大黃素在製備P2X₃介導神經病理痛/神經系統疾病藥物中的應用的製作方法

2023-06-08 01:02:46 3

專利名稱：大黃素在製備P2X3介導神經病理痛/神經系統疾病藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及鎮痛藥物用途發明領域，尤其是涉及可用於防治疼痛的大黃素(單獨 用)在製備P2X3導神經病理痛/神經系統疾病藥物中的應用。
背景技術：
疼痛(pain)由痛覺(painperception)和痛反應(pain response)兩部分組成， 是臨床上大多數疾病共有並最常見的症狀之一，主要表現為機體對組織損傷或潛在的損傷 所產生的一種不愉快的主觀反應。由於疼痛給人們造成極大痛苦，據2001年第二期《國際 疼痛學會通迅》報導美國106次國會通過一項決議，宣布從2001年元月一日起的十年為 「疼痛控制和研究的十年」(Decadeof Pain Control and Research)。由此說明各國對疼痛 研究的重視。根據疼痛時程可將疼痛分為急性痛(生理性痛)和慢性痛(病理性痛)。其 中慢性痛包括炎症痛、神經病理痛、癌症痛。目前臨床上將疼痛作為繼體溫、脈搏、呼吸、血 壓等四大生命體徵之後的第五大生命體徵，是生命體徵的重要指標。由於慢性痛機理複雜， 其治療成為臨床上的難題。神經病理痛是指由神經系統損傷或疾病所引起的疼痛症候群， 常常表現為自發性的疼痛，對機械、冷、熱等傷害性刺激產生痛覺過敏；對非傷害性刺激產 生觸誘發痛、痛覺倒錯和燒灼痛等神經病理性痛覺過敏。由於慢性痛持續時間長，對人身心 健康危害較大，其研究成為疼痛領域的熱點和重點。三叉神經痛是臨床上發病率較高，對病 人的生活質量影響較大的一種較難完全治癒的疾病。三叉神經痛是一種慢性疼痛綜合症， 藥物治療是首選，雖然治療藥物較多，但有效而副作用較小的藥很少，而且有些藥物可能一 開始有效但很快會產生耐藥性。因此我們有必要探尋新的具有較好療效在而且副作用較小 的三叉神經痛止痛藥物，為三叉神經痛治療探索新的方法。化學藥物鎮痛仍是目前最主要的疼痛治療手段，主要包括阿片類鎮痛藥、中樞作 用的非阿片類鎮痛藥、作用於外周的抗炎鎮痛藥和複方抗炎鎮痛藥。但阿片類等鎮痛藥物 的副作用如呼吸抑制、噁心、嘔吐、嗜睡、尿瀦留等發生率較高，而且長期應用易產生藥物耐 受與依賴以及突然停藥導致的戒斷症候群。奈福泮(Nefopam，平痛新)為一種新型的非 麻醉性鎮痛藥，兼有輕度的解熱和肌松作用，化學結構屬於環化鄰甲基苯海拉明，所以不具 有非留體抗炎藥的特性，亦非阿片受體激動劑，對中、重度疼痛有效，主要用於術後止痛、牙 痛、癌症痛、急性外傷痛，臨床亦用於三叉神經痛治療。消炎痛(Indometacin，吲哚美辛)為 非甾體類抗炎藥，具有解熱、鎮痛及抗炎等作用，其作用機理為通過對環氧酶的抑制而減少 前列腺素的合成，制止炎症組織痛覺神經衝動的形成，抑制炎性反應，包括抑制白細胞的趨 化性及溶酶體酶的釋放等，由於消炎痛有多種嚴重的副作用，影響其使用範圍。因此，尋找 以新的分子靶標為基礎的鎮痛藥物成為目前的研究熱點和面臨的首要任務。嘌呤類物質三磷酸腺苷(ATP)作為重要的信使物質參與痛覺信息傳遞。嘌呤 (Purine)受體分為嘌呤1和嘌呤2 (Purine LPurine 2 ;P1，P2)受體，ATP及其類似物作用 於P2受體。P2受體分為配體門控性離子通道型受體(P2X受體)和G蛋白偶聯型受體(P2Y
3受體)。P2X受體有七種亞型(P2U。英國「自然」雜誌報導ATP作用的P2X3受體(P2X 受體的一種亞型)特異性地在與痛覺傳入有關的背根神經節小、中神經細胞克隆表達。將 ATP用離子透入法導入志願者前臂皮膚亦可產生劑量依賴性的痛覺反應。疼痛、傷害性刺 激使損傷細胞、應激細胞以及感覺神經末梢本身釋放大量ATP，ATP及其作用的P2X受體涉 及痛覺及傷害性信息在初級感覺神經細胞的傳遞，其中主要是同聚性P2X3受體參與初級感 覺神經細胞的痛覺及傷害性信息傳遞。基因敲除P2X3受體的小鼠減小了對福馬林致痛 試驗的兩相反應。P2X3受體介導神經病理痛的痛覺傳遞。神經病理痛刺激時，P2X3受體和 P2X3mRNA表達增加，感覺神經細胞P2X3受體介導ATP激活的門控通道電流明顯增強。應用 P2X3受體反義寡核苷酸及RNA幹擾技術可使炎性痛大鼠模型背根神經節的P2X3受體水平 下調，進而明顯減輕P2X3受體激動劑a，i3-meATP和福馬林所致的足底傷害性反應。三 叉神經傳導口腔黏膜的感覺。三叉神經節有P2X3受體的表達，三叉神經節對三叉神經痛的 傳遞有著重要作用，P2X3受體參與三叉神經痛的痛覺傳遞。疼痛狀態下P2X3受體對其激動 劑的反應性增加，P2X3受體拮抗劑A-317491明顯減小大鼠完全福氏佐劑誘導的慢性炎性熱 痛覺過敏和福馬林引起的痛覺行為。這些發現為神經病理痛和三叉神經痛的發病機理提 供了新的依據。申請人實驗室以前的研究也顯示傷害性刺激可導致背根感覺神經細胞和三 叉神經節神經細胞P2X3受體表達增加。目前國外已有研究生產P2X3受體拮抗劑(如R03) 用於臨床治療疼痛的報導。大黃素(emodin)是中藥大黃的主要有效成分，並且在正品大黃中的游離蒽醌中 佔的比例較大，其藥理作用與大黃有許多相似之處。大黃味苦性寒，歸脾、胃、大腸、肝、心 經；大黃有瀉火解熱、通瘀導滯、止痛止血等作用。大黃素是從豆科植物野葛及甘葛藤根中 提取的一種黃酮苷，臨床上主要用於心血管疾病和糖尿病的治療。文獻報導[丁豔，黃志 華·大黃素藥理作用研究進展.中藥藥理與臨床，2007 ;23 (5) :236-238.]大黃素具有抗炎 作用，但目前尚無單獨用大黃素直接具有鎮痛作用的報導，臨床上也無大黃素通過鎮痛作 用機制進行疼痛治療的報導。

發明內容
本發明的第一個目的在於提供大黃素的第一個新用途，即大黃素在製備治療慢性 痛(優選神經病理痛)的藥物中的應用。本發明的第二個目的在於提供大黃素的第二個新用途，即大黃素在製備治療三叉 神經節神經細胞介導疼痛藥物中的應用。本發明的第三個目的在於提供大黃素的第三個新用途，即大黃素在製備治療涉及 P2X3受體介導的神經系統疾病的病理生理機制防治藥物中的應用。大黃素可減輕神經病理痛及三叉神經痛模型大鼠的痛行為反應。大黃素治療疼痛 的作用機理為阻斷P2X3受體介導的疼痛信息傳遞，產生防治疼痛的作用。為了更好地理解本發明的實質，下面結合附圖以實驗和結果來證明大黃素的用 途。


圖1為大黃素神經病理痛大鼠熱痛敏的影響圖2為大黃素神經病理痛大鼠機械痛敏的影響圖；圖3為免疫組織化學方法觀察大黃素對神經病理痛大鼠背根神經節P2X3受體免 疫反應性的影響圖，其中A 正常組；B 假手術組；C 坐骨神經慢性壓迫性損傷組；D 單獨 大黃素組；E 坐骨神經慢性壓迫性損傷+大黃素處理組；F 坐骨神經慢性壓迫性損傷+消 炎痛處理組；圖4為原位雜交方法觀察大黃素對神經病理痛大鼠背根神經節P2X3受體mRNA表 達的影響圖，其中A 正常組；B 假手術組；C 坐骨神經慢性壓迫性損傷組；D 單獨大黃素 組；E 坐骨神經慢性壓迫性損傷+大黃素處理組；F 坐骨神經慢性壓迫性損傷+消炎痛處
理組；圖5為蛋白印跡方法觀察大黃素對神經病理痛大鼠三叉神經節P2X3受體蛋白表 達的影響圖，其中實驗分組順序正常組(control)；假手術組(sham)；坐骨神經慢性壓迫 性損傷組(Chronic constriction injury, CCI)；單獨大黃素處理組(Emodin)；坐骨神經 慢性壓迫性損傷+大黃素處理組(CCI+emodin)；坐骨神經慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組 (CCI+Indo)；圖6為RT-PCR方法觀察大黃素對神經病理痛大鼠三叉神經節P2X3受體mRNA表 達的影響圖，其中實驗分組順序正常組(control)；假手術組(sham)；坐骨神經慢性壓迫 性損傷組(Chronic constriction injury, CCI)；單獨大黃素處理組(Emodin)；坐骨神經 慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組(CCI+Indo)；坐骨神經慢性壓迫性損傷+大黃素處理組 (CCI+emodin)；圖7為大黃素三叉神經痛大鼠機械痛敏的影響圖；圖8為大黃素對三叉神經痛大鼠三叉神經節P2X3受體免疫反應性的影響圖，其中 A 假手術組；B 三叉神經損傷模型組；C 三叉神經損傷+大黃素處理組；D 三叉神經損傷 +奈福泮處理組；E 單獨大黃素處理組；圖9為原位雜交方法觀察大黃素對三叉神經痛大鼠三叉神經節P2X3受體mRNA表 達的影響圖，其中A 假手術組；B 三叉神經損傷模型組；C 三叉神經損傷+大黃素處理組； D 三叉神經損傷+奈福泮處理組；E 單獨大黃素處理組；圖10蛋白印跡方法觀察大黃素對三叉神經痛大鼠三叉神經節P2X3受體蛋白表達 的影響圖，其中實驗分組順序A 假手術組；B 三叉神經損傷模型組；C 三叉神經損傷+大 黃素處理組；D 三叉神經損傷+奈福泮處理組；E 單獨大黃素處理組； 圖11為RT-PCR方法觀察大黃素對三叉神經痛大鼠三叉神經節P2X3受體mRNA表 達的影響圖，其中實驗分組順序A 假手術組；B 三叉神經損傷模型組；C 三叉神經損傷+ 大黃素處理組；D 三叉神經損傷+奈福泮處理組；E 單獨大黃素處理組。
具體實施例方式本發明以大黃素對神經病理痛作用(作為慢性痛的代表)和三叉神經痛(作為三 叉神經介導疼痛的代表)作用兩部分。一、材料和方法(一 )大黃素對P2X3受體介導神經病理痛作用研究1. 1動物和分組
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雄性SD大鼠，220_250g，南昌大學醫學院實驗動物科學部提供。將大鼠隨機分成5 組，每組12隻。實驗分組I組(正常組)(control) ； II組(假手術組)(sham) ；III組(坐 骨神經慢性壓迫性損傷組)(Chronic constriction injury, CCI) ；IV組(單獨大黃素處理 組)(Emodin) ； V組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+大黃素處理組)(CCI+emodin) ； VI組(坐 骨神經慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組)(CCI+Indo)。將大黃素以20mg/ml溶於0. 5%的 羧甲基纖維素鈉，再按1 2的體積比用生理鹽水稀釋，50mg/kg的大黃素終濃度給予腹腔 注射。I組每天腹腔注射生理鹽水；II組每天腹腔注射大黃素注射液；III組(假手術組)切 開皮膚暴露坐骨神經，不結紮神經即縫合皮膚。IV組CCI術後第1天開始每天腹腔注射大 黃素注射液。VI組實驗大鼠於術前半小時和術後每天腹腔注射消炎痛(4mg/kg/d)，每天一 次至實驗結束。1. 2藥物與試劑大黃素(中國藥品生物生物製品檢定所中藥化學對照品，編號110756)；硫噴 妥鈉，上海新亞藥業有限公司(生產批號050101)；消炎痛(廣東華南藥業，國藥準字 H44020701) ；SP試劑盒，原位雜交試劑盒及DAB試劑盒(北京中山生物技術有限公司)； P2X3 抗體購自美國 CHEMIC0N INTERNATIONAL 公司。1. 3主要儀器BME-403 Von Frey細絲(中國醫學科學院生物醫學工程研究所)；BME-410C型全 自動熱痛刺激儀(中國醫學科學院生物醫學工程研究所)；消毒紗布、手巾、棉籤等，碘酒及 75%酒精，手術器械包剪刀、眼科小彎鑷、血管鉗、絲線、有齒鑷、神經剝離子等。 1.4慢性神經病理痛模型製作用硫噴妥鈉麻醉大鼠(30mg/kg，腹腔注射)，在無菌條件下於大鼠右大腿後外側 切開皮膚，鈍性分離出坐骨神經，以4-0含鉻腸線輕度結紮坐骨神經，共結紮4道，每個結 之間間隔約1mm。結紮過程中可見坐骨神經被結紮處直徑略減小，並伴有右後肢一過性抽 動，並注意不要結紮太緊以至於完全阻斷神經外周的血流。大鼠術後單籠飼養，分別於術前 (Od)及術後l，3，5，7，9，ll，14d測量機械縮足反射閾值和熱縮足反射潛伏期(測定時間恆 定於每日10:00-14:00，室溫維持在22 士 0.5 °C )。1. 5神經病理痛大鼠機械痛敏檢測用BME-403 Von Frey細絲(中國醫學科學院生物醫學工程研究所)測定機械 縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。置大鼠於透明的有機玻璃箱 (22 X 12 X 22cm3)中，有機玻璃箱底為1 X Icm2的鐵絲網。術後大鼠放置於實驗室飼養，測 試前將大鼠放在有機玻璃箱中適應15min。折力分別為0. 13，0. 20，0. 33，0. 60，1. 30，3. 60， 5. 00，7. 30，9. 90，20. lg，折力彡20. Ig時均記為20. Igo從最小折力開始，每根試驗10次， 直至出現縮足反射次數大於5/10，即50%反應閾值(即引起10次試驗中5次反應的值。重 復三次，取其平均值)。每次刺激間隔時間至少大於15s，並待刺激引起的反應(如舔足、甩 腿等)完全消失。1. 6神經病理痛大鼠熱痛敏檢測將有機玻璃箱置於3mm厚的玻璃板上，用BME-410C型全自動熱痛刺激儀(中國醫 學科學院生物醫學工程研究所)照射大鼠足底。熱輻射刺激儀照射大鼠足底至出現抬腿回 避時間為熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL) 0切斷時間為30秒，以防止組織灼傷。1. 7大鼠背根神經節(DRG) P2X3受體的表達五組實驗大鼠於術後第14天腹腔注射硫噴妥鈉(30mg/kg)深麻醉，經升主動脈灌 注4%多聚甲醛(0. lmol/L 8，？!17.4)，分離出大鼠1^4、1^5段01 ，取出固定，放入4%多聚 甲醛/0. ImPBS(含0. 1%DEPC)中固定2小時，用20%蔗糖脫水，在恆冷箱切片機上行冰凍 切片，厚度為15ym.放入4%的多聚甲醛中保存。每隻大鼠的DRG切片隔5張取一張二步 法免疫組織化學染色測定DRG神經細胞P2X3受體的表達，DAB顯色。與此同時對DRG切片 進行原位雜交測定P2X3受體mRNA的表達，雜交前所用液體和器皿都經0. 1 %的DEPC嚴格 處理。冰凍切片在0. 05%的H2O2室溫下作用30分鐘，以去除內源性過氧化物酶，胃蛋白酶 消化1-2分鐘，37°C預雜交液中孵育2小時，棄去預雜交液，轉入雜交液於水浴中37°C過夜。 次日，用梯度枸櫞酸鹽水(2XSSC，0. 5XSSC和0. 2XSSC)衝洗切片各15分鐘。入37°C封閉 液30分鐘，轉入生物素化的地高辛中37°C孵育30分鐘，0. 05%的PBS衝洗15分鐘，相繼 在SABC-POD和生物素化的過氧化物酶中各孵育30分鐘，DAB顯色。結果用圖像分析系統 軟體(武漢天平影像技術有限公司，HMIAS-2000高清晰彩色醫學圖文分析系統)對P2X3陽 性神經細胞進行平均光密度值分析。蛋白印跡檢測大鼠DRG的P2X3蛋白表達變化結果通過 AlphaImager 2200圖像分析軟體讀取目的條帶在X光膠片上測得的光密度掃描值，以各組 β -actin條帶的掃描值標化其相應組P2X3的蛋白表達量。1. 8實驗數據的統計處理各組數據以χ士sem表示。多組間比較用單因素方差分析，繼以最小顯著差法 (LSD)行兩兩比較。用SPSS11. 0軟體包進行數據處理。ρ < 0. 05為差異有顯著性。 (二)大黃素對P2X3受體介導三叉神經痛作用研究2. 1動物和分組雄性SD大鼠，220_250g，60隻，南昌大學醫學院實驗動物科學部提供。隨機將大鼠 分為假手術組、三叉神經痛模型組、三叉神經痛模型大黃素處理組、三叉神經痛模型奈福泮 處理組和單獨大黃素處理對照組。將大黃素以20mg/ml溶於0. 5%的羧甲基纖維素鈉，再按 1 2的體積比用生理鹽水稀釋，50mg/kg的大黃素終濃度給予腹腔注射。奈福泮(56. 9mg/ kg/d)肌肉注射，每天一次至實驗結束。2. 2藥物與試劑大黃素(中國藥品生物生物製品檢定所中藥化學對照品，編號110756)；奈福泮 (山東方明藥業股份有限公司，國藥準字H37021048)；乙醚，天津市大茂化學試劑廠(生產 批號050801)；硫噴妥鈉，上海新亞藥業有限公司(生產批號050101) ；SP試劑盒，DAB試 劑盒(北京中山生物技術有限公司)；P2X3抗體(CHEMICON INTERNATIONAL，美國)；SlOO抗 體(武漢博士德公司)。2. 3主要儀器BME-403 Von Frey細絲(中國醫學科學院生物醫學工程研究所)等。2. 4三叉神經痛模型製作建立眶下神經慢性壓迫性損傷大鼠動物模型。測定各組動物臉部機械性異常痛 敏。2. 5三叉神經痛大鼠機械痛敏測定
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用BME-403 Von Frey細絲測定機械縮足反射閾值(mechanical withdrawalthreshold，MWT)。置大鼠於透明的有機玻璃箱(22X 12X22cm3)中，有機玻璃 箱底為IX Icm2的鐵絲網。術後大鼠放置於實驗室飼養，測試前將大鼠放在有機玻璃箱中適 應 15min。折力分別為 0. 13，0. 20，0. 33，0. 60，1. 30，3. 60，5. 00，7. 30，9. 90，20. Igo 從最小 折力開始，每根試驗10次，直至出現縮足反射次數大約5/10，即50%反應閾值(即引起10 次試驗中5次反應的值)。最大折力為20. lg，大於此值時記為20. lg。每次試驗至少間隔 15s，並待刺激引起的反應(如舔足、甩腿等)完全消失。2.6各組數據以1士^!11表示。多組間比較用單因素方差分析，繼以最小顯著差法 (LSD)行兩兩比較。用SPSS11. 0軟體包進行數據處理。ρ < 0. 05為差異有顯著性。二、結果(一 )大黃素對P2X3受體介導的神經病理痛作用的研究結果各組大鼠術後均未見肢體運動障礙和自殘現象。1. 1行為學研究1. 1. 1神經病理痛大鼠熱痛敏檢測坐骨神經被結紮4天後神經病理通模型基本形成，III組(坐骨神經慢性壓迫性損 傷組；Chronic constriction injury，CCI)、V組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+大黃素組； CCI+emodin)和VI組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組，CCI+Indocin)的熱縮足 反射潛伏期(thermal withdrawal latency, TffL)較 I 組(正常對照組，control)、II 組(假 手術組，sham)和IV組(單獨大黃素組，emodin)顯著性下降(ρ 0. 05)。V組(CCI+emodin) 熱縮足反射潛伏期與I組(control)、II組(sham)和IV組(emodin)之間相比較仍下降(ρ < 0. 01)，但與III組(CCI)之間比較顯著性增加(ρ 0. 05)，而III組(CCI)仍 較低(ρ < 0. 01)。坐骨神經被結紮7d後，VI組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組， CCI+Indocin)與CCI組實驗大鼠比較其熱縮足反射潛伏期增大，有明顯差異(ρ 0. 05)。見圖1。1.1.2神經病理痛大鼠機械痛敏檢測坐骨神經被結紮4d後神經病理通模型基本形成，III組(Chronic constrictioninjury, CCI)、V組(CCI+emodin)和VI組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+消 炎痛處理組，CCI+Indocin)與 I 組(control)、II 組(sham)和IV組(emodin)相比，其機 械縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold, MWT)顯著性下降(ρ 0. 05)。坐 骨神經被結紮7d後，雖V組(CCI+emodin)與I組(control)相比，其機械縮足反射閾值 (mechanical withdrawal threshold, MWT)仍低(ρ < 0.01)，但與III組(CCI)之間比較， 機械縮足反射閾值(mechanical withdrawalthreshold, MWT)已顯著性增加(ρ < 0. 01)。 坐骨神經被結紮7d後，VI組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組，CCI+Indocin)與 CCI組實驗大鼠比較其機械縮足反射閾值增大，有明顯差異(ρ 0.05)。見圖2。1. 1. 3免疫組織化學方法測定大鼠背根神經節(DRG) P2X3受體的表達變化
術後14d，用免疫組織化學方法測定大鼠1^4、L5手術側背根神經節(DRG) 2&受 體的表達。每隻大鼠背根神經節L4、L5段切片中隔5張取一張切片，用圖像分析系統軟體 分析P2XJ0性神經細胞的平均光密度值變化。I組(正常組，control)、II組(假手術 組，Sham)、III組(坐骨神經慢性壓迫性損傷組，CCI)、IV組(單獨大黃素組，Emodin)、V 組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+大黃素組，CCI+emodin)和VI組(坐骨神經慢性壓迫性損 傷+消炎痛處理組，CCI+Indocin)的平均光密度值值分別為110. 84士 19. 86 (Control)、 112. 40 + 26. 76( Sham),217. 02 + 33. 64( CC I)U08. 08 + 20. 87 (emodin)、 123. 72士34. 24 (CCI+emodin)和 135. 58士32. 32 (CCI+Indo)(各組 η = 10)。I 組、II 組、 IV組之間Ρ2Χ3受體表達無顯著性差異(ρ > 0. 05) ；III組DRG的Ρ2Χ3受體的表達較I組、 II組、IV組明顯增加(P < 0. 01) ； V組DRG的Ρ2Χ3受體的表達較I組、II組、IV組高(ρ < 0. 05)，但和III組相比仍較低(ρ < 0. 05) ；VI組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+消炎痛處理 組，CCI+Indocin)與CCI組實驗大鼠比較P2X3受體表達明顯降低(ρ < 0. 01) ,VBiDRG的 Ρ2Χ3受體表達較I組、II組、V組明顯增高(ρ < 0. 01)，但和IV組相比稍增高(ρ < 0. 05)。 見圖3。1. 1. 4原位雜交方法測定大鼠背根神經節(DRG) Ρ2Χ3受體mRNA的表達變化術後14d，採用原位雜交方法測定大鼠L4、L5段手術側背根神經節(DRG) 2&受 體mRNA的表達。每隻大鼠L4、L5背根神經節切片中隔5張取一張切片，用圖像分析系 統軟體分析P2X3陽性神經細胞的平均光密度值變化。與免疫組織化學實驗結果非常相 似，I組(正常組，control)、II組(假手術組，Sham)、III組(坐骨神經慢性壓迫性損傷 組，CCI)、IV組(單獨大黃素組，Emodin)、V組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+大黃素組， CCI+emodin)和VI組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+消炎痛處理組，CCI+Indocin)的平均光 密度值值分別為94. 40 士 21. 24 (Control)、95. 42 士 17. 25 (Sham)、171. 89 士 50. 27 (CCI)、 90. 12 士 19. 12 (emodin)、98· 38 士 13. 66 (CCI+emodin)、112. 53 士 15. 73 (CCI+Indo)(各組 η =10)。I組、II組、IV組、V組之間Ρ2Χ3受體表達無顯著性差異(ρ > 0. 05) ；III組DRG的 Ρ2Χ3受體的表達較I組、II組、IV組明顯增加(ρ < 0. 01) ； V組DRG的Ρ2Χ3受體的表達較I 組高(P < 0. 05) ；VI組與III組比較Ρ2Χ3受體mRNA表達下降(ρ < 0. 05)，與I組、II組、IV 組、V組比較表達升高(ρ <0.05)。見圖4。1. 1. 5蛋白印跡檢測大鼠背根神經節(DRG)P2X3蛋白表達變化於術後14d，用Western Blot方法進一步證實大黃素對CCI大鼠手術側L4/L5 段背根神經節？2&受體蛋白表達的影響。結果採用Alphalmager 2200圖像分析軟體， 讀取目的條帶在X光膠片上測得的光密度掃描值，與其對應的β -actin條帶的比值作 為P2X3蛋白表達的相對水平量。結果顯示I組(正常組，control)、II組(假手術組， sham)、III組(坐骨神經慢性壓迫性損傷組，CCI)、IV組(單獨大黃素組，Emodin)、乂組(坐 骨神經慢性壓迫性損傷+大黃素組，CCI+emodin)和VI組(坐骨神經慢性壓迫性損傷+ 消炎痛處理組，CCI+Indocin)的P2X3的蛋白表達量(經對應的β-actin標化後)分別 為 0. 59 士0. 05 (Control)、0· 62 + 0. 05 (Sham) U. 43 + 0. 37 (CCI)、0· 54士0· 03 (emodin)、 0. 56 士 0· 03 (CCI+emodin)、0· 68 士 0· 06 (CCI+Indo)(各組 η = 5)。統計學分析顯示，CCI 組 Ρ2Χ3 蛋白的表達明顯高於 Ctrl 組、Sham 組、Ctrl+Emodin 組、CCI+Emodin 組、CCI+Indocin 組(ρ < 0.01), Sham組與Ctrl組以及Ctrl+Emodin組和Ctrl組之間相比，P2X3蛋白的表
9達無顯著性差異(P > 0. 05)；而CCI+Emodin組與CCI+Indocin組之間相比，DRG的P2X3蛋 白的表達相對量更低，但無顯著性差異(P > 0. 05) ；CCI+Emodin組及CCI+Indocin組與CCI 組比較，DRG的P2X3蛋白的表達相對量明顯下降(ρ < 0. 01)。見圖5。1.1. 6RT-PCR檢測大鼠背根神經節(DRG) P2X3mRNA的表達於術後14d，用RT-PCR法檢測結紮側DRG P2X3mRNA的表達，採用凝膠成像分析系 統讀取目的電泳條帶的斑點密度(平均光密度)掃描值，將？2&條帶與其對應的β-actin 條帶的比值作為P2X3mRNA表達的相對量。結果顯示，Ctrl對照組、Sham組、CCI神經病 理痛模型組、Ctrl+Emodin組、CCI+Emodin治療組和CCI+Indo組的大鼠DRG的P2X3mRNA 的P2X3mRNA表達相對量(經對應的β -actin標化後)分別為0. 67士0. 44(Control)、 0. 75 士 0. IO(Sham)、0. 84 士 0. 14 (CCI)、0. 70 士 0. 10(emodin)、0. 68 士 0. 03 (CCI+emodin)、 0.76士0.05 (CCI+Indo)(各組η = 10)。CCI神經病理痛模型組實驗大鼠的背根神經節 的P2X3mRNA表達與Ctrl對照組、Sham組、Ctrl+Emodin組相比明顯升高，且有顯著性意 義(P < 0. 01)，CCI+Emodin治療組與CCI神經病理痛模型組DRGP2X3mRNA的表達量相比， CCI+Emodin治療組實驗大鼠DRG的P2X3mRNA的表達顯著性下降(ρ < 0. 01) ；CCI+Emodin 治療組與CCI+Indo組相比實驗大鼠DRG的P2X3mRNA的表達下降，但無統計學意義(ρ
<0. 05)。見圖 6。( 二 )大黃素對Ρ2Χ3受體介導的三叉神經痛作用的研究結果2. 1. 1三叉神經大鼠機械痛敏測定用BME-403 Von Frey細絲測定機械縮足反射閾值(mechanical withdrawalthreshold，MWT)。置大鼠於透明的有機玻璃箱(22X 12X22cm3)中，有機玻璃 箱底為IXlcm2的鐵絲網。術後大鼠放置於實驗室飼養，測試前將大鼠放在有機玻璃箱中 適應 15min。折力分別為 0. 13，0. 20，0. 33，0. 60，1. 30，3. 60，5. 00，7. 30，9. 90,20. lg，折力 ^ 20. Ig時均記為20. lg。從最小折力開始，每根試驗10次，直至出現縮足反射次數大於 5/10，即50%反應閾值(即引起10次試驗中5次反應的值。重複三次，取其平均值)。每 次刺激間隔時間至少大於15s，並待刺激引起的反應(如舔足、甩腿等)完全消失。術後第7天神經病理通模型基本形成，II組(三叉神經痛模型組， TrigeminalNeuralgia, TN)、III組(三叉神經痛模型+大黃素處理組；TN+emodin)和IV組 (三叉神經痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)的機械刺激閾值較I組(假手術組對照 組，sham)和V組(單獨大黃素處理組，emodin)顯著性下降(ρ 0. 05)。9d後，II、 III、IV組的機械刺激閾值仍低於I組和V組(ρ < 0.01)，但IV組(TN+Nefopam)高於II組 (ρ<0·01)。眶下神經被結紮Ild後，III組與TN組實驗大鼠比較其機械刺激閾值增大(ρ 0. 05)，持續至術後15d，TN組大鼠的機械刺激閾 值維持在低水平，而與TN+emodin組和TN+Nefopam組大鼠比較均存在顯著統計學差異(ρ
<0. 01)。見圖 7。2. 1. 2免疫組化檢測大鼠三叉神經節(TG) Ρ2Χ3表達變化隨機將SD大鼠(體重200 士 20g)分為I組(假手術組，Sham)、II組(三叉神經痛 模型組，Trigeminal Neuralgia, TN)、III組(三叉神經痛模型+大黃素處理組，TN+Emodin)、 IV組(三叉神經痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)和V組(單獨大黃素處理對照組，
10Emodin)。於術後14d，用免疫組織化學方法測定大鼠三叉神經節(TG)P2X3受體的表達。 免疫組化結果經Hmias-2000高清晰彩色醫學圖文分析系統分析，結果顯示假手術組、三 叉神經痛模型組、大黃素處理三叉神經痛模型組、奈福泮處理三叉神經痛模型組和單獨 大黃素處理對照組的平均光密度值分別為=183. 02 士 23. 30 (Sham), 330. 31 士 68. 27 (TN)、 193. 01 士38. 81 (TN+Emodin) ,316. 92士51. 43 (TN+Nefopam)、191. 86士28. 13 (Emodin)(各組 η = 10)。II (三叉神經痛模型組)明顯高於I組(假手術組)、ΙΙΙ組(三叉神經痛模型+ 大黃素處理組)、V組(單獨大黃素處理對照組)(ρ 0. 05) ；IV (三叉神經痛模型+奈福泮處理組)與I、111、V組之間 Ρ2Χ3受體表達相比增高(ρ < 0.01)，但其與II組(三叉神經痛模型組)比較，DRG的Ρ2Χ3 受體的表達量下降(P < 0. 05)。見圖8。2.1.3原位雜交檢測大鼠三叉神經節(TG) Ρ2Χ3的mRNA表達變化SD大鼠(體重200 士 20g)隨機分為I組(假手術組，Sham)、II組(三叉神經痛模 型組，Trigeminal Neuralgia, TN)、III組(三叉神經痛模型+大黃素處理組，TN+Emodin)、 IV組(三叉神經痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)和V組(單獨大黃素處理對照組， Emodin)。於術後14d，採用原位雜交方法測定大鼠三叉神經節(DRG) P2X3受體mRNA的 表達。原位雜交結果經Hmias-2000高清晰彩色醫學圖文分析系統測定大鼠三叉神經 節(TG)P2X3受體的表達。結果顯示各組的平均光密度值分別為83.02士23.30(Sham)、 96. 77 + 9. 11 (TN) ,82. 17 + 9. 95 (TN+Emodin) ,90. 98 + 20. 09 (TN+Nefopam)、 79. 71 士 14. 09 (Emodin)(各組η = 10)。II組(三叉神經痛模型組)明顯高於I組(假手術 組)、ΙΙΙ組(三叉神經痛模型+大黃素處理組)、V組(單獨大黃素處理對照組)(ρ 0.05) ；IV (三叉神經痛模型+奈福泮處 理組)與I、111、乂組之間？2&受體表達相比增高(P <0.01)，但其與II組(三叉神經痛模 型組)比較，DRG的Ρ2Χ3受體的表達量下降(ρ < 0. 05)。見圖9。2. 1. 4蛋白印跡檢測大鼠三叉神經節(TG)Ρ2Χ3蛋白表達變化SD大鼠(體重200 士 20g)隨機分為I組(假手術組，Sham)、II組(三叉神經痛模 型組，Trigeminal Neuralgia, TN)、III組(三叉神經痛模型+大黃素處理組，TN+Emodin)、 IV組(三叉神經痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)和V組(單獨大黃素處理對照組， Emodin)。於術後14d，採用蛋白印跡檢測大鼠三叉神經節(TG)P2X3蛋白表達變化。結果通過Alpha Imager 2200圖像分析軟體讀取目的條帶在X光膠片上測得的 光密度掃描值，以各組β-actin條帶的掃描值標化其相應組蛋白表達量。結果顯 示，假手術組(Sham)、三叉神經痛模型組(Trigeminal Neuralgia, TN)、三叉神經痛模型 +大黃素處理組(TN+Emodin)、三叉神經痛模型+奈福泮處理組(TN+Nefopam)和單獨大 黃素處理對照組(Emodin)的P2X3的蛋白表達量(經對應的β-actin標化後)分別為 0. 79 士 0. 08 (Sham)、0. 97 士 0. 02 (TN)。0. 81 士 0. 06 (TN+Emodin)，0. 89 士 0. 03 (TN+Nefopam)、 0.72 士0.05 (Emodin)。II組(三叉神經痛模型組)明顯高於I組(假手術組)、III組(三叉 神經痛模型+大黃素處理組)、V組(單獨大黃素處理對照組)(ρ 0. 05) ；IV (三叉神經痛模型+奈福泮處理組)與I、 III、V組之間Ρ2Χ3受體表達相比增高(ρ<0.05)，但其與II組(三叉神經痛模型組)比較，
11DRG的P2X3受體的表達量下降(ρ < 0. 05)。見圖10。 2.1. 5RT-PCR檢測大鼠三叉神經節(TG) P2X3的mRNA表達變化隨機將SD大鼠(體重200 士 20g)分為I組(假手術組，Sham)、II組(三叉神經痛 模型組，Trigeminal Neuralgia, TN)、III組(三叉神經痛模型+大黃素處理組，TN+Emodin)、 IV組(三叉神經痛模型+奈福泮處理組，TN+Nefopam)和V組(單獨大黃素處理對照組， Emodin)。引物設計選用β -actin作為內參，引物序列如下Primer P2X3(產物長度為 519bp)S 5， -CAACTTCAGGTTTGCCAAA-3『A 5， -TGAACAGTGAGGGCCTAGAT-3，Primer β-actin (產物長度為 240bp)S 5』 -TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3』A 5』 -CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3』於術後14d，用RT-PCR法檢測結紮側TG P2X3mRNA的表達，採用凝膠成像分 析系統讀取目的電泳條帶的斑點密度(平均光密度)掃描值，將P2X3條帶與其對應 的β -actin條帶的比值作為P2X3mRNA表達的相對量。結果顯示，假手術組(Sham)、 三叉神經痛模型組(Trigeminal Neuralgia, TN)、三叉神經痛模型+大黃素處理組 (TN+Emodin)、三叉神經痛模型+奈福泮處理組(TN+Nefopam)和單獨大黃素處理對照 組(Emodin)的大鼠TG的P2X3mRNA表達相對量(經對應的β -actin標化後)分別為 0. 89 士0. 08 (Sham) U. 03 士0. 03 (TN)、0· 86 士 0. 02 (TN+Emodin)、0· 95 士0· 01 (TN+Nefopam)、
0.84士0.07(Emodin)(各組η = 5)。II組(三叉神經痛模型組)明顯高於I組(假手術 組)、ΙΙΙ組(三叉神經痛模型+大黃素處理組)、V組(單獨大黃素處理對照組)(ρ < 0. 01)。
1、111、乂組之間卩2\受體表達無顯著性差異(ρ>0.05) ；IV (三叉神經痛模型+奈福泮處 理組)與I、111、乂組之間？2&受體表達相比增高(P <0.01)，但其與II組(三叉神經痛模 型組)比較，DRG的Ρ2Χ3受體的表達量下降(ρ < 0. 05)。見圖11。申請人:實驗室的研究發現單獨用大黃素可減輕神經病理痛大鼠的痛行為反應。根 據大黃素減小神經病理痛大鼠背根神經節神經細胞和三叉神經痛大鼠三叉神經節神經細 胞Ρ2Χ3受體mRNA和蛋白的表達，表明大黃素減輕疼痛的作用機理是阻斷P2X3受體介導的 疼痛信息傳遞，具有防治疼痛的作用。此外，由於Ρ2Χ3·呤受體涉及神經系統多種疾病的 發病，大黃素可能通過影響Ρ2Χ3受體介導的神經信號傳遞對神經系統疾病產生防治作用。實施例1 用本技術領域公知的方法，製成適用於神經病理痛治療的口服、注射或局部應用 (如局敷)的大黃素製劑。與非留體類抗炎鎮痛藥消炎痛處理組大鼠實驗結果相比表明 大黃素是作用於Ρ2Χ3受體產生鎮痛效應。相對於阿片類等鎮痛藥物的副作用大、易產生藥 物耐受與依賴以及戒斷症候群，消炎痛等抗炎鎮痛藥毒副作用大等不足之處，大黃素作為 中藥有效成份毒副作用小，更利於其作為鎮痛藥物的開發應用。實施例2 大黃素抑制大鼠三叉神經節神經細胞Ρ2Χ3受體mRNA和蛋白的表達，影響三叉神 經節神經細胞介導的疼痛。用本技術領域公知的方法，可製成適用於三叉神經節神經細胞介導疼痛治療的口服、注射或局部應用(如局敷)的大黃素製劑。實施例3 用本技術領域公知的方法，製成適用於涉及P2X3受體介導神經系統疾病治療的口 服、注射或局部應用(如局敷)的大黃素製劑。消炎痛及奈福泮可明顯減輕大鼠的痛敏反 應，但消炎痛及奈福泮對CCI神經病理痛模型大鼠及三叉神經痛大鼠背根初級感覺神經細 胞和三叉神經初級感覺神經細胞P2X3受體表達的影響低於大黃素處理組，顯示大黃素的鎮 痛作用機理與消炎痛及奈福泮不同，大黃素可通過降低P2X3受體表達產生作用，進而表明 大黃素可能成為P2X3受體介導神經系統疾病防治的藥物。
權利要求
單獨用大黃素在製備用於治療涉及P2X3受體介導的慢性痛的藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其中所述慢性痛為神經病理痛。
3.大黃素在製備用於治療涉及三叉神經節神經細胞P2X3受體介導疼痛的藥物中的應用。
4.大黃素在製備治療涉及P2X3受體介導的神經系統疾病防治藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及大黃素在製藥領域中的新用途，即大黃素在製備P2X3介導疼痛/神經系統疾病藥物中的應用。實驗觀察到大黃素可抑制痛覺行為反應，進而應用免疫組化、原位雜交、RT-PCR及蛋白印跡等技術觀察到大黃素可抑制神經病理痛模型大鼠背根神經節及三叉神經痛模型大鼠三叉神經節神經細胞P2X3受體的mRNA和蛋白表達。實驗證實大黃素對慢性痛(神經病理痛)和三叉神經節神經細胞傳遞的疼痛具有抑制作用的機理是阻斷初級感覺神經細胞P2X3受體介導的痛覺信息傳遞。本發明為神經病理性疼痛及/或三叉神經節神經細胞介導疼痛防治探明新方法，同時還表明大黃素具有影響神經細胞P2X3受體的作用，這將有助於P2X3受體所涉及神經系統疾病的藥物防治應用。
文檔編號A61P25/00GK101879151SQ20101022801
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月15日 優先權日2010年7月15日
發明者劉雙梅, 劉晗, 徐昌水, 李桂林, 梁尚棟, 高雲 申請人:南昌大學