粒的濃度，備用；
10)對禽霍亂菌的外膜蛋白A基因進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束後在凝膠成像系統 中觀察到條帶為1050bp時，證明禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗製備成功；
步驟六、動物免疫實驗
取1日齡的沒經過免疫的雛雞40隻，每日按正常日糧飼養，4周齡時將其平均分為試 驗組和對照組，每組20隻，試驗組共三次免疫，第一次免疫時間為4周齡，第二次免疫時間 為6周齡，第三次免疫時間為8周齡，注射提取的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗即pCA質粒， 每次免疫的劑量200μβ/只，採用大腿內側肌肉注射；對照組的20隻雞不進行任何免疫； 步驟七、動物攻毒實驗
10周齡時，對試驗組和對照組進行肌肉注射禽霍亂菌，攻毒劑量為每隻雞注射IXlO9 個禽霍亂菌，攻毒之後，對兩組繼續飼養至12周齡時止，記錄兩組在12周齡時的存活量，並 計算出試驗組和對照組的保護率，保護率越高說明免疫預防效果越好； 試驗組的保護率的計算方法如下 (試驗組在12周齡時存活量+20) X 100% 對照組的保護率的計算方法如下 (對照組在12周齡時存活量+20) X 100%
結果顯示，試驗組在12周齡時存活13隻，試驗組的保護率為65% ；對照組在12周齡全 部死亡，對照組的保護率為0%，說明利用本發明製備出的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗pCA給 雞進行三次免疫之後能使被免疫雞有效地預防禽霍亂。所述的LB培養固體培養基的組成成分為按重量比每升LB培養固體培養基中含有 1%的胰蛋白腖、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉和水。所述的LB液體培養基的組成成分為按重量比每升LB液體培養基中含有1%的胰 蛋白腖、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，餘量為水。所述的溶液I的組成成分為按質量比每升溶液I中含有50 mmol/L的葡萄糖、25 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、10 mmol/L的乙二胺四乙酸，餘量為水。所述的溶液II的組成成分為按重量比每升溶液II中含有lOmmol/L的氫氧化鈉、 10%的十二烷基磺酸鈉，餘量為水。所述的溶液III的組成成分為按重量比每升溶液III中含有60%的5 mol/L的乙酸 鉀、11. 5%的冰醋酸，餘量為水。所述的磷酸鹽緩衝液的組成成分為按重量比每升磷酸鹽緩衝液中含有0. 8%的氯 化鈉、0. 02%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 29%的十二水合磷酸氫二鈉，餘量為水。
權利要求
1. 一種禽多殺性巴氏桿菌病核酸疫苗的製備方法，其特徵在於步驟一、引物設計根據禽霍亂菌基因組序列設計用於擴增禽霍亂菌外膜蛋白A基因的兩條引物Pl和P2 Pl 5' -GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3'；P2 :5』 -CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3』 ；步驟二、禽霍亂菌外膜蛋白A基因的PCR擴增及純化1)在0.2ml的PCR反應管中加入引物Pl和引物P2各 μ ，再依次加入DNA聚合酶 0. 5μ1、聚合酶緩衝液2. 5μ1、四種雙脫氧核糖核苷酸混合物3μ1、禽巴氏桿菌的基因組 μ 和水16μ1，再將含有上述試劑的PCR反應管放入PCR擴增儀中，進行PCR反應，PCR反應程 序首先進行94°C預變性，時間為5分鐘，預變性結束後進入循環過程，每個循環的程序為 94° C變性，時間為1分鐘，57° C復性，時間為45秒鐘，72° C延伸，時間為1分鐘，將上述循環 程序重複30次，30次循環結束後，72°C再次延伸，時間10分鐘，得到PCR擴增的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產物，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物，在凝膠成像系統中觀察 到目的基因後，備用；3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作取1.5ml的離心管a並稱其重量，然後 在紫外燈下將凝膠上含有的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物切下來，將切下來的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產物放在已稱重的1. 5ml的離心管a中，稱取離心管a的總重並計算出 從凝膠上切下來的禽霍亂菌外膜蛋白A基因的產物的重量，然後將離心管a中的禽霍亂菌 外膜蛋白A基因的產物搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管a放置在50°C水 浴中加熱至離心管a中的物質完全融解止，將融解後的溶液加入到DNA純化柱a上，DNA純 化柱a位於收集管a中，在21°C條件下放置1分鐘，後將收集管a放在離心機中，轉速為 12000轉/分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內的液體，再向收集管a內的DNA純化柱a 中加入700μ1的溶液II，在21° C條件下放置1分鐘，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘， 取出倒掉收集管a內的液體，後向DNA純化柱a上加入500μ1的溶液II，轉速為12000轉/ 分鐘，離心1分鐘，取出倒掉收集管a內的液體，將收集管a在轉速為13000轉/分鐘，離心 1分鐘，取出DNA純化柱a置於1. 5ml的離心管b中，在DNA純化柱a上加入40μ1溶液III， 將離心管b在21° C條件下放置1分鐘，將離心管b在轉速為13000轉/分鐘，離心1分鐘， 棄去DNA純化柱a得到離心管b中的40μ1液體，該液體就是純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A 基因；步驟三、真核表達載體pcDNA3. I+的酶切及純化1)酶切體系的配製在1.5ml的離心管c中加入真核表達載體pcDNA3. I+ 10μ1、限制 性內切酶Kpn I 3μ1、限制性內切酶EcoR I 3μ1、限制性內切酶緩衝液5μ1和水^μ ，混合 均勻止，得到的混合物Α，將上述混合物A放入37° C的水浴鍋中反應8小時，備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳對混合物A進行檢測利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物Α，在凝膠成像系統中進行觀察，備用；3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作取1.5ml的離心管d並稱其重量，在紫 外燈下將凝膠上的混合物A切下來，將切下來的混合物A放在已稱重的1. 5ml的離心管d中，稱取離心管d的總重並計算出從凝膠上切下來的混合物A的重量，然後將離心管d中的 混合物A搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管d放置在50° C水浴中加熱至混 合物A完全融解，將融解後的溶液加入到DNA純化柱b上，DNA純化柱b位於收集管b中， 收集管b在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離 心後倒掉收集管b內的液體，向DNA純化柱b上加入700μ1的溶液II，收集管b在21°C條件 下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心後倒掉收集管b內 的液體，向DNA純化柱b上加入500μ1的溶液II，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離 心1分鐘，離心後倒掉收集管b內的液體，倒掉收集管b中的液體後將放入離心機內，轉速 13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b放置於1. 5ml的離心管e中，後在DNA純化 柱b上加入40μ1溶液III，將離心管e在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機內轉速13000 轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱b得到離心管中e中的液體，該液體就是酶切並純 化後的真核表達載體PCDNA3. 1+，備用；步驟四、禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗的製備1)在1.5ml的離心管f中依次加入純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A基因15μ1、限制性內 切酶Kpn I 3μ1、限制性內切酶EcoR I 3μ1、限制性內切酶緩衝液5μ1和水Μμ ，混合均勻 止，得到的混合物B，將上述混合物B放入37°C的水浴鍋中反應5小時，取出備用；2)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測混合物B，在凝膠成像系統中進行觀察，備用；3)按照DNA凝膠回收試劑盒的方法進行操作取1.5ml的離心管g並稱其重量，在紫 外燈下將凝膠的混合物B切下來，將切下來的混合物B放在已稱重的1. 5ml的離心管g中， 稱取離心管g的總重並計算出從凝膠上切下的混合物B的重量，然後將離心管g中的混合 物B搗碎，加入等體積的溶液I，混合均勻止，將離心管g放置在50° C水浴中加熱至混合物 B完全融解，將融解後的溶液加入到DNA純化柱c上，DNA純化柱c位於收集管c中，收集管 c在21°C條件下放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心後倒 掉收集管c內的液體，離心後倒掉收集管c內的液體，向DNA純化柱c上加入700μ1的溶液 II，收集管C在21°C條件下將放置1分鐘，放入離心機中，轉速為12000轉/分鐘，離心1分 鍾，離心後倒掉收集管c內的液體，向DNA純化柱c上加入500μ1的溶液II，放入離心機中， 轉速為12000轉/分鐘，離心1分鐘，離心後倒掉收集管c內的液體，倒掉收集管c中的液 體後將放入離心機內，轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c並放置於1. 5ml 的離心管h中，後在DNA純化柱c上加入40μ1溶液III，將離心管h在21°C條件下放置1分 鍾，放入離心機內轉速13000轉/分鐘，離心1分鐘，取出DNA純化柱c得到離心管中h中 的40μ1液體，該液體就是酶切並純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A基因，備用；4)在1.5ml的離心管i中，依次加入酶切並純化後的禽霍亂菌外膜蛋白A基因10μ1、 酶切並純化後的真核表達載體pcDNA3. 1+2μ1、DNA連接酶 μ 、DNA連接酶緩衝液2μ1和水 5μ1，混合均勻止，將離心管i放入16° C的水浴鍋中，反應12小時，備用；5)待反應結束後，在離心管i中加入200μ1的大腸桿菌JM83，先將離心管i置於0°C 的冰水混合物中，時間30分鐘，取出置於42° C條件下，放置90秒，再取出，將離心管i置於 O0C的冰水混合物中，放置3分鐘，後向離心管i中加入0. 5ml的LB液體培養基，形成含有 LB液體培養基的混合液，備用；6)將離心管i置於37°C的搖床中振蕩培養，轉速200轉/分鐘，時間為1.5小時，結束後，取ΙΟΟμΙ含LB液體培養基的混合液塗布於含濃度為5(^g/ml氨苄青黴素的LB培養 固體培養基上，將塗布後的LB培養固體培養基置於37° C的培養箱內，倒置培養16小時，備 用；7)挑取培養後的LB培養固體培養基上的1個菌落，將菌落放入5ml含氨苄青黴素的 的LB液體培養基中，其氨苄青黴素的濃度為50μβ/πι1，後將含氨苄青黴素的LB液體培養基 置於37° C恆溫搖床內，在轉速為200轉/分鐘，振蕩培養16小時；8)待振蕩培養結束後，取Iml含有菌落的LB液體培養液加到1.5ml的離心管j中，將 離心管j放入離心機內離心，轉速12000轉/分鐘，離心5分鐘，棄去離心管j中的上層澄 清液體，加入ΙΟΟμΙ的預先冷卻至4° C的溶液IV，均勻混合後，加入200μ1的溶液V，混合均 勻止，後將離心管j置於0°C的冰水混合物中，放置3分鐘，後向離心管j中加入150μ1的 預先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，後將離心管j放於0° C的冰水混合物中，靜置5分鐘， 取出放入冷凍離心機內，在轉速為12000轉/分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，後取出，備 用；9)取離心管j中的上層澄清液體400μ1，將其加到1.5ml的離心管k中，向離心管k中 加入苯酚200μ1和氯仿200μ1，振蕩混勻後，放入冷凍離心機內，在轉速為12000轉/分鐘， 4°C條件下離心10分鐘，待離心結束後取上層液體400μ1移入到1. 5ml的離心管m中，加入 800μ1的無水乙醇，將離心管m於-20° C條件下，放置20分鐘，後取出放入冷凍離心機內，轉 速13000轉/分鐘，4° C條件下離心10分鐘，棄去離心管m中的上層澄清液體；10)在離心管m中加入濃度為70%的乙醇0.5ml，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/ 分鐘，4°C條件下離心5分鐘，棄去上層澄清液體，得到沉澱物I，該沉澱物I為pCA質粒，待 PCA質粒乾燥後，加入30μ1超純水進行溶解，得到的溶液為pCA質粒溶液；11)在1.5ml的離心管η中，加入2μ1的pCA質粒溶液，後依次向離心管η中加入 μ 的限制性內切酶Kpn I、 μ1的限制性內切酶EcoR I、 μ 的限制性內切酶緩衝液和水5μ1， 混合均勻後，置於37° C條件下，反應2小時，形成酶切液；12)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測pCA質粒酶，在凝膠成像系統中進行觀察，觀察到1050bp 大小的條帶，PCA質粒是本發明製備的禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗；步驟五、禽霍亂菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA質粒的大量製備1)挑取步驟四中含有PCA質粒的大腸桿菌JM83；2)挑取培養後LB培養固體培養基上的1個菌落，將菌落放入25ml含氨苄青黴素的的 LB液體培養基中，其氨苄青黴素的濃度為5(^g/ml，後將LB液體培養基，置於37°C恆溫搖 床內振蕩培養，轉速200轉/分鐘，至液體在600納米處的吸光度，OD600值為0. 6止，將振 蕩培養後的液體轉至500ml含有氨苄青黴素的LB液體培養基中，其氨苄青黴素的濃度為 5(^g/ml，置於37°C恆溫搖床內振蕩培養，轉速200轉/分鐘，培養15小時；3)待振蕩培養結束後，將含有菌落的500mlLB液體培養基放入IOOOml的離心管中， 將IOOOml的離心管放入冷凍離心機內，轉速6000轉/分鐘，4°C條件下離心時間15分鐘， 棄去上層澄清液體得到沉澱物II，向離心管中加入18ml的預先冷卻至4°C的溶液IV，將沉 澱物II懸浮，再加入2ml濃度為10mg/ml的溶菌酶，至混合均勻止，再加入40ml的溶液V， 混合均勻止，將1000ml的離心管置於20° C條件下，放置5分鐘，後向1000ml的離心管中加 入20ml預先冷卻至4° C的溶液VI，混合均勻，將其放於0° C的冰水混合物中，靜置10分鐘，取出放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4° C條件下離心20分鐘，取上層澄清液體，備 用；4)在200ml的離心管中，加入步驟3中的上層澄清液體80ml，再加入32ml的異丙醇， 振蕩混勻後在20° C條件下放置10分鐘，後放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4° C的 條件下離心20分鐘，待離心結束後倒掉上層澄清液體，得到200ml的離心管中的沉澱物III， 再向200ml的離心管中加入50ml的70%的乙醇，將200ml的離心管放入冷凍離心機內，轉 速12000轉/分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，棄去澄清液體，待沉澱物III乾燥後備用；5)在含有沉澱物III的200ml離心管中加入:3ml的pH值為8.0的三羥甲基氨基甲烷-乙 二胺四乙酸，TE溶液，使沉澱物III溶解，將溶解後的溶液轉移至15ml的離心管中，在0°C的 冰水混合物中，放置10分鐘，後向15ml的離心管中加入3ml的濃度為5mol/l的氯化鋰溶 液，放入冷凍離心機內，轉速10000轉/分鐘，離心時間10分鐘，取上層澄清液體，備用；6)在IOml的離心管中加入步驟5中的上層澄清液體和等體積的異丙醇，混合均勻止放 於20° C條件下，放置10分鐘，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/分鐘，4° C條件下離心10 分鐘，棄去上層澄清液體，加入5ml濃度為70%的乙醇，放入冷凍離心機內，轉速12000轉/ 分鐘，4°C的條件下離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉澱物IV，乾燥，備用；7)向含有沉澱物IV的IOml的離心管中加入0.5ml含有濃度為100mg/ml的RNA酶A的 三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，將沉澱物IV溶解，後向溶液中加入0. 25ml的 苯酚和0. 25ml的氯仿，至混合均勻止，將IOml的離心管放入冷凍離心機內，轉速12000轉/ 分鐘，4°C的條件下離心10分鐘，取0. 5ml的上層澄清液體轉至5ml的離心管內，加入Iml 的無水乙醇，置於-20°C條件下，放置20分鐘，放入冷凍離心機內，轉速13000轉/分鐘， 4°C條件下離心10分鐘，棄去上清液棄掉，得到沉澱物V，乾燥備用；8)向含有沉澱物V的5ml離心管中加入Iml超純水，使沉澱物V溶解，加入0.5ml的 聚乙二醇-氯化鎂，PEG-MgCl2溶液，置於20° C條件下，放置30分鐘，放入離心機內，轉速 13000轉/分鐘，離心20分鐘，棄去上層澄清液體，加入0. 5ml濃度為70%的乙醇，放入離心 機內，轉速13000轉/分鐘，離心5分鐘，倒掉上層澄清液體，得到沉澱物VI，該沉澱物就是 大量製備的PCA質粒即為製備的禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗；9)向含有沉澱物VI的5ml離心管中加入Iml濃度為0.01摩爾/升的磷酸鹽緩衝液，使 沉澱物VI溶解，溶解後的溶液為大量製備的PCA質粒溶液，後用分光光度計測定溶液中所 含的PCA質粒的濃度，備用；10)對禽霍亂菌的外膜蛋白A基因進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結束後在凝膠成像系統 中觀察到條帶為1050bp時，證明禽霍亂外膜蛋白A基因疫苗製備成功；所述的載體為真核表達載體pcDNA3. I+ ；所述的LB培養固體培養基的組成成分為按重量比每升LB培養固體培養基中含有1% 的胰蛋白腖、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉、1. 5%的瓊脂粉和水；所述的LB液體培養基的組成成分為按重量比每升LB液體培養基中含有1%的胰蛋白 腖、0. 5%的酵母提取物、1%的氯化鈉，餘量為水；所述的溶液I的組成成分為按質量比每升溶液I中含有50 mmol/L的葡萄糖、25 mmol/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸、10 mmol/L的乙二胺四乙酸，餘量為水；所述的溶液II的組成成分為按重量比每升溶液II中含有lOmmol/L的氫氧化鈉、10%的十二烷基磺酸鈉，餘量為水；所述的溶液III的組成成分為按重量比每升溶液III中含有60%的5 mol/L的乙酸鉀、 11. 5%的冰醋酸，餘量為水；所述的磷酸鹽緩衝液的組成成分為按重量比每升磷酸鹽緩衝液中含有0. 8%的氯化 鈉、0. 02%的磷酸二氫鉀、0. 02%的氯化鉀、0. 29%的十二水合磷酸氫二鈉，餘量為水。
全文摘要
一種禽多殺性巴氏桿菌病核酸疫苗的製備方法，以禽多殺性巴氏桿菌基因組序列設計引物，以禽多殺性巴氏桿菌CVCC474菌株基因組為模板通過PCR擴增出目的基因，利用限制性內切酶KpnⅠ和限制性內切酶EcoRⅠ對目的基因和真核表達載體pcDNA3.1(+)進行酶切，後將目的基因和真核表達載體pcDNA3.1(+)進行連接，轉化入大腸桿菌感受態JM83中，提取質粒，酶切鑑定後獲得禽多殺性巴氏桿菌病核酸疫苗；本發明方法所製備出的禽多殺性巴氏桿菌病核酸疫苗通過動物試驗檢測表明，可降低禽多殺性巴氏桿菌病的發生，降低禽多殺性巴氏桿菌對禽類侵襲，其製作方法簡單，容易操作。
文檔編號A61K39/102GK102139116SQ201010605018
公開日2011年8月3日 申請日期2010年12月25日 優先權日2010年12月25日
發明者孫軍傑, 孫曉菲, 宮強, 張勇法, 張敏, 曲寧, 牛明福, 程茗 申請人:河南科技大學